РОЛЬ МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ ПОРЫ В ТРАНСМЕМБРАННОМ

еКСПеРИМеНТАльНі РОБОТИ
УДК 577.23
роль митохондриальной поры в трансмембранном
обмене кальция в митохондриях
О. В. АКОПОВА
Институт физиологии им. А. А. Богомольца НАН Украины, Киев;
e-mail: circul@biph.kiev.ua
Изучали накопление Са2+ в энергизованных митохондриях печени крыс в условиях открывания
митохондриальной поры (mitochondrial permeability transition pore, MPTP). Как и при блокировании
МРТР циклоспорином А, накопление Са2+ сопровождается выходом Н+ в среду инкубации. Соотношение обмена Са2+ на Н+, независимо от открывания поры, составляет 1 Са2+ : 1 Н+. Показано, что
открывание МРТР резко снижает Са2+-емкость митохондрий: от ~400 нмоль/мг в присутствии циклоспорина А до ~80÷100 нмоль/мг в условиях открывания поры. В отсутствие циклоспорина А накопление Са2+ сопровождается нечувствительным к ингибитору Са2+-унипортера – рутениевому красному
высвобождением ионов кальция и соответственно нечувствительным к рутениевому красному, но
чувствительным к циклоспорину А входом Н+ в матрикс митохондрий. Индуцированный открыванием
поры и подавляемый циклоспорином А кальций-протонный обмен происходит лишь при накоплениии
в матриксе количества кальция, превышающего базальный уровень. Таким образом, показано, что в
отличие от Са2+-унипортера, митохондриальная пора обладает собственной протонной проводимостью, а ее открывание обеспечивает обмен ионов Са между митохондриями и средой, сопряженный с
противоположно направленным транспортом протонов в митохондриальный матрикс. Сделан вывод,
что открывание МРТР в физиологических условиях является важным механизмом регуляции уровня
накопления Са2+ в митохондриях (Са2+-емкости) и внутримитохондриального рН.
К л ю ч е в ы е с л о в а: митохондрии, пора, Са2+-унипортер, транспорт Са2+ и Н+, Са2+-емкость.
К
настоящему времени все более очевидной становится важная роль митохондрий во внутриклеточном транспорте
Са2+ и в регуляции его клеточного гомеостаза
в целом. В исследованиях последних лет обнаружено, что клеточный кальциевый обмен
осуществляется преимущественно путем локальной передачи кальциевых сигналов между плазматической мембраной, эндоплазматическим ретикулумом и митохондриями.
Этот механизм локального обмена ионами Са
обеспечивается соответствующим взаимным
расположением ретикулума, наружной клеточной мембраны и митохондриальных структур
[1–3].
Митохондрии обмениваются ионами Са с
соседствующим окружением (клеточной мембраной, эндоплазматическим ретикулумом
и ядром) с помощью Са2+-транспортной системы, которая, как известно, включает Са2+унипортер, Na+/Са2+- и H+/Са2+-обмен. Значительную роль в кальциевом обмене выполняет
также митохондриальная пора (mitochondrial
permeability transition pore, MPTP) – неселективный канал, открывание которого ин-
40
дуцируется ионами Са митохондриального
матрикса [4–6]. Структура МРТР-канала интенсивно изучается в течение последних 15 лет
[6]. Известно, что основными структурными
единицами его являются белки наружной и
внутренней митохондриальных мембран – потенциалзависимый анионный канал (VDAC)
и ADP/ATP-антипортер. Открывание канала
МРТР происходит также с участием циклофиллина D – матриксного белка, активируемого ионами Са [6,7]. Кальций и сам по себе
выполняет регуляторную роль в функционировании поры – активирует ее открывание
со стороны матрикса, но, напротив, блокирует ее с наружной стороны митохондриальной мембраны [5,6]. В настоящее время также установлено, что важную роль в регуляции
МРТР выполняют энзим гексокиназа и белки
семейства Bcl [8]. В физиологических условиях в непосредственной регуляции МРТР могут принимать участие и некоторые изоформы
протеинкиназы С, которая, как предполагают,
связывается с анионным каналом VDAC при
ее активации под действием физиологических стимулов, блокируя тем самым открыва-
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2008, т. 80, № 3
О. В. АКОПОВА
ние поры [9,10]. В исследованиях, проводимых
в настоящее время в разных лабораториях,
выявляются все новые регуляторные белки,
принимающие участие в функционировании
МРТР.
Полагают, что вход и выход Са2+ из митохондрий происходят различными путями:
кальций попадает в матрикс через Са2+-унипортер – потенциалзависимый Са2+-канал
внутренней мембраны митохондрий, а высвобождается из матрикса через Na+/Са2+- и
H+/Са2+-обменники либо через пору [5, 6, 11].
Однако, несмотря на многочисленные исследования последних двух десятилетий, даже
к настоящему времени все еще недостаточно
изученной остается роль отдельных компонентов Са2+-транспортной системы митохондрий в
трансмембранном обмене кальция, в частности
роль митохондриальной поры в транслокации
ионов Са через митохондриальную мембрану.
Известно, что потенциалзависимый вход
кальция в матрикс через Са2+-унипортер [11]
сопровождается выходом Н+ в среду инкубации в определенных стехиометрических соотношениях [12–16]. В стандартных условиях
эксперимента стехиометрия обмена составляет
1 Са2+: 1 Н+ [13–15]. При этом нами показано
соответствие таких характеристик транспорта
Са2+, как порядок реакции, константа скорости и время половинного превращения тем же
характеристикам транспорта Н+ [17]. Кальцийпротонный обмен необходим и для выхода
Са2+ из митохондрий, в частности после сброса мембранного потенциала [13, 14, 17, 18]. Однако, как мы установили ранее [17], кальцийпротонный обмен, необходимый для выхода
катиона из матрикса, обеспечивается экзогенным переносчиком протонов (СССР), после
чего кальций выходит в среду через унипортер
в обмен на вход протонов в матрикс митохондрий. В присутствии циклоспорина А выход
Са2+ из митохондрий, как и сопряженный с ним
транспорт протонов, полностью подавляются
ингибитором Са2+-унипортера – рутениевым
красным [17]. Таким образом, в присутствии
циклоспорина А кальций высвобождается в
среду через унипортер, причем реверсия Са2+унипортера и выход Са2+ из митохондрий происходят путем Са2+-протонного обмена.
Известно, что неселективный канал
МРТР является одним из «участников» кальциевого обмена между митохондриями и средой [5,11]. Поэтому в данной работе поставлена
задача изучить накопление Са2+ и его выход из
митохондрий в условиях открывания МРТР и
выяснить роль поры в механизмах, обеспечиISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2008, т. 80, № 3
вающих обратимость энергозависимого накопления кальция в митохондриях.
материалы и методы
В опытах использовали белых крыс с массой тела 200–250 г. Печень промывали охлажденным 0,9%-м раствором KCl (4 °С), после
чего измельчали и гомогенизировали в 5-кратном объеме среды (в мМ): 250 сахарозы, 20
трис-НCl-буфера и 1 ЭДТА (рН 7,4). Для выделения митохондрий гомогенат центрифугировали 7 мин при 700 g (4 °С); затем супернатант
центрифугировали 15 мин при 11 000 g (4 °С).
Осадок суспендировали в небольшом объеме
среды, не содержащей ЭДТА, и хранили на
льду при 4 °С.
Изменение концентрации Са2+ в среде
определяли в присутствии 70 мкМ арсеназо-III с помощью спектрофотометра USB-2000
(Ocean Optics, США), используя двухволновую
методику регистрации светопоглощения при
654 и 690 нм.
Концентрацию ионов водорода в среде
инкубации измеряли с помощью стеклянного
электрода ЭСКЛ-08 М.1. Общее количество
ионов кальция и водорода рассчитывали с помощью калибровочных кривых, построенных
на основании данных титрования суспензии
растворами CaCl2 и HCl. Количество Са2+ и Н+
выражали в наномолях на 1 мг белка.
Регистрацию транспорта ионов проводили
в среде следующего состава (в мМ): 120 КCl, 1
КН2РО4, 5 Na-глутамат, содержащей заданные
концентрации CaCl2; pН доводили КОН до 7,5.
Для блокирования митохондриальной поры в
некоторых опытах в среду добавляли циклоспорин А (10-6 М). Ротенон, протонофор (карбонилцианид-m-хлорфенилгидразон, СССР) и
рутениевый красный вносили в среду в количестве 10 нмоль/мг белка, 2⋅10-6 М и 2⋅10-5 М
соответственно.
В работе использованы также арсеназо-III
(Aldrich), Na-глутамат, трис (основание), протонофор СССР (Sigma), рутениевый красный,
циклоспорин А (Fluka), ротенон (ISN) и другие
реактивы марки осч и чда. Растворы готовили
на бидистилляте. Достоверность результатов
оценивали с помощью t-критерия Стьюдента.
Величину Р < 0,05 считали статистически значимой.
результаты и обсуждение
Накопление Са2+ в энергизованных митохондриях изучено как в отсутствие, так и в
присутствии циклоспорина А – ингибитора
митохондриальной поры. В таких же услови41
еКСПеРИМеНТАльНі РОБОТИ
200 200
Ʉɨɥɢɱɟɫɬɜɨ ɢɨɧɨɜ, ɧɦɨɥɶ/ɦɝ
Количество
ионов,
нмоль/мг
белка
Ʉɨɥɢɱɟɫɬɜɨ
ɢɨɧɨɜ,
ɧɦɨɥɶ/ɦɝ
Ⱥ
Ⱥ
1
2
1
2
160 160
120 120
80 80
40 40
0
0
0
50 50 100 100 150 150
0
Количество добавленного
Са2+,
2+
2+
ɋɨɞɟɪɠɚɧɢɟ
ɋɚ
ɜ
ɫɪɟɞɟ,
ɧɦɨɥɶ/ɦɝ
ɋɨɞɟɪɠɚɧɢɟ ɋɚ ɜ ɫɪɟɞɟ,
ɧɦɨɥɶ/ɦɝ
нмоль/мг белка
Ʉɨɥɢɱɟɫɬɜɨ ɢɨɧɨɜ, ɧɦɨɥɶ/ɦɝ
→ [Ca2+] + 2[H+]
(1)
[Ca2+]i + 2[H+]o ←
o
i
В соответствии с данными литературы
[13–16] можно предположить, что подобное
отклонение стехиометрических коэффициентов обмена от теоретического соотношения
1Са2+: 1Н+ обусловлено симпортом фосфата и
протонов, совместно с ионами Са, в матрикс
митохондрий [15,16], либо, возможно, связыванием Са2+ с фосфатом в матриксе [13,14].
В присутствии циклоспорина А в условиях блокирования МРТР кинетические кривые,
отражающие накопление Са2+ в митохондриях,
представляют собой экспоненту и соответствуют характеристикам реакции первого порядка:
снижение концентрации Са2+ в среде отвечает
уравнению C(t) = C0e-kt (рис. 2, кривая 1). В
отсутствие циклоспорина А открывание МРТР
приводит к снижению количества кальция,
накапливаемого митохондриями. Открывание
митохондриальной поры происходит одновременно с транспортом Са2+ через унипортер в
матрикс митохондрий и сопровождается набуханием органелл (рис. 2, кривые 2, 4). При
этом сам по себе транспорт этого катиона почти не вызывает изменений митохондриального
объема (рис. 2, кривые 1, 3). Открывание поры
также сопровождается замедлением накопления Са2+ в митохондриях (рис. 2, кривые 1, 2).
Известно, что открывание МРТР сопровождается нечувствительным к ингибитору
унипортера (рутениевому красному) выходом
Са2+ из митохондрий [18,19]. В данном эксперименте блокирование Са2+-унипортера специфическим ингибитором рутениевым красным
показывает, что в отсутствие циклоспорина А
одновременно с накоплением Са2+ через унипортер, помимо сравнительно медленного нечувствительного к рутениевому красному выхода Са2+ из митохондрий, происходит также
12 12
нечувствительный к нему вход Н+ в митохондриальный матрикс. Нечувствительный к рутениевому красному выход Са2+ из митохондрий, как известно из литературы, может иметь
различную природу. В частности, таковыми
являются Са2+/Н+- и Na+/Са2+-обмен в этих
органеллах [20, 21]. В данной работе оба процесса – выход Са2+ и вход Н+ – обусловлены
140 140
Количество
ионов,
нмоль/мг
белка
Ʉɨɥɢɱɟɫɬɜɨ
ɢɨɧɨɜ,
ɧɦɨɥɶ/ɦɝ
ях эксперимента было определено количество
протонов, высвобождающихся из митохондрий
в ответ на внесение Са2+ в среду инкубации
(рис. 1). Полученные данные показывают, что в
отсутствие циклоспорина А открывание МРТР
приводит не только к сильному ограничению
Са2+-емкости (рис. 1, А), но и к соответствующему снижению выхода ионов Н+ из митохондрий (рис. 1, Б). При этом, как и ранее, в
присутствии циклоспорина А [17] наблюдаемое отношение ионов Са к ионам Н+ составляет 1 : 1, независимо от индукции МРТР, что
вдвое ниже, чем требует стехиометрия обмена:
Ȼ Ȼ
120 120
1
2
1
2
100 100
80 80
60 60
40 40
20 20
0
0
0 0 50 50 100 100 150 150
2+
ɜ ɫɪɟɞɟ,
ɧɦɨɥɶ/ɦɝ
ɋɨɞɟɪɠɚɧɢɟ
ɋɚ2+ɋɚ
Количество
добавленного
Са2+,
ɋɨɞɟɪɠɚɧɢɟ
ɜ ɫɪɟɞɟ,
ɧɦɨɥɶ/ɦɝ
нмоль/мг белка
Рис. 1. Накопление ионов Са (1) энергизованными митохондриями печени крыс и высвобождение
ионов Н (2) в среду инкубации в условиях блокирования (А) и открывания (Б) митохондриальной поры.
Среда инкубации (здесь и ниже, в мМ): 120 KCl, 1 KH2PO4, 5 глутамата Na, 1 мкМ циклоспорина А
(А), 2 трис-HCl-буфер (рН 7,5). По оси абсцисс указано количество добавленного в среду Са2+; по оси
ординат – накопление Са2+ в митохондриях (1) и выход протонов (2) в среду инкубации (M ± m, n = 6,
Р < 0,05)
42
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2008, т. 80, № 3
О. В. АКОПОВА
0,6
0,2
-0,2 0
2
1
20
40
3
60
t, c
-0,6
-1
4
Рис. 2. Накопление Са2+ (кривые 1, 2) и изменение
светопоглощения в суспензии митохондрий (кривые 3, 4) в ходе накопления Са2+ в присутствии
(кривые 1 и 3) и в отсутствие циклоспорина А
(кривые 2 и 4). Концентрация добавленного в инкубационную среду Са2+ – 10 мкМ. Циклоспорин А вносили в концентрации 1 мкМ (n = 4,
Р < 0,05). По оси абсцисс указано время, с; по
оси ординат – изменение концентрации Са2+ в
среде (кривые 1, 2) светопоглощения в суспензии
(кривые 3, 4) в относительных единицах. Начальную концентрацию Са2+ в среде принимали
за 1, минимальную величину светопоглощения в
суспензии – за 1
открыванием поры, о чем свидетельствует их
полное подавление циклоспорином А.
Таким образом, открывание поры обеспечивает обратимость накопления Са2+ в митохондриях: параллельно с аккумуляцией
катиона в матриксе происходит и его высвобождение через пору в среду (рис. 3, кривая 1).
Возможность регистрации нечувствительного
к рутениевому красному выхода Са2+ зависит
от его количества в митохондриях. В условиях
проведенного в данной работе эксперимента
минимальное количество кальция, необходимое для индукции МРТР в митохондриях
печени крыс, составляло ~15 нмоль Са2+/мг
белка. Высвобождение Са2+ в присутствии рутениевого красного сопровождается входом в
матрикс протонов (рис. 3, столбик 2), который, как и выход Са2+, полностью подавляется
циклоспорином А. Для этого нечувствительного к рутениевому красному и подавляемого
циклоспорином А транспорта протонов также
необходимо накопление в митохондриях количества кальция, достаточного для индукции
МРТР.
Повышение концентрации кальция в среде и накопления его в матриксе митохондрий,
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2008, т. 80, № 3
приводит к активации МРТР, что проявляется
в повышении нечувствительного к рутениевому красному выхода Са2+, как и поглощения
протонов митохондриями (рис. 3). Приведенные факты позволяют сделать вывод, что митохондриальная пора функционирует как циклоспоринчувствительный кальций-протонный
обмен, активация которого сопровождается
повышением протонной проводимости митохондриальной мембраны.
Ранее нами было показано [17,22], что
выход Са2+ в условиях деполяризации митохондриальной мембраны в присутствии циклоспорина А затруднен, если не обеспечен
противоток протонов из среды по градиенту
концентраций Н+. Выход Са2+ в этом случае
сопряжен с входом эквивалентного количества
протонов в матрикс [17]. В присутствии циклоспорина А одной лишь деполяризации мембраны после накопления Са2+ недостаточно
для выхода Са2+ и поглощения протонов митохондриями: транспорт Н+ в обмен на ионы
Са наблюдается только в присутствии экзогенного переносчика протонов – СССР [17]. В то
же время в отсутствие циклоспорина А, как
свидетельствуют данные, пермеабилизация
мембраны для ионов Н происходит вследствие
открывания поры, через которую протоны и
попадают в матрикс в обмен на выход Са2+ из
митохондрий в среду (рис. 3). На основании
установленных фактов можно предположить,
что пермеабилизация мембраны митохондрий
для протонов в равной степени необходима
как для высвобождения Са2+ через унипортер,
Количество
Са2+ и ɢɨɧɨɜ,
Н+, нмоль/мг
белка
Ʉɨɥɢɱɟɫɬɜɨ
ɧɦɨɥɶ/ɦɝ
Изменение
Ɂɧɚɱɟɧɢɹ, ɜ ɭɫɥ.отн.
ɟɞ. ед.
светопоглощения,
1
1
2
100
80
60
40
20
0
0
30
60
90
120
150
200
2+
ɋɚ , ɧɦɨɥɶ/ɦɝ
Рис. 3. Нечувствительное к рутениевому красному высвобождение Са2+ из митохондрий (столбик 1) и вход протонов в матрикс (столбик 2)
в отсутствие циклоспорина А (n = 4, M ± m).
Данные достоверны, Р < 0,05
43
еКСПеРИМеНТАльНі РОБОТИ
так и через митохондриальную пору. Однако,
в отличие от Са2+-унипортера, для реверсии
которого необходимо присутствие экзогенного протонофора, митохондриальная пора, обладающая собственной протонной проводимостью, способна обеспечить независимо от
унипортера трансмембранный обмен ионов Са
из матрикса на ионы Н из внемитохондриальной среды. Кроме того, закономерно предположить, что именно протонная проводимость
МРТР может обеспечивать в физиологических
условиях реверсию унипортера и быстрый выход кальция в случае Са2+-индуцированной
деполяризации митохондрий [3]. Результаты
проведенного эксперимента показывают, что
этот чувствительный к циклоспорину А кальций-протонный обмен индуцируется ионами
Са при накоплении их в матриксе в концентрациях, превышающих базальный уровень.
Активация МРТР с повышением концентрации Са2+, вносимого в суспензию (рис.
3), приводит к снижению времени удерживания Са2+ в матриксе и к ускорению выхода
его из митохондрий (рис. 4, А; кривые 1–3).
Так, если в условиях накопления небольших
добавок катиона Са2+ (~30 нмоль/мг) кинети-
10
3
3
0
2
50
2
40
30
20
1
10
0
Ⱥ
0 20
0
1
40
20
60
40
20
0
60
40
80
60
ɇɚɤɨɩɥɟɧɢɟ ɢɨɧɨɜ, ɧɦɨɥɶ/ɦɝ
20
2+
30
ɋɚ , ɧɦɨɥɶ/ɦɝ
2+
ɋɚ , ɧɦɨɥɶ/ɦɝ
60
50
ɇɚɤɨɩɥɟɧɢɟ ɢɨɧɨɜ, ɧɦɨɥɶ/ɦɝ
70
60
40
Ȼ
Ⱥ
70
ческие характеристики транспорта приближаются к механизму обратимой реакции первого
порядка (обмена между матриксом и средой,
→ В, рис. 4, А; кривая 1), в которой пряА ←
мая реакция соответствует накоплению кальция через унипортер, а обратная – выходу его
через пору, то с увеличением концентрации
Са2+ процесс аккумуляции катиона в матриксе приобретает характеристики последовательного механизма накопления через унипортер
и высвобождения через пору: А → В → С [23]
(рис. 4, А; кривые 2, 3). В данной работе параметры двух экспоненциальных кривых, отражающих накопление Са2+ в митохондриях:
C(t) = C2exp(-k2t) – C1exp(-k1t) (2) (рис. 4, А;
кривые 2, 3), получены путем последовательной линеаризации экспериментальных зависимостей C(t) в координатах lnC – t (параметры
C2, k2) и ln|C(t) – C2exp(-k2t)| – t (параметры C1,
k1) [23]. Найденные графически значения C1,
C2, k1, k2 для кривых 2 и 3 (рис. 4, А) приведены
в подписи к рисунку. В случае обратимой реакции первого порядка для накопления Са2+ в матриксе: C(t) = k1C0(k1 + k -1)-1(1 – exp(-(k1 + k -1)t)
(3), константы скорости k1 и k -1, входящие в
уравнение (3), находили экспериментально пу-
0
t, c
80
t, c
Ȼ
60
2
40
2
1
20
0 20
0
1
40
20
60
40
t, c
60
t, c
Рис. 4. Изменение содержания Са2+ в матриксе (А, Б) и Н+ в среде инкубации (Б) в ходе энергозависимого накопления Са2+ в митохондриях в условиях открывания МРТР. Концентрация добавленного в
среду Са2+: 40 нмоль/мг (А, кривая 1), 60 нмоль/мг (А, кривая 2), 90 нмоль/мг (А – кривая 3; Б – кривые 1, 2, n = 4, Р < 0,05). Пунктиром обозначены расчетные кривые для обратимого (А, кривая 1)
и последовательного (А, кривые 2, 3; Б, кривые 1, 2) механизмов накопления Са2+ и Н+. Параметры,
входящие в уравнения (2)–(3), определяли из экспериментальных данных. Для обратимой реакции первого порядка (2) k1 = 5,58⋅10 -2 c-1; k-1 = 3,0⋅10 -2 c-1 (A, кривая 1). Для последовательного механизма (2):
C1 = 94,6, C2 = 66,7, C ∞ = 30; k1 = 6,2⋅10 -2 c-1, k2 = 2,8⋅10 -2 c-1 (A, кривая 2); C1 = C2 =100, C ∞ = 0;
k1 = 0,3 c-1; k2 = 4,12⋅10 -2 c-1 (A, 3; Б, 1); C1 = 120; C2 = 138; C ∞ = 20; k1 = 0,14 c-1; k2 = 4,6⋅10 -2 c-1 (Б,
кривая 2). С ∞ – константа, учитывающая неполный выход Са2+ либо вход Н+ (n = 4, Р < 0,05)
44
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2008, т. 80, № 3
О. В. АКОПОВА
тем блокирования поры циклоспорином А (k1)
и унипортера рутениевым красным (k -1) соответственно.
Активация МРТР приводит к необратимому высвобождению Са2+ из митохондрий в
среду. Этот процесс отражается на повышении
константы k2 – уравнение (2). Таким образом,
активация МРТР значительно ограничивает
Са2+-емкость митохондрий (рис. 1) и приводит
к резкому сокращению времени удерживания
кальция в митохондриальном матриксе, что
и подтверждают экспериментальные кривые
(рис. 4, А; кривые 2, 3).
Полученные в настоящей работе данные показывают, что в условиях открывания
МРТР транспорт Са2+ во всех случаях сопровождается одновременным противоположно направленным переносом протонов через
мембрану митохондрий. Так, накопление Са2+
через унипортер и выход катиона через пору
сопровождается экструзией протонов из матрикса через комплексы дыхательной цепи и их
последующим возвратом в матрикс через митохондриальную пору, обладающую, как показано выше, протонной проводимостью (рис. 4,
Б; кривые 1, 2). При этом кинетические характеристики транспорта ионов водорода близки
к таким же характеристикам транспорта кальция (рис. 4, Б).
Результаты проведенного исследования
позволяют оценить роль митохондриальной
поры в механизмах транслокации ионов Са в
митохондриях и свидетельствуют о важной в
физиологических условиях функции МРТР –
механизма, который обеспечивает быстрый
обмен кальция между митохондриями и средой, а также регуляцию Са2+-емкости, митохондриального объема и внутримитохондриального рН.
Уже в ранних исследованиях транспорта
Са2+ было обнаружено, что блокирование Са2+унипортера рутениевым красным не способно
полностью предотвратить утечку катиона из
митохондрий, в частности после сброса мембранного потенциала. Природа этого явления
долго оставалась непонятной [18, 19]. К настоящему времени известен ряд механизмов,
нечувствительных к рутениевому красному и
способных, помимо унипортера, обеспечивать
выход кальция из митохондриального матрикса: Na+/Са2+- и H+/Са2+-обмен [21, 22], а также
присутствующие в мембране жирные кислоты, связывающие Са2+ и опосредующие перенос протона через мембрану [24]. В условиях
эксперимента, проведенного в данной работе,
одновременное блокирование поры и унипорISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2008, т. 80, № 3
тера циклоспорином А и рутениевым красным
соответственно приводит к полному блокированию выхода Са2+ даже после деполяризации
мембраны протонофором СССР, тогда как в
условиях блокирования одного лишь унипортера для высвобождения Са2+ не требовалось
ни полного сброса ΔΨm, ни внесения в среду
СССР (рис. 3). Приведенные результаты свидетельствуют, что, помимо митохондриальной
поры, другие механизмы кальциевого обмена
не вносят заметного вклада в выход Са2+ из органелл в ходе проведенного эксперимента. Таким образом, в настоящей работе убедительно
показано, что митохондриальная пора, обладающая протонной проводимостью и обеспечивающая Са2+/Н+-обмен, необходимый для
выхода Са2+ из митохондрий, наряду с Са2+унипортером, является основным механизмом высвобождения значительного количества
кальция из митохондриального матрикса.
В то же время, следует отметить, что понимание роли МРТР как механизма, обеспечивающего транспорт протонов в обмен на
ионы Са, сталкивается с определенной проблемой теоретического характера. Исходя из
общепринятых в настоящее время представлений об МРТР как об ионном канале, активируемом ионами Са [4], трудно предположить
возможность одновременного транспорта одноименно заряженных Са2+ и Н+ через этот
канал в противоположных направлениях [25].
Для объяснения наблюдаемых процессов следует, по-видимому, предположить существование протонного циклоспоринчувствительного
канала в мембране митохондрий, функционирование которого сопряжено с открыванием
МРТР.
В физиологических условиях именно
МРТР может являться механизмом, способным обеспечить обмен ионами Са между
матриксом и средой в условиях небольших
колебаний ΔΨm, недостаточных для реверсии
Са2+-унипортера. Закономерно высказать предположение, что роль МРТР не сводится только
лишь к инициированию процесса клеточной
деградации (апоптоза) и развития различных
патологических состояний организма. Результаты данной работы свидетельствуют о физиологической роли митохондриальной поры как
механизма поддержания баланса между цитозольным и митохондриальным уровнем Са2+ за
счет кальций-протонного обмена вследствие
спонтанного повышения протонной проводимости мембраны при накоплении Са2+ в матриксе, превышающих некоторые пороговые величины. «Отключение» этого механизма, как
45
еКСПеРИМеНТАльНі РОБОТИ
показывают результаты наших собственных
исследований [26], может приводить к Са2+-перегрузке митохондрий вследствие повышения
их Са2+-емкости и соответственно к гиперпродукции активных форм кислорода, окислительному стрессу и нарушению метаболизма
в этих органеллах. Влияние рассматриваемого
механизма транспорта Са2+ на сопряженность
процессов энергетического обмена в митохондриях – субстратного окисления и окислительного фосфорилированя – предполагается
выявить в наших дальнейших исследованиях.
роль мітохондріальної пори
у трансмембранному обміні
кальцію в мітохондріях
О. В. Акопова
Інститут фізіології ім. О. О. Богомольця
НАН України, Київ;
e-mail: circul@biph.kiev.ua
Досліджено накопичення Ca2+ в енергізованих мітохондріях печінки щурів в умовах
відкриття мітохондріальної пори (mitochondrial
permeability transition pore, МРТР). Як і за умов
блокування МРТР циклоспорином А, накопичення Ca2+ супроводжується виходом Н+ у
середовище інкубації. Незалежно від МРТР,
співвідношення між Ca2+ та Н+ становить 1 : 1.
Показано, що відкриття МРТР стрімко знижує Ca2+-ємність мітохондрій від 400 до 80–
100 нмоль/мг. За відсутності циклоспорину А
накопичення іонів кальцію супроводжується
нечутливим до інгібітора Ca2+-уніпортера рутенієвого червоного вивільненням Ca2+ і, відповідно, нечутливим до рутенієвого червоного,
але чутливого до циклоспорину А входом Н+
до матриксу мітохондрій. Кальцій-протонний
обмін, чутливий до циклоспорину А, відбувається в разі накопичення в мітохондріях такої кількості кальцію, яка перевищує базальний рівень. Отже, показано, що, на відміну від
Ca2+-уніпортера, мітохондріальній порі притаманна власна протонна провідність, а її відкриття забезпечує обмін іонів Са між мітохондріями та середовищем, що супроводжується
протилежно спрямованим транспортуванням
протонів до матриксу. Дійшли висновку, що
відкриття МРТР за фізіологічних умов є важливим механізмом регуляції Ca2+-ємності мітохондрій та мітохондріального рН.
К л ю ч о в і с л о в а: мітохондрії, пора,
Ca2+-уніпортер, транспортування Ca2+ та Н+,
Ca2+-ємність.
46
the role of permeability
transition pore in
transmembrane ca2+-exchange
in mitochondria
O. V. Akopova
Bogomolets Institute of Physiology, National
Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv;
e-mail: circul@biph.kiev.ua
Summary
Ca2+-uptake accompanied with mitochondrial
permeability transition pore (MPTP) opening is
studied in rat liver mitochondria. In conditions of
MPTP opening, as well as in conditions of MPTP
blockage by cyclosporine A (CsA), Ca2+-uptake in
mitochondria is counterbalanced by proton efflux
into incubation medium. Independent of MPTP
opening, observed stoichiometry of this exchange
is 1Ca2+ : 1H+. MPTP opening dramatically decreases Ca2+-uptake in mitochondria: from ~400
nmol/mg protein in the presence of CsA to ~80÷100
nmol/mg protein due to the increased mitochondrial membrane permeability. In the absence of
CsA Ca2+-uptake is accompanied by the insensitive
to Ca2+-uniporter blocker, ruthenium red (RR),
release of Ca2+ from mitochondria which corresponds to as well RR-insensitive, but sensitive to
CsA uptake of H+ into mitochondrial matrix.
This calcium-proton exchange resulting from
MPTP opening is observed only when Ca2+ uptake into matrix exceeds some basal level. The data
are consistent with an assumption that, contrary
to Ca2+-uniporter, MPTP has its own proton conductance. MPTP opening provides exchange of
Ca2+ between mitochondria and medium which is
coupled to the counterflow of protons into matrix
space. Obtained data elucidate the physiological
role of MPTP as regulatory mechanism for control
of Ca2+-uptake level and intramitochondrial pH.
K e y w o r d s: mitochondrial pore, Ca2+-uniporter, Ca2+, H+, transport, Ca2+-uptake.
1. Скулачев В. П. Энергетика биологических
мембран. – М.: Наука, 1989. – 564 с.
2. Berridge M. J., Lipp P., Bootman M. D. // Nat.
Rev. Mol. Cell Biol. – 2000. – 1. – P. 11–21.
3. Kостюк П. Г., Костюк О. П., лук’янець О. А.
Іони кальцію у функції мозку – від
фізіології до патології. – К.: Наук. думка,
2005. – 198 с.
4. O’Rourke B. // J. Physiol. – 2000. – 529. –
Р. 23–36.
5. Bernardi P. // Physiol. Rev. – 1999. – 79. –
Р. 1127–1155.
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2008, т. 80, № 3
О. В. АКОПОВА
6. Сrompton M., Barksby E., Johnson N., Capano M. // Biochimie. – 2002. – 84, N 2. –
P. 143–152.
7. Кroemer G., Zamzami N., Susin S. A. //
Immunol. Today. – 1997. – 18. – Р. 44–51.
8. Weiss J. N., Korge P., Honda H. M., Ping P. //
Circ. Res. – 2003. – 93. – Р. 292–301.
9. Garlid K. D. // Basic Res. Cardiol. – 2000. –
95. – P. 275–279.
10. Korge P., Honda H. M., Weiss J. N. // Proc.
Natl. Acad. Sci. USA. – 2002. – 99, N 5. –
P. 3312–3317.
11. Gunter T. E., Yule D. I., Gunter K. K. et al. //
FEBS Lett. – 2004. – 567. – P. 96–102.
12. Mitchell P. // Biol. Rev. – 1966. – 41. – P. 445–
456.
13. Pozzan T., Bragadin M., Azzone G. F. // Eur. J.
Biochem. – 1976. – 71. – P. 93–99.
14. Fiskum G., Lehninger A. L. // J. Biol. Chem. –
1979. – 254. – P. 6236–6239.
15. Виноградов А. Д., лейкин Ю. Н. // Биохимия. –
1971. – 36, № 5. – С. 1061–1067.
16. Chance B. // J. Biol. Chem. – 1965. – 240. –
P. 2729–2736.
17. Акопова О. В. // Укр. біохім. журн. – 80,
№ 2. – 2008.
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2008, т. 80, № 3
18. Puskin J. S., Gunter T. E., Gunter K. K.,
Russell Ph. R. // Biochemistry. – 1976. – 15. –
P. 3834–3842.
19. Broekemeier K. M., Pfeiffer D. R. // Ibid. –
1995. – 34. – P. 16440–16449.
20. Wingrove D. E., Gunter T. E. // J. Biol. Chem. –
1986. – 261. – P. 15166–15171.
21. Wingrove D. E., Gunter T. E. // Ibid. –
P. 15159–15165.
22. Акопова О. В., Сагач В. Ф. // Укр. біохім.
журн. – 2007. – 79, № 1. – С. 58–67.
23. Березин И. В., Мартинек К. Основы
физической химии ферментативного катализа. – М.: Высш. школа, 1977. – 280 с.
24. Skulachev V. P. // Biochim. Biophys. Acta. –
1998. – 1363. – P. 100–124.
25. Мембраны: ионные каналы / Под ред.
Ю. А. Чизмаджев. – М.: Мир, 1981. –
320 с.
26. Акопова О. В., Коцюруба А. В., Ткаченко Ю. П.,
Сагач В. Ф. // Фізіол. журн. – 2005. – 51. –
С. 3–11.
Получено 11.03.2008
47