Использование атомно - силовой микроскопии для оценки

УДК 581.1
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ
ДЛЯ ОЦЕНКИ СТРУКТУРНОГО СОСТОЯНИЯ МЕМБРАН
ХЛОРОПЛАСТОВ ГОРОХА
Т.А. Гончарова, Л.Н. Курганова, А.В. Лихачева,
Ю.Ю. Гущина, А.А. Брилкина
Нижегородский госуниверситет
В работе приведены результаты исследования структуры мембран хлоропластов гороха методом атомно-силовой микроскопии (АСМ). Оценены
возможности метода для исследования структурных изменений мембран
хлоропластов на фоне воздействия стресс-фактора. В контактном режиме
сканирования определены форма, размер органелл, гетерогенность фракции,
а также особенности структуры поверхности отдельного хлоропласта. После
обработки растений паракватом in vivo с помощью метода АСМ не показано
существенных изменений структуры наружной мембраны хлоропластов.
У растений в процессе восприятия внешних сигналов и формирования адекватного ответа на них роль первичных сенсоров могут выполнять мембранные
структуры. Одна из реакций растений на стресс заключается в активации перекисного окисления мембранных липидов (ПОЛ), результатом которого могут
быть структурно-функциональные нарушения как отдельных белков-ферментов и
мембраносвязанных ферментативных комплексов, так и мембранных образований
клетки в целом. Существует ряд экспериментальных подходов для исследования
структуры мембран. В последнее время метод АСМ достаточно широко применяется в биологии с целью изучения структурных изменений мембран клеток, отдельных биомолекул, дополняя традиционные методы анализа биологических
объектов. При высокой разрешающей способности метода предоставляется возможность исследования биологических объектов в условиях, максимально приближенных к нативным. Вместе с тем, еще существуют методические проблемы
для использования АСМ в качестве метода визуализации биообъектов (Прохоров
и др., 1999; Engel et al., 1999; Thomson et al., 1999).
В представленной работе оценивали возможности применения атомно-силовой
микроскопии для характеристики структурных изменений мембран хлоропластов
растений после воздействия стресс-фактора.
Объектом исследования служили растения гороха (Pisum sativum L.). В качестве стрессирующего фактора использовали гербицид — паракват, активирующий
свободно-радикальные процессы в хлоропластах вследствие нарушения работы
электронно-транспортной цепи (Donahue et al., 1997). Растения гороха опрыскивали 100 мкМ раствором параквата в 0.25%-ном твин-20, время обработки составляло 60 минут. В качестве контрольных использовали необработанные растения, а
также растения, опрысканные 0.25%-ном твин-20. Хлоропласты выделяли согласно методу D. Arnon et al. (1956). Для атомно-силовой микроскопии препараты
мембран фиксировали на покровных стеклах 2%-ным раствором глутаральдегида.
АСМ-измерения проводили на воздухе в контактном режиме на атомно-силовом
168
микроскопе Accurex 2100 (TopoMetrix). Использовали кантилеверы из нитрида
кремния с радиусом кривизны около 50 нм. Методом АСМ оценивали форму,
размеры хлоропластов, гетерогенность фракции, а также структурные особенности их наружной мембраны. Данные АСМ-топографии хлоропластов сопоставляли с таковыми световой и электронной микроскопии. Одновременно с исследованием тонкой ультраструктуры хлоропластов определяли интенсивность перекисного окисления липидов как одного из показателей структурного состояния мембран. ПОЛ тестировали по количеству промежуточных продуктов процесса —
диеновых конъюгатов (ДК) (Fletcher et al., 1973). Антиоксидантный статус хлоропластов оценивали по активности супероксиддисмутазы (СОД) (К.Ф. 1.15.1.11) и
глутатионредуктазы (ГР) (К.Ф. 1.6.4.2.) (Чевари и др., 1985; Iavata, Tanaka, 1977).
Рис. 1. АСМ-изображение хлоропластов (а) и
наружной мембраны отдельного хлоропласта (б)
На рис. 1 представлены АСМ-изображения хлоропластов необработанных растений гороха. Размеры крупных хлоропластов составили 5–6 мкм. При помощи
АСМ оказалось возможным исследование топографии поверхности отдельного
хлоропласта без многочисленных срезов для реконструкции трехмерного изображения. На поверхности органеллы обнаружены выпячивания мембран, размеры
которых составляют в среднем 40–100 на 300–1000 нм. Образование выпячиваний
у хлоропластов способствует осуществлению контактного взаимодействия между
клеточными органеллами (Гамаюмова и др., 1975). Необходимо отметить, что
наружная мембрана хлоропластов в настоящее время менее всего изучена, особенно в функциональном плане. В связи с этим исследование топографии поверхности хлоропластов методом АСМ на фоне воздействия внешних факторов, по
всей видимости, позволит существенно продвинуться в изучении структурнофункциональных особенностей наружной мембраны хлоропластов, а также в понимании механизмов формирования ответной реакции растений на внешние воздействия. Известно, что стресс-воздействия могут способствовать фотоактивации
образования активированного кислорода и обусловленных им деструкционным
процессам мембран хлоропластов (Аверина, Радюк, 1989). В представленной работе в хлоропластах растений гороха, обработанных паракватом, обнаружено изменение прооксидантно-антиоксидантного равновесия: повышение уровня ДК на
фоне снижения активности СОД и активации ГР (рис. 2).
169
250
6
200
% от контрольного уровня
нмоль ДК на мг белка
5
4
3
2
100
50
1
0
150
контроль
твин
паракват
0
контроль
твин
активность СОД
паракват
активность ГР
Рис. 2. Влияние параквата на перекисный гомеостаз в хлоропластах гороха
Снижение активности СОД может быть обусловлено ингибированием фермента в условиях интенсивного образования О2-, вызываемого паракватом. Глутатионредуктаза является менее чувствительным ферментом на действие параквата и
обеспечивает более надежную защиту хлоропластов. По всей видимости, повышение активности ГР является компенсаторной реакцией в ответ на накопление
активных форм кислорода и продуктов ПОЛ в хлоропластах под действием параквата. На основании полученных результатов об активации процессов липопероксидации в хлоропластах можно предположить и наличие структурных изменений
мембран. Так, согласно Н. Авериной, М. Радюк (1989), при действии гербицидов
происходит потеря очертаний хлоропластов и их набухание. В представленной
работе методом АСМ не обнаружено существенных изменений формы, размеров
между хлоропластами стрессированных и контрольных растений. После обработки растений твином, паракватом, как и в контрольном варианте, встречаются хлоропласты с различной степенью структурированности поверхности (рис. 3).
Рис. 3. АСМ-изображение хлоропластов
после обработки растений твином (а) и паракватом (б)
170
Электронно-микроскопические исследования показали, что твин-20 и паракват
изменяют внутреннюю ультраструктуру хлоропластов, в частности, вызывают
дезорганизацию гранулярной системы. По всей видимости, выбранная в работе
концентрация параквата при воздействии in vivo не приводит к значительным нарушениям наружной мембраны хлоропластов, продукты ПОЛ оказывают модифицирующее влияние лишь на внутреннюю структуру хлоропластов. В связи с
этим методом АСМ проведена оценка структурных особенностей мембран хлоропластов на фоне воздействия параквата in vitro. АСМ-исследования показали наличие дезорганизации наружной мембраны органелл.
Таким образом, без применения специальных методик подготовки образцов
(напыления металлами, приготовления реплик, реконструкции сотен серийных
срезов тканей для получения трехмерного изображения биообъектов) методом
АСМ можно оценить форму, размеры хлоропластов и гетерогенность полученной
фракции. В процессе изучения методом атомно-силовой микроскопии структурных изменений мембран хлоропластов в ответ на внешние воздействия (особенно
in vitro) более перспективным кажется исследование препаратов мембран в физиологических условиях, т. е. в среде выделения без фиксации.
Работа была поддержана программой «Фундаментальные исследования и
высшее образование» (BRHE) и Научно-исследовательским и образовательным
центром сканирующей зондовой микроскопии ННГУ (НИОЦ СЗМ ННГУ).
ЛИТЕРАТУРА
Аверина Н.Г., Радюк М.С. Исследование ультраструктуры хлоропластов из листьев
фасоли (Phaseolus vulgare L.), обработанных 5-аминолевулиновой кислотой и 2,2'дипиридилом // Докл. АН БССР. 1989. Т. 33, № 5. С. 471–474.
Гамаюмова М.С., Кочубей С.М., Островская Л.К. и др. Фотохимические системы хлоропластов. Киев, 1975.
Прохоров В.В., Клинов Д.В., Демин В.В. Методические особенности наблюдения ДНК
в атомно-силовой микроскоп // Биоорганическая химия. 1999. Т. 25, № 3. С. 237–240.
Чевари С., Чаба И., Секей И. Роль супероксиддисмутазы в окислительных процессах
клетки и метод определения ее в биологических материалах // Лаб. дело. 1985. № 11.
С. 678–681.
Arnon D.L., Allen M.B., Whatly Z.B. Photosynthesis by isolated chloroplasts. Genetic concept and comparison of frie photochemical reaction // Biochim. Biophys. Acta. 1956. V. 20, № 2.
P. 449.
Donahue J.L., Okpodu C.M., Cramer C.L. et al. Responses of antioxidants to paraquat in pea
leaves // Plant physiology. 1997. V. 113. P. 249–257.
Engel A., Lyubchenko Y. Atomic force microscopy: a powerful tool to observe biomolecules
at work // Cell Biology. 1999. V. 9. P. 77–80.
Fletcher D.L., Dillared C.J., Tappel A.Y. Measurement of fluorescent lipid peroxidation
products in biological system and tissues // Analyt. Biochem. 1973. V. 52. P. 497–499.
Iavata J., Tanaka U. Glutathionereductases «positive» spectro-photometre assayes // Colled.
Cresh. Chem. Commun. 1977. V. 42, № 3. P. 1086–1089.
Thomson N.T., Smith B.L., Almqvist N. et al. Oriented, active Escherichia coli RNA polimerase: an atomic force microscope study // Biophysical J. 1999. V. 76, № 2. P. 1024–1033.
171