1 Оптогенетический подход в изучении механизма глутаматной нейротоксичности. Сурин А.М., (Москва, ФГБНУ «НИИОПП») При патологиях мозга (инсульте, черепно-мозговой травме, и некоторых нейродегенеративных заболеваниях) вокруг очага поражения возникает зона полутени (пенумбра), в которой изменения еще не приобрели необратимый характер. Зона очага со временем расширяется, и задача состоит в помощи организму терапевтическими средствами как можно сильнее затормозить расширения очага, предотвратив гибель нейронов в пенумбре. Каждая из этих зон имеет морфологические и биохимические характеристики. Методами микродиализа установили, что гибель клеток в пенумбре вызвана гиперактивацией ионотропных глутаматных рецепторов NMDA-типа, поэтому усилия направили, прежде всего, на поиск специфичных ингибиторов этих рецепторов. Однако выяснилось, что терапевтический эффект ингибиторов невелик, но при этом значительно ухудшаются когнитивные способности пациентов, а в ряде случаев, происходит увеличение зоны поражения. Поэтому были предприняты всесторонние систематические исследования процессов в пенумбре с привлечением широкого спектра биохимических и биофизических методов. Незаменимой моделью в этих исследованиях служат первичные нейрональные культуры из различных разделов мозга. Было показано, в том числе с участием нашего коллектива, что длительное действие высоких доз глутамата (Glu), имитирующих межклеточную концентрацию Glu в пенумбре, вызывает дисрегуляцию Са2+ гомеостаза, представляющего собой двух-фазное увеличение концентрации Са2+ ([Са2+]). Наличие второй фазы, т.н. отсроченной Са2+ дисрегуляции, коррелировало с последующей гибелью нейронов. Предотвращение избыточного входа Са2+ и развития Са2+ дисрегуляции спасало нейроны от гибели. Однако оставалось много нерешенных проблем, прежде всего связанных с ролью митохондрий в Са 2+ дисрегуляции поскольку эти органеллы являются главным источником АТФ для поддержания ионного гомеостаза Са2+ и Na+ насосами. Кроме того, в нейронах митохондрии служат основным Са2+ депо, оберегающим цитозоль от Са2+ перегрузки. Ранее были представлены результаты применения методов оптогенетики в сочетании с традиционными флуоресцентными красителями для выяснения механизмов регуляции ионного гомеостаза в нейронах, подвергнутых 2 действию нейротоксических доз глутамата (Khodorov et al, 2012; Сурин и соавт, 2014). Кроме того, совместное применение синтетических флуоресцентных зондов и флуоресцентных белковых сенсоров позволило обнаружить принципиальные различия в биоэнергетике культивируемых нейронов, полученных из эмбрионов по сравнению с культурами из новорожденных крыс (Surin et al, 2013). В докладе, посвященном 70-летию РАМН, эти представлены результаты исследований, выполненных в развитие описанного направления. Нам (совместно с Научным центром здоровья детей) впервые удалось получить нейрональные культуры, экспрессирующие АТФ-сенсор в матриксе митохондрий. Это позволило исследовать изменения концентрации АТФ ([ATP]) именно там, где происходит его синтез его основной доли – в матриксе митохондрий. Измерения были выполнены в покоящихся нейронах, а также в условиях, имитирующих инсульт (глюкозная депривация, ингибирование дыхания, гиперактивация глутаматных рецепторов). На Рис. 1 представлены изображения участка клеточной культуры, нагруженной индикатором на ионы Са2+ (верхнее красное изображение) и содержащей нейроны, экспрессирующие флуоресцентный АТФ-сенсорный белок в митохондриях (среднее зеленое изображение). Нам удалось подобрать условия, позволившие использовать АТФ-сенсор не только для измерения концентрации АТФ в митохондриях, но и для мониторинга рН внутри митохондрий (Рис. 1, правая нижняя панель). Последнее важно потому, что разность рН между митохондриями и цитозолем в совокупности с электрическим потенциалом характеризующего энергетическое состояние митохондрий. На Рис.1 графики изменений [Ca2+]i , [ATP] и рН представлены справа от соответствующих изображений. Полученные результаты показывают, что блокада гликолиза не устраняет синтез АТФ в течение 1020минут и только остановка дыхания в отсутствии глюкозы прекращает синтез АТФ в митохондриях. Это свидетельствует о том, что при отсутствии гликолиза и, соответственно, основного субстрата митохондрий пирувата, нейроны способны несколько минут обеспечивать цикл Кребса другим субстратом, вероятно, цитозольным глутаматом в результате активации GluGABA-цикла (цикла Робертса). 3 [Ca2+] [ATP] pH Рис. 1. Изображения поля культивируемых гиппокампальных нейронов, которые экспрессируют, АТФ/рН-чувствительный зеленый флуоресцентный белок в митохондриях и окрашены Са2+ индикатором (X-rhod-FF). Справа показаны соответствующие сигналы, вызванные удалением глюкозы, блокадой дыхательной цепи митохондрий цианидом и высокой концентрацией Glu : красным цветом изменения рН в матриксе митохондрий, целенным – изменения рН в цитозоле, сиреневым – изменения [ATP] в цитозоле и синим – средние по клетке изменения [Ca2+]i. Флуоресценцию Xrhod-FF возбуждали при 565нм и регистрировали при 635нм. Изменения [Ca2+]i определяли как относительные изменения интенсивности флуоресценции (F/Fo), где F – текущее значение интенсивности, а Fo – исходное в начале эксперимента. Изменения рН цитозоля (рНс) определяли как относительные изменения интенсивности флуоресценции АТФ-сенсора (F/Fo), где F – текущее значение интенсивности, а Fo – исходное в начале эксперимента; возбуждение и испускание, соответственно 485 и 525нм. При регистрации изменений [ATP] не вводили поправку на зависимость рэйшиометрического сигнала АТФ-сенсора от рН. 4 Изменения [АТФ] обратимы (Рис. 1, правая средняя панель), если не сопровождаются ростом [Ca2+]i (Рис. 1, правая верхняя панель). Стимуляция глутаматных рецепторов, приводит как к падению [ATФ] , так и росту [Ca2+]i и поэтому снижение [ATФ] более продолжительное и не устраняемое даже экзогенным пируватом. Из данных, представленных на Рис. 1, можно заключить, что в условиях ограниченного доступа глюкозы и кислорода снижение поступающего в нейроны Са2+ будет помогать нейронам выжить после глутаматного воздействия. Изменения [Ca2+]i, [ATP] и рН (Рис. 1) в митохондриях, в совокупности с данными по изменению рН в цитозоле и митохондриального потенциала (Khodorov et al, 2012; Сурин и соавт, 2014) указывают на то, что одним из пусковых факторов отсроченной кальциевой дисрегуляции является увеличения протонной проводимости внутренней мембраны митохондрий. Традиционно исследования лаборатории патологии ионного транспорта и внутриклеточной сигнализации НИИОПП были сосредоточены на регулировании ионного гомеостаза основных неорганических катионов – Са2+, Na+ и Н+. Создание чувствительных и специфичных белковых флуоресцентных сенсоров на ионы хлора, основного неорганического аниона всех эукариотических клеток, позволило исследовать одновременно с гомеостазом указанных катионов. гомеостаз - Cl На Рис. 2 представлены результаты одновременных измерений [Ca2+], [Cl-] и pH в цитозоле гиппокампальных нейронов при воздействии тормозящего нейротрансмиттера гамма-аминомасляной кислоты (GABA, 100 мкМ), при деполяризации плазматической мембраны с помощью KCl (50мМ) и в условиях глутаматной нейротоксичности (Glu, 30мкМ). Видно, что активация проницаемых для ионов хлора GABA-управляемых каналов (GABAAрецепторов) не повлияла ни на один из измеряемых параметров [Ca2+] (левая верхняя панель), [Cl-] (правая верхняя панель), рН (левая нижняя панель). Измерения [АТФ], выполненные по аналогичному протоколу на сестринской культуре (правая нижняя панель), также показали отсутствие изменений [АТФ] в цитозоле . 5 [Ca2+] [Cl-]c pH c [ATP] Рис.2. Влияние возбуждающего (Glu, 30мкМ) и тормозящего (GABA, 100мкМ) нейромедиаторов, и деполяризации мембран на концентрации ионов Сa2+, Cl-, Н+ и АТФ в цитозоле культивируемых нейронов гиппокампа. Деполяризацию плазматической мембраны достигали эквимолярной заменой NaCl в буфере на 50мМ KCl. Флуоресценцию X-rhod-FF возбуждали как описано на Рис. 1. Изменения рН цитозоля (рНс) определяли как относительные изменения интенсивности флуоресценции хлорного сенсора (F/Fo), где F – текущее значение интенсивности, а Fo –исходное в начале эксперимента; возбуждение и испускание, соответственно 485 и 525нм. При регистрации изменений [ATP] не вводили поправку на зависимость рэйшиометрического сигнала АТФ-сенсора от рН. Деполяризация плазматической мембраны вызывает быстрые, легко обратимые подъемы [Ca2+], [Cl-] и [H+], не приводящие к падению [АТФ] (Рис.2). Из этого следует, что поддержание гомеостаза ионов хлора в отсутствие глутамата не требует больших затрат АТФ. Напротив, даже кратковременная аппликация нейротоксической дозы Glu, индуцировала сразу рост [Ca2+], [Cl-] и [H+] и стремительное снижение [АТФ] (Рис.2). Эти 6 данные указывают на критическую роль потенциала плазматической мембраны и поступления в нейроны Са2+ для поддержания баланса ионов хлора. Представленные результаты по хлорному гомеостазу демонстрируют необходимость мультипараметрических измерений и учета действия возбуждающих и тормозящих нейромедиаторов для исследования клеточных механизмов нейротоксичности и эпилептогенеза. Цитированная литература Khodorov, B.I., Mikhailova, M M., Bolshakov, A P., Surin, A.M., Sorokina, E.G., Rozhnev, S.A., and Pinelis, V.G. (2012). Dramatic effect of glycolysis inhibition on the cerebellar granule cells bioenergetics. Biochemistry (Mosc.) Suppl. Series A: Membrane Cell. Biol. 6, 186-197. A.M. Surin, S. Khiroug, L.R. Gorbacheva, B.I. Khodorov, V.G. Pinelis and L. Khiroug (2013). Comparative analysis of cytosolic and mitochondrial ATP synthesis in embryonic and postnatal hippocampal neuronal cultures. Front. Mol. Neurosci. 5:102. doi: 10.3389/fnmol.2012.00102. Epub 2013 Jan 10. Сурин А.М., Горбачева Л.Р. , Савинкова И.Г., Шарипов Р.Р., Ходоров Б.И., Пинелис В.Г. (2014) Исследование изменений [АТФ] в цитозоле индивидуальных нейронов при развитии глутамат-индуцированной дизрегуляции кальциевого гомеостаза. Биохимия.2014.- Т 79, №2. - С. 196-208.