файл диссертации в формате (2762 Kb.)
реклама
1 МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ федеральное государственное бюджетное учреждение «НАУЧНЫЙ ЦЕНТР АКУШЕРСТВА, ГИНЕКОЛОГИИ И ПЕРИНАТОЛОГИИ ИМЕНИ АКАДЕМИКА В.И. КУЛАКОВА» На правах рукописи ГОРШИНОВА Виктория Константиновна ПЕРСОНАЛИЗАЦИЯ ПРОГРАММЫ ЭКСТРАКОРПОРАЛЬНОГО ОПЛОДОТВОРЕНИЯ У ЖЕНЩИН С ИЗБЫТОЧНОЙ МАССОЙ ТЕЛА И ОЖИРЕНИЕМ НА ОСНОВАНИИ ОЦЕНКИ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ МИТОХОНДРИАЛЬНОГО АППАРАТА 14.01.01 – акушерство и гинекология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: доктор медицинских наук Смольникова В.Ю. кандидат биологических наук Высоких М.Ю. Москва- 2016 2 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ…………………………………………………………………….5 ГЛАВА 1. Проблемы избыточного веса при лечении в программах ЭКО (обзор литературы)…………………………………………...……….………13 1.1 Влияние ожирения на уровень половых гормонов и репродуктивную систему…………………………………..………...16 1.2 Инсулин, адипокины и их воздействие на репродуктивную систему в норме и при ожирении…………………………………....18 1.3 Влияние ожирения на течение и исход беременности……………………………………………………….....22 1.4 Особенности лечения женщин с избыточной массой тела с использованием современных репродуктивных технологий.……..24 1.5 Влияние ожирения на рецептивность эндометрия………...…...27 1.6 Влияние ожирения на ранние этапы оплодотворения………….30 1.7 Митохондриальный аппарат и репродуктивная система………31 1.8 Окислительный стресс и хроническое воспаление……………..35 1.9 Окислительный метаболизм в оогенезе и раннем эмбриогенезе………………………………………………….........….39 1.10 Энергетический метаболизм и состояние митохондриального ретикулума в кумулюсных клетках………………………………..44 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ………….........46 2.1. Материал исследования………………………………………………….46 2.2 Дизайн исследования……………………………………………………..47 2.3. Методы исследования…………………………………………………....48 2.3.1. Общеклинические методы исследования………………….…50 2.3.2. Гормональное исследование…………………………………52 2.3.3. Ультразвуковое исследование органов малого таза………....53 2.3.4. Спермиологическое исследование эякулята………………….53 2.3.5 Специальные методы исследования…………………………...55 2.3.6. Протокол стимуляции функции яичников……………………61 3 2.3.7. Трансвагинальная пункция яичников…………………...……62 2.3.8 Метод оплодотворения и культивирования дробящихся эмбрионов in vitro .................................................................................62 2.3.9 Перенос эмбрионов в полость матки……………...………….64 2.3.10 Поддержка лютеиновой фазы и посттрансферного периода…………………………………………………………...……65 2.3.11 Диагностика наступления беременности…………………..65 2.3.12 Статистический анализ полученных данных……………..…65 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ………. 68 3.1. Клинико-анамнестическая характеристика включенных в исследование супружеских пар……………………………………...……………………….69 3.1.1. Возрастная характеристика супружеских пар……………..…69 3.1.2 Антропометрическая характеристика пациенток…………...70 3.1.3. Социально-экономические характеристики исследуемых групп………………………………………………………………..….73 3.1.4. Характеристика менструальной функции женщин…………73 3.1.5. Репродуктивный анамнез пациенток……………………….....74 3.1.6. Характеристика женщин по перенесенным гинекологическим заболеваниям и оперативным вмешательствам………………….....78 3.1.7. Гормональный профиль пациенток, включенных в исследование…………………………………………………….…….81 3.2. Особенности лечения в программе ЭКО у женщин с избыточной массой тела…………………………………………………………………..83 3.2.1. Особенности стимуляции суперовуляции, фолликуло- и оогенеза у пациенток в исследуемых группах………………..…….83 3.2.2. Характеристика раннего эмбриогенеза и исходов программ ВРТ у пациенток в исследуемых группах……………………...……87 3.2.3. Характеристика раннего эмбриогенеза у пациенток исследуемых групп……………………………………….…………...91 4 3.3. Ассоциация уровня адипокинов и провоспалительных цитокинов с особенностями фолликуло, оо- и раннего эмбриогенеза…………………94 3.4. Оценка функционального состояния митохондрий в мононуклеарах периферической крови и антиоксидантной активности у пациенток исследуемых групп……………………………………………………....…..103 3.5. Оценка трансмембранного потенциала митохондрий в клетках кумулюса у женщин с различным ИМТ…………………………………..106 3.6. Прогнозирование наступления клинической беременности на основании оценки ИМТ, уровня адипокинов и функциональной активности митохондрий МПК………….……………………………………………….108 ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ……………………….....…..113 ВЫВОДЫ………………………………………………………………….....127 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ……………………………………129 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ………………………………………………….131 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ…………………………………………………...134 5 ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы исследования Бесплодие среди супружеских пар достигает 10-15% и является одной и основных проблем современной медицины [80]. Не менее важной проблемой современного общества является эпидемия ожирения. При этом следует отметить, что возникновению данного заболевания наиболее подвержены женщины репродуктивного возраста [126]. Избыточная масса тела и ожирение определяются как аномальные и излишние жировые отложения, которые могут нанести ущерб здоровью. Избыточная масса является одной из причин нарушений менструальной функции, проявляющихся олигоменореей, ановуляцией и дисфункциональными маточными кровотечениями [111]. Однако стоит отметить, что даже при сохранении регулярного цикла, у женщин с данным заболеванием наблюдается снижение фертильности [115, 148]. Кроме того, избыточная масса коррелирует с различными сопутствующими заболеваниями, такими как ишемическая болезнь сердца, гипертония и сахарный диабет, что также может негативно отразиться на репродуктивной функции женщины. Ожирение повышает риск осложнений беременности, в том числе гестационной гипертензии, преэклампсии, гестационного диабета, макросомии плода и др., часто приводящих к необходимости оперативного родоразрешения [24, 91]. Данные исследований подтверждают, что степень ожирения у женщин обратно коррелирует с вероятностью наступления спонтанной беременности [18, 29, 47]. Однако вопрос о влиянии избыточной массы на ответ яичников при стимуляции фолликулогенеза и эффективность лечения методом экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) все еще остается открытым. В настоящее время данный вопрос широко обсуждается и большинство исследователей сходятся во мнении, что при использовании методов 6 вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) пациенткам с избыточной массой требуются более высокие дозы гонадотропинов. При этом у таких женщин получают меньшее количество ооцитов в результате стимуляции суперовуляции, отмечаются сниженная частота имплантации, наступления клинической беременности и более высокая частота самопроизвольных выкидышей [36, 66, 117]. Одним из молекулярных механизмов снижения репродуктивной функции может являться окислительный стресс [129]. Известно, что при ожирении происходит накопление жира и образование липидных включений, в том числе и в клетках вне жировой ткани, что приводит к развитию клеточного окислительного стресса практически во всех тканях и органах. В ответ на постоянный окислительный стресс и опосредованную им индукцию провоспалительных цитокинов часто возникает асептическое воспаление, носящее хронический очаговый и даже системный характер [56]. Таким образом, можно предположить, что ожирение посредством индукции окислительного стресса и развития хронического воспаления оказывает негативное воздействие на ткань яичника, уменьшая овариальный резерв. С другой стороны, известно, что как клеточный, так и тканевой окислительный стресс опосредованы дисфункцией митохондрий. Митохондрии – это мультифункциональные внутриклеточные органеллы, сопрягающие процесс аэробного окисления продуктов метаболизма углеводов и фосфорилирования адениновых нуклеотидов. Одной из основных функций митохондрий является поддержание энергетического баланса клетки и создание необходимого для клеточных процессов уровня эквивалентов свободной энергии в виде аденозинтрифосфата (АТФ). Состояние ооцита также зависит от полноценного функционирования митохондрий, обеспечивающих необходимый уровень АТФ. Ранее было показано, что определяющее значение в успешном оплодотворении и развитии предимплантационных митохондрий [105]. эмбрионов имеет функциональное состояние 7 Ожирение у самок мышей приводит к митохондриальной дисфункции в ооцитах и зиготах, опосредованной стресса: гиперполяризации, развитием состояния окислительного возрастанию скорости репликации митохондриальной ДНК и уровня биогенеза митохондриальных мембран. Эти данные подтверждают теорию, согласно которой избыточная калорийность пищи и, в частности, высокая доля жиров приводит к увеличению активности митохондрий на фоне индуцированного окислительного стресса, что в конечном итоге приводит к митохондриальной дисфункции и негативно влияет на качество ооцитов [57, 86]. Сегрегация хромосом в метафазе является высоко энергозависимым процессом, то есть ооциту для нормальной работы веретена деления и предотвращения развития анеуплоидий необходим достаточный уровень АТФ, а факторы, нарушающие способность митохондрий синтезировать АТФ, снижают качество ооцитов [72]. Так в работе Machtinger R. с соавторами (2012) было показано, что в неоплодотворившихся ооцитах женщин с морбидным ожирением (индекс массы тела (ИМТ) ≥ 35.0 кг/м2) значительно чаще, чем у женщин с нормальным весом, обнаруживалось два веретена деления или преобладали клетки с дезорганизованным веретеном и неправильным расположением хромосом [140]. Предполагают, что снижение синтеза энергии в виде АТФ на фоне дисфункции митохондриального аппарата у женщин с ожирением приводит к высокому уровню анеуплоидий в ооцитах, высокой частоте образования аномальных эмбрионов, снижению частоты имплантации и наступлению клинической беременности и спонтанным выкидышам [25, 57]. В связи с этим, изучение молекулярных механизмов снижения фертильности у женщин с избыточной массой тела со стороны оценки хронического воспаления и окислительного стресса является актуальным и перспективным. Данное исследование позволит оптимизировать подход к лечению данной группы женщин и повысить эффективность лечения в программе ЭКО, в частности, добавив к показателю наступления клинической беременности возможность оценки вероятности живорождения. 8 Цель исследования: Персонализация программы ЭКО для женщин с избыточной массой и ожирением на базе комплексной оценки параметров системного окислительного стресса с учетом функциональной активности митохондрий мононуклеаров периферической крови. Задачи исследования: 1) Проанализировать клинико-анамнестические данные у обследуемых групп женщин. 2) Определить корреляцию гормонального профиля обследуемых женщин с количественными и качественными показателями фолликуло-, оогенеза и раннего эмбриогенеза во время проведения программы ЭКО. 3) Сопоставить данные сравнительного активности митохондрий кумулюсных клеток анализа функциональной с качеством полученных ооцитов и ранних эмбрионов 4) Изучить корреляцию концентрации адипокинов, общего глутатиона и функциональной активности митохондрий мононуклеаров периферической крови (МПК) с ответом яичников при стимуляции суперовуляции у женщин с нормальной и избыточной массой. 5) Провести сравнительный анализ частоты наступления беременности и живорождения в исследуемых группах с учетом измеренных показателей провоспалительных цитокинов, состояния митохондрий МПК и маркеров окислительного стресса. 6) Разработать алгоритм дифференцированного подхода в лечении женщин с избыточной массой тела в программе ЭКО. Научная новизна В настоящей работе получены новые данные об особенностях раннего оои эмбриогенеза и его взаимосвязь с концентрацией адипокинов в плазме крови у женщин с избыточной массой тела и ожирением. Впервые проведена оценка функциональной активности митохондрий МПК и уровня активности неферментативного звена антиоксидантной системы 9 у женщин с различной массой тела в рамках лечения бесплодия при помощи методов ВРТ. Также впервые при помощи флюоресцентной микроскопии и имиджевого анализа была оценена функциональная активность митохондрий кумулюсных клеток у женщин, проходящих лечение в программе ЭКО. Исследована ассоциация трансмембранного потенциала клеток кумулюса с показателем ИМТ исследуемых женщин. На основании полученных данных проведена комплексная научная оценка исходов программ ВРТ, а также выявлена прогностическая значимость изученных параметров. Практическая значимость В ходе проведенного исследования было показано снижение эффективности лечения в программе ЭКО и переносе эмбриона (ПЭ) у женщин, страдающих ожирением, проявляющееся на всех этапах – фолликуло-, оогенезе, эмбриогенезе, имплантации. При анализе уровня провоспалительных адипокинов, функциональной активности митохондрий и маркеров антиоксидантной системы нами были выявлены показатели, позволяющие прогнозировать вероятность наступления клинической беременности, а также вероятность живорождения в день проведения трансвагинальной пункции яичников. Полученные данные позволяют дифференцировать подход к лечению женщин с метаболическими нарушениями и ИМТ от 20,0 кг/м2 и выше. На основании проведенного анализа обоснована целесообразность определения ИМТ, уровня лептина в плазме крови, трансмембранного потенциала (ΔΨ) митохондрий МПК, а также доли МПК с высокополяризованными митохондриями при лечении бесплодия методами ВРТ наряду с принятым клинико-лабораторным обследованием. Разработан алгоритм персонализированного подхода к проведению программы ЭКО у женщин с избыточной массой тела, ожирением нарушениями при нормальных значениях ИМТ. и метаболическими 10 Представленные практические рекомендации позволят клиницистам изменить подход в лечении женщин, страдающих ожирением, тем самым способствовать улучшению эффективности лечения при помощи методов ВРТ, а также рождению здорового ребенка с меньшими рисками развития метаболических нарушений в последующей жизни. Положения, выносимые на защиту 1) ИМТ отрицательно коррелирует с показателем АМГ в плазме крови исследуемых женщин, что может свидетельствовать о негативном влиянии ожирения на состояние овариального резерва. 2) Негативное влияние ожирения на фолликуло-, оогенез и ранний эмбриогенез обусловлено состоянием системного хронического воспаления, ассоциированного с окислительным стрессом. 3) Значение ИМТ 28,5 является граничным и разделяет популяцию исследуемых женщин на 2 подгруппы. В интервале 18,5<ИМТ<28,5 кг/м2 наибольшее предиктивное значение имеют показатели уровня лептина в плазме крови и трансмембранного потенциала митохондрий в МПК до стимуляции суперовуляции. Для ИМТ≥28,5кг/м2 наибольшее предиктивное значение имеют показатель объема талии и разница трансмембранного потенциала митохондрий в МПК до и после проведения стимуляции суперовуляции. 4) Логистическая регрессионная модель на основе измерения концентрации лептина и общего глутатиона в плазме крови, числа полученных ооцитов, а также величины трансмембранного потенциала митохондрий МПК, позволяет достоверно предсказывать вероятность живорождения и на основании полученного прогноза рекомендовать перенос эмбриона в цикле лечения или в криопротоколе после нормализации метаболических нарушений. Личный вклад автора Автор непосредственно участвовал в выборе научного исследования, разработке цели и задач исследования, сборе материала, проведении и интерпретации результатов параметров энергопреобразующей функции МПК и 11 фунционального состояния митохондриального аппарата в клетках кумулюса, анализе, обобщении и статистической обработке полученных данных. Автор лично принимал участие в ведении пациенток на всех этапах лечения бесплодия в программе ЭКО и ПЭ. Соответствие диссертации паспорту полученной специальности Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.01.01 – «акушерство и гинекология». Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 4 и 5 паспорта акушерства и гинекологии. Апробация материалов диссертации Основные положения диссертации и результаты работы представлены и доложены на XV Всероссийском научном форуме «Мать и Дитя» (Москва, 2014), VI Конгрессе по «Репродуктивной эндокринологии и бесплодию» (Анталия, Турция, международным 2014), XХI участием Всероссийском научном «Амбулаторно-поликлиническая конгрессе помощь: с от менархе до менопаузы» (Москва, 2015). Работа обсуждена на межклинической конференции отделения вспомогательных технологий в лечении бесплодия (06.08.2015 г) и заседании апробационной комиссии ФГБУ «НЦАГиП им. В.И. Кулакова» Минздрава России (19.10.2015 г, протокол № 9). Внедрение результатов исследования в практику Результаты исследования внедрены и используются в практической работе отделения вспомогательных технологий в лечении бесплодия и лаборатории митохондриальной медицины Кулакова» Минздрава России. ФГБУ «НЦАГиП им. В.И. 12 По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, из которых 4 входят в перечень рецензируемых научных журналов и изданий, рекомендованных ВАК. Структура и объем диссертации Диссертация изложена в традиционной форме на 148 страницах машинописного текста. Состоит из оглавления, введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций, списка сокращений и списка литературы. Работа иллюстрирована 22 таблицами и 29 рисунками. Библиографический указатель включает 159 литературных источника, из них 13 русскоязычных и 146 иностранных работ. 13 ГЛАВА 1. ПРОБЛЕМЫ ИЗБЫТОЧНОГО ВЕСА ПРИ ЛЕЧЕНИИ В ПРОГРАММАХ ЭКО (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ) В настоящее время в мире около 10-15% пар страдают бесплодием [80]. Динамика изменения демографических показателей в различных странах ставит проблему бесплодного брака в ряд основных проблем современной медицины и придает ей важное медико-биологическое и социальное значение [1]. Частота бесплодных браков высока во всех странах мира и не имеет тенденции к снижению, в связи с чем растет спрос на медицинские услуги по лечению бесплодия c использованием методов ВРТ. На основании проведенного Mascarenhas M.N. и соавторами масштабного исследования частоты распространения бесплодия во всем мире, включая Россию, с 1990 по 2012 гг., не было выявлено значительного увеличения данного показателя за указанный период времени. Согласно опубликованным данным, количество бесплодных пар по всему миру на 2010 год составило 48.5 млн. Для России показатель распространения первичного бесплодия среди женщин в возрасте 20-44 лет составил 1.9%, а вторичного бесплодия - 3.2%, что превышает аналогичный уровень для развитых стран, но находится в пределах среднего биологического уровня распространения бесплодия в популяции человека [109]. Не менее важной проблемой современного общества является эпидемия ожирения. Примерно 1.6 миллиарда взрослого населения (от 15 лет и старше) имеют избыточный вес и около 400 миллионов страдают ожирением [58, 125]. Что касается скорости распространения ожирения, следует отметить, что наиболее высокие темпы во всех странах отмечаются среди подрастающего поколения. При этом, хотя распространение ожирения отмечено для различных этногрупп, наблюдается его значительное превалирование в развитых странах, а в некоторых регионах мира ожирением страдает половина населения. Высокий процент распространения этого феномена обусловлен сложным 14 взаимодействием таких факторов, как генетическая предрасположенность, окружающая среда и социальное поведение человека [110]. Значимость проблемы состоит в первую очередь в том, что на данный момент ожирение уже обогнало фактор курения как ведущую причину преждевременной смерти в большинстве развитых стран и в настоящее время рассматривается в качестве одной из серьезных угроз здоровью человека [138]. Так, установлено, что ожирение является ключевым фактором риска развития серьезных хронических заболеваний, таких как нарушения сердечно-сосудистой системы, сахарный диабет 2 типа, онкологические заболевания, метаболический синдром, а также приводит к дисфункции репродуктивной системы. В частности, ожирение признано одной из ведущих причин развития бесплодия [80]. О негативном влиянии ожирения на репродуктивную функцию писал еще Гиппократ в своем трактате о скифах – «люди такой конституции не могут быть плодовитыми…виной тому полнота и мягкотелость. Матка у таких женщин не способна принять семя, а менструации нечастые и скудные» [63]. Механизмы снижения фертильности при ожирении до сих пор до конца не изучены. Было выявлено, что у женщин с ожирением частота бесплодия в три раза выше, чем у женщин с нормальным ИМТ [74]. У таких пациенток даже при наличии нормального овуляторного цикла отмечается снижение фертильности [18, 115, 148, 150]. Было показано, что при уровне ИМТ>25 кг/м2 наблюдается значительное удлинение отрезка времени от возникновения у женщины желания реализации репродуктивной функции до наступления беременности [59]. Увеличение данного временного периода может также носить и вторичный характер - вследствие снижения частоты половых контактов у людей, страдающих ожирением (в том числе между постоянными половыми партнерами), по сравнению с людьми, имеющими нормальную массу тела [22,30]. Было предположено, что снижение полового влечения у людей, страдающих ожирением, вызвано снижением уровня дофамина и повышением уровня серотонина в головном мозге, что является вторичным вследствие 15 переедания. Кроме того, повышенное потребление сахара может иметь фармакологический эффект, трансформируя сексуальное желание в сигнал к приему пищи рассматривать [30]. Таким образом, как результат снижение взаимодействия фертильности набора следует определенных патофизиологических изменений и социобиологических факторов. Среди различных показателей, характеризующих степень ожирения, ИМТ является основным [155]. Однако использование только ИМТ без учета остальных параметров может быть подвергнуто критике, поскольку этот показатель не учитывает соотношение жировой и мышечной масс, а так же тип распределения жировой ткани (ЖТ) у индивида. Например, мускулистый спортсмен может быть классифицирован как страдающий избыточным весом или ожирением, при том, что в его организме будет мало жировой ткани. Существующий метод точного количественного определения весовой доли ЖТ от общей массы тела, основанный на измерении суммарного показателя магнитного момента вращения диполей воды (денситометрия жировой ткани методом магнитного резонанса), доступен в клиниках высокого уровня и обладает высокой стоимостью, что сужает область его применения. Наконец, при расчете степени ожирения и оценке риска развития ассоциированных с ним заболеваний на основании измерения ИМТ необходимо принимать во внимание этнические характеристики, так как показатели избыточного веса и ожирения для жителей азиатских стран отличны от европейского населения. Эпидемиологические исследования показали, что представители монголоидной расы начинают страдать от заболеваний, связанных с избыточной массой тела, при более низком значении ИМТ по сравнению с европейцами, а негроиды – при более высоком, соответственно. Так, у представителей негроидной расы порог избыточного веса начинается с 26,3 кг/м2, а у лиц полинезийского происхождения - с 29,5 кг/м2 [155]. Таким образом, ИМТ остаётся единственно признанным международным критерием оценки веса. C целью более точной оценки типа распределения ЖТ, по рекомендации Всемирной Организации Здравоохрания (ВОЗ), вместе с ИМТ 16 следует проводить измерение окружности талии (ОТ) и бедер (ОБ) и оценивать соотношение объема талии к объему бедер (ОТ/ОБ). При таком подходе к определению типа распределения жировой ткани наиболее прогностически неблагоприятным вариантом ожирения оказывается висцеральный тип, характеризующийся отложением жировой ткани преимущественно в области живота и внутренних органов. Известно, что висцеральная ЖТ метаболически наиболее активна, и это является основным фактором риска развития заболеваний, ассоциированных с ожирением, в то время как периферическая ЖТ метаболически малоактивна [53]. Было показано, что при центральном типе ожирения, определяемом как увеличенный объем талии (более 80 см) или высокое значение соотношения ОТ/ОБ (более 0,8), происходит снижение фертильности [139]. Датский исследователь Zaadsta B.M. с соавторами отметили, что увеличение отношения ОТ/ОБ на 0.1 приводит к снижению вероятности наступления беременности на 30% [47]. Принимая во внимание вышесказанное, стоит подчеркнуть необходимость дальнейшего изучения основополагающих механизмов влияния ожирения на репродукцию и поиска методов эффективного снижения избыточной массы тела с целью коррекции метаболических нарушений. 1.1. Влияние ожирения на уровень половых гормонов и репродуктивную систему За последние десятилетия представления клинических специалистов о функциях ЖТ претерпели значительные изменения. Ранее ЖТ расценивалась лишь как источник энергетически богатых субстратов окисления, необходимый для поддержания потребностей организма в различных метаболических состояниях. В современном представлении ЖТ рассматривается также как эндокринный орган (жировая железа), клетки которого обладают значительным потенциалом роста и способностью к гипертрофии. Это сложный гормонально активный орган, который секретирует молекулы, обладающие 17 ауто/паракринной и эндокринной активностью, и играет важную роль в регуляции энергетического баланса и гомеостаза всего организма [2, 5]. Жировая ткань (ЖТ) является не только значимым источником синтезируемых стероидных гормонов, но и местом конверсии андрогенов в эстрогены в реакции, катализируемой ароматазой, а также эстрадиола в эстрон и дегидроэпиандростерона в андростендиол и т.д. При этом по мере увеличения объема жировой ткани происходит активация этих процессов [111]. Наконец, посредством контроля уровня экспрессии транспортных белков - глобулинов, связывающих половые гормоны (ГСПГ), жировая ткань участвует в регуляции биодоступности стероидных гормонов. Известно, что распределение ЖТ в организме оказывает важное влияние на концентрацию ГСПГ в периферической крови. Так, у женщин с висцеральным типом ожирения отмечается выраженное снижение концентрации ГСПГ в сыворотке крови по сравнению с женщинами с нормальным типом распределения ЖТ. При этом концентрация сывороточных ГСПГ обратно пропорциональна соотношению ОТ/ОБ [111]. Снижение ГСПГ приводит к повышению концентрации свободных дигидротестостерон и андрогенов, андростендиол. таких Повышение как уровня тестостерон, эстрогенов, образующихся в результате периферической конверсии андрогенов, по механизму отрицательной обратной связи воздействует на гипофиз, что приводит к гиперсекреции лютеинизирующего гормона (ЛГ), что, в свою очередь, ведет к стимуляции продукции андрогенов в клетках теки яичника и развитию относительной гиперандрогенемии. Образующиеся андрогены в адипоцитах подвергаются ароматизации в эстрогены, замыкая, таким образом, круг положительной обратной связи, приводящий к быстрому нарастанию концентрации стероидов в крови и десинхронизации процессов, формирующих менструальный цикл. В результате происходит нарушение фолликулогенеза и атрезия фолликулов [29]. Поскольку ожирение нарушает баланс работы ансамбля гормонов, контролирующего активность репродуктивной системы, изменяя не только 18 продукцию, но и биодоступность половых гормонов, вышеописанные изменения приводят к нарушению функционирования гипоталамо- гипофизарно-яичниковой оси. Подобные нарушения проявляется частыми нарушениями менструального цикла по типу олигоменореи, ановуляции и дисфункциональных маточных кровотечений у данной группы женщин [111, 121]. 1.2. Инсулин, адипокины и их воздействие на репродуктивную систему в норме и при ожирении Инсулин Яичник является органом-мишенью для инсулина, который оказывает свое воздействие через рецепторы к инсулину и инсулино-подобному фактору роста 1 (ИПФР-1). Эти рецепторы обнаружены в клетках гранулезы, теки и в стромальной ткани яичника. Инсулин стимулирует стероидогенез в клетках теки и гранулезы, усиливая действие ЛГ за счет индукции экспрессии и увеличения числа его рецепторов [146]. Кроме того, инсулин оказывает свое действие на уровне гипофиза, где повышает чувствительность гонадотрофов к гонадолиберину, что приводит к активации стероидогенеза в яичниках [146]. ИПФР-1 участвует в пролиферации и дифференцировке клеток, контролируя в них биосинтез белка. Часто при ожирении в организме развивается состояние гиперинсулинемии и инсулинорезистентности. В печени и яичниках инсулин ингибирует синтез белка, связывающего ИПФР-1, в результате концентрация ИПФР-1 повышается, что негативно отражается на фолликуло-, оо- и эмбриогенезе. Эти изменения способствуют увеличению ановуляторных циклов, ранних репродуктивных потерь частоты и снижению фертильности у женщин с избыточной массой тела [121, 127]. Адипокины. Адипокины - это белковые молекулы, синтезируемые клетками ЖТ, которые играют ключевую роль в регуляции энергетического метаболизма, контролируя чувство голода и насыщения при потреблении пищи, а также 19 участвуя в регуляции распределения ЖТ. Адипокины определяют чувствительность тканей к инсулину, а также принимают участие в индукции или блокировании каскада воспалительных реакций. Наиболее изученными адипокинами являются лептин, адипонектин, ИЛ-6, фактор некроза опухоли-α (ФНО-α), резистин. Также список известных адипокинов дополняют ретинолсвязывающий белок 4, васпин, висфатин, гепсидин и др., но биологическая роль каждого из них ясна не до конца [26, 122]. При избыточном накоплении ЖТ наблюдается изменение профиля экспрессии адипокинов, что приводит к нарушению метаболических процессов во всех органах и тканях организма. Недавно было обнаружено, что адипокины оказывают воздействие на все уровни репродуктивной системы, регулируя стероидогенез в яичниках, созревание ооцитов и развитие эмбрионов, а также создают благоприятную среду в матке для имплантации эмбриона и его дальнейшего развития [14]. Адипокины являются своего рода связующим звеном между энергетическим метаболизмом и репродуктивной системой. Показано, что изменение концентрации адипокинов в плазме крови сопряжено с изменением уровня оксидативного стресса. Так, увеличение концентрации ФНО-α, ИЛ-6, лептина и снижение концентрации адипонектина ассоциировано со снижением активности антиоксидантной системы [4]. Лептин – это белок, который в основном синтезируется адипоцитами ЖТ, кроме того его синтез отмечается в желудке, плаценте, фолликулярной жидкости и молочной железе [28]. Лептин участвует в регуляции энергетического обмена и контролирует массу тела, влияя на аппетит и порог насыщения при потреблении пищи, а также играет важную роль в репродуктивной функции, при нормальных сывороточных концентрациях оказывая стимулирующее действие на гипоталамо-гипофизарно-яичниковую ось. Рецепторы лептина обнаружены в гипоталамусе и гипофизе, что свидетельствует о его участии в секреции гонадотропинов [121]. При этом уровень циркулирующего лептина положительно коррелирует с абсолютной 20 величиной жировой массы организма [29]. Лептин действует на гипоталамус, блокируя синтез и высвобождение нейропептида Y, вызывающего чувство голода, вследствие чего его называют гормоном насыщения. У людей с избыточной массой тела отмечается повышенная концентрация лептина в плазме крови, но при этом подавления аппетита или улучшения метаболических показателей не происходит в связи с развитием к нему резистентности [113]. Интересно, что в течение менструального цикла уровень лептина в сыворотке крови незначительно изменяется. Небольшой подъем концентрации происходит в фолликулярной фазе, а максимальная концентрация совпадает с пиком повышения уровня ЛГ перед овуляцией, что, вероятнее всего, свидетельствует о возможном участии лептина в процессе имплантации [136]. У человека и грызунов в эндометрии и клетках предимплантационных эмбрионов, а также в клетках гранулезы и теки были обнаружены рецепторы к лептину и его мРНК, что указывает на способность лептина влиять на стероидогенез в ткани яичника у млекопитающих [78]. По мере увеличения жировой массы уровень лептина в сыворотке крови и фолликулярной жидкости повышается, что оказывает ингибирующее действие на фолликулогенез, нарушая отбор доминантного фолликула и овуляцию [139]. В исследовании Merhi Z. с соавторами (2013) было обнаружено, что лептин подавляет экспрессию антимюллерова гормона (АМГ) и рецепторов АМГ 2 типа (АМГР-2) в клетках кумулюса и пристеночных клетках фолликула (гранулезе) [77]. Freeman E.W. с соавторами (2007) исследовали динамические показатели уровня АМГ для женщин репродуктивного возраста с ожирением и нормальной массой тела. У женщин репродуктивного возраста с ожирением было отмечено снижение уровня циркулирующего в плазме крови АМГ в среднем на 65%, при этом количество антральных фолликулов было одинаковым в обеих исследуемых группах [21]. Следует отметить, что другими исследователями отрицательной корреляции между ИМТ и АМГ обнаружено не было [45], в связи с чем этот вопрос на данный момент остается открытым. 21 Адипонектин ̶ это гликопротеин, который экспрессируется исключительно адипоцитами, при этом его синтез подкожной жировой тканью выше, чем висцеральной [28]. В отличие от других адипокинов, его концентрация в плазме крови при ожирении или абдоминальном распределении ЖТ снижается. Этот парадокс объясняют наличием ингибиторов экспрессии и секреции адипонектина, вырабатываемых жировой тканью [7]. Уровень адипонектина в плазме крови обратно пропорционален массе жировой ткани и показателю отношения ОТ/ОБ [32]. Было показано, что адипонектин тормозит дифференцировку преадипоцитов, тем самым оказывая влияние на рост ЖТ. Адипонектин регулирует энергетический гомеостаз и оказывает противовоспалительный и антиатерогенный эффекты. Недавние исследования показали, что адипонектин приводит к повышению ИПФР-1, повышая чувствительность тканей к инсулину, индуцирующему синтез стероидов клетками гранулезы [15]. Интерлейкин 6 (ИЛ-6) является медиатором воспаления, при этом примерно 1/3 циркулирующего в организме ИЛ-6 вырабатывается адипоцитами. Следует отметить, что в особенно большом количестве ИЛ-6 синтезируется именно в висцеральной ЖТ. В высокой концентрации ИЛ-6 подавляет активность ароматазы в клетках гранулезы, сглаживает преовуляторный пик ЛГ, снижает чувствительность тканей к инсулину [29, 55]. Ингибитор активатора плазминогена (ИАП-1) является важнейшим антагонистом тканевого активатора плазминогена, относится к группе сериновых протеаз и образуется в эндотелиальных клетках, гепатоцитах, но большинство циркулирующего в крови ИАП-1 вырабатывается клетками ЖТ. Функция ИАП-1 главным образом состоит в том, что этот белок подавляет в крови фибринолитическую активность, а также снижает чувствительность тканей к инсулину. При ожирении повышение ИАП-1 положительно коррелирует синдрома [29, 55]. с вероятностью развития метаболического 22 Фактор некроза опухоли-α (ФНО-α) ̶ это цитокин, экспрессия которого наиболее выражена в адипоцитах висцеральной ЖТ. ФНО-α подавляет синтез адипонектина, ухудшает передачу инсулиновых сигналов. В синергизме с другими цитокинами, секретируемыми адипоцитами, а именно ИЛ-6 и ИЛ-1, ФНО-α может стимулировать секрецию лептина. Под влиянием ФНО-α резко увеличивается образование перекиси водорода и других свободных радикалов макрофагами и нейтрофилами [29]. Таким образом, в настоящее время признано, что изменения уровня инсулина и провоспалительных адипокинов, наблюдаемые при ожирении, могут нарушать стероидо-, фолликуло-, оо-, эмбриогенез, рецептивность эндометрия и имплантацию эмбриона, приводя к снижению фертильности. 1.3. Влияние ожирения на течение и исход беременности Согласно статистическим данным, в настоящее время число женщин, имеющих избыточный вес или ожирение, составляет больше 20% от числа всех женщин, вступающих в беременность [70, 74]. К настоящему времени накоплена достаточная доказательная база для обобщенного однозначного заключения, что избыточный вес негативно отражается на течении беременности, способствуя повышению частоты материнской и перинатальной заболеваемости и смертности. Это, в свою очередь, становится одной из основных проблем современной репродуктивной медицины [90, 93, 142]. Артериальная гипертезия, гестационный сахарный диабет, преждевременный разрыв плодных оболочек, увеличение частоты оперативных родоразрешений, рост частоты послеродовых инфекций, послеродовых кровотечений, тромбоэмболий – вот неполный список акушерских осложнений, достоверно чаще встречающихся у женщин, страдающих ожирением [12, 13, 24, 35, 81, 88, 90, 91, 142]. Наличие у матери ожирения ведет к изменениям эпигенетической, гормональной и биохимической среды развивающегося эмбриона/плода, что отражается на его внутриутробном росте и развитии. У потомства матерей, страдающих ожирением, повышен риск врожденных пороков развития, внутриутробной гибели, макросомии или задержки роста 23 плода, что отражается в увеличении перинатальной смертности у данной когорты женщин [140]. Чаще возникают такие осложнения как дистоция плечиков, внутриутробная гипоксия плода и т.д., что негативно отражается на оценке новорожденных по шкале Апгар, а также приводит к необходимости лечения новорожденных в условиях реанимации. [74, 90, 142]. Мета-анализ, проведенный Maheshwari А., показал высокий риск выкидышей у женщин с ожирением, подвергшихся лечению с использованием методов ВРТ [81]. На основании мета-анализа, выполненного в том же году Metwally M. с соавторами, также был показан высокий риск репродуктивных потерь у пациенток с ИМТ>25 кг/м2, независимо от способа достижения беременности [39]. Опубликованные в 2008 году результаты мета-анализа о взаимосвязи материнского ожирения и частоты появления врожденных дефектов у плода убедительно демонстрируют, что наличие у матери ожирения до зачатия связано с повышенным риском развития дефектов нервной трубки у плода. Риски развития данной патологии у женщин с избыточным весом, ожирением и морбидным ожирением составили 1.22, 1.70 и 3.11, соответственно [89]. Эти данные были подтверждены когортным исследованием, в которое были включены 41 013 женщин с одноплодной беременностью. На основании проведенного анализа авторы показали, что риск врожденных нарушений развития нервной ткани был значительно выше в группе женщин со сниженной массой тела (ИМТ<18.5 кг/м2) и ожирением (ИМТ>30.0 кг/м2) и составил 1.60 (p= 0.02) и 1.30 (p= 0.03), соответственно. Увеличения данного риска для женщин с избыточной массой тела выявлено не было [84]. Следует отметить, что негативное влияние материнского ожирения на потомство выходит за рамки внутриутробного и неонатального периодов и проявляется на последующих жизненных этапах – в детстве, подростковом и взрослом возрасте, демонстрируя эффект программирования. Развитие детерменировано, ожирения что и инсулинорезистентности подтверждено генетически эпидемиологическими и 24 экспериментальными исследованиями [34, 49]. Имеются данные о том, что основа развития ожирения и резистентности к инсулину устанавливаются еще в момент зачатия, когда программирующиеся под влиянием различных физиологических и эпигенетических механизмов метаболические расстройства могут передаваться следующим поколениям [122]. В недавних исследованиях была выявлена положительная корреляция между ИМТ матерей и их потомства [94, 122]. Недавно проведенные эпидемиологические исследования показали, что вес матери в момент зачатия, а также степень увеличения массы ее тела во время беременности, коррелируют с повышенным риском развития у потомства сердечно-сосудистых и метаболических заболеваний [83 ,92]. Следует отметить, что дети, зачатые после резкого снижения массы тела матерью, не были предрасположены к развитию ожирения и инсулинорезистентности по сравнению с родными братьями и сестрами, зачатыми, когда их мать страдала ожирением [43]. Данные о состоянии здоровья населения показывают, что наличие ожирения и диабета у матери во время беременности является основным фактором, способствующим развитию данных заболеваний у детей [94, 122]. В связи с этим, мероприятия, направленные на профилактику избыточной массы тела у женщин детородного возраста, имеют огромное терапевтическое и социальное значение. 1.4. Особенности лечения женщин с избыточной массой тела с использованием современных репродуктивных технологий Помимо негативного влияния на течение самой беременности, избыточный вес является фактором, снижающим эффективность лечения бесплодия с использованием методов ВРТ. В настоящее время данный вопрос широко обсуждается, и большинство исследователей сходятся во мнении, что ключевым оказывается негативное воздействие на процессы фолликуло-, оогенеза и раннего эмбриогенеза, рецептивность эндометрия и частоту наступления беременности [19, 36, 48, 66, 74, 108, 112, 117, 118]. Так в работе Bu Z. и соавторов (2013) было показано, что ожирение и избыточный вес 25 неблагоприятно отражаются на результатах лечения в программе ЭКО независимо от наличия при этом у пациенток СПКЯ [119]. Данные многих исследований указывают не только на необходимость использования более высоких доз препаратов гонадотропинов (Гн) и увеличение продолжительности стимуляции суперовуляции у пациенток с ожирением, но и на снижение показателя оплодотворения, повышение частоты отмены переноса эмбрионов в связи с низким качеством получаемых эмбрионов, оцененных по совокупности эмбриологических показателей, снижение частоты имплантации, наступления клинической беременности и живорождения, учащение ранних репродуктивных потерь [36, 48, 66, 117, 118]. Кроме того, низкое качество получаемых эмбрионов приводит к увеличению числа утилизированных эмбрионов и уменьшению количества эмбрионов, пригодных для криоконсервации [36, 48, 66, 118]. Существующая, тем не менее, некоторая противоречивость данных, получаемых разными группами исследователей, может быть связана как с дизайном исследования, так и с различиями в использовании критериев определения избыточной массы тела и ожирения [38, 40, 117, 144]. Необходимость применения более высоких доз Гн у женщин с ожирением можно связать с нарушением фармакодинамики, приводящей к изменениям абсорбции и клиренса лекарственных препаратов. Гн относятся к классу липофильных соединений, благодаря чему могут накапливаться в ЖТ, тем самым создавая относительную резистентность к препаратам данной группы у пациенток с избыточным отложением ЖТ [44]. Также следует отметить, что во время стимуляции суперовуляции в период «окна селекции» у женщин с ожирением, как правило, отмечается более высокий терапевтический порог концентрации сывороточного ФСГ, необходимого для активации множественного роста фолликулов, что связано с изменением метаболизма эстрадиола, снижением сывороточной концентрации ГСПГ и нарушением фармакодинамики препаратов Гн [139]. 26 По данным исследований, несмотря на применение более высоких суммарных доз Гн, количество аспирированных ооцитов одинаково для женщин с нормальным ИМТ и ожирением [38, 117]. Исключение составляет работа Zander-Fox D.L. и соавторов (2012), где после трансвагинальной пункции в группе женщин с ожирением было получено меньшее количество ооцитов по сравнению с контрольной группой [36]. Встречаются исследования, в которых каких-либо достоверных различий в исходах лечения в программе ЭКО в зависимости от ИМТ не было выявлено [40, 144]. Так, Caillon H. и соавторы (2015) показали, что при лечении в программе ЭКО овариальный ответ и качество полученных эмбрионов не различались между исследуемыми группами, но пациенткам в группе с избыточной массой тела требовались более высокие дозы Гн, частота отмены переносов была выше, а при наступлении беременности ранние репродуктивные потери происходили чаще [38]. Вероятно, разделение пациенток в данном исследовании только на две группы могло исказить полученные данные, так как при избыточной массе тела и ожирении отмечается разная степень метаболических нарушений. С другой стороны, согласно данным, полученным норвежскими исследователями в ходе выполнения ретроспективного анализа (5019 циклов ЭКО/ИКСИ у 2660 женщин), существует линейная зависимость между высоким уровнем ИМТ и самопроизвольными выкидышами в сроке 6-12 недель беременности. Относительный риск прерывания беременности на малом сроке у женщин с ожирением (ИМТ>30 кг/м2) составил 1.69 (p=0.003) по сравнению с женщинами с нормальным весом [65]. В работе Moragianni V.A. с соавторами было показано, что у пациенток с ИМТ>30 кг/м2 частота имплантации, наступления клинической беременности и живорождения были значимо ниже по сравнению с женщинами, имеющими нормальную массу тела. Наряду с этим, при ожирении I степени (ИМТ=30.0 – 34.9 кг/м2) вероятность живорождения составила 0.63, при ожирении II степени (ИМТ=35.0 – 39.9 27 кг/м2) – 0.39, а при ожирении III степени (ИМТ>40.0 кг/м2) данный показатель равнялся 0.32 [108]. В данном контексте нельзя не упомянуть показатели частоты преждевременных родов у матерей с различным ИМТ, полученные в результате исследования, проведенного в США с участием более 60 000 женщин с одноплодной беременностью [41]. На основании представленных данных была выявлена общая тенденция увеличения риска преждевременных родов параллельно с ростом ИМТ. Авторы приводят данные о том, что при морбидном ожирении, по сравнению с женщинами с нормальными значениями ИМТ, относительные риски развития очень ранних преждевременных родов (до 28 недель гестации), ранних преждевременных родов (до 32 недель гестации) и преждевременных родов (до 37 недель гестации) составили 2.6, 2.2 и 1.5, соответственно [41]. Таким образом, при морбидном ожирении (ИМТ>35.0 кг/м2) резко ухудшается эффективность лечения в программе ЭКО. Это объясняет тактику репродуктологов во многих странах мира, которые отказывают данной группе женщин в лечении бесплодия методами ВРТ до снижения веса до оптимальных значений, объясняя это не только низкой эффективностью лечения, но и риском развития различных заболеваний и серьезных осложнений у матери и ее будущего ребенка. 1.5. Влияние ожирения на рецептивность эндометрия До сих пор нет единого мнения о том, ведет ли ожирение к гистопатологическим и молекулярным изменениям эндометрия. Недавно проведенный протеомный анализ образцов эндометрия у женщин с различным ИМТ показал, что ожирение или избыточный вес являются независимыми факторами, нарушающими экспрессию важных структурных белков эндометрия, таких как лейкемия-ингибирующий фактор (ЛИФ) и гаптоглобин, что может объяснять высокую частоту встречаемости самопроизвольных выкидышей и неразвивающихся беременностей у данной когорты пациенток [19]. В образцах эндометрия у женщин с привычным выкидышем и ожирением 28 авторы статьи обнаружили повышение концентрации белка гаптоглобина по сравнению с женщинами, имеющими нормальный ИМТ. Полученные факты вполне объяснимы, так как гаптоглобин является важным компонентом реакции организма на воспаление, а ожирение рассматривают как состояние хронического воспаления, при котором адипоциты синтезируют различные маркеры воспаления, одним из которых и является гаптоглобин. Есть работы, в которых показано увеличение в крови концентрации гаптоглобина пропорционально степени ожирения [135]. Следовательно, значительное повышение уровня гаптоглобина в эндометрии при ожирении может нарушать процесс имплантации бластоцисты, что и объясняет более низкую вероятность наступления беременности у данной группы женщин. Помимо этого, была обнаружена отрицательная корреляционная зависимость между ИМТ и уровнем ЛИФ, экспрессирующегося в железистом эпителии и строме эндометрия, и принимающем участие в регуляции процесса имплантации. Уровень этого фактора в железистом эпителии значительно возрастает в среднюю и позднюю секреторные фазы, кроме того, он синтезируется на поверхности бластоцисты перед имплантацией [19]. Ожирение обычно ассоциировано с резистентностью к инсулину и гиперинсулинемией, а, как известно, повышенный уровень инсулина приводит к снижению уровня гликоделина и белка, связывающего ИПФР 1 (IGFBP1) [121]. Низкие уровни гликоделина и белка IGFBP1, который облегчает связывание лигандов рецепторов, экспонированных на поверхности клеток эмбриона и эпителия эндометрия, ассоциированы с привычным связи ожирением невынашиванием при ожирении [139]. Для установления клинической между и рецептивностью эндометрия идеальной моделью для исследования является лечение в программе ЭКО с использованием донорских ооцитов, полученных от женщин с нормальной массой тела. Но среди имеющихся в настоящее время работ в отношении данного вопроса встречаются противоречивые данные. 29 Одним из значимых исследований в данной области является работа Bellver J. и соавт. (2013), проанализировавших 9 587 циклов лечения в программе ЭКО с использованием донорских ооцитов, то есть применивших вышеописанную модель. По результатам этого исследования частота имплантации, наступления биохимической и клинической беременности была достоверно ниже в группе реципиенток с ожирением по сравнению с участницами исследования с нормальной массой тела. Частота живорождения в группе женщин с ожирением была на 27% ниже, чем в контрольной группе. Учитывая тот факт, что каких-либо значимых различий по основным характеристикам и протоколам стимуляции между донорами не было и качество перенесенных эмбрионов между группами не отличалось, авторы пришли к выводу о том, что рецептивность эндометрия у женщин с ожирением была снижена [116]. Схожие данные были получены этой же группой исследователей в 2007 г. при обследовании 2 656 циклов лечения в программе ЭКО с использованием донорских ооцитов [114]. В то же время, по результатам проведенного Jungheim E.S. и соавт. (2013) мета-анализа 4 758 циклов ЭКО с использованием донорских ооцитов, значимой связи между исходами лечения в группах женщин с нормальной массой тела и ожирением не наблюдали. Однако авторы не считают окончательными сделанные выводы об отсутствии связи между ожирением и негативными исходами лечения, и объясняют полученные результаты статистической неоднородностью включенных в мета-анализ исследований (небольшие выборки, различные критерии включения и исключения, протоколы стимуляции суперовуляции и параметры измерения и оценки ИМТ) [71]. В недавно проведенном исследовании Barboza I.C. и коллег (2014) была выявлена корреляция между ИМТ≥ 30 кг/м2 и увеличением толщины эндометрия, что также может отражаться на изменении его рецептивности [16]. Таким образом, метаболические нарушения при ожирении приводят к клеточным и молекулярным изменениям эндометрия, а, возможно, и к 30 локальной сосудистой дисфункции, что может являться причиной развития дефектов имплантации. Возникновение сосудистой дисфункции некоторые исследователи связывают с наличием у женщин с ожирением гиперлептинемии, приводящей к дисбалансу уровня оксида азота (II), синтезируемого ферментом NO-синтазой (эндотелиальной формой eNOS) [158]. Это приводит к нарушению регуляцию сосудистого тонуса, а также к повышенной продукции провоспалительных цитокинов и белка гаптоглобина, которые играют важную роль в процессах ангиогенеза, в том числе и в эндометрии [14, 19, 158]. Этим может объясняться низкий уровень имплантации и клинической беременности, а также высокий процент ранних репродуктивных потерь у женщин с ожирением, прошедших лечение в программе ЭКО. 1.6. Влияние ожирения на ранние этапы оплодотворения На данный момент исследователей и клинических специалистов беспокоит вопрос о том, насколько и каким образом избыточный вес и ожирение влияют на скорость развития эмбриона, изменяя параметры его метаболизма. Учитывая сложность работы с человеческими эмбрионами в связи с правовыми и морально-этическими аспектами, большинство исследований о влиянии ожирения на ранних этапах оплодотворения и развития эмбрионов к настоящему моменту выполнены лишь на лабораторных животных. Британские ученые в 2014 г. впервые изучили влияние избыточного веса матери на развитие человеческих ооцитов и предимплантационных эмбрионов. Авторы обнаружили, что в отличие от женщин с нормальной массой тела, ооциты, полученные от женщин, страдающих избыточным весом или ожирением, меньше по диаметру (p = 0.001) и имеют более низкую способность к оплодотворению (P < 0.001). Используя замедленную микрокиносъемку (Time-Lapse analysis), было проведено сравнение динамики развития оплодотворившихся эмбрионов и показано, что эмбрионы, полученные от женщин с избыточной массой тела, быстрее достигают стадии морулы (p < 0.001) [75]. 31 Схожее исследование было проведено в 2013 г. Bellver J. и соавторами, но каких-либо расхождений в скорости деления между эмбрионами, полученными от женщин с различными показателями ИМТ, обнаружено не было [137]. Подобную противоречивость данных можно объяснить тем, что исследователи оценивали результаты в течение 72 часов от момента оплодотворения, в то время как по показателям изменения метаболических процессов ясно, что видимые различия могут начать проявляться только через 68 часов после оплодотворения, к 72 часам не достигая величин, доступных для регистрации [75]. Leary C. с коллегами также обнаружили, что на стадии бластоцисты в трофоэктодерме эмбрионов, полученных от женщин с ИМТ>25 кг/м2, содержалось значительно меньшее количество клеток. Поскольку именно из трофэктодермы в процессе эмбриогенеза формируются цитотрофобласт и синцитиотрофобласт, то очень вероятно, что подобное снижение количества клеток-предшественников хориона на момент имплантации может оказывать негативное влияние на способность трофобласта к инвазии и последующее развитие плаценты [75]. Анализ культуральной среды показал, что по сравнению с контролем в бластоцистах, развившихся у женщин с ожирением, снижено потребление глюкозы, нарушен метаболизм аминокислот и повышено содержание триглицеридов, то есть наблюдаются значительные метаболические изменения [75]. Авторы предположили, что у женщин с избыточной массой тела и ожирением в результате отклонения от нормы метаболических параметров нарушена регуляция экспрессии ферментов, оказывающих воздействие на паттерн метилирования ключевых генов онтогенеза, что приводит к отклонениям в работе системы эпигенетического контроля развития эмбриона [75]. 1.7. Митохондриальный аппарат и репродуктивная система В последние годы общепризнано, что поражающие большой процент населения во всем мире заболевания метаболической этиологии, такие как 32 неврологические, онкологические, иммунные, а также сахарный диабет, связаны с дисфункцией митохондрий [107, 132]. Число исследований в этой области резко выросло в последние годы в связи с особенностями репродуктивного поведения женщин в современном мире, откладывающих реализацию репродуктивной функции на более старший возраст, когда помимо снижения овариального резерва увеличивается частота встречаемости эмбрионов с анеуплоидиями и другими хромосомными аномалиями на фоне связанных с возрастом нарушений работы митохондриального аппарата [130]. Недавно была продемонстрирована взаимосвязь дисфункции митохондрий и бесплодия у женщин, страдающих от ожирения и/или сахарного диабета, а также при старении яйцеклетки [31, 85, 149]. Митохондрии представляют собой цитоплазматические двухмембранные органеллы, присутствующие практически во всех клетках эукариот. Отдельная клетка может содержать от одной до нескольких тысяч митохондрий, а их число зависит от типа ткани и ее метаболической нагрузки. Митохондрии являются единственными клеточными органеллами, которые имеют свою собственную ДНК (мтДНК), кодирующую ряд основных функциональных белков дыхательной цепи, при этом митохондриальный субгеном находится под постоянным контролем ядра клетки, что обеспечивает высокую лабильность органелл и их постоянную подстройку в зависимости от потребностей клетки [52, 103]. Особенно следует подчеркнуть важность процессов слияния и деления митохондрий при формировании ими в клетке ретикулярной системы, обеспечивающей связность энергопреобразующих процессов в клетке, лежащих в основе клеточной динамики [154, 157]. Эти два тесно связанных между собой процесса контролируют форму, размер и количество митохондрий в клетке, то есть определяют общее морфофункциональное состояние популяции митохондрий, ее адаптацию к метаболическим нуждам и способствуют выживанию клетки. В процессы слияния и деления вовлекаются не только полноценно функционирующие, но и поврежденные или стареющие 33 митохондрии, что способствует их выживанию и препятствует накоплению митохондриальных мутаций. Это своего рода адаптационный защитный механизм, обеспечивающий способность клеток «выдерживать» высокий уровень поврежденной мтДНК [52]. Было показано, что в клетках, в которых слияние митохондрий снижено, отмечается серьезное нарушение дыхательной емкости [104, 154]. Нарушение равновесия между слиянием и делением митохондрий наблюдается при метаболических расстройствах и нейродегенеративных заболеваниях [157]. Активность митохондрий зависит не только от их общей динамики и подвижности, но также от ряда функциональных характеристик, которые важны для конкретной стадии клеточного цикла и включают в себя скорость потребления кислорода, эффективность переноса электрона в дыхательной цепи, мембранный окислительного потенциал и фосфорилирования, степень сопряженности локализацию и дыхания и распределение митохондрий внутри клетки, количество мтДНК. Интересно, что поскольку трансмембранный потенциал является показателем активности митохондрий, по его значению можно косвенно судить о качестве ооцитов. На ооцитах мышей было показано, что низкий трансмембранный потенциал митохондрий приводит к формированию аномальных эмбрионов [101]. Основная функция митохондрий – генерация эквивалента свободной энергии в форме молекул аденозинтрифосфата (АТФ). Митохондрии являются ключевым участником внутриклеточной регуляции энергетического метаболизма клетки и сигнализации, контролируя пролиферацию и дифференцировку клеток, поддерживая гомеостаз клеточной популяции. Таким образом, главной задачей окислительной ветви метаболизма, обеспечиваемой митохондриями, является поддержание в клетке достаточного для выполнения различных задач уровня свободной энергии за счет окисления пищевых субстратов. Вся энергия химических связей, высвобождаемая в процессе окисления жирных кислот, аминокислот и углеводов, используется в митохондриях в форме восстановительных эквивалентов. Дыхательная цепь – 34 это сложный полиферментный комплекс, локализованный во внутренней мембране митохондрий. Все реакции, происходящие в дыхательной цепи митохондрий, сопряжены: переносчики водорода и электронов расположены в строгом порядке, в соответствии с величиной их окислительно-восстановительного потенциала. Окисление никотинамидадениндинуклеотидфосфата (НАДН) и (ФАДН2) в НАД+ и ФАД обеспечивает поток электронов вдоль дыхательной цепи митохондрий, с одновременным перекачиванием протонов в межмембранное пространство за счет комплексов I, III и IV. Далее в IV комплексе электроны передаются на кислород с образованием воды. Вследствие выкачивания из матрикса митохондрий положительно заряженных протонов на их внутренней мембране возникает разность электрохимического потенциала, который запускает работу V комплекса, синтезирующего энергию в виде молекул АТФ. Протоны могут также возвращаться в матрикс при помощи разобщающих белков, преобразующих трансмембранный потенциал в тепло и играющих важную роль в процессе термогенеза. Снижение митохондриального окисления жирных кислот может приводить к накоплению промежуточных биологически активных гидрофобных соединений, таких как диацилглицерол, церамиды и ацилы жирных кислот, приводящих к развитию инсулинорезистентности [6, 11, 151]. В последние двадцать лет пристальное внимание исследователей привлечено к феномену участия митохондрий в реализации каскада реакций программированной гибели клеток – апоптоза, центральным событием которого является открытие неспецифической транзитной поры большого диаметра в интактной внутренней мембране митохондрии и выходе в цитозоль проапоптогенных факторов, локализованных в мемжмембранном митохондриальном компартменте. На всех стадиях онтогенеза участие митохондрий в апоптозе критично для правильного формирования тканей и органов и достижения строгого соответствия их структуры выполняемой функции [57]. 35 На ооцитах и предимплантационных эмбрионах человека было показано, что существует прямая связь между функциональной активностью митохондрий эмбриона и его качеством [57]. При исследовании механизмов реализации потенциала развития ооцитов, определяемого как способность к образованию здорового, жизнеспособного эмбриона, оказалось, что нарушение сегрегации хромосом и прекращение деления клеток часто связаны с дефектами в митохондриях, от которых зависит биоэнергетический потенциал ооцитов [123, 152]. На модели вызванного диетой ожирения у мышей было показано, что снижение уровня энергетического метаболизма ооцитов и предимплантационных эмбрионов положительно коррелирует со снижением частоты наступления беременности [86]. Это позволило предположить, что одним из механизмов, ведущим к репродуктивным неудачам при ожирении, является нарушение функционального состояния митохондриального ретикулума [86, 153]. Стоит подчеркнуть, что качество ооцита во многом зависит от состояния материнских митохондрий, обеспечивающих энергетические потребности делящегося эмбриона вплоть до момента возобновления митохондриального образующихся органелл биогенеза макромолекул, и включения соответствующих в состав обновленному геному. 1.8. Окислительный стресс и хроническое воспаление Состояние хронического воспаления при ожирении отличается по происхождению и характеризующегося механизму развития покраснением от участка классического воспаления, воспаления, повышением температуры, отеком и болью. Типичными чертами хронического воспаления является отсутствие очага воспаления и подострый характер его течения на фоне выраженных метаболических отклонений системного типа, в связи с чем хроническое воспаление также получило название «метавоспаление» или метаболическое воспаление [56]. Источником, поддерживающим состояние воспаления при ожирении, являются адипоциты, которые, синтезируя в кровь провоспалительные 36 цитокины, поддерживают воспалительный процесс, одновременно нарушая метаболический гомеостаз [56]. Таким образом, при избыточном потреблении питательных веществ в адипоцитах активируются множественные сигнальные пути, запускающие воспалительный процесс. Дополнительным признаком воспалительного процесса при ожирении является хронический характер течения и повышенная инфильтрация тканей, принимающих участие в процессе метаболизма, иммунными клетками, такими как макрофаги, дендритные и Т-клетки [56, 95]. Нарушение метаболизма липидов в адипоцитах ведет к повышению уровня свободных жирных кислот в системном кровотоке, которые инициируют воспалительный сигнальный каскад при помощи популяции иммунных клеток, инфильтруюших адипоциты. Провоспалительные цитокины еще больше усиливают инфильтрацию адипоцитов иммунными клетками в кольце положительной обратной связи, а также нарушают сигнальный каскад инсулина, приводя к развитию инсулинорезистентности и, в конечном счете, сахарного диабета 2 типа (рисунок 1) [95]. Рисунок 1. Жировая ткань в норме и при ожирении 37 Повышенный уровень провоспалительных цитокинов в крови при ожирении активирует НАДФН-оксидазный комплекс, локализованный на плазматической мембране клетки, являющийся первичным источником продукции активных форм кислорода – супероксидного анион-радикала, перекиси водорода, пероксинитрита и др. [143]. Митохондрии, содержащие в своем составе большое количество молекул, лабильных в отношении окислителей (липиды с непредельными жирными кислотами, мтДНК, редокс-центры белковых комплексов дыхательной цепи и т.д.) являются как мишенью радикалов, так и основным источником активных форм кислорода (АФК) вторичного происхождения по отношению к НАДФНоксидазе плазмалеммы. Известен феномен циклической активации митохондриями продукции активных форм кислорода в ответ на повышение концентрации свободных радикалов в межмембранном пространстве и в цитозоле [128, 159]. На промежуточных этапах переноса электронов в дыхательной цепи митохондрий непрерывно происходит утечка электронов с окислительно-восстановительных центров с образованием продуктов одно- и двухэлектронного восстановления кислорода. Постоянное и составляющее не менее 1% от общего количества кислорода образование АФК сопровождается массовым повреждением макромолекул, в том числе липидов, белков и нуклеиновых кислот, находящихся в непосредственной близости к сайтам продукции свободных радикалов в митохондриях [51]. Подобное повреждение имеет ряд серьезных последствий как на клеточном и тканевом, так и на системном уровне. Происходит активация каскада программированной клеточной гибели и формирование локального очага воспаления, в плазме крови нарастает количество фрагментов митохондрий, выполняющих функцию индукторов системного патологических состояний воспалительного (сепсис, ответа, дисфункция развитие печени тяжелых и почек, неврологические нарушения и др.) [100]. Недавнее открытие ведущей роли так называемых «митохондриальных молекулярных паттернов, ассоциированных с повреждением» (mtDAMP – 38 mitochondrial Damage Associated Molecular Patterns), в развитии состояния хронического воспаления и ассоциированных с ним патологических состояний, позволило связать окислительного между стресса, собой апоптоза ранее и полученные роли данные активных форм о связи кислорода митохондриального происхождения в нарушении васкулярной функции в развитии дисфункции эндотелия [100]. В связи с этим огромное значение приобретают процессы, контролирующие как уровень макромолекул, достаточный для поддержания адекватного функционального состояния клеточных систем, так и уровень АФК в клетке. К настоящему моменту хорошо известно, что при ожирении повышается уровень АФК в тканях и плазме крови, наблюдается нарастание скорости накопления повреждений в мтДНК, увеличивается вероятность возникновения делеций и точечных мутаций, приводящих к изменениям функционального состояния митохондрий и опосредованному нарушению фертильности [129, 154]. При ожирении повышенное содержание окисленных форм липидов дополнительно усиливает утечку электронов из дыхательной цепи митохондрий и, как следствие, увеличивает скорость продукции АФК, усиливая, тем самым, окислительный стресс и воспалительный процесс, связанные положительной обратной связью [143]. Поскольку нарушение баланса между образованием АФК и их утилизацией эффектов антиоксидантными этих макромолекул антиоксидантных соединений и mtDAMP, защитных системами приводит к очевидно, систем защиты от повреждающих накоплению поврежденных что снижение усиливает активности свободнорадикальное повреждение тканей и потенцирует развитие патологических состояний. Системы антиоксидантной защиты состоят из двух основных звеньев: ферментативного ферментативного и и неферментативного. неферментативного Согласованное звеньев действие обеспечивает неспецифическую резистентность и адаптацию организма к воздействию 39 различных стрессовых факторов. Считается, что уровень активности внутриклеточных ферментативных антиоксидантных систем генетически детерминирован. Неферментативное звено антиоксидантной системы состоит из низкомолекулярных соединений эндо- и экзогенного происхождения. Предполагают, что при системном окислительном стрессе ферментативное звено антиоксидантной системы иногда может оказываться менее эффективным по сравнению с защитным действием неферментативного звена, так как антиоксидантные ферменты локализованы в основном внутри клеток и быстро инактивируются свободными радикалами, а для их синтеза de novо требуется время. Таким образом, в условиях окислительного стресса усиливается роль неферментативной антиоксидантной защиты [6]. Одним из таких соединений является трипептид глутатион (γ- глутамилцистеинилглицин) – небелковый тиол, который играет важную роль во многих внутриклеточных процессах, таких, как синтез белка, регуляция и экспрессия генов клеточного цикла. Также глутатион участвует в транспорте аминокислот, обмене дисульфидов, связывании тяжелых металлов. Глутатион присутствует в организме в окисленной и восстановленной формах. Уровень глутатиона поддерживается как синтезом de novo, так и восстановлением его окисленной формы с помощью глутатионредуктазы и НАДН+Н. Глутатион играет важную роль в повышении резистентности клеток и адаптивных возможностей метаболизма при воспалении и иммунных реакциях. Обезвреживая перекиси и гидроксильные радикалы, глутатион является одним из важнейших компонентов антиоксидантной защиты организма [10]. 1.9. Окислительный метаболизм в оогенезе и раннем эмбриогенезе Митохондрии имеют жизненно важное значение для реализации функции ооцитов, поэтому об их качестве можно судить по функциональному состоянию митохондриального аппарата [152]. В отличие от большинства дифференцированных соматических клеток, где генерация энергии АТФ происходит путем окислительного фосфорилирования, в ооцитах 40 млекопитающих данный процесс осуществляется путем гликолиза и пентозофосфатного пути. Изменение типа метаболизма в эмбриогенезе связано с существенными структурными преобразованиями митохондрий. Так, в преовуляторных ооцитах и до стадии формирования бластоцисты митохондрии имеют форму эллипсоидов или сфероидов с плотным матриксом и небольшим количеством крист [106, 132]. На стадии бластоцисты митохондрии приобретают вытянутую гантелеобразную форму с менее плотным матриксом и большим количеством поперечно-ориентированных крист [23, 132]. Уменьшение плотности матрикса и увеличение количества крист в эмбриогенезе сопряжены с повышением уровня утилизации глюкозы и потребления кислорода, что отражает переход с анаэробного (гликолиз и пентозо-фосфатный путь) на аэробный путь (окислительное фосфорилирование) энергетического метаболизма на стадии формирования бластоцисты и имплантации [57]. Таким образом, несмотря на то, что состояние ооцита зависит от полноценного функционирования митохондрий, обеспечивающих необходимый уровень АТФ и поддерживающих клеточный гомеостаз, количество и активность митохондрий должны строго соответствовать этапам созревания яйцеклетки, её оплодотворения и дальнейшего развития эмбриона [102]. Известно, что у мышей на стадии созревания ооцита количество копий мтДНК повышается более чем в 30 раз [82, 145]. Ооциты мышей с относительно низким количеством копий мтДНК чаще всего являются дефектными по сравнению с ооцитами, содержащими большее количество копий мтДНК [145]. В клинических исследованиях показано, что ооциты, успешно оплодотворившиеся in vitro, содержали большее количество копий мтДНК по сравнению с неоплодотворившимися [131]. Эти данные согласуются с предположением, что качество ооцита и его потенциал к оплодотворению зависят от числа копий мтДНК, содержащихся в нем. Одним из факторов, влияющих на качество ооцитов, является избыточная масса тела. У мышей, получавших питание, приводящее к развитию ожирения, 41 отмечалась задержка созревания ооцитов и сниженная способность к их дальнейшему развитию, отклонения в формировании веретена деления в ооцитах и нарушения расположения хромосом, что в итоге приводило к развитию эмбрионов с анеуплоидиями [34, 62]. Grindler N.M. и Moley K.H. (2013) предполагают, что подобные нарушения функций ооцитов являются результатом дисфункции митохондрий [57]. Диета с высоким содержанием жиров у мышей приводит к дезорганизации митохондрий и изменениям их морфологии в ооцитах электронная плотность – уменьшается матрикса, количество увеличивается крист, снижается количество вакуолей, митохондрии набухают [62]. При этом митохондрии в ооцитах мышей с ожирением образуют агрегаты и беспорядочно расположены в ооплазме, в то время как в группе контроля они располагаются равномерно по всей клетке, а наибольшее их количество сосредоточено в перинуклеарной зоне. Стоит отметить, что распределение митохондрий в ооцитах мышей, страдающих сахарным диабетом, аналогично тому, что наблюдается у мышей с ожирением [62]. Согласно существующим этическим нормам, запрещающим использовать ооциты человека для исследовательских целей до проведения оплодотворения, в мировой литературе отсутствуют данные о влиянии избыточной массы тела на мембранный потенциал митохондрий в ооцитах человека. При этом результаты, полученные при исследовании ооцитов мышей, противоречивы. В работе Igosheva N. с соавторами (2010) наблюдали резкое повышение мембранного потенциала в ооцитах мышей с ожирением, а Wu L.L. с соавторами (2010) сообщают о его снижении [61, 86]. При измерении окислительно-восстановительного потенциала ооцитов было обнаружено, что по сравнению с ооцитами контрольных мышей в клетках животных с алиментарным ожирением окислительно-восстановительный потенциал и уровень восстановленного глутатиона были существенно ниже. На этом фоне высокий уровень окисленных флавопротеинов и пиридиновых нуклеотидов в ооцитах мышей экспериментальной группы свидетельствует о том, что 42 ожирение приводит к повышению активности дыхательной цепи митохондрий [86]. Кроме того, скорость продукции АФК более чем в 2 раза повышена в ооцитах и зиготах мышей, страдающих ожирением, по сравнению с контролем [86]. Однако определение метаболической активности в ооцитах показало значительное снижение уровня цитрата – основного интермедиата цикла трикарбоновых кислот в матриксе митохондрий, в группе мышей, получавших пищу с высоким содержанием жиров, в то время как различий в содержании АТФ обнаружено не было [62]. Наблюдаемые изменения содержания цитрата могут указывать на наличие митохондриального стресса без значительного негативного влияния на метаболизм ооцита в целом, за счет компенсаторного биогенеза и повышения уровня репликации мтДНК [86]. В совокупности эти данные подтверждают теорию, согласно которой избыточная калорийность пищи и, в частности, высокая доля жиров приводит к увеличению активности митохондрий на фоне индуцированного окислительного стресса, что в конечном итоге приводит к митохондриальной дисфункции и негативно влияет на качество ооцитов [57, 86]. Например, было показано, что в неоплодотворившихся ооцитах женщин с морбидным ожирением (ИМТ ≥ 35.0 кг/м2) значительно чаще, чем у женщин с нормальным весом, обнаруживаются два веретена деления, а среди ооцитов с одним веретеном преобладают клетки с дезорганизованным веретеном и неправильным расположением хромосом [141]. Предполагают, что именно эти нарушения структуры веретена деления в ооцитах женщин с ожирением и ассоциированные с этим дефекты хромосом приводят к высокому уровню анеуплоидий, спонтанным выкидышам и высокой частоте образования аномальных эмбрионов (рисунок 2) [25, 57]. Сегрегация хромосом в метафазе является высоко энергозависимым процессом, то есть ооциту для нормальной работы веретена деления и предотвращения развития анеуплоидий необходим достаточный уровень АТФ, а факторы, нарушающие способность митохондрий синтезировать АТФ, снижают качество ооцитов [72]. 43 Одной из основных проблем репродуктивной медицины является способность клинических специалистов выбрать эмбрион, который будет обладать высокой способностью к имплантации. На сегодняшний день основным методом выбора эмбрионов для их последующего переноса в полость матки является морфологической критерий отбора на основании шкалы ESHRE 2009 г. [147]. Рисунок 2. Влияние индуцированного окислительного стресса при избыточном потреблении жиров на функции митохондрий и качество ооцитов. КК ̶ кумулюсная клетка, АФК ̶ активные формы кислорода, PPP ̶ pentose phosphate pathway (пентозо-фосфатный путь), 1 ̶ ядро, 2 ̶ митохондрии, 3 ̶ митохондрии с аномальным строением, 4 ̶ аномальное веретено деления, 5 ̶ веретено деления Известно, что, несмотря на то, что морфологические параметры эмбриона являются одним из основных показателей его качества, этот метод оценки 44 имеет существенные недостатки. В настоящее время основным способом дополнительной оценки качества эмбриона является предимплантационнный генетический скрининг, но при этом метод является инвазивным и дорогостоящим. В связи с этим широко распространены исследования по поиску и изучению альтернативных морфологическому анализу неинвазивных методов оценки качества эмбрионов. 1.10 Энергетический метаболизм и состояние митохондриального ретикулума в кумулюсных клетках Достаточно многообещающе выглядят исследования последнего десятилетия, показывающие возможность оценки качества ооцитов по состоянию окружающих его клеток, получаемых при выделении кумулюсооцитарного комплекса после пункции фолликула при лечении в программе ЭКО. Кумулюсные клетки – это клетки, формирующие непосредственное окружение ооцита при созревании фолликула и происходящие из низкодифференцированных предшественников - клеток гранулезы. Основным фактором дифференцировки клеток-предшественников кумулюса является изменение соотношения ФСГ/ЛГ в плазме крови [54]. Кумулюс образует с ооцитом так называемый кумулюс-ооцитарный комплекс, обеспечивающий рост, развитие и созревание ооцита. Основная функция кумулюса состоит в обеспечении транспорта метаболитов и сигнальных молекул между тканью яичника и ооцитом. С другой стороны, в созревающем фолликуле ооцит секретирует факторы роста, действующие локально, управляя дифференцировкой и функцией КК [64]. Учитывая тесную взаимосвязь между КК и ооцитом, можно получать информацию о состоянии ооцита посредством обнаружения молекулярных изменений в КК. Например, модели экспрессии определенных генов отражают процессы, происходящие в клетке в данный момент времени, в том числе и ответ клеток на различные воздействия окружающей среды. Таким образом, анализ активности генов в КК может выявить данные об условиях внутри 45 фолликула и качестве полученного ооцита. КК постоянно реагируют на изменения, происходящие в интра-фолликулярной среде, с целью обеспечения оптимального развития ооцитов, а также регулируют экспрессию антиоксидантов и других молекул, ингибирующих свободнорадикальные процессы и контролирующих продукцию АФК на уровне, соответствующем стадии созревания ооцита. Кроме того, важной функцией КК является минимизация уровня потенциальных повреждающих агентов генетического материала ооцита, вызванных внешними факторами. КК играют ключевую роль в двухсторонней передаче сигналов к ооциту. Важность этих сигнальных путей не может быть переоценена и является жизненно важной для производства жизнеспособных гамет [64]. Принимая во внимание двунаправленную передачу сигналов между КК и ооцитом, считается, что состояние энергопреобразующих систем и метаболических процессов в КК могут отражать уровень метаболизма ооцита, определяющий его способность к дальнейшему созреванию, последующему успешному оплодотворению и дальнейшему эмбриональному развитию. Среди генов, дифференциально экспрессирующихся в КК при различных условиях, внимание исследователей в последнее время наиболее привлекают гены митохондриального биогенеза в связи с тем, что они являются контролерами точек сопряжения пути дифференцировки и метаболических процессов [57, 105]. Таким образом, изучение проблемы нарушения репродуктивной функции у женщин с ожирением на основании оценки маркеров окислительного стресса и функциональной активности митохондриального аппарата в МПК и КК является актуальной и поможет глубже изучить патогенез и возможности коррекции метаболических нарушений и снизить дальнейшее распространение этой серьезной проблемы. 46 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материал исследования В соответствии с целью исследования и поставленными для ее решения задачами, на базе отделения вспомогательных технологий в лечении бесплодия (руководитель отделения – д.м.н. Калинина Е.А.) и митохондриальной медицины (руководитель отделения – лаборатории к.б.н. Высоких М.Ю.) Федерального государственного бюджетного учреждения «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова» Министерства здравоохранения Российской Федерации (директор – академик РАН Сухих Г.Т.), в период с августа 2013 г. по март 2015 г. осуществлялся набор пациенток. Критерии включения пациенток в исследование: возраст от 18 до 37 лет включительно; женское бесплодие трубного происхождения и/или мужской фактор бесплодия (субфертильная сперма супруга); нормальный овариальный резерв (уровень ФСГ на 2-3 день цикла ≤ 10 МЕ/л; АМГ не менее 1 нг/мл; по данным УЗИ органов малого таза – не менее 5 антральных фолликулов в каждом яичнике); нормальное анатомическое строение матки; нормальный кариотип у обоих супругов (46, XX; 46, XY); подписанное информированное согласие на включение в исследование. Критерии невключения в исследование: соматические и психические заболевания, являющиеся противопоказаниями для вынашивания беременности и родов; врожденные пороки развития или приобретенные деформации полости матки, при которых невозможна имплантация эмбрионов или вынашивание беременности; 47 злокачественные новообразования любой локализации, в том числе в анамнезе; отягощенный акушерско-гинекологический анамнез (эндометриоз III-IV ст., миома матки больших размеров, СПКЯ, перенесенные оперативные вмешательства на яичниках и др.); опухоли яичников; острые воспалительные заболевания любой локализации; хронические заболевания в стадии обострения; сниженный овариальный резерв; патология щитовидной железы; сахарный диабет 1 и 2 типа; нефертильная сперма супруга. Критерии исключения пациенток из исследования: отмена переноса эмбрионов с их последующей криоконсервацией; осложнения, вызванные лечением в программе ЭКО (синдром гиперстимулированных яичников, внутрибрюшное кровотечение и т.д.); отсутствие ооцитов после стимуляции суперовуляции. В исследование были включены 173 пациентки, обратившиеся для проведения лечения в программе ЭКО/ИКСИ и ПЭ, прошедшие предварительное обследование, строго соответствующие критериям включения/исключения. Исследование было одобрено комиссией по этике биомедицинских исследований при ФГБУ «НЦАГиП им. В.И. Кулакова» МЗ РФ (протокол № 6 от 17.05.2013). 2.2. Дизайн исследования Для оценки влияния избыточной массы тела на параметры фолликуло-, оо- и раннего эмбриогенеза, а также исхода лечения в программе ЭКО, все пациентки были разделены на три группы в зависимости от ИМТ. Дизайн исследования представлен на рисунке 3. 48 Женщины с избыточной массой тела (ИМТ 25,0-29,9 кг/м2) Женщины с нормальной массой тела (ИМТ 18,5-24,9 кг/м2) Женщины с ожирением (ИМТ >30,0 кг/м2) Исключены из исследования Стимуляция суперовуляции Ооциты не получены n=1 Трансвагинальная пункция яичников Отмена переноса эмбрионов n=12 Перенос эмбрионов в полость матки Беременность «+» Роды Беременность «-» Неразвивающаяся беременность Самопроизвольный выкидыш Рисунок 3. Дизайн исследования 2.3. Методы исследования Перед началом лечения бесплодия с применением методов ВРТ, в амбулаторных условиях по месту жительства и/или в ФГБУ «НЦАГиП им. В.И. Кулакова» МЗ РФ было проведено предварительное клинико-лабораторное обследование супружеских пар в соответствии с приказом Министерства здравоохранения Российской Федерации № 107н "О порядке использования вспомогательных репродуктивных технологий, ограничениях к их применению" от 23 августа 2012 г. противопоказаниях и 49 Применялись следующие общеклинические и специальные методы обследования: 1) определение суммарных антител к бледной трепонеме в крови, антител класса IgM, IgG к вирусу иммунодефицита человека 1/ 2 (ВИЧ 1/2); HBSантигена и антител к HCV – у обоих супругов; 2) определение группы крови и резус-фактора; 3) клинический анализ крови; 4) биохимический анализ крови; 5) гемостазиограмма; 6) мазок на степень чистоты из влагалища; 7) общий анализ мочи; 8) кольпоскопия и цитологическое исследование шейки матки; 9) анализ крови на гормоны на 2-3 д.м.ц.: фолликулостимулирующий гормон (ФСГ), лютеинизирующий гормон (ЛГ), эстрадиол (Е2), пролактин (ПРЛ), свободный тестостерон (Тсв), дигидроэпиандростерона сульфат (ДГЭА- С), кортизол (К), тиреотропный гормон (ТТГ), свободный тироксин (Т4св), соматотропный гормон (СТГ), 17-оксипрогестерон (17-ОП), антимюллеров гормон (АМГ); на 20-22 д.м.ц. – прогестерон (П). 10) определение в крови антител класса M и G к вирусу краснухи, токсоплазмозу, цитомегаловирусу, вирусу простого герпеса I и II типов; 11) инфекционное обследование посредством метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) на заболевания передающиеся половым путем (ЗППП): хламидиоз, уреаплазмоз, микоплазмоз, трихомонаду, вирусы простого герпеса I и II типов, вирус папилломы человека (ВПЧ) 16,18 типов. 12) флюорография легких (для женщин, не проходивших это исследование более 12 месяцев); 13) молекулярно-биологическое исследование на вирус простого герпеса 1, 2, на цитомегаловирус в крови; 14) бактериоскопическое исследование отделяемого влагалища, уретры и цервикального канала с определением чувствительности к антибиотикам; 50 15) ультразвуковое исследование органов малого таза; 16) регистрация электрокардиограммы; 17) ультразвуковое исследование молочных желез – женщинам до 35 лет, при выявлении по результатам ультразвукового исследования признаков патологии молочной железы, а также женщинам старше 35 лет проводилась маммография; 18) заключение терапевта о состоянии соматического статуса пациентки, отсутствии противопоказаний к проведению стимуляции суперовуляции, вынашиванию беременности и родам; 19) мужьям (партнерам) женщин выполнялось исследование эякулята; 20) при выявлении (консультация) эндокринных нарушений врача-эндокринолога, назначался проводилось осмотр ультразвуковое исследование щитовидной железы и паращитовидных желез, почек и надпочечников. 2.3.1. Общеклинические методы исследования У всех женщин проводился сбор анамнестических данных с целью изучения наследственности, аллергоанамнеза, получения информации о ранее перенесенных/настоящих оперативных инфекционных вмешательствах по и поводу соматических заболеваниях, экстрагенитальной патологии. Изучались особенности становления и характер менструального цикла (возраст менархе, регулярность и продолжительность менструального цикла, характер менструации), половой функции (время начала половой жизни, количество половых партнеров/браков, методы контрацепции), образа жизни, вредных привычек, условий труда и быта. Особенно тщательно анализировались данные о характере, клиническом течении и методах лечения ранее перенесенных заболеваний половых органов и органов малого таза, с обязательным предоставлением выписок из медицинских документов с указанием объема выполнения операции, течения послеоперационного периода и результатов гистологического исследования. Тщательно производился сбор анамнеза о репродуктивной функции женщин и мужчин (количество беременностей, уточнялось, в каком браке и с каким 51 партнером они наступили, их исходы и наличие осложнений во время беременностей, родов и в послеродовом периоде, количество детей и их развитие). У каждой пациентки уточняли данные о продолжительности и причинах бесплодия, методах его лечения на предыдущих этапах, сведения о ранее проведенных программах ВРТ (место и дата проведения процедуры, схема стимуляции суперовуляции, количество полученных ооцитов и эмбрионов, день и количество перенесенных в матку эмбрионов, количество криоконсервированных эмбрионов, исход программы и др.). Перед вступлением в программу ЭКО всем женщинам проводилось измерение длины и массы тела, после чего производился расчет ИМТ по формуле Кетле: ИМТ = масса тела/рост2 (кг/м2), по результатам вычисления которого, согласно рекомендациям Всемирной Организации Здравоохранения (WHO guideline), пациентки были распределены в одну из трех групп: I группа – женщины с нормальной массой тела, ИМТ=18,5-24,99 (79 пациенток) – группа контроля. II группа – женщины с избыточной массой тела, ИМТ=25,0-29,99 (43 пациентки). III группа – женщины с ожирением, ИМТ> 30,0 (51 пациентка). С целью определения характера распределения жировой ткани проводилось измерение объема талии (ОТ) и окружности бедер (ОБ) и определялось их соотношение. Показатель ОТ/ОБ, равный менее 0,85, оценивался как гиноидный тип ожирения с преимущественным отложением жировой ткани в области бедер и ягодиц, более 0,85 – как висцеральный, с преимущественным отложением жировой ткани в области передней стенки живота. В ходе гинекологического исследования проводился осмотр наружных половых органов с оценкой их развития и анатомических особенностей. При бимануальном исследовании органов малого таза оценивали размер, форму, подвижность и консистенцию матки, ее болезненность при пальпации, наличие образований в области придатков матки, а также признаки спаечного процесса. 52 2.3.2 Гормональное исследование Перед вступлением в программу ЭКО/ИКСИ всем пациенткам производилась оценка гормонального статуса в период ранней фолликулиновой фазы (3-5 день менструального цикла (д.м.ц.)) одного из циклов, предшествовавших стимуляции суперовуляции. В плазме крови исследовалась концентрация следующих гормонов: ФСГ, ЛГ, АМГ, Е2, ПРЛ, К, Тсв, ДЭА-С, ТТГ, Т4св, СТГ, 17-ОП. Концентрацию П оценивали в плазме крови в период лютеиновой фазы на 20-22-й д.м.ц. Нормативные показатели концентрации гормонов в плазме крови у женщин репродуктивного возраста представлены в таблице 1. Таблица 1 Нормативные показатели концентрации гормонов в плазме крови у женщин репродуктивного возраста Наименование показателя Нормативные показатели ФСГ 3,0-10,0 МЕ/л ЛГ 3,0- 8,0 МЕ/л АМГ 1,0- 4,5 нг/мл Е2 150-450 пмоль/л ПРЛ 120-500 мМЕ/л К 200-500 нмоль/л Тсв 1,0-2,5 нмоль/л ДЭА-С 0,9-11,7 мкмоль/л ТТГ 1,0-3,0 мМЕ/л Т4св 10,0-25,0 пмоль/л СТГ 0,15-13,0мМЕ/л 17-ОП 0,3-3,0 нмоль/л П (лютеиновая фаза цикла) 16-95 нмоль/л 53 2.3.3 Ультразвуковое исследование органов малого таза Всем пациенткам на этапе предварительного обследования на 5-7 д.м.ц. проводилось ультразвуковое исследование (УЗИ) органов малого таза с целью исключения возможных противопоказаний для начала проведения лечения в программе ВРТ. Исследование выполнялось на ультразвуковом аппарате компании «Brulle Kierre» (Siemens, Германия) с использованием трансвагинального датчика частотой 7,5 МГц. Исследование проводилось при опорожненном мочевом пузыре. Для обеспечения стерильности на датчик одевался одноразовый презерватив. В ходе исследования оценивались размеры тела матки, ее форма и положение, структура миометрия, полость матки, толщина и структура эндометрия, размеры яичников и их положение относительно матки, количество антральных фолликулов. Определялось наличие свободной жидкости или наличие объемных образований в полости малого таза, оценивалась степень выраженности спаечного процесса. Частота проведения УЗ-мониторинга определялась схемой протокола стимуляции функции яичников. Первое УЗИ органов малого таза осуществлялось в день планируемого начала лечения на 2-5 д.м.ц., в зависимости от состояния овариального резерва пациентки. Далее УЗ мониторинг фолликулогенеза и роста эндометрия проводился на 5 день стимуляции функции яичников с целью определения даты начала введения препарата ант-ГнРГ, далее - по одному разу в 2-3 дня с целью контроля динамики роста фолликулов и эндометрия и решения вопроса о назначении овуляторной дозы препарата хорионического гонадотропина (ХГ). 2.3.4 Спермиологическое исследование эякулята Показатели сперматогенеза оценивались дважды: при предварительном обследовании в рамках подготовки к программе ЭКО/ИКСИ и в день трансвагинальной пункции яичников (ТВП). Перед проведением исследования пациенты соблюдали предписанные рекомендации. Сбор материала производился в стерильный пластмассовый контейнер. Оценка параметров 54 эякулята производилась в соответствии с нормативами ВОЗ от 2010 г. (табл. 2) [156]. Таблица 2 Нормативы спермограммы (ВОЗ, 2010) Показатель Общий объем эякулята PH Концентрация сперматозоидов в 1 мл эякулята Общее количество сперматозоидов Время разжижения Подвижность сперматозоидов Общая подвижность сперматозоидов (А+В) Сперматозоиды с прогрессивным движением (А) Морфология Жизнеспособность сперматозоидов Концентрация лейкоцитов Агглютинация Эритроциты Слизь Амилоидные тельца Антиспермальные антитела (MARтест) Норматив, единицы измерения ≥ 1,5 мл ≥ 7,2 ≥ 15 млн/мл ≥ 39 млн 10-60 минут ≥ 40% ≥ 32% ≥ 4 % нормальных форм ≥ 58 % живых сперматозоидов < 1 млн/мл отсутствует отсутствуют Небольшое количество отсутствуют < 50 % сперматозоидов, ассоциированных с антиспермальными антителами Для оценки патологии эякулята руководствовались критериями ВОЗ 2010 г.: аспермия – отсутствие эякулята; азооспермия – отсутствие сперматозоидов в эякуляте; олигозооспермия – снижение концентрации сперматозоидов ниже нормативного значения (общая подвижность <40%, сперматозоиды с прогрессивным движением <32%); тератозооспермия – повышение аномальной морфологией (˃96%); количества сперматозоидов с 55 олигоастенотератозооспермия — сочетание трех видов патозооспермии; астенотератозооспермия, олиготератозооспермия, олигоастенозооспермия – сочетание двух видов патозооспермии. 2.3.5 Специальные методы исследования Анализ параметров энергопреобразующей функции митохондрий мононуклеарных клеток периферической крови (МПК) Для анализа было отобрано 112 образцов периферической крови, полученных от 56 пациенток, отобранных случайным образом. Для выделения мононуклеарных клеток периферической крови (МПК) использовали периферическую венозную кровь, взятую у пациенток натощак до начала стимуляции суперовуляции в пробирки с этилендиаминтетраацетатом (ЭДТА) (Sarstedt). Для функциональную оценки влияния активность применения митохондрий гонадотропинов перед проведением на ТВП производился повторный забор венозной крови. Использовали стандартную методику выделения МПК на градиенте фиколла (Sigma) плотностью 1,077 г/мл. Дизайн исследования приведен на рисунке 4. Для оценки трансмембранного потенциала митохондрий, выделенные МПК окрашивали потенциала флуоресцентным митохондрий индикатором трансмембранного 5,5',6,6'-тетрахлор-1,1'3,3'-тетраэтилбензимидазол- карбоцианином (JC1) (Life technologies) по протоколу, рекомендованному производителем, и методом проточной цитометрии оценивали распределение клеток по интенсивности окраски в зеленом и красном канале. JC-1 представляет собой катионный краситель, поглощение которого митохондриями напрямую связано с уровнем их трансмембранного потенциала. Большая концентрация JC-1 коррелирует с большим его поглощением, излучая при этом красное свечение, в то время как зеленое свечение указывает на присутствие JC-1 в качестве мономера. Показатель соотношения красного и зеленого спектров указывает на степень поляризации внутренней мембране митохондрий. 56 Для оценки жизнеспособнсти клеток использовали краситель пропидий йодид (Life technologies). Женщины с избыточной массой тела (ИМТ 25,0-29,9 кг/м2) n=16 Женщины с нормальной массой тела (ИМТ 18,5-24,9 кг/м2) n=21 Женщины с ожирением (ИМТ >30,0 кг/м2) n=19 Забор крови натощак до начала стимуляции суперовуляции Измерение доли высокополяризованных МПК и потенциала митохондрий Стимуляция суперовуляции яичников Забор крови натощак перед проведением трансвагинальной пункции Трансвагинальная пункция яичников яичников Анализ Перенос эмбрионов в полость матки Исход лечения Рисунок 4. Дизайн анализа параметров энергопреобразующей функции митохондрий и исходов лечения в программе ЭКО Измерение проводили на проточном цитофлуориметре (BD FACS Calibur). Для каждой пробы измеряли два показателя: долю МПК с высокополяризованными митохондриями и величину, характеризующую потенциал митохондрий в МПК. Показатель, характеризующий потенциал митохондрий в клетках крови, рассчитывали как (М красный 1/М зеленый 1) - (М красный 2/ М зеленый 2), где М красный 1 и М зеленый 1 – медианы интенсивности свечения МПК с высокополяризованными митохондриями в интактной пробе на длинах волн 590 и 529 нм, соответственно, а М красный 2 и М зеленый 2 – медианы 57 интенсивности свечения МПК с высокополяризованными митохондриями в контрольной пробе, в которую был добавлен карбонилцианид-4-(трифторметил)-фенилгидразон разобщитель (Sigma) в дыхания конечной концентрации 7 µМ (рисунок 5). В дальнейшем данный показатель будет обозначен как ΔΨ. А Б Рисунок 5. Распределение мононуклеаров, окрашенных JC1, до и после действия разобщителя митохондриального дыхания и оксилительного фосфорилирования. А – энергизованное состояние, Б – деэнергизованное состояние Оценка фунционального состояния митохондриального аппарата в клетках кумулюса Для анализа было отобрано 100 образцов клеток кумулюса, полученных от 14 пациенток, отобранных случайным образом. Забор клеток кумулюса производился механическим путем, после чего клетки помещались в пронумерованные чашки с буферной средой для гамет, уравновешенной до +370С. Клетки кумулюса культивировали на чашках Петри, 58 адаптированных для микроскопии (диаметр 35мм; Ibidi, Германия) в среде для культивирования ДМЕМ/F12 (ПанЭко, Россия) с добавлением пенициллина/стрептомицина и 10% фетальной бычьей сыворотки, в условиях СО2-инкубатора (+37, 5% СО2, влажность 95%). На пятый день культивирования живые адгезированные на поверхность чашки клетки окрашивали флуоресцентными красителями (Life Technologies, США) согласно инструкции фирмы производителя: Митотрэкер зеленый (MitoTracker Green) – краситель зеленого цвета, окрашивающий митохондрии, независимо от величины потенциала на их мембране; Тетраметилродамин (TMRM) – краситель красного цвета, специфически окрашивающий метаболически активные митохондрии; Hoechst 33342 – краситель синего цвет, специфически связывающийся с ДНК и использующийся для окрашивания клеточных ядер. Снимки окрашенных клеток делали на флуоресцентном микроскопе Zeiss (Германия) при увеличении х63 (масляная иммерсия), по 8-10 полей зрения на каждую чашку Петри. Полученные снимки анализировали с помощью специализированной программы для обработки изображений ImageJ (США). Для каждого изображения рассчитывали соотношение интенсивности зеленой и красной флюоресценции из расчета на одну клетку, которое характеризует величину трансмембранного потенциала митохондрий. Определение содержания глутатиона в цельной крови Определение содержания глутатиона в цельной крови проводили по методике, приведенной в работе Giustarini D. и коллег [17]. Кровь собирали в пробирки содержащие только ЭДТА (концентрация 75 мг/мл, 23 мкл ЭДТА на 1 мл цельной крови) в случае определения общего глутатиона (tGSH). После этого кровь аккуратно перемешивали, переворачивая пробирки, и хранили при температуре -80°С. 59 Для измерения общего глутатиона в образцы добавляли эквивалентный объем 15% TXУ, перемешивали и центрифугировали 2 минуты при 14000g. Супернатант отбирали, для проведения измерений образцы разводили в 20 раз. Определение глутатиона в образцах крови основано на энзиматической реакции восстановления одной молекулы окисленного глутатиона (GSSG) до двух молекул глутатиона (GSH) ферментом глутатионредуктазой (GR) в присутствии НАДФН и спектрофотометрическом измерении хромофорного продукта реакции. Образующийся GSH взаимодействует с 5,5'-дитиобис(2нитробензойной) кислотой (DTNB) с образованием окрашенного продукта реакции 2-нитро-5-тиобензоата сульфгидрильных (–SH) (TNB) групп в пропорционально количеству образце. измеряется TNB спектрофотометрически при 412 нм - это единственный компонент реакции, поглощающий при данной длине волны. Измерение tGSH проводили следующим образом: в кювету при постоянном перемешивании последовательно добавляли 920 мкл 200 мМ фосфатного буфера, 20 мкл 20 мМ DTNB, 20мкл исследуемого образца, 20 мкл 4.8 мМ НАДФН и 20 мкл фермента GR 20 U/мл. После добавления в систему GR происходит запуск энзиматической реакции, результатом которой является изменение оптической плотности раствора образца, которое мы регистрировали в течение 1 минуты (∆А412). Концентрацию tGSH определяли по калибровочной кривой. Для её построения в кювету вместо исследуемого образца добавляли раствор глутатиона с известной концентрацией, для его приготовления стоковый раствор 20 мМ GSH (6.1 мг GSH в 1мл воды) последовательно разводили водой до 100, 75, 50, 20, 10 и 5 мкМ. Полученные значения концентрации tGSH в мкмоль/литр пересчитывали с учетом всех разведений. Для стандартизации методики полученные данные по концентрации общего глутатиона нормировались на содержание гемоглобина в крови пациентов. 60 Измерение концентрации гемоглобина (Hb) в крови проводили с помощью гемихромного метода. Принцип данного метода основан на переводе всех форм Hb в одну – гемихром (HbChr). При взаимодействии Hb с трансформирующим раствором происходит его превращение в окисленную низкоспиновую форму – гемихром, интенсивность которого прямо пропорциональна концентрации Hb в пробе. В качестве трансформирующего агента был использован раствор додецил сульфата натрия (SDS): 6% стоковый раствор (6г SDS/100мл дистиллированной воды), рабочий раствор – 0.06% (450мкл SDS 6% + 45мл H2O дистиллированной). Для приготовления пробы к 20мкл крови содержащей ЭДТА добавляли 5мл 0.06% SDS, хорошо перемешивали и инкубировали 5 мин при комнатной температуре. Измерения оптической плотности проводили спектрофотометрическим методом в режиме сканирования в диапазоне спектра от 450 до 650 нм против кюветы с 0.06% SDS. Максимум поглощения гемихрома находится при λ=533 нм. Концентрацию гемоглобина рассчитывали по формуле: C=A*f, где С – концентрация гемоглобина (г/л), А – оптическая плотность измеряемого раствора (ед.опт.пл.), f – теоретический фактор равный 398 (г/л*ед.опт.пл-1). Определение содержания показателей лептина, адипонектина, Среактивного белка и ИЛ-6 в плазме крови Измерение концентрации белков в плазме проводили при помощи наборов для мультиплексного анализа (таблица 3) на мультиплексном анализаторе Luminex 200 (Luminex Corporation, США). Пробы венозной крови отбирали натощак в пробирки с калием-ЭДТА (Sarstedt, Германия). Для получения плазмы кровь центрифугировали со скоростью 4000 об./мин. в течение 10 Германия). Аликвоты плазмы мин. при +4°С (Eppendorf 5810R, (4х200мкл) отбирали в чистые промаркированные пробирки и хранили при -80°С до момента проведения измерений. 61 Процедуру измерения проводили в соответствии с инструкцией производителя наборов. Расчет концентрации белков в плазме крови осуществляли по калибровочной кривой в программе Luminex 100 IS 2.3 (Luminex Corporation, США). Таблица 3 Использованные в работе наборы для мультиплексного анализа № Название набора Производитель 1 Human Adipokine Panel 1 Merck Millipore 2 Human Adipokine Panel 2 Merck Millipore п/п 3 Human Neurodegenerative Disease Panel 2 Merck Millipore Каталожный Измеряемый номер белок HADK1MAG61K HADK2MAG61K HNDG2MAG36K адипонектин интерлейкин-6, лептин С-реактивный белок 2.3.6 Протокол стимуляции функции яичников Стимуляция функции яичников у всех пациенток проводилась по стандартному протоколу с препаратами Гн и антГнРГ. Протокол стимуляции суперовуляции начинался со 2-5 дня менструального цикла, выбор стартовой дозы гонадотропинов зависел от возраста пациентки и параметров овариального резерва. При помощи УЗмониторинга оценивалась динамика роста фолликулов и по мере необходимости производилась коррекция дозы вводимых гонадотропинов. С целью предотвращения преждевременной лютеинизации фолликулов, при достижении лидирующим фолликулом 14-15 мм в диаметре, начиналось ежедневное подкожное введение препарата антГнРг в дозе 0,25 мг/сут. подкожно вплоть до дня введения триггера овуляции. При достижении фолликулами размеров 18-20 мм в диаметре, с целью финального дозревания ооцитов в качестве триггера овуляции вводился препарат хорионического 62 гонадотропина человека в дозе 10 000 ЕД однократно за 35-36 часов до планируемой ТВП (рисунок 6). Триггер овуляции и Перенос эмбриона ТВП антГнРГ Препарат ФСГ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 дни менструального цикла гестагены Трансвагинальное УЗИ органов малото таза Рисунок 6. Схема применения протокола с антГнРГ 2.3.7 Трансвагинальная пункция яичников Забор ооцитов проводился через 35-36 часов после введения овуляторной дозы ХГ под внутривенной анестезией и ультразвуковым контролем с использованием одноразовых игл (Vitrolife Inc, США) в условиях малой операционной. Аспирация фолликулярной жидкости производилась под отрицательным давлением 190 мм водного столба в заранее подогретые стерильные пробирки, содержащие 0,5 мл гепарина, которые немедленно передавались эмбриологу для последующей идентификации ооцит- кумулюсного комплекса и оценки степени зрелости полученных ооцитов. 2.3.8 Метод оплодотворения и культивирования дробящихся эмбрионов in vitro Сразу же после аспирации фолликулярной жидкости производилась идентификация ооцит-кумулюсных комплексов и оценка степени зрелости ооцитов под стереомикроскопом на нагретой поверхности стерильного ламинарного бокса. Во время производимых манипуляций постоянно поддерживали стабильную температуру (+370С) и показатель рН среды (7,5). 63 Ооцит-кумулюсные комплексы отмывали от фолликулярной жидкости и крови и помещали в стерильные планшеты Nunc с культуральной средой (Fertilization medium, COOK, Австралия) на 2-3 часа с целью предварительной инкубации при температуре +370 С и атмосфере с 5% СО2. Выбор метода оплодотворения зависел от показателей спермограммы (объема эякулята, концентрации сперматозоидов в эякуляте, количества прогрессивно-подвижных сперматозоидов, процента морфологически нормальных сперматозоидов и степени их агглютинации) и количества полученных ооцитов. Каждый образец эякулята подвергали седиментационному разделению в градиенте плотности при центрифугировании, отмывали в буфере для гамет (Gamete buffer, COOK, Австралия) и ставили на флотацию. При оплодотворении методом ЭКО по окончании периода предварительной инкубации ооцит-кумулюсные комплексы инсеминировали в четырехлуночных планшетах Nunc, где на каждый ооцит добавляли по 0,1 мл культуральной среды, содержащей сперматозоиды в концентрации 100000150000 прогрессивно-подвижных сперматозоидов на 1 мл. При необходимости проводили оплодотворение ооцитов методом интрацитоплазматической инъекции сперматозоида в ооцит (ИКСИ). Перед проведением ИКСИ после периода предварительной инкубации производилось денудирование ооцитов – их ферментативное очищение от клеток кумулюса при помощи раствора гиалуронидазы в течение 20 секунд. После этого ооциткумулюсные комплексы отмывали в буферной среде HEPES и возвращали в лунки, где проводилась преинкубация. Через 30 минут оставшиеся клетки кумулюса удаляли механическим путем. Этапы ИКСИ: 1. выбор сперматозоида и его иммобилизация посредством перетирания жгутика; 2. захват выбранного сперматозоида в инъекционную пипетку; 64 3. фиксация и поворот ооцита с целью локализации полярного тельца в положении 6 или 12 ч; 4. введение сперматозоида с аспирированной ооплазмой в ооцит. После проведения оплодотворения методом ИКСИ ооциты переносили в культуральную среду с целью дальнейшего культивирования. Оценка оплодотворения проводилась через 14-16 часов после оплодотворения. Оплодотворение расценивали как нормальное при наличии двух пронуклеусов в цитоплазме. В случае отсутствия двух пронуклеусов оплодотворение считали несостоявшимся. Оплодотворение расценивали как аномальное в случае определения одного или более двух пронуклеусов. Оценку качества эмбрионов производили на 3-и сутки (через 72 часа после получения ооцитов) после оплодотворения на основании совокупности их морфологических характеристик. При этом учитывались показатели скорости дробления эмбрионов, оценивались симметричность бластомеров, их моно-/мультинуклеарность и степень фрагментации. В соответствии с классификацией, установленной международным согласительным совещанием ESHRE в 2009 г., эмбрионы были разделены на 3 класса [Alpha Scientists in Reproductive Medicine]: 1 класс (хорошего качества) – эмбрионы, состоящие из 7-8 симметричных мононуклеарных бластомеров, имеющие менее 10% фрагментации цитоплазмы, без явлений мультинуклеарности; 2 класс (удовлетворительного качества) - эмбрионы, состоящие из 6-8 симметричных мононуклеарных бластомеров, имеющие 10-25% фрагментации цитоплазмы, без явлений мультинуклеарности; 3 класс (плохого качества) - эмбрионы, состоящие из 6 и менее бластомеров (при этом бластомеры могут быть несимметричны между собой), фрагментация цитоплазмы составляет более 25%, отмечаются явления мультинуклеарности. 2.3.9 Перенос эмбрионов в полость матки Перенос эмбрионов в полость матки осуществлялся в асептических условиях под ультразвуковым контролем посредством применения 65 одноразовых гибких катетеров на 3 или 5 сутки культивирования in vitro. Количество перенесенных эмбрионов в одном цикле ЭКО/ИКСИ не превышало двух. 2.3.10 Поддержка лютеиновой фазы и посттрансферного периода Поддержка лютеиновой фазы и посттрансферного периода осуществлялись по общепринятой схеме: через 24 часа после проведения ТВП назначался препарат микронизированного прогестерона (Утрожестан) в дозе 200-300 мкг/сут. или дидрогестерон (Дюфастон) в дозе 20-30 мг/сут. После переноса эмбрионов в полость матки дозировку одного из гестагенных препаратов увеличивали в два раза. 2.3.11 Диагностика наступления беременности Диагностика наступления беременности производилась путем определения в сыворотке крови концентрации ß-субъединицы ХГЧ через 14 дней после переноса эмбрионов в полость матки. Тест на беременность считался положительным при концентрации ß-ХГЧ более 20 МЕ/л («биохимическая беременность»). Ультразвуковая диагностика клинической беременности проводилась через 21 день после переноса эмбрионов с целью визуализации плодного яйца в полости матки и при сроке 5-6 недель беременности с целью определения сердцебиения. 2.3.12 Статистический анализ полученных данных Статистическая обработка данных выполнена на индивидуальном компьютере с помощью электронных таблиц «Microsoft Excel» и пакета прикладных программ «SPSS Statistics 17.0», «Statistica for Windows» v. 7.0. Все полученные количественные данные обработаны методом вариационной статистики. Для каждого количественного параметра были определены: среднее значение, среднеквадратическое отклонение, ошибка среднего, медиана, 95% доверительный интервал. Для качественных данных определяли показатели частоты (%). Перед проведением сравнительного анализа тип распределения количественных данных был определен для каждой исследуемой группы при 66 помощи критерия Колмогорова-Смирнова или Шапиро-Уилка, определяемых в зависимости от размера выборки, а также при помощи построения графиков распределения анализируемых данных. При нормальном типе распределения данных определяли среднее значение со стандартным отклонением. Для сравнения данных применяли методы параметрической статистики: t-тест для анализа данных в 2-х независимых группах и однофакторный дисперсионный анализ ANOVA для анализа данных в трех и более независимых группах. Если количественные данные не подчинялись закону нормального распределения, то для их описания применялись медиана и процентили. Для оценки различий между группами применяли методы непараметрической статистики: тест Манна-Уитни для сравнения данных в 2-х группах или тест Краскела-Уоллиса для сравнения данных в трех и более группах). Для описания качественных данных использовали частоты и доли, с которыми данные признаки встречались в выборке. Для сравнения качественных показателей и установления значимых различий между ними в 2х и более группах использовали тест χ2, для вычисления которого прибегали к построению таблиц сопряженности. Зависимые корреляции. переменные Корреляционный оценивались анализ при помощи проводился с коэффициента использованием параметрического критерия Пирсона при нормальном типе распределения данных или непараметрического корреляционного критерия Спирмена при отличном от нормального типе распределения данных. Математические модели прогноза вероятности наступления клинической беременности и живорождения создавались при помощи метода логистической регрессии, на основании которой были построены уравнения для предсказания вероятности наступления анализируемого события. Статистически значимыми считались различия при р<0,05 (95% уровень значимости), при р<0,01 (99% уровень значимости). Отношение шансов (ОШ) приведено с 95% доверительным интервалом (ДИ). Для уменьшения ошибки выборки использовались строгие критерии отбора 67 пациентов. Для уменьшения информационной ошибки исследования для всех пациентов использовались одни и те же методы диагностики на базе одной лаборатории. Оценка воздействующего фактора и исхода также была едина для всех пациентов. 68 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Согласно поставленным целям и задачам исследования было обследовано 173 пациентки, обратившиеся с целью проведения программы ЭКО/ИКСИ по поводу бесплодия, обусловленного трубно-перитонеальным фактором, отсутствием овуляции, мужским фактором (при отсутствии выраженной патозооспермии) и сочетанным фактором, соответствовавших критериям включения/исключения (см. главу 2). В ходе проведенного лечения из исследования было исключено 12 пациенток в связи с отменой переноса эмбрионов из-за высокого риска развития клинически значимого синдрома гиперстимуляции яичников (7 пациенток из 1 группы, 4 пациентки из 2 группы и 1 пациентка из 3 группы), и 1пациентка в связи с отсутствием ооцитов после пункции (из 3 группы). Данные о профиле набора включенных в исследование пациенток представлены на рисунке 7. После ознакомления с целью и поставленными задачами исследования, все женщины подписали информированное согласие. Пациентки с бесплодием, обратившиеся в отделение ВРТ n=173 Группа 1 Женщины с нормальной массой тела n=79 (ИМТ 18,5-24,9 кг/м2) Группа 2 Женщины с избыточной массой тела n=43 (ИМТ 25,0-29,9 кг/м2) Исключены из исследования n=7 Исключены из исследования n=4 Группа 1 Группа 1 Группа 1 Группа 2 n=72 n=39 Группа 3 Женщины с ожирением n=51 (ИМТ ≥30,0 кг/м2) Исключены из исследования n=2 Группа 3 n=49 Рисунок 7. Профиль набора включенных в исследование пациенток 69 3.1. Клинико-анамнестическая характеристика включенных в исследование супружеских пар Для выявления возможных конфаундеров с целью их дальнейшего исключения для минимизации систематической ошибки исследования была изучена клинико-анамнестическая характеристика групп. 3.1.1 Возрастная характеристика супружеских пар Возраст супружеских пар, включенных в исследование, выясняли на момент начала лечения в программе ЭКО и ПЭ. Таблица 4 Возрастная характеристика включенных в исследование пациенток Возраст, лет Медиана Среднее арифметическое Минимум Максимум Тест Шапиро-Уилка (p) Группа 1 (нормальная масса тела) n=72 31,0 31,4 Группа 2 (избыточная масса тела) n=39 32 31,9 Группа 3 (ожирение) n=49 23,0 37,0 0,05 26,0 37,0 0,034 25,0 38,0 0,001 33 32,6 На основании критерия Шапиро-Уилка было обнаружено, что возраст пациенток в исследуемых группах не подчиняется закону нормального распределения. Тест Краскела-Уоллеса не выявил статистически значимых различий по возрасту между исследуемыми группами (таблица 4). Таким образом, средний возраст пациенток составил 31,4±3,4 лет, 31,9±3,3 лет и 32,6±4,0 лет в группах 1, 2 и 3, соответственно (p=0,142). На основании критерия Шапиро-Уилка было обнаружено, что возраст половых партнеров в исследуемых группах так же не подчинялся закону нормального распределения. Тест Краскела-Уоллеса не выявил статистически значимых различий по возрасту между исследуемыми группами (таблица 4). Таким образом, средний возраст половых партнеров составил 34,2±6,0 лет, 33,0±6,1 лет и 35,1±6,2 лет в группах 1, 2 и 3, соответственно (p=0,174). Возрастная характеристика супружеских пар представлена на рисунке 8. 70 Таблица 5 Возрастная характеристика половых партнеров пациенток, включенных в исследование Возраст, лет Медиана Среднее арифметическое Минимум Максимум Тест Шапиро-Уилка (p) Группа 1 (нормальная масса тела) n=72 32,0 34,2 Группа 2 (избыточная масса тела) n=39 32,0 33,0 Группа 3 (ожирение) n=49 26,0 53,0 0,000 23,0 51,0 0,011 26,0 56,0 0,003 34,0 35,1 Рисунок 8. Возраст включенных в исследование женщин и их половых партнеров Линия в середине «ящика» представляет собой медиану (50-й процентиль), границами «ящика» служат первый и третий квартили (25-й и 75-й процентили). Концы «усов» соответствуют минимальному и максимальному значениям. Крайние точки (выбросы) – данные, выходящие за границы «усов». 3.1.2 Антропометрическая характеристика пациенток Включенные в исследование пациентки имели женский тип телосложения с правильным развитием вторичных половых признаков. Проведенный анализ антропометрических данных не выявил значимых различий в средних показателях роста между группами (таблица 6). Средний 71 рост пациенток составил 1,65±0,06 м. в группе 1, 1,65±0,07 м и 1,65±0,06 м в группе 2 и 3, соответственно (p=0,955, ANOVA). Учитывая нормальное распределение данных по весу, для их анализа был применен однофакторный дисперсионный анализ ANOVA, который показал статистически значимые различия между группами (р<0,001). Также были выявлены статистически значимые различия между группами по показателям соотношения ОТ/ОБ (р<0,001) и изменения массы тела в ответ на стимуляцию суперовуляции (р=0,011). Однако стоит отметить, что изменение массы тела, выраженное в процентах от исходной массы, значимо между группами не различалось (р=0,129). При анализе ИМТ, ОТ и ОБ выявлены межгрупповые различия между средними арифметическими и медианами, а также был сделан вывод о ненормальном характере распределении данных (основываясь на графическом анализе и достигнутом уровне значимости в тесте Шапиро-Уилка). Тест Краскела-Уоллеса выявил статистические значимые различия по показателям ИМТ (р<0,001), ОТ (р<0,001) и ОБ (р<0,001) между исследуемыми группами, что потребовало дополнительного попарного сравнения между группами. Тест Манна-Уитни также выявил статистически значимые различия по вышеописанным показателям между группами. При анализе показателей веса и ИМТ были выявлены различия между исследуемыми группами, что указывает на то, что исследуемые группы были сформированы верно. 72 Таблица 6 Антропометрическая характеристика исследуемых групп Показатель Группа 1 (ИМТ 18,524,99 кг/м2) Группа 2 (ИМТ 25,029,99 кг/м2) Группа 3 (ИМТ>30,0 кг/м2) ИМТ (кг/м2) * 22,21 (20,5423,88) 27,36 (26,4029,06) 33,58 (32,65- 0,001 36,53) Рост(м) ** 1,65±0,06 1,65±0,07 1,65±0,06 0,955 Вес (кг) ** 60,02±6,53 75,03±7,26 95,07±12,37 0,001 ОТ (см) * 71 (66-74) 84 (80-89) 100 (94-108) 0,001 ОБ (см) * 98 (94-101) 106 (103-110) 116 (109122) 0,85±0,08 0,001 P– уровень значимос ти ОТ/ОБ** 0,73±0,05 0,79±0,06 0,001 Изменение веса после стимуляции суперовуляции (кг) ** 0,34±1,16 0,76±1,49 1,10±1,78 0,011 Общее число пациенток 160 72 39 49 *данные представлены как медиана, 25 - 75 процентили, тест Краскела-Уоллеса; **данные представлены как средние ± стандартное отклонение, тест ANOVA. * ** ** * * ** * Рисунок 9. ИМТ и вес включенных в исследование женщин Линия в середине «ящика» представляет собой медиану (50-й процентиль), границами «ящика» служат первый и третий квартили (25-й и 75-й процентили). Концы «усов» соответствуют минимальному и максимальному значениям. Крайние точки (выбросы) – данные, выходящие за границы «усов». * – р<0,001 (тест Краскела-Уоллеса), **– р<0,001 (тест ANOVA) 73 3.1.3. Социально-экономические характеристики исследуемых групп По семейному положению, условиям проживания, уровню образования и трудовой занятости пациентки между группами исследования не различались. Отягощенность по наследственным заболеваниям между группами также не различалась и была представлена онкологическими, сердечно-сосудистыми заболеваниями (гипертоническая болезнь, инфаркт, инсульт) и сахарный диабет 2 типа. По частоте распространения курения исследуемые группы между собой статистически значимо не различались (χ2, р=0,252). 3.1.4. Характеристика менструальной функции женщин Данные по оценке менструальной функции пациенток (возраст менархе, продолжительность цикла, длительность и характер менструальных выделений) представлены в таблице 7. Таблица 7 Характеристика менструальной функции включенных в исследование женщин Показатель Группа 1 (ИМТ18,524,99 кг/м2) Группа 2 (ИМТ 25,029,99 кг/м2) Группа 3 (ИМТ>30,0 кг/м2) P– уровень значимос ти Возраст менархе (лет) * 13 (12-14) 13 (12-14) 13 (12-14) 0,800 Продолжительность менструального 28 (28-29) 29 (28-32) 28 (28-30) 0,197 цикла (дней) * Продолжительность менструального 5 (4-6) 5 (4-6) 5 (4-5,5) 0,229 кровотечения* Регулярный 97% (70) 85% (33) 92% (45) χ2=5,84 менструальный цикл** 0,054 Нерегулярный 3% (2) 15% (6) 8% (4) менструальный цикл** Болезненные менструации** 36% (26) 41% (16) 49% (24) χ2=1,99 Безболезненные менструации** 64% (46) 59% (23) 51% (25) 0,369 Интенсивность менструального** кровотечения Скудная 1% (1) 0% (0) 6% (3) χ2=4,93 Умеренная 78% (56) 77% (30) 80% (39) 0,294 Обильная 21% (15) 23% (9) 14% (7) Общее число пациенток 160 72 39 49 *данные представлены как медиана, 25 - 75 процентили, тест Краскела-Уоллеса; **данные представлены как абсолютное число пациенток и доли пациенток в %, χ2-тест. 74 При анализе возраста менархе, продолжительности менструального цикла и длительности менструального кровотечения было обнаружено, что данные не подчиняются закону нормального распределения. При применении непараметрического критерия Краскела-Уоллеса статистически значимых различий между данными показателями в исследуемых группах выявлено не было. На основании оценки основных характеристик менструального цикла женщины в исследуемых группах были сопоставимы. У большинства пациенток менархе наступило в 13 лет, при этом самый ранний возраст менархе составил 8 лет, а самый поздний – 18 лет. Средняя продолжительность менструального цикла составила 28 дней, а длительность менструального кровотечения – 5 дней. Анализ характера менструальной функции женщин показал, что у большинства пациенток цикл был регулярным. При этом, согласно критерию хи-квадрат (χ2=5,84) и показателю двухсторонней асимптотической значимости (р=0,054), наблюдалась тенденция к увеличению числа женщин с нерегулярным менструальным циклом в группах с избыточной массой тела и ожирением. 3.1.5. Репродуктивный анамнез пациенток Данные репродуктивного анамнеза фиксировались на момент начала проведения программы ЭКО/ИКСИ. В среднем дебют половой жизни отмечался в18,7±2,7 лет, 18,2±2,0 лет, 18,9±3,0 лет в группах 1,2 и 3 соответственно и статистически между группами не различался (тест Краскела-Уоллеса, p=0,785). Продолжительность бесплодия у женщин в группе 1 составила 4,8±3,3 года, в группе 2 и группе 3 – 5,8± 3,2 года и 7,2 ± 4,2 года соответственно, при этом были выявлены статистически значимые различия между исследуемыми группами (тест Краскела-Уоллеса, р=0,004). В связи с этим было проведено попарное сравнение между группами, для чего был применен тест МаннаУитни, который выявил статистически значимые различия по 75 продолжительности бесплодия между группой 1 и группой 3 (p=0,01) (рисунок 10). * * Рисунок 10. Продолжительность бесплодия у включенных в исследование женщин Линия в середине «ящика» представляет собой медиану (50-й процентиль), границами «ящика» служат первый и третий квартили (25-й и 75-й процентили). Концы «усов» соответствуют минимальному и максимальному значениям. Крайние точки (выбросы) – данные, выходящие за границы «усов». * – p=0,01 (тест Манна-Уитни). Данные о типе бесплодия включенных в исследование женщин представлены на рисунке 11. 100% 90% * * 80% 70% 60% 50% Вторичное бесплодие 40% Первичное бесплодие 30% * ̶ р=0,011 (χ2-тест) 20% 10% 0% Группа 1 Группа 2 Группа 3 Рисунок 11. Характеристика включенных в исследование женщин по типу бесплодия 76 Анализ данных о типе бесплодия у женщин исследуемых групп выявил статистически значимые различия в распределении случаев первичного и вторичного бесплодия (χ2=6,82, p=0,033). При этом при попарном исследовании исследуемых групп было обнаружено, что статистически значимо между собой различались лишь 1 и 2 группа (р=0,011), что указывает на то, что частота вторичного бесплодия в группе женщин с нормальной массой тела была выше, в то время как в группе женщин с избыточной массой тела чаще наблюдалось первичное бесплодие. Показатель продолжительности бесплодия между 1 и 3 группами (р=0,124), а также между 2 и 3 группами (р=0,297) достоверно не различались. В структуре представленной этиологии бесплодия (рисунок 12) во всех группах преобладал трубно-перитонеальный фактор и составил 68,1%, 56,4% и 59,2% соответственно. Мужской фактор составил 13,9%, 20,5% и 28,6% в 1,2 и 3 группах. На долю сочетанного фактора и бесплодия неясной этиологии в первой группе пришлось 9,7% и 8,3%, во второй группе – 20,5% и 2,6%, в третьей группе – 8,2% и 2%. Отсутствие овуляции встречалось только в группах 2 и 3, и составило 2,6% и 2%. 100% Неясного генеза 90% 80% Сочетанный фактор 70% 60% Мужской фактор 50% 40% Трубно-перитонеальный фактор 30% 20% Отсутствие овуляции 10% 0% группа 1 группа 2 группа 3 Рисунок 12. Характеристика включенных в исследование женщин по фактору бесплодия 77 Анализ данных об этиологическом факторе бесплодия у пациенток статистически значимых различий в исследуемых группах не выявил (χ2, p=0,157). Анализ репродуктивного анамнеза женщин с вторичным бесплодием (общее число беременностей, искусственных абортов, самопроизвольных выкидышей, неразвивающихся беременностей, преждевременных и своевременных родов) показал, что по исходам беременностей статистически значимых различий между группами выявлено не было (таблица 8). У пациенток в группе 1 в 12,5% случаев беременность закончилась родами, в 18,8% – абортом на малом сроке беременности, в 13,8% случаев произошло самопроизвольное прерывание беременности, в 7,5% была диагностирована неразвивающаяся беременность, в 46,2% – внематочная беременность, в 1,2% случаев произошла антенатальная гибель плода. Из осложнений беременности отмечалось одно прерывание беременности на сроке 26 недель гестации в связи с врожденными пороками развития плода, три поздних выкидыша в связи с истмико-цервикальной недостаточностью, один индуцированный аборт в 18 недель гестации в связи с наличием гемофилии А у плода, и одна антенатальная гибель плода. Во 2 группе исследования беременность завершилась своевременными родами в 19,2% случаев, абортом на малом сроке беременности в 15,4%, самопроизвольным прерыванием беременности в 7,7%, неразвивающейся беременностью в 7,7%, а внематочная беременность отмечалась в 50% всех случаев беременности. В 3 группе исследования беременность завершилась своевременными родами в 13,8% случаев, абортом на малом сроке беременности в 29,3%, самопроизвольным прерыванием беременности в 13,8%, неразвивающейся беременностью в 5,2%, а внематочная беременность отмечалась в 36,2% всех случаев беременности. Из осложнений беременности отмечалась одна антенатальная гибель плода. По количеству попыток ЭКО в анамнезе исследуемые группы также статистически значимо между собой не различались (тест Краскела-Уоллеса, р=0,076). 78 Таблица 8 Акушерский анамнез включенных в исследование женщин Показатель Группа 1 (ИМТ 18,524,99 кг/м2) n=72 Группа 2 (ИМТ 25,0-29,99 кг/м2) n=39 Группа 3 (ИМТ>30,0 кг/м2) n=49 80 26 58 Число беременностей на 1 пациентку* 1 (0-2) 0 (0-1) 1 (0-2) 0,082 Число попыток ЭКО в анамнезе* 1 (1-2) 1 (1-2) 1 (1-2) 0,076 Общее число своевременных родов** 12,5% (10) 19,2% (5) 13,8% (8) Число своевременных родов на 1 пациентку* Общее число искуственных** прерываний беременности Общее число искуственных прерываний беременности на 1 пациентку* Общее число неразвивающихся** беременностей Общее число неразвивающихся беременностей на 1 пациентку* Общее число внематочных беременностей** Общее число внематочных беременностей на 1 пациентку* Общее число самопроизвольных прерываний беременности (до 22 недель гестации) ** Общее число самопроизвольных прерываний беременности (до 22 недель гестации) на 1 пациентку* Антенатальная гибель плода** 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0,848 18,8% (15) 15,4% (4) 29,3% (12) 0,273 0 (0) 0 (0) 0 (0-0,5) 0,094 7,5% (6) 7,7% (2) 5,2% (3) 0,169 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0,353 46,2% (37) 50% (13) 36,2% (21) 0,305 0 (0) 0 (0) 0 (0-0,5) 0,389 13,8% (11) 7,7% (2) 13,8% (8) 0,648 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0,321 1,2% (1) 0% (0) 1,7% (1) 0,875 Общее число беременностей P– уровень значимос ти *данные представлены как медиана, 25 - 75 процентили, тест Краскела-Уоллеса; **данные представлены как абсолютное число пациенток и доли пациенток в %, χ2-тест. 3.1.6. Характеристика женщин по перенесенным гинекологическим заболеваниям и оперативным вмешательствам Данные о перенесенных гинекологических заболеваниях наглядно представлены в таблице 9. 79 Таблица 9 Перенесенные гинекологические заболевания среди включенных в исследование женщин Показатель Группа 1 (ИМТ 18,524,99 кг/м2) n=72 Группа 2 (ИМТ 25,029,99 кг/м2) n=39 Группа 3 (ИМТ>30,0 кг/м2) n=49 P– урове нь значи мости 40,3% (29) 41% (16) 30,6% (15) 0,488 Наружный генитальный эндометриоз 1-2 ст.* 4,2% (3) 0% (0) 0% (0) 0,154 Аденомиоз 1-2 ст.* 4,2% (3) 0% (0) 8,2% (4) 0,176 Миома матки* 4,2% (3) 18% (7) 10,2% (5) 0,057 52,8% (38) 41% (16) 40,8% (20) 0,326 6,9% (5) 15,4% (6) 4% (2) 0,138 Хронический сальпингоофорит* ИППП* Патология эндометрия* *данные представлены как доли пациенток в % и абсолютное число пациенток, χ2-тест. Представленные данные показывают, что как по частоте, так и по структуре встречаемости гинекологической патологии пациентки в исследуемых группах не различались. Принимая во внимание, что больший процент включенных в исследование пациенток имели трубно-перитонеальный фактор бесплодия (суммарно 61,2%), высокая частота распространения хронического воспаления придатков матки (суммарно 37,3%) и наличие в анамнезе ИППП (суммарно 44,9%) в структуре перенесенных гинекологических заболеваний вполне объяснима. Оперативные вмешательства на органах малого таза в анамнезе имели 119 из 160 включенных в исследование пациенток (74,4%). Структура оперативных вмешательств по группам представлена на рисунке 13. 80 Группа 1 Группа 2 Лапароскопия 6% 22% 72% Лапароскопия Лапароскопия 29% Лапаротомия 67% Гистероскопия Группа 3 4% 23% Лапаротомия 5% 72% Лапаротомия Гистероскопия Гистероскопия Рисунок 13. Структура вида оперативных вмешательств на органах малого таза среди включенных в исследование женщин . Данные о количестве и характере перенесенных оперативных вмешательств у женщин, включенных в исследование, представлены в таблице 10. Таблица 10 Перенесенные оперативные вмешательства на органах малого таза среди включенных в исследование женщин Оперативные Вмешательства Диагностическая лапароскопия* Консервативная миомэктомия* Адгезиолизис* Пластика маточных труб* Односторонняя тубэктомия* Двухсторонняя тубэктомия* Гистероскопия, РДВ* Группа 1 Группа 2 (ИМТ 18,5- (ИМТ 24,99 кг/м2) 25,0-29,99 n=72 кг/м2) n=39 14% (13) 3,7% (2) Группа 3 (ИМТ>30,0 кг/м2) n=49 Р– уровень значим ости 14,1% (9) Доля и процент в общей структур е 24 (11,4%) 0,315 3,2% (3) 7,4% (4) 1,6% (1) 3,8% (8) 0,194 10,8% (10) 3,2% (3) 18,5% (10) 3,7% (2) 21,9% (14) 0% (0) 16,1% (34) 2,4% (5) 0,381 0,343 41,9% (39) 29,6% (16) 34,3% (22) 36,5% (77) 0,133 5,4% (5) 7,4% (4) 4,7% (3) 5,7% (12) 0,743 21,5% (20) 29,6% (16) 23,4% (15) 24,1% (51) 0,505 Общее количество 93 54 64 211 0,611 операций** *данные представлены как доли пациенток в % и абсолютное число пациенток, χ2-тест; **данные представлены как средние ± стандартное отклонение, тест ANOVA. Среднее количество перенесенных оперативных вмешательств на органах малого таза на пациентку составило 1,3±1,0, 1,4±1,2 и 1,3±1,1 в группе 1,2 и 3 соответственно (ANOVA, p=0,907). При анализе данных о количестве и структуре перенесенных оперативных вмешательств (адгезиолизис, 81 односторонняя и двухторонняя тубэктомия, пластика маточных труб, миомэктомия, диагностическая лапароскопия, гистероскопия) статистически значимых различий между группами не было выявлено (р>0,05). Среди экстрагенитальной патологии в исследуемых группах встречались заболевания желудочно-кишечного тракта, такие как хронический гастрит или язва двенадцатиперстной кишки в стадии ремиссии, заболевания мочеполовой системы, а именно хронический пиелонефрит и хронический цистит в стадии ремиссии. Среди заболеваний дыхательной системы отмечался хронический бронхит в стадии ремиссии. Также наблюдалась патология щитовидной железы в виде аутоиммунного тиреоидита (который до начала стимуляции суперовуляции был скорректирован при помощи медикаментозной терапии). По частоте встречаемости вышеописанной экстрагенитальной патологии пациентки в исследуемых группах между собой не отличались. 3.1.7. Гормональный профиль женщин, включенных в исследование В рамках подготовки к лечению в программе ЭКО/ИКСИ для оценки функционального состояния репродуктивной и эндокринной систем всем пациенткам, включенным в исследование, в период ранней фолликуллярной фазы (на 3-5 д.м.ц.) была проведена оценка параметров гормонального профиля (таблица 11). Принимая во внимание ненормальное распределение показателей уровня гормонов ЛГ, ПРЛ, Е2, Т4св, Т, АМГ и П, для анализа данных был применен непараметрический статистический критерий. На основании проведенного теста Краскела-Уоллеса были выявлены статистически значимые различия показателей уровня ЛГ (p=0,001) и прогестерона (р=0,001) в исследуемых группах. На основании полученных данных были проведены попарные сравнения между исследуемыми группами, приняв за достигнутый уровень значимости р<0,017. Тест Манна-Уитни показал статистически значимые различия по уровню ЛГ (р<0,001) и прогестерона (р<0,001) в плазме крови между группами 1 и 3. 82 Таблица 11 Гормональный статус включенных в исследование женщин Показатель Нормативные показатели 3,0-10,0 МЕ/л Группа 1 (ИМТ 18,5-24,99 кг/м2) n=72 6,7±1,6# Группа 2 (ИМТ 25,0-29,99 кг/м2) n=39 6,2±1,6 Группа 3 (ИМТ>30,0 кг/м2) n=49 5,9±1,8# ФСГ, МЕ/л** Р – уровень значимости ЛГ, МЕ/л* 3,0- 8,0 МЕ/л 5,3 (4,0-7,1)# 4,5 (2,6-6,3) 3,9 (2,2-5,6)# Пролактин, мМЕ/л* 120-500 мМЕ/л 235,0 (169,7-345,0) 287,7 (186,6-407,9) 396,6 (210,8-517,2) 0,037/ # - р=0,012 0,001/ # - р<0,001 0,925 Е2, пмоль/л* 150-450 пмоль/л 216,0 (161,0-272,0) 133,8 (110,7-264,6) 184,5 (117,0-271,7) 0,070 Тестостерон, нмоль/л* Кортизол, нмоль/л** 1,0-2,5 нмоль/л 1,2 (0,8-1,7) 1,4 (0,6-2,4) 1,2 (0,8-2,0) 0,590 200-500 нмоль/л 380,1±203,3 370,0±146,4 353,6±183,9 0,818 ДЭА-С,мкмоль/л** 0,9-11,7 мкмоль/л 5,0±2,7 5,3±3,5 5,1±3,6 0,932 СТГ,мМЕ/л** 0,15-13,0мМЕ/л 2,9±4,5 1,3±2,1 2,0±3,7 0,264 ТТГ, мМЕ/л** 1,0-3,0 мМЕ/л 1,81±1,03 1,88±0,83 1,72±0,89 0,779 Т4 св, пмоль/л* 10,0-25,0 пмоль/л 14,3 (13,4-16,2) 14,2 (11,9-16,1) 13,7 (12,8-15,0) 0,320 17-ОП, нмоль/л** 0,3-3,0 нмоль/л 2,0±1,0 1,8±1,1 2,0±3,5 0,618 АМГ, нмоль/л* 1,0- 4,5 нг/мл 3,1 (2,4-3,9) 2,2 (1,2-4,6) 1,4 (1,0-4,0) 0,172 Прогестерон, 30,6 (18,0-47,4)# 18,7 (14,0-52,8) 14,6 (9,2-20,7)# 0,001/ 16-95 нмоль/л нмоль/л* #- р<0,001 * данные представлены как медиана, 25 - 75 процентили, тест Краскела-Уоллеса; **данные представлены как средние ± стандартное отклонение, тест ANOVA. # - попарное сравнение групп при помощи теста Манна-Уитни для непараметрических данных и t-критерия Стьюдента для параметрических данных. 83 Несмотря на отсутствие различий в показателе уровня АМГ между исследуемыми группами, корреляционный анализ Спирмана показал отрицательную зависимость показателя ИМТ и уровня АМГ в плазме крови (ρ=-0,21, p=0,04). Учитывая нормальное распределение показателей гормонов ФСГ, К, ТТГ, ДГА-S, СТГ и 17-ОП, был применен однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA), на основании которого были обнаружены статистически значимые различия по уровню ФСГ в плазме крови между исследуемыми группами (р=0,037). Сравнив попарно исследуемые группы при помощи t-критерия Стьюдента для независимых выборок, получили статистические значимые различия по уровню ФСГ в плазме крови между группами 1 и 3 (р=0,012). В результате проведенного анализа обнаружены статистически значимые более низкие показатели уровня базального ФСГ и ЛГ у женщин с ожирением по сравнению с женщинами с нормальной массой тела. Однако, эти различия минимальны и находятся в пределах референсных значений. 3.2. Особенности лечения в программе ЭКО у женщин с избыточной массой тела 3.2.1. Особенности стимуляции суперовуляции, фолликуло- и оогенеза у пациенток в исследуемых группах В процессе лечения в программе ЭКО всем пациенткам был проведен протокол с препаратами ФСГ и антагонистами ГнРГ. Для выявления возможных конфаундеров применением гонадотропинов нами человеческого для был проведен менопаузального стимуляции суперовуляции анализ и между протоколов с рекомбинантных исследуемыми группами (рисунок 14). В группе исследования №1 для стимуляции суперовуляции в 69,4% случаев использовали препараты рекомбинантного ФСГ и в 30,6% препараты человеческого менопаузального ФСГ (чм ФСГ). Во 2 и 3 группах исследования данные показатели составили 79,5% против 20,5% и 57,1% против 42,9%, 84 соответственно. На основании проведенного сравнительного анализа применения рекомбинантного и менопаузального гонадотропинов, было обнаружено, что исследуемые группы по данному показателю статистически значимо между собой не различались (χ2, р=0,078). 100% 90% 80% 70% 60% чм ФСГ 50% рекомбинантный ФСГ 40% 30% 20% 10% 0% группа 1 группа 2 группа 3 Рисунок 14. Протоколы лечения с применением рекомбинантного и менопаузального гонадотропинов у женщин в исследуемых группах В отношении используемых препаратов в качестве триггера овуляции, а именно препаратов рекомбинантного человеческого хорионического гонадотропина (ХГ) и агонистов гонадотропных рилизинг-гормонов (аГнРГ) в сочетании с ХГ, статистически значимых различий между группами выявлено не было (χ2, р=0,395). Основные характеристики лечения в программе ЭКО представлены в таблице 12. Для анализа данных об особенностях лечения пациенток с различным ИМТ в программе ЭКО/ИКСИ применяли непараметрический тест Краскела-Уоллеса. Между исследуемыми группами были обнаружены статистически значимые различия по количеству аспирированных ооцитов (р=0,043), зрелых ооцитов (р=0,008), дозе затраченного препарата на один ооцит (р=0,009), дозе затраченного на лечение препарата на один зрелый ооцит (р=0,002). Далее для попарного сравнения групп был применен тест Манна- 85 Уитни. Были выявлены статистически значимые различия между группой №1 и группой №3 по количеству аспирированных ооцитов (р=0,014), по количеству зрелых ооцитов (р=0,002), дозе препарата, затраченной на 1 аспирированный ооцит (р=0,004) и 1 зрелый ооцит (р=0,001) (рисунок 15). Таблица 12 Основные характеристики лечения в программе ЭКО Показатель Группа 1 (ИМТ 18,524,99 кг/м2) Группа 2 (ИМТ 25,029,99 кг/м2) Группа 3 (ИМТ>30,0 кг/м2) P– уровень значимо сти Суммарная доза препарата на лечение (МЕ) * 1350,0 (1175,01537,5) 1350,0 (1200,01650,0) 1500,0 (1237,51875,0) 0,058 Продолжительность стимуляции (дни) * 9,0 (8,5-10,0) 9,0 (8,0-11,0) 10,0 (9,0-10,5) 0,357 Общее количество 7,0 (5,0-10,0)# 5,0 (3,0-9,0) 5,0 (2,0-8,5) # аспирированных ооцитов* Количество аспирированных 6,0 (4,0-8,0) # 4,0 (3,0-8,0) 3,0 (2,0-7,0) # зрелых ооцитов* Доза препарата на ооцит* 187,5 (143,1257,1 (159,4330,0 (173,2340,0) # 400,0) 662,5) # Доза препарата на зрелый 217,5 (159,7318,8 (173,1431,3 (262,5ооцит* 412,5) # 562,5) 712,5) # Общее число пациенток 160 72 39 49 * данные представлены как медиана, 25 - 75 процентили, тест Краскела-Уоллеса; # - попарное сравнение групп при помощи теста Манна-Уитни. 0,043/#р=0,014 0,008/#р=0,002 0,009/#р=0,004 0,002\#р=0,001 На основании проведенного анализа, следует принять во внимание тенденцию к увеличению суммарной дозы препарата, затраченной на лечение с увеличением индекса массы тела (р=0,058) (рисунок 16). Также была обнаружена отрицательная корреляция между показателем уровня АМГ в плазме крови и суммарной дозой препарата, затраченного на лечение (ρ=-0,28, p=0,006), а также дозой препарата на получение одного ооцита (ρ=-0,49, р<0,001) и одного зрелого ооцита (ρ=-0,51, р<0,001). Следует отметить, что по продолжительности стимуляции суперовуляции пациентки в исследуемых группах между собой не различались. 86 А) * * Б) ** ** Рисунок 15. Количество аспирированных ооцитов (А) и количество среди них зрелых ооцитов (Б) у женщин исследуемых групп Линия в середине «ящика» представляет собой медиану (50-й процентиль), границами «ящика» служат первый и третий квартили (25-й и 75-й процентили). Концы «усов» соответствуют минимальному и максимальному значениям. Крайние точки (выбросы) – данные, выходящие за границы «усов». * – p=0,014 (тест Манна-Уитни), ** – p=0,002 (тест Манна-Уитни). Рисунок 16. Суммарная доза препаратов, затраченных на лечение у женщин исследуемых групп Линия в середине «ящика» представляет собой медиану (50-й процентиль), границами «ящика» служат первый и третий квартили (25-й и 75-й процентили). Концы «усов» соответствуют минимальному и максимальному значениям. Крайние точки (выбросы) – данные, выходящие за границы «усов» 87 Число аспирированных ооцитов, полученных при стимуляции, достоверно отрицательно коррелировало с концентрацией АМГ в крови пациенток (ρ=-0,41, р<0,001), что вполне объяснимо, так как АМГ является маркером овариального резерва. 3.2.2. Характеристика раннего эмбриогенеза и исходов программ ВРТ у женщин исследуемых групп Для определения влияния избыточной массы тела на исходы лечения в программах ВРТ нами была проведена оценка раннего эмбриогенеза, частоты наступления биохимической и клинической беременности, частоты ранних репродуктивных потерь и живорождения. С целью выявления возможных конфаундеров был проведен анализ распределения использованных методов оплодотворения среди исследуемых групп (таблица 13). Таблица 13 Методы искусственного оплодотворения у женщин в исследуемых группах Метод оплодотворения Группа 1 Группа 2 Группа 3 P– (ИМТ 18,5- (ИМТ 25,0- (ИМТ>30,0 уровень 2 24,99 кг/м ) 2 29,99 кг/м ) 2 кг/м ) значимос ти ЭКО* 47 (65,3%) 16 (41%) 15 (30,6%) 0,001 ИКСИ* Общее число пациенток 160 25 (34,7%) 72 23 (59%) 39 34 (69,4%) 49 *данные представлены как абсолютное число пациенток и доли пациенток в %, χ2-тест. На основании полученных данных были выявлены статистически значимые различия с преобладанием оплодотворения методом ЭКО в группе 1, и метода ИКСИ в группах №2 и №3. На основании проведенного t-критерия для независимых выборок было обнаружено, что в группе с избыточной массой 88 тела (t-критерий Стьюдента, р=0,014) и ожирением (t-критерий Стьюдента, р<0,001) значительно чаще применялся метод ИКСИ по сравнению с группой женщин с нормальной массой тела. Следует принять во внимание, что на основании приказа Министерства здравоохранения Российской Федерации № 107н "О порядке использования вспомогательных репродуктивных технологий, противопоказаниях и ограничениях к их применению" от 23 августа 2012 г. получение менее четырех ооцитов является одним из основных показаний к проведению оплодотворения методом ИКСИ. Основываясь на среднем количестве аспирированных зрелых ооцитов в группе женщин с избыточной массой тела и ожирением, можно объяснить более высокую частоту оплодотворения методом ИКСИ в группах №2 и №3. Далее была проведена оценка параметров раннего эмбриогенеза и исходов лечения в программах ВРТ в зависимости от ИМТ, основные характеристики которой представлены в таблице 14. На следующие сутки после оплодотворения в группе №1 было получено 518 эмбрионов с нормальным оплодотворением, в группе №2 – 244 эмбриона и в группе №3 – 271 эмбрион. При этом следует отметить, что по проценту оплодотворения исследуемые группы между собой не различались. На основании непараметрического теста Краскела-Уоллеса были обнаружены статистически значимые различия по среднему числу эмбрионов в исследуемых группах (р=0,022). После попарного сравнения групп было обнаружено, что среднее число эмбрионов было статистически значимо выше в группе женщин с нормальной массой тела по сравнению с женщинами, страдающими ожирением (тест Манна-Уитни, р=0,006). По количеству эмбрионов, перенесенных в полость матки, пациентки в исследуемых группах между собой не различались (тест Краскела-Уоллеса, р=1,000). 89 Таблица 14 Характеристики раннего эмбриогенеза и исходов лечения у женщин исследуемых групп Показатель Группа 1 (ИМТ 18,524,99 кг/м2) Группа 2 (ИМТ 25,029,99 кг/м2) Группа 3 (ИМТ>30,0 кг/м2) P– уровень значимос ти Среднее число полученных 6 (3-7)# эмбрионов на 1 пациентку (2pn) * Процент оплодотворения 75,1% 4 (2-7) 3 (2-5)# 76,6% 71,2% Количество перенесенных эмбрионов в полость матки* Частота наступления биохимической беременности ** Частота наступления клинической беременности** Частота имплантации ** 2 (2-2) 2 (2-2) 2 (2-2) 1,000 45,8% (33) 30,8% (13) 30,6% (15) 0,186 43,1% (31) 30,8% (12) 28,6% (14) 0,202 30,2%# 20,8% 15,9%# 0,037//#р=0,016 Частота живорождения** 30,6% (22) 23,1% (9) 16,3% (8) 0,075 0,022/#р=0,006 Количество циклов, в которых 43,1% (31) 41% (16) 28,6% (14) 0,249 производилась криоконсервация эмбрионов** Общее число пациенток 160 72 39 49 * данные представлены как медиана, 25 - 75 процентили, тест Краскела-Уоллеса; **данные представлены как абсолютное число пациенток и доли пациенток в %, χ2-тест; # - статистически значимые различия при попарном сравнении групп. Процент имплантации эмбрионов был статистически значимо ниже в группе женщин, страдающих ожирением по сравнению с группой женщин с нормальной массой тела (χ2, р=0,016). Также была обнаружена тенденция к снижению частоты имплантации в группе женщин с избыточной массой тела по сравнению с женщинами с нормальной массой тела (χ2, р=0,059). При этом статистически значимых различий по частоте наступления биохимической (тест Краскела-Уоллеса, р=0,186) и клинической беременности (тест КраскелаУоллеса, р=0,202) в исследуемых группах не было выявлено. По количеству пациенток, у которых была произведена криоконсервация эмбрионов, 90 исследуемые группы между собой достоверно также не различались (χ2, р=0,248) (рисунок 17). (χ2-тест) Рисунок 17. Исход лечения в программе ВРТ у женщин исследуемых групп В первой группе беременность завершилась родами у 22 пациенток, из них было 7 двоен. Всего в группе родилось 29 здоровых детей. Частота прерывания беременности в первой группе составила 29% (9), из них было 7 неразвивающихся беременностей и 2 самопроизвольных выкидыша. Во второй группе беременность завершилась родами у 9 пациенток, из них было 3 двойни, в итоге родилось 12 здоровых детей. Потери беременности составили 25% (5), из них 3 неразвивающиеся беременности и 2 самопроизвольных выкидыша. В третьей группе беременность завершилась родами у 8 пациенток, в итоге в группе родилось 8 здоровых детей. Частота прерывания беременности в третьей группе составила 28,6% (4), из них 3 неразвивающихся беременностей и 1 поздний выкидыш при сроке 20 недель беременности. Частота живорождения в исследуемых группах составила 30,6%, 23,1% и 16,3%, в 1,2 и 3 группах, соответственно (р=0,075). При этом наблюдается тренд снижения частоты живорождения в группе женщин, 91 страдающих ожирением, по сравнению с группой женщин с нормальной массой тела (χ2, р=0,059). Анализируя исходы беременностей, мы обнаружили, что по частоте прерывания беременностей исследуемые группы между собой значимо не различались. Всего в процессе исследования родилось 49 здоровых детей. ОШ живорождения у женщин с нормальной массой тела по сравнению с женщинами, страдающими ожирением составил 3.66 (95% ДИ: 1.41-10.26). ОШ живорождения у женщин с нормальной массой тела по сравнению с женщинами с избыточной массой тела составил 1.61 (95% ДИ: 0.66-4.05). 3.2.3. Характеристика раннего эмбриогенеза у пациенток исследуемых групп Учитывая большое количество исследований с противоречивыми данными относительно влияния избыточной массы тела на эмбриогенез, нами был проведен анализ взаимосвязи ИМТ с качеством эмбрионов, полученных в ходе лечения в программе ЭКО/ИКСИ. Оценка качества эмбрионов проводилась согласно классификации ESHRE от 2009 г. приблизительно через 72 часа после оплодотворения (3 сутки). По результатам проведенного анализа было показано, что эмбрионы 3 суток культивирования по морфологическим критериям между исследуемыми группами статистически значимо не различаются (χ2, р=0,822) (таблица 15). Следует отметить, что аномальное оплодотворение (формирование более 2-х пронуклеусов) или отсутствие оплодотворения наблюдалось в 7,3% (27 эмбрионов), 9,1% (17 эмбрионов) и 8,9% (14 эмбрионов) в группах исследования №1,2 и 3, соответственно. Статистически значимых различий по частоте патологического оплодотворения между группами обнаружено не было. 92 Таблица 15 Характеристики эмбрионов 3 культивирования жизни у женщин исследуемых групп Показатель Эмбрионы хорошего качества Группа 1 (ИМТ 18,5-24,99 кг/м2) Группа 2 (ИМТ 25,0-29,99 кг/м2) Группа 3 (ИМТ>30,0 кг/м2) Общее число эмбрионов Эмбрионы удовлетворительного качества Эмбрионы плохого качества Итого 137 (39,9%) 101 (29,5%) 105 (30,6%) 343 77 (45,3%) 50 (29,4%) 43 (25,3%) 170 60 (41,9%) 39 (27,3%) 44 (30,8%) 143 274 190 192 656 Принимая во внимание данные исследований, указывающих на то, что видимые различия основных показателей изменения метаболических процессов могут быть заметны только через 68 часов после оплодотворения, нами была проведена оценка качества эмбрионов на 5 сутки культивирования (Таблица 16). В группе женщин с нормальной массой тела на 5 сутки оплодотворения эмбрионы хорошего качества составили 55,9%, против 47,5% в группе женщин с избыточной массой тела и 39,2% в группе женщин, страдающих ожирением. Эмбрионы удовлетворительного и плохого качества составили 21,5% и 22,6%, 24,8% и 27,7%, 24,1% и 36,7% в группах №1, 2, и 3, соответственно. На основании проведенного анализа было показано, что эмбрионов хорошего качества, отобранных по морфологическим критериям, было статистически значимо больше в группе женщин с нормальной массой тела по сравнению с группой женщин, страдающих ожирением (χ2, р=0,013). Эмбрионов плохого качества было значимо больше в группе женщин, страдающих ожирением, по сравнению с группой женщин с нормальной массой тела (χ2, р=0,018). 93 Таблица 16 Характеристики эмбрионов 5 суток культивирования у женщин исследуемых групп Показатель Эмбрионы хорошего качества Группа 1 Группа 2 (ИМТ 18,5-24,99 (ИМТ 25,0-29,99 кг/м2) кг/м2) Группа 3 (ИМТ>30,0 кг/м2) Итого 55,9% (104) 47,5% (48) 39,2% (31) 183 Эмбрионы удовлетворительного качества 21,5% (40) 24,8% (25) 24,1% (19) 84 Эмбрионы плохого качества 22,6% (42) 27,7% (28) 36,7% (29) 99 Общее число эмбрионов 186 101 79 366 Для оценки жизнеспособности эмбрионов у женщин с различными показателями ИМТ была проведена оценка частоты бластуляции у пациенток, перенос эмбрионов которым производился на 5 сутки после оплодотворения. Частота бластуляции составила 60,8%, 62% и 55,8% в 1,2 и 3 группах, соответственно. На основании проведенного статистического анализа было показано, что по процентному соотношению частоты формирования бластоцист пациентки в исследуемых группах между собой не различались (тест χ2; группа 1 против группы 2: р=0,809, группа 1 против группы 3: р=0,343, группа 2 против группы 3: р=0,305). 94 100% 90% * * 80% Эмбрионы плохого качества 70% 60% 50% 40% Эмбрионы удовлетворительного качества * * 30% Эмбрионы хорошего качества 20% 10% 0% Группа 1 Группа 2 Группа 3 * - р<0,02 Рисунок 18. Морфологическая оценка эмбрионов 5 суток культивирования у женщин исследуемых групп 3.3. Ассоциация адипокинов и провоспалительных цитокинов с особенностями фолликуло, оо- и раннего эмбриогенеза Принимая во внимание данные исследований о регуляторном влиянии адипокинов на все уровни репродуктивной системы, мы провели анализ их концентрации в плазме крови у включенных в исследование женщин с результатами лечения в программе ЭКО/ИКСИ (таблица 17). Статистический анализ данных выявил значимые различия по показателям лептина, адипонектина, ИЛ-6, С-реактивного белка и соотношения лептин/адипонектин в плазме крови пациенток с различным ИМТ (тест Краскела-Уоллеса, р<0,001). При этом отмечалось увеличение концентрации лептина, ИЛ-6 и С-реактивного белка и снижение концентрации адипонектина с увеличением массы тела. 95 Таблица 17 Показатели адипокинов и провоспалительных цитокинов у женщин с различным ИМТ Показатель Группа 1 (ИМТ 18,5-24,99 кг/м2) n=72 Лептин, пг/мл * Группа 2 (ИМТ 25,0-29,99 кг/м2) n=39 Группа 3 Р– (ИМТ>30,0 уровень кг/м2) значимо n=49 сти 26,8 (20,7-32,7) 0,001 7,5 (4,7-12,9) 17,3 (11,7-25,5) Адипонектин,мкг/мл * 12,8 (8,7-15,7) 8,3 (6,3-14,0) 7,8 (4,7-11,0) 0,001 Лептин/Адипонектин* 0,6 (0,4-1,1) 1,9 (1,1-3,0) 3,6 (2,1-5,9) 0,001 ИЛ-6, пг/мл * 0,6 (0,4-0,9) 0,7 (0,5-1,1) 1,0 (0,6-1,9) 0,001 4,3 (2,4-9,2) 10,7 (5,4-18,0) С-реактивный белок 22,9 (16,6-38,1) 0,001 мкг/мл * * данные представлены как медиана, 25 - 75 процентили, тест Краскела-Уоллеса. Принимая во внимание не соответствующий нормальному характер распределения данных, нами был проведен корреляционный анализ по методу Спирмана для выявления взаимосвязи между показателем ИМТ и уровнем адипокинов в плазме крови. В ходе данного анализа нами была выявлена положительная корреляционная зависимость между значением ИМТ и уровнем лептина (ρ=0,79, р<0,001), ИЛ-6 (ρ=0,40, р<0,001), С-реактивного белка (ρ=0,61, р<0,001), показателем лептин/адипонектин (ρ= 0,76, р<0,001) и отрицательная корреляционная зависимость между значением ИМТ и уровнем адипонектина (ρ=-0,43, р<0,001). Диаграммы рассеяния показателя ИМТ и адипокинов представлены на рисунке 19. Схожая корреляционая зависимость была обнаружена между показателем ОТ и уровнями адипокинов в плазме крови: уровнем лептина (ρ=0,75, р<0,001), ИЛ-6 (ρ=0,42, р<0,001), С-реактивного белка (ρ=0,63, р<0,001), адипонектина (ρ=-0,46, р<0,001) и показателем лептин/адипонектин (ρ= 0,75, р<0,001). 96 a) а) б) Корреляция г) ИМТ и уровня в) адипонектина (Спирмана, ρ= д) Рисунок 19. Корреляции уровней адипокинов в плазме крови с ИМТ а) корреляция лептина с ИМТ; б) корреляция ИЛ-6 с ИМТ; в) корреляция С-реактивного белка с ИМТ; г) корреляция Адипонектина с ИМТ; д) корреляция соотношения Лептин/Адипонектин с ИМТ. -0,43, p=0,0 97 Также нами была обнаружена статистически значимая корреляция между суммарной дозой затраченных на лечение гонадотропинов и уровнем лептина (ρ= 0,19, p=0,021), ИЛ-6 (ρ= 0,24, p=0,005), С-реактивного белка (ρ= 0,22, p=0,001) и показателем лептин/адипонектин в плазме крови (ρ= 0,25, p=0,002). Суммарная доза препарата, затраченного на получение 1 ооцита положительно коррелировала с уровнем лептина (ρ=0,30, р<0,001) и показателем лептин/адипонектин (ρ=0,24, p=0,006). Интересно отметить, что количество аспирированных ооцитов отрицательно коррелировало с уровнем лептина в плазме крови (ρ=-0,22, p=0,006) и показателем лептин/адипонектин (ρ=-0,18, p=0,024). У пациенток с наступившей клинической беременностью показатель уровня лептина в плазме крови после стимуляции суперовуляции был значимо ниже по сравнению с женщинами, у которых беременность не наступила (10,7 пг/мл против 18,3 пг/мл, тест Манна-Уитни, р=0,003) (рисунок 20). пг/мл * * Рисунок 20. Показатель наступления клинической беременности в зависимости от уровня лептина в плазме крови Нами был проведен ROC-анализ для оценки чувствительности метода оценки уровня лептина в плазме крови для прогнозирования вероятности наступления беременности после лечения в программе ЭКО (рисунок 21). 98 Согласно проведенному ROC-анализу площадь под кривой составила 0,65; 95 % доверительный интервал от 0,55 до 0,74 (10,7 пг/мл против 18,3 пг/мл, р=0,003). Рисунок 21. ROC-анализ ассоциации уровня лептина в плазме крови и наступления клинической беременности Cледует отметить, что в группе женщин с нормальным показателем ИМТ, при уровне лептина в плазме крови выше 20 нг/мл беременность не наступала. В группах женщин с избыточной массой тела и ожирением уровень лептина в плазме крови у женщин с различным исходом лечения в программе ЭКО не различался (рисунок 22). Частота наступления клинической беременности не зависела от показателей в плазме крови уровня ИЛ-6 (тест Манна-Уитни, р=0,213), адипонектина (тест Манна-Уитни, р=0,172) и С-реактивного белка (тест МаннаУитни, р=0,175). Однако, при анализе данных было выявлено, что клиническая беременность наступала у женщин с более низким показателем соотношения уровня лептина к адипонектину (тест Манна-Уитни, р=0,007). 99 а) лептин, пг/мл б) лептин, пг/мл в) лептин, пг/мл Рисунок 22. Показатель уровня лептина у женщин с отрицательным и положительным исходом лечения: а) нормальная масса тела; б) избыточная масса тела; в) ожирение 100 В рамках современной концепции о том, что посредством индукции окислительного стресса и развития хронического воспаления ожирение оказывает негативное воздействие на фолликуло-, оо- и ранний эмбриогенез (см. обзор литературы), мы провели анализ связи данных морфологической оценки эмбрионов 3 и 5 суток культивирования и показателей уровня провоспалительных адипокинов в плазме крови исследуемых женщин. На основании проведенного статистического анализа нами было установлено, что морфологическая оценка эмбрионов 3 суток культивирования не зависела от показателей содержания лептина (тест Краскела-Уоллеса, р=0,710), адипонектина (тест Краскела-Уоллеса, р=0,837), ИЛ-6 (тест КраскелаУоллеса, р=0,472), С-реактивного белка (тест Краскела-Уоллеса, р=0,550) и показателя соотношения лептин/адепонектин (тест Краскела-Уоллеса, р=0,977) в плазме крови. При сравнении морфологической оценки качества эмбрионов 5 суток культивирования с показателями уровня провоспалительных адипокинов нами было обнаружено, что эмбрионы плохого качества встречались у женщин с более высоким уровнем лептина в плазме крови (тест Краскела-Уоллеса, р=0,002), С-реактивного белка (тест Краскела-Уоллеса, р=0,006). Кроме того отмечалась тенденция к более высокому показателю уровня ИЛ-6 (тест Краскела-Уоллеса, р=0,055). При попарном сравнении показателей уровня лептина между эмбрионами трех классов качества, показано, что у женщин со значимо более низкими показателями лептина в плазме крови наблюдалось большее количество эмбрионов хорошего (тест Манна-Уитни, р=0,001) и удовлетворительного качества (тест Манна-Уитни, р=0,007). У женщин, где преимущественно были получены эмбрионы плохого качества, отмечались статистически значимо более высокие показатели уровня С-реактивного белка (тест Манна-Уитни, р=0,002) и более высокие значения соотношения уровня лептина к адипонектину (тест Манна-Уитни, р=0,015) в плазме крови по сравнению с женщинами, у которых было получено больше эмбрионов хорошего качества. Показатель уровня адипонектина в плазме крови женщин 101 не отражался на морфологической оценке эмбрионов 5 суток жизни (тест Краскела-Уоллеса, р=0,550). Данные о показателях различных адипокинов и провоспалительных цитокинов в плазме крови включенных в исследование пациенток и их ассоциации с качеством эмбрионов 5 суток культивирования представлены на рисунке 23. а) в) 102 б) г) Рисунок 23. Морфологическая оценка эмбрионов 5 суток культивирования и адипокинов в плазме крови включенных в исследование пациенток (a) c показателем уровня лептина, б) с показателем уровня Среактивного белка, в) с показателем отношения лептин/адипонектин, г) с показателем ИЛ-6) 103 3.4. Оценка функционального состояния митохондрий в мононуклеарах периферической крови и антиоксидантной активности у пациенток исследуемых групп На основании проведенного анализа статистически значимых различий по показателям % поляризованных клеток, а также значению потенциала митохондрий в мононуклерах периферической крови до и после стимуляции суперовуляции у пациенток исследуемых групп обнаружено не было. Таблица 18 Показатели функционального состояния митохондрий в мононуклеарах периферической крови у пациенток исследуемых групп Показатель Группа 1 (ИМТ 18,5-24,99 кг/м2) Группа 2 (ИМТ 25,029,99 кг/м2) Группа 3 (ИМТ>30,0 кг/м2) Р– уровень значимос ти % поляризованных клеток до начала стимуляции* 60,51±9,86 61,52±13,30 64,50±10,18 0,479 % поляризованных клеток после стимуляции* 62,38±9,15 64,00±9,39 64,63±7,01 0,693 ΔΨ до начала стимуляции* 9,99±3,17 8,53±3,06 9,42±3,52 0,421 ΔΨ после стимуляции* 9,60±3,17 10,61±4,76 8,84±3,29 Общее число пациенток 56 21 16 19 *данные представлены как средние ± стандартное отклонение, тест ANOVA. 0,383 Таблица 19 Показатель уровня антиоксиданта глутатиона у пациенток исследуемых групп Показатель Группа 1 (ИМТ 18,524,99 кг/м2) Группа 2 (ИМТ 25,029,99 кг/м2) Группа 3 (ИМТ>30,0 кг/м2) tGSH мкмоль/л* 688,0 (514,6941,8) 890,9 (593,31128,9) 745,7(579,01153,9) 0,073 5,53±2,54 6,41±2,07 6,18±2,22 0,140 tGSH мкмоль/г Hb** Р– уровень значимости Общее число пациенток 149 66 36 47 * данные представлены как медиана, 25 - 75 процентили, тест Краскела-Уоллеса; **данные представлены как средние ± стандартное отклонение, тест ANOVA. 104 Нами была отмечена отрицательная корреляционная связь между показателем % поляризованных клеток до стимуляции в МПК с уровнем общего глутатиона, нормированного на гемоглобин (ρ=-0,27, p=0,048), и положительная корреляционная связь с уровнем С-реактивного белка в плазме крови (ρ=0,31, p=0,023). Потенциал статистически митохондрий значимо в МПК отрицательно до стимуляции коррелировал с суперовуляции общим уровнем глутатиона (ρ=-0,35, p=0,010) и общим глутатионом, нормированным на гемоглобин (ρ=-0,28, p=0,040). Статистический анализ оценки влияния показателей активности антиоксидантной системы в крови исследуемых женщин на качество эмбрионов 5 суток культивирования показал, что качество эмбрионов 5 суток жизни не зависело от показателя общего глутатиона - tGSH (тест КраскелаУоллеса, р=0,167) и общего глутатиона, нормированного на гемоглобин - GSH Hb (тест Краскела-Уоллеса, р=0,115). Далее мы провели анализ зависимости показателя живорождения от показателей функциональной активности митоходрий в МПК и активности антиоксидантной системы. На основании оценки уровня общего глутатиона и показателя трансмембранного потенциала митохондрий МПК после стимуляции суперовуляции были обнаружены достоверные различия между группами женщин, с позитивным и негативным исходами (беременность не наступила или прервалась) в программе ЭКО. Так, в группе женщин, где в итоге родились здоровые дети, трансмембранный потенциал митохондрий МПК после стимуляции суперовуляции был в среднем на 2,38 у.е. ниже (t=2,206, р=0,032, df=53), а показатель общего глутатиона в среднем на 154,95 мкмоль/л выше (t=2,247, р=0,026, df=146) по сравнению с женщинами с негативным результатом лечения (рисунок 24, 25). 105 * * Рисунок 24. Анализ зависимости показателя живорождения от функциональной активности митоходрий в МПК, измеренной после стимуляции суперовуляции Линия в середине «ящика» представляет собой медиану (50-й процентиль), границами «ящика» служат первый и третий квартили (25-й и 75-й процентили). Концы «усов» соответствуют минимальному и максимальному значениям. Крайние точки (выбросы) – данные, выходящие за границы «усов». * – p=0,032 (t-тест для двух независимых выборок) * * Рисунок 25. Анализ зависимости показателя живорождения от активности глутатион-зависимого звена антиоксидантной системы Линия в середине «ящика» представляет собой медиану (50-й процентиль), границами «ящика» служат первый и третий квартили (25-й и 75-й процентили). Концы «усов» соответствуют минимальному и максимальному значениям. Крайние точки (выбросы) – данные, выходящие за границы «усов». * – p=0,026 (t-тест для двух независимых выборок) 106 3.5. Оценка трансмембранного потенциала митохондрий в клетках кумулюса у женщин с различным ИМТ На основании проведенного качественного анализа отношения интенсивности флюоресценции высоко- и низкоэнергизованных митохондрий, клетки кумулюса были разделены на 3 класса: низкий, высокий и гиперпотенциал (рисунок 26). Как было описано выше (см. обзор литературы), высокий трансмембранный потенциал ассоциирован с повышенной продукцией АФК. С другой стороны известно, что жирные кислоты помимо участия в в-окислении разобщают дыхание митохондрии, снижая их трансмембранный потенциал и уровень синтеза АТФ. Поскольку движущей силой транспорта жирных кислот в митохондриях является их последующая деградация через в-окисление, можно предположить, что при ингибировании ферментативного каскада, ответственного за окисление жирных кислот, как транспорт, так и их разобщающее действие будут частично подавлены. При этом соответственно возрастает уровень АФК, продуцируемых митохондриальной дыхательной цепью. Нами был проведен анализ сравнения качества ооцитов и эмбрионов 5 суток культивирования с показателем трансмембранного потенциала митохондрий соответствующих их ооцитам кумулюсных клеток. Значимых различий между степенью зрелости ооцита и качеством эмбрионов, согласно морфологическим критериям оценки и показателем ΔΨ митохондрий клеток кумулюса, обнаружено не было (тест Краскела-Уоллеса, р=542). При это нами была обнаружена корреляционная связь (рисунок 27) достоверная между отрицательная показателем ИМТ и трансмембранным потенциалом митохондрий клеток кумулюса (Пирсон, r= 0,284, Р=0,007). 107 а) б) в) Рисунок 26. Оценка активности митохондрий в кумулюсных клетках: а) низкий потенциал; б) высокий потенциал; в) гиперпотенциал 108 Рисунок 27. Корреляция ИМТ и трансмембранного потенциала митохондрий клеток кумулюса 3.6. Прогнозирование наступления клинической беременности на основании оценки ИМТ, уровня адипокинов и функциональной активности митохондрий МПК Для расчета вероятности наступления клинической беременности у женщин с различной массой тела на основании оценки уровня адипокинов в плазме крови и показателей функциональной активности митохондриального аппарата МПК был проведен логистический регрессионный анализ. При построении прогностической модели наступления беременности было обнаружено, что происходит разделение женщин на 2 подгруппы: с ИМТ < 28,5 и ИМТ≥ 28,5. Для подгруппы женщин с ИМТ < 28,5 модель, основанная на уровне лептина и показателе потенциала МПК после стимуляции суперовуляции, обладала предсказательной силой. Для подгруппы с ИМТ ≥ 28,5 данная модель не работала. На основании логистическая полученных регрессионная данных модель для была построена подгруппы бинарная женщин с 109 ИМТ < 28,5 кг/м2, в которой результатом была переменная «клиническая беременность», предикторами – уровень лептина в плазме крови и показатель ΔΨ МПК после стимуляции суперовуляции. Построенная модель является статистически значимой (χ2(2)=8,51, p=0,014). Согласно результатам логистической регрессии строится уравнение для предсказания вероятности наступления клинической беременности: logit=3,39-(0,337* ΔΨ МПК после стимуляции)-(0,08*[Лептин]) p=exp(logit)/(1+exp(logit) Cредняя точность классификации составляет 76,7%, ОШ равно 9,33. Таким образом, можно оценить вероятность наступления клинической беременности в программе ЭКО на основании оценки представленных независимых переменных (ΔΨ МПК и уровень лептина после стимуляции суперовуляции). Таблица 20. Классификация предсказания вероятности наступления клинической беременности у женщин с 18,5≤ИМТ< 28,5 кг/м2 Наблюдавшиеся Клиническая беременность Предсказанные Клиническая беременность 0 1 Процент корректных 0 16 3 84,2 1 4 7 63,6 Поиск предикторов наступления беременности для женщин с ИМТ≥28,5 кг/м2 показал, что у большинства женщин с наступившей беременностью процент МПК с высокополяризованными митохондриями снижался в результате стимуляции суперовуляции, в то время как у большинства женщин с ненаступившей беременностью данный показатель увеличивался (рисунок 28). 110 а) б) у.е. у.е. Рисунок 28. Разница % МПК с высокополяризованными митохондриями до и после стимуляции суперовуляции у женщин с ИМТ≥28,5 кг/м2 с различным исходом лечения в программе ЭКО (а) беременность не наступила б) беременность наступила) Для женщин с ИМТ≥28,5 кг/м2 была построена логистическая регрессионная модель наступления беременности, основанная на изменении доли МПК с высокополяризованными митохондриями в результате стимуляции суперовуляции, и ОТ. Для женщин с ИМТ<28,5 кг/м2 данная модель не работала. Построенная модель является статистически значимой χ2(2)=7,35, p=0,025. Согласно результатам логистической регрессии строится уравнение для предсказания вероятности наступления клинической logit=-5,11+(0,048*ОТ)-(0,124*Δ% поляризованных МПК) p=exp(logit)/(1+exp(logit) беременности: 111 Таблица 21 Классификация предсказания вероятности наступления клинической беременности у женщин с ИМТ≥28,5 кг/м2 Наблюдавшиеся Клиническая беременность Предсказанные Клиническая беременность 0 1 Процент корректных 0 12 2 85,7 1 2 7 77,8 Cредняя точность классификации составляет 82,6%. ОШ равно 21, что позволяет оценить вероятность наступления клинической беременности в программе ЭКО на основании оценки представленных независимых переменных (ОТ и Δ% МПК с высокополяризованными митохондриями). Для построения модели оценки вероятности живорождения в программе ЭКО, при помощи функции feature selection были отобраны основные предикторы, влияющие на исследуемый показатель. На основании полученных данных была построена бинарная логистическая регрессионная модель, в которой исходом была переменная «живорождение», предикторами – показатель трансмембранного потенциала митохондрий, измеренного по окончании стимуляции суперовуляции (ΔΨ МПК после стимуляции), концентрация tGSH, а также уровень лептина в плазме крови и число аспирированных ооцитов. Построенная модель является статистически значимой (χ2 (4)=13,89, p=0,016). Согласно результатам логистической регрессии строится уравнение для предсказания вероятности живорождения: logit=-3,87+(0,13*[Лептин])+(0,193*кол-во аспирированных (0,003* tGSH)-(0,21* ΔΨ МПК после стимуляции) p=exp(logit)/(1+exp(logit) ооцитов)+ 112 Таблица 22 Классификация предсказания вероятности живорождения у женщин в исследуемых группах Таблица классификацииa Predicted родоразрешение Наблюденные родоразрешение Шаг 1 нет нет роды роды 35 8 4 5 Общий процент a. Разделяющее значение = ,500 Процент корректных 89,7 38,5 76,9 Cредняя точность классификации составляет 77%, ОШ равно 5,33. Таким образом, возможна оценка вероятности живорождения на основании оценки представленных независимых переменных (ΔΨ МПК стимуляции, [tGSH], [лептин], количество аспирированных ооцитов). после 113 ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ Избыточный вес или ожирение являются проблемой общественного здравоохранения и, в связи с неуклонным их ростом за последние 20 лет, привлекают все большее внимание врачей и ученых. В связи с доказанными неблагоприятными последствиями как для здоровья матери и плода во время беременности, так и в последующей период жизни ребенка, данная патология имеет первостепенное значение для женщин детородного возраста. Так, в настоящее время в Соединенных штатах Америки около 60% женщин детородного возраста имеют избыточный вес, либо страдают ожирением [133], а в Великобритании каждая пятая беременная женщина страдает ожирением [50]. К сожалению, статистические данные о распространении ожирения среди женщин репродуктивного возраста на территории Российской Федерации отсутствуют. Принимая во внимание увеличение числа женщин с избыточной массой, а также негативное влияние ожирения на репродуктивную систему, растет доля пациенток с данной патологией среди обращающихся для лечения бесплодия при помощи методов ВРТ. При этом на основании огромного числа клинических исследований и мета-анализов известно, что повышение ИМТ оказывает неблагоприятное влияние на результаты лечения методом ЭКО, значительно снижая частоту наступления беременности и живорождения, а также увеличивает частоту выкидышей [36, 48, 66]. Перед тем, как приступить к лечению женщины в программе ЭКО, врачу необходимо взвесить все риски и преимущества начала лечения женщины сразу же при ее обращении или отодвинуть его на время с целью снижения веса. В некоторых странах ограничением для начала лечения в программе ЭКО является показатель ИМТ более 35,0 кг/м2. При принятии решений по отсрочке лечения бесплодия с целью снижения веса нужно учитывать 114 возраст женщины. Ранее было показано, что влияние ИМТ на результативность лечения в программе ЭКО наиболее выражено у женщин до 35 лет [27], далее более негативный эффект на исход терапии оказывает возраст, таким образом, у данной когорты женщин принятие решения об отсрочке лечения на более поздние сроки с целью снижения веса должно быть аргументированным [27, 48]. У женщин с одним и тем же показателем ИМТ могут быть различные метаболические изменения, при этом нужно понимать, в каком случае целесообразно начинать лечение в программе ЭКО, а где необходимо скорректировать возникшие метаболические нарушения путем снижения веса и терапии. В качестве основных причин неудач лечения в программе ЭКО рассматривают низкое качество ооцитов и эмбрионов, обусловленное различными генетическими и метаболическими нарушениями, а также нарушение рецептивности эндометрия в связи с молекулярно-клеточными изменениями его структуры [75, 114, 116, 118, 141]. Стремительное развитие и активное внедрение современных биомедицинских технологий в широкую клиническую практику открывают новые возможности для диагностики и лечения супружеских пар с нарушениями репродуктивной функции. Кроме того, активное использование клиническими специалистами методов молекулярной и клеточной биологии приводит к расширению спектра подходов, направленных на изучение фундаментальных механизмов патогенеза различных заболеваний. Интегрирование экспериментальных и клинических данных в рамках данного подхода позволяет существенно сократить время внедрения разработанных и патогенетически обоснованных подходов к лечению бесплодия. Возможность более точно прогнозировать исход лечения в программе ЭКО представляет собой значительный интерес как с практической, так и научной точек зрения. Принимая во внимание неуклонный рост числа женщин репродуктивного возраста, страдающих избыточной массой тела, все 115 большую актуальность приобретает изучение молекулярных механизмов снижения фертильности у данной когорты женщин. Появившиеся методы оценки состояния хронического воспаления и окислительного стресса, а также функционального состояния митохондрий, открывают возможность более глубокого изучения патогенеза снижения фертильности и влияния данных состояний на фолликуло-, оо- и ранний эмбриогенез. В настоящей работе было проведено трехэтапное исследование, основной целью которого явилось повышение эффективности лечения в программе ЭКО у женщин с избыточной массой тела и ожирением на основании комплексной оценки ряда факторов: провоспалительных цитокинов в плазме крови, потенциала митохондриального аппарата МПК до начала и после окончания стимуляции суперовуляции, а также оценка трансмембранного потенциала митохондрий в кумулюсных клетках. На первом этапе работы был проведен анализ вероятности наступления клинической беременности в программе ЭКО на основании оценки ИМТ и концентраций адипокинов в плазме крови. С целью комплексной оценки каждого из этапов лечения в программе ЭКО, были сформированы три группы пациенток в зависимости от показателя ИМТ на основании рекомендаций ВОЗ. Оценка клинико-анамнестических данных женщин в исследуемых группах не выявила статистически значимых различий. Группы были сопоставимы по различным параметрам и подобраны таким образом, чтобы минимизировать влияние вмешивающихся факторов на исходы программ ВРТ и интерпретацию полученных показателей со стороны женщин. В ходе оценки гормонального статуса исследуемых пациенток были обнаружены различия по уровню ФСГ, ЛГ и прогестерона в крови между группой с нормальной массой тела и ожирением. Полученные данные согласуются с исследованием Caillon H. и De Pergola G., где у женщин с избыточной массой тела так же были обнаружены более низкие концентрации уровня ФСГ и ЛГ в плазме крови по сравнению с женщинами, 116 имеющими нормальный вес, при этом показатели данных гормонов находились в пределах референсных значений. Вышеприведенные изменения авторы связывают с нарушением пульсирующего выброса гонадотропинов, что в итоге ведет к отклонениям процесса фолликулогенеза от нормы [38, 68]. Более низкий уровень прогестерона у женщин с ожирением по сравнению с женщинами, имеющими нормальную массу тела, возможно, связан с недостаточной функцией желтого тела и объясняет, по данным многих авторов, высокий процент невынашивания беременности у данной когорты женщин, так как этот гормон играет важную роль в подготовке эндометрия к имплантации эмбриона, а также снижает активность сокращения миоцитов матки [38, 96]. В последние годы многие авторы обсуждают состояние метаболической эндотоксинемии у людей, страдающих ожирением [96,97]. Эндотоксины – это стабильные липополисахариды, которые являются основным компонентом наружной мембраны грам-отрицательных бактерий, составляющих примерно 70% всех бактерий, колонизирующих кишечник. Развитие состояния воспаления у людей с избыточной массой тела приводит к изменениям стенки кишечника, вследствие чего бактериальный эндотоксин из просвета кишечника поступает в системный кровоток, инициируя каскад провоспалительных реакций, играя важную роль в развитии состояния хронического воспаления и окислительного стресса. Считается, что состояние метаболической эндотоксинемии является ключевым медиатором метаболических нарушений, наблюдаемых при ожирении. В исследовании Tremellen K. и соавторов (2014) было показано, что эндотоксины нарушают функцию желтого тела, снижая продукцию прогестерона [96]. В настоящем исследовании была обнаружена отрицательная корреляционная связь уровня прогестерона в плазме крови с весом исследуемых женщин (ρ=-0,342, p=0,002), с показателями ИМТ(ρ=-0,348, p=0,002), ОТ (ρ=-0,313, p=0,005), 117 ОТ/ОБ (ρ=-0,230, p=0,040), а также уровнем С-реактивного белка (ρ=-0,314, p=0,006), что согласуется с выше представленными исследованиями. При анализе менструальной функции в группах с избыточной массой тела и ожирением отмечалась тенденция к увеличению числа женщин с нерегулярным менструальным циклом, что согласуется с данными многих исследований, отмечающих нарушение менструального цикла по типу олигоменореи и ановуляции у женщин с избыточной массой тела при отсутствии СПКЯ [111, 120]. В группе женщин с избыточной массой тела и ожирением ОТ, являющийся самостоятельным признаком наличия абдоминального ожирения, был достоверно больше (тест Краскела-Уоллеса, р<0,001) по сравнению с женщинами с нормальной массой тела. Висцеральное ожирение является наиболее неблагоприятным типом ожирения. При этом нарушается адипогенез, что ведет к гипертрофии адипоцитов и развитию окислительного стресса. На этом фоне адипоциты начинают синтезировать различные провоспалительные адипокины и другие факторы, приводящие к развитию эндотелиальной дисфункции и нарушению метаболических процессов. Рост абдоминального ожирения и связанные с ним изменения активности липопротеинлипазы в жировой ткани и триглицеридлипазы в печени, способствуют избыточному поступлению свободных жирных кислот в кровоток через воротную вену и усилению нарушения липидного обмена. Образуется положительная обратная связь, способствующая дальнейшему развитию патологического процесса [73]. Таким образом, при оценке параметров стимуляции суперовуляции и эффективности лечения в программе ЭКО следует принимать во внимание выраженность метаболических нарушений в группе женщин с избыточной массой тела и ожирением. В настоящее время спорным остается вопрос о том, влияет ли состояние ожирения на показатели овариального резерва. В некоторых исследованиях было показано снижение уровня циркулирующего в плазме 118 крови АМГ – маркера функционального состояния яичников – у женщин с ожирением по сравнению с женщинами с нормальной массой тела [21, 77]. При анализе исследуемых в настоящей работе групп различий в показателе уровня АМГ в плазме крови обнаружено не было (р=0,172), но при этом была обнаружена слабая корреляционная связь между показателем ИМТ и уровнем АМГ в плазме крови (ρ=-0,21, p=0,04). Это может указывать на то, что метаболические изменения и хроническое воспаление при ожирении негативно влияют на состояние овариального резерва. В ходе анализа особенностей стимуляции суперовуляции было отмечено, что у пациенток с ожирением доза препарата Гн, затраченного на один аспирированный ооцит и один идентифицированный зрелый ооцит, были статистически значимо выше по сравнению с женщинами с нормальной массой тела. В последнее время исследователи стали выделять такие показатели, как доза затраченных на стимуляцию гонадотропинов в перерасчете на один аспирированный ооцит и на один зрелый ооцит. Такой подход связан с тем, что под действием супрафизиологических концентраций Гн может нарушаться созревание ооцита и завершение мейоза, приводящее к анеуплоидиям ооцитов и эмбрионов [46, 99]. В исследовании Baart E.B. и соавторов было показано, что в группе пациенток, где стимуляция суперовуляции проводилась высокими дозами препаратов Гн, наблюдался больший процент эмбрионов с анеуплоидиями, по сравнению с женщинами, которым лечение проводилось средними и низкими дозами [98]. Вероятно, отмеченное в нашем исследовании использование большей дозы препаратов Гн на получение одного ооцита может указывать не только на сниженную чувствительность яичниковой ткани к стимуляции суперовуляции у женщин с ожирением, но и одной из причин получения большего числа ооцитов и эмбрионов плохого качества. По результатам проведенного анализа, наблюдалась тенденция к увеличению суммарной дозы препарата, затраченного на лечение, при увеличении ИМТ, что соответствует данным большинства исследований в 119 этой области [36, 38, 48, 66, 118]. При этом в нашем исследовании не наблюдалось увеличения продолжительности стимуляции суперовуляции в зависимости от показателя ИМТ, в то время как в исследовании Rittenberg V. (2011) было отмечено, что продолжительность стимуляции суперовуляции у женщин с ИМТ>25 кг/м2 была значительно больше по сравнению с женщинами с нормальной массой тела [66]. В ходе проведения настоящего исследования было выявлено, что в группе женщин, страдающих ожирением, было аспирировано значимо меньшее количество ооцитов (р=0,014), в том числе и зрелых (р=0,002), по сравнению с женщинами с нормальной массой тела. При этом с группой женщин с избыточной массой тела различий по данному показателю обнаружено не было. Полученные данные могут косвенно свидетельствовать о нарушении процесса фолликулогенеза и созревания ооцитов у женщин с ожирением и согласуются с результатами исследования Zander-Fox D.L. и соавт. (2013) [36]. Сравнительный анализ исходов программы ЭКО и ПЭ показал, что частота имплантации эмбрионов была значимо ниже в группе женщин с ожирением (χ2, р=0,016), а в группе женщин с избыточной массой наблюдалась тенденция к снижению данного показателя (χ2, р=0,059) по сравнению с женщинами с нормальной массой тела. При этом значимых различий по частоте наступления клинической беременности между группами выявлено не было, что, вероятно, связано с небольшой выборкой пациенток. В большинстве опубликованных работ, а также в проведенном нами ретроспективном исследовании 432 женщин с различным ИМТ, пролеченных в программе ЭКО в 2013 г., было обнаружено, что частота наступления клинической беременности у женщин с ожирением статистически значимо ниже по сравнению с женщинами, имеющими нормальную массу тела [3, 48, 66, 118]. Частота живорождения была наибольшей у женщин с нормальным весом (группа 1) и составила 30,6%, в то время как у женщин с избыточной 120 массой тела (группа 2) данный показатель составил 23,1%, а у женщин с ожирением (группа 3) 16,3%, при этом наблюдалась тенденция к снижению данного показателя между группами 1 и 3 (χ2, р=0,059). ОШ живорождения составило 3,66 у женщин с нормальной массой тела по сравнению со страдающими ожирением, и 1,61 по сравнению с женщинами с избыточной массой тела. Выявленные в настоящем исследовании тенденции в отношении увеличения суммарной дозы препаратов, затраченных на стимуляцию суперовуляции, а также достоверное снижение числа полученных ооцитов и эмбрионов, частоты имплантации и живорождения у женщин с ожирением по сравнению с женщинами с нормальной массой тела согласуются с результатами большинства работ, изучающих данную проблему [36, 48, 66, 118]. Считается, что различного рода метаболические изменения у женщин с ожирением негативно отражаются на качестве ооцитов и эмбрионов и, таким образом, снижают результативность лечения в программе ВРТ [75, 118, 141]. В связи с этим, в настоящей работе были изучены особенности раннего эмбриогенеза на основании оценки качества эмбрионов согласно морфологическим критериям на третьи и пятые сутки культивирования после оплодотворения у женщин с различным ИМТ. В ходе анализа было обнаружено, что на третьи сутки после оплодотворения эмбрионы по качеству между исследуемыми группами не различались, в то время как на пятые сутки в группе женщин, страдающих ожирением, наблюдалось значимое снижение количества эмбрионов хорошего качества по сравнению с женщинами с нормальной массой тела. Полученные данные могут свидетельствовать о дисфункции митохондриального аппарата при ожирении, которая начинает проявляться при активации метаболических процессов в эмбрионах на стадии бластоцисты в связи с возрастанием потребности в синтезе энергии для активного роста и имплантации. До стадии морулы потребление глюкозы 121 эмбрионом и его метаболизм находятся на низком уровне. Начиная с момента формирования бластоцисты, резко возрастает потребление кислорода и углеродосодержащих соединений, увеличивается интенсивность гликолиза [76]. Таким образом, эмбрион переходит из состояния метаболического покоя (до стадии бластоцисты) к активному метаболизму на момент имплантации. Высокий уровень метаболизма окислительного характера напрямую зависит от функциональной активности митохондрий, в связи с чем состояние митохондриального аппарата играет определяющую роль в успешном течении этапов развития уже на стадии раннего эмбриогенеза. В случае метаболических нарушений, характерных для избыточного веса и ожирения, наблюдаются как изменения параметров митохондриального дыхания, приводящие к снижению эффективности окислительного метаболизма, так и изменения морфологических характеристик эмбрионов пятых суток культивирования, коррелирующие с их способностью к последующей имплантации и развитию. С другой стороны, отсутствие наблюдаемой корреляции для эмбрионов более раннего срока развития (третьи сутки) говорит о том, что на данном этапе, соответствующем низкому уровню метаболизма, фактически не работает фактор отбора эмбрионов, ассоциированный с их способностью далее поддерживать адекватный стадии развития уровень метаболизма. В ходе настоящей работы были изучены особенности раннего эмбриогенеза в исследуемых группах в зависимости от концентрации адипокинов в плазме крови. На основании проведенного статистического анализа было установлено, что по совокупности критериев морфологической оценки качество эмбрионов третьих суток культивирования не зависели от содержания адипокинов в плазме крови исследуемых женщин. Иная картина наблюдалась среди эмбрионов пятых суток культивации, где было обнаружено, что у женщин с более низкими показателями лептина, Среактивного белка, соотношения лептин/адипонектин в плазме крови наблюдалось большее число эмбрионов хорошего качества, и наоборот. 122 Конечно, только морфологическая характеристика качества эмбриона не исключает наличия у него хромосомной патологии, и перенос эмбриона с носительством хромосомной патологии может негативно отразиться на эффективности программы ЭКО. Таким образом, в дальнейшем необходимо провести верифицирующее исследование качества эмбрионов у женщин с нормальной массой тела и ожирением с использованием предимплантационного генетического скрининга для оценки вероятности развития хромосомной патологии на фоне дисфункции митохондриального аппарата. На втором этапе настоящей работы, основываясь на предположении, что одним из механизмов, ведущих к репродуктивным неудачам при ожирении, является системное нарушение функционального состояния митохондриального ретикулума, была проведена оценка функционального состояния митохондрий МПК крови у пациенток исследуемых групп. Это исследование позволило охарактеризовать взаимосвязь избыточной массы тела, функциональной активности митохондрий МПК и живорождения. Проведенный анализ не показал статистически значимых различий по показателям митохондриального потенциала в МПК и антиоксидантной защитной системы между исследуемыми группами, но при этом было обнаружено, что среди женщин, у которых лечение завершилось рождением ребенка, митохондриальный трансмембранный потенциал после стимуляции суперовуляции был достоверно ниже (t-критерий для независимых выборок, р=0,032), а концентрация tGSH выше (t-критерий для независимых выборок, р=0,026). Полученные данные согласуются с нашей гипотезой о том, что высокий трансмембранный потенциал митохондрий и недостаточная активность глутатион-зависимого звена антиоксидантной системы ведет к повышенному синтезу АФК, которые оказывают негативное влияние на качество ооцитов и исход беременности. Достоверная отрицательная корреляция между показателем % МПК с высокополяризованными митохондриями до стимуляции и уровнем tGSH, а 123 также tGSH/Hb, указывает на ослабление антиоксиданстной защиты при высокой продукции АФК. Положительная корреляционная связь между долей МПК с высокополяризованными митохондриями до стимуляции с уровнем С-реактивного белка в плазме крови указывает на развитие окислительного стресса при персистенции воспалительного процесса. Полученные данные подтверждают концепцию о значимости величины емкости антиоксидантной защитной системы, основным компонентом которой выступает трипептид глутатион. При снижении емкости антиоксидантной защитной системы на фоне хронического воспаления, сопровождающегося окислительным стрессом, проявляется негативное давление метаболических нарушений, характерных для ожирения, таких как инсулинрезистентность, гипергликемия, гиперлипидемия. Основным поражающим фактором для созревающих ооцитов и зрелых фолликулов может являться резкое повышение липотоксичности, ассоциированной с повышенной продукцией перекисных форм липидов при ожирении и дисфункции митохондрий, в которых снижается как уровень бета-окисления свободных жирных кислот, так и их разобщающее действие, снижающее мембранный потенциал и продукцию АТФ. Наблюдающаяся тенденция к повышению концентрации tGSH свидетельствует о компенсаторной реакции на повышенный уровень окислительного стресса у женщин с ожирением. В группах пациенток, взятых в анализ, наблюдается корреляция частоты живорождения и уровня tGSH в крови. Также наблюдается уменьшение частоты живорождения в группах с избыточным весом и ожирением. В то же время, обратная корреляция между уровнем tGSH и величиной трансмембранного потенциала митохондрий, контролирующего уровень продукции АФК, отражает общую тенденцию снижения емкости антиоксидантной системы в состоянии хронического окислительного стресса при ожирении. 124 По данным исследований, проведенных ранее, в плазме крови женщин, страдающих ожирением, наблюдается более высокий уровень лептина по сравнению с женщинами с нормальным весом [69, 124]. Ранее было показано, что уровень лептина растет в ответ на стимуляцию суперовуляции [134]. Более выраженный рост уровня лептина при лечении в программе ЭКО отмечался в группе женщин с ожирением, при этом у них наблюдался сниженный ответ яичников на стимуляцию [38, 134]. Эти данные позволяют предположить, что высокие концентрации лептина снижают чувствительность ткани яичников к Гн, тем самым частично объясняя потребность в более высоких дозах Гн для стимуляции суперовуляции у женщин с ожирением по сравнению с имеющими нормальный ИМТ. Высокий уровень лептина, особенно на фоне избыточной массы тела, может негативно отражаться на фертильности при применении методов ВРТ, снижая количество и качество полученных ооцитов, влияя на раннее эмбриональное развитие. В настоящем исследовании было обнаружено, что по окончании стимуляции суперовуляции наблюдается положительная корреляция ИМТ с концентрацией лептина в плазме крови, и отмечаются статистически более высокие уровни лептина в группе женщин с избыточной массой тела и ожирением по сравнению с группой нормы. Учитывая полученные в данной работе данные о концентрациях лептина в плазме крови после стимуляции суперовуляции у женщин с избыточной массой тела, а также более низкую морфологическую оценку качества эмбрионов пятых суток культивирования у женщин с более высоким уровнем лептина в плазме крови (тест КраскелаУоллеса, р=0,002), мы предположили, что концентрацию лептина в плазме крови можно использовать в качестве предиктора наступления клинической беременности. На основании сформулированной гипотезы была построена модель прогнозирования вероятности наступления беременности по концентрации 125 лептина после стимуляции суперовуляции. Построенная модель была статистически значима только для женщин с ИМТ<28,5 кг/м2. Данная модель позволяет прогнозировать вероятность наступления беременности на основании показателей, измеренных после стимуляции суперовуляции. Мы предполагаем, что аналогичная модель может быть построена для прогнозирования вероятности наступления клинической беременности до вступления в программу ЭКО. Однако, учитывая данные литературы об изменении уровня лептина в процессе стимуляции суперовуляции [134], для создания такой модели требуются дополнительные исследования. Женщины с ИМТ≥28,0 кг/м2 представляют собой отдельную подгруппу, в которой сложный комплекс изменений метаболического, воспалительного и иммунного характера на фоне избыточного отложения жировой ткани оказывает негативное влияние на фертильность и требует иного подхода к прогнозированию исхода лечения. Для КК также наблюдается обратная корреляция между ИМТ и ΔΨ, что носит фундаментальный характер, определяющий качество ооцита, поскольку именно уровень свободной энергии в виде АТФ в ооците контролирует состояние веретена деления, снижая вероятность анеуплоидии и других патологических последствий нарушения сегрегации хромосом. Исходя из полученных нами данных, а также результатов клинических исследований о негативном влиянии ожирения на исход лечения в программе ЭКО [36, 38, 48, 66], существует необходимость оптимизировать подготовку к лечению и индивидуализировать терапию у данной когорты женщин. Учитывая изменение абсорбции и клиренса лекарственных препаратов, в особенности жирорастворимых, к которым относятся Гн, у женщин с ожирением, необходимо индивидуализировать протоколы стимуляции суперовуляции с адекватной подборкой дозы и способа введения препарата (желательно внутримышечным путем). Принимая во внимание низкие показатели имплантации, наступления клинической беременности и живорождения у женщин с ожирением по 126 сравнению с женщинами с нормальной массой тела, одной из важнейших задач врача-репродуктолога является прогнозирование исходов лечения до вступления пациентки с избыточной массой тела в программу ЭКО. На основании полученных нами результатов был разработан алгоритм персонализированного проведения программ ВРТ с учетом оценки ИМТ и уровня лептина в плазме крови (рисунок 29). Обращение для лечения в программе ЭКО Измерение массы тела, роста, оценка ИМТ Да Нет 2 ИМТ≥28 кг/м ? Измерение ОТ и Δ% МПК с высокополяризованными митохондриями Модель №1 оценки вероятности наступления клинической беременности «-» Измерение концентрации лептина в плазме и ΔΨ МПК после стимуляции суперовуляции стимуляции «+» «+» ПЭ Модель №2 оценки вероятности наступления клинической беременности Криоперенос эмбрионов после нормализации метаболического состояния «-» Рисунок 29. Алгоритм ведения женщин в программе ЭКО с учетом ИМТ и показателей метаболического состояния 127 ВЫВОДЫ 1) Женщины с ожирением по структуре встречаемости гинекологической заболеваемости и перенесенным оперативным вмешательствам не отличаются от женщин с нормальной массой тела, но характеризуются большей продолжительностью бесплодия: 7,2 ± 4,2 года против 4,8 ± 3,3 лет (р=0,01). 2) Гормональный профиль у женщин с ожирением, по сравнению с женщинами с нормальной массой тела, изменен, что выражается в более низких показателях уровня ФСГ (6,72±1,57 МЕ/л против 5,89±1,79 МЕ/л, р=0,012), ЛГ (6,94±5,37 МЕ/л против 4,04±1,61 МЕ/л, р<0,001) и прогестерона (27,62±20,42 нмоль/л против 17,04±11,13 нмоль/л, р<0,001) в плазме крови. 3) Ожирение оказывает негативное влияние на все этапы проведения программы ЭКО: снижается число аспирированных ооцитов (5 против 7 у пациенток с нормальной массой тела, р=0,014), в том числе и зрелых (3 против 6, р=0,02), при более высоких дозах вводимых гонадотропинов из расчета на один аспирированный ооцит (330,0 МЕ против 187,5 МЕ, р=0,004) и суммарно (1300 МЕ против 1500 МЕ, р=0,023). При этом частота имплантации у женщин с ожирением почти в два раза ниже по сравнению с женщинами с нормальной массой тела (15,9% против 30,2%, р=0,016), также отмечается тенденция к снижению частоты живорождения. 4) Имеется отрицательная корреляционная связь между показателем ИМТ и трансмембранным потенциалом митохондрий в кумулюсных клетках (критерий Пирсона, r= -0,284, Р=0,007), поддерживающих энергетический метаболизм ооцита на уровне, адекватном энергозатратам при формировании нормального веретена деления и успешной сегрегации хромосом (в метафазе II). 5) Высокие уровни лептина (ρ=0,79, р<0,001), С-реактивного белка (ρ=0,61, р<0,001), а также соотношение лептин/адипонектин (ρ=0,76, р<0,001) 128 положительно коррелируют с ИМТ и ассоциированы с плохим качеством эмбрионов на пятые сутки культивирования (Лептин р=0,002, С-реактивный белок р=0,006, лептин/адипонектин р=0,015). В то же время, в группе женщин с ожирением доля эмбрионов плохого качества на пятые сутки культивирования значимо выше по сравнению с группой женщин с избыточной и нормальной массой тела (χ2, р=0,013). 6) Концентрация лептина в плазме крови, определенная после стимуляции суперовуляции, у пациенток с наступившей клинической беременностью значимо ниже по сравнению с женщинами, у которых беременность не наступила (10,7 пг/мл против 18,3 пг/мл, р=0,003). 7) Вероятность благополучного завершения беременности живорождением в программе ЭКО выше у женщин с более высокой активностью глутатионзависимого звена антиоксидантной системы (р=0,026) и более низкими значениями трансмембранного потенциала митохондрий МПК, измеренного после стимуляции суперовуляции (р=0,032). 8) Женщины с нарушением липидного обмена нуждаются в дополнительном обследовании на этапе подготовки к программе ЭКО с целью определения метаболического профиля и персонифицированном подходе к лечению. 129 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1) Всем женщинам с 28,5>ИМТ≥18,5 кг/м2 на основании измерения уровня лептина в плазме крови после стимуляции суперовуляции возможно прогнозировать вероятность наступления беременности. При уровне лептина выше 20 нг/мл показано проведение криоконсервации эмбрионов с последующим их переносом после нормализации данного показателя. 2) Женщины с ИМТ≥28,5 кг/м2 представляют собой отдельную подгруппу с метаболическими нарушениями различной степени выраженности. На основании оценки трансмембранного измерения потенциала объема талии до митохондрий начала в лечения и мононуклеарах периферической крови в процессе стимуляции суперовуляции следует корректировать тактику ведения с криоконсервацией всех эмбрионов и их переноса после снижения веса и корректировки метаболических нарушений. 3) Учитывая тропность препаратов Гн к ЖТ, при проведении программы ЭКО и ПЭ у женщин с ожирением следует отдавать предпочтение препаратам с внутримышечной формой введения. 4) С учетом негативного влияния ожирения на вынашивание беременности, женщины с ИМТ≥30 кг/м2 перед вступлением в программу ЭКО должны быть проинформированы лечащим врачом о возможных рисках течения и исходов беременности в случае ее наступления. 5) Всем женщинам с ИМТ≥28,5 кг/м2 до начала лечения в программе ЭКО рекомендовано снижение массы тела до начала лечения на 7-10% от исходного показателя. Женщинам с избыточной массой тела с целью снижения веса следует поддерживать отрицательный энергетический баланс. Принимая во внимание повышенный уровень лептина и провоспалительных цитокинов у большинства женщин с избыточной массой тела, при соблюдении того или иного вида диеты, рекомендовано максимально возможное ограничение потребления насыщенных жиров с преобладанием в 130 составе диеты мононенасыщенных и полиненасыщенных жирных кислот. Учитывая положительное влияние полиненасыщенных жирных кислот на уровень лептина и характер воспаления, для женщин с избыточным весом и ожирением следует рекомендовать диету с высоким содержанием жиров данного типа с целью улучшения метаболических показателей и эффективности лечения в программе ЭКО. 6) Всем женщинам с ожирением рекомендован перенос эмбрионов на пятые сутки культивирования, учитывая особенности их метаболизма и увеличение числа эмбрионов плохого качества на указанный день культивации по сравнению с группой женщин с нормальной массой тела. 131 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 17-ОП – 17-оксипрогестерон антГнРГ – антагонисты гонадотропного рилизинг гормона АМГ – антимюллеров гормон АМГР-2 – рецептор антимюллерова гормона 2 типа АТФ – аденозинтрифосфат АФК – активные формы кислорода ВОЗ – Всемирная организация здравоохранения ВПЧ – вирус папилломы человека ВРТ – вспомогательные репродуктивные технологии Гн - гонадотропины ГСПГ - глобулины, связывающие половые гормоны ДГЭА-С – дигидроэпиандростерона сульфат ДИ – доверительный интервал д.м.ц. – день менструального цикла ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота ЖТ – жировая ткань Е2 - эстрадиол ИКСИ – инъекция сперматозоида в цитоплазму ооцита ИЛ-6 – интерлейкин 6 ИМТ – индекс массы тела ИППП – инфекции, передающиеся половым путем ИПФР 1 – инсулиноподобный фактор роста 1 ЛИФ – лейкемия-ингибирующий фактор К - кортизол КК – кумулюсная клетка ЛГ – лютеинизирующий гормон мРНК – матричная рибонуклеиновая кислота мтДНК – митохондриальная ДНК МПК – мононуклеарные клетки периферической крови 132 НАДФН – восстановленный никотинамидадениндинуклеотидфосфат НЦАГиП – научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии ОБ – объем бедер ОТ – объем талии ОТ/ОБ – отношение объема талии к объему бедер ОШ – отношение шансов П - прогестерон ПРЛ – пролактин ПЦР – полимеразная цепная реакция ПЭ – перенос эмбриона РДВ – раздельное диагностическое выскабливание СПКЯ – синдром поликистозных яичников СТГ – соматотропный гормон ТВП – трансвагинальная пункция Т4 – тироксин ТТГ – тиреотропный гормон ТХУ – трихлоруксусная кислота ФАД – флавинадениндинуклеотид ФСГ – фолликулостимулирующий гормон рФСГ – рекомбинантный фолликулостимулирующий гормон чмФСГ – человеческий менопаузальный фолликулостимулирующий гормон ФНО-α – фактор некроза опухоли α ХГЧ – хорионический гонадотропин человека УЗИ – ультразвуковое исследование ЭДТА – этилендиаминтетрауксусная кислота ЭКО – экстракорпоральное оплодотворение AUC – area under the curve ESHRE – European Society of Human Reproduction and Embryology (Европейское общество по вопросам репродукции человека и эмбриологии) Hb – hemoglobin (гемоглобин) 133 mtDAMP – mitochondrial (митохондриальные Damage молекулярные Associated паттерны, Molecular Patterns ассоциированные с повреждением) PAI-1 – plasminogen activator inhibitor-1 (ИАП-1 - Ингибитор активатора плазминогена-1) DTNB - 5,5'-дитиобис(2-нитробензойная) кислота tGSH - total glutathione (общий глутатион) GSSG - oxidized glutathione (окисленный глутатион) ΔΨ – трансмембранный потенциал 134 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Бесплодный брак. Современные подходы к диагностике и лечению / Под ред. Г. Т. Сухих, Т. А. Назаренко. – М. : ГЭОТАР-Медиа, 2010. – 518 с. 2. Бурлев, В.А. Жировая железа: молекулярные и функциональные особенности у беременных женщин / В.А. Бурлев // Проблемы репродукции. – 2012. – №5. – С. 9-18. 3. Влияние ожирения на исходы лечения в программе экстракорпорального оплодотворения, ретроспективное исследование за 2013 г. / В.К. Горшинова [и др.] // Журнал Акушерство и гинекология. – 2015. – №6. – С. 79-83. 4. Горшков, И.П. Роль адипокинов в патогенезе сахарного диабета 2 типа и метаболического синдрома / И.П. Горшков, В.И. Золоедов // Вестник новых медицинских технологий. – 2010. – №1. – С. 132-134. 5. Дедов, И.И. Жировая ткань как эндокринный орган / И.И. Дедов, Г.А. Мельниченко, С.А. Бутрова // Научный журнал Ожирение и метаболизм. – 2006. – №1. – С. 6-13. 6. Зенков, Н.К. Окислительный стресс: Биохимический и патофизиологический аспекты / Н.К. Зенков, В.З. Лапкин, Е.Б. Меныцикова. – М.: МАЙК «Наука/Интерпериодика», 2001. – 343 с. 7. Ковалева, О.Н. Адипокины: биологические, патофизиологические и метаболические эффекты / О.Н. Ковалева, Т.Н. Амбросова, Т.В. Ащеулова // Журнал внутренняя медицина. – 2009. – №3. – С. 15. 8. Особенности индукции суперовуляции у пациенток с избыточной массой тела и ожирением / М.Б. Аншина [и др.] // Проблемы репродукции. – 2009. – №1.– С. 65. 9. Руководство по клинической эмбриологии / Под ред. В.С. Корсака. – М. : издательство Медицинских книг, 2011. – 111-128 c. 10. Свободнорадикальные процессы в биосистемах / Т.Н. Попова [и др.]. – ИПК Кириллица. – 2008. 135 11. Скулачев, В. Мембранная биоэнергетика / В. Скулачев, А. Богачев, Ф. Каспаринский. – М.: Издательство Московского университета Москва, 2010. — С. 367 c. 12. Течение беременности и перинатальные исходы у женщин с нарушениями жирового обмена / Н.М. Подзолкова [и др.] // Научнопрактический журнал акушерство и гинекология. – №6. – С. 86-92. 13. Чухарева, Н.А. Особенности течения беременности у женщин с ожирением / Н.А. Чухарева, Н.К. Рунихина, Е.Н. Дудинская // Научнопрактический журнал акушерство и гинекология. – 2014. – №2.– С. 9-13. 14. Adipokines and the female reproductive tract / M. Reverchon [et al.] // Int J Endocrinol. – 2014. – P. 232-254. 15. Adiponectin increases insulin-like growth factor I-induced progesterone and estradiol secretion in human granulosa cells / C. Chabrolle [et al.] // Fertil Steril. – 2009. – Vol. 92, №6. – P. 1988–1996. 16. Analysis of endometrial thickness measured by transvaginal ultrasonography in obese patients / I.C. Barboza [et al.] // Einstein (Sao Paulo). – 2014. – Vol. 12, №2. – P. 164-167. 17. Analysis of GSH and GSSG after derivatization with N-ethylmaleimide / D. Giustarini [et al.] // Nat Proto c. – 2013. – Vol. 8, №9. – P. 1660-1669. 18. An interne t-based prospective study of body size and time-to-pregnancy / L.A. Wise [et al.] // Hum Reprod. – 2010. – №25. – С. 253-264. 19. A proteomic analysis of the endometrium in obese and overweight women with recurrent miscarriage: preliminary evidence for an endometrial defect / M. Metwally [et al.] // Reprod Biol Endocrinol. – 2014. – Vol. 5, №12. – P. 75. 20. Assidi, M. Use of both cumulus cells' transcriptomic markers and zona pellucida birefringence to select developmentally competent oocytes in human assisted reproductive technologies / M. Assidi, M. Montag, M.A. Sirard // BMC Genomics. – 2015. – Vol. 16, Suppl 1. – P. S9. 136 21. Association of anti-mullerian hormone levels with obesity in late reproductive-age women / E.W. Freeman [et al.] // Fertil Steril. – 2007. – Vol. 87, №1. – P. 101-106. 22. Association of body weight and female sexual dysfunction: a case control study / M. Mozafari [et al.] // Iran Red Crescent Med J. – 2015. – Vol. 17, №1. – P. e24685. 23. Bavister, B.D. Mitochondrial distribution and function in oocytes and early embryos / B.D. Bavister, J.M. Squirrell // Human Reproduction. – 2000. – Vol. 15, Suppl. 2. – P. 189-198. 24. Bhattacharya, S. Effect of body mass index on pregnancy outcomes in nulliparous women delivering singleton babies / S. Bhattacharya, D.M. Campbell, W.A. Liston // BMC Public Health. – 2007. – №7. – P. 168. 25. Bielanska, M. Chromosomal mosaicism throughout human preimplantation development in vitro: incidence, type, and relevance to embryo outcome / M. Bielanska, S.L. Tan // Hum. Reprod. – 2002. – №17. – P. 413-419. 26. Blüher, M. Adipokines – removing road blocks to obesity and diabetes therapy / M. Blüher // Mol Metab. – 2014. – Vol. 3, №3. – P. 230-240. 27. Body mass index: impact on IVF success appears age-related / M.L. Sneed [et al.] // Human Reproduction. – 2008. – Vol. 23, №8. – P. 1835-1839. 28. Bohler, H.J. Adipose tissue and reproduction in women / H.J. Bohler, S. Mokshagundam, S.J. Winters // Fertil Steril. – 2010. – Vol. 94, №3. – P. 795-825. 29. Brewer, C.J. The adverse effects of obesity on conception and implantation / C.J. Brewer, A.H. Balen // Reproduction. – 2010. – Vol. 140, №3. – P. 347364. 30. Brody, S. Slimness is associated with greater intercourse and lesser masturbation frequency / S. Brody // Journal of Sex and Marital Therapy. – 2004. – Vol. 30. – P. 251-261. 31. Chappel, S. The role of mitochondria from mature oocyte to viable blastocyst / S. Chappel // Obstet Gynecol Internat. – 2013. – №1. – P. 1-10. 137 32. Circulating adiponectin is associated with obesity and serum lipids in West Africans / K.G. Meilleur [et al.] // J Clin Endocrinol Metab. – 2010. – Vol. 95, №7. – P. 3517-3521. 33. Dang, M. N. The Epidemiology of Obesity / M. N. Dang, B. E. Hashem // Gastroenterol Clin North Am. – 2010. – Vol. 39, №1. – P. 1-7. 34. Diet-induced obesity model: abnormal oocytes and persistent growth abnormalities in the offspring / E.S. Jungheim [et al.] // Endocrinology. – 2010. – Vol. 151, №8. – P. 4039-4046. 35. Does high body mass index increase the risk of miscarriage after spontaneous and assisted conception? A meta-analysis of the evidence / M. Metwally [et al.] // Fertil Steril. – 2008. – Vol. 90, №3. – P. 714-726. 36. Does obesity really matter? The impact of BMI on embryo quality and pregnancy outcomes after IVF in women aged ≤38 years / D.L. Zander-Fox [et al.] // Aust N Z J Obstet Gynaecol. – 2012. – Vol. 52, №3. – P. 270-276. 37. Effects of adipocyte-secreted factors on decidualized endometrial cells: modulation of endometrial receptivity in vitro / S. Gamundi-Segura [et al.] // J Physiol Biochem. – 2015. – Vol. 71, №3. – P. 537-546. 38. Effects of female increased body mass index on in vitro fertilization cycles outcome / H. Caillon [et al.] // Obes Res Clin Pract. – 2015. – Vol. 9, №4. – P. 382-388. 39. Effect of increased body mass index on oocyte and embryo quality in IVF patients / M. Metwally [et al.] // Reproductive Biomedicine Online. – 2007. – Vol. 15, №5. – P. 532-538. 40. Effect of male and female body mass index on pregnancy and live birth success after in vitro fertilization / K.C. Schliep [et al.] // Fertil Steril. – 2015. – Vol. 103, №2. – P. 388-395. 41. Effect of maternal height and weight on risk for preterm singleton and twin births resulting from IVF in the United States, 2008-2010 / R.P. Dickey [et al.] // Am J Obstet Gynecol. – 2013. – Vol. 209, №4. – P. 349. 138 42. Effects of maternal obesity on antenatal, perinatal and neonatal outcomes / M.E. Avc [et al.] // J Matern Fetal Neonatal Med. – 2014. – Vol. 11. – P. 14. 43. Effects of maternal surgical weight loss in mothers on intergenerational transmission of obesity / J. Smith [et al.] // J Clin Endocrinol Metab. – 2009. – №94. – P. 4275-4283. 44. Effect of obesity on recombinant follicle-stimulating hormone absorption: subcutaneous versus intramuscular administration / M.P. Steinkampf [et al.] // Fertil Steril. – 2003. – Vol. 80, №1. – P. 99-102. 45. Elevated body mass index is associated with lower serum anti-mullerian hormone levels in infertile women with diminished ovarian reserve but not with normal ovarian reserve / E. Buyuk [et al.] // Fertility and Sterility. – 2011. – Vol. 95, №7. – P. 2364-2368. 46. Experimental evidence that changes in oocyte growth influence meiotic chromosome segregation / C.A. Hodges [et al.] // Human Reproduction. – 2002. – №17. – P. 1171-1180. 47. Fat and female fecundity: prospective study of effect of body fat distribution on conception rates / B.M. Zaadstra [et al.] // BMJ. – 1993. – Vol. 306. – P. 484487. 48. Female obesity adversely affects assisted reproductive technology (ART) pregnancy and live birth rates / B. Luke [et al.] // Hum Reprod. – 2011. – Vol. 26, №1. – P. 245-252. 49. Fetuses of obese mothers develop insulin resistance in utero / P.M. Catalano [et al.] // Diabetes Care. – 2009. – Vol. 32, №6. – P. 1076–1080. 50. Foster, C.E. Midwives’ attitudes towards giving weight-related advice to obese pregnant women / C.E. Foster, J. Hirst // British Journal of Midwifery. – 2014. – Vol. 22, №4. – P. 254-262. 51. Fridovich, I. Fundamental aspects of reactive oxygen species, or what's the matter with oxygen? / I. Fridovich // Ann N Y Acad Sci. – 1999. – Vol. 893. – P. 13-28. 139 52. Friedman, J.R. Mitochondrial form and function / J.R. Friedman, J. Nunnar // Nature. – 2014. – Vol. 505. – P. 335-343. 53. Galic, S. Adipose tissue as an endocrine organ / S. Galic, J.S. Oakhill, G.R. Steinberg // Mol Cell Endocrinol. – 2010. – Vol. 316. – P. 129-139. 54. Gilchrist, R.B. Oocyte-secreted factors: regulators of cumulus cell function and oocyte quality / R.B. Gilchrist, M. Lane, J.G. Thompson // Hum Reprod Update. – 2008. – Vol. 14, №2. – P. 159-177. 55. Gosman, G.G. Obesity and the role of gut and adipose hormones in female reproduction / G.G. Gosman, H.I. Katcher, R.S. Legro // Hum Reprod Update. – 2006. – Vol. 12, №5. – P. 585-601. 56. Gregor, M.F. Inflammatory mechanisms in obesity / M.F. Gregor, G.S. Hotamisligil // Annu Rev Immunol. – 2011. – №29. – P. 415-445. 57. Grindler, N.M. Maternal obesity, infertility and mitochondrial dysfunction: potential mechanisms emerging from mouse model systems / N.M. Grindler, K.H. Moley // Mol Hum Reprod. – 2013. – Vol. 19, №8. – P. 486-494. 58. Haslam D. Fast facts: Obesity / D. Haslam, G. Wittert. – UK: Health Press Limited, 2009. – 7 c. 59. Hassan, M.A. Negative lifestyle is associated with a significant reduction in fecundity / M.A. Hassan, S.R. Killick // Fertility and Sterility. – 2004. – Vol. 81. – P. 384-392. 60. Hauner, H. Adipose tissue inflammation: are small or large fat cells to blame? / H. Hauner // Diabetologia. – 2010. – Vol. 53, №2. – P. 223-225. 61. High-fat diet causes lipotoxicity responses in cumulus-oocyte complexes and decreased fertilization rates / L.L.Wu [et al.] // Endocrinology – 2010. – Vol. 151, №11. – P. 5438-5445. 62. High fat diet induced developmental defects in the mouse: oocyte meiotic aneuploidy and fetal growth retardation/brain defects / K.M. Luzzo [et al.] // PLoS One. – 2012. – №7. – P. e49217. 63. 1978. Hippocratic writings / Edited by G.E.R. Lloyd // London: Penguin Books. – 140 64. Huang, Z. The human oocyte and cumulus cells relationship: new insights from the cumulus cell transcriptome / Z. Huang, D. Wells // Mol Hum Reprod. – 2010. – Vol. 16, №10. – P. 715-725. 65. Impact of overweight and underweight on assisted reproduction treatment / P. Fedorcsak [et al.] // Human Reproduction. – 2004. – №19. – P. 2523-2528. 66. Influence of BMI on risk of miscarriage after single blastocyst transfer / V. Rittenberg [et al.] // Hum Reprod. – 2011. – Vol. 26, №10. – P. 2642-2650. 67. Influence of maternal overnutrition and gestational diabetes on the programming of metabolic health outcomes in the offspring: experimental evidence / T.J. Pereira [et al.] // Biochem Cell Biol. – 2014. – №19. – P. 1-14. 68. Inhibitory effect of obesity on gonadotropin, estradiol and inhibin B levels in fertile women / G. De Pergola [et al.] // Obesity (Silver Spring). – 2006. – Vol. 14, №11. – P. 1954-1960. 69. Interactions of the hormones leptin, ghrelin,adiponectin, resistin, and PYY3- 36 with the reproductivesystem / E. Budak [et al.] // Fertil Steril. – 2006. – Vol. 85, №6. – P. 1563-1581. 70. Is obesity still increasing among pregnant women? Prepregnancy obesity trends in 20 states, 2003-2009 / S.C. Fisher [et al.] // Prev Med. – 2013. – Vol. 56, №6. – P. 372-378. 71. IVF outcomes in obese donor oocyte recipients: a systematic review and meta-analysis / E.S. Jungheim [et al.] // Hum Reprod. – 2013. – Vol. 28, №10. – P. 2720-2727. 72. Jones, K.T. Chromosomal, metabolic, environmental, and hormonal origins of aneuploidy in mammalian oocytes / K.T. Jones, S.I. Lane // Exp Cell Res. – 2012. – Vol. 318, №12. – P. 1394-1409. 73. Jung, U. J. Obesity and its metabolic complications: the role of adipokines and the relationship between obesity, inflammation, insulin resistance, dyslipidemia and nonalcoholic fatty liver disease / U.J. Jung, M-S. Choi // Int J Mol Sci. – 2014. – Vol. 14, №4. – P. 6184-6223. 141 74. Klenov, V.E. Obesity and reproductive function: a review of the evidence / V.E. Klenov, E.S. Jungheim // Curr Opin Obstet Gynecol. – 2014. – Vol. 26, №6. – P. 455-460. 75. Leary, C. Human embryos from overweight and obese women display pheno typic and metabolic abnormalities / C. Leary, H.J. Leese, R.G. Sturmey // Hum Reprod. – 2015. – Vol. 30, №1. – P. 122-132. 76. Leese, H.J. Metabolism of the preimplantation embryo: 40 years on / H.J. Leese // Reproduction. – 2012. – Vol. 143, №4. – P. 417-427. 77. Leptin suppresses anti-Mullerian hormone gene expression through the JAK2/STAT3 pathway in luteinized granulosa cells of women undergoing IVF / Z. Merhi [et al.] // Hum Reprod. – 2013. – Vol. 28, №6. – P. 1661-1669. 78. Leptin system in embryo development and implantation: a protein in search of a function / A. Cervero [et al.] // Reprod Biomed Online. – 2005. – Vol. 10, №2. – P. 217-223. 79. Levens, E.D. Assessing the role of endometrial alteration among obese patients undergoing assisted reproduction / E.D. Levens, M.C. Skarulis // Fertil Steril. – 2008. – Vol. 89, №6. – P. 1606-1608. 80. Lifestyle factors and reproductive health: taking control of your fertility / R. Sharma [et al.] // Reprod Biol Endocrinol. – 2013. – Vol. 16, №11. – P. 66. 81. Maheshwari, A. Effect of overweight and obesity on assisted reproductive technology - a systematic review / A. Maheshwari, L. Stofberg, S. Bhattacharya // Hum Reprod Update. – 2007. – Vol. 13, №5. – P. 433-444. 82. Mahrous, E. Regulation of mitochondrial DNA accumulation during oocyte growth and meiotic maturation in the mouse / E. Mahrous, Q. Yang, H.J. Clarke // Reproduction. – 2012. – Vol. 144, №2. – P. 177-185. 83. Maternal adiposity — a determinant of perinatal and offspring outcomes? / D.A. Lawlor [et al.] // Nat Rev Endocrinol. – 2012. – Vol. 8, №11. – P. 679-688. 84. Maternal body mass index and congenital anomaly risk: a cohort study / J. Rankin [et al.] // Int J Obes (Lond). – 2010. – Vol. 34, №9. – P. 1371-1380. 142 85. Maternal diabetes causes abnormal dynamic changes of endoplasmic reticulum during mouse oocyte maturation and early embryo development / C.H. Zhang [et al.] // Reprod Biol Endocrinol. – 2013. – Vol. 19, №11. – P. 31. 86. Maternal diet induced obesity alters mitochondrial activity and redox status in mouse oocytes and zygotes / N. Igosheva [et al.] // PLoS One. – 2010. – Vol. 5, №4. – P. e10074. 87. Maternal insulin resistance causes oxidativestress and mitochondrial dysfunction in mouse oocytes / X.H. Ou [et al.] // Hum Reprod. – 2012. – Vol. 27, №7. – P. 2130-2145. 88. Maternal obesity and pregnancy outcome: a study of 287,213 pregnancies in London / N.J. Sebire [et al.] // Int J Obes Relat Metab Disord. – 2001. – Vol. 25, №8. – P. 1175-1182. 89. Maternal obesity and risk of neural tube defects: a metaanalysis / S.A. Rasmussen [et al.] // Am J Obstet Gynecol. – 2008. – Vol. 198, №6. – P. 611-619. 90. Maternal obesity and the risk of infant death in the United States / A. Chen [et al.] // Epidemiology. – 2009. – Vol. 20, №1. – P. 74-81. 91. Maternal obesity, associated complications and risk of prematurity / H. Aly [et al.] // J Perinatol. – 2010. – Vol. 30. – P. 447-451. 92. Maternal obesity during pregnancy and premature mortality from cardiovascular event in adult offspring: follow-up of 1 323 275 person years / R.M. Reynolds [et al.] // Br Med J. – 2013. – Vol. 347. – P. f4539. 93. Maternal overweight and obesity in early pregnancy and risk of infant mortality: a population based cohort study in Sweden / S. Johansson [et al.] // BMJ. – 2014. – Vol. 349. – P. g6572. 94. Maternal weight in pregnancy and offspring body composition in late adulthood: findings from the Helsinki Birth Cohort Study (HBCS) / J.G. Eriksson [et al.] // Ann Med. – 2015. – Vol. 23. – P. 1-6. 95. Mechanisms of obesity-induced inflammation and insulin resistance: insights into the emerging role of nutritional strategies / M.A. McArdle [et al.] // Front. Endocrinol. – 2013. – Vol. 4. – P. 52. 143 96. Metabolic endotoxaemia a potential novel link between ovarian inflammati on and impaired progesterone production / K. Tremellen [et al.] // Gynecol Endocrinol. – 2015. – Vol. 31, №4. – P. 309-312. 97. Metabolic endotoxemia with obesity: Is it real and is it relevant? / N.E. Boutagy [et al.] // Biochimie. – 2015. – Vol. 29. – P. 1-10. 98. Milder ovarian stimulation for in vitro fertilization reduces aneuploidy in the human preimplantation embryo: a randomized controlled trial / E.B. Baart // Human Reproduction. – 2007. – Vol. 22. – P. 980-988. 99. Mild ovarian stimulation for IVF / M.F. Verberg [et al.] // Human Reproduction Update. – 2009. – Vol. 15, №1. – P. 13-29. 100. Mitochondria damage-associated molecular patterns and vascular function / C.F. Wenceslau [et al.] // European Heart Journal. – 2014. – Vol. 35, №18. – P. 1172-1177. 101. Mitochondrial aggregation patterns and activity in human oocytes and preimplantation embryos / M. Wilding [et al.] // Hum Reprod. – 2001. – Vol. 16, №5. – P. 909-917. 102. Mitochondrial DNA content affects the fertilizability of human oocytes / P. Reynier [et al.] // Molecular human reproduction. – 2001. – Vol. 7, №5. – P. 425429. 103. Mitochondrial functionality in reproduction: from gonads and gametes to embryos and embryonic stem cells / J. Ramalho‐Santos [et al.] // Hum Reprod Update. – 2009. – Vol. 15, №5. – P. 553-572. 104. Mitochondrial fusion is required for mtDNA stability in skeletal muscle and tolerance of mtDNA mutations / H. Chen [et al.] // Cell. – 2010. – Vol. 141, №2. – P. 280-289. 105. Mitochondrial functions on oocytes and preimplantation embryos / L. Wang [et al.] // J Zhejiang Univ Sci B. – 2009. – Vol. 10, №7. – P. 483–492. 106. Mitochondrial morphology in human fetal and adult female germ cells / P.M. Motta [et al.] // Hum Reprod. – 2000. – Vol. 15, Suppl.2. – P. 129-147. 144 107. Mitochondrial peptidase IMMP2L mutation causes early onset of age- associated disorders and impairs adult stem cell self-renewal / S.K. George [et al.] // Aging Cell. – 2011. – Vol. 10, №4. – P. 584-594. 108. Moragianni, V.A. The effect of body mass index on the outcomes of first assisted reproductive technology cycles / V.A. Moragianni, S.M. Jones, D.A. Ryley // Fertil Steril. – 2012. – Vol. 98, №1. – P. 102-108. 109. National, regional and global trends in infertility prevalence since 1990: a systematic analysis of 277 health surveys / M.N. Mascarenhas [et al.] // PLoS Med. – 2012. – Vol. 9, №12. – P. e1001356. 110. Nguyen, D.M. The epidemiology of obesity / D.M. Nguyen, H.B. El-Serag // Gastroenterol Clin North Am. – 2010. – Vol. 39, №1. – P. 1-7. 111. Norman, R.J. Obesity and reproductive disorders: a review / R.J. Norman, A.M. Clark // Reprod Fertil Dev. – 1998. – Vol. 10, №1. – P. 55-63. 112. Obesity alters retrieved oocyte count and clinical pregnancy rates in high and poor responder women after in vitro fertilization / S. Kilic [et al.] // Arch Gynecol Obstet. – 2010. – Vol. 282, №1. – P. 89-96. 113. Obesity and leptin resistance: distinguishing cause from effect / M.G. Myers Jr. [et al.] // Trends Endocrinol Metab. – 2010. – Vol. 21, №11. – P. 643-651. 114. Obesity and poor reproductive outcome: the potential role of the endometrium / J. Bellver [et al.] // Fertil Steril. – 2007. – Vol. 88, №2. – P. 446451. 115. Obesity affects spontaneous pregnancy chances in subfertile, ovulatory women / J.W. Van der Steeg [et al.] // Hum Reprod. – 2008. – Vol. 23, №2. – P. 324-328. 116. Obesity reduces uterine receptivity: clinical experience from 9,587 first cycles of ovum donation with normal weight donors / J. Bellver [et al.] // Fertil Steril. – 2013. – Vol. 100, №4. – P. 1050-1058. 117. Obstetric outcomes after in vitro fertilization in obese and morbidly obese women / A. Dokras [et al.] // Obstetrics and gynecology. – 2006. – Vol. 108, №1. – P. 61-69. 145 118. Oocyte morphological abnormalities in overweight women undergoing in vitro fertilization cycles / R. Depalo [et al.] // Gynecological endocrinology: the official journal of the International Society of Gynecological Endocrinology. – 2011. – Vol. 27, №11. – P. 880-884. 119. Overweight and obesity adversely affect outcomes of assisted reproductive technologies in polycystic ovary syndrome patients / Z. Bu [et al.] // Int J Clin Exp Med. – 2013. – Vol. 6, №10. – P. 991-995. 120. Pantasri T. The effects of being overweight and obese on female reproduction: a review / T. Pantasri, R.J. Norman // Gynecol Endocrinol. – 2014. – Vol. 30, №2. – P. 90–94. 121. Pasquali, R. The impact of obesity on reproduction in women with polycystic ovary syndrome / R. Pasquali, A. Gambineri, U. Pagotto // BJOG. – 2006. – Vol. 113, №10. – P. 1148-1159. 122. Pereira, S.S. Adipokines: biological functions and metabolically healthy obese profile / S.S. Pereira, J.I. Alvarez-Leite // Journal of Receptor, Ligand and Channel Research. – 2014. – Vol. 7. – P. 15-25. 123. Peterson, C. M. Skeletal Muscle Mitochondria and Aging: A Review / C. M. Peterson, D. L. Johannsen, E. Ravussin // J Aging Res. – 2012. – Vol. 2012. – P. 120. 124. Pre- and post- prandial appetite hormone levels in normal weight and severely obese women / J.J.Carlson [et al.] // Nutrition & Metabolism. – 2009. – Vol. 11, №6. – P. 32. 125. Prentice, A.M. The emerging epidemic of obesity in developing countries / A.M. Prentice // Int J Epidemiol. – 2006. – Vol. 35, №1. – P. 93-99. 126. Prevalence and trends in obesity among US adults: 1999–2008 / K.M. Flegal [et al.] // JAMA. – 2010. – Vol. 303, №3. – P. 235-241. 127. Racial differences in the association between body mass index and serum IGF1, IGF2, and IGFBP3 / J.H. Fowke [et al.] // Endocr Relat Cancer. – 2010. – Vol. 17, №1. – P. 51-60. 146 128. Reactive oxygen species (ROS)-induced ROS release: a new phenomenon accompanying induction of the mitochondrial permeability transition in cardiac myocytes / D.B. Zorov [et al.] // J Exp Med. – 2000. – Vol. 192, №3. – P. 10011014. 129. Robker, R.L. Inflammatory pathways linking obesity and ovarian dysfunction / R.L. Robker, L.L. Wu, X. Yang // J Reprod Immunol. – 2011. – Vol. 88, №2. – P. 142-148. 130. Rugarli, E.I. Mitochondrial quality control: a matter of life and death for neurons / E.I. Rugarli, T. Langer // EMBO J. – 2012. – Vol. 31, №6. – P. 13361349. 131. Santos, T.A. Mitochondrial content reflects oocyte variability and fertilization outcome / T.A. Santos, S. El Shourbagy, J.C. St John // Fertility and sterility. – 2006. – Vol. 85, №3. – P. 584-591. 132. Schatten, H. The impact of mitochondrial function/dysfunction on IVF and new treatment possibilities for Infertility / H. Schatten, Q.Y. Sun, R. Prather // Reproductive Biology and Endocrinology. – 2014. – Vol. 12. – P. 111. 133. Siega-Riz, A.M. Prepregnancy obesity: determinants, consequences, and solutions / A.M. Siega-Riz // Adv Nutr. – 2012. – Vol. 3, №1. – P. 105-107. 134. Serum and follicular fluid leptin during in vitro fertilization: relationship among leptin increase, body fat mass, and reduced ovarian response / T.L. Bützow [et al.] // J Clin Endocrinol Metab. – 1999. – Vol. 84, №9. – P. 3135-3139. 135. Serum haptoglobin: a novel marker of adiposity in humans / C. Chiellini [et al.] // J Clin Endocrinol Metab. – 2004. – Vol. 89, №6. – P. 2678-2683. 136. Serum leptin levels and reproductive function during the menstrual cycle / K. Ahrens // Am J Obstet Gynecol. – 2014. – Vol. 210, №3. – P. 248. 137. Similar morphokinetic patterns in embryos derived from obese and normoweight infertile women: a time-lapse study / J. Bellver [et al.] // Hum Reprod. – 2013. – Vol. 28, №3. – P. 794-800. 138. Talmor, A. Female Obesity and Infertility / A. Talmor, B. Dunphy // Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol. – 2015. – Vol. 29, №4. – P. 498-506. 147 139. Tamer, E.C. The impact of body mass index on assisted reproduction / E.C. Tamer, L.M. Senturk // Curr Opin Obstet Gynecol. – 2009. – Vol. 21, №3. – P. 228-235. 140. Tenenbaum-Gavish, K. Impact of maternal obesity on fetal health / K. Tenenbaum-Gavish, M. Hod // Fetal Diagn Ther. – 2013. – Vol. 34, №1. – P. 1-7. 141. The association between severe obesity and characteristics of failed fertilized oocytes / R. Machtinger [et al.] // Hum Reprod. – 2012. – Vol. 27, №11. – P. 198-207. 142. The effect of gestational weight gain by body mass index on maternal and neonatal outcomes / J.M. Crane [et al.] // J Obstet Gynaecol Can. – 2009. – Vol. 31, №1. – P. 28-35. 143. The effects of oxidative stress on female reproduction: a review / A. Agarwal [et al.] // Reprod Biol Endocrinol. – 2012. – Vol. 10. – P. 49. 144. The impact of maternal body mass index on in vitro fertilization outcomes / A. Legge [et al.] // J Obstet Gynaecol Can. – 2014. – Vol. 36, №7. – P. 613-619. 145. The importance of mitochondrial metabolic activity and mitochondrial DNA replication during oocyte maturation in vitro on oocyte quality and subsequent embryo developmental competence. / H. Ge [et al.] // Molecular reproduction and development. – 2012. – Vol. 79, №6. – P. 392-401. 146. The insulin-related ovarian regulatory system in health and disease / L. Poretsky [et al.] // Endocr Rev. – 1999. – Vol. 20, №4. – P. 535-582. 147. The Istanbul consensus workshop on embryo assessment: proceedings of an expert meeting / Alpha Scientists in Reproductive Medicine and ESHRE Special Interest Group of Embryology // Hum Reprod. – 2011. – Vol. 26, №6. – P. 12701283. 148. The relationship between obesity and fecundity / N. Yilmaz [et al.] // J Womens Health (Larchmt). – 2009. – Vol. 18, №5. – P. 633-636. 149. The root of reduced fertility in aged women and possible therapeutic options: Current status and future perspectives / J. Qiao [et al.] // Mol Aspects Medicine. – 2014. – Vol. 38. – P. 54-85. 148 150. Trends in maternal obesity incidence rates, demographic predictors, and health inequalities in 36 821 women over a 15-year period / N. Heslehurst [et al.] // BJOG: an International Journal of Obstetrics & Gynecology. – 2007. – Vol. 114, №2. – P. 187-194. 151. Turner, N. Developmental programming of obesity and insulin resistance: does mitochondrial dysfunction in oocytes play a role? / N. Turner, R.L. Robker // Mol Hum Reprod. – 2015. – Vol. 21, №1. – P. 23-30. 152. Van Blerkom, J. Mitochondrial function in the human oocyte and embryo and their role in developmental competence / J. Van Blerkom // Mitochondrion. – 2011. – Vol. 11, №5. – P. 797-813. 153. Van Blerkom, J. Mitochondria in human oogenesis and preimplantation embryogenesis: engines of metabolism, ionic regulation and developmental competence / J. Van Blerkom // Reproduction. – 2004. – Vol. 128, №3. – P. 269280. 154. Westermann, B. Bioenergetic role of mitochondrial fusion and fission / B. Westermann // Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. – 2012. – Vol. 1817, №10. – P. 1833-1838. 155. WHO/ Media center fact sheet: obesity and overweight [Digital source]. – 2015. – fact sheet №311. – access mode: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs311/en/ 156. World Health Organization reference values for human semen characteristics / T.G. Cooper [et al.] // Hum. Reprod. Update. – 2010. – Vol. 16. – P. 231–245. 157. Youle, R. J. Mitochondrial fission, fusion, and stress / R.J. Youle, A.M. Van der Bliek // Science. – 2012. – Vol. 337. – P. 1062–1065. 158. Zhang, C. The role of inflammatory cytokines in endothelial dysfunction / C. Zhang // Basic Res Cardiol. – 2008. – Vol. 103, №5. – P. 398–406. 159. Zorov, D.B. Mitochondrial reactive oxygen species (ROS) and ROS-induced ROS release / D.B. Zorov, M. Juhaszova, S.J. Sollott // Physiol Rev. – 2014. – Vol. 94, №3. – P. 909–950.
