УДК 577.322.2: 57.088.53 КОНКУРЕНТНОЕ СВЯЗЫВАНИЕ Н2О

142
Горюнов А.С., Суханова Г.А., Рожков С.П.
УДК 577.322.2: 57.088.53
КОНКУРЕНТНОЕ СВЯЗЫВАНИЕ Н2О И D2О И МЕЖБЕЛКОВЫЕ
ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ В РАСТВОРЕ ПО ДАННЫМ 1Н ЯМР
Горюнов А.С., Суханова Г.А., Рожков С.П.
Институт биологии Карельского НЦ РАН, Петрозаводск
Аномальные эффекты тяжелой воды (D2O) в отношении структурных и
функциональных свойств биомолекул, а также изотопные эффекты на более
высоких уровнях организации живого служат иллюстрацией важного значения
гидратации [1-3]. Связывание белком воды (H2O/D2O) изучено в основном в
адсорбционных экспериментах на увлажненных порошках малых глобулярных
белков, а также для белковых кристаллов и пленок [4]. В этой связи важной
задачей остается анализ гидратации белка в водном растворе с точки зрения
фракционирования изотопов растворителя между гидратной и свободной
водой. С целью количественной оценки Н/D замещения гидратной воды белка
использовался экспериментальный подход, основанный на том, что растворы
макромолекул не обладают эвтектическими свойствами, характерными для
низкомолекулярных растворенных веществ. Напротив часть воды не замерзает
вплоть до 200 К, когда она переходит в стеклообразное состояние.
МЕТОДИКА.
Содержание протонов в незамерзающей воде при температурах в
интервале от -10 до –40 °С определяли по интенсивности относительно более
узкого сигнала 1Н ЯМР воды с помощью спектрометра Tesla BS-467,
оснащенного стандартным термозондом с точностью поддержания
температуры ±1 °С. Последовательная запись спектров в интервале от -10 до
-40 °С проводилась при увеличении темперуры от –50 °С и выдерживании
образцов при каждой температуре по 15 мин. Абсолютную гидратацию
рассчитывали исходя из величины сигнала стандарта – водного раствора 24 %
LiCl, 0.10 % MnCl2, который не замерзает до температуры –50 °С и имеет
концентрацию воды 48,5 М при –35 °С [5]. Особенность настоящей работы – в
применении этого метода к белкам, растворенным в смешанном H2O-D2O
растворителе. При этом увеличение содержания D2O приводит к снижению
интенсивности сигнала 1Н ЯМР воды. Используя количество незамерзающей
воды как оценку гидратации, можно определить долю x атомов D в гидратной
воде как функцию общей доли хо атомов D воды раствора до замерзания:
x = (Ho,t – H %,t)/Ho,t = D %,t/H %,t ,
где Ho,t и H %,t – гидратация белка в отсутствии (0) и в присутствии ( %) D2O в
растворе при температуре t. Фракционирование изотопов растворителя
описывается с помощью показателя фракционирования [2]:
φ = [x/(1-x)]/[x0/(1-x0)] ,
где x и x0 – доли дейтерия в гидратной воде и в растворе в целом.
Структура и динамика молекулярных систем. Яльчик-2002. Т. 1.
а
0,5
12
0,4
10
8
0,3
0,2
2
0,0
0,1
0,7
0,2
x0
0,3
0,4
0
0,0
0,5
8
в
0,2
0,3
x0
0,4
0,5
г
6
0,5
5
0,4
4
0,3
3
2
1
0,2
0,1
0,1
7
0,6
φ
Гидратация, г Н2О/г белка
6
4
0,1
0,0
б
14
φ
Гидратация, г Н2О/г белка
0,6
143
0
0,0
0,1
0,2
x0
0,3
0,4
0,5
0,0
0,1
0,2
x0
0,3
0,4
0,5
Рис. 1. Изотермические зависимости гидратации (а,в) и показателя H/D
фракционирования (φφ) (б, г) от долевого содержания D2O (хо) в белковом растворе. а, б
– иммуноглобулин G; в, г – гемоглобин человека (HbA, окси форма).
● – -40 оС, ▲ – -35 оС, ▼ – -30 оС, ! – -25 oС, ◄ – -20 оС, ► – -15 оС, " – -10 оС.
Определение гидратации проводилось в смесях обычной и тяжелой воды при
рН = рНизмеренное, что обеспечивало идентичность электростатического
состояния белковых молекул [1]. Для приготовления образцов использовались
иммуноглобулин (IgG) и гемоглобин человека (HbA) в окси и мет формах,
полученные из свежей донорской крови, а также лиофилизированный
гемоглобин лошади (HbH) (Reanal) в мет форме. Образцы белковых растворов
для измерений готовились путем добавления концентрированных белковых
растворов к буферным растворам с заданной концентрацией D2O.
Концентрация белка была: 20 мг/мл для IgG и 50 мг/мл для HbA и HbH.
Горюнов А.С., Суханова Г.А., Рожков С.П.
144
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
На рис. 1 и 2 представлены прямые данные о количестве сорбированной
H2O в присутствии тяжелого изотопа (дейтерия) (абсолютной
2
0,4
φ
Гидратация, г Н2О/г белка
4
0,5
0,3
0,2
0
-2
0,1
0,0
0,8
0,1
0,2
x0
0,3
0,4
0,5
в
0,7
-4
0,0
0,1
x0
0,3
0,4
0,5
0,3
0,4
0,5
г
12
0,6
0,2
9
0,5
6
0,4
φ
Гидратация, г Н2О/г белка
б
а
0,6
0,3
3
0,2
0
0,1
0,0
0,1
0,2
0,3
x0
0,4
0,5
-3
0,0
0,1
0,2
x0
Рис. 2. Изотермические зависимости, аналогичные представленным на рисунке 1 для
метгемоглобина человека (а, б) и лошади (в,г). ● – -40 оС, ▲ – -35 оС, ▼ – -30 оС,
! – -25 оС, ◄ – -20 оС, ► – -15оС, " – -10оС.
гидратации H %,t) и результаты определения показателя фракционирования φ. Из
данных рис. 1,2 (а, в), в частности, можно видеть, что гидратация IgG
составляет 0,09±0,02, окси HbA 0,33±0,03, мет HbA 0,26±0,03, мет HbH
0,28±0,03 г воды/г белка, что хорошо согласуется с данными различных
методов для этих белков [4]. Значения φ рис. 1,2 (б, г) как правило превышают
единицу, что свидетельствует о преимущественном связывании тяжелого
изотопа белком и об обогащении гидратной воды тяжелой водой. Этот эффект
наиболее выражен при концентрациях D2O до 10 %, что является прямым
подтверждением изотопного эффекта низких концентрации D2O.
Структура и динамика молекулярных систем. Яльчик-2002. Т. 1.
145
Однако полученные значения φ в большинстве случаев оказались
чрезвычайно высоки. Так, для IgG при -35°С и x0 = 0,05 φ ≈ 14, для HbA при 30°С и x0 = 0,03 φ ≈ 7, для мет HbA при -25°С и x0 = 0,03 φ ≈ 4, для мет HbH при
-40°С и x0 = 0,03 φ ≈ 12. Любое отклонение от φ = 1 должно быть результатом
влияния изотопного H/D замещения на величину нулевых колебательных (и
либрационных) вкладов в энергию водородной связи в двух окружениях –
гидратной и объемной воде. Однако можно считать твердо установленным, что
вода на поверхности белка лишь в небольшой степени отличается от объемной
воды [6]. Показатель фракционирования φ для гидратной воды должен, таким
образом, быть ближе к единице, чем величина φ = 1,021 ± 0,001, полученная для
H/D фракционирования между льдом и обычной водой [7]. Даже для молекулы
воды непосредственно координированной ионом Со2+ в карбоангидразе φ
существенно не отличается от единицы (φ = 1,05 ± 0,17) [8]. Более сильного
эффекта фракционирования можно было бы ожидать для гидрогенных центров
ОН-, СООН- и NH2-групп из-за влияния ковалентных связей, но даже в этом
случае φ = 1,0 ± 0,1 [2]. Поэтому преимущественное связывание D2O не может
объяснить полученных нами столь больших значений φ.
Известно, что гидратация макромолекул в растворе существенным
образом зависит от их взаимодействия [4]. С другой стороны, многочисленные
данные свидетельствуют об усилении как внутри-, так и межмолекулярных
взаимодействий белков в присутствии D2O в растворе [1]. Это позволяет
предположить, что наблюдаемые в описанном эксперименте аномально
высокие значения φ могут быть обусловлены снижением видимой гидратации
белковых молекул при их взаимодействии, интенсивность которого
увеличивается в присутствии тяжелого изотопа D. В соответствии с таким
представлением эффект фракционирования должен быть наиболее выражен у
IgG и оксиHb, так как IgG известен своей склонностью к образованию
аггрегатов в растворе, а оксиHb имеет наибольшую гидратацию. Именно такое
соотношение эффектов у изученных белков и следует из рисунков 1 и 2.
Таким образом, в основе аномального эффекта D2O в биологических
системах может лежать воздействие тяжелой воды на внутри- и
межмолекулярные взаимодействия белковых молекул.
Работа выполнена при поддержке РФФИ (грант 00-04-49315).
ЛИТЕРАТУРА
1. Лобышев В.И., Калиниченко Л.П. Изотопные эффекты D2O в биологических
системах. М.: Наука, 1978.
2. Schowen KB, Schowen RL.// Methods Enzymol. 1982. V. 87. P. 551.
3. Xie M. et al. // Bioorg. Med. Chem. 1994. V. 2. N. 7. P. 691.
4. Rupley J.A., Carreri G.// Adv. Prot. Chem. 1991. V. 41. P. 172.
5. Hays, D.L., Fennema O.// Arch. Biochem. Biophys. 1982. V. 213. P. 1.
6. Denisov V.P., Halle B.// J. Mol. Biol. 1995. V. 245. N. 5. P. 682.
7. Aranson B. // J.Phys. Chem. 1969. V. 73. P. 3491.
8. Silverman D.N.// J.Am. Chem. Soc. 1981. V. 103. P. 6242.