Полная версия научной работы 348 КБ

УДК 579.678
МЕТОДИКА ВЫДЕЛЕНИЯ ФИТОПАТОГЕННЫХ БАЦИЛЛ
Кудряшова К.В., Феоктистова Н.А., Васильев Д.А.
ФГБОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная
академия имени П.А. Столыпина»
PROCEDURE FOR IDENTIFICATION OF PATHOGENIC BACILLI
Kudryashova K.V., Feoktistova N.A., Vasilev D.A.
Ulyanovsk State Agricultural Academy named P.A. Stolypin
Контаминация плодов и овощей фитопатогенными бациллами в
процессе их выращивания, сбора и последующего хранения – это серьезная
проблема производителей и переработчиков сельскохозяйственного сырья, но
и медиков. Пищевые отравления, вызванные бактериями Bacillus mesentericus
(pumilus), Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Bacillus mycoides, часто
характеризуются острым течением болезни и могут вызвать летальный исход.
В настоящее время обработка овощей и фруктов основана на отбраковке
недоброкачественной продукции с использованием ручного труда и
механических
устройств.
Подобная
обработка
–
это
трудоемкие
и
малоэффективные технологии, так как, удалив испорченную единицу
продукции, нельзя гарантировать, что споры фитопатогенных бацилл не
попали на другие фрукты и овощи. Задача изыскания эффективного и
безвредного способа обработки сельскохозяйственной продукции с целью
уничтожения фитопатогенных бацилл – актуальная тема для исследований,
результаты
которых
позволят
повысить
эффективность
применения
контрольных мер при хранении зерна, плодов и овощей в условиях
специализированных
зерно-
и
овощехранилищах,
в
торговых
залах
магазинов, а также сделать данную технологическую операцию значительно
дешевле [1].
Цель и задачи исследования - выделить и идентифицировать
фитопатогенные бациллы, контаминирующие фрукты.
Материалы. Яблоки, груши, слива, персики, абрикосы, мандарины,
завезенные из Израиля и Краснодарского края (Россия).
В
работе
использовали
методики,
изложенные
в
следующих
нормативно-технических документах и научных трудах: ГОСТ 26669-85 [2];
ГОСТ Р 51426-99 [3]; ГОСТ 26669-85 [4]; для выделения бактерий Bacillus
использовали схему дифференциации бактерий рода Bacillus [6,].
Было исследовано 36 проб корне- и клубнеплодов.
Ход исследований
Первый день. Исследуемые пробы вносили в физиологический раствор и
прогревали на водяной бане при температуре 70-75 °С в течение 30 мин и
высевают на чашки Петри с МПА. Все посевы помещали в термостат- при 37
°С на 18 ч. Культуры, выросшие на МПА, отсевали в пробирку с МПБ и
инкубировали в термостате при 37 °С в течение 4-5 ч. Для чистоты
эксперимента мы анализировали не менее трех колоний.
Второй день. Просматривали посевы и делали высевы на МПА, среды
Громыко и Гаузе № 2. Исходные посевы, а также засеянные чашки и
пробирки помещали в термостат при 37 °С на 18 часов.
Третий день. При наличии роста на МПА, средах Громыко и Гаузе № 2
готовили мазки выросших культур, затем окрашивали по Граму.
Грамположительные спорообразующие бактерии засевали в пробирки с
МПБ. После 4-5 ч инкубации в термостате при 37 °С и высевали на
следующие среды: среду Кларка, МПБ с 7% поваренной соли, среду с
мочевиной,
бульон
с
нитратами,
молочный
агар,
тирозировый
агар,
картофельный агар, МПБ с индикаторными бумажками на сероводород, аммиак
и индол, бульон с яичным желтком, 1% глюкозный агар, среду Омелянского с
глюкозой, МПА, кукурузно-пептонный агар. Все отобранные посевы помещали
в термостат при 37 °С.
Четвертый день. Учитывали результаты определения ферментативных
свойств выделенных культур. Для выявления глобул в протоплазме микробных
клеток готовили мазки культур, выросших на 1% глюкозном агаре, окрашивали
и микроскопировали. Грамположительные бациллы, образующие эндоспоры и
продуцирующие каталазу, относили к роду Bacillus. Культуры, клетки которых
не раздуваются при спорообразовании, считали представителями первой
морфологической
группы.
Бактерии
рода
Bacillus,
как
правило,
обнаруживаются в ассоциациях с другими бактериями, которые могут
подавлять рост бацилл при высевании проб на обычно применяемые среды.
Поэтому при выделении спорообразующих бактерий пробы прогревали перед
высевом на полноценные питательные среды при температуре 70 0С в течение
40 минут.
Пошаговая инструкция по первичной дифференциации бактерий рода
Bacillus [7] (рис. 1)
1. Подвижность микроорганизмов изучали в препаратах « висячая
капля» и «раздавленная капля», а также при посеве культуры в полужидкий
агар (0,45-0,75% агара) уколом.
2. Образование аммиака, индола, сероводорода определяли с помощью
индикаторных бумажек, помещенных под пробку пробирок с МПБ. При
образовании индола бумажка приобретала сиреневый или малиновый цвет
различной интенсивности. Об образовании сероводорода судили по
почернению индикаторной бумажки. При образовании аммиака индикаторная
бумажка краснеет.
3. Для определения гидролиза мочевины (наличие фермента уреазы)
производили посев на среду с мочевиной. Покраснение среды через 20-24 ч.
Рост при 37 0С свидетельствует о наличии у данного штамма фермента
уреазы (рис. 4).
4. Редукцию нитратов определи после роста культуры на бульоне с
нитратами в течение 24-72ч. В каждую пробирку с засеянным нитратным
бульоном прибавляли по 1 мл реактива. Если нитрат восстановлен в нитрит,
то получалось темно-синее окрашивание.
5. Гидролиз казеина изучали на молочном агаре. Культуру засевали на
среду штрихом, инкубировали в термостате при 37
0
С. Наблюдали за
появлением прозрачных зон гидролиза.
Рисунок 1 - Схема выделения и дифференциации бактерий рода
Bacillus (Gordon, 1973)
6. Для изучения разложения тирозина культуру инкубировали на агаре с
тирозином. О разложении тирозина судили по исчезновению кристаллов
тирозина в среде округ посевов.
7. Гидролиз крахмала наблюдали на картофельном агаре. Чашки Петри
с засеянным картофельным агаром через 24-48 ч. заливали раствором
Люголя. Светлые зоны вокруг посевов свидетельствовали о гидролизе
крахмала.
8. Для изучения продукции каталазы чашечную культуру заливали 10%
H2O2. Образовавшие пузырьки газа свидетельствовали о наличии каталазы
(рис. 3).
9. С помощью реакции Фогес-Проскауэра устанавливали в среде
ацетон, промежуточный продукт, образующийся при распаде глюкозы. Для
постановки реакции Фогес-Проскауэра (в модификации Барита) культуры
выращивали на среде Кларка 1-3 суток при 37 0С. Затем 1 мл культуральной
жидкости переносили в пробирку и прибавляли 0,6 мл α – нафтола (5%
раствор в абсолютном спирте) и 0,2 мл 40% КОН, взбалтывали. При
положительной реакции через 2-5 мин наблюдали розовое окрашивание. У
штаммов, дающих сильную реакцию, окраска становится интенсивной и
через 30 мин, а через 1 час переходит в малиновую. В случае отрицательной
реакции розового окрашивания не наблюдается, и раствор принимает цвет
меди.
10. Продукцию летициназы изучали на бульоне с яичным желтком. О
летициназной
активности
судили
по
появлению беловатой
мути
и
всплывающим хлопьям.
11. Продукция газов из нитратов в анаэробных условиях изучали на
нитратном бульоне с поплавком или под слоем стерильного вазелинового
масла. При продукции газа он скапливался в поплавке.
12. Для определения утилизации углеводов культуры засевали на
полужидкую среду Омелянского с углеводами. При образовании кислоты из
углеводов цвет среды изменяется с зеленого на желтый.
13. О кислотообразовании культур при росте на лакмусовом молоке
судили по изменению цвета молока до розового (красного).
14. Продукцию аргининдигидролазы изучали на среде Шеррио.
Пробирку со средой Шеррис и контрольную (без аргенина) засевали 18
часовой культурой и заливали стерильным вазелиновым маслом. Посевы
инкубировали при 37 0С в течение 5 дней. Если бактерии не способны
анаэробному расщеплению глюкозы, то среда в контрольной пробирке (без
аргенина) остается серой или слабо розовой. О разложении аргенина
свидетельствует появление фиолетовой окраски в опытной пробирке.
15. Для
быстрого
спорообразования
культуры
выращивали
на
кукурузно-пептонном агаре.
16. Рост в анаэробных условиях изучали на анаэробном агаре. Петлю
суточной бульонной культуры засевали уколом в столбик среды. Рост
культуры по всей длине укола свидетельствовали об анаэробном росте.
17. Об утилизации цитрата и пропионата судили по наличию роста
культур на среде Козера.
18. О разжижении желатина судили по разжижению мясо-пептонной
желатине.
19. Рассматривали наличие роста бактерий на солевом агаре (рис. 2).
В таблице 1 представлены основные свойства бактерий рода Bacillus,
используемых для дифференциации [7].
Дополнительными тестами для дифференциации выделенных бактерий
были биохимические тесты, предложенные Сидоровым [5]: утилизация
цитрата, взаимодействие с фенилаланиндезаминазой, D-маннитом (рисунок
1), D-ксилозой, D-глюкозой и L-арабинозой (таблица 2).
Полученные нами результаты изучения биохимических свойств
выделенных нами бацилл были сравнены с данными по изучению
биохимических свойств штаммов бактерий рода Bacillus, полученных из
музея кафедры МВЭ и ВСЭ УГСХА им. П.А. Столыпина.
Таким образом, в результате проведенных исследований нами было
выделено из 52 проб фруктов 19 культур бактерий, которые мы классифицировали
по ферментативным свойствам (на основании тестов, описанных в литературных
источниках и результатах изучения биохимических свойств штаммов бактерий
рода Bacillus, полученных из музея кафедры МВЭ и ВСЭ Ульяновская ГСХА им.
П.А. Столыпина) и отнесли к видам Bacillus mesentericus (pumilus) Bacillus
subtilis, Bacillus cereus, Bacillus mycoides, Bacillus megaterium.
Таблица 1 - Сводные данные об основных свойствах видов рода Bacillus,
используемых для дифференциации (по Gordon, 1973)
Виды
С
в
о
й
с
т
в
а
К
ат
а
л
аз
а
Ре
ак
ци
я
Ф
ог
ес
П
ро
ка
уэ
ра
Р
о
с
т
в
а
н
а
э
р
о
б
н
о
м
Р
о
с
т
п
р
и
Р
о
с
т
п
р
и
5
0
7
%
C
l
0
С
Об
раз
ова
ние
кис
лот
аи
газа
из
глю
коз
ы
Р
е
д
у
к
ц
и
я
н
и
т
р
а
т
о
в
Ги
др
ол
из
кр
ах
ма
ла
Р
о
с
т
п
р
и
6
5
0
С
Ш
и
р
и
н
а
к
л
е
т
к
и
1
,
0
м
к
м
а
г
а
р
е
С
п
о
о
б
р
а
з
о
в
а
н
и
е
О
бр
аз
ов
.
ки
сл
от
ы
из
гл
ю
ко
зы
+
B.
megaterium
B.cereus
+
-
-
-
+
-
0
+
-
+
+
+
+
+
-
+
-
+
+
-
+
+
B.subtilis
+
+
-
+
+
-
+
+
-
-
B. mesenteri
cus
B.coagulans
+
+
-
+
+
-
-
-
-
+
+
+
+
-
-
0
+
B.macerans
+
-
+
+
-
+
+
+
Г
и
д
р
о
л
и
з
к
а
з
е
и
н
а
П
а
р
а
с
п
о
р
а
л
ь
н
ы
е
в
к
л
ю
ч
е
н
и
я
+
-
+
+
0
+
+
+
-
-
+
+
+
-
-
0
+
+
0
-
-
-
+
+
+
-
Примечание − « + » - более 85% штаммов, исследованных Gordon (1973)
положительны,
« - » - более 85% штаммов отрицательны,
« 0 » - вариабельный признак.
Рисунок 2 - Первый день роста бактерий рода Bacillus на солевом 5%
желточном агаре
Рисунок 3 – Тест на определение каталазной активности
Рисунок 4 – Рост бактерий рода Bacillus на бульоне с мочевиной
Нами было исследовано на наличие бактерий Bacillus mesentericus,
Bacillus megaterium, Bacillus mycoides 52 пробы фруктов (яблоки, груши, слива,
персики, абрикосы, мандарины, завезенные из Израиля и Краснодарского
края (Россия)). Нами установлено, что уровень контаминации исследованных
проб бактериями рода Bacillus составил более 27 %. В результате
проведенных исследований нами было выделено 19 культур бактерий рода
Bacillus, которые мы дифференцировали по ферментативным свойствам (на
основании тестов, описанных в литературных источниках и изучения
биохимических свойств выделенных штаммов и штаммов из коллекции
бактерий рода Bacillus Научно-исследовательского инновационного центра
микробиологии и биотехнологии ФГБОУ ВПО «Ульяновской ГСХА им. П.А.
Столыпина»), как бактерии видов Bacillus mesentericus (pumilus) Bacillus
subtilis, Bacillus cereus, Bacillus mycoides, Bacillus megaterium.
Таблица 2 – Сводные данные об основных свойствах видов рода Bacillus,
используемых для дифференциации (по Сидорову, 1995)
Вид
B. cereus
B.subtilis
B.megaterium
B.mycoides
Признаки
Рост в присутствие
лизоцима
+
х
+
Анаэробный рост
+
+
Каталаза
+
+
+
+
Тест Фогес+
+
+
Проскауера
Утилизация
+
+
х
цитрата
Расщепление
+
+
х
тирозина
Фенилаланин
дезаминаза
+
Летициназа
+
х
х
Редукция натратов
до нитритов
+
+
х
+
Гидролиз
Казеина
+
+
+
Желатина
+
+
х
+
Крахмала
+
+
+
+
Образование
кислоты из
D-глюкозы
+
+
+
+
L-арабинозы
+
х
D-ксилозы
+
х
D-маннита
+
х
Газ из глюкозы
Примечание − « + » - более 85% штаммов, исследованных Сидоровым
B
mesentericus
х
+
+
+
-
+
+
-
+
+
+
+
-
(1975) положительны,
« - » - более 85% штаммов отрицательны,
« х » - вариабельный признак.
Бактерии рода Bacillus - фитопатогенные бактерии, поражающие лен,
тыкву, кукурузу, свеклу, плоды апельсина, абрикоса, кабачков и других
растений, клубни картофеля, семенники капусты, коробочки хлопчатника и
т.п., и тем самым наносящие значительный экономический ущерб
сельскохозяйственным и перерабатывающим предприятиям [1].
Библиографический список
1.
Асколонов,
С.П.
Пищевые
заболевания,
вызываемые
спорообразующими бактериями Bacillus subtilis и Bacillus mesentericus / С.П.
Аскалонов, А.И. Ильчерко // Вопросы питания. – Киев: Госмедиздат УССР. –
1962. – С.226-229.
2.
ГОСТ 26669-85 «Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка
проб для микробиологических анализов».
3.
ГОСТ Р 51426-99 «Общее руководство по приготовлению
разведений для микробиологических исследований».
4.
ГОСТ 26669-85 «Подготовка проб для микробиологического
анализа».
5.
Сидоров, М.А. Определитель зоопатогенных микроорганизмов:
справочник / М.А. Сидоров. − М.: Колос, 1995. − С.104–112.
6.
Смирнов, В.В. Методические рекомендации по выделению и
идентификации бактерий рода Bacillus из организма человека и животных /
В.В. Смирнов, С.Р. Резник, И.Б. Сорокулова. − Киев: Наукова думка, 1983. −
С. 51.
7.
Gordon R. The genus Bacillus. - In Handb. Microbiol. Cleveland
(Ohio). 1973, vol . 1. – P.71-88.