ВОЗМОЖНОСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ МЕТОДА АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ ХЛОРОПЛАСТОВ, МИТОХОНДРИЙ И ВЕЗИКУЛ ПЛАЗМАТИЧЕСКИХ МЕМБРАН КЛЕТОК ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ Т.А. Гончарова, В.А. Воденеев, Ю.Ю. Гущина, Нижегородский госуниверситет им. Н.И. Лобачевского, Н. Новгород, факс (8312) 65-79-23, e-mail: kfr@unn.ac.ru В последнее время метод сканирующей зондовой микроскопии, в частности атомно-силовой (АСМ), вследствие высокой разрешающей способности достаточно широко применяется в биологии с целью изучения структурного состояния мембран клеток и отдельных биомолекул, дополняя традиционные методы исследования [1]. Одним из преимуществ метода является возможность изучения биологических препаратов в физиологических условиях (жидкости). Вместе с тем, целый ряд методических проблем все еще затрудняет использование АСМ в качестве рутинного метода визуализации биологических структур [1]. В представленной работе проведена оценка возможности применения метода АСМ для изучения структурного состояния препаратов плазматической мембраны (везикул плазматических мембран), а также мембран хлоропластов и митохондрий. Фракцию везикул плазматических мембран получали из клеток стеблей 10–12-дневных проростков тыквы по методу [2] с последующей очисткой в двухфазной системе декстран-полиэтиленгликоль. Препараты митохондрий и хлоропластов гороха выделяли методом дифференциального центрифугирования по Саламатовой [3] и Arnon [4]. АСМизмерения проводили в контактном режиме на воздухе на атомносиловом микроскопе Accurex 2100 (TopoMetrix). Использовали кантилеверы из нитрида кремния с радиусом кривизны около 50 нм. Для АСМизмерений препараты мембран фиксировали на покровных стеклах рас82 твором глутаральдегида до конечной концентрации 1%. Структурные особенности хлоропластов и митохондрий исследовали в норме, а также после воздействия in vivo гербицида параквата и теплового шока. С помощью атомно-силовой микроскопии получены трехмерные изображения везикул плазматических мембран, митохондрий и отдельных хлоропластов. Везикулы представлены замкнутыми образованиями, латеральные размеры которых 0.5–1.5 мкм. Размеры везикул сравнимы с таковыми, полученными на электронном микроскопе. Незначительное увеличение размеров может быть связано с особенностями приготовления препаратов для атомно-силовой микроскопии, а также с эффектом уширения, вызванным конечным радиусом кривизны зонда. Помимо оценки формы, метод АСМ позволил охарактеризовать структуру поверхности отдельной везикулы. Известно, что при стандартном выделении митохондрий в растворе сахарозы происходит полная деградация межмитохондриальных контактов. В связи с этим митохондрии представлены отдельными везикулами, размер которых 0.86–1.18 мкм в диаметре и 0.3–0.4 мкм в высоту. Тепловой шок не оказывал видимых воздействий на структуру митохондрий. Метод АСМ позволил оценить форму и размеры хлоропластов, гетерогенность полученной фракции. Размеры крупных хлоропластов составили 5–7 мкм. При исследовании топографии поверхности отдельного хлоропласта обнаружена складчатость поверхности со множеством локальных выпячиваний мембран. Аналогичные результаты были получены в работе [5] на электронном микроскопе путем реконструкции серийных срезов для получения трехмерного изображения. Таким образом, метод АСМ позволяет детально судить о структурированности поверхности, не требуя длительного приготовления образцов. При воздействии параквата методом АСМ не обнаружено достоверных изменений размеров органелл и существенных структурных изменений наружной мембраны. Таким образом, методом АСМ впервые получены трехмерные изображения хлоропластов, митохондрий и везикул плазматических мембран высших растений. Не отмечено существенных изменений структуры органелл после воздействия на растения внешних факторов. В процессе изучения структурных изменений мембран органелл в ответ на внешние воздействия (особенно in vitro) методом атомно-силовой мик- 83 роскопии более перспективным кажется исследование препаратов мембран в физиологических условиях, т.е. в растворе. Работа выполнена при финансовой поддержке программы "Фундаментальные исследования и высшее образования" и НОЦ СЗМ ННГУ. Литература 1. Яминский И.В., Бондаренко В.М. Липополисахариды, клеточные стенки, живые бактериальные клетки // В сб.: Сканирующая зондовая микроскопия биополимеров / Под ред. И.В. Яминского. М.: Научный мир, 1997. 88 с. 2. Hodges T.K., Leonard R.T. Purification of a plasma membrane-bound adenosine triphosphatase from plant roots // Methods Enzymol. 1974. V. 32. P. 392–406. 3. Саламатова Т.С. Выделение митохондрий из мезокотилей этиолированных проростков кукурузы // В сб.: Методы изучения мембран растительных клеток / Под ред. В.В. Полевой. Л., 1986. 192 с. 4. Arnon D.L., Allen M.B., Whatly Z.B. Photosynthesis by isolated chloroplasts. Genetic concept and comparison of frie photochemical reaction // Biochim. Biophys. Acta, 1956. V. 20. № 2. P. 449. 5. Силаева А.М., Ширяев А.И. Глобулярные образования растительной клетки // В сб.: Хлоропласты и митохондрии / Под ред. А.А. Шахов. М.: Наука, 1969. 344 с. 84