ОЦЕНКА БИОХИМИЧЕСКИХ ИЗМЕНЕНИЙ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ

ÁÞËËÅÒÅÍÜ ÂÑÍÖ ÑÎ ÐÀÌÍ, 2010, ¹ 4 (74)
УДК 613.63:577.1
Н.Н. Михайлова, Л.Г. Горохова, А.С. Казицкая, Е.Н. Масленникова, Д.А. Щербакова
ОЦЕНКА БИОХИМИЧЕСКИХ ИЗМЕНЕНИЙ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ
НА РАННИХ СТАДИЯХ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ФТОРИСТОЙ ИНТОКСИКАЦИИ
Научно-исследовательский институт комплексных проблем гигиены и профессиональных заболеваний
СО РАМН (Новокузнецк)
В условиях экспериментальной модели фтористой интоксикации отмечено увеличение количества
эритроцитов в периферической крови на фоне достоверного снижения уровня гемоглобина.
Ферментный статус лейкоцитов на ранних стадиях интоксикации характеризовался повышением
активности СДГ и α-ГФДГ, отражающей срочный компенсаторный механизм мобилизации базовых
энергетических ресурсов клетки. На 3-й неделе эксперимента отмечалась разнонаправленность
ответной реакции для ЩФ и КФ, подтверждающая активацию анаболических процессов в организме.
Ключевые слова: фтористая интоксикация, эритроциты, лейкоциты, ферменты
ESTIMATION OF BIOCHEMICAL CHANGES IN PERIPHERAL BLOOD
AT EARLY STAGES OF EXPERIMENTAL FLUORIC INTOXICATION
N.N. Mikhailova, L.G. Gorokhova, A.S. Kazitskaya, E.N. Maslennikova, D.A. Shcherbakova
Research Institute for Complex Problems of Hygiene and Occupational Diseases of the Siberian Branch
of the Russian Academy of Medicine, Novokuznetsk
In the conditions of experimental model of fluoric intoxication the increase in erythrocyte quantity in peripheral
blood against reliable decrease in haemoglobin level was revealed. The enzyme status of leukocytes at early
stages of intoxication was characterized by the increase in SDH and α-GPDH activity that reflected an urgent
compensatory mechanism of mobilization of base energy cell resources. On the third week of the experiment
different direction of response for AlP and AcP was detected confirming the activation of anabolic processes
in an organism.
Key words: fluoric intoxication, erythrocytes, leukocytes, enzymes
Особое значение имеет изучение системы
крови как отражение компенсаторно-приспособительных реакций организма в ответ на действие
вредных производственных факторов. Важным
показателем естественной неспецифической резистентности организма является качественная
и количественная характеристика эритроцитов
и лейкоцитов периферической крови, поскольку,
тесно контактируя со всеми тканями и вступая с
ними в функциональные взаимоотношения, они
отражают происходящие в организме физиологические и патологические изменения [7, 10, 11].
Полифункциональная роль форменных элементов
крови в механизмах адаптации и компенсации в
условиях гипоксии, газотранспортных процессах и осуществлении других жизненно важных
функций объясняет высокую информативность
функционального состояния этих клеток [15]. Так,
например, высокая чувствительность активности
лейкоцитарных ферментов крови к экзогенным
воздействиям различной природы позволяет выявить внутриклеточные механизмы динамики
процессов компенсации и предшествующие клиническим проявлениям изменения [3, 6].
Вместе с тем биохимическому мониторингу
периферической крови в динамике развития профессиональных патологий не уделяется должного
внимания. Оценка направленности внутриклеточных метаболических сдвигов при избытке фторсодержащих соединений в организме представляет
особый интерес для выявления ранних стадий
фтористой интоксикации. Изучая биохимический
профиль отдельных клеток, можно определить
направленность ответной реакции организма на
поступление данного ксенобиотика и разработать
методы коррекции и профилактики на ранних
стадиях интоксикации.
Цель работы заключалась в выявлении и оценке биохимических маркеров периферической
крови на ранних стадиях экспериментальной фтористой интоксикации.
МЕТОДИКА
Эксперимент проводился на 40 нелинейных
белых крысах массой 200–250 г, которые были
разделены на 2 группы: интактную и опытную – с
фтористой интоксикацией, которую моделировали пассивным запаиванием фтористым натрием
в дозе 10 мг/л в течение 12 недель. Забор крови
из хвостовой вены проводили через 2, 4, 6 суток
и 3, 6, 9 и 12 недель затравки. Оценивали количество эритроцитов, лейкоцитов и гемоглобина
в периферической крови, активность щелочной
фосфатазы (ЩФ) в нейтрофилах, кислой фосфатазы (КФ), сукцинатдегидрогеназы (СДГ) и активность митохондриальной и цитоплазматической
α-глицерофосфатдегидрогеназы (α-ГФДГ) в лимфоцитах. Ферментный статус лейкоцитов периферической крови определяли на мазках с использованием стандартных цитохимических методик.
Методологические аспекты гигиенических исследований
43
ÁÞËËÅÒÅÍÜ ÂÑÍÖ ÑÎ ÐÀÌÍ, 2010, ¹ 4 (74)
Эксперимент проводился в соответствии с
«Правилами проведения работ с использованием
экспериментальных животных» (приказ МЗ СССР
№755 от 12.08.1977). Данные обрабатывались методом математической статистики с помощью пакета
программ «Статистика 6.0».
ствует об активации эритропоэза как компенсаторного механизма в ответ на повреждающее действие
фтора непосредственно на морфофункциональную
структуру эритробластов и зрелых форм.
Изменения ферментативной активности форменных элементов крови под влиянием ксенобиотиков играют существенную роль в патогенезе
интоксикаций. Активность ферментов в лимфоцитах животных, подвергшихся затравке фторидом
натрия в течение первой недели, существенно
увеличилась за счет повышения на 15 % уровня СДГ
(рис. 1) и α-ГФДГ цит., на 10 % – α-ГФДГ мит. СДГ
– фермент аэробного гликолиза, катализирующий
реакцию окисления сукцината в фумарат в цикле
Кребса. Это единственный фермент цикла, прочно
связанный с внутренней мембраной митохондрий,
который может служить критерием выраженности
компенсаторной активации альтернативных путей
окисления субстратов в дыхательной цепи в условиях развивающейся гипоксии [2, 5]. Активация
сукцинатоксидазного пути окисления способствует увеличению резистентности организма в ранний
период интоксикации. Ферменты глицерофосфатного «челночного» механизма митохондриального
переноса электронов (α-ГФДГ мит. и α-ГФДГ цит.)
характеризуют напряженность энергетического
обмена. Активация этих ферментов свидетель-
РЕЗУЛЬТАТЫ
Начало фтористой затравки характеризовалось
наличием достаточно заметных изменений параметров периферической крови животных (табл. 1).
К концу первой недели и до конца эксперимента
в крови опытных крыс наблюдалось развитие относительного лейкоцитоза.
В течение 2–4 суток эксперимента наблюдалась тенденция к увеличению количества эритроцитов в периферической крови на фоне достоверного снижения уровня гемоглобина. В течение 1–3
недель количество эритроцитов в группе с фтористой интоксикацией выравнивалось с контролем,
впоследствии достоверно повышаясь на 6 неделе,
одновременно с поступательным падением в них
уровня гемоглобина на 10 % от контроля. Фтор,
образуя комплексы с ионами металлов, блокирует
ферменты, участвующие в синтезе гема. В то же
время увеличение количества эритроцитов на ранних сроках фтористой интоксикации свидетель-
Таблица 1
Показатели периферической крови крыс в динамике фтористой интоксикации
Показатель
Эритроциты, 1012/л
Гемоглобин, г/л
Лейкоциты, 109/л
Сроки затравки
Группа
животных
2 суток
4 суток
1 неделя
3 недели
6 недель
опыт
5,5 ± 0,13
5,3 ± 0,07
5,0 ± 0,26
5,4 ± 0,35
5,6 ± 0,08*
контроль
5,2 ± 0,20
4,9 ± 0,26
5,3 ± 0,30
5,2 ± 0,08
5,1 ± 0,07
опыт
125,7 ± 1,4
114,2 ± 0,6***
121,6 ± 2,8
120,4 ± 2,3*
119,7 ± 0,9*
контроль
129,8 ± 4,9
127,5 ± 2,6
130,7 ± 8,4
130,5 ± 3,2
128,7 ± 3,3
опыт
7,1 ± 1,34
8,9 ± 0,95
10,8 ± 1,1*
11,0 ± 2,32
11,0 ± 1,24
контроль
6,1 ± 0,46
8,6 ± 1,01
7,2 ± 0,91
6,9 ± 0,91
8,6 ± 0,55
Примечания: * – р < 0,05; ** – р < 0,01; *** – р < 0,001 – достоверное различие по сравнению с контрольной группой животных.
Активность СДГ, ед. эксп.
14
12
10
***
**
*
***
8
6
4
контроль
2
опыт
0
2 сут.
4 сут.
1 нед.
3 нед.
6 нед.
9 нед.
12 нед.
Сроки затравки
Рис. 1. Изменение активности сукцинатдегидрогеназы в лимфоцитах периферической крови крыс в динамике фтористой
интоксикации. Примечания: * – р < 0,05; ** – р < 0,01; *** – р < 0,001 – достоверное различие по сравнению с
контрольной группой животных.
44
Методологические аспекты гигиенических исследований
ÁÞËËÅÒÅÍÜ ÂÑÍÖ ÑÎ ÐÀÌÍ, 2010, ¹ 4 (74)
ствует о функциональной мобилизации защитных
систем лимфоцитов, возникающей в результате
воздействия различных химических факторов [1,
4] и имеющей неспецифический характер. Обнаруженные изменения свидетельствуют об активации
аэробных процессов превращения субстратов в
клетках и отражают срочный компенсаторный
механизм мобилизации базовых энергетических
ресурсов клетки в условиях сравнительно небольших по силе внешних воздействий [5].
Активность лизосомальных ферментов является чувствительным маркером клеточного «неблагополучия», отражает динамику клинического
течения патологического процесса, его прогностическое значение и уровень клеточной деструкции
[13]. Маркерным ферментом лизосом, характеризующим катаболические процессы в клетке,
является КФ. На ранних сроках интоксикации (4-е
сутки) ее уровень повышался на 14 %, а далее, с 1-й
по 3-ю неделю, поступательно снижался на 14 % по
сравнению с контролем и возрастал к 9-й неделе
эксперимента на 33 % (рис. 2). Активация КФ на
ранней стадии ФИ обеспечивает энергетические
потребности клетки и является маркером усиления гликолиза. Снижение активности к 3-й неделе
Кислая фосфатаза, ед. эксп.
0,3
интоксикации показывает изменение направления
метаболических процессов с преобладанием анаболических реакций и усиленного глюконеогенеза
для создания оптимального уровня глюкозы за счет
углеродных скелетов аминокислот.
Одним из наиболее чувствительных к направленному действию фтора ферментов считается
ЩФ, участвующая в транспорте фосфора через
мембрану клеток [12]. В литературных данных
о ходе клинического обследования людей, подвергавшихся длительному воздействию фтора в
условиях производства (гальванические цеха алюминиевого завода), не отмечено снижения уровня
ЩФ в гранулоцитах крови. Напротив, наблюдалась
активация фермента при продолжительном стаже
работы (7–15 лет) [8].
Проведенное нами исследование активности
ЩФ в лейкоцитах периферической крови крыс,
получавших фторид натрия, показало снижение
ее активности в нейтрофилах, отражающее уменьшение образования макроэргических фосфорных
соединений в организме. Ингибирующий эффект
выявлен уже на 4-е сутки после начала введения
токсиканта (снижение активности на 47 %), что говорит о наличии специфичной реакции на фториды
***
*
0,25
**
0,2
0,15
0,1
0,05
контроль
опыт
0
2 сут.
4 сут.
1 нед.
3 нед.
6 нед.
9 нед.
12 нед.
Сроки затравки
Рис. 2. Изменение активности кислой фосфатазы в лимфоцитах периферической крови крыс в динамике фтористой
интоксикации. Примечания: * – р < 0,05; ** – р < 0,01; *** – р < 0,001 – достоверное различие по сравнению с контрольной группой животных.
Активность щелочной
фосфатазы, ед. эксп.
0,35
**
0,3
0,25
***
0,2
0,15
**
**
0,1
контроль
0,05
опыт
0
2 сут.
4 сут.
1 нед.
3 нед.
6 нед.
9 нед.
12 нед.
Сроки затравки
Рис. 3. Изменение активности щелочной фосфатазы в лейкоцитах периферической крови крыс в динамике фтористой
интоксикации. Примечания: * – р < 0,05; ** – р < 0,01; *** – р < 0,001 – достоверное различие по сравнению с контрольной группой животных.
Методологические аспекты гигиенических исследований
45
ÁÞËËÅÒÅÍÜ ÂÑÍÖ ÑÎ ÐÀÌÍ, 2010, ¹ 4 (74)
со стороны ЩФ в начальный период интоксикации
(рис. 3). К 3-й неделе наблюдалась активация данной ферментной системы (на 61 %), что согласуется
с литературными данными [9, 14] и подтверждает
активацию анаболических процессов в организме.
Таким образом, цитохимические методы исследования лейкоцитов крови дают устойчивые и
корректные результаты, позволяющие определить
начало развития декомпенсаторных процессов
до выявления функциональных расстройств на
уровне организма.
Разнонаправленность ответной реакции при
хронической интоксикации фторидом натрия
отмечалась лишь для ЩФ на ранних стадиях. Изменения активности СДГ, α-ГФДГ и КФ являются
неспецифичными на всех этапах эксперимента [8,
12], в то время как отмеченная нами способность к
угнетению ЩФ относится к эффектам, специфичным для фторидов на ранних сроках интоксикации.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Перестройка ферментного статуса лейкоцитов
позволяет осуществить долгосрочный прогноз влияния аккумуляции фтора на состояние организма.
Полученная нами информация о фазовых изменениях, отмеченных на уровне цитохимических показателей в динамике ранних стадий хронических
интоксикаций, и достоверный характер выявленных
изменений может явиться основой для разработки
дополнительных критериев, используемых в комплексной оценке состояния здоровья людей, контактирующих с профессиональными вредностями.
ЛИТЕРАТУРА
1. Белоскурская Г.И., Балмахаева Р.М. Функционально-морфологические особенности лейкоцитов у больных с хронической фосфорной
интоксикацией // Гигиена труда и проф. забол. –
1982. – № 9. – С. 46–48.
2. Васин М.В., Королева Л.В. Активация сукцинатоксидазной системы клеток при патофизиологических состояниях организма // Митохондрии
в патологии : мат. Всерос. совещания. – Пущино,
2001. – С. 25–27.
3. Долгушин М.В. и др. Цитохимическая оценка
метаболических изменений в лейкоцитах периферической крови крыс в условиях хронической
интоксикации тетрафторидом германия // Бюлл.
ВСНЦ СО РАМН. – 2005. – № 1 (39). – С. 157–160.
4. Иванова Л.А. Цитохимия ферментов клеток
крови в диагностике, оценке характера течения и
эффективности терапии некоторых профессиональных заболеваний : автореф. дис. … докт. мед.
наук / НИИ ГТ и ПЗ АМН СССР. – М., 1991. – 47 с.
5. Лукьянова Л.Д. Сигнальная функция митохондрий при гипоксии и адаптации // Патогенез.
– 2008. – № 3. – С. 4–12.
6. Макарьева И.В. и др. Значение цитохимического исследования внутриклеточного метаболизма нейтрофилов в оценке воздействия продуктов
хлорорганического производства // Клин. лаб.
диагностика. – 2004. – № 9. – С. 42–43.
7. Микашинович З.И. Действие различных
факторов на кровь // Бюл. экспер. биол. – 1980. –
№ 10. – С. 418–420.
8. Окунев В.Н., Смоляр В.И., Лаврушенко Л.Ф.
Патогенез, профилактика и лечение фтористой
интоксикации. – Киев, 1987. – 152 с.
9. Очиров И.А. Закономерности изменений
репаративно-регенеративных процессов при переломах длинных костей в условиях хронической
интоксикации фторидом натрия : автореф. дис.
… канд. мед. наук / ВСНЦ СО РАМН. – Иркутск,
2003. – 23 с.
10. Павлюченко И.И. Окислительный стресс,
его мониторинг и критерии оценки антиокислительной активности лекарственных препаратов
и БАД : автореф. дис. ... докт. мед. наук. – М.,
2005. – 34 с.
11. Рязанцева Н.В. и др. Эритроцит при патологии: размышления у электронного микроскопа
// Арх. патологии. – 2004. – № 3. – С. 53–61.
12. Строчкова Л.С., Сороковой В.И. Влияние
неорганических соединений фтора на ферменты
клетки // Успехи соврем. биол. – 1983. – Т. 96,
Вып. 2. – С. 211–223.
13. Цыганкова О.В., Руяткина Л.А., Бондарева З.Г. Лизосомальные ферменты. Новый взгляд
на фундаментальные материи с позиций кардиолога // Цитокины и воспаление. – 2009. – № 4. –
С. 5–11.
14. Borysewicz-Kewicka M., Kobylanska M.
Peridоntal disease, oral hygiene and fluoride content
of dental deposits in aluminum worker // Fluoride. –
1983. – Vol. 16, N 1. – P. 5–10.
15. Kilfer C.R., Snyder L.M. Oxidation and erythrocyte senescence // Curr. Opin. Hematol. – 2000. –
N 7. – P. 113–116.
Сведения об авторах
Михайлова Надежда Николаевна – д.б.н., профессор, зав. лабораторией экспериментальных гигиенических исследований НИИ КПГПЗ СО РАМН (654041, Кемеровская область, г. Новокузнецк, ул. Кутузова, 23; тел./факс: 8 (3843) 79-66-69,
тел.: 8 (3843) 79-69-79; e-mail: fiskaf@mail.ru)
Горохова Лариса Геннадьевна – к.б.н., научный сотрудник лаборатории экспериментальных гигиенических исследований
НИИ КПГПЗ СО РАМН (654041, Кемеровская область, г. Новокузнецк, ул. Кутузова, 23; тел./факс: 8 (3843) 79-66-69, тел.:
8 (3843) 79-69-79; e-mail: fiskaf@mail.ru)
Казицкая Анастасия Сергеевна – биолог лаборатории популяционной генетики НИИ КПГПЗ СО РАМН (654041, Кемеровская область, г. Новокузнецк, ул. Кутузова, 23; тел./факс: 8 (3843) 79-66-69, тел.: 8 (3843) 79-69-79; e-mail: fiskaf@mail.ru).
Масленникова Елена Николаевна – м.н.с. лаборатории экспериментальных гигиенических исследований НИИ КПГПЗ
СО РАМН (654041, Кемеровская область, г. Новокузнецк, ул. Кутузова, 23; тел./факс: 8 (3843) 79-66-69, тел.: 8 (3843) 7969-79; e-mail: fiskaf@mail.ru)
Щербакова Дарья Александровна – аспирант лаборатории экспериментальных гигиенических исследований НИИ КПГПЗ
СО РАМН (654041, Кемеровская область, г. Новокузнецк, ул. Кутузова, 23; тел./факс: 8 (3843) 79-66-69, тел.: 8 (3843) 7969-79; e-mail: fiskaf@mail.ru)
46
Методологические аспекты гигиенических исследований