МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ УКРАИНЫ СУМСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ УКРАИНЫ
СУМСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ
Каплин Николай Никитович
Ивахнюк Татьяна Васильевна
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
по теме: «Морфология микроорганизмов. Методы изучения морфологии и размеров
бактериальной клетки. Световая микроскопия. Простые методы окраски»
для студентов 2 курса медицинского института
дневной формы обучения
дисциплина: «Микробиология, вирусология и иммунология»
СумГУ - 2015
1
Тема: Морфология микроорганизмов. Методы изучения морфологии и размеров
бактериальной клетки. Световая микроскопия. Простые методы окраски.
Актуальность темы: Микробиологическая диагностика в первую очередь необходима для
определения причины
инфекционных заболеваний. Существует 5 основных методов
лабораторной
диагностики:
микроскопический, бактериологический, биологический,
серологический и аллергический. Принципами изучения морфологии и тинкториальных свойств
необходимо владеть каждому практикующему врачу.
Цель занятия: Освоить правила и режим работы в микробиологической лаборатории.
Овладеть техникой микроскопирования микробиологических препаратов с помощью
иммерсионной системы микроскопа. Овладеть методикой приготовления фиксированных
препаратов из культур, выращенных на жидких и плотных питательных средах.
Вопросы для обсуждения
Правила работы в микробиологической лаборатории.
Предмет, задачи и методы исследования микробиологии.
Исторические этапы формирования микробиологии как общебиологической
дисциплины.
4.
Основные отличия прокариотических и эукариотических клеток.
5.
Специфические черты бактерий
использующиеся
для
систематики
микроорганизмов.
6.
Наменклатура и классификация микроорганизмов.
7.
Классификация микроорганизмов.
8.
Многообразие форм бактериальных клеток.
9.
Этапы приготовления мазка-препарата бактериальных культур.
10.
Классификация красителей, используемых в микробиологической практике.
11. Простые методы окраски микробиологических препаратов.
1.
2.
3.
Практическая работа студентов
Работа 1. Ознакомиться с правилами работы в микробиологической лаборатории.
Работа 2. Изучение основного лабораторного оборудования, которое используется в
микробиологической лаборатории.
Работа 3. Повторить строение микросокпа.
Работа 4. Сравнить морфологию основных групп микроорганизмов.
Работа 5. Знакомство с иммерсионным методом микроскопирования окрашенного
препарата (Staphylococcus pyogenes, окрашенного генциан-виолетом).
Работа 6. Овладеть методом приготовления и простой окраски микропрепаратов.
Работа 7. Микроскопия приготовленных и окрашенных простыми методами препаратов из
агаровой культуры S.aureus и бульонной культуры E.coli.
Работа 1.
Алгоритм практической работы студентов
Правила работы в учебной микробиологической лаборатории
1. При работе в лаборатории с бактериологическим материалом необходимо
тщательно соблюдать правила личной и общественной безопасности при ее выполнении.
2.
В помещение учебной микробиологической лаборатории лаборатории
нельзя входить без специальной одежды – халата, белой шапочки, сменной обуви.
3.
Нельзя вносить в лабораторию посторонние вещи.
4.
Запрещается надевать верхнюю одежду платье на халат.
2
5.
В помещении микробиологической лаборатории категорически запрещается
курить, принимать пищу, хранить продукты питания.
6.
В помещении лаборатории необходимо строго соблюдать чистоту и
порядок. На рабочем столе не должно быть посторонних предметов. Запрещаются
излишние разговоры, суета и использование мобильных телефонов.
7.
Каждый студент имеет в лаборатории постоянное рабочее место и
микроскоп для работы.
8.
Материал для работы принимают дежурные по группе у лаборанта и в его
присутствии раздают студентам.
9.
В конце занятия студенты сдают весь материал дежурным, которые в
свою очередь сдают его преподавателю или лаборантам кафедры.
10.
Все предметы, которые были использованы при работе
с живыми
микроорганизмами (петли, пипетки, предметные стекла и др.) должны быть сразу
обеззаражены либо прожигаем в пламени спиртовки (петли), либо погружаем в
дезинфицирующий раствор.
11.
Если студент случайно разобьет пробирку с микроорганизмами он обязан
немедленно сообщить об этом преподавателю и вместе с ним обеззаразить рабочее место.
12.
В конце занятия студент должен:
а) привести в порядок рабочее место;
б) сдать дежурному весь материал и микроскоп;
в) вымыть руки с мылом при необходимости с дезинфицирующим раствором;
г) представить отчет о проделанной работе на подпись преподавателю.
Работа 2. Лабораторное оборудование, используемое в микробиологической
лаборатории
а. Чашка Петри.
б. Предметное стекло.
в. Покровное стекло.
г. Бактериологическая игла.
д. Бактериологическая петля.
Работа 3. Строение светового микроскопа:
1. Оптическая система включает объектив и окуляр.
а) Объектив - это система линз, вставляемая в тубус снизу и непосредственно
направляемая на объект (отсюда - и название). Обычные увеличения объектива: х8 , х20,
х40 (сухие объективы), х90 (иммерсионный объектив).
б) Окуляр вставляется в тубус сверху. Применяются окуляры с увеличением х7, х10,
х15.
в) Результирующее увеличение микроскопа - произведение увеличений объектива и
окуляра, например:
20 х10 = 200 раз.
3
г) Таким образом, функция оптической системы - формирование увеличенного
изображения препарата на сетчатке глаза наблюдателя.
2. Осветительная система - источник света, зеркало, конденсор и диафрагма.
а) Источник света может быть встроен в микроскоп, а может находиться и вне
микроскопа (пример - обычная настольная лампа).
б) Зеркало собирает лучи от источника и направляет их на препарат снизу (Одна
поверхность зеркала - плоская, вторая - вогнутая; последняя используется при
искусственном освещении).
в) Конденсор состоит из линз, которые фокусируют лучи света на препарате.
Поднимая и опуская конденсор (с помощью винта), можно настраивать фокусировку
лучей.
г) Диафрагма вмонтирована в конденсор; это система непрозрачных пластинок с
отверстием посередине. Она ограничивает световой поток, падающий на препарат.
При использовании объективов с большим увеличением отверстие диафрагмы
следует уменьшить - для ослабления сферической аберрации.
3. Механическая система - тубус, штатив, колонка и предметный столик.
а) С колонкой связаны макро- и микрометрический винты. Они поднимают и
опускают тубус для фокусировки изображения объекта на сетчатке глаза наблюдателя.
Макровинт используется при работе на малом увеличении, а микровинт - на
большом.
б) Предметный столик может перемещаться в горизонтальной плоскости, что
позволяет менять участки препарата, попадающие в поле зрения.
В итоге, световые лучи проходят следующий путь:
источник
препарат
света
объектив
тубус
зеркало
окуляр.
конденсор
диафрагма
Т.е. микроскопия ведётся в проходящем свете, для чего препарат должен быть достаточно
тонким. Заметим также, что микроскоп даёт перевёрнутое изображение объекта.
4
Устройство светового микроскопа:
1 - окуляр,
2 - тубус,
3 - тубусодержатель,
4 - винт грубой наводки,
5 - микрометренный винт,
6 - подставка,
7 - зеркало,
8 - конденсор, ирисовая диафрагма и
светофильтр,
9 - предметный столик,
10 - револьверное устройство,
11 – объектив
Работа 4. Сравнительная морфология основных групп микроорганизмов.
При иммерсионном микроскопировании рассмотрите (используя таблицу) и зарисуйте в
таблицу 1 морфологические группы микроорганизмов окрашенные различными
способами.
Таблица 1 Протокол исследования
Морфологические группы
Способ окраски
Рисунок
Микрококки
Диплококки
Стрептококки
Стафилококки
Сарцины
Палочки
Стрептопалоки
Вибрионы
Спирохеты
5
Streptococcus pyogenes,
окраска генциан-виолетом
Staphylococcus epidermidids,
окраска генциан-виолетом
Neisseria gonorrhоeaе,окраска
фуксином Пфайффера
Clostriduim botulinum,
окраска генциан-виолетом
Corynebacterium diphtheriae,
окраска генциан-виолетом
Escherichia coli,окраска
фуксином Пфайффера
Vibrio cholerae, окраска
фуксином Пфайффера
Spirochetta buccalis, окраска
генциан-виолетом
Работа 5
Метод иммерсионной микроскопии
Важнейшей характеристикой каждого объектива, как и любой оптической системы,
является его разрешающая способность. Под разрешающей способностью понимают
минимальное расстояние между двумя точками, при котором они еще видны
раздельно, т. е. не сливаются в одну.
Иммерсионные объективы используются для изучения объектов невидимых или
плохо видимых через сухие системы микроскопа.
6
Основные этапы работы:
1)
подготовка микроскопа для работы: поднять конденсор до упора
предметного столика, полностью открыть диафрагму, поставить плоское (при
естественном) или вогнутое (при искусственном освещении) зеркало;
2)
осветить поле зрения под контролем объектива х 8;
3)
нанести на препарат маленькую куплю масла, положить препарат на столик
микроскопа и закрепить, поставить иммерсионный объектив.
4)
Глядя на столик сбоку, медленно опустить макровинтом объектив до
соприкосновения с маслом и немного погрузить в него. Затем, глядя в окуляр, очень
медленно поднимать тубус макровинтом, до появления объекта; опускать объектив
макровинтом глядя в окуляр, нельзя! Четкость изображения достигается с помощью
микровинта;
4.) приготовьте объект для иммерсионной микроскопии, рассмотрите его и
заполните протокол исследования в таблице 1.
Таблица 2 Протокол исследования
Исследуемый материал
Иммерсионная микроскопия
Рисунок
Метод окраски
Краткая справка для студентов
При появлении в поле зрения пузырьков операцию настройки (соприкосновение
фронтальной линзы с иммерсией) необходимо повторить.
При нехватке света открыть апертурную диафрагму конденсора полностью и
зеркалом (при наличии такового) установить наилучшую освещенность, после этого
апертурную диафрагму целесообразно немного прикрыть.
Применение вместо кедрового масла других масляных иммерсий не рекомендуется,
так как если показатель преломления используемой иммерсии (например, вазелинового
масла с показателем 1,48162) отличается от показателя преломления кедрового масла
(показатель 1,515), то возможно снижение контраста и нечеткость изображения, а также
уменьшение разрешающей способности. После окончания работы не оставляйте объектив
в иммерсионной жидкости и не забывайте после работы производить чистку фронтальной
(первой) линзы объектива и конденсора.
Порядок чистки. Иммерсионные объективы обязательно должны после
использования подвергаться чистке с помощью ватного тампона, наверченного на
заостренную деревянную палочку, и 96% спирта. Для этого объектив вывинчивают из
микроскопа (или устанавливают в положение, удобное для чистки с большим свободным
расстоянием), сухим тампоном одним движением руки снимают иммерсионную жидкость
с передней линзы объектива; следующий тампон смачивают спиртом, причем тампон
должен быть чуть влажным. Кругообразным движением, без вдавливания линзы внутрь
объектива (конденсора), аккуратно протереть линзу (операцию можно повторить дважды
с вновь смоченным тампоном); последний раз линзу протирают сухим тампоном.
Операции следует проводить очень аккуратно и осторожно, следить за количеством
смеси, которой должно быть ровно столько, чтобы протереть чуть влажным тампоном.
7
Внимание!

При плохо вычищенном объективе может произойти резкое снижение
контраста изображения, потеря четкости, резкости и разрешающей способности
объектива, появление дополнительного рассеянного света.

Плохо вычищенный фронтальный компонент конденсора снижает
освещенность поля на предмете, возможно появление дополнительной окраски и провалов
освещенности в изображении мелких элементов.
Работа
6.
Методы
приготовления
и
простой
окраски
микропрепаратов.
Препараты из чистой культуры микроорганизмов используют для изучения их
морфологии, анатомического строения тинкториальных свойств.
Работа 6.1. Приготовить препарат из агаровой культуры Staphylococcus aureus.
Приготовление препарата из агаровой культуры
1. Обозначить место нанесения материала стеклографом с обратной стороны
предметного стекла, предварительно обезжиренного.
2. Предметное стекло провести через пламя спиртовки (стерилизация). Рабочая
поверхность обращена к пламени.
3. Нанести
на
стекло
петлю физиологического раствора. Для этого
бактериологическую петлю прокалить в пламени спиртовки, держа ее как карандаш
вертикально в правой руке. Два-три раза провод через пламя и нижнюю треть
петледержателя. Не выпуская петлю, левой рукой взять пробирку с 0,9% раствором
натрия хлорида, а 4-м и 5-м пальцами правой руки зажимают ватно-марлевую пробку,
вытягивают ее, а края пробирки проносят через пламя спиртовки, держа на расстоянии 15
– 20 см от пламени, не выпуская пробки. Опустив петлю в жидкость, набрать каплю
физраствора. Вынимаю петлю, проводят пробку и открытый край пробирки через пламя,
после чего ее закрывают и ставят в штатив. После чего на центр стекла нанести каплю
изотонического раствора.
3. Стерильно извлечь из пробирки неполную петлю микробной массы: петлю
снова стерилизовать, в левую руку взять пробирку с агаровой культурой. Открыть
пробирку, придерживаясь всех правил, охладить петлю о стенки пробирки и набрать нею
небольшое количество культуры, а пробирку закрыть, фломбируя края пробирки и
пробку, и поставить в штатив.
4. Эмульгировать бактерии в капле физиологического раствора на стекле до
образования слегка мутной взвеси.
5. Полученную взвесь распределить равномерным тонким слоем на
поверхности стекла площадью в 1-2 копеечную монету.
6. Прокалить петлю.
7. Высушить препарат на воздухе.
8. Зафиксировать препарат – провести 3-раза через верхнюю часть пламени
спиртовки (мазок должен быть сверху).
9. Окрасить препарат.
8
1. Фиксировать мазок на пламени.
2. На
фиксированный
препарат
нанести каплю раствора генцианвиолета – 2 минуты.
3. Промыть водой.
4. Высушить препарат в тетради для
высушивания препаратов.
Рисунок 1. Схема окраски бактерий простым методом
Работа 6.2. Приготовить препарат из чистой культуры Escherichia coli,
выращенной на жидкой питательной среде.
1. Бактериальной петлей набрать каплю исследуемой чистой культуры,
придерживаясь, правил стерильности, как описано выше.
2. Взятый материал нанести на предметное стекло и сделать равномерный
тонкий мазок.
3. Если для забора чистой культуры с жидкой питательной среды используют
пастеровскую пипетку, ее тоже держат в правой руке и проводят через
пламя перед внесением в пробирку. Тонкий кончик пипетки после
охлаждения возле стенки пробирки опускают в бульонную культуру, держа
открытый конец ее открытым. После попаданию в пипетку культуры
верхний конец ее закрывают указательным пальцем, вынимают из пробирки.
Последнюю закрывают и ставят в штатив. На поверхность предметного
стекла с пипетки выпускают каплю материала и опускают в дезраствор.
Простерилизованной бактериологической петлей делают мазок.
4. Мазок фиксируют на пламени спиртовки. Затем окрашивают фуксином
Пфайффера – 2 минуты.
9
Работа 7. Микроскопия приготовленных и окрашенных простыми методами
препаратов из агаровой культуры S.aureus и бульонной культуры E.coli. Результаты
микроскопии внести в таблицу3
Исследуемый материал
Агаровая культура S.aureus
Таблица 3 Протокол исследования
Иммерсионная микроскопия
Рисунок
Метод окраски
Генциан-виолет
Фуксином Пфайффера
Бульонная культура E.coli
Приложение 1
Объяснения к самостоятельной работе студентов по теме
«Морфология микроорганизмов. Методы изучения морфологии и размеров
бактериальной клетки. Световая микроскопия. Простые методы окраски».
Эукариоты — это микроорганизмы с истинным
ядром (от греч. эу—истинный, карио—ядро); к
ним относят грибы, водоросли и простейшие
микроорганизмы. Клетки эукариот содержат ряд
органелл (ядро, пластиды), которые аналогичны
соответствующим органеллам клеток высших
растений. В этом проявляется сходство строения
одноклеточных организмов с клетками высших
растений.
Прокариоты — микроорганизмы, имеющие
Прокариоты
примитивный ядерный аппарат и не содержащие
митохондрий и хлоропластов. К ним относят
бактерии и синезеленые водоросли, или
цианобактерии, как их теперь принято называть.
Таким образом, прокариотная и эукариотная
организации клеток принципиально различны.
Ниже рассматривается строение прокариотной
(бактериальной) клетки.
Цель
микробиологических установить факт наличия или отсутствия
возбудителя в организме больного и на
исследований
объектах окружающей среды.
Задачи
микробиологических идентифицировать микроорганизмы в исследуемом материале, определить их видовую
исследований
принадлежность,
морфологические,
биохимические, токсигенные и антигенные
свойства, а также установить чувствительность
выделенных микроорганизмов к антимикробным
препаратам. Несмотря на то, что проведение
микробиологических исследований относится к
компетенции микробиологов, каждый врач,
имеющий дело с инфекционными заболеваниями,
Эукариоты
10
должен знать, как и когда необходимо отбирать
материал
для
исследований,
на
какие
исследования
его
направлять
и
как
интерпретировать полученные результаты.
Различия в строении клеток прокариот и эукариот
Признак
Прокариотическая клетка
Организация
генетического Нуклеиод, состоящий чаще
материала
всего из одной замкнутой в
кольцо
или
линейной
хромосомы
Эукариотическая клетка
Ядро, состоящее чаще
всего
более
одной
хромосомы. Есть белки
гистоны. Гены имеют
экзонно-интронную
организацию.
Опероны
отсутствуют
Локализация ДНК
В нуклеоиде и плазмидах
В ядре и некоторых
органеллах
Цитоплазматические
Отсутствуют
(кроме Имеются
структуры
рибосом)
Рибосомы в цитоплазме
70S-типа
80S-типа
Движение цитоплазмы
Отсутствует
Имеется
Жгутики
Состоят
из
одной Состоят
из
фибриллы, построенной из микротрубочек,
субъединиц
собранных в группы
флагеллина
Клеточная стенка (там, где Состоит из пептидогликан Пептидогликан
муреин
она присутствует)
муреин (за исключением отсутствует
архебактерий)
Антони ван Левенгук (1632–1723)
Открытие микроорганизмов связано с именем
голландского естествоиспытателя Антони ван
Левенгука
(1632–1723),
который,
заинтересовавшись
строением
льняного
волокна, отшлифовал несколько грубых линз.
Позднее он достиг большого совершенства при
изготовлении
линз
и
назвал
их
«микроскопиями». Открытие А. ван Левенгука
привлекло всеобщее внимание. Оно явилось
основой развития микробиологии, изучения
форм микроорганизмов и их распространения
во внешней среде. Это был морфологический,
или описательный
период
развития
микробиологии, который продолжался с конца
XVII до середины XIX в. Этот период для
микробиологии был малоплодотворным, так
как оптические приборы того времени не
позволяли отличить один вид микроорганизма
от другого, не могли дать представление о
биологических
свойствах
и
роли
микроорганизмов в природе.
Начало изучению физиологии и биохимии
Луи Пастер (1822– 1895)
микроорганизмов, выяснению их роли в
11
Роберта Кох (1843–1910)
природе и
жизни
человека
положил
французский ученый Луи Пастер. С его работ
начался
физиологический
период
микробиологии. Л. Пастер
впервые
в
противоположность мнению химиков показал,
что процессы
брожения
и
гниения
обусловливаются
жизнедеятельностью
микроорганизмов, специфических для каждого
вида
брожения. Он установил,
что
эти
процессы могут осуществляться без доступа
молекулярного
кислорода в анаэробных
условиях. Таким образом, Пастер открыл
принципиально новое биологическое явление – анаэробиоз. недеятельности
микроорганизмов. Он предложил способ
предохранения вина и пива от скисания и
прогоркания (способ борьбы с контаминацией
пищевых продуктов): их кратковременный
прогрев до температуры 70–80 °С, названный
впоследствии пастеризацией.
Роберт
Кох
занимался
изучением
возбудителей
инфекционных
заболеваний.
Свои
исследования Кох начал с изучения
сибирской язвы и показал, что возбудителями
этого заболевания являются бактерии вида
Bacillus anthracis.
Позднее он
открыл
возбудителей
туберкулеза (бактерии вида
Mycobacterium tuberculosis), которые в его
честь были названы «палочкой Коха». В 1905
г. Кох за исследования туберкулеза была
присуждена Нобелевская премия по физиологии
и медицине. Он и его ученики открыли
возбудителей и других заболеваний – азиатской
холеры,
дифтерии,
брюшного
тифа,
столбняка, гонореи.
Р. Кох
и
его
ученики
обогатили
микробиологию
новыми
методами
исследований:
•
разработали
методы
окраски
микроорганизмов анилиновыми красителями;
•
усовершенствовали
технику
микроскопирования – конденсор Аббе и
иммерсионные
объективы,
что
дало
возможность выявлять плохо различимые
бактериальные формы;
• ввели в микробиологическую практику
плотные
питательные
среды, на которых
микроорганизмы
способны
формировать
колонии, что в свою
очередь позволяет
невооруженным глазом определять количество
12
Постулаты Коха:
И. И. Мечникова (1845–
1916)
Н. Ф. Гамалея (1859–1949)
жизнеспособных микроорганизмов в пробе.
1. Микроорганизм обнаруживают в каждом
случае
конкретного
предполагаемого
заболевания, а также в условиях, ответственных
за патологические изменения и клиническое
течение болезни.
2. Микроорганизм не выделяют при других
болезнях как случайный или не патогенный
паразит.
3. После изоляции из организма больного и
выделения чистой культуры патогенный
микроорганизм должен вызвать аналогичное
заболевание у восприимчивого животного.
Он открыл явление фагоцитоза и впервые
показал,
что
защита
организма
от
болезнетворных микроорганизмов – сложная
биологическая реакция, в основе которой
лежит способность фагоцитов захватывать и
разрушать посторонние тела, попавшие в
организм. В 1909 г. за исследования по
фагоцитозу Мечникову была присуждена
Нобелевская премия в области иммунологии.
Исследования Мечникова не ограничивались
формулированием фагоцитарной теории. Он
изучал
патогенез
холеры
и
биологию
холероподобных
вибрионов,
показал
возможность заражения шимпанзе сифилисом и
предложил
метод
лечения
сифилиса
монохлоридом ртути.
И. И. Мечников
является
также
основоположником учения о микробном
антагонизме,
послужившем основой для
развития науки об антибиотикотерапии. Он
показал,
что
молочнокислые
бактерии
подавляют гнилостные бактерии. На принципе
микробного антагонизма Мечников обосновал
теорию долголетия и предложил для продления
человеческой
жизни
использовать
простоквашу, которая впоследствии получила
название «мечниковской». В настоящее время
эта теория подтверждена многочисленными
экспериментами и
положена
в
основу
развития отдельной отрасли биотехнологии,
связанной с получением и использованием
пробиотиков.
Соратником И. И. Мечникова был микробиолог
эпидемиолог Н. Ф. Гамалея, который внес
большой вклад в изучение туберкулеза,
холеры,
бешенства. Ввел
в
практику
вакцинацию людей против бешенства. Он
13
создал также противохолерную и оспенную
вакцины, впервые описал явление лизиса
бактерий под действием агентов, которые
впоследствии были названы бактериофагами. Н.
Ф.
Гамалея
считается
одним
из
основоположников не
только медицинской
микробиологии,
но
и
иммунологии
и
вирусологии.
Д. И. Ивановский
(1864–1920)
Открыл
вирус, вызывающий
мозаичную
болезнь
табака.
Открытие
Ивановского
послужило
толчком
к
обнаружению
возбудителей вирусных заболеваний человека
и животных. Д. И. Ивановский по праву
считается основоположником новой ветви
микробиологии – вирусологии.
Периоды развития микробиологии
Гиппократ высказал идею о невидимых
веществах, вызывающих заболевания.
Открытие мира микробов (бактерий) связано с
Морфологический период
именем Антоний ван Левенгука, который в 1674
году сконструировал микроскоп, дающий
увеличение в 300 раз. В конце ХVII века начался
период
описания
микроорганизмов,
но
биологические свойства их все также оставались
не изученными в связи с несовершенством
микроскопической техники.
Луи Пастер (1822-1895) установил, что процесс
Физиологический период
брожения
вызывается
микроорганизмами,
причем каждый вид брожения – определенным
видом. Гниение также является результатом
жизнедеятельности микроорганизмов. Вместе с
врачем Э.Ру Пастер доказал микробную природу
заразных заболеваний. Пастер получил вакцину
против сибирской язвы, ему удалось превратить
уличный вирус бешенства в вакцину против
бешенства. После работ Пастера с 1874 по 1900
год были открыты более 35 возбудителей
бактериальных
заболеваний
человека
и
животных.
В 1876 году Р.Кох доказал, что возбудителем
сибирской язвы является Bacillus Anthracis. Он
предложил метод выделения чистых культур из
изолированных колоний на плотных средах,
способы
окраски
бактерий
анилиновыми
Эврестический период
14
Иммунологический период
Молекулярно-генетический период
Принципы систематики
красителями. В 1882 году открыл возбудителя
туберкулеза, в 1883 году – возбудителя холеры,
приготовил туберкулин. Велики его заслуги в
усовершенствовании микроскопии – конденсор
Аббе и иммерсионные объективы.
Английский врач Эдуард Дженнер (1749-1823) –
предложил вакцину против натуральной оспы.
Л. Пастер. Пастеровский институт открыт в 1888
г. в Париже. ВИЧ – выделен именно там.
И.И. Мечников – открыл явление фагоцитоза.
И. Эрлих – гуморальный иммунитет. В 1908 году
И.И. Мечникову и И. Эрлиху присуждена
Нобелевская премия по иммунологии.
В развитие иммунологии большой вклад внесли
ученики И.И.Мечникова – А.М.Безредка (18701940), Л.А.Тарасевич (1868-1927), И.Г.Савченко,
В.И.Исаев, и ученые Э.Ру, А.Иенсен, Э.Беринг,
Ш.Китазато, Ж.Борде, О.Жангу, Р.Рамон и др.
Со
втрой
половины
ХХ
века
при
микробиологических,
вирусологических
и
иммунологических исследованиях используются
молекулярные и генетические методы.
Систематика (таксономия) бактерий является
одним из наиболее важных и сложных, но
менее
разработанных
разделов
микробиологии.
Задачами
систематики
являются классификация, номенклатура и
идентификация организмов.
Классификация – распределение множества
организмов по группам (таксонам).
Номенклатура
–
присвоение
названий
отдельным группам и видам микроорганизмов.
В систематике бактерий, так же как и в
ботанике, зоологии,
принята
бинарная
номенклатура, согласно которой бактериям
присваивается название, состоящее из двух
слов: первое определяет их принадлежность к
конкретному
роду,
второе –
к
виду.
Например, Clostridium botulinum и Clostridium
tetani – два различных вида бактерий,
относящихся к одному роду. Названия
бактериям присваивают
в
соответствии с
правилами
Международного
кодекса
номенклатуры бактерий.
Основной
таксономической
категорией
является вид. Виды объединяются в роды,
роды – в семейства, семейства – в порядки,
далее следуют классы, отделы, царства. В
микробиологии существуют
также более
мелкие таксономические единицы, чем вид:
15
подвид (subspeciens), разновидность. Подвиды
могут
различаться
по
физиологическим
(biovar), морфологическим (morphovar) или по
антигенным (serovar) свойствам.
Вид — совокупность особей с одинаковым
Вид
фенотипом, дающих плодовитое потомство и
обитающих в определённом ареале.
Клон – чистая культура, полученная из одной
Понятие клона и штамма
клетки, и штамм – культуры бактерий одного
вида, выделенные из различных источников
либо из одного источника в разное время или
полученные в ходе генетических манипуляций.
Разные штаммы одного и того же вида бактерий
могут отличаться друг от друга по целому ряду
свойств, например по чувствительности к
антибиотикам, способности к синтезу токсинов,
ферментов и др.
классификации бактерий учитывается
Критерии
систематики При
большое
количество различных свойств и
микроорганизмов
признаков. Свойства и признаки, характерные
для всех бактерий данной
группы и
нехарактерные для микроорганизмов других
групп, называют критериями систематики.
Кокковидные бактерии обычно имеют
Морфология бактерий
форму правильного шара диаметром 1,0–2,0
мкм,
но
могут
быть
овальными,
эллипсоидными, бобовидными. Кокковидные
бактерии способны делиться в нескольких
плоскостях, при этом после деления клетки
могут не расходиться и формировать различного
вида скопления.
Если деление кокков происходит в одной
плоскости, то могут образовываться пары
клеток – диплококки (рис. А) (от лат. diplos –
двойной) и цепочки клеток разной длины –
стрептококки (от греч. streptos – цепочка)
(рис. Б).
Кокки,
делящиеся в двух взаимно
перпендикулярных
плоскостях
и
не
расходящиеся после этого, образуют тетрады
кокков (тетракокки) (от лат. tetra – четыре)
(рис. В). Когда деление клеток происходит в
трех взаимно перпендикулярных плоскостях,
образуются пакеты из восьми кокков в виде
тюков кубической формы (сарцины) (от лат.
sarcina – связка, тюк) (рис. Д).
У некоторых видов бактерий при делении
кокков в нескольких плоскостях могут
образовываться
неправильные
по
форме
скопления, напоминающие гроздья винограда –
16
стафилококки (от лат.
винограда) (рис. Г).
staphyle –
гроздь
Палочковидные (цилиндрические) клетки
сильно различаются по отношению длины
клетки к ее поперечнику. Они делятся только в
одной плоскости – перпендикулярно оси
цилиндра. Клетки при этом могут располагаться
поодиночке
(монобактерии,
рис.
А),
образовывать пары (диплобактерии, рис. Б) или
цепочки (стрептобактерии, рис. В).
Извитые клетки могут иметь разное число
завитков. В зависимости от формы
и
количества завитков различают три типа
клеток: вибрионы (рис. А) (от греч. vibrio –
извиваюсь, изгибаюсь) имеют один завиток, не
превышающий четверти оборота спирали
(изогнутые
клетки
наподобие
запятой);
спириллы (от греч. speira – спираль) имеют 3–5
крупных завитков и спирохеты – большое
количество мелких завитков (рис. Б, В).
Форма клеток большинства бактерий
является устойчивым видовым признаком.
Однако существуют бактерии, обладающие
морфологической
изменчивостью
(плеоморфизмом), в зависимости от условий
имеющие
вид
палочек,
кокков
или
обнаруживающие
слабое
ветвление.
У
некоторых видов бактерий при прохождении
цикла развития также наблюдается изменение
формы клеток.
17
Выбор лабораторных исследований
Микроскопические методы
Бактериологические методы
Биологические методы
Основу
микробиологической
диагностики
инфекционных
заболеваний
составляют
микроскопические,
бактериологические,
биологические,
серологические
и
аллергологические методы.
Микроскопические
методы
включают
приготовление мазков и препаратов для
микроскопирования. В большинстве случаев
результаты микроскопических исследований
носит ориентировочный характер (например,
определяют
отношение
возбудителей
к
окраске), так как многие микроорганизмы
лишены морфологических и тинкториальных
особенностей. Тем не менее микроскопией
материала
можно
определить
некоторые
морфологические
признаки
возбудителей
(наличие спор, жгутиков, внутриклеточных
включений и т.д.), а также установить факт
наличия или отсутствия микроорганизмов в
присланных образцах
Бактериологические методы — «золотой
стандарт» микробиологической диагностики, так
как
результаты
микробиологических
исследований позволяют точно установить
факт наличия возбудителя в исследуемом
материале. Идентификацию чистых культур (до
вида микроорганизма) проводят с учётом
морфологических,
тинкториальных,
культуральных, биохимических, токсигенных и
антигенных
свойств
микроорганизма.
Большинство
исследований
включает
определение чувствительности к антимикробным
препаратам у выделенного возбудителя. Для
эпидемиологической
оценки
роли
микроорганизма
проводят
внутривидовую
идентификацию
определением
сероваров,
фаговаров, биоваров, резистентваров и т.д.
Биологические методы направлены на
определение наличия токсинов возбудителя в
исследуемом материале и на обнаружение
возбудителя (особенно при незначительном
исходном содержании в исследуемом образце).
Методы включают заражение лабораторных
животных
исследуемым
материалом
с
последующим выделением чистой культуры
патогена,
либо
установлением
факта
присутствия микробного токсина и его природы.
Моделирование экспериментальных инфекций у
чувствительных
животных
—
важный
инструмент изучения патогенеза заболевания и
18
Микроскопия материала
Подготовка
микроскопии
материала
Нативные препараты
Окрашенные препараты
Отбор материала
характера взаимодействий внутри системы
микроорганизм-макроорганизм. Для проведения
биологических
проб
используют
только
здоровых животных определённых массы тела и
возраста. Инфекционный материал вводят внутрь,
в дыхательные пути, внутрибрюшинно, внутривенно, внутримышечно, внутрикожно и
подкожно, в переднюю камеру глаза, через
трепанационное
отверстие
черепа,
субокципитально
(в
большую
цистерну
головного мозга). У животных прижизненно
забирают кровь, экссудат из брюшины, после
гибели — кровь, кусочки различных органон,
СМЖ, экссудат из различных полостей
Любое бактериологическое исследование
начинается с микроскопии материала и его
последующего посева на питательные среды.
Эффективность выделения возбудителя во
многом зависит от правильной техники забора
образцов
клинического
материала,
своевременности их доставки, в лабораторию или
колоний выросших микроорганизмов.
В
бактериологической
практике
к
микроскопически исследуют неокрашенные
образцы (нативный материал) и окрашенные
препараты
(мазки
или
мазки-отпечатки),
приготовленные из клинического материала или
колоний выросших микроорганизмов.
Нативные
препараты
готовят
для
исследования живых неокрашенных бактерий.
Наибольшее распространение получили метод
висячей капли, микрокамеры с плотными
средами
и
негативные
методы
исследования
живых
бактерий.
Для
прижизненного исследования также часто
применяются исследование в тёмном поле и
фазово-контрастная
микроскопия.
Подобные приёмы часто используют для
диагностики сифилиса и предварительной
диагностики
диарей,
вызванных
кампилобактерами, а также для определения
подвижности микроорганизмов.
Для приготовления окрашенных препаратов
из исследуемого объекта готовят мазки и
фиксируют их
Тампоны, содержащие микроорганизмы,
прокатывают по предметному стеклу (рис. 2,
А); с их помощью также готовят мазки из
непрозрачных жидкостей, например взвеси
испражнений (рис. 2, Б). Мазки из материалов со
19
слизистой или грубой консистенцией готовят
растиранием их между двумя предметными
стёклами (рис. 3). Прозрачные жидкости
(например, мочу или СМЖ) можно нанести в
виде капли на предметное стекло (рис. 4, А),
при этом границы капли желательно обвести
маркёром.
Лучшие
результаты
даёт
предварительное центрифугирование; затем
осадок наносят на стекло; если он густой, его
можно распределить с помощью стеклянной
палочки (рис. 4, Б).
Рисунок 2. Приготовление мазков
из материала с тампонов (А) и
непрозрачных жидкостей (Б)
Рисунок
3.
Приготовление
мазков
из
материала
со
слизистой оболочки или грубой
консистенции
(например,
мокроты)
20
Рисунок
4.
Приготовление
мазков
из
прозрачных
жидкостей (А) и из осадка после
центрифугирования (Б)
Фиксация
Цели фиксации
Окрашивание
Размеры микроорганизмов
В практической бактериологии наиболее распространена
термическая
фиксация
(над
пламенем горелки) — метод грубый, но
сохраняющий морфологию и отношение к красителям у бактерий. Для более детального
изучения
структуры
клеток
применяют
фиксирующие растворы, предотвращающие
ферментативный
аутолиз
бактерий
и
стабилизирующие
макромолекулы
путём
химического их сшивания. Для светооптической
микроскопии используют формалин, спирты,
глутаральдегид, жидкость Карнуа, ацетон, пары
осмиевой кислоты и др. Мазки фиксируют,
помещая их в раствор фиксатора или нанося
фиксаж на мазок. Для электронной микроскопии
применяют глутаральдегид и тетраоксид осмия.
1. Обеззаразить микроорганизмы
2. Прикрепить микроорганизмы к стеклу
3. Убитые
бактерии
лучше
красятся
анилиновыми красителями.
Стандартные красители, используемые для
окраски бактерий, — карболовый фуксин Циля,
фуксин Пфайффера и метиленовый синий по
Лёффлеру.
Для
получения
более
информативных результатов в светооптической
микроскопии используют специальные и
дифференцирующие методы окраски.
К миру бактерий относят мельчайшие
организмы, мельче их только микоплазмы,
риккетсии, вирусы и бактериофаги. Средний
размер
бактериальной
клетки
составляет
примерно 2 мкм (микрометра) в длину и около 1
мкм в ширину. Кокки обычно имеют диаметр
0,5—1,5 мкм; ширина палочковидных форм
бактерий от 0,5 до 1 мкм, длина—2—10 мкм.
Мелкие палочки имеют ширину 0,2—0,4 мкм и
длину 0,7—1,5 мкм. Однако встречаются
бактерии
больших
размеров,
например
возбудитель
сибирской
язвы.
Если
21
Измерение
клетки
размера
бактериальные клетки обычно можно увидеть в
световой микроскоп, то вирусы, размеры
большинства из которых находятся в диапазоне
16—200 нм (нанометров) , можно наблюдать
только в электронный микроскоп.
1 мм (миллиметр) = 10 мкм (микрометрам) = =
10 нм (нанометрам) = 107 А (ангстремам) = 109
пм
(пикометрам).
Малая
величина
бактериальных
клеток
очень
затрудняет
выявление деталей их внутреннего строения. В
последнее время сконструированы специальные
электронные микроскопы для обнаружения
деталей внутреннего строения бактериальнй
клетки.
Проводится по ходу микроскопирования с
микробной
помощью
окуляр-микрометра
(для
непосредственного
измерения
объекта
–
пластинка с 50 делениями в окуляре) и объектмикрометра (определяет цену деления окулярмикрометра – стекло, закрепляющееся на
предметном столе). В начале работы добиваются
совпадения их делений. Затем отмечают число
делений
объект-микрометра,
в
которые
умещается исследуемый микроорганизм.
Иммерсионная система (от позднелат.
Иммерсионная система (от позднелат.
immersio — погружение)
immersio — погружение) — оптическая система,
в которой пространство между предметом и
первой
линзой
заполнено
иммерсионной
жидкостью.
В качестве последней применяют кедровое
или минеральное масло (показатель преломления
1,515); водный раствор глицерина (1,434); воду
(1,333); монобромнафталин (1,656); вазелиновое
масло (1,503); йодистый метилен (1,741).
Оптические
характеристики
иммерсионной
жидкости (показатель преломления и дисперсия)
входят в аберрационный расчет объективов
микроскопа и учитываются при определении
оптических параметров объектива (увеличение,
числовая апертура), а также при аберрационной
коррекции
(исправление
по
полю,
ахроматизация, исправление хроматических и
сферических аберраций).
22
Принцип иммерсионной микроскопии
(схема)
Разрешающая
микроскопа
способность
Отчетливость получаемого изображения
определяется
разрешающей
способностью микроскопа, которая зависит от
длины волны используемого света и числовой
апертуры оптической системы микроскопа.
Разрешающая способность связана обратной
связью с пределом разрешения – минимальным
расстоянием между двумя точками, при котором
еще можно различить каждую из них.
Приложение 2
Примеры тестовых заданий для самоконтроля по теме:
«Морфология микроорганизмов. Методы изучения морфологии и размеров
бактериальной клетки. Световая микроскопия. Простые методы окраски».
1. Назовите 3 основные формы бактерий:
А. *шаровидные (кокки)
Б. *палочковидные
В. *извитые
Г. Звёздчатые
2. На какие 5 групп подразделятся кокки в зависимости от взаимного
расположения:
А. *диплококки
Б. *стрептококки
В. *тетракокки
Г. *сарцины
Д. *стафилококки
Е. диплобактерии
Ж. стрептобациллы
З. коккобактерии
И. стрептобактерии
К. фузобактерии
5. К диплококкам относятся 3 патогенных вида:
А. *менингококки
Б. *гонококки
В. *пневмококки
Г. стрептококки
Д. стафилококки
23
Е. микрококки
6. Приведите 3 примера анилиновых красителей используемых для окраски
микроорганизмов с указанием цвета красителей:
А. *основной фуксин красного цвета
Б. *метиленовый синий сине-голубого цвета
В. *генциан-виолет фиолетового цвета
Г. основной фуксин сине-голубого цвета
Д. метиленовый синий фиолетового цвета
Е. генциан-виолет красного цвета
7.Перечислите 4 этапа приготовления препарата-мазок соблюдая последоательность:
А. *приготовление мазка (1)
Б. *высушивание (2)
В. *фиксация (3)
Г. *окраска (4)
Д. приготовление мазка (4)
Е. высушивание (1)
З. фиксация (2)
И. окраска (3)
8.Укажите 3 цели проведения фиксации мазка:
А. *чтобы убить микробы
Б. *nрикрепить мазок к стеклу
В. *cделать микробы более восприимчивыми к окраске
Г. чтобы обездвижить микробы
Д. для высушивания мазка
Е. сделать микробы более стойкими к окраски
9.Приведите 5 примеров взаимного расположения палочковидных бактерий:
А. *беспорядочное (сальмонеллы)
Б. *парное (диплобактерии-клебсиеллы диплобациллы)
В. *цепочками (стрептобациллы-возбудитель сибирской язвы)
Г. *под углом друг другу (возбудитель дифтерии)
Д. *параллельное (возбудитель лепры)
Е. одиночное (микрококки)
З. в виде скопления (стафилококки)
И. pасположение по четыре (тетракокки)
К. в виде пакета (сарцины)
Л. расположение в виде стайки рыб (микрококки)
10. Из испражнений больного кишечной инфекции бактериолог выделелил чистую
культуру вибрионов. К какой группе бактерій по морфологическим свойтвам Вы
отнесете эти микроорганизмы?
А. *Извтые бактерии
Б. Клостридии
В. Кокки
Г. Бациллы
24
Приложение 3
Граф логической структуры по теме:
«Морфология микроорганизмов. Методы изучения морфологии и размеров
бактериальной клетки. Световая микроскопия. Простые методы окраски».
1. Изучение морфологии возбудителя заболевания.
2. Определение чистоты выделенной культуры.





Оценка
1 - взятие, хранение и транспортировка материала
для изучения
убитых микроорганизмов:
 фиксированный
простые
микропрепарат
методы
 мазки из жидкого материала
окрашивание
 мазки из вязкого материала
микропрепаратов
 тонкий мазок крови
сложные
 толстая капля крови
методы
 препарат-отпечаток
 препарат-соскоб
 препарат для ЭМ
для изучения живых микроорганизмов:
 висячая капля
 раздавленная капля
3 - микроскопия:
световая (сухая или иммерсионная система)
темнопольная
фазово-контрастная
люминесцентная
электронная
4 - заключение
достоинства  простой
 доступный
 быстрый
 экономичный
недостатки  низкая чувствительность
 низкая специфичность
 используется на всех этапах бактериологического метода
диагностики, для контроля чистоты выделяемой культуры
2 - приготовление
микропрепаратов
Этапы
Цели
Схема микроскопического метода исследования
25
Список рекомендуемой литературы:
1. Пяткин К.Д., Кривошеин Ю.С. Микробиология. – М.: Медицина, 1981. – С.4 - 26.
2. Борисов Л.Б. Медицинская микробиология, иммунология, вирусология. М.:
МИА, 2002. – С. 26 - 41.
3. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммунология и
вирусология. – СПб., 2002. – С. 14 – 22, 31 - 32.
4. Поздеев О.К. Медицинская микробиология / Под ред. акад. РАМН
В.И.Покровского. – М.: ГЭОТАР, 2001. – С. 11 – 14, 17.
5. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: Учебник / Под ред.
А.А. Воробьева. – М.:Медицинское информационное агенcтво, 2004. – С. 27 - 46.
6. Руководство к лабораторным занятиям по медицинской микробиологии / Под
редакцией Л. Б. Борисова. – М.: Медицина, 1993. – С. 5 – 17.
26