Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования
реклама
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В.Ломоносова Биологический факультет На правах рукописи КОТОВА ИРИНА БОРИСОВНА АНАЭРОБНЫЕ МИКРОБНЫЕ СООБЩЕСТВА, РАЗРУШАЮЩИЕ АЗОКРАСИТЕЛИ И ИХ ПРОИЗВОДНЫЕ Специальности 03.02.03 - микробиология 03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва, 2013 Работа выполнена на кафедре микробиологии биологического факультета ФГБОУ ВПО Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Нетрусов Александр Иванович Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор кафедры биотехнологии Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Российский химико-технологический университет имени Д.И.Менделеева Градова Нина Борисовна доктор биологических наук, зав. лабораторией инновационных технологий Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт проблем экологии и эволюции имени А.Н.Северцова РАН Ушакова Нина Александровна доктор биологических наук, профессор, зав. кафедрой земельных ресурсов и оценки почв факультета почвоведения Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова Яковлев Александр Сергеевич Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение Институт микробиологии имени С.Н.Виноградского РАН науки Защита состоится ___________________ 2013 года в 15 ч 30 мин на заседании диссертационного совета Д.501.001.21 при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, дом 1, МГУ, корп.12, Биологический факультет, ауд. М-1. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова Автореферат разослан _________________ 2013 г. Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Пискункова Нина Федоровна 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Азокрасители и аминоароматические соединения (ААВ) входят в состав многих товаров (красок, лаков, тканей, кожаных, пластиковых и типографских изделий, продуктов питания, лекарственных средств и парфюмерно-косметической продукции) и применяются практически во всех областях человеческой деятельности (Березин, Березин, 2001; Карпов, Белов, 2002). При производстве и использовании со сточными водами сбрасывается от 10 до 50% ААВ. Пищевые азокрасители требуют особо пристального внимания, так как они вступают в прямой контакт с человеческим организмом. Высокую токсичность и мутагенность ААВ связывают с преобразованием их в реакционноспособные интермедиаты, взаимодействующие с молекулами ДНК и гемоглобином крови и способствующие развитию раковых заболеваний у человека и животных (Weisburger, 1997; Pinheiro et al., 2004). Сохранение азокрасителями и ароматическими аминами своих свойств под действием факторов окружающей среды обусловило их повсеместное применение, однако именно это качество стало серьезным препятствием для разрушения их в сточных водах и в естественных местообитаниях. Анаэробные микроорганизмы способны осуществлять полную минерализацию ААВ с образованием незначительного количества биомассы, а проведение процесса в метаногенных условиях технологически более удобно, так как не требует внесения дополнительных акцепторов электронов в среду и позволяет получить на выходе полезный продукт - биогаз (Slokar, Majcen Le Marechal, 1998; Калюжный, 2004). В связи с этим первостепенное значение приобретает изучение метаногенных микробных сообществ, способных активно и стабильно осуществлять полную минерализацию ААВ. Состояние вопроса. К началу настоящего исследования в научной литературе имелось значительное количество работ, показывающих принципиальную возможность полной минерализации ААВ в анаэробных условиях (Bumpus, 1995), однако в большинстве случаев авторы ограничивались простой констатацией факта деструкции ААВ безотносительно к состоянию микробных культур и без подробного разбора этапов и промежуточных продуктов этого процесса. Данные литературы о специфичности микробных сообществ к ароматическим аминам весьма противоречивы, поскольку не выделены микроорганизмы, осуществляющие первые стадии деструкции и использующие сразу несколько изомеров аминоароматики. Наиболее изучены процессы разложения аминоароматических кислот (ААК) в нитрат- и сульфатредуцирующих условиях (Braun, Gibson, 1984; Tschech, Fuchs, 1987; Schnell, Schink, 1992). Для этих условий подробно разобраны пути расщепления ароматического кольца через бензоил-КоА-, резорциновый и флороглюциновый пути (Dutton, Evans, 1969; Heider, Fuchs, 1997; Carmona et al., 2009). Несмотря на то, что в очистных сооружениях используются анаэробные реакторы на основе именно метаногенных сообществ, на момент начала наших исследований работы по разложению в метаногенных условиях ААК были малочисленны (Tschech, Schink, 1988; Kalyuzhnyi et al., 2000), а пути превращений ААК на первых этапах процесса не были известны. В подавляющем большинстве работ, посвященных деструкции ААВ, авторы применяли метаногенные сообщества как «черный ящик» без учета видового состава и взаимодействий внутри него. На момент начала наших исследований данных об их микробном составе и свойствах входящих в них культур было крайне мало, сведения отрывочны и не систематизированы. Отсутствовали данные о влиянии этих ксенобиотиков на общую структуру анаэробных сообществ, превращающих их в биогаз, а также на каждую группу микроорганизмов неметаногенных стадий процесса. Не было сведений о таксономической принадлежности, метаболическом потенциале и функциях в сообществе выделенных из таких 3 консорциумов чистых культур. Таким образом, к началу работы микробиологическая конверсия ААВ в биогаз не была изучена комплексно, так как отсутствовала полная схема превращений с указанием интермедиатов и групп микроорганизмов, ответственных за каждую стадию процесса. Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было комплексное изучение метаногенной деструкции азокрасителей и аминоароматических кислот анаэробными микробными сообществами различного происхождения и изменений структуры этих сообществ при контакте с аминоароматическими ксенобиотиками. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: 1) Выделить из илов очистных сооружений и донных отложений природных водоемов активные и стабильные анаэробные микробные сообщества, способные к полной минерализации ААВ, и определить параметры культивирования, оптимальные для эффективного обесцвечивания азокрасителей и метаногенной деградации ААК; 2) Определить основные ароматические и линейные интермедиаты процесса конверсии ААВ в биогаз, вероятный механизм обесцвечивания азокрасителей и путь деградации ААК в активных сообществах; 3) Проследить изменения структуры сообществ по ходу процесса и во времени; 4) Определить компонентный состав типичного активного метаногенного сообщества и сравнить его с исходным илом; 5) Выделить чистые и ко-культуры микроорганизмов-членов сообществ и определить их роли в общем процессе биодеградации ААВ; 6) Создать искусственные микробные ассоциации из выделенных чистых и ко-культур для подтверждения их функций в сообществе и для проверки предложенной схемы трофической цепи; 7) Проверить выявленные закономерности на кишечных микробных сообществах млекопитающих и определить подходы к их использованию в качестве тест-систем для проверки пищевых азокрасителей. Научная новизна работы. Впервые проведено комплексное исследование процесса метаногенной конверсии ААВ, сопровождаемое изучением изменений структурно-функциональной организации осуществляющих его анаэробных микробных сообществ различного происхождения. Полученные в работе данные о возможности «подстраивания» метаболизма как отдельных микроорганизмов, так и микробных сообществ в целом к использованию неприродных соединений расширили наши познания о пределах существования живой материи. Сведения о поведении микробных сообществ при контакте с ксенобиотиками, которые можно рассматривать как стрессовые факторы, представили новую информацию о возможных направлениях сукцессионных изменений структуры сообщества и его активности. Впервые получены стабильные метаногенные сообщества, способные с высокой скоростью разлагать изомеры АБК и АСК. Выявлены основные закономерности функционирования сообществ при контакте с ААВ и факторы, влияющие на их активность. Показана принципиальная разница характеристик и оптимальных параметров для первой стадии метаногенной деструкции азокрасителей (обесцвечивания) и последующих этапов разложения образовавшихся ароматических аминов. Впервые определены основные ароматические и линейные интремедиаты процесса метаногенной деструкции ААК и предложена последовательность реакций, осуществляемая в сообществах. Независимо от происхождения сообществ продемонстрирована схожесть у них цепи реакций деструкции ААК, 4 наиболее соответствующей бензоил-КоА-пути. Впервые показана возможность деструкции ААК сообществами, выделенными из донных отложений естественных водоѐмов, которые ранее не подвергались массированному воздействию таких ксенобиотиков. Впервые установлено, что при преобразовании ААВ и их интермедиатов сообщества также меняют свою структуру. Из метаногенного сообщества выделен Citrobacter freundii WA1, осуществляющий не описанную ранее реакцию восстановления и одновременного дезаминирования ААК. Впервые показано наличие и индуцибельный характер данной активности у штаммов вида Citrobacter freundii, хранящихся в коллекции микроорганизмов каф. микробиологии биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова.Из активных метаногенных сообществ выделены два штамма Pseudomonas aeruginosa ASA2 и Tsaydam-5-ASA и впервые показана возможность опосредования химической реакции трансформации ААК биологической нитратредуцирующей активностью псевдомонад. Выделен и идентифицирован ряд чистых культур (Bacillus subtilis ЕР-АВА, Moraxella osloensis ЕР-АВА2, Lactobacillus paracasei ssp. paracasei L-34, L. rhamnosus L-43.1), участвующих в процессе деструкции ААК на стадии брожения. Впервые показано наличие дополнительной функции обесцвечивания азокрасителей у данных лактобацилл и C. freundii WA1. Установлена значимая роль факультативных и аэротолерантных анаэробов в стабилизации и функционировании метаногенных микробных сообществ, разрушающих ААВ. Практическая значимость работы. В процессе экспериментов с ААВ выработан алгоритм получения и исследования активных и стабильных анаэробных микробных сообществ, который может быть применен к другому классу сложных органических ксенобиотиков. Полученные в работе фундаментальные знания могут послужить основой для моделирования и «конструирования» микробных сообществ с заданными свойствами, а также для отслеживания судьбы ААВ в природе и их влияния на экосистемы различных уровней. Выделенные нами стабильно работающие высокоактивные микробные сообщества могут стать базой для создания биореакторов. Изучение процессов биологической и химической трансформации ААК, осуществляемых C. freundii WA1 и штаммами P. aeruginosa, поможет моделировать микропроцессы, происходящие в анаэробных илах при изменении физико-химических условий. Данные о сукцессионных изменениях структуры сообщества и его активности при контакте с ААВ должны учитываться при прогнозировании результатов загрязнения природных и искусственных систем. Исследование биодеградабельной способности сообществ, полученных из донных осадков природных водоемов, почвы, экскрементов животных и человека, и мониторинг изменений их структуры под влиянием ААВ может дать исходные сведения для построения более сложных моделей, а также возможность прогнозировать последствия загрязнения таких биотопов. Простая и быстрая регистрация в кишечных сообществах пищевых азокрасителей и интермедиатов их обесцвечивания и дальнейшей деструкции позволяет рекомендовать такие тесты для первичной проверки данных добавок. Установленные сдвиги в структуре кишечных сообществ при контакте с ААВ и токсичность азокрасителей и продуктов их распада по отношению к лактобациллам, составляющим важную часть нормальной микробиоты ЖКТ млекопитающих, позволяет предвидеть риски для здоровья при попадании пищевых азокрасителей в организм с пищей, напитками и лекарствами. Материалы диссертационной работы использованы автором для написания разделов в 9-ти учебниках (см. Список публикаций) и вошли в читаемые в МГУ имени М.В.Ломоносова курсы «Микробиология» и «Актуальные проблемы микробиологии». Они могут быть использованы в системе высшего профессионального образования в программах по микробиологии и биотехнологии естественнонаучных направлений. Апробация работы. 5 Результаты исследований были представлены на Симпозиуме INTAS “Microbial and cellular systems for Pharmacology, Biotechnology, Medicine and Environment” (Moscow, 26-30 May,1999), научной конференции «Проблемы экологии и физиологии микроорганизмов» (Москва, 21 декабря 1999); научной конференции «Горизонты физико-химической биологии» (Пущино, 28 мая – 2 июня, 2000); 9-м Международном симпозиуме по микробной экологии “Interactions in microbial world” (Амстердам, Нидерланды, 26-31 августа, 2001); 7-м Международном семинаре FAO/SREN «Анаэробное разложение для поддержания очистки сточных вод» (Москва, 19-22 мая, 2002); 2-м Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 10-14 ноября, 2003); Всероссийском симпозиуме «Биотехнология микробов» (Москва, 20-23 октября, 2004); Международной конференции “Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды” (Саратов, 14-16 сентября, 2005); Всероссийском симпозиуме с международным участием «Автотрофные микроорганизмы» (Москва, 21-24 декабря, 2005); 12-й Международной пущинской школеконференции «Биология – наука XXI века» (Пущино, 10-14 ноября, 2008); 4-й Всероссийской научно-практической конференции с международным участием “Экологические проблемы промышленных городов” (Саратов, 7-8 апреля, 2009); научной конференции “Экосистемы. Организмы. Инновации-11” (Москва, 24 июня, 2009); Всероссийском симпозиуме с международным участием «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов» (Москва, 24-27 декабря, 2009); 7-й Международной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Беларусь, Минск, 31 мая – 4 июня, 2010); 6-й школе-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 25-27 октября, 2010); 6-й Международной научно-практической конференции «Найновите постижения на европейската наука - 2011» (Болгария, София, 17-25 июня, 2011). Публикации. По результатам исследований опубликовано 47 работ, из них 10 статей в изданиях, рекомендованных ВАК, 10 глав в учебниках и учебных пособиях, 6 статей в сборниках и 21 тезис докладов. Положения, выносимые на защиту. 1) Анаэробная конверсия азокрасителей в биогаз, осуществляемая микробными сообществами, является многоэтапным процессом, включающим неспецифическую стадию обесцвечивания и специфическую стадию трансформации образовавщихся ароматических аминов. Эти стадии имеют различный механизм, регуляцию и отношение к параметрам культивирования. 2) Активные метаногенные сообщества независимо от происхождения осуществляют процесс деструкции ААВ сходным образом и имеют аналогичную структурно-функциональную организацию. 3) Контакт с ААВ приводит к сукцессии микробных сообществ, выражающейся в снижении общего числа клеток, уменьшении биоразнообразия и смене доминирования. 4) Факультативно анаэробные и аэротолерантные микроорганизмы играют значительную роль как в процессе метаногенной деструкции ААВ, так и в стабилизации микробного сообщества, разрушающего эти вещества. 5) Искусственные микробные сообщества с заданными свойствами могут быть созданы как из микроорганизмов, выделенных из активных консорциумов одинакового или разного происхождения, так и из коллекционных штаммов со свойствами, аналогичными присутствующим в консорциуме. 6) Прослеживание судьбы ААВ в кишечных микробных сообществах млекопитающих может быть использовано в качестве первичного теста при проверке пищевых азокрасителей на безопасность. 6 Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, описывающей материалы и методы исследований и излагающей полученные результаты и их обсуждение, заключения и выводов. Текст предваряется списком сокращений и завершается перечнем использованной литературы из 398 источников. Работа изложена на 431 странице, проиллюстрирована 137 рисунками и 43 таблицами. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Обзор литературы. В обзоре представлены данные о значимости ААВ в человеческой практике, рассмотрены преимущества и недостатки биологических способов удаления этих ксенобиотиков из отходов и стоков. Обобщены сведения о биохимических путях конверсии азокрасителей и ароматических аминов у микроорганизмов в анаэробных условиях и описаны микробные сообщества и чистые культуры микроорганизмов, способные к деструкции ароматических веществ. Рассмотрены данные о структурно-функциональной организации анаэробных сообществ, осуществляющих полную минерализацию других органических загрязнителей, и о влиянии на их активность различных параметров культивирования. Экспериментальная часть: материалы и методы. Биологический материал. В работе использованы илы очистных сооружений (Курьяновской станции аэрации, пивоваренного завода «Efes Pilsener» и свиноводческих комплексов), донные отложения естественных водоемов (озер Хилганта, Цайдам, Алгинское, термальных источников на реках Гарга, Алла, Сея, Белого моря и реки Джамна) и фекалии млекопитающих (лошади, верблюда, козы, оленя, свиньи, коровы и человека), характеризовавшиеся разными физико-химическими и микробиологическими параметрами. Пробы из содовых озѐр Бурятии любезно предоставлены д. б. н. проф. Б. Б. Намсараевым (Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН). Активные штаммы Methanosarcina barkeri (DSMZ 800) и Methanospirillum hungatei (DSMZ 864) любезно предоставлены Dr. C. Plugge и Dr. F. de Bock (кафедра микробиологии, Университет Вагенингена, Нидерланды). Основные субстраты и другие реактивы. В качестве субстратов использованы азокрасители Acid Orange 6 (АО6), Acid Orange 7 (АО7), Methyl Orange (МО) и Methyl Red (MR), широко применяемые в текстильном производстве, Tartrazine (Tn), Ponceau S (PS) и Sunset Yellow FCF (SY), активно используемые в пищевой, фармацевтической и косметической промышленности, и Azophloxine (Az), ранее являвшийся пищевым азокрасителем, а в настоящее время запрещенный к использованию в большинстве стран. Как предполагаемые интермедиаты разложения азокрасителей и их изомеры применяли 4-аминорезорцин, 1-амино2-нафтол, сульфаниловую кислоту, N,N-диметил-п-фенилендиамин (ДМФ), 1,4фенилендиамин (Aldrich, США), 2- и 3-аминобензойные кислоты (2- и 3-АБК), 4аминосалициловую кислоту (4-АСК) (Sigma, США), 4-АБК (Merck, ФРГ), 5-АСК (Merck, ФРГ и Janssen Chimical, Бельгия), а также 3-гидроксибензальдегид, бензальдегид (БА), бромэтансульфоновую кислоту (БЭСК, Sigma, США), бензиловый спирт (БС), 2- и 3гидроксибензиловые спирты (2- и 3-ГБС), 2- и 3-аминобензиловые спирты (Aldrich, ФРГ), бензойную (БК) и салициловую (СалК) кислоты, ацетонитрил, метанол, уксусную и серную кислоты (Merck, ФРГ), нитропруссид натрия, фенол, резазурин (Fluka, ФРГ), дрожжевой экстракт (BDH Chemicals, Великобритания) высшей степени очистки. Другие соли и реактивы производства различных отечественных и зарубежных фирм были максимально доступной степени чистоты (не ниже ч.д.а.). 7 Среды и условия культивирования. Для получения сообществ как базовую использовали минеральную среду №1 (Razo-Flores, 1997a, б; Kalyuzhnyi, Sklyar, 2000), содержащую 0,01% дрожжевого экстракта, микроэлементы и резазурин как индикатор анаэробных условий. Для выделения, очистки и роста чистых и ко-культур микроорганизмов применяли также минеральную среду № 2 (г/л): KH2PO4 - 0,38; Na2HPO4 - 0,53; NH4Cl - 0,30; NaCl - 0,30; CaCl2.2H2O - 0,11; MgCl2.6H2O - 0,10, с микроэлементами и витаминами. Для выделения чистых культур из сообществ использовали эти же среды с азокрасителями или ароматическими аминами как основными субстратами; МПА или БСА; MRS (как в жидком, так и в агаризованном варианте). В ряде случаев применяли внесение в среды ко-субстратов, экзогенных акцепторов электронов, фосфатного или карбонатного буфера, изменяли содержание дрожжевого экстракта, исключали NH4Cl. Ко-культуры WFS и WAC выращивали на глюкозо-пептонной среде. Среды для анаэробного культивирования кипятили для избавления от кислорода и разливали под током азота во флаконы, которые закрывали резиновыми пробками и зажимали алюминиевыми колпачками. Газовую фазу во флаконах дополнительно заменяли на требуемую – N2, H2, N2/CO2 (80/20), H2/CO2 (80/20). Конечное давление во флаконах составляло 160 кПа (~1,6 атм). Среды стерилизовали автоклавированием (1 ати), а раствор витаминов - фильтрованием. После стерилизации в некоторые среды в качестве восстановителя добавляли раствор Na2S.9H2O до конечной концентрации 0,278 г/л. рН среды устанавливали после стерилизации до 7,0-7,5 - для сообществ; 7,5 - для культивирования штамма WA1 и ко-культуры WSR; 6,8-7,0 - для роста M. barkeri, M. hungatei, а также для накопления метаногенов, бродильщиков и гомоацетогенов из сообществ. Базовое культивирование сообществ и чистых культур проводили при 30ºС. Для формирования анаэробных сообществ в жидкую анаэробную среду стерильными шприцами вносили 5-50% об/об гомогенизированной анаэробной пробы, а также ААВсубстраты и различные добавки, необходимые по условиям опытов, из их стерильных анаэробных концентрированных растворов. Аэробное культивирование осуществляли на качалке (180-220 об/мин). Накопительные культуры различных функциональных групп микроорганизмов получали по классическим микробиологическим схемам (Практикум по микробиологии, 2005). Для выделения чистых культур разведения культуральной жидкости высевали глубинным или поверхностным способом в агаризованные анаэробные среды в чашках Петри и пенициллиновых пузырьках или использовали метод предельных разведений. Посевы инкубировали в анаэробных боксах с газогенераторными пакетами Genbox (bioMerieux, Франция) или в термостате в аэробных условиях. Методы идентификакции микроорганизмов. Выделение и первичную очистку ДНК проводили модифицированным фенол-хлороформным методом (Маниатис и др., 1984; Брюханов и др., 2012). Полученные образцы ДНК дополнительно очищали на миниколонках "Wizard DNA clean-up system" (Promega Corporation, США) согласно инструкции производителя. Для амплификации полноразмерной копии гена 16S рРНК использовали пару праймеров 827F (5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3') и 1492R (5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3') согласно протоколу. Продукты ПЦР очищали от посторонних примесей при помощи электрофореза в 0,8% агарозе и на миниколонках “Wizard PCRPreps” (Promega, США) по инструкции производителя. Секвенирование проводили в двух направлениях с применением набора “BigDye Terminator v.3.1 Cycle Sequencing Kit” (Applied Biosystems, США) согласно рекомендациям производителя. Последовательности генов 16S рРНК сравнивали с помощью данных и программного обеспечения Ribosomal Database Project – RDP (http://rdp.cme.msu.edu). Редактирование последовательностей осуществляли с помощью редактора BioEdit (http://jwbrown.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html). Последовательности были выравнены с соответствующими последовательностями ближайших видов бактерий с помощью программы 8 CLUSTALW v 1.75 (Thompson et al., 1994). Построение бескорневых филогенетических деревьев исследуемых бактерий производили с помощью пакета программ TREECONW (http://bioc-www.uia.ac.be/u/yvdp/treeconw.html, Van de Peer, De Wachter,1994). Разделение фрагментов ДНК, полученных при ПЦР-амплификации выделенных из сообществ образцов с праймерами 338F (GC) (5′CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG-3′) и 518R (GC) (5'CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCGGTGBCAGCMGCCGCGGTAA3'), проводили методом ДГГЭ в 8% полиакриламидном геле, содержащем линейный градиент (30-70%) ДНК-денатурантов (мочевина и формамид), при 60°С и напряжении 70 В в течение 20 ч. После электрофореза гели окрашивали раствором красителя SYBR Gold (разведение 1:10000) 40 мин. Фрагменты ДНК, извлеченные из наиболее четких полос геля, реамплифицировали, используя универсальные праймеры 907R (5'CCGTCAATTCCTTTAAGTTT-3') и 515F (5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3'). Для идентификации чистых культур проводили стандартные цитологические и физиологобиохимические тесты согласно руководству Берджи (Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, 2001, 2005, 2009), а также API-тестирование (www.apiweb.biomerieux.com). Аналитические методы. Анализ содержания ААВ и НАДН в культуральной жидкости проводили спектрофотометрическим сканированием в диапазоне длин волн 200-600 нм на спектрофотометре Shimadzu UV-1202 (Япония). Концентрацию ароматических аминов определяли также с помощью ВЭЖХ, используя колонки с обращѐнной фазой Диасорб 130С16Т, 6 мкм (BCM, Россия) и Luna 5u С18 (2) 100 A (Phenomenex, США) в системе уксусная кислота - метанол, ChromSpher C18 2х10 cм (Chrompack, Varian Inc., CША) в градиенте смеси серной кислоты и ацетонитрила, Inertsil ODS3 2х10 cм (Chrompack, Varian Inc., CША) в градиенте смеси уксусной кислоты и ацетонитрила, по поглощению при 230-255 нм. Массспектрометрический анализ продуктов трансформации ААВ проводили с использованием газового хроматографа HP5890-II (Hewlett Packard, США), снабженного ТCD-детектором, и масс-спектрометра 5974A MSD (Hewlett Packard, США). Разделение компонентов пробы производили на капиллярной колонке Sil5CB-MS 25 м х 0,32 мм (Chrompack, Varian Inc., CША). Концентрации летучих продуктов определяли с помощью хроматографов CHROM – 5 (ЧССР), Chrompack СР9000 (Varian Inc., CША) с пламенно-ионизационным детектором на колонке SiL5 CB 25 м х 0,32 мм (Chrompack, Varian Inc., CША) и Кристалл 2000М (Россия) на микрокапиллярной колонке Zebron ZB- FFAP (США). Концентрацию органических кислот также определяли с помощью ВЭЖХ разделением на колонках Polyspher OAHY 3 см х 6,5 мм (Merck, ФРГ) и Varian Metacarb 67H (300 мм) (Merck, Германия). Концентрацию аминокислот определяли с помощью ВЭЖХ в обращенных фазах с разделением на колонке Inertsil ODS2 (Chrompack, Varian Inc., CША), регистрируя поглощение при 436 нм с помощью детектора ThermoQuest (США). Определение содержания лактата проводили электрохимически с использованием биосенсоров первого поколения на основе L-лактатоксидазы в проточноинжекционной ячейке (www.rusens.com). Аммоний-ион в культуральной жидкости накопительных культур определяли по стандартному методу Несслера (Лурье, 1984) и методу Фосетта и Скотта (Fawcett, Scott, 1960) с нитропруссидом натрия. Сульфид-ион детектировали по методу Трюпера и Шлегеля (Truper, Schlegel, 1964) с ДМФ. Определение концентрации нитратов в жидкой фазе проводили с помощью спектрофотометрического метода с хромотроповой кислотой, а нитритов - с α-нафтиламином (Лурье, 1984), используя спектрофотометр Shimadzu UV-1202 (Япония). Нитрат, нитрит, сульфат, сульфит и тиосульфат анализировали также с помощью ВЭЖХ на аналитической колонке Ionopac AS9-SC (Chrompack, Varian Inc., CША). Концентрацию органических веществ в жидкой фазе определяли по ХПК, выявленному бихроматным методом (Лурье, 1984). Анализ газов проводили на хроматографе ЛХМ 8 МД – модель 3 с катарометром (Россия), на колонках, 9 заполненных порапаком – QS, и на хроматографе Кристалл 2000М (Россия) с катарометром и набивной колонкой, неподвижная фаза - уголь, с предварительным измерением давления во флаконах с помощью манометра WIKA (Германия). Содержание водорода, метана и СО2 измеряли также на газовом хроматографе Shimadzu, модель GC-2014 (Япония), содержащем 2 колонки и снабженном TCD-детектором. Разделение водорода и метана проводили на колонке Molsieve 2 м х 3 мм, температура детектора 150ºС, газ-носитель – аргон. Концентрацию СО2 измеряли на том же хроматографе, снабженном TCD-детектором, температура детектора 130ºС, газ-носитель – гелий. Разделение производили на колонке Poraplot Q СЗ7554, 25 м х 0,53 мм (Chrompack, Varian Inc., CША). Для определения скорости роста штаммов измеряли оптическую плотность проб культуральной жидкости на однолучевом спектрофотометре LKB Ultraspec II (Швеция). Рост молочнокислых бактерий оценивали нефелометрически с использованием фотоэлектрического колориметра-нефелометра ФЭКН-57 (Россия). В ряде случаев количество клеток определяли с помощью рассевов на агаризованные среды по Коху. Содержание белка в среде анализировали методом Бредфорд (Bradford, 1976). Концентрацию биомассы оценивали по количеству БВБ (Скляр, 1987). Общую протеолитическую активность определяли методом Ансона (Anson, 1935; Hagihara et al., 1958) Микроскопические методы. Сравнительный анализ морфологического состава анаэробных сообществ и приблизительную оценку численности клеток проводили с помощью световой и электронной сканирующей микроскопии (Практикум по микробиологии, 2005). Препараты живых клеток просматривали с использованием фазового контраста на микроскопе Leica DMR HC (Wetzlar, ФРГ) со встроенной цифровой камерой Leica DC 250. Фиксированные в пламени горелки и окрашенные препараты просматривали в световом микроскопе «Микмед-1» (ЛОМО, Россия) и Биолам-2 (ЛОМО, Россия) с масляной иммерсией при общем увеличении 900-1000х. Фотографирование препаратов и колоний на агаре производили фотоаппаратом «Canon IXUS 70» в автоматическом режиме. Зафиксированные в 2,5% растворе глутарового альдегида и обезвоженные образцы, закрепленные на предметных столиках, напыляли порошком золота и просматривали на электронных сканирующих микроскопах “AMRAY 1830I” (США) и “Hitachi S-405A”(Япония). Экспериментальная часть: результаты и обсуждение. Деструкция азокрасителей метаногенными микробными сообществами из илов очистных сооружений. На первом этапе работы использовали пробы илов из очистных сооружений пивоваренного завода «Эфес Пилснер» (ЕР) и Курьяновской станции аэрации (КСА), которые перерабатывали смеси загрязнителей, состояли из большого числа видов микроорганизмов различных функциональных групп и были способны к метаногенному разложению органических веществ. Для работы выбрали четыре технических (АО6 и 7, МО и MR) и два пищевых (Tn и PS) азокрасителя. Метаногенные консорциумы микроорганизмов были получены внесением в среду № 1 10% по объему инокулята и растворов субстратов до конечной концентрации 50-300 мг/л. В анаэробных условиях культивирования микробный консорциум КСА обесцвечивал все 6 веществ практически без лаг-периода, но с разной скоростью, убывающей в ряду: MR > PS > MO > AO7 > Tn ≈ AO6. Микробное сообщество ЕР гораздо медленнее фрагментировало PS (MR > MO > AO7 > AO6 > PS) и не разлагало в условиях опыта Tn (рис. 1). Обесцвечивание не содержащего сульфо-группу азокрасителя MR (1) привело к образованию ДМФ и 2-АБК, после чего в консорциуме КСА началось выделение метана (рис. 2А) как за счет деметилирования ДМФ до 1,4-фенилендиамина (2), так и за счѐт последующей полной минерализации 2-АБК (3). 1,4-фенилендиамин был устойчив к дальнейшему разложению и накапливался в культуральной жидкости. 10 Рис. 1. Обесцвечивание азокрасителей микробными сообществами КСА и ЕР в анаэробных условиях. В сообществе ЕР полное обесцвечивание MR приводило к появлению ДМФ и 2-АБК (рис. 2Б), однако далее в течение 90 сут опыта они накапливались, а выделения метана не происходило. В процессе обесцвечивания AO6 в обоих консорциумах наблюдали постепенное накопление метана (рис. 3А), очевидно, за счет минерализации 4-аминорезорцина (5), появления которого следовало ожидать исходя из структурной формулы азокрасителя (4), но который не был обнаружен. COONa COONa CH3 N N CH3 4[H] NH2 N + H2N CH3 (1) H3C N CH3 CH3 NH2 COOH 4[H] + 2CH4 NH2 + 5H2O (2) N NH2 NH2 3.5CH4 + 3.5CO2 + NH3 (3) Рис. 2. Разложение MR консорциумом КСА (А) и изменение спектра культуральной жидкости сообщества ЕР с MR (Б). OH HO OH N N SO3Na 4[H] HO NH2 + H2N SO3Na (4) NH2 OH + 4H2O 3CH4 + 3CO2 + NH3 OH (5) 11 Рис. 3. Разложение АО6 и АО7 анаэробными консорциумами (на примере ЕР). После полного обесцвечивания АО7 (6) обоими сообществами концентрации образовавшихся 1амино-2-нафтола и сульфаниловой кислоты практически не изменялись, а накопление метана было незначительно (рис. 3Б). OH OH N N SO3Na 4[H] NH2 + H2N SO3Na (6) H3C N (7) H3C N N SO3Na 4[H] H3C N NH2 + H2N SO3Na H3C Рис. 4. Разложение МО анаэробными консорциумами (на примере ЕР). Под действием обоих анаэробных консорциумов MO восстанавливался (7) с образованием ДМФ и сульфаниловой кислоты, не разлагавшейся в течение 90 сут культивирования. Выделение метана регистрировали одновременно с образованием устойчивого 1,4-фенилендиамина в процессе деметилирования ДМФ (рис. 4). Количество метана в сообществах, где он образовывался, соответствовало теоретически рассчитанному по уравнениям полной минерализации разлагаемых интермедиатов. Под действием КСА фрагментация PS проходила постепенно с изменением цвета с малинового на оранжевый, а затем среда становилась бесцветной. В качестве интермедиата фиксировали образование сульфаниловой кислоты, со временем накапливающейся в среде. После полного обесцвечивания наблюдали активное образование биогаза, очевидно, за счет разложения не идентифицированных нами продуктов (рис. 5А, Б). Существенное расхождение теоретически рассчитанных (8 ммоль) и экспериментально определѐнных (3,8 ммоль) количеств образовавшегося метана свидетельствовало о неполноте их разложения. Сообщество ЕР разрушало PS медленнее, но с образованием тех же интермедиатов, однако без выделения метана. 12 Рис. 5. Предполагаемая схема распада PS (А) и его разложение под действием анаэробного метаногенного консорциума КСА (Б). Обесцвечивание Tn консорциумом КСА приводило к образованию сульфаниловой кислоты, которая накапливалась в культуральной жидкости, и метана за счет разложения неидентифицированных интермедиатов (рис. 6). Из-за их неполной минерализации полученное экспериментальным путѐм количество метана (3,5 ммоль) не соответствовало теоретически рассчитанному (5 ммоль). Микробное сообщество ЕР не обесцвечивало Tn в течение 90 сут. Таким образом, все исследованные азокрасители (кроме Tn в случае ЕР) в анаэробных условиях эффективно обесцвечивались под действием метаногенных сообществ микроорганизмов (см. рис. 1), в то время как в аэробных условиях только MR подвергался разложению консорциумом КСА (рис. 7). Рис. 6. Предполагаемая схема распада Tn (А) и его разложение под действием консорциума КСА (Б). Микробное сообщество КСА в целом показало более высокую активность обесцвечивания азокрасителей и образования метана, чем консорциум ЕР, однако ни в одном сообществе не была достигнута полная конверсия азокрасителей в биогаз. Легче всего оба консорциума обесцвечивали MR, не содержащий сульфо- и гидроксильных заместителей и имеющий одну азосвязь. Рис. 7. Аэробная инкубация сообществ с азокрасителями (на примере MR, Tn и PS). Скорость обесцвечивания росла в интервале значений концентраций азокрасителей 0-2 мМ (для PS - до 1 мМ) и при повышении температуры культивирования в диапазоне 20-55оС. При содержании инокулята 5-10 об.% ее значение становилось практически постоянным, а оптимальные значения рН находились в 13 диапазоне 6,5-8,0. При этом учитывали, что обесцвечивание является только первой стадией биодеструкции азокрасителя и ее ускорение необязательно должно повысить скорость всего процесса полной конверсии субстрата в биогаз. Рис. 8. Изменение скорости обесцвечивания азокрасителей при внесении в среду сообщества ЕР экзогенных акцепторов электронов и этанола. В опытах с более простыми по химическому строению MR, АО6 и 7 и МО и консорциумом ЕР, заведомо обладающим как сульфат-, так и нитратвосстанавливающей активностями, показано, что внесение в среду 2 мМ сульфата и особенно нитрата резко замедляло процесс обесцвечивания (рис. 8А) за счет эффективной конкуренции с азогруппами за восстановительные эквиваленты. Добавление в среду 4 мМ этанола в качестве доступного косубстрата (донора электронов) увеличивало скорость обесцвечивания азокрасителей (рис. 8Б), так как при его потреблении анаэробным сообществом синтезировались дополнительные восстановительные эквиваленты. Рис. 9. Обесцвечивание азокрасителей анаэробной культуральной жидкостью, освобожденной от клеток (А); путем химического восстановления 0,5 мМ сульфида (Б) или 0,5 мМ НАДН (В) и сравнение средних скоростей обесцвечивания анаэробным консорциумом и его метаболитами (на примере сообщества ЕР и AO6, КЖ - культуральная жидкость). Обесцвечивание структурно различных азокрасителей анаэробными сообществами разного происхождения практически без лаг-периода, в том числе консорциумом из аэробного активного ила КСА в анаэробных условиях, показывает неспецифичность этого процесса. Сохранение способности анаэробных сообществ к обесцвечиванию азокрасителей на фоне полного подавления метаногенеза с помощью БЭСК говорит о второстепенной роли ацетокластических метаногенов в процессе восстановления азосвязей. Отсутствие 14 обесцвечивания азокрасителей автоклавированным сообществом подтвердило, что адсорбция не является фактором, существенным для процесса, и для его прохождения необходимы жизнеспособные клетки. Оценка токсического влияния исходных азокрасителей и образовавшихся в результате их обесцвечивания ароматических аминов по изменению ацетокластической метаногенной активности анаэробного сообщества (табл. 1) отчасти подтвердила, что анаэробное восстановление может представлять собой неспецифичную реакцию детоксикации (Donlon et al., 1995; Razo-Flores, 1997), так как только 1-амино-2-нафтол и 1,4-фенилендиамин оказались более токсичными, чем исходный азокраситель. В то же время, между скоростями обесцвечивания азокрасителей в анаэробных условиях (см. рис. 1, MR > PS > MO > AO7 >Tn ≈ AO6) и их токсичностью (табл. 1, MO > AO7 > MR > PS > AO6 > Tn) не наблюдали корреляции, поэтому эта характеристика азокрасителя не может быть напрямую использована для предсказания эффективности его обесцвечивания анаэробным сообществом. Восстановление активности ацетокластического метаногенеза после многократной стерильной отмывки консорциума ЕР от 2 мМ (10-тикратного уровня IC50) самого токсичного из азокрасителей MO послужило косвенным свидетельством преимущественно внеклеточной локализации первой стадии деструкции азокрасителя. Еще одним доказательством восстановления азосвязи вне клеток явилось полное обесцвечивание азокрасителей с образованием соответствующих ароматических аминов бесклеточной культуральной жидкостью, содержащей все продукты жизнедеятельности микробных сообществ (рис. 9А) без дальнейшей конверсии аминов и выделения метана. Таблица 1. Токсичность азокрасителей и ароматических аминов в анаэробных условиях. АзоIC50 азоIC50 образовавшихся ароматических аминов, мM краситель красителя, мM Сульфаниловая ДМФ 1,4-фенилендиамин MO 0,25 кислота 2,02 0,51 Не токсична до 2,0 Сульфаниловая 1-амино-2-нафтол AO7 0,90 кислота 0,54 Не токсична до 2,0 2-АБК ДМФ 1,4-фенилендиамин MR 0,99 Не токсична до 2,0 2,02 0,51 Сульфаниловая Неидентифицированный(е) PS 2,00 кислота ароматический(е) интермедиат(ы) Не токсична до 2,0 н.о. Сульфаниловая 4-аминорезорцин AO6 2,50 кислота >2,0 Не токсична до 2,0 Сульфаниловая Неидентифицированный(е) Tn >2,50 кислота ароматический(е) интермедиат(ы) Не токсична до 2,0 н.о. Примечание: токсическое воздействие ароматических аминов оценивали вплоть до концентрации 2,0 мМ, н.о. - не определяли. Метаболиты, участвующие в обесцвечивании азокрасителей, отличались термонестабильностью, так как подвергнутые автоклавированию микробные консорциумы не восстанавливали азосвязь. Для выявления конкретных соединений, участвующих в разрыве азосвязей, проверили возможность восстановления азокрасителей (150, 75 и 0,75 мг/л) в бесклеточной системе. В присутствии сульфида (после небольшого лаг-периода, рис. 9Б) или НАДН (рис. 9В) все исследуемые азокрасители полностью обесцветились с образованием 15 ароматических аминов. Однако поскольку концентрации сульфида и НАДН, измеренные в культуральной жидкости анаэробного консорциума, были очень низкими (<0,05 мМ и <20 мкМ, соответственно), то эти соединения нельзя считать основными агентами восстановления азокрасителей, хотя определѐнный вклад в обесцвечивание они могли вносить (рис. 9Г). При взаимодействии рибофлавина и AO6 в бесклеточной системе обесцвечивания последнего не наблюдали, в то время как добавление рибофлавина даже в низкой концентрации (15 мкМ) в анаэробный консорциум привело к увеличению скорости обесцвечивания азокрасителя практически в 10 раз. Однократное добавление рибофлавина способствовало сохранению повышенной скорости фрагментации АО6 на протяжении последующих циклов обесцвечивания азокрасителя, что говорит о многократном участии (обратимом окислениивосстановлении) рибофлавина или его производного в качестве переносчика. На основании полученных данных нами предложен гипотетический механизм анаэробного восстановления азокрасителей (рис. 10). В соответствии с ним азосвязь красителя расщепляется под действием восстановленных веществ-медиаторов, являющихся продуктами метаболизма микробного сообщества в анаэробных условиях. При этом роль микробных клеток заключается в постоянном пополнении запаса таких веществ за счет ферментативного восстановления их окисленной формы. Деструкция ароматических аминов метаногенными микробными сообществами из илов очистных сооружений. В случае использования ароматических аминов-интермедиатов восстановления азокрасителей как исходных субстратов в анаэробных условиях полной минерализации до биогаза подвергались 4-аминорезорцин, 1-амино-2-нафтол и 2-АБК (рис. 11). Характерной особенностью процесса их конверсии в биогаз являлось наличие лаг-периода, длительность которого для 4-аминорезорцина составила 3-4 сут, для 2-АБК - 14 сут и для 1амино-2-нафтола - 22 сут. Интересно, что при обесцвечивании АО7 образующийся 1-амино-2нафтол практически не подвергался дальнейшей деструкции. Количество выделившегося метана во всех случаях в целом соответствовало теоретически рассчитанному по уравнениям полной минерализации для 4-аминорезорцина (5), 2-АБК (3) и 1-амино-2-нафтола (8). Было также отмечено увеличение концентрации обязательного продукта - аммиака (аммония). SO3H NH2 + 4H2O + H+ OH + 8H2O 2.5CH4 + 3.5CO2 + NH4+ + H2S 5.5CH4 + 4.5CO2 + NH3 (8) (9) NH2 При использовании в качестве исходного субстрата сульфаниловой кислоты анаэробные сообщества после лаг-периода длительностью 25 сут осуществляли ее метаногенную биодеградацию на 60% за 40 сут (рис. 12А), тогда как при обесцвечивании азокрасителей она накапливалась в среде и дальнейшей минерализации не подвергалась. Экспериментальный баланс (1,1 мМ СН4) для конвертированного в биогаз количества сульфаниловой кислоты (0,5 мМ) согласуется с теоретически рассчитанным по уравнению 9 (1,25 мМ СН 4), хотя по данным литературы сульфосодержащие ароматические амины вообще не способны разлагаться в бескислородных условиях (Tan, 2001). ДМФ и 1,4-фенилендиамин не разлагались анаэробными сообществами в течение 360 сут инкубации. ДМФ, подвергавшийся деметилированию в консорциумах, обесцвечивающих азокрасители МО и MR, при использовании в качестве исходного субстрата оказался устойчивым и накапливался в культуральной жидкости. Вероятно, при обесцвечивании этот интермедиат образуется постепенно, в небольших количествах, не оказывающих ингибирующего действия на микроорганизмы, осуществляющие деметилирование. 16 Рис. 10. Гипотетический механизм обесцвечивания азокрасителей: Мвосст., Мокисл. - окислительно-восстановительный(е) медиатор(ы), восстановленный(е) и окисленный(е), соответственно, РФ - рибофлавин, СР - сульфатредуктор. Сравнительная оценка показателей токсичности каждого амина, определенная по степени снижения активности ацетокластического метаногенеза, показала (см. табл. 1), что биоразлагаемость не вполне коррелирует с этой характеристикой. Рис. 11. Деструкция ароматических аминов (А) и образование метана (Б) анаэробными сообществами (на примере ЕР). Так, полной метаногенной конверсии подвергался достаточно токсичный 1-амино-2-нафтол, в то время как нетоксичная сульфаниловая кислота разлагалась только на 60%. Это еще одно подтверждение «неуниверсальности» такого метода определения токсичности и свидетельство возможного ингибирования аминами активности микроорганизмов неметаногенных стадий процесса. Рис. 12. Неполная конверсия сульфаниловой кислоты в биогаз в анаэробном метаногенном сообществе (А); разложение 2-АБК и устойчивость сульфаниловой кислоты в аэробных условиях (Б). В то же время, в аэробных условиях сообщество из активного ила КСА не разлагало сульфаниловую кислоту в течение 25 сут (рис. 12Б), хотя в литературе есть данные о ее деструкции в аэробных условиях (Tan, 2001). 4-аминорезорцин, 1-амино-2-нафтол, ДМФ и 1,417 фенилендиамин в аэробных условиях через несколько часов подвергались автополимеризации с образованием темного нерастворимого осадка, поэтому их анаэробная деструкция, вероятно, является единственным путем минерализации этих соединений. Рис. 13. Микроскопическая картина исходного ила КСА (А) и консорциума КСА с PS (Б), 1000х. Только 2-АБК полностью минерализовалась под действием аэробного консорциума (рис. 12Б), что соответствует данным других авторов (Balba, Evans, 1980; Lochmeyer et al., 1992). Об этом свидетельствовало также снижение значения ХПК культуральной жидкости в конце опыта на величину 0,39 г ХПК/л при начальной концентрации 2-АБК в среде 0,3 г ХПК/л. Использование безаммонийной среды в наших экспериментах привело к существенному сокращению (в 2-3 раза) лаг-периодов разложения 2-АБК и 4-аминорезорцина,тогда как 1амино-2-нафтол в этих условиях не разлагался даже через 120 сут. Нехватка азота при сохранении всех остальных параметров опыта не изменила скорость и глубину частичной конверсии сульфаниловой кислоты и не привела к деградации устойчивых ДМФ и 1,4-фенилендиамина. Рис. 14. Соотношение морфотипов в исходном иле ЕР и в сообществах с МО, MR, PS (обесцвечивание), 2АБК (полная конверсия в биогаз), сульфаниловой кислотой (неполная конверсия) и ДМФ (отсутствие разложения). Добиться практически полной конверсии сульфаниловой кислоты в биогаз удалось путем внесения дополнительной порции анаэробного инокулята (10% от объема исходного 18 биоматериала) и снижения начальной концентрации субстрата с 0,8 до 0,5 мМ при инкубации сообщества на безаммонийной среде. Вероятно, за счет уменьшения концентрации субстрата было снято ингибирование всех стадий процесса, а отсутствие аммония стимулировало отщепление аминогрупп и дальнейшие превращения субстрата. Накопление конечных продуктов (1,35 мМ СН4, 0,6 мМ NH4+ и 0,4 мМ H2S) соответствовало теоретически рассчитанному (1,25 мМ СН4, 0,5 мМ NH4+ и 0,5 мМ H2S), причем концентрация сульфида не превышала 0,48 мМ и не являлась ингибирующей для анаэробных микроорганизмов (Калюжный и др., 1991). Присутствие сульфата в среде не привело к изменениям биодеградабельности ДМФ и 1,4фенилендиамина, тогда как внесение 3 мМ нитрата имело следствием исчезновение субстратов из культуральной жидкости и образование темного нерастворимого осадка вследствие автополимеризации. При полной или частичной конверсии 2-АБК, 4-аминорезорцина, 1-амино-2-нафтола и сульфаниловой кислоты в качестве промежуточного продукта фиксировали только следовые количества ацетата. Морфологические особенности микробных консорциумов, разрушающих азокрасители и ароматические амины. Определение морфологического состава анаэробных микробных сообществ при добавлении азокрасителей в концентрации 0,75 мМ и приблизительную оценку численности микробных клеток проводили с помощью световой и сканирующей электронной микроскопии. Несмотря на ограниченность этого метода оценки, его применение позволило нам судить о качественных и количественных изменениях состава исследуемых сообществ. В исходных илах выявлено 14 основных морфотипов, из них 11 типов палочек и 3 типа кокков. В сообществах с азокрасителями и ароматическими аминами количество морфотипов и общая численность клеток снижается (рис. 13). При этом для всех случаев контакта с ААВ наблюдали уменьшение доли преобладающих в исходных илах длинных палочек с тупыми концами, расположенных главным образом в цепочках, и относительное увеличение доли кокковидных клеток, особенно резкое в сообществах с устойчивыми соединениями (рис. 14). Независимо от степени деградации аминов в их присутствии число ослизненных и поврежденных клеток в сообществах было повышено на 30-50% как по сравнению с исходными илами, так и по сравнению с консорциумами, разлагающими азокрасители. Чем медленнее происходило разложение азокрасителя, тем более явным «обедняющим» изменениям подвергалось сообщество. Эти же параметры в сообществах при контакте с ароматическими аминами коррелировали с биоразлагаемостью и ацетокластической токсичностью соединений. Таким образом, внесение в анаэробные метаногенные сообщества ААВ привело к визуально наблюдаемым количественным и качественным изменениям, т.е. эти вещества оказывали селективный эффект на состав консорциумов. Деструкция изомеров АБК и АСК микробными сообществами из илов различного происхождения. Для детального исследования этапов преобразования ААВ в биогаз и изменений в структуре консорциумов выбрали аминоароматические монокарбоновые кислоты с одной аминогруппой (ААК): 2-, 3-, 4-АБК и 4-, 5-АСК. Эти соединения являются интермедиатами обесцвечивания многих азокрасителей (MR, Mordant Yellow, Mordant Orange, Siriuslichtbraun, Siriuslichtgelb и др.) и имеют важное значение как самостоятельные загрязнители стоков и отходов нефтехимической и фармацевтической промышленности. Также расширили спектр источников метаногенных сообществ, включив в работу мезофильный флокулярный ил очистных сооружений стоков свиноводческих комплексов (СК) и донные отложения природных водоемов с разными физико-химическими параметрами (см. Биологический материал). Активные сообщества получали путем длительной инкубации биоматериала на среде № 1 в анаэробных условиях с одним из изомеров ААК, варьируя три температуры (20, 30 и 55°С). Начальный pH среды для каждого ила соответствовал pH 19 исходного местообитания. В консорциумах из донных осадков термальных источников рек Алла, Сея и Белого моря за счет адсорбции (что было показано в опытах с автоклавированной биомассой) концентрация субстрата падала на 10-20% в течение 20-50 сут, однако разложения ААК не происходило. В сообществах из донных осадков термальных источников реки Гарга и озера Алгинское содержание ААК на 15-50% изменялось вследствие неполной деструкции, так как регистрировали следовые количества Н2 и ЛЖК (ацетата, пропионата, бутирата), однако ни образования биогаза, ни дальнейшего потребления субстрата не наблюдали в течение последующих 2-х лет. Потребление субстрата с выделением биогаза было отмечено только в консорциумах, представленных в табл. 2. Во всех микробных ассоциациях независимо от степени их активности даже при принудительном подщелачивании в процессе культивирования рН самопроизвольно устанавливался в интервале значений 6,5-8,0. Несмотря на разнообразие использованных нами сочетаний температуры инкубации и кислотности среды, оптимальным для процесса биодеградации выбранных субстратов оказался режим культивирования при температуре 30оС и околонейтральном (6,5-7,5) значении рН. Не удалось получить ни одной активной и стабильной ассоциации при пониженной или повышенной температурах и высоком уровне рН. Таблица 2. Сообщества, показавшие потребление ААК. Вариант Параметры культивирования, субстрат Лаг-период активности биоразложения (сут) Средняя скорость деградации (мМ/сут) в цикле потребления субстрата* tо = 30оС, рН = 6,5-7,5, 280-100 0,60-0,80 АБК tо = 30оС, рН = 6,5-7,5, 4300 0,15 АБК СК tо = 30оС, рН = 6,5-7,5, 5150-200 0,50 АСК tо = 55оС, рН = 6,5-7,5, 30,50 (автополимеризация 250 АБК субстрата во 2-ом цикле) о о t = 30 С, рН = 6,5-7,5, 210 0,03 АБК КСА tо = 30оС, рН = 6,5-7,5, 410-14 0,03 АБК tо = 30оС, рН = 6,5-7,5, 2ЕР 7-14 0,08 АБК Х t=30ºC, рН=7,0, 2-АБК 50 0,02 t=30ºC, рН=7,0, 2-АБК 35 0,22 t=30ºC, рН=7,0, 3-АБК 176 0,03 Ц t=30ºC, рН=7,0, 4-АБК 176 0,04 t=30ºC, рН=7,0, 5-АСК 113 0,07 t=30ºC, рН=7,0, 2-АБК 54 0,04 Дж t=30ºC, рН=7,0, 4-АБК 90 0,01 t=30ºC, рН=7,0, 5-АСК 176 0,02 *цикл потребления субстрата - промежуток времени от внесения субстрата до момента его полного использования. В активных консорциумах на начальном этапе всегда наблюдали лаг-период (7-300 сут), в течение которого могли регистрироваться незначительные колебания концентрации субстрата в 20 среде, однако активного его разрушения не происходило. В зависимости от источника биоматериала различались время адаптации к ААК (см. табл. 2) и длительность цикла его потребления, однако природа и последовательность появления промежуточных и конечных продуктов были сходны во всех активных сообществах (рис. 15). В новом цикле потребления наблюдали увеличение содержания бензоата, аммония и метана, однако уровень ацетата оставался постоянно низким. Дальнейшее использование того же субстрата активными консорциумами обычно протекало без лаг-периодов и с увеличенной скоростью (сокращалась длительность цикла потребления), причем Н2, ЛЖК и спирты уже не регистрировались. В целом, наиболее высокие показатели активности и стабильности биодеградации показали микробные сообщества, полученные из илов очистных сооружений, вероятно потому, что эти илы были изначально адаптированы к высоким концентрациям смесей органических веществ, обладали исходным высоким биоразнообразием микроорганизмов и существовали при температуре и значениях рН, наиболее приближенных к тем, что оказались оптимальными для процесса биодеструкции. Рис. 15. Типичная картина появления промежуточных и конечных продуктов при биодеградации ААК на примере сообщества СК, разрушающего 2-АБК (стрелками отмечено время регистрации следовых количеств водорода, ЛЖК и спиртов – пропионата, ацетата, бутирата, этанола и изопропанола). Не удалось получить ни одного активного и стабильного консорциума, разрушающего 4-АСК. Наиболее биодеградабельным субстратом для микробных ассоциаций различного происхождения оказалась 2-АБК. В дальнейших исследованиях основной упор был сделан на активные и стабильные сообщества СК (2-, 4-АБК и 5-АСК), КСА (2- и 4-АБК), ЕР (2-АБК) и Ц (2-АБК и 5-АСК). Показано, что скорости использования субстрата и образования метана возрастают линейно при увеличении начальной концентрации ААК в среде от 0 до 1200 мг/л (от 0 до 8,759 мМ). Микробное сообщество в варианте с максимальным содержанием субстрата было представлено более крупными и рыхлыми хлопьевидными агрегатами, а с минимальным - мелкими частицами, лежащими плотным слоем, тогда как по литературным данным для других органических веществ в системах с высокой концентрацией субстратов, напротив, развиваются компактные и более мелкие агрегаты (Thaveesri et al., 1995; Picioreanu et al., 1998; 1999). При анализе микроскопической картины отмечено примерно одинаковое соотношение морфотипов клеток во всех опытных вариантах с преобладанием скоплений мелких кокков и мелких прямых палочек. Отсутствие ряда морфотипов исходных илов объяснялось, по-видимому, их высокой чувствительностью даже к небольшим концентрациям ААК. Снижение биоразнообразия в сообществе под действием ААК может свидетельствовать об их токсичности для микроорганизмов, причем поскольку деструкция субстрата и метанообразование даже увеличивались, эти члены сообщества скорее всего выполняют вспомогательные функции. Потребление субстрата и выделение биогаза существенно замедлены при инкубации активных сообществ в условиях перемешивания (220 об/мин) по сравнению с культивированием в статичных условиях, что отмечено и в литературе (Junnarkar et al., 2006). 21 Параллельные микроскопические наблюдения показали, что в статичных условиях образование структурированных агрегатов происходит намного быстрее и они крупнее, чем при перемешивании. Установлено, что при увеличении количества биомассы в среде активность биодеградации также повышается, причем в отличие от обесцвечивания азокрасителей в случае разложения ААК «насыщение» не обнаружено вплоть до 50%-ного содержания биологического материала в среде. Не обнаружено прямой корреляции между концентрацией белка, степенью биоразнообразия исходного биоматериала и активностью биодеградации ААК у сообществ из него. Высокое содержание белка может отражать наличие бóльшего количества микроорганизмов, не принимающих непосредственного участия в процессе биодеградации. В то же время, наибольшей стабильностью обладали сообщества из осадков с богатым видовым разнообразием (СК и КСА), так как по мнению группы авторов (Morales et al., 1996) более разнообразные сообщества могут иметь бόльшую устойчивость к внешним воздействиям. Прирост биомассы, определенный по общему белку через 10 циклов потребления субстрата, составлял не более 510%. Рис. 16. Зависимость активности биодеградации ААК от концентрации глюкозы (А, на примере ЕР с 2-АБК) и пирувата (Б, на примере СК с 5-АСК) в среде. Несмотря на показанную нами потенциальную возможность деградации ААК в илах естественных водоемов, в природных экосистемах эти процессы не происходят или идут очень медленно из-за неоптимальности физико-химических условий. В таких случаях эти соединения могут быстро накапливаться, создавая избыточную нагрузку на процессы самоочищения, кардинально изменять трофические связи и видовой состав данной среды обитания. Показано, что оптимальной температурой для всех активных консорциумов является 30оС. Снижение (до 20оС) и особенно повышение (до 55оС) температуры культивирования приводило к падению активности биодеградации, в то время как для обесцвечивания азокрасителей именно высокая температура являлась оптимальной. Установлено, что при отклонении начального значения рН среды от околонейтрального активность и стабильность деструкции ААК существенно снижались, причем высокое исходное значение рН (9,0) во всех сообществах по мере потребления субстрата падало до 7,0-7,5. При принудительном подщелачивании среды все консорциумы сразу, а консорциум Ц через 35 циклов потребления, практически теряли разрушающую способность. Микроскопи22 ческая картина сообществ, культивируемых при экстремальных для процесса значениях температуры и рН, отличалась от растущих при оптимальных условиях наличием большого количества детрита и незначительным общим числом клеток. Активные метаногенные сообщества, долгое время контактировавшие с ААК, были не способны к их нитрат- и сульфатзависимому разложению, тогда как исходные илы обладали активностями нитрат- и сульфатредукции. Из проверенных легкоусваиваемых ко-субстратов (глюкозы, этанола, пирувата или смеси возможных продуктов стадии брожения - лактата, формиата, ацетата, пропионата, бутирата) только глюкоза и пируват оказали заметное стимулирующее воздействие на скорость деструкции ААК, которая повышалась в диапазоне концентраций ко-субстрата 0-20 мМ (рис. 16А, Б). При этом сбраживание пирувата с образованием ацетата, пропионата, формиата, бутирата и лактата консорциумами приводило к снижению рН до 6,7, глюкозы с образованием тех же продуктов - до 5,5-5,0. Усиление метаногенеза коррелировало с повышением концентрации ко-субстрата в среде, однако из-за более резкого закисления среды при сбраживании 20 мМ глюкозы активность метанообразования в этом случае несколько понижалась. Добавление ко-субстрата приводило также к увеличению общей численности клеток в консорциуме, что фиксировали нефелометрически и с помощью микроскопии. Детальное исследование процесса метаногенной деструкции ААК. На предыдущих этапах нашей работы в качестве ароматического промежуточного продукта удалось зафиксировать только бензоат. Для «разбалансирования» межвидового переноса интермедиатов с целью их выявления и идентификации использовали разведения микробных сообществ в 2-3 раза, что существенно замедлило общую скорость процесса, однако позволило наряду с Н 2, БК и некоторыми линейными летучими соединениями (этанолом, пропанолом, изопропанолом, пропионатом и бутиратом) зарегистрировать в сообществах СК, КСА, ЕР и Ц продукты первичной трансформации: 2-гидроксибензиловый спирт (2-ГБС) для 5-АСК и бензиловый спирт (БС) - для АБК и СалК. Все идентифицированные и предполагаемые (исходя из структурных формул ААК) ароматические интермедиаты были внесены в среду с активными консорциумами в концентрации 2-3 мМ. Также проверили возможность обесцвечивания этими сообществами азокрасителя АО6, продуктами восстановления которого являются ароматические амины, отличные от использованных нами ААК. Установлено (табл. 3), что сообщества различались по субстратным предпочтениям, однако все они были способны восстанавливать азосвязь АО6, что еще раз подтверждает неспецифичность данной реакции. Продукт дальнейшего превращения БС и 2-ГБС был идентифицирован как БК. БС и 2-ГБС значительно активней потреблялись теми консорциумами, в которых они были определены как первичные продукты трансформации основного субстрата. В то же время, скорость использования 2-ГБС была крайне низкой даже в этих случаях, что, как мы определили, было связано с его высокой токсичностью (IC50 для 2-ГБС составила 0,355 мМ). Остальные соединения даже в концентрациях 12-15 мМ не снижали активность образования метана на 50%. Только процесс разрушения 2-ГБС предварялся длительным лаг-периодом (150 сут) и даже через 200 сут не наблюдали полной минерализации этого вещества. Остальные ароматические субстраты потреблялись сообществами значительно быстрее, но с разными скоростями. БК использовали все изученные сообщества. Консорциум ЕР с 2-АБК оказался единственным, который мог потреблять и БС, и 2-ГБС, поэтому его исследовали более подробно. Внесение 20 мМ пирувата в среду стимулировало процесс биодеградации сообществом ЕР как основного субстрата (2-АБК), так и других использованных ароматических веществ в 2-60 раз, а СалК и БА сообщество ЕР было способно разлагать только в присутствии пирувата. При сбраживании пирувата как единственного субстрата образовывались Н2, СО2, ацетат, пропионат, формиат, бутират и лактат. 23 Таблица 3. Сообщество СК СК КСА Использование ароматических субстратов консорциумами, разрушающими ААК. Средняя скорость Субстрат потребления субстрата, Интермедиаты мМ/сут 2-АБК (основной) 0,59±0,011 БС, БК, ацетат БС 0,163±0,074 БК, ацетат, этанол (следы) 2-ГБС 0 БК 0,077±0,009 Ацетат, этанол (следы) СалК 0 Сульфаниловая кислота, АО6 0,19±0,008 ацетат, этанол 2-ГБС, БК, Н2, ацетат, 5-АСК (основной) 0,47±0,014 этанол (следы) Н2 (следы), БК, ацетат, 2-ГБС 0,003±0,0007 этанол (следы) БС 0 БК 0,010±0,003 Ацетат, этанол (следы) СалК 0,09±0,007 БС, БК, ацетат Сульфаниловая кислота, АО6 0,17±0,004 ацетат, этанол 2-АБК (основной) 0,03±0,0017 БС, БК, ацетат БС 0,167±0,081 БК, ацетат, этанол (следы) 2-ГБС 0 БК 0,071±0,006 Ацетат, этанол (следы) СалК 0 Сульфаниловая кислота, АО6 0,25±0,012 ацетат, этанол Конечные продукты СН4, СО2, NH4+ СН4, СО2 СН4, СО2 Сульфаниловая кислота, СН4, СО2, NH4+ СН4, СО2, NH4+ СН4, СО2, NH4+ СН4, СО2 СН4, СО2, NH4+ Сульфаниловая кислота, СН4, СО2, NH4+ СН4, СО2, NH4+ СН4, СО2 СН4, СО2 Сульфаниловая кислота, СН4, СО2, NH4+ 24 КСА ЕР Ц БС, БК, ацетат СН4, СО2, NH4+ БК, ацетат, этанол (следы) СН4, СО2 Ацетат, этанол (следы) СН4, СО2 Сульфаниловая кислота, Сульфаниловая кислота, АО6 0,22±0,029 ацетат, этанол СН4, СО2, NH4+ 2-АБК (основной) 0,08±0,011 БС, БК, ацетат СН4, СО2, NH4+ БС 0,022±0,0037 БК, ацетат, этанол СН4, СО2 Н2 (следы), БК, ацетат, 2-ГБС 0,002±0,0003 СН4, СО2 этанол (следы) БК 0,113±0,012 Ацетат, этанол (следы) СН4, СО2 СалК 0 Сульфаниловая кислота, Сульфаниловая кислота, АО6 0,12±0,015 ацетат, этанол СН4, СО2, NH4+ 2-ГБС, БК, Н2, ацетат, 5-АСК (основной) 0,07±0,0016 СН4, СО2, NH4+ этанол (следы) Н2 (следы), БК, ацетат, 2-ГБС 0,003±0,0009 СН4, СО2, NH4+ этанол (следы) БС 0 БК 0,014±0,002 Ацетат, этанол (следы) СН4, СО2 СалК 0,05±0,004 БС, БК, ацетат СН4, СО2, NH4+ Сульфаниловая кислота, Сульфаниловая кислота, АО6 0,10±0,017 ацетат, этанол СН4, СО2, NH4+ Приведены средние значения трѐх независимых экспериментов со стандартными ошибками среднего. 4-АБК (основной) БС 2-ГБС БК СалК 0,03±0,0011 0,040±0,003 0 0,021±0,008 0 25 При исследовании процесса потребления 2-ГБС был идентифицирован еще один промежуточный продукт его трансформации - бензальдегид (БА). Разложение БС и БК сообществом ЕР при наличии пирувата проходило без лаг-периода и с увеличенной скоростью, причем сначала сбраживался практически весь пируват (0,5-3 сут), затем следовала стадия трансформации БС в БК и деароматизация БК (2-8 сут) и наконец наблюдали полную минерализацию субстратов (13-22 сут). Таким образом, доступное питательное вещество (пируват) стимулировало не только деструкцию самих ААК, но и ароматических интермедиатов их разложения, что свидетельствует о вероятности осуществления первичной трансформации (амино)ароматических соединений в процессе кометаболизма. Для накопления интермедиатов разложения ААК применили также ингибирование конечных стадий конверсии субстрата в метан с помощью БЭСК, которое, в отличие от обесцвечивания азокрасителей, полностью останавливало деградацию ААК. Подавление метаногенеза в тех же консорциумах, но с добавлением пирувата как ко-субстрата, не оказывало влияния на скорость исчезновения из среды ААК, однако позволило накопить и идентифицировать с помощью ВЭЖХ ароматические продукты трансформации 5-АСК и АБК как 2-ГБС и БС, соответственно. Обнаружение тех же интермедиатов ароматической природы в условиях блокирования метаногенеза согласуется с результатами наших экспериментов и подтверждает нашу гипотезу и данные литературы по другим ароматическим веществам (Heider, Fuchs, 1997а), что на начальных этапах их деградации не происходит расщепления бензольного кольца субстрата. На основе анализа зарегистрированных нами интермедиатов и последовательности их появления в культуральной жидкости активных сообществ предложена следующая цепь реакций (трофическая цепь) использования ААК (рис. 17). Рис. 17. Гипотетическая схема метаногенной биодеградации ААК в активных сообществах. В активных сообществах при внесении ААК бензальдегид (БА) не регистрировался как промежуточный продукт, однако он выявлялся как интермедиат при использовании в тех же консорциумах 2-ГБС в качестве начального субстрата. Поскольку во всех сообществах с разными изомерами ААК всегда идентифицировали БК, то наиболее вероятным путем деструкции ААК представляется бензоил-КоА-путь, наиболее распространенный по литературным данным в нитрат- и сульфатредуцирующих условиях (Heider, Fuchs, 1997а). 26 Нами не обнаружено потребления активными сообществами флороглюцина, резорцина и его аналога пирогаллола как в качестве единственных источников углерода и энергии, так и в присутствии пирувата, т.е. вероятно в данных сообществах не реализуются альтернативные резорциновый и флороглюциновый пути деградации ААК. При длительной (более 1 месяца) инкубации активных метаногенных сообществ без ААК (без или с доступным линейным субстратом) активность деструкции ААК падала до нуля, при этом способность к метаногенезу за счет сбраживания пирувата или глюкозы сохранялась. Восстановление прежнего уровня деструкции ААК либо требовало значительных по времени лаг-периодов (до полугода), либо не достигалось вообще в пределах времени эксперимента (до 3 лет). Для поддержания высокой скорости метаногенной конверсии ААК следовало исключить ситуацию «голодания по аминоароматическому субстрату» для активных микробных сообществ. Структурно-функциональная организация метаногенных микробных сообществ, разрушающих ААК. Нами показано, что субстраты-ксенобиотики оказывают значительное влияние на состав и функциональные возможности микробных сообществ, т.е. способствуют закономерным изменениям их структуры. Так, различные фазы процесса биодеградации коррелировали с изменениями морфологических и культуральных признаков метаногенных сообществ. Активизация использования ААК сообществом имела следствием слипание находящихся в среде конгломератов в рыхлые гранулы, которые по мере стабилизации процесса биодеградации уплотнялись и принимали вид мелких (не более 15 мкм в диаметре) округлых агрегатов с внутренней полостью, содержащих значительное количество кокков (рис. 18А, Б). Появлялись также округлые сильно ослизненные сплошные агрегаты, состоящие из мелких кокков и палочек (рис. 18В). Отмеченные нами агрегаты с внутренней полостью описаны в литературе как ассоциации, где эдификатором выступают представители рода Methanosarcina (Dolfing et al., 1985; Wiegant, de Man, 1986; Dubourguier et al., 1988; Wu et al., 1992; Заварзин, 2003). В конце цикла потребления ААК часть клеточных агрегатов могла приобретать неправильную форму и содержать включения и микроколонии. Рис. 18. Микрофотографии агрегатов СК различной морфологии (А - общий вид смеси агрегатов, масштабная черта 300 мкм, Б - с внутренней полостью, м.ч. 6 мкм, В - сплошной, м.ч. 1 мкм). Начало активного метаногенеза всегда совпадало с появлением в сообществе в значительном количестве тонких палочек разной длины, часто фрагментированных, собранных в очень длинные нити, иногда в чехлах, а также Methanosarcina-подобных клеток (рис. 19, 1, 2). При сравнении микроскопической картины исходных илов и активных консорциумов из них было отмечено снижение общего количества клеток и уменьшение числа их морфотипов с более чем 14 до 5-8 (рис. 19А, 1-6). Установлено также, что микроорганизмы в сообществе находятся в тесном физическом контакте (рис. 19Б), который характерен для синтрофных взаимодействий (Schink, 1997, Stams, Plugge, 2009). 27 Рис. 19. Морфотипы клеток (1-6), характерные для активного метаногенного разрушающего ААК сообщества, и пространственное объединение микроорганизмов (А - общий план консорциума ЕР с 2-АБК; Б - тесный контакт клеток, начальный этап формирования микробного агрегата; А, Б, 5, 6 - фазовый констраст, 1-4 -электронные микрофотографии; м.ч. А - 5 мкм, Б - 20 мкм, 1- 10 мкм, 2 - 12 мкм, 3 - 6 мкм, 4 - 3 мкм). Добавление доступного ко-субстрата увеличивало общее количество клеток в активных консорциумах, а также повышало долю вибриоподобных клеток, гетероморфных бесспоровых палочек и мелких кокков. Длительное существование активного консорциума в условиях «голодания» помимо утраты разрушающей способности приводило к уплотнению микробных агрегатов, появлению большого количества спор и исчезновению гетероморфных палочек, собранных в цепи. В сообществах с заблокированным метаногенезом как в отсутствие, так и в присутствии ко-субстрата не обнаруживали крупные кокки в пакетах или многоклеточных агрегатах (рис. 19, 2), а также вибриоподобные клетки (рис. 19, 3) и длинные тонкие споровые палочки (рис. 19, 5). Клеточные агрегаты в этих условиях принимали неправильную форму и становились существенно мельче (распадались на группы клеток). Это согласуется с данными других исследователей (Dolfing et al., 1985; Wiegant, de Man, 1986; Dubourguier et al., 1988; Wu et al., 1992; Заварзин, 2003) о значительной роли метаногенов в формировании и поддержании архитектуры микробных агрегатов. Стабильность любого микробного сообщества в значительной мере зависит от функционального разнообразия входящих в его состав микроорганизмов. В активных сообществах выявлены следующие функциональные группы микроорганизмов: 1) гетеротрофные мезофилы (до 106 КОЕ/мл), олиготрофы (1,5-3,5 х 103 КОЕ/мл), споровые формы, целлюлозолитики (7,5-14 х 102 клеток/мл), анаэробные азотфиксаторы (2,5-4,0 х 102 клеток/мл), сульфатредукторы (1,1-4,2 х 106 клеток/мл) и молочнокислые бактерии (104-105 КОЕ/мл). 28 Для сравнительного ДГГЭ-анализа микробного состава активных сообществ, полученных нами из различных источников, но осуществляющих аналогичные процессы биодеградации ААК, использовали консорциумы ЕР с 2-АБК как представителя сообществ из илов очистных сооружений и Ц с 5-АСК в качестве сообщества из донных отложений природного, не загрязненного ААК водоема. Анализ визуальной идентичности, т.е. количества и местоположения полос на геле, показал, что образцы сходны друг с другом. Филогенетический анализ выявил преобладание в исследуемых сообществах значительного числа некультивируемых микроорганизмов, относящихся к группам Thermotogae, Bacteroidetes и «некультивируемые почвенные бактерии». В дальнейшем для подробного исследования видового состава выбрали сообщество ЕР с 2-АБК и исходный ил ЕР, филогенетический анализ которых подтвердил преобладание некультивируемых микроорганизмов нескольких филогенетических групп (рис. 20). Рис. 20. ДГГЭ-профили исходного ила ЕР (Б, Г) и активного сообщества ЕР с 2-АБК (А, В) и филогенетическое положение микроорганизмов, входящих в состав исследованных образцов (А, Б - археи, В, Г - бактерии). 29 Полосы 1-10 присутствовали в обоих образцах, однако в исходном иле регистрировали также полосы 11-13, не обнаруженные в активном сообществе, что еще раз подтверждает селективный эффект ААК. В исходном иле наибольшей плотностью отличались полосы 10, 12 и 13, тогда как в активном сообществе самыми насыщенными были полосы 5-7. И в том, в другом образце просматривалось множество слабых полос, не поддающихся идентификации. Анализ архейного компонента показал, что под действием ААК произошла смена доминирующего микроорганизма: в исходном иле наблюдали преобладание Methanosarcina mazeii, а в активном сообществе доминировала Methanosaeta concilii. Несмотря на выявление в составе активных сообществ большого числа некультивируемых микроорганизмов параллельно проводили классический микробиологический анализ. Особое внимание обращали на выделение и идентификацию микроорганизмов, участвующих в первых реакциях конверсии ААК, поскольку к началу нашей работы о них было практически ничего не известно. Также были выделены три стабильных ко-культуры, в которых наблюдали преобладающие компоненты, однако элиминация минорных микроорганизмов не происходила в течение длительного времени (более 7 лет) и они пассировались как единое целое. Выделенные чистые и ко-культуры и их свойства представлены в табл. 4, 5). Показано, что C. freundii WA1 был способен восстанавливать азосвязь АО6 при культивировании в среде № 1 с дрожжевым экстрактом и пируватом, причем азокраситель в выбранной концентрации (0,3 мМ) не оказывал токсического действия на культуру (количество живых клеток не снижалось). Цитробактер не использовал ААК как субстрат для роста, однако при добавлении в среду пирувата, глюкозы или серина клетки с разной скоростью осуществляли анаэробную трансформацию изомеров АСК в 2-ГБС, а изомеров АБК и БА - в БС. 2-АБК, БК и СалК культурой практически не трансформировались (табл. 6). Глюкоза и серин были менее эффективными ко-субстратами. Другие субстраты, поддерживающие рост цитробактера, не стимулировали трансформацию 5-АСК, однако снижение концентрации дрожжевого экстракта в среде негативно отражалось на приросте биомассы, полноте сбраживания пирувата и трансформации ААК. Как в отсутствие, так и в присутствии 5-АСК пируват сбраживался клетками C. freundii WA1 до ацетата, CO2, H2 и следовых количеств лактата, сукцината и формиата. Восстановление 5АСК начиналось, когда некоторое количество пирувата уже было сброжено культурой C. freundii WA1. 5-АСК в концентрации 9 мМ полностью ингибировала рост культуры, тогда как даже 40 мМ БК угнетали его лишь на 40%. Высокие концентрации 5-АСК ингибировали также собственную трансформацию клетками C. freundii WA1. Внесение 5-АСК в анаэробную среду и ее последующая трансформация в 2-ГБС снижали количества лактата и формиата на 11 и 13%, соответственно. Ацетата при этом становилось больше на 10%. Удельная скорость роста ( ) C. freundii WA1 составляла 0,19 и 0,22 ч-1 с и без 5-АСК, соответственно, что косвенно свидетельствует об использовании части восстановительных эквивалентов, полученных клетками в результате брожения пирувата, для трансформации ААК. Таким образом, выделенный нами C. freundii WA1 отвечает за первые этапы трофической цепи разложения ААК, осуществляя их первичную трансформацию. Он восстанавливает ароматические карбоксикислоты до соответствующих спиртов с одновременным дезаминированием при росте на среде с доступным источником углерода и энергии, т.е. в процессе кометаболизма. Эффективность этой реакции зависит от положения заместителя ароматического кольца (см. табл. 6). При инкубации C. freundii WA1 с ко-субстратами, но без ААК, способность к трансформации утрачивается. Проверка штаммов вида Citrobacter freundii, хранящихся в коллекции микроорганизмов каф. микробиологии биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова, на наличие трансформирующей активности показала, что все они после 9 мес. инкубации с ААК были способны к их трансформации (на 12-57%) в присутствии ко-субстрата (пирувата или глюкозы). 30 Таблица 4. Выделенные чистые культуры и их основные свойства. Название, №в Генбанке Источник и способ выделения Citrobacter freundii WA1, AY259630 СК с 5-АСК, посев на агаризованную среду № 2 с 5-АСК и пируватом, инкубация в анаэробных условиях Pseudomonas aeruginosa ASA2, KC137274 СК с 2-АБК, посев на агаризованную среду № 1 с 2-АБК, инкубация в анаэробных условиях Pseudomonas aeruginosa Ц с 5-АСК, посев на агаризованную Tsaydam-5среду № 1 с 5-АСК и пируватом, ASA, инкубация в анаэробных условиях KC137277 ЕР с 2-АБК, глубинный посев в Bacillus агаризованную среду № 1 с subtilis ЕРпируватом после кипячения пробы АВА, 10-15 мин, инкубация в анаэробных JQ762447 условиях Moraxella ЕР с 2-АБК, посев на МПА после osloensis ЕРкипячения пробы 15-20 мин, АВА2, инкубация в анаэробных условиях JQ762446 Основные свойства Грамотрицательные, подвижные, бесспоровые, прямые или слегка изогнутые палочки, иногда в длинных цепочках в общем слизистом чехле. Факультативный анаэроб, сбраживает сахара до кислоты и газа, растет также на пирувате, серине, формиате, фумарате, малате, дрожжевом экстракте, но не на -кетоглутарате, спиртах, других ЛЖК и Н2/СО2. Восстанавливает нитрат только до нитрита. Диссоциирует на R-, S- и S1-варианты. В активных сообществах присутствует в виде R-диссоцианта Грамотрицательные мелкие прямые бесспоровые подвижные палочки. Факультативный анаэроб, не способен сбраживать глюкозу или расти автотрофно. Растет на дрожжевом экстракте, фумарате, аланине, гистидине, аспартате, но не на серине или цистеине Восстанавливает нитрат только до нитрита. Диссоциирует на S-, R- и М-варианты. В активных сообществах присутствует в виде М-диссоцианта Грамотрицательные мелкие прямые или слегка изогнутые подвижные палочки, не образующие спор. Факультативный анаэроб, способен расти анаэробно на среде с дрожжевым экстрактом, глюкозой, пептоном, пируватом, аэробно на МПА или БСА. Восстанавливает нитрат только до нитрита. Диссоциирует на S-, R- и М-варианты. В активных сообществах присутствует в виде М-диссоцианта Грамположительные подвижные палочки, способные образовывать эндоспоры. Факультативный анаэроб, растет аэробно и анаэробно в среде с пируватом, пептоном, дрожжевым экстрактом, глюкозой, но не с D-ксилозой и глицеролом. Сбраживает пируват, глюкозу и смесь аминокислот до лактата, этанола, ацетата и 2,3-бутандиола Грамотрицательные неподвижные бесспоровые палочки. Факультативный анаэроб, растет аэробно и анаэробно в среде с пируватом, пептоном, глюкозой, аэробно и микроаэрофильно на МПА 31 Lactobacillus paracasei ssp. paracasei L34, KC137275 Ц с 5-АСК, постановка накопительной культуры бактерий молочнокислой группы на жидкой MRS и рассев на анаэробный и аэробный MRS-агар Грамположительные короткие палочки с зернистым содержимым, неподвижны, спор не образуют, иногда располагаются в коротких цепочках и гроздьях. Аэротолерантный анаэроб, растет на ряде D-сахаров, в том числе глюкозе, сахарозе и лактозе, и спиртов, в том числе глицероле. Не восстанавливает нитрат, не разжижает желатину Lactobacillus rhamnosus L-43.1, KC137276 ЕР с 2-АБК, постановка накопительной культуры бактерий молочнокислой группы на жидкой MRS и рассев на анаэробный и аэробный MRS-агар Грамположительные ровные неподвижные бесспоровые палочки среднего размера, в коротких цепочках. Аэротолерантный анаэроб, растет на ряде D-сахаров, в том числе глюкозе, сахарозе и лактозе, и спиртов, но не на глицероле. Не восстанавливает нитрат, не разжижает желатину Таблица 5. Обозначение WFS WAC Выделенные ко-культуры и их основные свойства. Источник и способ Микроскопическая картина Основные свойства выделения СК с 5-АСК и пируватом, Значительно преобладают крупные Рост в строго анаэробных условиях с посев на анаэробную палочки со спорообразованием высокой скоростью. Сбраживает глюкозу с глюкозо-пептонную среду бациллярного типа, как минорный образованием кислот и газа. Не требует и последующий прогрев компонент присутствуют очень мелкие факторов роста в среде. Не растет автотрофно при 80ºС 20-25 мин кокки или короткие палочки СК с 5-АСК и пируватом, постановка накопительной Преобладают длинные тонкие палочки, Рост в строго анаэробных условиях. культуры в анаэробной образующих круглые споры Способна расти автотрофно при наличии среде № 2 с дрожжевым плектридиального типа, как минорный факторов роста. При росте на Н2/СО2 экстрактом и Н2/СО2 компонент присутствуют очень мелкие (80/20) образует ацетат и бутират, а на (80/20) в качестве кокки или короткие палочки метаноле - ацетат и пропионат газовой фазы, предельные разведения 32 WSR СК c 5-АСК и пируватом, постановка накопительной культуры в среде № 2 с лактатом, сульфатом и дрожжевым экстрактом, предельные разведения Изогнутые вибриоподобные клетки и тонкие палочки среднего размера в приблизительно равном соотношении, возможно, присутствуют мелкие кокки Восстанавливает сульфат при росте на лактате, пирувате и смеси ЛЖК (ацетата, пропионата, бутирата, формиата). Сбраживает пируват в отсутствии сульфата в среде. Требует присутствия факторов роста Таблица 6. Трансформация ароматических кислот (1 мМ) и бензальдегида (0,5 мМ) C. freundii WA1 при росте на среде с пируватом. Трансформировано через 3 сут Трансформировано через 3 сут Ароматическое вещество Ароматическое вещество инкубации, мМ инкубации, мМ 2-АБК <0,010 4-АСК 0,066 ± 0,014 3- АБК 1,167 ± 0,214 5-АСК 1,096 ± 0,196 4- АБК 0,049 ± 0,012 БК <0,010 БА 0,322 ± 0,025 СалК <0,010 Данные являются средними значениями трех независимых экспериментов со стандартными ошибками среднего. 33 В аэробных условиях P. aeruginosa ASA2 и Tsaydam-5-ASA могли окислять из всех ААК только 2-АБК, причем скорость окисления зависела от степени аэрации. При росте в анаэробной жидкой среде без экзогенных акцепторов электронов они не показали способности к преобразованию ААК, а также к использованию БК, СалК, БС и 2-ГБС. В свою очередь, ААК в концентрациях до 10 мМ по результатам посева на БСА не оказывали ингибирующего действия на жизнеспособность и последующий рост культур. Концентрация ААК снижалась только при развитии псевдомонад в присутствии дрожжевого экстракта или некоторых аминокислот (аланина, гистидина или аспартата) и нитрата в среде культивирования, однако ни один изомер ААК в условиях нитратредукции не потреблялся культурами как ростовой субстрат. По данным ВЭЖХ исчезновение всех изучаемых изомеров АБК и АСК сопровождалось появлением двух ароматических продуктов, один из которых был идентифицирован как соответствующая начальному субстрату гидрокси- (ГБК) или дигидроксибензойная (ДГБК) кислота. Второй ароматический продукт трансформации (АПТ) идентифицировать не удалось. Соотношение ГБК (или ДГБК) и АПТ в стационарной фазе роста P. aeruginosa ASA2 составляло для разных изомеров ААК от 20:80 до 35:65. Добавление в среду № 1 без клеток различных анионов продемонстрировало, что трансформация ААК осуществляется не ферментными системами псевдомонад, а в результате химической реакции ААК и нитрита. Эта небиологическая трансформация при росте культур на доступном углеродном субстрате может быть опосредована живыми клетками псевдомонад, образующих нитрит в результате восстановления нитрата. Мы предполагаем, что взаимодействие нитрита и ААК приводит к образованию иона арилдиазония с последующим появлением арильного катиона и выделением N2 (Engbersen, de Groot, 1988; Шабаров, 1994). Арильный катион, вероятно, реагирует с гидроксильным (и возможно, с бикарбонатным) анионом. Зарегистрированная разница концентраций потребленного нитрата и образованного нитрита эквимолярна количеству преобразованной ААК. Таким образом, жизнедеятельность клеток P. aeruginosa ASA2 и Tsaydam-5-ASA может обеспечивать химическую трансформацию при изменении химического состава реальных сточных вод. У P. aeruginosa ASA2 и Tsaydam-5-ASA нами не обнаружены описанные в литературе способности М-диссоциантов псевдомонад расти анаэробно за счет сбраживания глюкозы, а также проявлять протеолитическую активность (Милько, Ильиных, 2004; Милько и др., 2008; Милько и др., 2010). Выделенные нами штаммы B. subtilis ЕР-АВА и M. osloensis ЕР-АВА2 не показали способности использовать ААК, БК, СалК, БС, 2-ГБС (1 мМ) и БА (0,5 мМ) при инкубации в среде № 1 без или с доступным ко-субстратом, хотя для представителей рода Bacillus ранее была отмечена возможность деградации фталата (Aftring, Taylor, 1981), а для членов рода Moraxella - БК, БА, БС, флороглюцина (Berry et al., 1987) и п-крезола (Bossert, Young, 1986), сопряженная с нитратредукцией. Внесение биомассы (20 об.% от исходного биоматериала) B.subtilis ЕР-АВА или M. osloensis ЕР-АВА2 в активный консорциум ЕР с 2-АБК стимулировало метанообразование на 12 и 18%, соответственно, и снижало значение рН до 6,5, хотя скорость потребления 2-АБК практически не изменялась. Одновременное добавление клеток штаммов и глюкозы, напротив, уменьшало выход метана на 7-20%, вероятно, из-за значительного закисления среды (до 5,5). Таким образом, выделенные культуры способны осуществлять сбраживание линейных субстратов и их следует поместить в «бродильный» блок трофической цепи биодеструкции ААВ. В анаэробных условиях в виде чистых культур выделенные нами L. paracasei subsp. paracasei L-34 и L. rhamnosus L-43.1 не разлагали ААВ при инкубации на «бедной» для них минеральной среде № 1 как в отсутствие, так и в присутствии доступного ко-субстрата (пирувата). Показано, что в вариантах с пируватом происходило его сбраживание с образованием L-лактата и закислением среды. Лактобациллы осуществляли молочнокислое брожение смеси ЛЖК и спиртов, использованных как сборный субстрат, соответствующий возможным интермедиатам. 34 Рис. 21. Обесцвечивание PS (фото, 1 культуральная жидкость в начале опыта, 2 - через 3 сут) и SY (спектры) L. paracasei subsp. paracasei L-34 в анаэробных условиях роста. Чтобы смоделировать условия «достаточности питания», которые лактобациллам, повидимому, создают партнеры при инкубации сообществ в минеральной среде, нами для культивирования лактобацилл в виде чистых культур была выбрана богатая среда MRS. Поскольку лактобациллы относятся к аэротолерантным микроорганизмам, то параллельно те же варианты инкубировали в аэробных условиях. Испытания проводили с пищевыми азокрасителями PS, Tn, SY и Az и интермедиатами их разложения. Оба штамма лактобацилл в отсутствие кислорода полностью обесцвечивали азокрасители PS, Tn и SY через 2-4 сут (рис. 21) с образованием сульфаниловой кислоты, накапливающейся в культуральной жидкости. В то же время, Az обесцвечивался только культурой L. rhamnosus L-43.1 (на 7-е сут). При росте обеих культур в аэробных условиях PS, SY и Az не обесцвечивались, в то время как Tn подвергался частичной фрагментации. Однако нами, в отличие от Perez-Diaz, McFeeters (2009) для некоторых штаммов L. casei и L. paracasei, не зафиксировано появление некоего «продукта анаболизма» пурпурного цвета с максимумами поглощения на 361 и 553 нм. Рис. 22. Влияние различных ААВ на рост L. paracasei subsp. paracasei L34 (А) и L. rhamnosus L43.1 (Б) в аэробных и анаэробных условиях. 5-АСК, 2-АБК, сульфаниловая кислота, БС, БК и СалК лактобациллами не потреблялись как в анаэробных, так и в аэробных условиях. Обе культуры активно росли и на 2-3-и сут достигали 35 стационарной фазы, при этом значение рН падало с 6,5 до 4-4,5 за счет осуществляемого лактобациллами молочнокислого брожения. В анаэробных условиях присутствие в среде 2АБК, 5-АСК, БС и БК практически не влияло, Tn и Az - несколько замедляло, а PS и SY, наоборот, стимулировало рост L. paracasei ssp. paracasei L-34 (рис. 22А). Наиболее заметную задержку роста наблюдали при добавлении сульфаниловой и салициловой (СалК) кислот. В аэробных условиях ингибирующее действие ААВ на рост культуры было более выраженное, причем ни одно вещество не стимулировало рост. Наиболее токсичным субстратом как в анаэробных, так и в аэробных условиях оказалась сульфаниловая кислота, а самым нетоксичным - 2-АБК. Незначительное ингибирование роста L. rhamnosus L-43.1 наблюдали при внесении PS, SY, 5-АСК и 2-АБК (рис. 22Б). Az, напротив, несколько стимулировал развитие культуры. Наиболее существенное негативное влияние (25-40%) выявлено для Tn, СалК, БС и БК, тогда как сульфаниловая кислота не действовала на рост этой культуры. В аэробных условиях ингибирующее действие ААВ возрастало в 2,1-5,0 раз, причем «безразличная» культуре в анаэробных условиях сульфаниловая кислота в присутствии кислорода в 4,5 раза снижала скорость роста штамма, а для красителя Az наблюдали смену небольшого стимулирующего действия на ингибирующее. Неожиданным оказалось положительное влияние на культуру в присутствии кислорода азокрасителя SY, который в анаэробных условиях замедлял ее рост. Наиболее токсичным субстратом для L. rhamnosus L-43 как в анаэробных, так и в аэробных условиях оказался Tn, а самыми нетоксичными - SY и Az. При внесении дополнительного количества клеток L. rhamnosus L-43.1 (20 об.% от исходного биоматериала) в активное сообщество ЕР с 2-АБК показана стимуляция процессов брожения при неизменной скорости деструкции 2-АБК. Наблюдали усиление метанообразования на 15% и закисление среды до рН=6,5, так как внесенные клетки лактобацилл при брожении продуцировали дополнительное количество органических кислот, в том числе ацетата, служащего субстратом метаногенеза. Если в сообщество вместе с биомассой лактобацилл вносили еще и глюкозу, то снижение рН до 5,5 приводило, наоборот, к ингибированию метаногенеза в 1,1-1,3 раза. Таким образом, лактобациллы входят в «бродильный» блок трофической цепи сообществ, разрушающих ААВ. В составе сообщества, где партнеры, вероятно, могут обеспечивать им «достаточность питания», лактобациллы способны развиваться на минеральной среде, сбраживать линейные интермедиаты и выполнять дополнительную функцию разрыва азосвязей при метаногенной деструкции азокрасителей. Ко-культуры WFS, WAC и WSR при росте в среде № 1 с ААК как в присутствии косубстрата, так и без него не показали способности трансформировать или разлагать изомеры АБК и АСК. Искусственные анаэробные микробные сообщества. Для доказательства способности выделенных чистых и ко-культур взаимодействовать и функционировать в составе микробного сообщества создали ряд искусственных ассоциаций с разным набором компонентов. Для формирования сообществ, где 5-АСК являлась единственным источником углерода и энергии, использовали 6 компонентов в различных сочетаниях (табл. 7). Бинарные культуры метаногена и одной из ко-культур WFS, WAC или WSR, а также различные сочетания кокультур между собой не обладали деградирующей активностью. Ассоциации C. freundii WA1 и ко-культуры WFS или WAC не могли трансформировать 5-АСК, однако добавление метаногена стимулировало ее разложение. Внесение в искусственные сообщества ко-культуры WSR существенно не влияло на активность потребления субстрата. Ни одно из искусственных сообществ не могло полностью минерализовать 5-АСК в условиях эксперимента, возможно, изза несоблюдения нужных пропорций компонентов и/или отсутствия не выделенных нами или некультивируемых партнеров. Тем не менее, осуществление частичной (на 20-25%) биодеструкции 5-АСК продемонстрировало способность C. freundii WA1 в составе сообщества трансформировать 5-АСК до 2-ГБС без дополнительных источников углерода. 36 Таблица 7. Искусственные сообщества, показавшие потребление 5-АСК. Детектируемые (промежуточные) и Члены сообщества (основная функция) Деградация 5-АСК конечные продукты C. freundii WA1 (первичная трансформация) Ко-культура WAC (гомоацетогенез) + (<25% за 10 сут) (Н2, 2-ГБС, ацетат), СО2, СН4 Ко-культура WFS (брожение) M. barkeri (метаногенез) C.freundii WA1 (первичная трансформация) Ко-культура WAC (гомоацетогенез) + (<25% за 10 сут) (Н2, 2-ГБС), СО2, СН4, ацетат Ко-культура WSF (брожение) M. hungatei (метаногенез) C.freundii WA1 (первичная трансформация) Ко-культура WAC (гомоацетогенез) + (<20% за 10 сут) (Н2, ацетат), 2-ГБС, СО2, СН4 M. barkeri (метаногенез) C.freundii WA1 (первичная трансформация) Ко-культура WFS (брожение) + (<20% за 10 сут) (Н2), 2-ГБС, СО2, СН4 M. hungatei или M. barkeri (метаногенез) C. freundii WA1 (первичная трансформация) Ко-культура WAC (гомоацетогенез) + (~10% за 10 сут) 2-ГБС, СО2, Н2, ацетат, пропионат Ко-культура WFS (брожение) C. freundii WA1 (первичная трансформация) Ко-культура WFS (брожение) или Ко-культура WAC (гомоацетогенез) C. freundii WA1 (первичная трансформация) M. hungatei (метаногенез) или M. barkeri (метаногенез) 37 Очевидно, в сообществе восстановительные эквиваленты для этой реакции могут быть получены из общего пула, обусловленного межвидовым транспортом водорода или формиата (Stams, 1994; Schink, 1997). Еще одна искусственная микробная ассоциация была создана для демонстрации возможности деструкции азокрасителей. Сообщество составили из выделенных нами чистых культур C. freundii WA1, L. rhamnosus L-43.1 и ко-культуры WSR. При его развитии в анаэробной среде № 1, содержащей MR (1 мМ), 2-АБК или 5-АСК (0,5 мМ), на 6 сут наблюдали обесцвечивание азокрасителя (рис. 23). Исчезновение MR сопровождалось появлением ДМФ и 2-АБК (пики на 242 и 310 нм). В дальнейшем, при уменьшении пика, соответствующего 2-АБК, регистрировали появление валериановой и капроновой кислот, пропионата, бутирата и ацетата. Из-за отсутствия метаногенов количество Н2 в течение всего опыта увеличивалось. Таким образом, MR подвергся частичной деструкции под действием созданной нами микробной ассоциации в соответствии со схемой: азокраситель → ароматические амины → линейные интермедиаты → ЛЖК, спирты, СО2, Н2. 2-АБК и 5-АСК в качестве начальных субстратов были устойчивы в течение опыта либо из-за элиминации метаногенной стадии, либо из-за длительного лаг-периода. Использованные компоненты были выделены нами из сообществ различного происхождения, однако осуществляли совместный процесс биодеградации, т.е. показана принципиальная возможность «конструирования» микробных консорциумов из культур с заданными свойствами. Несмотря на то, что по нашим данным полученные из активных сообществ псевдомонады не играют непосредственной роли в процессе метаногенной деградации ААВ, они постоянно выделяются из различных илов, включая илы очистных сооружений. Для доказательства возможности полной минерализации хотя бы одного продукта химической трансформации ААК создали искусственную ассоциацию из P. aeruginosa ASA2 и специально выделенного из ила очистных сооружений, обрабатывающих бытовые стоки, «вспомогательного» микроорганизма WH, разлагающего 2,5-дигидроксибензойную кислоту (2,5-ДГБК) до СО2 при восстанавлении нитрата до N2. При одновременном внесении в среду с 5-АСК и 10-20 мМ нитрата культур P. aeruginosa ASA2 и WH происходила как химическая трансформация 5-АСК, так и разложение образованной 2,5-ДГБ до CO2 (рис. 24). Таким образом, создание искусственных микробных ассоциаций позволило подтвердить роли выделенных нами микроорганизмов. На основе анализа собственных и имеющихся в литературе данных идентифицированные микроорганизмы были расположены в последовательности, составляющей трофическую цепь (рис. 25). Нам не удалось выделить микроорганизм, способный использовать 2-ГБС и/или БС, однако регистрируемый в сообществе следующий интермедиат, БА, мог использоваться тем же цитробактером. Не исключено, что C. freundii WA1 при трансформации ААК часть БА восстанавливает до 2-ГБС или БС, а часть окисляет в БК. В этих реакциях могут участвовать также присутствующие в сообществе некультивируемые члены рода Clostridium, представители которого обладают широкими метаболическими возможностями. Деароматизацию БК также могут осуществлять клостридии и/или ко-культура WSR, содержащая сульфатредуцирующий микроорганизм, для которых известна способность раскрывать бензольное кольцо (Bock et al., 2000; Muller, Schink, 2000; Plugge et al., 2002). Не выделенный нами, но идентифицированный в сообществе при помощи ДГГЭ-анализа представитель вида Proteiniphilum acetatigenes на основании сведений о свойствах типового и других описанных штаммов (Chen, Dong, 2005) может участвовать, например, в превращении пирувата в ацетат и СО2. В синтрофной стадии может принимать участие выделенная нами ко-культура WSR как сульфатредуктор в отсутствие сульфата. Возможно также, что она осуществляется также какой-либо группой некультивируемых микроорганизмов, присутствующих в сообществе. 38 Рис. 23. Обесцвечивание азокрасителя MR искусственным микробным сообществом: 1 – без добавления субстрата (контроль); 2 – с MR, начало эксперимента; 3 – с MR, на 6 сут инкубации - и изменение спектральных характеристик культуральной жидкости искусственной микробной ассоциации с MR. Рис. 24. Предполагаемая схема, сочетающая биологические и химическую реакции при разложении ААК (на примере 5-АСК), под действием искусственной ассоциации P. aeruginosa ASA2 и изолята WH. Моделирование ситуаций загрязнения ААВ. Первым шагом к исследованию «судьбы» ксенобиотика в реальных системах может быть создание лабораторных моделей, имитирующих основные параметры места загрязнения. Поскольку даже сточные воды специализированных химических производств содержат, как правило, набор загрязнителей, то определили возможность использования выделенными нами сообществами (на примере СК и КСА) ААК из бинарных смесей. Показано, что смешивание двух ААК в целом снижало скорость их деструкции. Из смеси 5-АСК+2-АБК оба субстрата потреблялись сообществами одновременно и с практически одинаковой скоростью, тогда как из смесей 2АБК+4-АБК и 5-АСК+4-АСК в первую очередь использовался более деградабильный изомер (рис. 26А, Б). В качестве первичной грубой модели, имитирующей вброс пищевых азокрасителей в ЖКТ, использовали микробные сообщества экскрементов человека и некоторых млекопитающих и Tn, PS, SY, широко применяемые в пищевой, фармацевтической, косметической промышленности, запрещенный к применению в пищевой промышленности в большинстве стран Az и, для сравнения, технический азокраситель MR, а также ароматические интермедиаты их разложения. Микробные сообщества из фекалий различных млекопитающих были способны с разной скоростью обесцвечивать использованные азокрасители (рис. 27), что еще раз свидетельствует о неспецифичности реакции разрыва азосвязей. Самым устойчивым оказался Tn, а самыми биодеградабильными - SY и Az. Образовавшаяся в вариантах с PS, Tn, SY и Az сульфаниловая кислота была устойчива к дальнейшему расщеплению, а 2-АБК и ДМФ в образцах с MR исчезали из культуральной жидкости, как и в случае с сообществами из илов очистных сооружений. В качестве линейных интермедиатов во всех пробах регистрировали ацетат и пропионат, а в ряде сообществ - также бутират, валериановую и капроновую кислоты. 39 Рис. 25. Трофические связи в анаэробном сообществе, осуществляющем конверсию азокрасителей в биогаз. Для сообщества ФКР с Tn было показано, что на 7 сут содержание кислот в опыте более чем в 2 раза превышает таковое в контроле, что подтверждает деструкцию ароматических интермедиатов. В сообществах ФВ, ФКЗ, ФЧ2, ФКР и ФО отмечали образование метана за счет разложения азокрасителя, в других образцах присутствие азокрасителя, наоборот, подавляло метаногенез. Наиболее активный и устойчивый метаногенез наблюдали в сообществе ФО, которое конвертировало в биогаз три из пяти использованных азокрасителей (Tn, PS и MR). Путем сопоставления времен выхода различных групп веществ нами установлено, что закономерности разложения ААВ в кишечных сообществах повторяют закономерности, выявленные для сообществ из илов очистных сооружений и донных отложений природных водоемов. Рис. 26. Потребление ААК из бинарных смесей метаногенными сообществами СК (А - 4-АБК+2-АБК; Б - 4АСК+5-АСК). В то же время, длительность удержания каловых масс у испытанных млекопитающих не позволяет говорить о прохождении полной минера40 лизации азокрасителей в реальных условиях, поэтому велика вероятность длительного присутствия в ЖКТ самих азокрасителей и продуктов их распада. Поскольку ААВ снижают общую численность клеток, обедняют компонентный состав микробных сообществ и меняют доминирование в них, а также ингибируют рост лактобацилл, которые являются неотъемлемой частью нормальной микробиоты ЖКТ млекопитающих, то можно утверждать, что испытанные вещества являются скорее «вредными» и представляют определенную опасность для здоровья людей. Рис. 27. Сравнение времен полного обесцвечивания азокрасителей микробными сообществами из ЖКТ разных млекопитающих. Таким образом, показана принципиальная возможность использования сообществ ЖКТ для первичного экспресс-тестирования пищевых азокрасителей. микробных Заключение. Главной целью работы было детальное изучение процесса полной метаногенной деструкции ААВ и соотнесение с ним изменений в структурно-функциональной организации активного сообщества. Такие исследования к моменту написания нашего труда в литературе представлены не были. Выбор биологического материала диктовался наличием или теоретической возможностью осуществления метаногенного разложения органических веществ. Нами проведен скрининг 11 видов анаэробных осадков различного происхождения и активные микробные сообщества получены как из источников, где подобные загрязнения могли иметь место, так и из естественных водоемов, не загрязнѐнных соответствующими веществами. Поскольку априори результат был непредсказуем, то на начальной стадии работы задействовали максимально возможный спектр сред и условий культивирования. Нам удалось получить анаэробные микробные сообщества, которые стабильно (более 5-10 лет) с высокой скоростью разрушают азокрасители и ААК до биогаза, что делает их перспективными для биотехнологического использования. Другим результатом работы является детальное изучение процесса полной минерализации ААК до биогаза, определение основных ароматических и линейных интермедиатов и последовательности реакций в метаногенных сообществах, а также оптимальных физикохимических параметров культивирования. Для этого были применены как накопление и регистрация интермедиатов при различных воздействиях на сообщества, так и использование 41 идентифицированных и предполагемых промежуточных продуктов в качестве начальных субстратов. Подтверждением «двухстадийности» процесса конверсии азокрасителей в биогаз стали выявленные различия в механизмах, регулировании и отношении к факторам инкубации этапов обесцвечивания и преобразования аминов-интермедиатов (в частности, ААК). Несмотря на разнообразие использованных сочетаний температуры и кислотности среды, оптимальными для процесса биодеградации в целом оказалась инкубация при 30 оС и рН=6,5-7,5, что не соответствует физико-химическим параметрам природных местообитаний, из которых происходят илы донных отложений. Это существенно ограничивает протекание анаэробной биодеградации таких соединений при показанной нами ее потенциальной возможности и наличии микроорганизмов необходимых функциональных групп. Поскольку в природных водоемах невозможно привести физико-химические факторы к требуемым значениям, то при сбросе стоков, загрязненных ААВ, необходимо применять дополнительные методы очистки в искусственных системах с использованием специально разработанных препаратов на основе анаэробных микробных сообществ. Другим важным результатом работы является демонстрация воздействия ААВ на структурно-функциональную организацию сообществ, осуществляющих их деструкцию. Наши исследования подтвердили, что традиционный быстрый и удобный метод оценки токсичности по снижению ацетокластической активности свидетельствует об угнетении именно метаногенов и не позволяет выявить ингибирующее влияние исследуемых соединений на другие группы членов анаэробного сообщества. Проверка влияния ААВ, осуществленная нами на выделенных чистых культурах, показала, что одно и то же соединение может не ингибировать ацетокластический метаногенез и одновременно значительно подавлять развитие других членов трофической цепи. Доказательством «небезразличности» ААВ для сообщества также является наблюдаемое снижение общего количества клеток и изменение соотношения морфотипов, более выраженное в случае ароматических аминов как начальных субстратов. Большинство микроорганизмов в сообществе оказалось некультивируемыми, а те, которые удалось выделить в виде чистых культур, являлись представителями рутинных систематических групп, факультативными или аэротолерантными анаэробами с довольно пластичным метаболизмом. Изучение физиолого-биохимических возможностей выделенных микроорганизмов и привлечение литературных данных, а также создание из них искусственных ассоциаций позволили нам определить их функции в сообществе и соотнести их с этапами процесса деструкции ААВ. Показана возможность «сборки» искусственных сообществ как из микроорганизмов с аналогичными функциями, но из других источников, так и из выделенных в чистые культуры членов разных консорциумов, выполняющих одинаковый процесс биоразложения ААВ. Анализ собственных и литературных сведений показывает необходимость проведения тщательного мониторинга судьбы ААВ не только в окружающей среде, но и в организме человека и животных. Осуществленное в данной работе лабораторное моделирование свидетельствует о разрушении азокрасителей кишечными микробными сообществами млекопитающих по предложенной нами схеме. Не только запрещенные к использованию, но и разрешенные пищевые азокрасители подвергаются неполному разложению за времена нахождения в организме, а значит могут вызывать негативные изменения в структуре и функционировании нормальной микробиоты человека и животных. Поскольку отказ от их использования в современной жизни не представляется реальным, то следует прежде всего ограничить контакт с пищевыми азокрасителями чувствительных групп населения (особенно детей) и проводить очистку сточных вод от этих соединений вследствие риска для здоровья. Таким образом, наши исследования показали, что не только микробные сообщества могут преобразовывать азокрасители и ААК вплоть до полного превращения в биогаз, но и ААВ, в свою очередь, воздействуют на микробные сообщества, изменяют их структуру и функционирование. 42 Выводы: 1. Из илов очистных сооружений и донных осадков природных водоемов выделены и изучены анаэробные микробные сообщества, стабильно (5-10 лет) и с высокой активностью обесцвечивающие азокрасители и конвертирующие аминоароматические кислоты (0,07-0,8 мМ/сут) в биогаз, что делает их перпективными для биотехнологического использования. 2. Установлено, что анаэробная конверсия азокрасителей в биогаз, осуществляемая микробными сообществами, включает неспецифическую стадию обесцвечивания и специфический этап трансформации образовавщихся ароматических аминов, различающиеся механизмами, регуляцией и отношением к параметрам культивирования. 3. Определены продукты фрагментации испытанных зокрасителей и впервые идентифицированы основные ароматические и линейные интермедиаты анаэробной деструкции ААК. Предложена общая схема процесса разложения ААК путем первичной трансформации до соответствующих ароматических спиртов, окисляющихся до бензойной кислоты, с ее последующей деароматизацией и образованием смеси ЛЖК, спиртов, СО 2 и Н2, превращающихся через синтрофную стадию в биогаз. Установлено, что метаногенные сообщества разрушают ААК по бензоил-КоА-пути. 4. Показано, что ААВ оказывают селективное воздействие на метаногенные микробные сообщества, снижая общее количество клеток и биоразнообразие в них и вызывая смену доминирующих видов. В свою очередь, активные консорциумы в определенных пределах способны к самокоррекции своей структуры в ответ на воздействие различных факторов. 5. Определен компонентный состав активных метаногенных сообществ и показано преобладание в них некультивируемых микроорганизмов, близких к Bacteroidetes и Clostridium. Выделено и идентифицировано до вида 7 чистых культур, установлены их возможные функции и предложена схема трофических связей при конверсии ААК в биогаз. 6. Показана принципиальная возможность «конструирования» сообществ с заданными свойствами как из микроорганизмов, выделенных из консорциумов различного происхождения, так и из коллекционных культур с аналогичными свойствами. 7. Путем лабораторного моделирования продемонстрирована необходимость проведения тщательного мониторинга судьбы ААВ в окружающей среде и в организме человека и животных из-за их неполного разложения в ЖКТ, способного привести к негативным изменениям структуры и функционирования нормальной микробиоты млекопитающих. Показана принципиальная возможность использования кишечных микробных сообществ для первичного тестирования пищевых азокрасителей. СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в журналах, рекомендованных ВАК: 1. Савельева О.В., Котова И.Б., Скляр В.И., Калюжный С.В., Нетрусов А.И. Выделение штамма Pseudomonas ASA2 из метаногенного сообщества, расщепляющего аминобензоат и аминосалицилат.// Микробиология.- 2002.- Т.71, № 2.- С.1-2. 2. Савельева О.В., Емашова Н.А., Котова И.Б., Нетрусов А.И., Калюжный С.В. Анаэробная биоконверсия аминоароматических соединений.// Успехи современной биологии.- 2003.- Т.123, № 4.- С.336-349. 3. Savelieva O., Kotova I., Roelofsen W., Stams A.J.M., Netrusov A. Conversion of aminoaromatic acids by a methanogenic enrichment and by a novel Citrobacter freundii strain.// Arch. Microbiol. - 2004. -Т. 181. - Р.163-170. 4. Yemashova N.A., Telegina A.F., Kotova I.B., Netrusov A., Kalyuzhnyi S.Decolorization and partial degradation of selected azo dyes by methanogenic sludge.// Appl. Biochem. and Biotechnol. 2004. - V.119, № 1. - Р. 31-40. 43 5. И.Б.Котова, О.В.Савельева, А.Т.Дьяконова, В.И.Скляр, С.В.Калюжный, А.Стамс, А.И.Нетрусов. Анаэробные микробные сообщества, разлагающие аминоароматические кислоты. // Прикл. биохим. и микробиол. - 2005. - Т.41, № 4.- С.422-428. 6. Н.А.Емашова, И.Б.Котова, А.И.Нетрусов, С.В.Калюжный. Особенности разложения азокрасителей анаэробными микробными сообществами. // Прикл. биохим. и микробиол. - 2009. - Т.45, № 2. - С. 195-201. 7. Линькова Ю.В., Есакова А.А., Дьяконова А.Т., Намсараев Б.Б., Котова И.Б., Нетрусов А.И. Проверка способности анаэробных микробных сообществ к разрушению аминоароматических ксенобиотиков. // Экология и промышленность России. - 2011 - №1. - С. 29-33. 8. Линькова Ю.В., Куликова И.А., Котова И.Б., Нетрусов А.И. Деградация азокрасителей и ароматических аминов метаногенными микробными сообществами из илов очистных сооружений // Вода: химия и экология. - 2011. - № 7 - С. 51-58. 9. Линькова Ю.В., Дьяконова А.Т., Гладченко М.А., Калюжный С.В., Котова И.Б., Стамс А., Нетрусов А.И. Метаногенная деструкция (амино)ароматических веществ анаэробными микробными сообществами // Прикл. биохим. и микробиол. - 2011. - Т.47, № 5. - С.558-565. 10. Линькова Ю.В., Котова И.Б., Нетрусов А.И. Способность микробных сообществ из донных отложений оз. Цайдам к метаногенной деструкции аминоароматических ксенобиотиков// Вода: химия и экология. - 2013. - №1. - С. 64-70. Главы в учебных пособиях: 1. Котова И.Б. Биоразрушения.// Экология микроорганизмов: Учеб. для студ. вузов/ Под ред.А.И.Нетрусова. – М.: Издательский центр «Академия». - 2004. – С.165-175. (272 с.). 2. Семенова Е.В., Котова И.Б., Нетрусов А.И. Получение накопительных и чистых культур анаэробных микроорганизмов.// Практикум по микробиологии. Учеб. для студентов вузов./Под ред.А.И.Нетрусова. – М.: Издательский центр «Академия».- 2005.- С.214-222 (608 с.). 3. Котова И.Б. Анаэробная биодеградация азокрасителей и их производных.// Практикум по микробиологии. Учеб. для студентов вузов./Под ред.А.И.Нетрусова. – М.: Издательский центр «Академия».- 2005.- С. 376-387 (608 с.). 4. А.И.Нетрусов, И.Б.Котова. Взаимоотношения микроорганизмов друг с другом. Проблема загрязнения природных экосистем и возможности самоочищения. Микробиологическая очистка сточных вод и переработка отходов.// А.И.Нетрусов, И.Б.Котова. Микробиология Учеб. для студ. вузов.– М.: Издательский центр «Академия». - 2006. – С. 266-268, 290-292, 313-314 (352 с.) 5. А.И.Нетрусов, И.Б.Котова. Взаимоотношения микроорганизмов друг с другом. Проблема загрязнения природных экосистем и возможности самоочищения. Синтетические химические соединения и их детоксикация микроорганизмами.// А.И.Нетрусов, И.Б.Котова. Общая микробиология. Учеб. для студ. вузов.– М.: Издательский центр «Академия». - 2007. – C. 180181, 206-209 (288 с). 6. А.И.Нетрусов, И.Б.Котова. Взаимоотношения микроорганизмов друг с другом. Проблема загрязнения природных экосистем и возможности самоочищения. Микробиологическая очистка сточных вод и переработка отходов.//А.И.Нетрусов, И.Б.Котова. Микробиология Учеб. для студ. вузов. 2-е издание. – М.: Издательский центр «Академия». - 2007. – С. 266-268, 290-292, 313-314 (352 с). 7. А.И.Нетрусов, И.Б.Котова. Взаимоотношения микроорганизмов друг с другом. Проблема загрязнения природных экосистем и возможности самоочищения. Микробиологическая очистка сточных вод и переработка отходов.// А.И.Нетрусов, И.Б.Котова. Микробиология Учеб. для студ. вузов. 3-е издание, исправл. – М.: Издательский центр «Академия». - 2009. – С. 266-268, 290-292, 313-314 (352 с). 44 8. А.И.Нетрусов, И.Б.Котова. Микробное сообщество.Синтрофия. Микробные местообитания. Пространственное расположение микроорганизмов. Проблема загрязнения природных экосистем и возможности самоочищения.// А.И.Нетрусов, И.Б.Котова. Микробиология: учеб. для студ. учреждений высш. проф. образования. Бакалавриат, педагогическое образование.- М.: Издательский центр «Академия». - 2012. – С. 237-239, 277281, 292-294 (384 с). 9. А.И.Нетрусов, И.Б.Котова. Взаимоотношения микроорганизмов друг с другом. Рост микроорганизмов в прикрепленном состоянии. Проблема загрязнения природных экосистем и возможности самоочищения. Микробиологическая очистка сточных вод и переработка отходов.// А.И.Нетрусов, И.Б.Котова. Микробиология. Университетский курс: учебник для студ. учреждений высш. проф. образования. Бакалавриат. - 4-е изд., перераб. и доп. - М.: Изд. центр «Академия», 2012. – С. 281-283, 299-300, 306-308, 342-348 (384 с). 10. Котова И.Б. Биоразрушения.// Экология микроорганизмов: Учеб. для бакалавров. 2-е издание/ Под ред.А.И.Нетрусова. – М.: Издательство «Юрайт», 2013. - (в печати). Статьи в других журналах и сборниках: 1. Savelieva O., Kotova I., Sklyar V., Kalyuzhnyi S., Netrusov A. Anaerobic microbial communities degrading of various aminoaromatics.// “Anaerobic digestion for sustainability in waste (water) treatment and re-use”. Proc. 7th FAO/SREN – Workshop, 19-22 May 2002, Moscow, Russia.М., 2002.- V.1.- Р. 84-90. 2. Esakova A., Diakonova A., Kotova I., Netrusov A. Analysis of the ability of anaerobic sediments to transform aminoaromatic xenobiotics.// “Anaerobic digestion for sustainability in waste (water) treatment and re-use”. Proc. 7th FAO/SREN – Workshop, 19-22 May 2002, Moscow, Russia.М., 2002.- V.2.- Р. 415-416. 3. Yemashova N.A., Telegina A.F., Kotova I.B., Kalyuzhnyi S.V. Degradation of azo dyes by methanogenic sludge // In Biocatalytic Technology and Nanotechnology. Ed.: G.E. Zaikov, Nova Science Publisher. - 2004. - Р. 41-50. 4. Ю.В.Линькова, А.Т.Дьяконова, И.Б.Котова, А.И.Нетрусов. Метаногенные микробные сообщества, разрушающие ароматические соединения.// «Экологические проблемы промышленных городов». Сборник научных трудов. Ч.1. – Саратов: СГУ, 2009. – С. 38-39. 5. И.Б.Котова, Ю.В.Линькова, И.А.Куликова, А.Т.Дьяконова, А.И.Нетрусов Особенности микробных сообществ, способных разрушать аминоароматические ксенобиотики в анаэробных условиях.// «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии». Материалы VII Международной конференции (Минск, 31 мая – 4 июня 2010 г.) - Минск: «Белоруская навука», 2010. – С. 360-362. 6. Линькова Ю.В., Котова И.Б., Нетрусов А.И. Особенности микробных сообществ, способных разрушать аминоароматические ксенобиотики в анаэробных условиях.// Материали за VII международна научна практична конференция «Найновите постижения на европейската наука - 2011», 17-25-ти юни 2011, Ветеринарна наука, Биологии. - София, «Бял ГРАД-БГ» ООД, 2011. - Т. 32. - С. 66-68. Тезисы научных конференций: 1. Kalyuzhnyi S.V., Sklyar V.I., Mosolova T.P., Kucherenko I.A., Degtyarova N.N., Russkova Y.I., Kotova I.B., Netrusov A.I. Methanogenic biodegradation of selected aminobenzoates and aminosalicylates.// “Microbial and cellular systems for Pharmacology, Biotechnology, Medicine and Environment” INTAS Symp., Moscow, 26-30 May 1999.- М., 1999.- С. 52-53. 2. Савельева О.В., Котова И.Б., Нетрусов А.И. Анаэробное сообщество, разлагающее 2аминобензойную кислоту.//Тр. Науч. Конф. «Проблемы экологии и физиологии 45 микроорганизмов (к 110-летию со дня рождения проф. Е.Е.Успенского)», Москва, 21 декабря 1999 г.- М., 2000.- С. 93. 3. Тян А.Т., Брюханов А.Л., Котова И.Б., Нетрусов А.И. Разложение 5-аминосалициловой кислоты в анаэробных условиях консорциумом микроорганизмов.// Тр. Науч. Конф. «Проблемы экологии и физиологии микроорганизмов (к 110-летию со дня рождения проф. Е.Е.Успенского)», Москва, 21 декабря 1999 г.- М., 2000.-С. 103. 4. Мятлева-Савельева О.В., Котова И.Б., Нетрусов А.И. Микробное разложение изомеров аминобензойной кислоты в анаэробных условиях.//Тр. Науч. конф. мол. ученых «Горизонты физико-химической биологии», Пущино, 28 мая – 2 июня 2000 г.- Пущино, 2000.- С. 54. 5. Savelieva O., Kotova I., Diakonova A., Sklyar V., Stams A., Netrusov A. Biodegradation of selected aminoaromatic compounds under anaerobic conditions.//Proc. 9th Int. Symp. On Microbial Ecology “Interactions in microbial world”, Amsterdam, The Netherlands, 26-31 August 2001.Amsterdam, 2001.- Р. 372. 6. Емашова Н.А., Телегина А.Ф., Котова И.Б., Калюжный С.В. Разложение азокрасителей метаногенным консорциумом микроорганизмов.//"Биотехнология: состояние и перспективы развития". Материалы II Международ. Конгресса, 10-14 ноября 2003, Москва, Россия. - М., 2003. - Ч.2. - С. 216-217. 7. Емашова Н.А., Телегина А.Ф., Котова И.Б., Нетрусов А.И., Калюжный С.В. Конверсия Nзамещенных ароматических веществ метаногенным консорциумом микроорганизмов.//"Биотехнология микробов". Материалы Всеросс. Симп., посвященного 120летию со дня рожд. акад. В.Н.Шапошникова, 20-23 октября 2004 г, Москва, Россия.- М.:"Макс Пресс", 2004.- С. 28. 8. Есакова А.А., Дьяконова А.Т., Котова И.Б., Нетрусов А.И. Использование аминоароматических соединений метаногенными микробными ассоциациями из донных отложений водоемов с разными физико-химическими свойствами. //"Биотехнология микробов". Материалы Всеросс. Симп., посвященного 120-летию со дня рожд. акад. В.Н.Шапошникова, 2023 октября 2004 г, Москва, Россия.- М.:"Макс Пресс", 2004.- С. 30. 9. Линькова Ю.В., Дьяконова А.Т., Котова И.Б., Нетрусов А.И. Структура анаэробных микробных сообществ, потребляющих аминоароматические субстраты.//"Биотехнология микробов". Материалы Всеросс. Симп., посвященного 120-летию со дня рожд. акад. В.Н.Шапошникова, 20-23 октября 2004 г, Москва, Россия.- М.:"Макс Пресс", 2004.- С. 54. 10. Линькова Ю.В., Есакова А.А., Дьяконова А.Т., Котова И.Б., Нетрусов А.И.Влияние начальных условий культивирования на потребление 2-аминобензойной кислоты метаногенными ассоциациями из донных отложений естественных водоемов. //"Биотехнология микробов". Материалы Всеросс. Симп., посвященного 120-летию со дня рожд. акад. В.Н.Шапошникова, 20-23 октября 2004 г, Москва, Россия.- М.:"Макс Пресс", 2004.- С. 55. 11. Линькова Ю.В., Дьяконова А.Т., Котова И.Б., Нетрусов А.И. Анаэробные сообщества микроорганизмов, разрушающие аминоароматические соединения.// «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды». Материалы Международной конференции, 14-16 сентября 2005 г, Саратов, Россия.- Саратов: Изд-во «Научная книга», 2005.С. 32-33. 12. Телегина А.Ф., Емашова Н.А., Котова И.Б., Нетрусов А.И. Воздействие физикохимических факторов на формирование активного анаэробного сообщества, разрушающего азокрасители.// «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды». Материалы Международной конференции, 14-16 сентября 2005 г, Саратов, Россия.- Саратов: Изд-во «Научная книга», 2005.- С. 116-117. 13. Дьяконова А.Т., Котова И.Б., Нетрусов А.И. Скрининг штаммов Citrobacter freundii на способность к первичной трансформации аминоароматических кислот.// «Автотрофные микроорганизмы». Материалы Всероссийского симпозиума с международным участием, 21-24 декабря 2005 г, Москва, Россия.- М.: МАКС Пресс, 2005.- С. 89. 46 14. Емашова Н.А., Телегина А.Ф., Котова И.Б., Калюжный С.В., Нетрусов А.И. Разрушение азокрасителей и их ароматических производных метаногенными микробными сообществами.// «Автотрофные микроорганизмы». Материалы Всероссийского симпозиума с международным участием, 21-24 декабря 2005 г, Москва, Россия.- М.: МАКС Пресс, 2005.- С. 90. 15. Piksasova O.V., Cherdintseva T.A., Kotova I.B., Ulumdjiev A.N., Netrusov A.I. Collection of Potential Strains of Probiotic Lactic Acid Bacteria from Natural Sources. EUPROBIO 2008 (Краков – Польша, 15-17 октября 2008 г.) Материалы, тезисы докладов. - Krakow: Polskie Towarzystwo Probiotyczne i Prebiotyczne, 2008 - С. 72. 16. Линькова Ю.В., Дьяконова А.Т., Котова И.Б., Нетрусов А.И. Деструкция некоторых ароматических соединений анаэробными микробными сообществами.//12-я Международная пущинская школа-конференция мол. ученых «Биология – наука XXI века». Сборник тезисов, Пущино, 10-14 ноября 2008 г., Пущино, 2008. – С. 268. 17. Куликова И.А., Дьяконова А.Т., Линькова Ю.В., Котова И.Б., Нетрусов А.И. Разрушение двух пищевых азокрасителей анаэробными микробными сообществами различного происхождения.// «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов». Материалы Всеросс. симпозиума с международ. участием, МГУ им. Ломоносова, биол. ф-т, 24-27 дек. 2009 г. – М.: МАКС Пресс, 2009. – С. 99. 18. Чердынцева Т.А., Котова И.Б., Пиксасова О.В., Нетрусов А.И. Поиск новых штаммов бактерий молочнокислой группы как потенциальных пробиотиков.// «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов». Материалы Всеросс. симпозиума с международ. участием, МГУ им. Ломоносова, биол. ф-т, 24-27 дек. 2009 г. – М.: МАКС Пресс, 2009. –С. 198. 19. Линькова Ю.В., Дьяконова А.Т., Котова И.Б., Нетрусов А.И. Деструкция аминоароматических кислот анаэробными микробными сообществами. Труды научн. конференции “Экосистемы. Организмы. Инновации-11”: Москва, 24 июня 2009 г. - М.: МаксПресс, 2010. - С. 59. 20. Чердынцева Т.А., Котова И.Б., Пиксасова О.В., Пименова М.А., Мельников В.Г., Хлебников В.С., Абрамов В.М., Нетрусов А.И.. Новые штаммы лактобацилл, выделенные из природных источников, как потенциальные пробиотики. // «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии». Материалы VII Международной конференции. Минск, 31 мая – 4 июня 2010 г.. - Минск: «Белоруская навука», 2010. – С. 76 - 77. 21. Линькова Ю.В., Котова И.Б., Куликова И.А., Дьяконова А.Т., Нетрусов А.И.. Особенности физиологии анаэробных микробных сообществ, использующих аминоароматические вещества.// «Актуальные аспекты современной микробиологии». Тезисы VI молодежной школы-конференции с международным участием. Москва, 25-27 октября 2010 г. - М.: Макс пресс, 2010.- С. 41-43. Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность своему научному консультанту д.б.н., проф. Нетрусову А.И. и д.х.н., проф. Калюжному С.В., по инициативе которых было начато это исследование, за постоянное внимание, помощь и заинтересованное обсуждение результатов. Автор искренне признателен своим соратникам, принимавшим участие в работе на разных ее этапах: сотрудникам, дипломникам и аспирантам каф. микробиологии биологического факультета МГУ им. Ломоносова - к.б.н. Линьковой Ю.В., к.б.н. Савельевой О.В., Дьяконовой А.Т., Есаковой А.А., Куликовой И.А., Пуреховской К.А. и сотрудникам каф. химической энзимологии химического факультета МГУ им.Ломоносова - к.х.н. Скляру В.И., к.х.н. Емашовой Н.А. и к.х.н. Гладченко М.А. Хотелось бы выразить огромную благодарность д.б.н., проф. Егорову Н.С., в группе которого я начинала свою научную деятельность, и с бесконечной признательностью вспомнить моего первого наставника к.б.н. Н.С.Ландау. 47 Автор искренне благодарен д.б.н. Т.Г.Юдиной за консультации и помощь в осуществлении электронно-микроскопических исследований, к.б.н. Е.С.Милько - за консультации и методическую помощь в вопросах диссоциации микроорганизмов, к.б.н. Е.В.Семеновой - за критическое обсуждение проблем биодеградации ксенобиотиков, к.б.н. Т.А.Чердынцевой - за участие в работе с лактобациллами и постоянную экспериментальную помощь. Автор признателен д.б.н. Т.П.Туровой (Институт микробиологии им. С.Н.Виноградского РАН) и сотрудникам группы молекулярно-биологической идентификации Центра «Биоинженерия» РАН за помощь в проведении и интерпретации результатов филогенетического анализа. Хочется поблагодарить проф. А.Стамса и сотрудников его лаборатории (Университет Вагенингена, Нидерланды) за предоставление аппаратурной базы, методическую помощь, обсуждение результатов и советы по дальнейшим направлениям исследований. Автор выражает признательность всем сотрудникам и преподавателям кафедры микробиологии биологического факультета МГУ им. Ломоносова, оказывавшим разнообразную помощь в процессе выполнения работы. Большое спасибо членам моей семьи и моим друзьям за постоянную моральную поддержку и веру в успех. Список сокращений ААВ - аминоароматическое(ие) вещество(а); ААК - аминоароматическая(ие) кислота(ы); АБК, АСК - аминобензойная и аминосалициловая кислоты, соответственно; АПТ - ароматический продукт трансформации; АО6, АО7, Az, МО, MR, PS, SY, Tn - Acid Orange 6, Acid Orange 7, Azophloxine, Methyl Orange, Methyl Red, Ponceau S, Sunset Yellow FCF, Tartrazine, соответственно; БА, БК, БС, ГБС - бензальдегид, бензоат, бензиловый и гидроксибензиловый спирты, соответственно; БВБ - беззольное вещество биомассы; БЭСК - бромэтансульфоновая кислота; ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография; ГБК, ДГБК, СалК - гидроксибензойная, дигидроксибензойная и салициловая (2-гидроксибензойная) кислоты, соответственно; ДГГЭ - денатурирующий градиентный гельэлектрофорез; ДМФ - N,N-диметил-п-фенилендиамин; ЕР, КСА, СК - мезофильный гранулярный ил из EGSB-реактора очистных сооружений пивоваренного завода «Efes Pilsener» (Москва) и мезофильные флокулярные илы очистных сооружений Курьяновской станции аэрации (Москва) и свиноводческих комплексов (Россия), соответственно; ЖКТ - желудочно-кишечный тракт; IC50 - концентрация субстрата, при которой ацетокластическая метаногенная активность микробного сообщества снижается на 50%; ЛЖК - летучие жирные кислоты; м.ч. - масштабная черта; ПЦР - полимеразная цепная реакция; ФВ, ФКЗ, ФКР, ФЛ, ФО, ФС - фекалии верблюда, козы, коровы, лошади, оленя, свиньи, соответственно, из национального парка «Хвалынский» Саратовской области; ФЧ1 и ФЧ2 - фекалии ребенка 3,5 (1) и 5,5 (2) лет, соответсвенно; Х, Ц, Дж - донные отложения озер Хилганта, Цайдам (Россия, Бурятия) и реки Джамна (Индия), соответственно; ХПК - химическое потребление кислорода. 48
