Пименова Мария Анатольевна Цитогенетическая
реклама
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Гематологический научный центр» Министерства здравоохранения Российской Федерации На правах рукописи Пименова Мария Анатольевна Цитогенетическая характеристика гемопоэтических и стромальных клеток-предшественниц у больных миелодиспластическими синдромами 14.01.21 – гематология и переливание крови Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: академик РАМН доктор медицинских наук, профессор В. Г. Савченко Москва 2014 2 Оглавление Список используемых сокращений ............................................................................. 5 Введение ......................................................................................................................... 7 Актуальность проблемы ............................................................................................ 7 Цель исследования ..................................................................................................... 8 Задачи исследования .................................................................................................. 8 Научная новизна и практическая ценность работы................................................ 9 Основные положения, выносимые на защиту ....................................................... 10 Структура диссертации .......................................................................................... 10 1. Обзор литературы ................................................................................................... 11 1.1. История знаний о МДС .................................................................................... 12 1.2. Классификация МДС ........................................................................................ 13 1.3. Цитогенетические исследования при МДС ................................................... 18 1.4. Клиническое значение хромосомных аномалий при МДС ......................... 20 1.4.1. Аномалии хромосомы 5 ................................................................................... 21 1.4.2. Аномалии хромосомы 7 ................................................................................... 22 1.4.3. Аномалии хромосомы 8 .................................................................................. 23 1.4.4. Комплексный кариотип и клональная эволюция ........................................... 24 1.5. МДС – клональное заболевание стволовой кроветворной клетки ............. 25 1.5.1. Цитогенетические исследования кроветворных клеток-предшественниц . 29 1.6. Роль стромального микроокружения ............................................................. 30 1.6.1. Строма костного мозга. Мезенхимальные стромальные клетки ................ 30 1.6.2. Функциональные особенности стромы при МДС ......................................... 33 1.6.3. Цитогенетические исследования клеток стромы .......................................... 35 2. Материалы и методы .............................................................................................. 40 2.1. Дизайн исследования ....................................................................................... 40 3 2.2. Характеристика больных ................................................................................. 41 2.3. Лабораторные исследования ........................................................................... 42 2.3.1. Получение фракции мононуклеаров .............................................................. 42 2.3.2. Селекция CD34+ кроветворных клеток-предшественниц из костного мозга и периферической крови............................................................................................. 43 2.3.3. Получение культуры МСК .............................................................................. 44 2.3.4. Стандартное цитогенетическое исследование .............................................. 46 2.3.5. Флюоресцентная in situ гибридизация ........................................................... 46 2.4. Статистический анализ .................................................................................... 49 3. Результаты и обсуждение ...................................................................................... 50 3.1. Цитогенетическое исследование клеток костного мозга ............................. 50 3.2. Определение групп риска в соответствии с прогностическими шкалами IPSS, WPSS и IPSS-R .............................................................................................. 52 3.3. Результаты динамического наблюдения за больными МДС........................ 56 3.4. Характеристика CD34+ клеток-предшественниц, полученных из костного мозга и периферической крови .............................................................................. 60 3.4.1. Содержание CD34+ клеток в костном мозге и периферической крови ...... 60 3.4.2. Исследование цитогенетических аномалий в CD34+ клетках ...................... 63 3.4.3. Хромосомные аномалии в CD34+ клетках в зависимости от клинического варианта заболевания ................................................................................................. 68 3.4.4. Хромосомные аномалии в CD34+ клетках в зависимости от их прогностической значимости ..................................................................................... 69 3.4.5. Хромосомные аномалии в CD34+ клетках в зависимости от клеточности костного мозга ............................................................................................................ 70 3.4.6. Хромосомные аномалии в CD34+ клетках в зависимости от фиброза в костном мозге ............................................................................................................. 71 3.5. Характеристика МСК костного мозга ............................................................ 72 3.5.1. Темпы роста культуры МСК у больных и здоровых лиц ............................ 72 4 3.5.2. Темпы роста культуры МСК в зависимости от клинического варианта заболевания, группы риска IPSS-R, клеточности костного мозга и наличия фиброза ........................................................................................................................ 75 3.5.3. Стандартное цитогенетическое исследование МСК .................................... 78 3.5.4. Цитогенетическое исследование МСК методом FISH ................................. 80 3.5.5. Клиническое наблюдение пациента с клональными нарушениями кариотипа МСК .......................................................................................................... 83 Заключение ................................................................................................................. 87 Выводы ........................................................................................................................ 90 Библиографический список ....................................................................................... 91 Приложение 1 ............................................................................................................ 112 5 Список используемых сокращений МДС – миелодиспластический синдром СКК – стволовая кроветворная клетка МСК – мезенхимальные стромальные клетки РА – рефрактерная анемия РН – рефрактерная нейтропения РТ – рефрактерная тромбоцитопения РЦ – рефрактерная цитопения РЦУД – рефрактерная цитопения с унилинейной дисплазией РАКС – рефрактерная анемия с кольцевыми сидеробластами РЦМД – рефрактерная цитопения с мультилинейной дисплазией РАИБ – рефрактерная анемия с избытком бластов РАИБ-Т – РАИБ в трансформации ОМЛ – острый миелоидный лейкоз ХММЛ – хронический миеломоноцитарный лейкоз КС – кольцевые сидеробласты Алло-ТСГК – трансплантация аллогенных гемопоэтических стволовых клеток HLA – человеческий лейкоцитарный антиген (главный комплекс гистосовместимости) FAB – франко-американо-британская группа ПЦР – полимеразная цепная реакция IPSS – международная прогностическая шкала риска ВОЗ – Всемирная организация здравоохранения WPSS – прогностическая шкала риска ВОЗ IPSS-R – пересмотренная международная прогностическая шкала риска FISH – флюоресцентная in situ гибридизация ХМПЗ – хронические миелопролиферативные заболевания ЦСА – циклоспорин А 6 МНС – главный комплекс гистосовместимости ЭПО – эритропоэтин Ara-C – цитозин-арабинозид Г-6-ДГ – глюкозо-6-дегидрогеназа CD – кластер дифференцировки Г-КСФ – гранулоцитарный колониестимулирующий фактор ГМ-КСФ – гранулоцитарно-макрофагальный КСФ ХМЛ – хронический миелолейкоз ПЦР – полимеразная цепная реакция NK – натуральные киллеры MMP – матриксные металлопротеиназы ЭДТА – этилендиаминтетрауксусная кислота ФГА – фитогемагглютинин ЭПО – эритропоэтин Ara-C – цитозин-арабинозид АЧН – абсолютное число нейтрофилов 7 Введение Актуальность проблемы Миелодиспластические синдромы заболеваний системы крови, (МДС) – группа клональных характеризующихся дисплазией одного или нескольких ростков миелопоэза, неэффективным кроветворением, которое проявляется цитопеническим синдромом, а также повышенным риском развития острого миелоидного лейкоза. Эффективное лечение МДС в настоящее время не разработано. Единственным методом биологического излечения является трансплантация аллогенных гемопоэтических стволовых клеток, однако ее эффективность ограничена как возможностью выполнения (отсутствие HLAсовместимого донора, пожилой возраст и тяжелый соматический статус больного), так и частотой рецидивов заболевания. Результаты химиотерапевтического лечения остаются крайне неутешительными, что делает необходимым проведение дальнейших исследований в этой области гематологии с целью более глубокого понимания патогенетических путей развития заболевания и разработки принципиально новых подходов к терапии. Известно, что развитие клональных нарушений, приводящих к диспластическим изменениям в костном мозге, изначально происходит в стволовой кроветворной клетке (СКК) и ранних гемопоэтических (кроветворных) клетках-предшественницах. В то же время функционирование, деление и дифференцировка незрелых кроветворных клеток обеспечивается их взаимодействием со стромальным микроокружением, которое строит «дом» для гемопоэтических клеток и во многом определяет их дальнейшую судьбу. Согласно данным многочисленных исследований функционирование стромы костного мозга при МДС нарушено, что может быть объяснено участием микроокружения в ходе развития заболевания. Цитогенетическое исследование клеток костного мозга входит в перечень обязательного обследования на этапе установления диагноза МДС. Хромосомные аномалии выявляют примерно у половины больных, они являются 8 критерием подтверждения диагноза, фактором прогноза ответа на лечение и продолжительности жизни. Вместе с тем изучение цитогенетических особенностей как кроветворных, так и стромальных клеточных компонентов костного мозга имеет важное теоретическое значение для более глубокого понимания биологических процессов, лежащих в основе заболевания. Имеющиеся в литературе данные цитогенетических исследований клеток стромы костного мозга противоречивы. В связи с этим для получения более глубокого представления о биологических процессах, лежащих в основе заболевания, представляется важным изучение хромосомных аномалий не только в зрелых кроветворных клетках костного мозга, но и прицельно в популяциях ранних клеток-предшественниц, принимающих непосредственное участие в патогенезе МДС, – CD34+ гемопоэтических клетках и мезенхимальных стромальных клетках (МСК). Цель исследования Охарактеризовать цитогенетические особенности CD34+ гемопоэтических клеток-предшественниц мезенхимальных костного стромальных мозга клеток и периферической костного мозга крови у и больных миелодиспластическими синдромами. Задачи исследования 1. Оценить частоту и спектр хромосомных аномалий у больных МДС в момент диагностики. 2. Сопоставить эффективность выявления хромосомных аномалий в клетках костного мозга методом стандартного цитогенетического исследования и флюоресцентной in situ гибридизации (FISH). 3. Охарактеризовать и сравнить изменения кариотипа в CD34+ гемопоэтических клетках-предшественницах костного мозга и периферической 9 крови с помощью метода FISH. Охарактеризовать изменения кариотипа в CD34+ клетках в зависимости от клиникo-лабораторных данных. 4. Оценить свойства мезенхимальных стромальных клеток костного мозга по их росту в культуре и исследовать наличие связи с клиническим вариантом заболевания, группой риска IPSS-R и морфологическими особенностями МДС. 5. Изучить и сравнить цитогенетические изменения в МСК костного мозга методом стандартного цитогенетического исследования и FISH у больных МДС и здоровых лиц. Научная новизна и практическая ценность работы Полученные в исследовании результаты показали, что CD34+ клеткипредшественницы содержат хромосомные аберрации (аномалии), определяемые в общей популяции клеток костного мозга. Размер патологического клона в общей популяции клеток костного мозга и CD34+ клетках одинаков. Выраженность клональных предшественницах изменений коррелирует с их в циркулирующих выраженностью в клеткахклетках- предшественницах костного мозга. Это имеет практическое значение, так как использование клеток периферической крови для проведения цитогенетических исследований у больных может уменьшить кратность пункций костного мозга. Установлено, что мезенхимальные стромальные клетки, полученные из костного мозга больных МДС, обнаруживают сниженную пролиферативную способность по сравнению с их аналогами у здоровых доноров костного мозга и проявляют генетическую нестабильность. Определяемые в МСК аномалии кариотипа отличны от аберраций в кроветворных клетках. Аномалии кариотипа МСК наряду с хромосомными нарушениями в клетках костного мозга могут являться факторами, ухудшающими прогноз у больных МДС. Полученные данные позволяют сделать вывод, что МСК костного мозга не являются частью патологического клона при МДС, вместе с тем проявляют функциональные нарушения, которые, несомненно, имеют значение в патогенезе заболевания. 10 Данные результаты имеют большое теоретическое значение и могут служить заделом для последующих исследований. Основные положения, выносимые на защиту 1. Клональные нарушения кариотипа CD34+ клеток-предшественниц, полученных как из костного мозга, так и из периферической крови, соответствуют аномалиям кариотипа общей популяции клеток костного мозга при МДС. 2. Хромосомные аберрации мезенхимальных стромальных клеток костного мозга выявлены у 9,5% больных МДС; они отличны от аномалий кариотипа кроветворных клеток. Структура диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов и их обсуждения, заключения, выводов, библиографического списка и одного приложения. 11 1. Обзор литературы Группа клональных заболеваний кроветворной ткани, объединенных общим названием МДС, характеризуется диспластическими изменениями в миелокариоцитах и неэффективным кроветворением, которое проявляется нарушением процессов образования, дифференцировки и запрограммированной гибели клеточных элементов костного мозга и картиной цитопении в периферической крови, а также повышенным риском трансформации в острый миелоидный лейкоз (ОМЛ). Как показано на рисунке 1, начальным звеном патогенеза заболевания является мутация в СКК, которая запускает механизм клонального кроветворения и повышает степень программированной клеточной гибели (апоптоза), приводящей к неэффективному кроветворению в костном мозге. Вместе с этим происходит нарушение функционирования стромального микроокружения, а также процессы гиперметилирования генов. В результате накопление продуктов клонального кроветворения приводит к эволюции опухолевого клона и трансформации заболевания в острый лейкоз. Рисунок 1. Патогенез развития миелодиспластического синдрома 12 Несмотря на попытки детального изучения патогенетических особенностей заболевания и поиски новых подходов к терапии, результаты лечения больных МДС и продолжительность их жизни остаются неутешительными [6, 12, 79, 144, 146, 162]. В связи с чем очевидна необходимость дальнейших исследований, которые могут внести вклад в понимание биологии заболевания и способствовать улучшению прогноза у больных МДС. 1.1. История знаний о МДС Описания случаев стойкой анемии, не поддающейся доступным методам лечения (сырая печень, соли железа и фолаты), встречаются уже в начале XX века. Именно из-за неэффективности доступной в те времена терапии заболевание приобрело название «рефрактерной» анемии. В 1920 е годы врач Военно-медицинской академии в г. Санкт-Петербурге М.И.Аринкин [21] впервые предложил метод прижизненной стернальной пункции костного мозга. Стали накапливаться знания об изменениях в кроветворной ткани при рефрактерных анемиях. В 1938 году C.Rhoads [132] опубликовал исследование около 100 случаев рефрактерной анемии, в котором отмечено наличие у этих больных макроцитоза, тромбоцитопении, лейкопении и склонности к лихорадке и кровотечениям, заканчивающихся летальным исходом. Автором также подчеркивался приобретенный, не наследственный характер изучаемого синдрома. Вероятно, часть описанных больных страдала другими заболеваниями (туберкулез, последствия воздействия токсических веществ, острый лейкоз или апластическая анемия), однако состояние остальных было обусловлено рефрактерной анемией, которая в современном понимании является вариантом МДС. Постепенно формулировались критерии дифференциальной диагностики макроцитарной пернициозной (В12-дефицитной) анемии и макроцитарной рефрактерной анемии на основании не только клинической картины, но и лабораторного обследования, включая диаметр эритроцитов, клеточность костного мозга и пр. [61]. 13 В 1942 году были охарактеризованы нормальные сидероциты и «сидеробласты», нагруженные гранулами свободного железа, в костном мозге мышей [70]. Ученые обратили внимание на этот феномен и у людей, страдающих анемией: нарушение созревания нормобластов (эритроидных предшественников), увеличение их количества и накопление в цитоплазме гранул свободного железа, и дали описание рефрактерной анемии с кольцевыми сидеробластами – варианту МДС в современной классификации. Анемия у таких больных зачастую имела доброкачественный характер на протяжении нескольких лет [32]. Дальнейшее наблюдение за больными выявило, что у части из них до появления развернутой картины острого лейкоза имел место разный по длительности период анемии. Возникли термины «предлейкоз», «малопроцентный» и «тлеющий» лейкоз. [35, 76, 91]. Описывали клиническое течение сидеробластной анемии как проявления раннего этапа развития эритробластного лейкоза [44]. Тем не менее, не во всех случаях хронической анемии развивался острый лейкоз; исследователи предположили, что с прогрессированием заболевания связано увеличение клеточности в костном мозге, выраженность нарушений созревания и количественного содержания аномальных клиническом форм миелокариоцитов течении рефрактерных [64]. Таким анемий образом, диктовали различия в необходимость формулирования классификации этих синдромов с целью как уточнения диагностических критериев вариантов заболевания, так и определения тактики ведения больных. 1.2. Классификация МДС Франко-американо-британская (FAB) группа исследователей в 1976 году охарактеризовала две классификационные категории «синдромов дисмиелопоэза» – рефрактерная анемия с избытком бластов (РАИБ) и хронический миеломоноцитарный лейкоз (ХММЛ) [25]. В 1982 году классификация была расширена, термин «синдромы дисмиелопоэза» заменен на 14 «миелодиспластические синдромы», который используют для обозначения заболевания и в настоящее время [26]. Согласно FAB-классификации 1982 года, было выделено 5 вариантов МДС: рефрактерная анемия (РА), рефрактерная анемия с кольцевыми сидеробластами (РАКС), РАИБ, РАИБ в трансформации (РАИБ-Т) и ХММЛ. FAB-классификация использовалась гематологами всего мира на протяжении более 30 лет, ее актуальность не утрачена и до сих пор. Однако разнообразие клинических вариантов МДС требовало выбора различных терапевтических подходов и, следовательно, определения критериев оценки риска трансформации заболевания. В 1997 году P.Greenberg с соавт. [68] представили прогностическую шкалу риска IPSS (International Prognostic Scoring System), которая позволила на основе трех критериев: количества бластных клеток в костном мозге, кариотипа и степени цитопенического синдрома – выделить 4 категории прогноза: категории низкого, промежуточного-1 и -2 и высокого риска (таблица 1). Таблица 1 Прогностическая шкала IPSS (1997г.) Количество баллов Фактор 0 0,5 1 1,5 2 Бластные клетки КМ (%) <5 5-10 - 11-19 20-30 Кариотип Хороший - - Цитопения 0-1 - - Промежуточный Плохой 2-3 - Примечание: Кариотип – хороший (нормальный кариотип и изолированные del(5q), del(20q) и -Y); промежуточный (+8 и другие аномалии, сочетание двух аномалий); плохой (аномалии хромосомы 7 и комплексный кариотип); Цитопения – гемоглобин 100 г/л, АЧН (абсолютное число нейтрофилов) 1,5х109/л, тромбоциты 100х109/л; 0 баллов – низкий риск, 0,5-1 балл – промежуточный-1 риск, 1,5-2 балла – промежуточный-2 риск, ≥ 2,5 баллов – высокий риск. 15 Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) в 2000 году была создана новая классификация гематологических заболеваний, внесены изменения и в классификацию МДС: выделены варианты рефрактерной цитопении с мультилинейной дисплазией (РЦМД) с и без кольцевых сидеробластов, МДС с изолированной делецией 5q и неклассифицированный МДС, РАИБ разделена на категории РАИБ-1 и РАИБ-2 в соответствии с количеством бластных клеток, выделена отдельная категория МДС-МПЗ (миелопролиферативные заболевания), ХММЛ удален из классификации, пограничный процент бластных клеток между МДС и острым миелоидным лейкозом (ОМЛ) составил 20% вместо 30%, категория РАИБ-Т удалена [84]. Классификация ВОЗ дополнена в 2008 году: РА была включена в категорию рефрактерной цитопении с унилинейной дисплазией (РЦУД), внутри которой также выделены рефрактерная нейтропения (РН) и рефрактерная тромбоцитопения (РТ), варианты РЦМД с и без КС были объединены (таблица 2) [146]. 16 Таблица 2 Классификация МДС (ВОЗ 2008г.) Тип МДС ПК КМ 1. Рефрактерная 1- или 2-ростковая цитопения с цитопения, унилинейной дисплазией БК < 1% (РА, РН, РТ) Дисплазия одного ростка (> 10% клеток), БК < 5% 2. Рефрактерная анемия с кольцевыми сидеробластами (РАКС) Анемия БК < 1% > 15% КС, дисплазия красного ростка, БК < 5% 3. Рефрактерная цитопения с мультилинейной дисплазией (РЦМД) 2- или 3-ростковая цитопения, БК < 1%, моноциты < 1х109/л Дисплазия 2 или 3 ростков ( 10% клеток), БК < 5%, ~ 15% КС 4. Рефрактерная анемия с Цитопения, 1-, 2- или 3-ростковая избытком бластов-1 БК < 5%, дисплазия, 9 (РАИБ-1) моноциты < 1х10 /л БК = 5-9% 5. Рефрактерная анемия с Цитопения, избытком бластов-2 БК = 5-19%, (РАИБ-2) моноциты < 1х109/л, палочки Ауэра +/- 1-, 2- или 3-ростковая дисплазия, БК = 10-19%, палочки Ауэра +/- 6. МДС с изолированной Анемия, del(5q) (5q-cиндром) нормальное или повышенное число тромбоцитов, БК < 1% Нормальное или увеличенное число мегакариоцитов, БК < 5%, изолированная del(5q) 7.МДС неклассифицированный (МДС-Н) Цитопения, БК < 1% Дисплазия < 10% клеток одного или нескольких ростков БК < 5% Примечание: КС – кольцевые сидеробласты, БК – бластные клетки Вместе с пересмотром классификации разрабатывались и более точные прогностические шкалы для больных МДС. Вносимые изменения, прежде всего, имели клиническое значение, так как со временем претерпевали изменения 17 подходы к лечению пациентов [125]. В 2007 году L.Malcovatti с соавт. [101] разработали новую шкалу динамической оценки риска у больных МДС – WPSS, в которой учитывались клинический вариант по классификации ВОЗ, кариотип и наличие зависимости от гемотрансфузий. Согласно этой шкале выделено 5 категорий риска: очень низкий, низкий, промежуточный, высокий и очень высокий (таблица 3). Таблица 3 Прогностическая шкала WPSS (2007г.) Количество баллов Фактор 0 1 2 3 Категория ВОЗ РА, РАКС, МДС с 5q- РЦМД, РЦМД-КС РАИБ-1 РАИБ-2 Кариотип хороший промежуточный плохой - Зависимость от гемотрансфузий нет есть - - Примечание: 0 баллов – очень низкий риск, 1 балл – низкий риск, 2 балла - промежуточный риск, 3-4 балла – высокий риск, 5-6 баллов – очень высокий риск. В 2012 году группой ученых из 11 стран мира опубликованы результаты наблюдения более 7000 больных и предложена новая прогностическая шкала IPSS-R [69]. Увеличено с 5 до 16 число специфических цитогенетических аномалий при МДС, определена клиническая значимость редких хромосомных нарушений, а также были учтены показатели возраста и коморбидности (таблица 4). 18 Таблица 4 Прогностическая шкала IPSS-R (2012г.) Параметр Группы риска, цитогенетика Категории и баллы Очень хороший Хороший Промежуточный Плохой Очень плохой 4 0 1 2 3 Бластные клетки КМ (%) ≤2 >2–<5 5 – 10 >10 – < 20 0 1 2 3 Гемоглобин (г/л) ≥ 100 80 – < 100 < 80 0 1 1,5 АЧН (х109/л) ≥ 0,8 < 0,8 0 0,5 ≥ 100 50 – < 100 < 50 0 0,5 1 Тромбоциты (х109/л) Примечание: АЧН – абсолютное число нейтрофилов; Кариотип – очень хороший (del(11q) и -Y); хороший (нормальный кариотип, изолированные del(5q), del(12p) и del(20q), сочетание двух аномалий, одна из которых del(5q)); промежуточный (изолированные del(7q), +8, +19, i(17) и другие аномалии, сочетание двух аномалий); плохой (-7, inv(3)/t(3q), сочетание 2 аномалий, одна из которых -7/del(7q), комплексный кариотип: 3 аномалии); очень плохой (комплексный кариотип: 3 аномалий); 0-1,5 балла – очень низкий риск, 2-3 баллов – низкий риск, 3,5-4,5 баллов - промежуточный риск, 5-6 баллов – высокий риск, ≥ 6,5 баллов – очень высокий риск. Необходимо отметить, что выше приведены не все существующие варианты стратификации риска у больных МДС. Их многочисленность обусловлена разнообразием клинических вариантов заболевания, однако ни одна шкала в полной мере не отражает всех особенностей МДС. В частности, в классификации ВОЗ не отражено значение гистологической картины костного мозга, вместе с тем показано, что увеличение клеточности и наличие фиброза являются важными факторами, ухудшающими прогноз у больных МДС. Более того, показана необходимость двустороннего исследования трепанобиоптатов подвздошных костей, по крайней мере, в дебюте заболевания [4]. Следует также 19 подчеркнуть, что прогностические шкалы определяют прогноз естественного течения заболевания у больных, не получающих специфическое лечение. А, следовательно, благодаря применению эффективных методов терапии, прогноз у пациентов с МДС может и должен быть изменен. Анализ прогностической значимости новых исследований – проточной цитометрии [165] и исследования профиля генетических мутаций [24] – у пациентов с МДС продолжен, и, возможно, в скором времени будут предложены новые подходы к классификации и определению прогноза. 1.3. Цитогенетические исследования при МДС В 1956 году двумя группами исследователей независимо друг от друга было установлено, что нормальный кариотип человека состоит из 23 пар хромосом: 22 пар аутосом и 1 пары половых хромосом [57, 152]. Началась эра клинической цитогенетики. Появление метода дифференциального окрашивания хромосом сделало возможным выделение и исследование каждой хромосомы в отдельности [38, 138]. Обработанные трипсином и далее окрашенные хромосомы приобретали специфическую для каждой пары исчерченность, обусловленную чередованием темных полос (G-полосы), содержащих интерстициальный гетерохроматин, и светлых участков. Метод стал стандартом цитогенетического исследования. В дальнейшем появление новых методик, в частности, флюоресцентной in situ гибридизации (FISH), позволило проводить хромосомный анализ в интерфазных (не делящихся) ядрах. Впервые методика была описана в начале 1980х годов [94]. Наряду с возможностью изучения аномалий морфологии хромосом методом стандартного цитогенетического исследования, метод FISH позволил проводить анализ конкретных специфических последовательностей ДНК и РНК. Методика представляет собой использование флюоресцентных проб (зондов), которые связываются с комплементарными участками ДНК при помощи реакции гибридизации. Метод позволяет более точно определить локализацию и выявлять малые клоны с хромосомными аномалиями. 20 Идеи о преимущественно клональной природе МДС возникли уже в 1960 е годы. J.Grouchy с соавт. [46] описали аномалии хромосом F-группы (19-20 пары) у 5 из 6 пациентов с сидеробластной анемией (частичные делеции и перицентрические инверсии). Предполагалось, что гены, контролирующие процессы кроветворения, расположены в хромосомах указанной группы. R.E.Millard с соавт. [107] определили те же аномалии у больных истинной полицитемией, а R.M.Goodman [66] – у 79-летнего пациента с миелофиброзом. Однако позже стало очевидно, что эти соматические хромосомные аномалии могут быть определены в лимфоцитах периферической крови у лиц, не страдающих гематологическими заболеваниями, и ассоциированы с тяжелыми ментальными расстройствами [60, 51]. В середине 1970х годов были описаны клональные изменения в костном мозге у больных «предлейкозом» – трисомия 8, -7/del(7q), -5/del(5q) [124, 139]. Было подтверждено наличие клональных цитогенетических аномалий у пациентов с рефрактерной анемией, описаны аномалии 1 (дубликация 1q), 2 (t(2;7), t(2;21)), 3 (del(3p)), 5 (del(5q)), 20 (del(20q)), 7, 8, 9, 19 и 21 хромосом (трисомии) [22]. 1.4. Клиническое значение хромосомных аномалий при МДС При цитогенетическом исследовании клеток костного мозга у больных МДС на момент установления диагноза клональные изменения кариотипа выявляют в 40-70% случаев в зависимости от варианта заболевания, при прогрессировании заболевания или развитии вторичной миелодисплазии они встречаются чаще – у 70-90% больных [68, 83, 106, 114, 134, 147, 164]. Сбалансированные хромосомные аберрации встречаются при МДС крайне редко; наиболее характерными являются аномалии с потерей (делеции, моносомии) или добавлением генетического материала (трисомии, изохромосомы, инсерции). Хромосомные аномалии, описанные при МДС, встречаются также и при ОМЛ de novo. Исключением является del(20q), 21 характерная для категории МДС низкого риска, которая описана также у больных ХМПЗ. При МДС не встречаются характерные хромосомные аномалии, соответствующие специфическому варианту ОМЛ – t(15;17), inv(16), t(8;21), t(9;11). Аномалии кариотипа чаще определяют у пациентов с МДС категории высокого риска (РАИБ) в сравнении с категорией низкого риска (РЦ, РЦМД, РАКС). Однако за исключением del(5q), не выявлено связи конкретной хромосомной аномалии с клиническим вариантом МДС [83]. При МДС могут быть выявлены одновременно несколько патологических клонов, определяющихся в разных клетках [83]. Это явление не характерно для ОМЛ de novo. Показана роль кариотипа как независимого фактора прогноза при МДС [83, 168]. Не всегда присутствие клональных нарушений ассоциировано с быстрой трансформацией в острый лейкоз. Согласно прогностической шкале IPSS кариотип клеток костного мозга распределен на 3 категории: благоприятный (нормальный кариотип, изолированные del(5q), del(20q), -Y), неблагоприятный (-7/del(7q), комплексный кариотип) и промежуточный (+8 и другие аномалии) [68]. Наиболее распространенными аномалиями кариотипа являются аномалии с вовлечением хромосом 5, 7 и 8, каждая из которых изолированно или в составе множественных нарушений кариотипа встречается примерно у 10% больных МДС. 1.4.1. Аномалии хромосомы 5 Делеция длинного плеча хромосомы 5 – самая частая аномалия, ее наличие определяют у 10-15% пациентов с МДС. Описан только интерстициальный тип делеции без транслокации генетического материала. Выделяют 3 типа делеции: 1-й тип – с вовлечением сегмента q13-q31 или q13-q33; 2-й тип – q12-q31 или q14-q31; 3-й тип – делеция минимального сегмента q23-q32. Какой бы ни был размер делеции, общим участком является регион 5q31, который в свою очередь неоднороден. Делеция может вовлекать центромерную часть региона, что чаще ассоциировано с плохим прогнозом, или теломерную часть (расположенную 22 ближе к региону 5q32), что обычно наблюдают при 5q-синдроме. На длинном плече хромосомы 5 расположены гены EGR-1 и -катенина, их роль в развитии заболевания до конца не ясна. Классический 5q-синдром, или МДС с изолированной del(5q), – это вариант рефрактерной макроцитарной анемии с нормальным или увеличенным числом тромбоцитов, морфологическими признаками дизэритропоэза и увеличенным количеством голоядерных микроформ мегакариоцитов [48, 156]. Морфологические изменения в костном мозге у этих больных имеют сходство с проявлениями при хронических миелопролиферативных заболеваниях. У некоторых пациентов может быть выявлена мутация гена JAK2 в регионе V617F [146]. Заболевание чаще встречается у женщин, преобладает пожилой возраст – всего 15% больных моложе 50 лет. Классический 5q-синдром характеризуется хроническим стабильным течением, отсутствием признаков прогрессирования и трансформации в ОМЛ длительное время. Del(5q) может встречаться не только изолированно, но и в составе множественных аномалий кариотипа. Определение дополнительно к del(5q) второй хромосомной аномалии может существенно не ухудшить прогноз в сравнении с прогнозом при классическом 5q-синдроме. В то же время сочетание del(5q) с аномалиями хромосомы 7 (-7/del(7q)), а также аномалии хромосомы 5 в составе комплексных нарушений кариотипа значительно ухудшают выживаемость больных. Терапией выбора для пациентов с del(5q) и благоприятным иммуномодулирующая терапия прогнозом в настоящее леналидомидом, время является эффективность которой составляет 80% [98]. 1.4.2. Аномалии хромосомы 7 Вторая по частоте аномалия при МДС – полная утрата хромосомы 7 (моносомия) или интерстициальная/терминальная делеция участка длинного плеча del(7q) – определяется у 8-11% пациентов. При del(7q) принципиальна потеря регионов 7q22, 7q31-32 и 7q36; в этих регионах расположены гены EZH2 23 и MLL5, отвечающие за эпигенетическую регуляцию процессов клеточной дифференцировки [50, 78, 96]. Опубликованы данные о мутации генов семейства RAS, гена AML1 и гиперметилировании p15INK4B у больных этой цитогенетической категории [41, 42]. Клиническое течение МДС с аномалией хромосомы 7 характеризуется короткой средней продолжительностью жизни больных, выраженным цитопеническим синдромом, тяжелыми инфекционными осложнениями и высокой частотой развития ОМЛ [46, 123]. Значимых отличий клинического течения заболевания при различных локализациях делецированного участка q-плеча хромосомы 7 не выявлено, однако согласно последним данным продолжительность жизни короче и риск трансформации в ОМЛ выше у пациентов с моносомией 7, чем у пациентов с del(7q) [136]. В настоящее время терапией выбора у больных МДС группы высокого риска является применение гипометилирующих препаратов (децитабин, азацитидин) с последующей трансплантацией аллогенных гемопоэтических стволовых клеток, а также проведение трансплантации в качестве первой линии терапии, так как химиотерапевтическое воздействие в большинстве случаев оказывается неэффективным, а продолжительность полученных ремиссий короткой. 1.4.3. Аномалии хромосомы 8 Увеличение количества (амплификации) генетического материала также характерно для пациентов с МДС. Самой частой амплификацией является трисомия 8, ее встречаемость – 7-9% больных. Следует отметить, что среди характерных для МДС аномалий эта наиболее часто встречается у пациентов с ОМЛ de novo. Определение изолированной трисомии 8 позволяет отнести пациента к группе промежуточного риска с общей продолжительностью жизни 26 месяцев [136]. Ключевым генетическим маркером при данном варианте МДС принято считать ген c-MYC, расположенный в регионе 8q24 и кодирующий фактор транскрипции. Его экспрессия повышена в клетках, содержащих трисомию [141]. У этой категории больных эффективным может быть применение иммуносупрессивной терапии (циклоспорин А (ЦСА), 24 антитимоцитарный глобулин) [92, 141]. Механизм действия ЦСА на кроветворные клетки может быть как опосредованным, так и прямым. К эффектам, опосредованным через Т-лимфоциты, относят следующие: блокада продукции активированными Т-лимфоцитами и NK-клетками интерферона и фактора некроза опухоли; ингибирование синтеза и секреции интерлейкина-2 CD4+ лимфоцитами, что ведет к угнетению их активности и апоптозу; блокада МНС-I-зависимых механизмов ингибирования гемопоэтических клеток цитотоксическими CD8+ лимфоцитами и NK-клетками. Непосредственные эффекты ЦСА связаны с прямым ингибированием митохондриального циклофиллина, участвующего в запуске каскада реакций программированной клеточной гибели, а также с увеличением клоногенной активности клетокпредшественниц в культурах, из которых удалены CD4 +/CD8+ клетки. Таким образом, иммуносупрессивные свойства ЦСА оказывают терапевтический эффект при лечении МДС [5, 11]. 1.4.4. Комплексный кариотип и клональная эволюция Количество хромосомных перестроек существенно влияет на прогноз при МДС. Так, показано, что у пациентов с комплексным кариотипом он значимо хуже, чем у пациентов с изолированными аномалиями или нормальным кариотипом. Наличие множественных хромосомных аномалий ассоциировано с плохим ответом на проводимую терапию и короткой продолжительностью жизни больных. Комплексным кариотипом является определение 3 и более хромосомных аномалий. Комплексные нарушения, возможно, возникают последовательно в результате многоэтапного процесса клональной эволюции. Характерны несбалансированные структурные поломки с вовлечением регионов 5q, 7q, 3p, 3q, 12p, 16q, 17p, 18q и 20q, а также появление дополнительных хромосом и их участков – 8/8q, 11q, 17q, 21q [155]. Комплексные аномалии кариотипа чаще ассоциированы с вторичными МДС и ОМЛ, при наличии анамнеза предшествующей терапии алкилирующими агентами и ингибиторами топоизомеразы II, воздействия радиации и токсинов. Агрессивные методы 25 лечения, показанные этой категории больных, не всегда бывают оправданы в силу тяжелого соматического состояния или возраста, что делает необходимым поиск новых подходов к их лечению [72]. Клональная эволюция МДС – это процесс, лежащий в основе прогрессии заболевания. Последовательные цитогенетические исследования клеток костного мозга в динамике позволяют определить появление хромосомных аномалий при ранее нормальном кариотипе или появление новых аномалий дополнительно к уже выявленным [153]. Другой причиной прогрессии заболевания может быть экспансия существующего патологического клона [82]. Так называемую «генетическую нестабильность» (эволюцию клона) выявляют приблизительно у 30% пациентов c МДС [139]. Эволюция патологического клона, как и увеличение процента бластных клеток в костном мозге, значительно увеличивает риск трансформации заболевания в острый лейкоз [154]. Тем не менее, показано также проявление генетической нестабильности при относительно стабильном клиническом течении заболевания [65]. 1.5. МДС – клональное заболевание стволовой кроветворной клетки Патогенез заболевания – предмет внимательного изучения со времени выделения самостоятельной нозологической формы. В 1960е годы были опубликованы наблюдения, что у женщин с лейомиомой, гетерозиготных по гену, кодирующему синтез фермента глюкозо-6-дегидрогеназы (Г-6-ДГ), клетки опухоли содержат только один изотип этого фермента вместо двух, как происходит в здоровых клетках, то есть представляют собой клон одной клетки. Вслед за этим появилось предположение, что все опухоли имеют клональное происхождение [97]. Среди онкогематологических заболеваний это утверждение было впервые проверено у больных хроническим миелолейкозом (ХМЛ) [52, 53]. Чуть позже схожие результаты получены и у больных МДС [127]. W.H.Raskind с соавт. [131] на примере обследования пациентки с миелодисплазией и хромосомными аномалиями в клетках костного мозга (триcомия 8 и del(11q)) 26 показали, что несмотря на отсутствие этих аномалий в фибробластах кожи и Влимфоцитах крови, среди последних определяется гомозиготность по Г-6-ДГ, что доказывало клональное повреждение клетки-предшественницы миело- и лимфопоэза. Отсутствие хромосомных нарушений в других, кроме миелоидной, клеточных линиях, авторы объясняли «многоступенчатостью» патогенеза заболевания, появлением нескольких независимых событий в процессе развития болезни. Происходит ли первоначальное событие в генетическом аппарате стволовой кроветворной клетки или на уровне коммитированных миелоидных предшественниц, остается спорным. Данные, полученные J.T.Prchal с соавт., демонстрируют поражение мультипотентной стволовой клетки при МДС [127]. Подтверждением этого служат и результаты, опубликованные J.W.Janssen с соавт. [86], в которых показано наличие полиморфизма X-сцепленных генов и мутации генов RAS-семейства в клетках костного мозга и различных клеточных линиях периферической крови при МДС. В свою очередь, известны случаи лимфоидной трансформации заболевания, хотя ее частота не столь велика [29, 67], а также выявление одновременно с МДС В- или Т-клеточных лимфопролиферативных заболеваний [23, 112]. Определение хромосомных аномалий и генетических мутаций представляет несомненное доказательство клональной природы МДС. Учитывая разнообразие клинических форм заболевания, представляется вероятным, что патогенез заболевания многоступенчатый, начальное событие которого происходит в отделе полипотентных СКК, а дальнейшие события, приводящие к возникновению хромосомных аномалий, задействуют клетки-предшественницы миелоидной линии гемопоэза. Необходимо отметить, что упомянутые выше исследования не касались непосредственно исследования самих стволовых клеток. Несмотря на то, что МДС принято считать клональным заболеванием СКК, окончательную характеристику начального звена патогенетической цепочки, приводящей к развитию заболевания, еще предстоит узнать. На поверхности СКК определяют ряд специфических маркеров, в дальнейшем на этапах дифференцировки их иммунофенотип меняется. Общим 27 маркером ранних кроветворных клеток является антиген CD34. Кластер дифференцировки CD34 - это высокогликозилированный трансмембранный протеин с муциноподобной структурой и молекулярной массой 115 кДа. Белок CD34 кодируется геном, расположенным в локусе 1q32. Структура молекулы стала известна в 1986 году, а годом позже эксперименты на летально облученных обезьянах показали, что антиген экспрeссируют мультипотентные СКК, способные дифференцироваться во все клеточные линии, и коммитированные линейные клетки-предшественницы [20, 27]. Антиген CD34 является, в свою очередь, важным фактором регулирования процесса адгезии незрелых кроветворных клеток в костномозговых нишах [59, 77, 95]. На поверхности СКК также экспрессирован антиген CD90 (Thy-1) и отсутствует экспрессия CD38, CD45RA и Lin. Появление CD38, CD45RA и линейных маркеров происходит в процессе дифференцировки до общих миелоидных, гранулоцитарно-макрофагальных и мегакариоцитарно- эритроидных клеток-предшественниц. Показано, что относительное количество общих миелоидных клеток-предшественниц, то есть клеток с фенотипом Lin−/CD34+/CD38+/CD123+/CD45RA−, в костном мозге больных МДС увеличено по сравнению с нормальным костным мозгом [99]. В то же время наблюдают значительное уменьшение гранулоцитарно-макрофагальных клеток- предшественниц с фенотипом Lin−/CD34+/CD38+/CD123+/CD45RA+, а количество мегакариоцитарно-эритроидных предшественниц Lin−/CD34+/CD38+/CD123−/ CD45RA− существенно не отличается от нормы [122]. Таким образом, при МДС нарушен путь дифференцировки СКК до коммитированных предшественниц. Количество CD34+ кроветворных клеток-предшественниц у пациентов с МДС увеличено по сравнению с их количеством у здоровых лиц как в костном мозге, так и в периферической крови [110, 149]. Увеличение числа CD34+ клеток обусловлено повышенной клеточностью костного мозга, нарушением созревания кроветворных клеток и позитивностью по антигену CD34+ бластных клеток. Исключение могут составлять варианты МДС, протекающие с гипоплазией и фиброзом в костном мозге. Процент CD34+ клеток в костном мозге, 28 определенный с помощью проточной цитометрии, по данным исследования D. de Smet с соавт. [47] зависит от варианта заболевания: у пациентов в группе низкого риска (РЦ, РЦМД) в среднем определено 1,7% CD34+ клеток, у пациентов с РАИБ – 10,5%, тогда как у здоровых доноров костного мозга в среднем содержится 1,5% CD34+ клеток. Количество циркулирующих CD34+ клеток у здоровых лиц составляет по разным данным 0.015% до 0.5% от всех ядросодержащих кроветворных клеток [58, 157]. клеток-предшественниц Абсолютное у больных число МДС циркулирующих низкого риска вследствие глубокой цитопении обычно меньше или соответствует их числу в крови здоровых лиц, тогда как у пациентов из группы высокого риска значительно превышает его. Наблюдают корреляцию между количеством CD34+ клеток в костном мозге и в периферической крови, а также процентом бластных клеток [105]. Увеличение количества CD34+ клеток в костном мозге и периферической крови в динамике имеет неблагоприятное прогностическое значение, так как может соответствовать прогрессии заболевания [58, 157]. Механизм «выхода» незрелых клеток-предшественниц в периферическую кровь может быть связан с нарушением их адгезии в костном мозге [159]. Кроветворные клетки-предшественницы, полученные из костного мозга больных МДС, имеют функциональные отличия от их нормальных аналогов. Так, эффективность колониеобразования и время репопулирования in vitro длительной клеточной культуры у них значительно ниже [99]. Функциональные нарушения кроветворных клеток-предшественниц более выражены у пациентов с аномалиями кариотипа. В недавней работе B.Will с соавт. [167] на примере изучения незрелых кроветворных клеток у нескольких пациентов с аномалиями кариотипа показано, что эти клетки дифференцируются in vitro в миелоидные предшественницы с морфологическими признаками дисмиелопоэза (билобулярность ядра, псевдопельгеризм). В костном мозге пациентов с МДС нарушено функционирование путей передачи сигналов взаимодействия незрелых кроветворных клеток-предшественниц, в частности, интерферонового сигнального пути, путей фактора некроза опухоли- и фактора роста опухоли- 29 [116]. Эти механизмы приводят к увеличению степени запрограммированной клеточной гибели – апоптоза, изменению пролиферативного потенциала и процессов самообновления пула клеток-предшественниц гемопоэза, что является одной из причин развития у больных цитопенического синдрома [4]. Таким образом, являясь «субстратом» миелодисплазии в костном мозге и начальным звеном ее развития, незрелые кроветворные клетки демонстрируют различные функциональные особенности, отличающие их от аналогов в здоровом костном мозге. Несмотря на то, что эти особенности несколько отличны у пациентов с разными вариантами заболевания и цитогенетическими аномалиями, общие принципы их функциональной неполноценности одинаковы. 1.5.1. Цитогенетические исследования кроветворных клетокпредшественниц Изучение цитогенетических, генетических и эпигенетических изменений в СКК и коммитированных клетках-предшественницах важно для определения уровня возникновения мутаций при МДС. Опубликованы данные, что и CD34+/CD38-, и CD34+/CD38+ клетки-предшественницы содержат цитогенетические аномалии, которые определены в общей костномозговой популяции клеток [73]. Также показано, что трансформация и рецидив заболевания – события, происходящие на уровне клеток-предшественниц [74, 75]. Исследование группы пациентов с del(5q), получивших терапию леналидомидом, показало, что клональные нарушения сохраняются на уровне клеток-предшественниц несмотря на достижение клинико-гематологической и цитогенетической ремиссии заболевания. Это демонстрирует чрезвычайную устойчивость опухолевых клеток к терапевтическому воздействию и сложность достижения полноценных ремиссий [117, 151. Данные, полученные I.Muira с соавт., показывают наличие клональных изменений (моносомии 7) на уровне лимфо-миелоидных клеток-предшественниц [109]. Некоторое время назад считалось, что у пациентов с трисомией 8 мультипотентные СКК свободны от 30 клональных нарушений, и патологический клон при этой аномалии определяется только на стадии миелоидных предшественниц [135]. Этот постулат позднее был опровергнут последующими исследованиями. Однако стоит отметить, что размер патологического клона с трисомией 8, определяемого в незрелых клетках-предшественницах, несколько меньше, чем при других цитогенетических аномалиях [116]. В 2012 году B.Will с соавт. [167] опубликовали исследование, в котором цитогенетические маркеры были обнаружены в СКК и миелоидных предшественницах, которые сохранялись на фоне терапии заболевания гипометилирующими агентами. Цитогенетические исследования лимфоидной клеточной линии показывают, что аномалии кариотипа в этих клетках не определяются. Это можно было бы объяснить большим периодом жизни лимфоцитов и, таким образом, их способностью «маскировать» имеющиеся клональные изменения в части вновь образованных клеток. Вместе с тем характерные генетические нарушения не выявляют и с помощью высокочувствительной методики ПЦР. С другой стороны, может быть и так, что мультипотентные СКК под воздействием генетических и эпигенетических нарушений теряют способность к лимфоидной дифференцировке при МДС. И, следовательно, гипотеза о возникновении МДС на уровне СКК не может быть отвергнута 87, 118. С другой стороны, есть исследования, в которых показано присутствие del(5q) и del(20q) в В-лимфоцитах и отсутствие их в Т-лимфоцитах [85, 166]. Однако такие публикации оценивают неоднозначно, так как генетические мутации в В-лимфоцитах могут быть связаны с вирусным воздействием (например, вируса Эпштейна-Барр) и иметь вторичный характер. Вторичный генез может обусловливать и нарушение функции NK-клеток у больных МДС [62, 88, 118]. Не так давно стало известно, что циркулирующие CD34+ клетки пациентов с МДС наравне с клетками костного мозга содержат цитогенетические аномалии [37]. И, следовательно, кроветворные клетки-предшественницы костного мозга и 31 периферической крови при МДС проявляют сходные свойства, в том числе и хромосомные нарушения. 1.6. Роль стромального микроокружения 1.6.1. Строма костного мозга. Мезенхимальные стромальные клетки Строма костного мозга представляет собой основу для кроветворных клеточных элементов. Она состоит из межклеточного матрикса и клеток, выстилающих костномозговую полость (эндост) и стенки синусоидных капилляров, а также жировых клеток и макрофагов. Компоненты стромы создают микроокружение, которое обеспечивает рост, деление и созревание кроветворных клеток. В костном мозге микроокружение представлено несколькими типами клеток: остеобласты, хондроциты, гладкомышечные клетки, адипоциты, эндотелиоциты, ретикулярные клетки и макрофаги. Микроокружение формирует «ниши» для кроветворных клеток. Показано, что СКК расположены в эндостальных нишах – в близости к выстилающим трабекулярную кость остеобластам и мезенхимальным стромальным клеткам, а созревающие клетки-предшественницы локализуются вблизи кровеносных сосудов – в периваскулярных нишах, вокруг эндотелиоцитов синусоидных капилляров [49]. Клетки удерживаются в нишах при помощи межклеточных контактов; процессы их деления и дифференцировки регулируются секретируемыми в межклеточное пространство различными паракринными факторами (цитокинами) [16, 163]. В эндостальной нише осуществляется поддержание пула незрелых СКК, их миелоидная дифференцировка посредством синтеза остеобластами гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ), гранулоцитарномакрофагального КСФ (ГМ-КСФ) и интерлейкина-6. В экспериментах in vitro было показано, что количество CD34+ клеток в длительной клеточной культуре увеличивается вчетверо за 2 недели культивирования в присутствии остеобластов [150]. Взаимодействие паратиреоидного гормона с рецептором на 32 поверхности остеобластов приводит к активации и увеличению их количества, что, в конечном счете, приводит к увеличению числа незрелых СКК [13]. В основе лежит взаимодействие лиганда Jagged 1 с рецептором Notch на поверхности СКК. Остеобласты секретируют цитокины, стимулирующие пролиферацию СКК, в частности, ангиопоэтин. В то же время они продуцируют в межклеточный матрикс белок остепонтин, являющийся обратным регулятором содержания СКК [145]. Негативными регуляторами пролиферации СКК выступают также адипоциты. Чем меньше их количество в костном мозге, тем успешней приживление трансплантата [115]. Рецептор CXCR4 на поверхности СКК имеет сродство к хемокину CXCL12, который наряду с другими стромальными клетками в большом количестве секретируют ретикулярные клетки, окружающие синусоидные капилляры и эндост. Взаимодействие рецептора с лигандом обеспечивает хоуминг СКК (способность мигрировать и оставаться в костном мозге), тем самым сохраняется их пул в костном мозге [148]. Известна роль ретикулярных клеток в продукции интерлейкина-6 и c-kit лиганда (фактора стволовых клеток), Г-КСФ и ГМ-КСФ [71]. СКК и более зрелые клетки-предшественницы локализованы также вокруг синусоидных капилляров в периваскулярных нишах, функция которых наравне с эндостальными нишами заключается в поддержании процессов деления и дифференцировки незрелых кроветворных клеток в костном мозге, а также в экстрамедуллярных очагах кроветворения, в которых отсутствует костная ткань. Роль регуляторов адгезии и пролиферации CD34+ клеток-предшественниц в периваскулярной нише отведена эндотелиоцитам и мезенхимальным стромальным клеткам. Механизм регуляции тот же, что и в эндостальной нише, показана также роль секретируемого эндотелиоцитами плейотрофина (гепаринсвязывающего фактора роста), оказывающего индуцирующее влияние на пролиферацию СКК [43]. Мезенхимальные стромальные клетки (МСК) - важный клеточный компонент стромы. Это фракция прилипающих к пластику 33 фибробластоподобных клеток, образующих колонии in vitro с сохранением дифференцировочного потенциала. На поверхности МСК экспрессированы маркеры CD73, CD105, CD90, Stro-1 и отсутствуют маркеры кроветворных клеток CD34, CD45, CD14, HLA-DR [14, 40]. МСК – это мультипотентные клетки-предшественницы зрелых клеточных компонентов стромы. Под воздействием индуцирующих факторов они способны к дифференцировке в остеобласты, хондробласты и адипоциты [126]. МСК ответственны за поддержание и регуляцию кроветворения в костном мозге [17, 45, 113]. Они секретируют ростовые дифференцировка факторы, кроветворных благодаря которым предшественниц. МСК происходит экспрессируют рецепторы клеточной адгезии, обеспечивающие миграцию и поддержание пула СКК в костном мозге. 1.6.2. Функциональные особенности стромы при МДС При МДС наряду с функциональными нарушениями в СКК и в коммитированных клетках-предшественницах получены сведения о патологии стромы костного мозга. Возможно, повреждение стромального микроокружения происходит вторично в ответ на дефект взаимодействия клонально-измененных стволовых кроветворных клеток с клетками костномозговых ниш. Существует и обратная точка зрения о возникновении клональных нарушений в СКК в условиях патологии стромы. Еще в конце XIX века S.Paget в своей теории «почвы и зерна» предположил, что в основе сложного многоэтапного процесса канцерогенеза лежит нарушение специфического взаимодействия опухолевых клеток и окружающей ткани [121]. Клетки опухоли «строят» свое микроокружение путем высвобождения в межклеточный матрикс различных факторов, действие которых приводит к нарушению нормального гомеостаза стромы, и поддержанию опухолевого роста, формируя порочный круг обратной связи. Подобные механизмы реализованы при опухолях различного происхождения и локализации и могут лежать в основе как возникновения опухоли in situ, так и образования метастазов [111]. 34 Из многочисленных исследований мы знаем о функциональном влиянии микроокружения костного мозга на процессы персистенции и экспансии злокачественного клона при различных заболеваниях системы крови. Например, описано образование межклеточных связей и взаимодействие посредством цитокинов между плазматическими клетками и клетками стромального микроокружения при множественной миеломе, приводящие к активному ангиогенезу и деструкции кости [108]. У больных ХМЛ показано, что клональное кроветворение обусловлено специфическим взаимодействием кроветворных клеток-предшественниц и макрофагов стромы. Макрофаги – компонент стромы гемопоэтического происхождения, они являются частью патологического клона при ХМЛ и способствуют поддержанию клонального кроветворения за счет подавления роста нормальных кроветворных клетокпредшественниц [31]. Формирование обширных зон фиброза обусловлено избыточной продукцией макрофагами и мегакариоцитами цитокинов, таких как полученный из тромбоцитов фактор роста (PDGF), фактор роста фибробластов (FGF), трансформирующий фактор роста альфа (TGF), что наблюдают при хронических миелопролиферативных заболеваниях и первичном миелофиброзе [39]. Дисрегуляция матриксных металлопротеиназ (MMP) в межклеточном пространстве у больных острыми лейкозами и МДС среди прочих причин может влиять на клеточность костного мозга [2, 81]. Изучение трансплантации аллогенных гемопоэтических стволовых клеток позволило установить, что компоненты стромы реципиента костного мозга имеют хозяйское происхождение. И тот факт, что в этих условиях донорское кроветворение способно развиться, говорит о функциональности и обратимости нарушений стромы при опухолевых заболеваниях системы крови [130]. С другой стороны, существует проблема отторжения пересаженного костного мозга [103], а также развития лейкоза из клеток трансплантата [18], причину возникновения которых некоторые ученые видят в инициирующем дефекте стромы реципиента. В пользу этой теории свидетельствует экспериментальное исследование австралийских ученых о возникновения миелопролиферативного синдрома у 35 мышей при инактивировании рецептора к ретиноевой кислоте (RAR), а также работа американских исследователей о развитии индуцированной миелодисплазии в костном мозге мышей, сформировавшейся в результате делеции ответственного за процессинг РНК гена Dicer1 [128, 160]. Изучение функциональных особенностей стромы при МДС необходимо для понимания биологии этого заболевания. В последнее время опубликованы работы о нарушении взаимодействия рецептор-лиганд между СКК и клетками стромы, в частности, значительно увеличена продукция МСК хемокина CXCL12 [56]. Фактор CXCL12 (SDF-1) ответственен за поддержание СКК в состоянии покоя в костномозговых нишах [120]. На поверхности МСК костного мозга у больных МДС изменена экспрессия молекул адгезии [7, 9]. В свою очередь, MMP могут способствовать нарушенной восприимчивости рецептора CXCR4 и инактивации хемокина CXCL12, что приводит к отрыву и выходу СКК в периферическую кровь [104]. При МДС нарушена регуляция сигнального пути Notch – важного механизма процесса клеточной дифференцировки, и пластичность МСК костного мозга снижена [100, 158]. В длительной культуре костного мозга соответствующие нарушения проявляются сниженной способностью МСК к поддержанию кроветворения in vitro и приводят к появлению блока дифференцировки кроветворных клеток-предшественниц, что имеет место при МДС. Стоит также отметить, что строма костного мозга больных МДС более эффективно взаимодействует с кроветворными клеткамипредшественницами, выделенными из костного мозга больных, чем с их аналогами от здоровых лиц, и, следовательно, имеет ограниченную способность к поддержанию нормального кроветворения 8, 63, 137. 1.6.3. Цитогенетические исследования клеток стромы Несмотря на общее мезодермальное (мезенхимальное) происхождение кроветворных компонентов костного мозга и клеток стромального микроокружения, попытки определения общей предшественницы, способной 36 дифференцироваться одновременно в обе клеточные линии, не увенчались успехом [161]. Единственным стромальным компонентом, имеющим на этапе эмбрионального развития общее с кроветворными клетками происхождение (из мезангиобласта), является сосудистый эндотелий [93]. В костном мозге взрослого организма отдельно существуют стволовая кроветворная клетка и мезенхимальная стволовая клетка. Тем не менее интересным представляется ответ на вопрос: имеют ли место клональные нарушения в строме больных МДС? МСК костного мозга здоровых лиц способны формировать in vitro клеточные колонии в течение множества, по меньшей мере 10, пассажей, сохраняя при этом стабильный кариотип и не накапливая хромосомные мутации, являясь, таким образом, удобной моделью для изучения [3, 28, 169]. Однако МСК от больных МДС обладают ограниченной пролиферативной активностью. Имеющиеся сведения о наличии хромосомных аномалий в стромальных клетках на примере МСК противоречивы и не позволяют сделать окончательные выводы. Описанные аномалии кариотипа МСК разнообразны и не отображают характерные для МДС изменения в кроветворных клетках. С другой стороны, опубликованы данные и об отсутствии клональных нарушений в МСК при МДС. В таблице 5 представлены результаты исследования кариотипа МСК у больных МДС, опубликованные за последние годы: Таблица 5 Результаты цитогенетических исследований МСК Автор, год E.FloresFigueroa, 2005 [54] %с Характеристика аномалий Число Диагноз аномалиями кариотипа МСК больных кариотипа Число больных Вовлеченные клеток КМ (%), вид хромосомы аномалии 11 МДС 7/11 (63%) 5/9 (56%), клональные и неклональные потери хромосом (гипоплоидия) -X, -1, -2, -3, -5, -8, -10, -11, -12, -13, -14, -15, -17, -19, -20, -21, -22 37 O.Blau, 2007 [34] O.Blau, 2011 [33] 31 94 МДС (18/31) 8/18 (44%) ОМЛ (13/31) 8/13 (61%) МДС (43/94) 16/43 (37%) ОМЛ (51/94) 25/51 (49%) 13/27 (48%) структурные, клональные – 4/13 (30%), der(7), t(1;7), t(1;10), del(17p) неклональные 8/13 (62%) t(7;9), t(4;7), dic(6;16), t(7;19), t(15;17), t(1;3), del(2q), del(3p), del(11q), t(2;13), численные неклональные - 1/13 (8%) -12, +13 15/94 (16%) клональные структурные t(1;2), t(1;6), del(7q), t(3;20), inv(X), del(11q), del(13q), del(15q) клональные численные L.-X. Song, 2012 [143] 22 МДС 13/22 (59%) 14/22 (64%) клональные, численные, потеря хромосомного материала (гипоплоидия) клональные структурные 2/14 (14%) +5, -4, -X, -Y -6, -7, -11, -12, -20, -21, -22 t(2;11), dup(1) В работах E.Flores-Figueroa с соавт. 54, 55 на небольшом количестве больных продемонстрировано, что у большинства наблюдались аномалии кариотипа МСК с потерей генетического материала как клональные, так и неклональные. Примерно у половины больных хромосомные нарушения МСК 38 были выявлены в исследовании O.Blau с соавт. 34, в которое включен 31 больной ОМЛ и МДС. Авторами отмечено, что чаще встречались аномалии 1, 7, 10 и 17 хромосом. В последующее исследование этих же авторов 33 были включены почти 100 пациентов; клональные хромосомные нарушения в МСК обнаружены у 16%: они представлены как структурными (транслокации и делеции), так и численными (моносомии и трисомии) аномалиями, не связанными с возрастом больных, но ассоциированными с неблагоприятным кариотипом в общей популяции клеток костного мозга и с худшей выживаемостью больных. Также авторами не была получена какая-либо закономерность среди различных хромосомных аберраций МСК. В недавнем сообщении китайские исследователи выявили аномалии кариотипа МСК у 70% больных, которые включали комплексные нарушения с потерей генетического материала от нескольких хромосом [143]. Применение метода сравнительной геномной гибридизации позволяет выявить цитогенетические аномалии МСК у 100% больных МДС 100. В то же время в ряде публикаций продемонстрировано отсутствие в МСК у больных МДС цитогенетических изменений [90, 129, 142]. Наряду с этим в исследовании M.Klaus с соавт. [90 подчеркнуто, что МСК от больных МДС соответствуют по дифференцировочному потенциалу (пластичности) МСК от здоровых доноров, но отличаются от них по пролиферативной активности – время удвоения количества клеток в культуре МСК больных значимо превышало таковое в контрольной группе здоровых лиц. V.Soenem-Cornu с соавт. [142] и A.Ramakrishman с соавт. [129] продемонстрировали одинаковую способность МСК больных МДС поддерживать длительную культуру гемопоэтических предшественниц, как содержащих, так и не содержащих хромосомные аберрации. S.Alvi с соавт. [19] указали, что характеристики МСК в длительной культуре не различаются у больных МДС и здоровых лиц. Противоречивость характеристик МСК, отраженную в упомянутых выше исследованиях, можно объяснить гетерогенностью включенных больных с учетом клинических вариантов МДС и групп риска; разным сроком 39 длительности состояния ―хронического воспаления‖ в строме костного мозга, обусловленного заболеванием; различиями в методах исследования и, соответственно, в интерпретации полученных результатов. Таким образом, несмотря на большое число исследований, механизмы развития клонального кроветворения при МДС до сих пор до конца не изучены. В обзоре литературных источников освещены основные сведения о патогенезе МДС, значимости цитогенетического исследования различных клеточных популяций как инструмента изучения биологии заболевания. Новые знания могут внести существенный вклад в формирование понимания механизмов патогенеза и послужить основой для разработки новых подходов к терапии МДС. Анализ частоты и спектра хромосомных аномалий как в гемопоэтических, так и в стромальных клеточных компонентах костного мозга при МДС представлен противоречиво. В связи с этим целью настоящей работы явился анализ хромосомных изменений в изолированных популяциях незрелых клеток – кроветворных CD34+ клеток-предшественниц и мезенхимальных стромальных клеток у больных МДС. 40 2. Материалы и методы 2.1. Дизайн исследования Проспективное исследование было начато в июле 2011 года и завершено в марте 2013 года. Дизайн исследования представлен на рисунке 2: Доноры костного мозга (n=7) Больные МДС (n=43) Костный мозг (3-6 мл) 1-2 мл стандартное цитогенетическое исследование, FISH 1-2 мл -выделение фракции CD34+клеток, FISH 1-2 мл получение культуры МСК, СЦИ, FISH Кровь (10 мл) Костный мозг (1-2 мл ) выделение фракции CD34+ клеток, FISH получение культуры МСК, СЦИ Рисунок 2. Дизайн исследования Исследование одобрено Этическим комитетом ФГБУ Гематологического научного центра МЗ РФ. Пациентами подписано информированное согласие с доступным изложением целей и значения, а также безопасности исследования. Все больные, включенные в исследование, находились на этапе диагностики и установления варианта МДС. У пациентов имелся разной длительности анамнез снижения показателей крови, однако они не получали ранее специфическую терапию (химиотерапия, иммуномодулирующая терапия, трансплантация костного мозга) по поводу МДС. Пациентам проводили взятие костного мозга 41 (стернальная пункция) и периферической венозной крови в стерильные контейнеры Vacuette с стандартным количеством антикоагулянта гепарина – Litium Heparin. Цитогенетические исследования выполнены в кариологической лаборатории ФГБУ ГНЦ МЗ РФ (заведующая лаб. д. м. н. Е.В. Домрачева). Выделение изолированной фракции CD34+ клеток-предшественниц костного мозга и периферической крови выполнено в кариологической лаборатории ФГБУ ГНЦ МЗ РФ. Получение культуры МСК костного мозга осуществлено в лаборатории физиологии кроветворения ФГБУ ГНЦ МЗ РФ (заведующая лаб. д. б. н. Н.И. Дризе). 2.2. Характеристика больных В исследование включены 43 больных, 20 мужчин и 23 женщины. Медиана возраста составила 59 лет (от 19 до 77 лет). Распределение по вариантам заболевания следующее: МДС – 36 больных (РA – 2, РАКС – 3, МДС с del(5q) – 3, РЦМД – 14, РАИБ1 – 5, РАИБ2 – 9), ОМЛ из предшествующей миелодисплазии – 7 больных. У двух из указанных больных (РАИБ-2 и ОМЛ) был онкологический анамнез и проводилась химиотерапия по поводу второй опухоли (вторичный МДС и ОМЛ). Контрольную группу составили 7 здоровых доноров костного мозга и 4 больных лимфопролиферативными заболеваниями (диффузная В- крупноклеточная лимфома – 2, лимфогранулематоз – 2). Обследование и клиническое ведение большинства больных осуществлено в научно-клиническом отделе высокодозной химиотерапии, депрессий кроветворения и трансплантации костного мозга (руководитель д. м. н. Е.Н. Паровичникова) и в поликлиническом отделении (заведующая д. м. н. А.Л. Меликян) ФГБУ ГНЦ МЗ РФ. Разработка дизайна исследования, научная и клиническая часть работы сотрудником отделения выполнена совместно химиотерапии кроветворения к. м. н. А.В. Кохно. с ведущим гемобластозов и научным депрессий 42 Вариант классификации заболевания устанавливали ВОЗ Пациентам [146]. на основании проводился анализ критериев показателей гемограммы, цитологическое, цитохимическое и цитогенетическое исследования пунктата костного мозга и гистологическое исследование трепанобиоптата подвздошной кости. Характеристика включенных больных представлена в таблице 6: Таблица 6 Характеристика больных Диагноз Пол, м/ж Медиана возраста, годы Средняя длительность цитопении, месяцы МДС, n =36 ОМЛ из МДС, n=7 17/19 59 (29-77) 45 (1-450) 3/4 64 (19-77) 6 (1-12) 2.3. Лабораторные исследования 2.3.1. Получение фракции мононуклеаров Фракцию мононуклеаров получали из аспирата костного мозга и периферической крови перед селекцией CD34+ кроветворных клеток- предшественниц и культивированием МСК. Клетки выделяли в градиенте 1,077 г/см3 плотности фиколла (Lympho Separation Medium – LSM, ICN Biomedicals, USA) при 1500 об/мин в течение 35 минут. Пипеткой собирали кольцо из мононуклеаров и отмывали от фиколла добавлением среды RPMI 1640 (Sigma, USA) или MEM (HyСlone, USA). Клетки осаждали при 1000 об/мин в течение 10 минут, процедуру повторяли 3 раза. 43 2.3.2. Селекция CD34+ кроветворных клеток-предшественниц из костного мозга и периферической крови Получение CD34+ клеток проводили методом позитивной иммуномагнитной селекции с использованием моноклонального антитела к CD34 (MicroBead kit, Miltenyi Biotec, Germany). Фракция мононуклеарных клеток из костного мозга и периферической крови была пропущена через пресепарационный фильтр для устранения склеивания и закупорки магнитной колонки. Выполняли подсчет количества клеток в камере Горяева. Клеточную взвесь пропускали через помещенную в магнитное поле и предварительно смоченную буферным раствором колонку. После удаления негативной немеченой антителом фракции клеток в эпендорф собирали позитивную фракцию. Для пробы с количеством мононуклеаров до 2х108 использовали колонку MS MACS Column с соответствующим количеством буфера. Буферный раствор готовили из фосфатно-солевого буфера с pH=7,2, 0,5% бычьего альбумина, 2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), разведенной в основном растворе (MACS BSA Stock Solution) 1:20 с раствором auto MACS Rinsing Solution. Использовали дегазированный буферный раствор. Контроль чистоты полученной фракции клеток был выполнен методом проточной цитометрии с использованием моноклональных антител анти-CD34PE и анти-CD45-FITS (BD, USA). Чистота полученной фракции составила 94,5%. Результат представлен на рисунке 3: 44 Рисунок 3. Контроль чистоты изолированной популяции CD34+ клеток с помощью проточной цитометрии Полученную суспензию клеток осаждали при 1000 об/мин в течение 10 минут. Далее проводили фиксацию с использованием смеси ледяной уксусной кислоты с (960) метиловым спиртом в соотношении 1:3, клетки ресуспендировали в фиксаторе и затем осаждали, процедуру проводили трехкратно. Фиксированный клеточный осадок распыляли на поверхность адгезивного стекла с помощью цитоспина Shandon Cytospin 4 (Thermo scientific, USA) со скоростью 1000 об/мин в течение 8 минут. Далее выполняли исследование методом FISH. 2.3.3. Получение культуры МСК Для получения МСК использовали аспират костного мозга. Мононуклеарную фракцию ресуспендировали в стандартной среде для культивирования, состоящей из среды -МЕМ (HyClone, USA), 10% эмбриональной телячьей сыворотки (HyClone, USA), 2 мМ L-глутамина (BioWest)), 100 ед/мл пенициллина (Ферейн, Россия) и 50 ед/мл стрептомицина (Ферейн, Россия). Клетки рассаживали в концентрации 1-8x106 клеток во флаконы для культивирования с площадью дна 25 и 75 см2 (Costar) и культивировали в 5% CO2 в воздухе при t=37С. После образования 45 конфлюэнтного монослоя клетки промывали раствором версена (0,02% раствор ЭДТА в физиологическом растворе (Sigma)), а затем обрабатывали 0,25% раствором трипсина (ICN) и пассировали в концентрации 4x10 3 клеток на 1 см2 поверхности дна флакона. В работе использовали клетки после 2-3 пассажей (в двух случаях – после 4 и в двух случаях – после 5 пассажей), за которые происходило истощение кроветворных клеточных элементов, и достигалась чистая культура фибробластов. За 16-24 часа до снятия клеток во флакон добавляли колхицин или колцемид в количестве, необходимом для достижения конечной концентрации в среде 1 г/мл. МСК снимали с флаконов 0,05% трипсином. Количество снятых со дна флакона клеток подсчитывали в камере Горяева, их жизнеспособность определяли по отсутствию окраски трипановым синим. Следующим этапом готовили цитогенетический осадок. Клетки осаждали при 1000 об/мин в течение 10 минут и проводили гипотоническую обработку 0,55% (0,07М) раствором калия хлорида в инкубаторе при t=370С в течение 20 минут. Гипотонию прерывали добавлением 0,5 мл 5% уксусной кислоты и осаждали клетки при 1000 об/мин в течение 10 минут. Далее проводили фиксацию с использованием смеси ледяной уксусной кислоты с метиловым (960) спиртом в соотношении 1:3, клетки ресуспендировали в фиксаторе и затем осаждали, процедуру проводили трехкратно. Взвесь клеток с небольшом количеством фиксатора хранили в холодильнике при t=-180С до проведения цитогенетических исследований. Все клетки имели характерную для фибробластов веретеновидную форму. МСК были охарактеризованы иммунофенотипически на наличие маркеров МСК моноклональными антителами к CD73, CD90, CD105 (BD) и на отсутствие маркеров гемопоэтических клеток антителами к CD45 (Sigma), CD34, CD14 (BD), HLA-DR (DAKO). Была подтверждена способность полученных МСК к остеогенной и адипогенной дифференцировке in vitro. 46 2.3.4. Стандартное цитогенетическое исследование Суспензию исследованных клеток (общая популяция костного мозга, МСК) наносили пастеровской пипеткой на предварительно смоченное дистиллированной водой предметное стекло с расстояния 15-20 см для лучшего «разбрасывания» хромосом. Стекло промывали фиксатором и высушивали на термоплато при t=650С. G-дифференциальную окраску хромосом осуществляли по модифицированной методике M.Seabright [138]. Цитогенетические препараты помещали в сухожаровый шкаф при t=950С на 35 минут. Далее стекла погружали на 3-5 сек в 0,025% раствор трипсина (Sigma) с последующим двукратным отмыванием в физиологическом растворе. Стекла окрашивали красителем Wright (Merck, Germany) в течение 1-1,5 минут и сушили под проточным воздухом. Цитогенетическое исследование МСК выполняли по методу, описанному Z.Zhang 169. Хромосомный анализ проводили под иммерсионным объективом (увеличение 12,5х100). Подсчитывали 20 метафаз. Кариотип анализировали в соответствии с критериями Международной цитогенетической номенклатуры [80]. Клональной считали структурную аномалию и трисомию при обнаружении минимум в двух метафазах и моносомию – минимум в трех. При обнаружении структурной перестройки в одной метафазе ее обозначали как неклональную (спонтанную). Единичные неполные митозы могли не учитываться как неклональные аномалии ввиду возможности потерь хромосом при обработке клеточного осадка. 2.3.5. Флюоресцентная in situ гибридизация Для постановки FISH-исследования использовали следующие ДНК-зонды: – LSI (5q31-q34) EGR-1 SpectrumOrange / D5S721/D5S23 SpectrumGreen Probe (VysisAbbott, USA) для выявления делеции и моносомии 5; 47 – LSI (7q31) SpectrumOrange / CEP 7 SpectrumGreen Probe для выявления делеции и моносомии 7; – CEP 8 SpectrumOrange DNA ProbeKit к центромере 8 для выявления моносомии и трисомии; – LSI AML1 / ETO Dual Color Fusion Translocation Probe для выявления транслокации (8;21)(q22;q12-q21) и моносомии 21; – CEP X SpectrumOrange / CEP Y SpectrumGreen DNA Probe для выявления моносомии и трисомии X, +Y; – LSI D20S108 (20q12) SpectrumOrange Probe для выявления делеции и моносомии 20; – EVI t(3;3),inv(3)(q21;q26) Break Dual-Color Probe (Kreatech Diagnostics®) для выявления inv(3)(3q26). Суспензию клеток наносили на предметное стекло. Под световым микроскопом определяли области нанесения зонда. Зонд предварительно готовили путем разбавления буферным раствором и дистиллированной водой согласно инструкции производителя. На стекло наносили 1,5 л готового зонда, накрывали покровным стеклом и заклеивали. Денатурацию и гибридизацию проводили в приборе TermobriteTM Slide Hybridization / Denaturation System (Abbott), время денатурации – 2 минуты при t=740С, время гибридизации – 16-24 часа при t=370С. После завершения гибридизации с предметного стекла снимали клей и покровное стекло, затем препарат обрабатывали с целью удаления избытка зонда: 1) в течение 2-х минут, поместив стекло в емкость с раствором 0,4 SSC / 0,3%NP-40 (SSC – Abbott) в паровой бане при t=730С; 2) в течение 1-й минуты в растворе 2 SSC / 0,1%NP-40 при комнатной температуре. После высушивания на препарат наносили раствор DAPI II (Abbott) и накрывали покровным стеклом. Анализ сигналов проводили с помощью флюоресцентного микроскопа Zeiss-Axioscope (Germany) с использованием тройного фильтра Orange / Green / 48 Dapi. Для каждого зонда анализировали по 200 интерфазных ядер с четкими сигналами. Границы нормальных значений процента позитивных ядер для каждого зонда были определены по формуле + 3, где – среднее по совокупности, равное (n1+n2+n3+n4+n5)/5, – стандартное отклонение, равное [(n1-)2+(n2)2+(n3-)2+(n4-)2+(n5-)2]/(5-1). Анализировали 1000 ядер мононуклеарных клеток периферической крови от 5 здоровых доноров, n1, n2, n3... и т.д. – количество ядер, содержащих аномалию, у первого, второго, третьего… и т.д. доноров. Границы нормы для используемых зондов: – LSI (5q31-q34). G – зеленый, центромера, R – красный, регион 5q31. Норма 2G2R, 1G1R – до 2,2% (если превышает – моносомия 5), 2G1R – до 5,7% (если превышает – делеция 5q31); – LSI (7q31). G – зеленый, центромера, R – красный, регион 7q31. Норма 2G2R, 1G1R – до 2,2% (если превышает – моносомия 7), 2G1R – до 5,7% (если превышает – делеция 7q31); – CEP 8. R – красный, центромера. Норма 2R, 1R – до 9% (если превышает – моносомия), 3R – до 0,8% (если превышает – трисомия 8); – LSI AML1 / ETO. G – зеленый, ген AML (21q12-q21), R – красный, ген ETO (8q22), Y – сливной сигнал. Норма 2G2R, 1G1R2Y – 0% (если превышает – t(8;21)), 3G2R – до 0,8% (если превышает – трисомия 21); – CEP X / Y. G – зеленый сигнал, регион Yq12 хромосомы Y, R – красный сигнал, центромерный регион хромосомы X. Норма (мужчины) – 1G1R; 1R – до 0,5% (если превышает – потеря хромосомы Y), 2G1R – до 0,5% (если превышает - добавочная хромосома Y). Норма (женщины) – 2R; 1R – до 0,5% (если превышает – моносомия Х), 3R – до 0,5% (если превышает – трисомия X); – LSI (20q12). R – красный сигнал, регион 20q12. Норма – 2R; 1R – до 5,7% (если превышает – делеция 20q12); – EVI t(3;3),inv(3)(q21;q26). F – сливной сигнал (регион 3q26). Норма – 2F; 1F1G1R – до 2% (если превышает – inv(3)). 49 2.4. Статистический анализ Статистический анализ выполнен совместно с сотрудниками лаборатории биостатистики ФГБУ ГНЦ МЗ РФ (заведующий – к. т. н. С. М. Куликов). Оценка достоверности различий между группами осуществлялась с использованием методов описательной статистики, парного и непарного t-тестов, анализа кривых выживаемости. Корреляционный анализ проводили методом попарной корреляции Пирсона. Результаты оценивались статистически значимыми при р 0,05. Данные представлены в виде средних значений и величины стандартного отклонения, медианы с указанием минимального и максимального значений. Результаты были обработаны с помощью статистического пакета SAS и R. 50 3. Результаты и обсуждение 3.1. Цитогенетическое исследование клеток костного мозга Всем 43 пациентам, включенным в исследование, выполнено кариотипирование клеток костного мозга. При стандартном цитогенетическом исследовании нормальный кариотип определен у 23 (53,5%) из 43 больных, у одного из них выявлена конституциональная инверсия хромосомы 9 – inv(9)(p13q21), у 16 (37,2%) больных выявлены аномалии кариотипа и у 4 (9,3%) больных исследование не выполнено вследствие отсутствия достаточного количества или удовлетворительного качества митозов. Среди выявленных аномалий преобладали изолированные хромосомные аберрации – у 9 (56,3%) из 16 больных: делеция 5q, моносомия 7, изохромосома 14 и инверсия хромосомы 3; у 2 (12,5%) больных выявлено сочетание 2 аномалий: делеции 5q с моносомией 7 и трисомии Х с моносомией 7; и у 5 (31,2%) больных определены комплексные нарушения кариотипа: 3 и более аномалии. Следующим этапом применили метод FISH у пациентов с хромосомными аномалиями с целью их подтверждения. У пациентов с нормальным кариотипом или отсутствием митозов выполняли FISH-исследование с ДНК-зондами к хромосомам 5, 7 и 8 с целью возможного выявления «скрытых» аномалий в указанных хромосомах. Зонды к данным цитогенетическим маркерам выбраны с учетом наиболее распространенных и клинически значимых аномалий при МДС [10, 68, 72, 136, 146]. У 7 (16,3%) из 43 больных с помощью FISH-исследования выявлены скрытые хромосомные аномалии, которые не были определены при кариотипировании. У двух из них (пациенты 012 и 014) при стандартном исследовании не были получены митозы, и методом FISH выявлены: в первом случае – одновременно del(5q) и del(7q) в 84% клеток, во втором – трисомия 8 в 67% клеток. У 4 больных определен нормальный кариотип, однако с помощью FISH-исследования у двух из них (пациенты 003 и 040) выявлена del(5q) в 75% и 67% клеток, соответственно; у одного больного (036) выявлена моносомия 7 в 51 45% клеток и у одной больной (033) – трисомия 8 в 19% клеток. Еще у 1 больного (028), у которого в кариотипе определена изолированная del(5q), FISH анализ позволил выявить дополнительно трисомию 21 в 52% клеток. Таким образом, количество больных с аномалиями кариотипа увеличилось с 16 (37,2%) до 22 (51,2%). Число больных без хромосомных аномалий в клетках костного мозга составило 21 (48,8%). Распределение выявленных аномалий по прогнозу согласно шкале IPSS-R было следующим: аномалии очень хорошего прогноза не были выявлены ни в одном случае; у 6 (27,3%) больных выявлены аномалии хорошего прогноза (нормальный кариотип, del(5q) изолированно и в сочетании со второй аномалией); у 3 (13,6%) больных определены аномалии промежуточного прогноза (i(14) и +8); у 9 (40,9%) больных – аномалии плохого прогноза (3 аномалии, -7/del(7q) изолированно и в сочетании со второй аномалией, inv(3)) и у 4 (18,2%) больных определены аномалии очень плохого прогноза (более 3 аномалий). Результаты цитогенетических исследований общей популяции клеток костного мозга представлены в таблице 20 (приложение 1). Известно, что стандартное цитогенетическое исследование является классическим подходом для проведения хромосомного анализа с целью выявления аномалий кариотипа. Исследование входит в перечень необходимых процедур на этапе диагностики МДС [10, 68, 69, 72, 146]. Тем не менее в некоторых случаях получение митозов в культуре клеток костного мозга представляет преимущество трудность, при клетки с нормальным культивировании перед кариотипом получают клонально-измененными опухолевыми клетками, и их митотическая активность начинает преобладать, либо качество митозов в препаратах оказывается недостаточным для проведения анализа. Метод флюоресцентной in situ гибридизации обладает рядом преимуществ перед стандартным исследованием, так как при его выполнении достаточно наличия интерфазных ядер, а, следовательно, нет зависимости от успехов в культивировании клеток. Применение метода FISH дополнительно к стандартному цитогенетическому исследованию способствует определению 52 скрытых хромосомных аномалий, не выявленных при кариотипировании, по разным данным, у 6-18% больных МДС [30, 89, 102, 133]. В нашей работе показано, что после выполнения FISH-исследования дополнительно к стандартному исследованию кариотипа в 16,3% случаев удалось выявить хромосомные аберрации, не определенные при кариотипировании. Количество больных с цитогенетическими аномалиями в клетках костного мозга после применения двух диагностических методов составило 22 (51,2%) из 43, что соответствует частоте встречаемости хромосомных аберраций у пациентов с МДС в дебюте заболевания [10, 68, 72, 146, 136]. Среди больных с изменениями кариотипа изолированная аномалия выявлена у 13 (59,1%) больных, сочетание 2 аномалий – у 4 (18,2%) больных и комплексные нарушения кариотипа – у 5 (22,7%) больных. Таким образом, стандартное цитогенетическое исследование позволяет выявить хромосомные аномалии в клетках костного мозга у пациентов с МДС в дебюте заболевания и является основным методом их диагностики. В некоторых случаях целесообразно выполнение дополнительно к стандартному методу FISHисследования с целью определения скрытых поломок. 3.2. Определение групп риска в соответствии с прогностическими шкалами IPSS, WPSS и IPSS-R 36 пациентов с МДС были стратифицированы на группы риска в зависимости от результатов цитогенетического исследования, количества бластных клеток в костном мозге, варианта заболевания, показателей гемограммы и наличия трансфузионной зависимости в соответствии с критериями прогностических шкал IPSS, WPSS и IPSS-R. Больным с вторичным МДС и больным, у которых при стандартном цитогенетическом исследовании не были получены митозы и методом FISH «скрытые» аномалии не выявлены, группа риска не определялась. Результаты представлены в таблице 21 (приложение 1). 53 Из 11 больных с низким риском по шкале IPSS у 3 по шкале WPSS определен очень низкий риск, у 6 – низкий и у 2 – промежуточный; по шкале IPSS-R распределение было следующим – у 10 больных подтвержден низкий риск и у 1 больного определен промежуточный риск. 10 больных согласно шкале IPSS отнесены к промежуточному-1 риску; по шкале WPSS 1 больной отнесен к очень низкому риску, 2 больных – к низкому, 4 – к промежуточному и 3 – к высокому риску; по шкале IPSS-R у 3 больных определен низкий риск, у 5 больных – промежуточный и у 2 – высокий риск. У 9 больных в соответствии с критериями шкалы IPSS определен промежуточный-2 риск; согласно шкале WPSS у 1 из них определен промежуточный риск, у 7 – высокий риск и у 1 больного – очень высокий риск; по шкале IPSS-R у 2 больных подтвержден промежуточный риск, 6 больных отнесены к категории высокого риска и 1 больной – к категории очень высокого риска. Высокий риск по шкале IPSS установлен 4 больным; в соответствии со шкалами WPSS и IPSS-R все больные были отнесены к категории очень высокого риска. Основные изменения в прогнозе у больных в соответствии с разными шкалами были определены в категории промежуточного риска. Так, по шкале IPSS эта группа (промежуточный-1 и промежуточный-2 риск) составила 19 из 34 больных, тогда как для WPSS – 7 и для IPSS-R – 8 больных. Распределение больных в группу более низкого или более высокого риска осуществлено в первом случае за счет наличия или отсутствия зависимости от гемотрансфузий, во втором – за счет прогностического значения аномалий кариотипа, градации цитопенического синдрома и количества бластных клеток в костном мозге. У двух больных (015 и 016) были выявлены комплексные аномалии кариотипа – более 3 аномалий. Согласно шкале IPSS-R такие изменения кариотипа отнесены к очень плохому прогнозу, и, следовательно, у пациента 015 группа риска была изменена с промежуточного-2 на очень высокий, а у пациента 016 – с промежуточного-2 на высокий. У пациентки 022 определена инверсия 54 хромосомы 3, которая перемещена из категории промежуточного в категорию плохого прогноза. Тем не менее у больной подтвержден промежуточный риск и по новой шкале. Всего у 25 из 34 больных группа риска по трем прогностическим шкалам различалась, у 9 из них прогноз совпадал. У двух больных категория риска была изменена согласно шкале IPSS-R на более высокий вследствие прогностического значения кариотипа. В таблице 7 приведена сравнительная характеристика лабораторных показателей и частоты хромосомных аномалий у пациентов разных групп риска по шкале IPSS-R: Таблица 7 Показатели периферической крови и частота хромосомных аномалий у больных разного риска по шкале IPSS-R Риск Очень низкий Число Число Л АЧН Гем Тр больных с больных медиана медиана медиана медиана хромосомным (%) (разброс) (разброс) (разброс) (разброс) и аномалиями (%) 0 (0,0%) - - - - - 3,7 (2,3-7,6) 2 (0,8-5,0) 89 (68-138) 207* (46-710) 3 (23,1%)* Промежу- 8 (23,5%) точный 3,1 (2,2-5,8) 1,7 (0,9-4,4) 75 (61-120) 130 (10-309) 4 (50,0%)* Высокий 8 (23,5%) 3,8 (2,7-7,7) 2,2 (0,1-4,8) 85 (59-103) 55 (34-134) 5 (62,5%)* Очень 5 (14,7%) высокий 2,2 (2,0-3,3) 0,6* (0,2-1,7) 87 (70-92) 39 (6-79) 5 (100%)* *p<0,05 *p<0,05 Низкий 13 (38,3%) *p<0,05 Примечание: Л – лейкоциты; АЧН – абсолютное число нейтрофилов; Гем – гемоглобин; Тр – тромбоциты; 55 Как видно из таблицы, количество больных преобладало в группе низкого риска – 13 (38,3%), ни один больной не был определен в группу очень низкого риска. Наблюдалось четкое увеличение частоты хромосомных аберраций с повышением группы риска: в группе низкого риска аномалии кариотипа определены всего у 23,1% больных, все они имели благоприятный прогноз (del(5q) изолированно или в сочетании со второй аномалией); а в группе очень высокого риска хромосомные аномалии выявлены у 100% больных, среди аномалий в этой группе были -7/del(7q) и комплексные нарушения кариотипа. Наличие хромосомных аномалий достоверно влияло на распределение больных по группам риска (p<0,05). Также закономерно прослеживалось усугубление цитопенического синдрома у больных высокого и очень высокого риска в сравнении с группами более благоприятного прогноза. Выявлено достоверное отличие абсолютного числа нейтрофилов (АЧН) в группе очень высокого риска и количества тромбоцитов – в группе низкого риска (p<0,05). В таблице 8 представлено распределение больных по группам риска после проведения стандартного исследования кариотипа и после применения дополнительно к нему FISH-исследования: Таблица 8 Распределение больных на группы риска по шкале IPSS-R после проведения стандартного цитогенетического исследования и после применения FISH Группа риска Очень низкий Низкий Промежуточный Высокий Очень высокий Группа риска не определена Количество больных СЦИ, n=32 0 (0,0%) 13 (40,6%) 7 (21,9%) 8 (25,0%) 4 (12,5%) СЦИ+FISH, n=34 0 (0,0%) 13 (38,3%) 8 (23,5%) 8 (23,5%) 5 (14,7%) 3* 1** Примечание: * больные, у которых при СЦИ не получены митозы; ** больной, у которого после применения FISH цитогенетические маркеры не выявлены 56 Как видно из таблицы, после проведения кариотипирования 3 больных не представлялось возможным стратифицировать на группы риска вследствие отсутствия данных цитогенетического исследования (не получены митозы), тогда как после выполнения дополнительно FISH-исследования у 2 из них были выявлены цитогенетические аномалии, позволившие определить одного больного в группу промежуточного риска и одного больного – в группу очень высокого риска. Таким образом, все три прогностические шкалы риска функциональны и могут быть использованы в клинике для стратификации больных МДС на группы риска. Шкала IPSS-R позволяет более четко распределить больных МДС по группам риска в соответствии с прогностическим значением кариотипа и цитопеническим синдромом. 3.3. Результаты динамического наблюдения за больными МДС Время наблюдения за больными составило от 2,3 до 21 месяца (медиана 11,6 месяцев). Больным в зависимости от варианта заболевания применяли следующие виды терапевтического воздействия: сопроводительная терапия (заместительные гемотрансфузии, витаминотерапия), ростовые факторы (эритропоэтин), иммуномодулирующая терапия (леналидомид), химиотерапия (малые дозы цитозара, «7+3»), эпигенетическая терапия (азацитидин) и трансплантация аллогенных гемопоэтических стволовых клеток. Данные представлены в таблице 9: 57 Таблица 9 Лечение больных Вид лечения Количество больных Сопроводительная терапия (гемотрансфузии, витамины группы В) Ростовые факторы (ЭПО) Иммуномодулирующая терапия (леналидомид) Гипометилирующая терапия (азацитидин) Химиотерапия (малые дозы Ara-C, «7+3») Алло-ТГСК Отказ от лечения 15 1 4 8 8 3 1 Учитывая разнородность проводимой терапии, нам не удалось получить сопоставимые группы для анализа долгосрочного прогноза. Общая выживаемость больных в группе в целом составила 82%, как представлено на рисунке 4: 1 Cum. Survival .8 .6 .4 .2 0 0 2.5 5 7.5 10 12.5 Time 15 17.5 20 22.5 Рисунок 4. Общая выживаемость больных МДС, включенных в исследование За время наблюдения умерли 5 больных, все – от прогрессии в ОЛ. Цитогенетические аномалии выявлены у 18 (50%) из 36 больных МДС. Была проанализирована общая выживаемость в зависимости от выявления хромосомных нарушений в клетках костного мозга. Графики выживаемости представлены на рисунке 5: 58 1 Cum. Survival .8 есть аномалии .6 .4 нет аномалий .2 0 0 2.5 5 7.5 10 12.5 Time 15 17.5 20 22.5 Рисунок 5. Общая выживаемость больных МДС в зависимости от выявления аномалий кариотипа В нашем исследовании общая выживаемость среди больных с аномалиями и без аномалий кариотипа не отличалась, по-видимому, из-за небольшой длительности наблюдения, разнородности и малочисленности групп. Наличие хромосомных аномалий достоверно не увеличивало вероятность трансформации МДС в ОМЛ (p=0,68) Больные были распределены в группы прогноза по шкале IPSS-R. Для определения общей выживаемости в зависимости от группы риска больные высокого и очень высокого риска объединены; таким образом были сформированы группа низкого (n=12), промежуточного (n=9) и высокого (n=12) риска. Графики выживаемости представлены на рисунке 6: 1 Cum. Survival .8 .6 .4 .2 0 0 низкий риск 2.5 5 7.5 10 12.5 Time 15 17.5 промежуточный риск 20 22.5 высокий риск Рисунок 6. Общая выживаемость больных МДС в зависимости от группы риска по шкале IPSS-R 59 Как видно из рисунка, все больные из группы низкого риска были живы в течение периода наблюдения. В группе с промежуточным риском умерли двое и в группе с высоким риском – трое больных. Учитывая, что смерти зафиксированы в группах промежуточного и высокого риска, мы проанализировали выживаемость больных, объединив эти две группы в одну. Графики представлены на рисунке 7: 1 Cum. Survival .8 .6 низкий риск .4 высокий риск .2 0 0 2.5 5 7.5 10 12.5 Time 15 17.5 20 22.5 Рисунок 7. Общая выживаемость больных МДС в зависимости от группы риска по шкале IPSS-R Как видно из графика, выживаемость больных в группе низкого риска составила 100%, а в группе промежуточного/высокого риска – 66% (p=0,07). Несмотря на отсутствие достоверных различий, очевидно, что выживаемость лучше у больных из группы низкого риска. Недостаточные сроки наблюдения за больными, разнородные и немногочисленные группы не позволяют сделать окончательные выводы. С этим связаны высокие показатели выживаемости и отсутствие влияния аномалий кариотипа на выживаемость. Смерти зафиксированы в группах промежуточного и высокого риска, тогда как в группе низкого риска все больные были живы. 60 3.4. Характеристика CD34+ клеток-предшественниц, полученных из костного мозга и периферической крови 3.4.1. Содержание CD34+ клеток в костном мозге и периферической крови По данным литературы у здоровых лиц в костном мозге содержится примерно 1,5% и в периферической крови – до 0,5% CD34+ гемопоэтических клеток-предшественниц [47, 58, 157]. У пациентов с МДС количество CD34+ клеток увеличено как в костном мозге, так и в периферической крови вследствие задержки созревания миелоидных и лимфоидных предшественниц, а также увеличения количества бластных клеток [47, 58, 110, 116, 157]. С помощью проточной цитометрии было подсчитано процентное содержание CD34+ клеток в популяции CD45+ клеток лимфоцитарной, моноцитарной и гранулоцитарной клеточных линий у 12 пациентов: РАИБ – 8, РЦ (МДС с del(5q) и РЦМД) – 4. Результаты представлены в таблице 10: Таблица 10 Процент CD34+ клеток в костном мозге и периферической крови у больных МДС, здоровых доноров и больных лимфопролиферативными заболеваниями Процент бластных клеток КМ Процент CD34+ клеток КМ Процент CD34+ клеток ПК РАИБ+РЦ (n=12) 8,4305,430 (0,400-18,200) 5,1083,855* (0,700-13,400) 1,5101,400* (0,02-4,30) Доноры КМ (n=5) - 1,114±0,604 (0,591-2,109) 0,023±0,012 (0,009-0,033) Больные ЛПЗ (n=4) - 0,918±0,863 (0,260-2,10) *p<0,05 0,007±0,08 (0,001-0,017) *p<0,05 Примечание: КМ – костный мозг, ПК – периферическая кровь, РЦ – рефрактерная цитопения, РАИБ – рефрактерная анемия c избытком бластов; ЛПЗ – лимфопролиферативные заболевания 61 С учетом небольшой группы больных содержание CD34+ клеток анализировали без разделения по вариантам заболевания. Как видно из таблицы, среднее содержание CD34+ клеток-предшественниц в группе больных МДС составило 5,11% (0,70-13,40) в костном мозге и 1,51% (0,02-4,30) – в периферической крови. Содержание CD34+ клеток у больных МДС было значимо больше, чем в контрольных группах здоровых доноров костного мозга и больных лимфопролиферативными заболеваниями как в костном мозге, так и в периферической крови (p<0,05). Во всех исследованных клеточных образцах в группе больных МДС имела место гетерогенность популяции CD34+ клеток по экспрессии антигена CD34, а также наблюдалась более интенсивная гранулярность в проекции бокового светорассеяния. На рисунке 8 (а, б) приведен пример подсчета количества CD34+ клеток в костном мозге и в периферической крови у пациента 036 с диагнозом МДС: РАИБ-2: а) 62 б) Рисунок 8. Пример подсчета CD34+ клеток у больного 036 костном мозге и периферической крови Примечание: а) костный мозг; б) периферическая кровь На правой нижней картинке рисунков а) и б) прямоугольником очерчена фракция CD34+ клеток. Отсутствие четких границ между популяциями CD34+ и CD34- клеток (расположена внизу слева, зеленого цвета) говорит о гетерогенности популяции CD34+ клеток в отношении экспрессии антигена CD34, а высокое их расположение в проекции бокового светорассеяния (SSC) говорит патологической гранулярности. Описанные параметры могут отражать иммунофенотипические признаки диспластических изменений в CD34+ кроветворных предшественницах при МДС. Следующим этапом было проведено сравнение количества бластных клеток в костном мозге и содержания CD34+ клеток-предшественниц в костном мозге. Значимой зависимости между этими показателями получено не было, однако корреляция не нулевая (индекс Пирсона 0,31, p=0,32). Что означает наличие тенденции к зависимости количества CD34+ клеток от количества 63 бластных клеток в костном мозге и возможность достижения статистически достоверных результатов на большей выборке больных. Результаты представлены на рисунке 9: Индекс Пирсона=0,31, p=0,32 Рисунок 9. Процент CD34+ клеток костного мозга в зависимости от количества бластных клеток Таким образом, показано, что у больных МДС количество CD34+ клеток в костном мозге и в периферической крови значимо больше по сравнению со здоровыми лицами и больными ЛПЗ. CD34+ клетки при МДС гетерогенны в отношении экспрессии антигена CD34 и имеют повышенную гранулярность цитоплазмы. 3.4.2. Исследование цитогенетических аномалий в CD34+ клетках С помощью стандартного цитогенетического исследования и метода FISH у 22 из 43 пациентов в общей популяции клеток костного мозга были выявлены аномалии кариотипа. У 16 из них выполнено FISH-исследование фракции CD34+ кроветворных клеток-предшественниц с соответствующими ДНК-зондами. Хромосомные аберрации были выявлены у всех исследованных больных в CD34+ клетках как костного мозга, так и периферической крови. 64 Средний процент ядер с положительными флюоресцентными сигналами в общей популяции клеток костного мозга был несколько меньше, чем в CD34+ клетках, значения составили: 58,8123,99% – в общей популяции клеток костного мозга, 69,3026,35% – в CD34+ клетках костного мозга и 65,4026,65% – в CD34+ клетках периферической крови. Значимого различия размеров патологических клонов в этих клеточных популяциях получено не было, p=0,09, 0,33 и 0,11, соответственно. На рисунке 10 представлено распределение процента аномальных ядер в этих клеточных популяциях: 100 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 75 ● ● ● ● ● ● ● % label ● 50 ● ● 25 ● ● BM cells ● CD34+cells BM ● CD34+cells PB ● ● ● ● ● ● ● BM cells ● ● CD34+cells BM CD34+cells PB Рисунок 10. Средние значения процента ядер с положительными флюоресцентными сигналами в общей популяции клеток костного мозга и в CD34+ клетках Примечание: BM cells – клетки костного мозга; CD34+ BM cells – CD34+ клетки, костный мозг; CD34+ PB cells – CD34+ клетки, периферическая кровь У 6 больных выявлены существенные различия содержания аномальных ядер в общей популяции клеток костного мозга и их содержания в фракции CD34+ клеток. У 3 из них размер патологического клона в клетках костного мозга был значительно меньше, чем в CD34+ клетках: трисомия 21 в 25% ядер у пациентки 041, del(5q) в 27% ядер у пациента 029 и моносомия 7 в 45% ядер у пациента 036, в то время как в CD34+ клетках эти аномалии выявлены в 80%, 65 75% и 84% ядер, соответственно. У 3 пациентов, наоборот, среди CD34+ клеток количество клонально-измененных было меньше, чем в общей популяции: у пациентки 006 моносомия 7 выявлена в 60% клеток костного мозга, а в CD34+ клетках - всего в 26%; у пациентки 022 inv(3) в общей популяции клеток костного мозга определена в 45% клеток, а в CD34+ клетках – в 25% (в костном мозге) и в 28% (в периферической крови); и у пациентки 033 в общей популяции клеток был определен 19%-ный клон с трисомией 8, а в фракции CD34+ клеток – всего 5%-ный. Интересным было распределение клонально-измененных клеток в разных клеточных фракциях еще у двух больных. У пациентки 032 при исследовании общей популяции клеток костного мозга выявлено 2 патологических клона – моносомия 7 (в 23% ядер) и трисомия X (в 20% ядер), причем эти клоны при стандартном исследовании определялись в разных клетках. Исследование CD34+ клеток показало наличие среди них такого же процента клеток с моносомией 7 (26%), но отсутствие клона с трисомией X. Было проведено стандартное цитогенетическое исследование культуры фитогемагглютинин(ФГА)- стимулированных лимфоцитов периферической крови, в которых определен нормальный кариотип; трисомия X не была выявлена в лимфоцитах и методом FISH. Таким образом, конституциональный характер трисомии Х у этой пациентки не подтвержден. У другого больного (028) с del(5q) и трисомией 21 при исследовании общей популяции клеток костного мозга также создавалось впечатление о наличии одновременно 2 клонов клеток. Так, при стандартном исследования определен только клон с del(5q), а клетки с трисомией 21 отсутствовали. Результаты FISH-исследования были следующими: клон с del(5q) определен в 80% клеток, а с трисомией 21 – в 52%. Таким образом, часть клонально-измененных клеток содержали только del(5q), а остальные клетки – и del(5q), и трисомию 21. В то же время процент клеток, содержащих обе аномалии, в фракции CD34+ клеток был одинаковый – 70% клеток с del(5q) и 70% клеток с трисомией 21. 66 Такие существенные различия процентного соотношения клональноизмененных клеток среди общей клеточной популяции костного мозга и изолированной фракции CD34+ предшественниц у этих больных обусловлены, вероятно, эволюцией патологических клонов. Было проанализировано наличие зависимости между процентным содержанием клеток с аберрантным кариотипом во фракции CD34+ клеток и в общей популяции клеток костного мозга. Выявлена прямая корреляционная зависимость данных показателей (p<0,05). Графики представлены на рисунке 11 (а, б, в): 60 40 20 % in CD34+cells BM 80 а) 20 30 40 50 60 70 80 90 % in BM cells Индекс Пирсона=0,62; p<0,05 67 60 40 20 % in CD34+cells PB 80 б) 20 30 40 50 60 70 80 90 % in BM cells Индекс Пирсона=0,60; p<0,05 60 40 20 % in CD34+cells PB 80 в) 20 40 60 80 % in CD34+cells BM Индекс Пирсона=0,98; p<0,05 Рисунок 11. Зависимость процента клонально-измененных ядер в общей популяции клеток костного мозга и среди CD34+ клеток Примечание: а) общая популяция клеток костного мозга и CD34+ клетки костного мозга; б) общая популяция клеток костного мозга и CD34+ клетки периферической крови; в) CD34+ клетки костного мозга и периферической крови 68 Далее FISH-исследование изолированной фракции CD34+ клеток было выполнено у больных без аномалий кариотипа (n=21/43). С целью возможного определения малых или «скрытых» клональных нарушений на уровне кроветворных клеток-предшественниц у 17 из 21 больных исследование было выполнено с применением ДНК зондов к хромосомам 5, 7 и 8. У всех этих больных определено отсутствие, по крайней мере искомых, цитогенетических аномалий во фракции клеток-предшественниц. Таким образом, в CD34+ клетках-предшественницах определяются те же аномалиями кариотипа, что и в общей популяции клеток костного мозга. Процент клонально-измененных ядер среди общей популяции клеток костного мозга и CD34+ клеток, полученных как из костного мозга, так и из периферической крови, одинаков. Выявлена прямая корреляционная зависимость между величиной клона в этих клеточных популяциях. У пациентов без аномалий кариотипа «скрытые» хромосомные аберрации в CD34+ клеткахпредшественницах не выявлены. 3.4.3. Хромосомные аномалии в CD34+ клетках в зависимости от клинического варианта заболевания Среди пациентов с аномалиями кариотипа (n=16) в клетках костного мозга был 1 больной РА, 2 больных МДС с del(5q), 5 больных РЦМД, 6 больных РАИБ и 2 больных ОМЛ. Проанализировано содержание клонально-измененных ядер среди CD34+ клеток у больных в зависимости от варианта заболевания. Больные без увеличения бластных клеток в костном мозге были объединены в одну группу (РЦ), а больные с увеличением количества бластных клеток – в другую (РАИБ и ОМЛ). Результаты представлены в таблице 11: 69 Таблица 11 Процент клонально-измененных CD34+ клеток у пациентов с разными вариантами заболевания Диагноз РЦ (РА, 5q- и РЦМД), n=8 РАИБ и ОМЛ, n=8 Процент CD34+ клеток с хромосомной аномалией КМ ПК 70,624,6 68,423,7 67,330,3 62,130,7 p=0,79 p=0,64 Примечание: КМ – костный мозг, ПК – периферическая кровь, РЦ – рефрактерная цитопения, РА – рефрактерная анемия, 5q- – МДС с del(5q), РЦМД – рефрактерная цитопения с мультилинейной дисплазией, РАИБ – рефрактерная анемия с избытком бластов, ОМЛ – острый миелоидный лейкоз (стадия трансформации) Как видно из таблицы, величина патологического клона в CD34+ клетках, как костного мозга, так и периферической крови, не отличалась у больных с разными вариантами заболевания (без бластоза, с бластозом и в стадии трансформации). 3.4.4. Хромосомные аномалии в CD34+ клетках в зависимости от их прогностической значимости Среди исследованных больных у 7 определены благоприятные хромосомные аномалии (del(5q)), у 8 больных - хромосомные аномалии промежуточного прогноза (моносомия 20, трисомия 21, трисомия 8, дополнительная Y хромосома) и у 5 больных – неблагоприятные аномалии (inv(3), моносомия 7). Было проведено исследование содержания клональноизмененных CD34+ клеток у больных в зависимости от варианта хромосомных аномалий. Результаты представлены в таблице 12: 70 Таблица 12 Процент клонально-измененных CD34+ клеток в зависимости от прогностической значимости хромосомных аномалий Вариант хромосомной аномалии Благоприятный, n=7 Промежуточный, n=8 Неблагоприятный, n=5 Процент CD34+ клеток с хромосомной аномалией КМ ПК 82,610,1 79,88,8 60,228,8 57,926,9 64,635,5 59,738,9 p=0,07 p=0,32 p=0,82 p=0,06 p=0,38 p=0,93 Как видно из таблицы, среди CD34+ клеток процент клональноизмененных ядер с благоприятными аномалиями был выше, чем с аномалиями, имеющими промежуточный (p=0,07 – в костном мозге и p=0,06 – в периферической крови) и неблагоприятный прогноз (p=0,32 – в костном мозге и p=0,38 – в периферической крови). Однако эти различия не были достоверны. 3.4.5. Хромосомные аномалии в CD34+ клетках в зависимости от клеточности костного мозга При анализе гистологических препаратов трепанобиоптатов подвздошной кости увеличение клеточности костного мозга по сравнению с возрастной нормой определено у 8 больных, снижение клеточности и преобладание жирового костного мозга – у 5 больных и нормальная клеточность – у 1 больного. Было проведено сравнение величины патологического клона в CD34+ клетках в зависимости от клеточного состава костного мозга. Для проведения анализа больные со сниженной и нормальной клеточностью костного мозга объединены в одну группу. Результаты представлены в таблице 13: 71 Таблица 13 Процент клонально-измененных CD34+ клеток в зависимости от клеточности костного мозга Клеточность КМ Снижена/нормальная, n=6 Увеличена, n=8 Процент CD34+ клеток с хромосомной аномалией КМ ПК 52,729,7 53,229,2 74,224,0 70,023,9 p=0,16 p=0,26 Как видно из таблицы, клональные нарушения в CD34+ клетках более выражены у больных с гиперклеточным костном мозгом по сравнению с гипо- и нормоклеточным (p=0,16 – в костном мозге и p=0,26 – в периферической крови). Однако эти различия статистически не достоверны, по-видимому, вследствие малой группы больных в анализе. 3.4.6. Хромосомные аномалии в CD34+ клетках в зависимости от фиброза в костном мозге Коллагеновый фиброз оценивался морфологически при микроскопии гистологических препаратов костного мозга. Трепанобиопсия костного мозга выполнена у 39 больных. Обращала на себя внимание частая встречаемость признаков фиброза – у 13 (33,3%) из 39 больных. Необходимо отметить, что в костном мозге больных с цитогенетическими аномалиями фиброз встречался в 1,7 раз чаще, чем у больных без аномалий кариотипа – у 42,1% (8 из 19 больных) и у 25% (5 из 20 больных), соответственно (p=0,43). Было проведено сравнение содержания клонально-измененных CD34+ клеток в зависимости от наличия фиброза в костном мозге. Результаты представлены в таблице 14: 72 Таблица 14 Процент клонально-измененных CD34+ клеток в зависимости от наличия/отсутствия фиброза в костном мозге Процент CD34+ клеток с хромосомной аномалией КМ ПК 74,322,9 67,020,8 62,529,8 62,529,8 p=0,36 p=0,37 Фиброз есть, n=6 нет, n=8 Размер патологического клона среди CD34+ клеток не зависел от наличия фиброза и был одинаков у больных с наличием и отсутствием признаков фиброза в костном мозге. Таким образом, в исследовании было показано, что выраженность клональных изменений в CD34+ кроветворных клетках-предшественницах не зависела от таких прогностических факторов как диагноз, кариотип, клеточность костного мозга и фиброз. 3.5. Характеристика МСК костного мозга 3.5.1. Темпы роста культуры МСК у больных и здоровых лиц Культура МСК получена у 36 из 43 больных; у 4 больных не получен рост клеточной культуры и у 3 больных исследование не проводили. Сравнительная характеристика МСК больных и здоровых доноров представлена в таблице 15: 73 Таблица 15 Сравнительная характеристика МСК костного мозга больных МДС и здоровых доноров Параметр Группа Кол-во посаженных Конфлюэнтность, клеток х106 % (разброс) Больные (n=24) 6,4 (5,0-8,0) 50-100 - митозы получены (n=18) 46,6 (27-89) 45,1 (27-89) - митозы не получены (n=6) Доноры (n=7) Время получения подслоя (2 пассаж), дни (разброс) 51,3 (39-77) 8,2 (7,8-8,5) 100 33,8 (12-54) Как видно из таблицы, плотность клеточного подслоя (конфлюэнтность) на площади дна пластикового матраса у больных в большинстве случаев не доходила до 100%. Среднее время формирования монослоя у больных превышало время в контрольной группе здоровых доноров, составив 46,614,5 и 33,815,2 дней, соответственно. На рисунке 12 представлено сравнение времени формирования конфлюэнтного подслоя МСК у больных МДС и здоровых доноров: 74 p=0,14 Рисунок 12. Время формирования конфлюэнтного подслоя МСК у больных и доноров Достоверное различие темпов роста культуры МСК у больных МДС и здоровых доноров не получено (p=0,14). Несмотря на статистически не значимые отличия показателей динамики роста МСК, нельзя утверждать, что кинетика роста МСК больных МДС и здоровых лиц одинакова, так как проанализировано небольшое количество случаев, а также не были учтены больные, у которых клеточный монослой не сформировался (n=4). Как представлено также в таблице 15, вследствие снижения пролиферативной способности МСК больных МДС в некоторых случаях не были получены митотически делящиеся клетки. Было проведено сравнение времени формирования конфлюэнтного подслоя МСК в случаях получения достаточного количества анализируемых митозов и в случаях их отсутствия. Результаты представлены на рисунке 13: 75 p=0,33 Рисунок 13. Время формирования конфлюэнтного подслоя МСК в культурах, в которых были получены и в которых отсутствовали митозы Примечание: больные группа 1 – митозы получены; больные группа 2 - митозы отсутствовали Время получения культуры МСК в группе 1 (n=18, митозы получены) и группе 2 (n=6, митозы не получены) не различалось и составило 45,115,3 и 51,313,6 дней, соответственно (p=0,33). 3.5.2. Темпы роста культуры МСК в зависимости от клинического варианта заболевания, группы риска IPSS-R, клеточности костного мозга и наличия фиброза В анализ включены больные, у которых формирование конфлюэнтного монослоя достигнуто на втором пассаже (n=24). Распределение клинических вариантов заболевания было следующим: 1 больной РА, 2 больных РАКС, 2 больных МДС с del(5q), 11 больных РЦМД, 2 больных РАИБ-1, 2 больных РАИБ-2 и 4 больных ОМЛ. Для сравнительного анализа больные с отсутствием бластоза в костном мозге (РА, РАКС, МДС с del(5q) и РЦМД) были объединены в одну группу, а больные с избытком бластных клеток (РАИБ-1 и РАИБ-2) и в 76 стадии трансформации – в другую. Сравнение времени формирования конфлюэнтного подслоя МСК у пациентов с разными вариантами заболевания представлено в таблице 16: Таблица 16 Время формирования конфлюэнтного подслоя МСК в зависимости от варианта заболевания Диагноз Время получения МСК, дни РЦ (РА, 5q-, РАКС и РЦМД), n=16 РАИБ и ОМЛ, n=8 44,915,8 50,213,0 p=0,39 Вариант заболевания (без бластоза, с бластозом и ОМЛ) не влиял на время роста МСК в культуре. Среднее время формирования монослоя МСК на втором пассаже было одинаковым (p=0,39). Распределение следующим: 10 по больных группам группы риска согласно низкого риска, шкале 6 IPSS-R больных было группы промежуточного риска, 3 больных высокого и 1 больной – очень высокого риска. Мы сравнили среднее время получения культуры МСК у больных их разных групп риска. Больные с высоким и очень высоким риском были объединены: Таблица 17 Время формирования конфлюэнтного подслоя МСК в зависимости от группы риска Диагноз Время получения МСК, дни Низкий, n=10 Промежуточный, n=6 Высокий/очень высокий, n=4 46,913,9 40,812,0 44,215,7 p=0,83 Как видно из таблицы, время роста МСК не зависело от группы риска. 77 Далее проведен анализ связи между кинетикой роста МСК и морфологическими особенностями костного мозга. При анализе гистологических препаратов костного мозга клеточность была снижена у 6 больных, соответствовала возрастной норме у 4 больных и превышала ее у 13 больных. Одному больному гистологическое исследование костного мозга не проводили. Было проанализировано время получения культуры МСК в зависимости от клеточности костного мозга. Для получения сопоставимых по количеству больных групп больные с гипо- и нормоклеточным костным мозгом были объединены. Результаты представлены в таблице 18: Таблица 18 Время формирования конфлюэнтного подслоя МСК у больных в зависимости от клеточности костного мозга Клеточность КМ Время получения МСК, дни Снижена/нормальная, n=10 Увеличена, n=13 52,5±16,6 39,8±7,8 p<0,05 Клеточность костного мозга достоверно влияла на активность роста МСК в культуре. Выявлено, что у больных с гиперклеточным костным мозгом время получения конфлюэнтного монослоя было значимо меньше, чем у больных со сниженной и нормальной клеточностью (p<0,05). Наличие признаков коллагенового фиброза в трепанобиоптатах костного мозга в этой группе наблюдалось у 5 (21,7%) из 23 больных. В таблице 19 представлены показатели времени получения культуры МСК у больных с и без признаков фиброза в костном мозге: 78 Таблица 19 Время формирования конфлюэнтного подслоя МСК у больных с наличием и отсутствием фиброза в костном мозге Фиброз КМ Время получения МСК, дни есть, n=5 нет, n=18 45,614,3 44,412,4 p=0,86 Наличие морфологических признаков фиброза не влияло на показатели роста МСК в культуре. Среднее время формирования монослоя МСК у больных с фиброзом и без фиброза в костном мозге было одинаковым (p=0,86). Известно, что МСК больных МДС имеют функциональные отличия от МСК, полученных у здоровых лиц [7-9, 63, 100, 137, 158]. В нашем исследовании показано, что МСК костного мозга больных МДС проявляли сниженную пролиферативную способность в культуре по сравнению с МСК, полученными в контрольной группе: конфлюэнтность менее 100%, увеличение времени формирования монослоя или его отсутствие, однако значимые различия в культурах МСК больных и здоровых лиц не получены. Выявлена обратная зависимость времени формирования конфлюэнтного подслоя МСК от клеточности костного мозга. Клинический вариант МДС и наличие фиброза в костном мозге не влияли на темп роста культуры клеток. Таким образом, рост МСК костного мозга больных был снижен в сравнении с контрольной группой здоровых доноров. На скорость формирования конфлюэнтного подслоя МСК влияла клеточность костного мозга и не влияли клинический вариант заболевания и наличие фиброза. 3.5.3. Стандартное цитогенетическое исследование МСК Кариотипирование МСК выполнено у 27 из 36 больных (МДС - 23 и ОМЛ - 4) и у 7 здоровых доноров костного мозга. При анализе цитогенетических препаратов МСК от 9 больных не были получены делящиеся клетки либо 79 качество/количество имевшихся митозов не было достаточным для проведения исследования. Результаты цитогенетического исследования МСК приведены в таблице 20 (приложение 1). Нормальный кариотип определен у всех больных ОМЛ и у 21 больного МДС, у одного из которых (пациент 002) в кариотипе МСК определена конституциональная инверсия хромосомы 9. У 2 (9%) из 23 пациентов с МДС выявлены аномалии кариотипа МСК. У одного из них с конституциональной инверсией хромосомы 9 (пациент 009) выявлена неклональная транслокация в одной метафазе: 46,ХY,t(2;22)(p10;q11),inv(9)(p13q21)[1]/46,ХY, inv(9)(p13q21)[19]. У второго пациента (пациент 016) в кариотипе МСК выявлена клональная перестройка в 7 метафазах из 20: 46,ХY,add(2q)[7]/46,ХY[13]. В костном мозге у этого больного определены комплексные нарушения кариотипа. Исследование кариотипа общей популяции клеток костного мозга и МСК у этого больного представлено на кариограмме (рисунок 14 а, б): а) Кариотип: 45-46,XY,-5,+mar ?del(13q21),der(19),add(?q13or ?p13),-20,+2mar 80 б) Кариотип: 46XY,add(2)(q36) Рисунок 14. Кариотип клеток костного мозга и мезенхимальных стромальных клеток пациента 016 Примечание: а) общая популяция клеток костного мозга; б) мезенхимальные стромальные клетки У обоих пациентов с выявленной в клетках костного мозга и МСК инверсией хромосомы 9 ее конституциональный характер был подтвержден исследованием кариотипа культуры ФГА-стимулированных лимфоцитов периферической крови. В МСК, полученных от здоровых доноров костного мозга, хромосомные аномалии не выявлены. Таким образом, клональные аномалии кариотипа МСК выявлены всего у одного больного: структурная перестройка с вовлечением хромосомы 2. Хромосомные нарушения МСК у этого больного были отличны от аномалий кариотипа кроветворных клеток костного мозга. 81 3.5.4. Цитогенетическое исследование МСК методом FISH Исследование выполнено у 11 больных: 2 – МДС с del(5q), 3 – РЦМД, 2 – РАИБ-1, 2 – РАИБ-2 и 2 – ОМЛ. У всех этих больных в клетках костного мозга были выявлены хромосомные аномалии: у 5 больных – изолированные del(5q), моносомия 7 и inv(3), у 2 больных – сочетание 2 аномалий (моносомия 7 и трисомия X, del(5q) и del(7q)) и у 4 больных – комплексные нарушения кариотипа. Размер клонов, исследованных в клетках костного мозга с использованием соответствующих ДНК-зондов, составил 20-85%. При стандартном цитогенетическом исследовании МСК у 9 из 11 больных определен нормальный кариотип (у 1 из них выявлена конституциональная инверсия хромосомы 9), у 1 больного – клональные аномалии кариотипа и у 1 больного исследование не выполнено вследствие отсутствия митозов. При FISHанализе МСК были применены ДНК-зонды к выявленным в кроветворных клетках цитогенетическим маркерам. Ни в одном случае в МСК не были определены искомые хромосомные аномалии. Исключение составила пациентка 032, у которой в МСК было обнаружено 4% клеток с трисомией X. Как было указано выше, у данной пациентки в общей популяции клеток костного мозга выявлено 2 клона клеток – с моносомией 7 (в 23% ядер) и с трисомией Х (в 20% ядер); при исследовании CD34+ клеток-предшественниц клон с моносомией 7 определен в 26% ядер, а клон с трисомией Х отсутствовал; при исследовании ФГА-стимулированных лимфоцитов крови определен нормальный кариотип. Таким образом, учитывая отсутствие хромосомной аномалии (трисомии Х) в лимфоцитах периферической крови, ее конституциональный характер не был подтвержден. Оставалось неясным отсутствие клона с трисомией Х на уровне ранних кроветворных предшественниц, а также его наличие в культуре МСК. По всей видимости, у пациентки с моносомией 7 появление второго патологического клона (трисомии Х) произошло на уровне более зрелых клеток, на поверхности которых утрачен антиген CD34. В этом случае отсутствие трисомии Х в CD34+ клетках объяснимо. Вопрос о том, чем может быть 82 обусловлен факт наличия трисомии Х в клетках стромы, оставался открытым, так как в литературе нам не встретились описания совпадения клональных нарушений в кроветворных и стромальных клетках при МДС [90, 129, 142]. Представляется возможным, что небольшой процент позитивных ядер (4%) в данном случае был обусловлен наличием примеси кроветворных клеток (макрофагов) в культуре МСК. В нашем исследовании показано, что в МСК костного мозга не определяются хромосомные противоречит данным специфических для поломки, литературы кроветворных характерные [129, клеток 90]. для МДС. Наряду аномалий, с МСК Это не отсутствием проявляют генетическую нестабильность, выявляя другие аберрации [33, 34, 54, 55, 36, 100, 143]. В нашей работе в МСК у 2 (9,5%) из исследованных больных МДС выявлены структурные аномалии кариотипа (неклональная и клональная). Мы не наблюдали аномалии кариотипа МСК у больных в стадии трансформации в ОМЛ. В большинстве исследований описано преобладание потери генетического материала МСК (гипоплоидия, делеции, дериваты хромосом), тогда как методом сравнительной геномной гибридизации выявлено преимущественно увеличение генетического материала на различных хромосомах [100]. В нашем исследовании потери генетического материала МСК не были выявлены: у первого пациента определена неклональная (в одной метафазе) транслокация t(2;22), у второго – появление дополнительного участка на длинном плече хромосомы 2 (клональная аномалия). В литературе есть свидетельства о появлении в культурах МСК у здоровых лиц хромосомных аберраций в процессе культивирования in vitro, которые проявляются как на ранних (1-5-й), так и на более поздних пассажах [1, 14]. Тогда как в работах других исследователей продемонстрирована генетическая стабильность МСК при довольно длительном культивировании [15, 28]. Нельзя полностью исключить, что выявленные нами аномалии кариотипа у 2 больных не являются результатом трансформации in vitro, так как мы не исследовали кариотип МСК у этих больных на других пассажах. У первого больного 83 кариотип оценивался после трех пассажей, а у второго – после двух, таким образом, культуры клеток не подвергались длительному культивированию. Несовпадение хромосомных аномалий в популяциях кроветворных и стромальных клеток свидетельствует о том, что МСК не являются частью опухолевого клона при МДС. Этот факт не вызывает сомнение, учитывая отсутствие общей клетки-предшественницы кроветворной и мезенхимальной клеточных линий. В то же время клетки стромы костного мозга проявляют функциональную неполноценность у больных МДС (снижение пролиферативной активности, нарушение пластичности, аномальная экспрессия поверхностных маркеров и др.). Следовательно, наличие хромосомных аберраций наряду с нарушением процессов клеточного деления и дифференцировки подтверждают функциональную патологию стромы при МДС, что может иметь важное значение в патогенезе заболевания. Таким образом, после применения двух методов цитогенетического анализа – стандартного цитогенетического исследования и FISH – в МСК костного мозга выявлены структурные (клональные и неклональные) аномалии кариотипа у 9,5% больных МДС. Хромосомные аномалии, характерные для популяции кроветворных клеток костного мозга, выявлены не были. У всех больных в стадии трансформации в ОМЛ определен нормальный кариотип МСК. 3.5.5. Клиническое наблюдение пациента с клональными нарушениями кариотипа МСК Представлена история заболевания пациента 016 (м, 1944 г.р.). Диагноз МДС: РЦМД установлен в феврале 2012 года, длительность цитопении к моменту обследования – 2 месяца. Обоснование диагноза: – наличие общей слабости, фебрильной лихорадки – цитопенический синдром с зависимостью от гемотрансфузий. В общем анализе крови – гемоглобин 59 г/л, эритроциты 1,39х1012/л, лейкоциты 5,81х109/л, нейтрофилы 61%, моноциты 14%, тромбоциты 55х109/л 84 – миелограмма – гипоклеточный костный мозг, бластные клетки 1,4%, гранулоцитарный росток 45% с признакми дисгранулоцитопоэза (диссоциация созревания, гипогранулярность цитоплазмы, псевдопельгеризм), эритроцидный росток 50% с признаками дизэритропоэза (мегалобластоидность хроматина, атипия ядер), мегакариоциты в сниженном количестве – гистологическое исследование трепанобиоптата костного мозга – клеточность костного мозга увеличена, расширение эритроидного ростка, среди элементов гранулоцитопоэза – преобладание промежуточных форм, мегакариоциты в достаточном количестве. Признаки дисмиелопоэза в трех ростках кроветворения, фиброз в костном мозге не выявлен – общее содержание CD34+ клеток в костном мозге - 4,5% – цитогенетическое хромосомные поломки: исследование костного мозга – комплексные 45-46ХY,-?5,-13,der(19),add(?q13or?p13),-20,+marх2, +mar?del(13q21)[15]/45-46ХYidem,+dmin [2]/46ХY[3]. Методом FISH выявлены – del(5q) в 74% и моносомия 20 в 70% ядер, результаты исследования представлены на рисунке 15 (а, б, в, г): 85 а) б) в) г) Рисунок 15. FISH-исследование общей попудяции клеток костного мозга, изолированных CD34+ клеток костного мозга и периферической крови и мезенхимальных стромальных клеток у пациента 016. ДНК-зонд - LSI (5q33-q34) EGR-1 SpectrumOrange/D5S721/D5S23 SpectrumGreen Probe Примечание: а) общая популяция клеток костного мозга, del(5q) выявлена в 74% ядер; б) мезенхимальные стромальные клетки, del(5q) не выявлена; в) CD34+ клетки из костного мозга, del(5q) выявлена в 70% ядер; г) CD34+ клетки из периферической крови, del(5q) выявлена в 70% ядер; 86 На основании полученных данных обследования пациенту установлен диагноз: миелодиспластический синдром: рефрактерная цитопения с мультилинейной дисплазией. Риск IPSS – промежуточный-2 (1,5 балла). Риск WPSS – высокий (4 балла). Риск IPSS-R – высокий (6 балла). В течение 4 месяцев после установления диагноза пациент получал сопроводительную терапию, заместительные гемотрансфузии. В июне 2012 года в миелограмме отмечено увеличение количества бластных клеток до 16,3%, в гемограмме – трехростковая цитопения, бластемия до 17%. Наблюдалось прогрессирование заболевания. В июне начата терапия азацитидином в дозе 75 мг/м2 подкожно в течение 7 дней. Межкурсовые перерывы были увеличены в связи с развитием глубокой цитопении и инфекционных осложнений (грамположительный сепсис, двусторонняя пневмония). В связи с наличием осложнений доза азацитидина со второго курса редуцирована на 50%. С июня по сентябрь 2012 года проведено 3 курса гипометилирующей терапии. После завершения 3 курса терапии азацитидином происходило постепенное нарастание лейкоцитоза до 70х109/л. В пунктате костного мозга (сентябрь 2012 года) – 60% бластных клеток. Констатирована трансформация МДС в ОМЛ. Посткурсовой период осложнился повторным развитием двусторонней пневмонии с острой дыхательной недостаточностью, в связи с прогрессирующим течением которой пациент наблюдался в отделении реанимации и интенсивной терапии. Несмотря на массивную противомикробную терапию, объем поражения легочной ткани увеличивался, усугублялась степень дыхательной недостаточности, присоединились признаки полиорганной недостаточности и ДВС-синдрома. 16 октября 2012 года наступила смерть больного. Резюмируя представленный клинический случай, у пациента с РЦМД через 4 месяца после установления диагноза наблюдалась прогрессия заболевания и развитие РАИБ-2. В дальнейшем отмечалась резистентность к проводимой терапии гипометилирующими препаратами, на фоне которой 87 констатирована трансформация в острый миелоидный лейкоз и смерть от некупируемых инфекционных осложнений через 8 месяцев. Основываясь на категории риска, ожидаемая продолжительность жизни у этого больного составила по шкале IPSS 12,5 месяцев (1,2 лет), по шкале WPSS – 19 месяцев (1,6 лет), по шкале IPSS-R – 18 месяцев (1,5 лет). Среднее время трансформации в ОМЛ (IPSS-R) – 17 месяцев (1,4 лет). У пациента при исследовании МСК костного мозга выявлены клональные нарушения кариотипа – 30%-ный клон add(2q) (рисунок 14). Известно, что выявление клональных нарушений кариотипа МСК ассоциировано с неблагоприятным кариотипом в кроветворных клетках костного мозга, а также с худшей выживаемостью больных [33]. В нашем исследовании у пациента с клональной аномалией в МСК в клетках костного мозга были выявлены комплексные нарушения кариотипа, а продолжительность жизни оказалась почти вдвое меньше предполагаемой. Однако, учитывая единичность наблюдения, делать окончательные выводы не представляется возможным. Таким образом, присутствие клональных нарушений кариотипа в строме у больного с множественными хромосомными аберрациями в кроветворных клетках костного мозга, возможно, явилось дополнительным фактором, определившим резистентность к терапии, быструю трансформацию в острый лейкоз и короткую продолжительность жизни больного. 88 Заключение В исследовании представлен комплексный цитогенетический анализ разных клеточных популяций у больных МДС на этапе установления диагноза. Показано количество и спектр хромосомных аномалий, выявляемых в общей популяции клеток костного мозга. Среди включенных больных 22 (51,2%) имели клональные изменения кариотипа. Проанализирована эффективность стандартного цитогенетического исследования в выявлении хромосомных нарушений, а также значение флюоресцентной in situ гибридизации в определении скрытых аномалий, не зафиксированных при кариотипировании. Так, по нашим данным, у значительной части больных (16,3%) были выявлены дополнительно хромосомные аномалии после применения двух цитогенетических методов, что увеличило процент больных с нарушениями кариотипа с 37,2% до 51,2%. Полученные результаты свидетельствуют о целесообразности применения FISH-исследования в дополнение к стандартному. Особенно это важно в тех случаях, когда не удается проанализировать кариотип из-за отсутствия митозов, а также когда есть весомые подозрения на наличие клональных нарушений кариотипа (например, del(5q)), или определение хромосомных проведении нарушений необходимо для верификации диагноза при дифференциальной диагностики с пограничными состояниями (апластическая анемия, вторичные дисплазии кроветворения). В нашем исследовании у 4 из 7 больных, у которых были выявлены «скрытые» хромосомные аберрации, при стандартном исследовании определен нормальный кариотип. Эти данные указывают на то, что при получении нормального кариотипа, больным также желательно выполнять FISH-анализ. Больные, включенные в исследование, были стратифицированы на группы риска по основным прогностическим шкалам, используемым в практике врачагематолога – IPSS, WPSS и IPSS-R. Показана их функциональная значимость и проведено сравнение определения групп риска у больных согласно разным шкалам. 89 В работе охарактеризованы CD34+ гемопоэтические клетки- предшественницы у больных МДС. Показано, что их содержание увеличено в костном мозге и периферической крови больных по сравнению с контрольной группой здоровых лиц и больных лимфопролиферативными заболеваниями. Цитогенетическое исследование незрелых кроветворных клеток выявило в них клональные нарушения кариотипа. Хромосомные аномалии на уровне CD34+ клеток соответствовали выявленным в общей популяции клеток костного мозга, величина патологических клонов была одинакова. Установлена прямая зависимость между содержанием клонально-измененных клеток среди изолированной фракции клеток-предшественниц и их содержанием в общей клеточной популяции костного мозга. Показано, что выраженность клональных изменений на уровне CD34+ кроветворных клеток-предшественниц не зависела от таких прогностических факторов, как диагноз, категория риска, кариотип, клеточность костного мозга и наличие фиброза. Мы наблюдали больший размер патологического клона в клетках с благоприятными хромосомными аномалиями и у больных с гиперклеточным костным мозгом (результаты статистически не значимы). Определено, что у больных МДС в циркулирующих CD34+ клетках также содержатся аномалии кариотипа, это имеет практическое значение и может быть применено для проведения цитогенетических исследований у больных. Использование клеток периферической крови поможет снизить кратность пункций костного мозга у больных в процессе наблюдения и лечения. Проанализированы свойства мезенхимальных стромальных клеток костного мозга при МДС. Выявлено, что МСК больных отличны по пролиферативной активности от культуры клеток, полученных у здоровых доноров костного мозга, а также у разных больных – в зависимости от морфологических особенностей костного мозга. У большинства больных при цитогенетическом исследовании МСК содержали нормальный набор хромосом. Однако у 2 (9,5%) больных МДС в МСК были выявлены: в одном случае неклональная, в другом – клональная структурные аномалии кариотипа, которые отличались от нарушений кариотипа кроветворных клеток костного мозга. У 90 больных ОМЛ из предшествующего МДС хромосомные аномалии МСК не выявлены. Полученные данные позволяют сделать вывод, что МСК костного мозга не являются частью патологического клона при МДС, и вместе с тем проявляют функциональные нарушения, которые, несомненно, имеют значение в патогенезе заболевания. Таким образом, результаты нашего исследования демонстрируют, что аномалии кариотипа у больных МДС содержатся как в кроветворных, так и в стромальных клетках-предшественницах, что указывает на патогенетическое участие в развитии заболевания не только кроветворных компонентов костного мозга, но и их микроокружения, и является очередным свидетельством высокого уровня поражения при этом заболевании. Представляют важность дальнейшие исследования в данной области. 91 Выводы 1. У больных миелодиспластическими синдромами в дебюте заболевания методом стандартного цитогенетического исследования хромосомные аномалии в костном мозге выявлены у 37,2% больных, нормальный кариотип получен у 53,5% и отсутствие митозов – у 9,3% больных. 2. Применение метода флюоресцентной in situ гибридизации в дополнение к стандартному цитогенетическому исследованию позволило выявить «скрытые» аномалии кариотипа в 16,3% случаев, таким образом, процент больных с хромосомными аберрациями составил 51,2%. 3. Установлено, что в CD34+ гемопоэтических клетках-предшественницах в костном мозге и периферической крови определены те же аномалии кариотипа, что и в клетках общей популяции костного мозга. 4. Выявлена прямая корреляционная зависимость между величиной клона в клетках общей популяции костного мозга и в CD34+ гемопоэтических клеткахпредшественницах костного мозга и периферической крови. 5. Получена зависимость времени формирования подслоя мезенхимальных стромальных клеток от клеточности костного мозга: культура росла быстрее у больных с гиперклеточным костным мозгом. 6. Определены структурные (клональные и неклональные) аномалии кариотипа мезенхимальных стромальных клеток у 9,5% больных миелодиспластическими синдромами, отличные от аномалий кариотипа клеток костного мозга. 92 Библиографический список 1. Бочков Н.П. Цитогенетика стволовых клеток человека. / Бочков Н.П., Никитина В.А. // Молекулярная медицина. – 2008. – N 3. – с. 40-47. 2. Гайдамака, Н.В. Экспрессия матриксных металлопротеиназ и их ингибиторов в костном мозге у больных острыми лейкозами / Н.В. Гайдамака, Е.Н. Паровичникова., Л.Э. Завалишина, В.Г. Савченко, Г.А. Франк // Гематология и трансфузиология – 2009. – N 2. – p. 3-10. 3. Григорян, А.С. Спонтанная злокачественная трансформация мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток в культуре - происходит ли она в действительности?/ А.С. Григорян, П.В. Кругляков. // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. - 2009. – N 4. – c. 78-82. 4. Кохно, А.В. Терапия рефрактерных анемий и острых малопроцентных лейкозов. Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук: 14.00.29 / Кохно Алина Владимировна. – М. 2001. – 135 с. 5. Кохно, А.В. Эффективность терапии циклоспорином у больных миелодиспластическим синдромом / А.В. Кохно, Е.Н. Паровичникова, Е.А. Михайлова, Е.Н. Устинова, И.Б. Капланская, В.Н. Двирнык, Ю.В. Ольшанская, Е.В. Домрачева, В.Г. Савченко // Терапевтический архив. – 2010. – N 8. – c. 4853. 6. Кохно, А.В. Миелодиспластичкий синдром / А.В. Кохно, Е.Н. Паровичникова, В.Г. Савченко // Клиническая геронтология. – 2009. – N 3. – с. 33-46. 7. Лубкова, О.Н. Экспрессия VCAM-1 на стромальных клетках из костного мозга больных миелодиспластическими синдромами / О.Н. Лубкова, Н.В. Цветаева, К.С. Момотюк, В.М. Белкин, Т.Е. Манакова // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2011. – N 1. – c. 17-20. 8. Манакова, Т.Е. Функциональные нарушения кроветворного микроокружения при различных формах миелодиспластического синдрома / Т.Е. Манакова, Л.П. Герасимова, Н.В. Цветаева, К.С. Момотюк // Бюллетень 93 экспериментальной биологии и медицины. – 2000. – N 9. – c. 255-258. 9. Манакова, предшественников Т.Е. из Дефект костного адгезии мозга и хоминга больных кроветворных миелодисплазиями к стромальным клеткам из культур нормального костного мозга / Т.Е. Манакова, Н.В. Цветаева, В.М. Белкин, К.С. Момотюк, Н.Д. Хорошко // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.– 2005. – N 1. – c. 11-14. 10. Ольшанская, Ю.В. Хромосомные перестройки при миелодиспластическом синдроме / Ю.В. Ольшанская, Е.В. Домрачева, А.И. Удовиченко // Терапевтический архив. – 2005. – N 7. – с. 27-33. 11. Савченко, В.Г. Эффективность лечения циклоспорином А больных миелодиспластическими синдромами в зависимости от формы заболевания / В.Г. Савченко, Е.Н. Паровичникова, А.В. Кохно, Е.А.Михайлова, Ю.В.Ольшанская, И.Б.Капланская // Современная онкология. – 2001. – N 2. – с. 55-56. 12. Савченко, В.Г. Миелодиспластический синдром: некоторые вопросы патогенеза и лечения / В.Г. Савченко, Е.Н. Паровичникова, Е.А. Михайлова, Ю.В. Ольшанская, Е.Н. Устинова, Е.О. Грибанова, Г.А. Франк, Л.Ю. Тихонова, А.В. Кохно и др. // Терапевтический архив. – 1996. – N 7. – c. 31-37. 13. Свинарева, Д.А. Экспансия кроветворных клеток-предшественников ex vivo на подслое, обработанном паратиреоидном гормоном / Д.А. Свинарева, И.Н. Нифонтова, И.Л. Чертков, Н.И. Дризе // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2005. – N 9. – с. 320-324. 14. Свинарева, Д.А. Основные свойства мезенхимных стромальных клеток из костного доноров: поверхностные маркеры / Д.А. Свинарева, И.Н. Шипунова, Ю.В. Ольшанская, К.С. Момотюк, Н.И. Дризе, В.Г. Савченко // Терапевтический архив. – 2010. – N 7 – c. 52-56. 15. Шалыгина Ю.А. Сравнительный цитогенетический анализ мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток ранних пассажей и лимфоцитов человека / Шалыгина Ю.А., Ефимова О.А., Кругляков П.В., Пендина А.А., Григорян А.С., Кузнецова Т.В., Полынцев Л.Г., Баранов В.С. // Клеточная трансплантология и тканевая медицина. – 2009. – N 2. – с. 63-69. 94 16. Чертков, И.Л. Стволовая кроветворная клетка и ее микроокружение / И.Л. Чертков, O.A. Гуревич // Медицина. - 1984. – 238 с. 17. Чертков, И.Л. Схема кроветворения / И.Л. Чертков, Н.И. Дризе, А.И. Воробьев // Терапевтический архив. – 2006. – N 7. – c. 5-12. 18. Щеголеватая, О.О. Развитие острого миелоидного лейкоза из донорских клеток после аллогенной трансплантации периферических стволовых кроветворных клеток у больной острым монобластным лейкозом / О.О. Щеголеватая, Е.Н. Паровичникова, И.А. Демидова, В.Г. Исаев, А.Н. Соколов, Е.И. Желнова, И.В. Алексеева, В.А. Жеребцова, Т.В. Гапонова, Е.В. Домрачева и др. // Терапевтический архив. – 2011. – N 3. – c. 57-62. 19. Alvi, S. Successful establishment of long-term bone marrow cultures in 103 patients with myelodysplastic syndromes / S. Alvi, A. Shaher, V. Shetty, B. Henderson, B. Dangerfield, F. Zorat, L. Joshi, S. Anthwal, L. Lisak, L. Little et al. // Leuk Res. – 2001. – N 25. – p. 941-954. 20. Andrews. R.G. Monoclonal antibody 12.8 recognizes a 115-Kd molecule present on both unipotent and multipotent hematopoietic colony-forming cells and their precursors / R.G. Andrews, J.W. Singer, I.D. Bernstein // Blood. – 1986. – N 67. – p. 842-845. 21. Arinkin, M.I. Dieintravitale Untersuchungsmethodik des Knochenmarks / M.I. Arinkin // Folia Haematol (Leipzig). – 1929. – N 38. – p. 233-240. 22. Ayraud, N. Cytogenetic study of 88 cases refractory anemia / N. Ayraud, M. Donzeau, S. Raynaud, J.C. Lambert // Cancer Genet Cytogenet. – 1983. – N 8. – p. 243-248. 23. Baumann, M.A. Concurrent myelodysplasia and lymphoproliferation: a disorder of the true pluripotential stem cell? / MA. Baumann, J.A. Libnoch, R.M. Hansen, M.G. Heckman, G.A. Hanson // Q J Med. – 1985. – N 55. – p. 199-211. 24. Bejar, R. Clinical effect of point mutations in myelodysplastic syndromes / R. Bejar, K. Stevenson, O. Abdel-Wahab, N. Galili, B. Nilsson, G. Garcia-Manero, H. Kantarjian, A. Raza, R.L. Levine, D. Neuberg, B.L. Ebert // N Engl J Med. – 2011. – N 364. – p. 2496-2506. 95 25. Bennett, J.M. Proposals for the classification of the acute leukaemias. French-American-British (FAB) co-operative group / J.M. Bennett, D. Catovsky, M.T. Daniel et al. // Br J Haematol. – 1976. – N 33. – p. 451-458. 26. Bennett, J.M. Proposals for the classification of the myelodysplastic syndromes / J.M. Bennett, D. Catovsky, M.T. Daniel, G. Flandrin, D.A. Galton, H.R. Gralnick, C. Sultan // Br J Haematol. – 1982. – N 51. – p. 189-199. 27. Berenson, R.J. Antigen CD34+ marrow cells engraft lethally irradiated baboons / R.J. Berenson, R.G. Andrews, W.I. Bensinger, D.F. Kalamasz, G. Knitter, C.D. Buckner, I.D. Bernstein // J Clin Invest. – 1988. – N 81. – p. 951-955. 28. Bernardo, M.E. Human bone marrow derived mesenchymal stem cells do not undergo transformation after long-term in vitro culture and do not exhibit telomere maintenance mechanisms / M.E. Bernardo, N. Zaffaroni, F. Novara, A.M. Cometa, M.A. Avanzini, A. Moretta, D. Montagna, R. Maccario, R. Villa, M.G. Daidone, O. Zuffardi, F. Locatelli // Cancer Res. – 2007. – N 67. – p. 9142-9149. 29. Berneman, Z.N. A myelodysplastic syndrome preceding acute lymphoblastic leukaemia / Z.N. Berneman, D. Van Bockstaele, P. de Meyer, M. van der Planken, F. Vertessen, R. de Bock, M.E. Peetermans // Br J Haematol. – 1985. – N 60. – p. 353354. 30. Beyer, V. Systematic screening at diagnosis of -5/del(5)(q31), -7, or chromosome 8 aneuploidy by interphase fluorescence in situ hybridization in 110 acute myelocytic leukemia and high-risk myelodysplastic syndrome patients: concordances and discrepancies with conventional cytogenetics / V. Beyer, C. Castagné, D. Mühlematter, V. Parlier, J. Gmür, U. Hess, T. Kovacsovics, S. MeyerMonard, A. Tichelli et al. // Cancer Genet Cytogenet. – 2004. – N 152. – p. 29-41. 31. Bhatia, R. Abnormal function of the bone marrow microenvironment in chronic myelogenous leukemia: Role of malignant stromal macrophages/ R. Bhatia, P.B, McGlave, G.W. Dewald, B.R. Blazar, C.M. Verfaillie // Blood. – 1995. – N 85. – p. 3636-3645. 32. Bjorkman, S.E. Chronic refractory anemia with sideroblastic bone marrow: a study of four cases / S.E. Bjorkman // Blood. – 1956. – N 11. – p. 250-259. 96 33. Blau, O. Mesenchymal stromal cells of myelodysplastic syndrome and acute myeloid leukemia patients have distinct genetic abnormalities compared with leukemic blasts / O. Blau, C.D. Baldus, W.K. Hofmann, G. Thiel, F. Nolte, T. Burmeister, S. Turkmen, O. Benlasfer, E. Schumann et al. // Blood. – 2011. – N 118. – p. 5583-5592. 34. Blau, O. Chromosomal aberrations in bone marrow mesenchymalstroma cells from patients with myelodysplastic syndrome and acute myeloblasticleukemia / O. Blau, W.R. Hofmann, C.D. Baldus, G. Thiel, V. Serbent, E. Schumann, E. Thiel, I.W. Blau // Exp Hematol. – 2007. – N 35. – p. 221-229. 35. Block, M. Preleukemic acute human leukemia / M. Block, O. Leon, O. Jacobson, W.F. Bethard // JAMA. – 1953. – N 152. – p. 1018-1028. 36. Borgstrom, G.H. Clinical implications of monosomy 7 in acute nonlymphocytic leukemia / G.H. Borgstrom, L. Teerenhovi, P. Vuopio, A. de la Shapelle, H. Van Den Berghe, L. Brandt, H.M. Golomb, A. Louwagie, F. Mitelman et al. // Cancer Genet Cytogenet. – 1980. – N 2. – p. 115-126. 37. Braulke, F. FISH analysis of circulating CD34+ cells as a new tool for genetic monitoring in MDS: verification of the method and application to 27 MDS patients / F. Braulke, J. Schanz, K. Jung, K. Shirneshan, K. Schulte, C. Schuetze, R. Steffens, L. Trumper, D. Haase // Leuk Res. – 2010. – N 34. – p. 1296-1301. 38. Caspersson, T. Identification of human chromosomes by DNA-binding fluorescent agents / T. Caspersson, L. Zech, C. Johansson, E.J. Modest // Chromosoma. – 1970. – N 30. – p. 215-227. 39. Chagraoui, H. Pathogenesis of myelofibrosis with myeloid metaplasia: Insight from mouse models / H. Chagraoui, F. Wendling, W. Vainchenker // Best Pract Res Clin Haematol. – 2006. – N 19. – p. 399-412. 40. Chamberlain, G. Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing / G. Chamberlain, J. Fox, B. Ashton, J. Middleton // Stem cells. – 2007. – N 25. – p. 27392749. 41. Christiansen, D.H. Mutations of AML1 are common in therapy-related myelodysplasia following therapy with alkylating agents and are significantly 97 associated with deletion or loss of chromosome arm 7q and with subsequent leukemic transformation / D.H. Christiansen, M.K. Andersen, J. Pedersen-Bjergaard // Blood. – 2004. – N 104. – p. 1474-1481. 42. Christiansen, D.H. Methylation of p15INK4B is common, is associated with deletion of genes on chromosome arm 7q and predicts a poor prognosis in therapyrelated myelodysplasia and acute myeloid leukemia / D.H. Christiansen, M.K. Andersen, J. Pedersen-Bjergaard // Leukemia. – 2003. – N 17. – p. 1813-1819. 43. Chute, J.P. Soluble factors elaborated by human brain endothelial cells induce the concomitant expansion of purified human BM CD34 +CD38- cells and SCID-repopulating cells / J.P. Chute, G.G. Muramoto, J. Fung, C. Oxford // Blood. – 2005. – N 105. – p. 576-583. 44. Dameshek, W. Sideroblastic anaemia: is this a malignancy? / W. Dameshek // Br J Haematol. – 1965. – N 11. – p. 52-58. 45. Deans, R.J. Mesenchymal stem cells: Biology and potential clinical uses / R.J. Deans, A.B. Moseley // Exp Hematol. – 2000. – N 28. – p. 875-884. 46. De Grouchy, J. Analysis chromosomiques dans l'anemie sideroblastique idiopathique acquise / J. de Grouchy, C. de Nava, R. Zittoun, J. Bousser // Nouv Rev Fr Hematol. – 1966. – N 6. – p. 367-389. 47. De Smet, D. Diagnostic Potential of CD34+ Cell Antigen Expression in Myelodysplastic Syndromes / D. de Smet, F. Trullemans, K. Jochmans, W. Renmans, L. Smet, O. Heylen, A.M. Bael, R. Schots, B. Leus, M. de Waele // Am J Clin Pathol. – 2012. – N 138. – p. 732-743. 48. Dewald, G.W. Clinical characteristics and prognosis of 50 patients with a myeloproliferative syndrome and deletion of part of the long arm of chromosome 5 / G.W. Dewald, M.P. Davis, R.V. Pierre, J.R. O'Fallon, H.C. Hoagland // Blood. – 1985. – N 66. – p. 189-197. 49. Doan, P.L. The vascular niche: home for normal and malignant hematopoietic stem cells / P.L. Doan, J.P. Chute // Leukemia. – 2012. – N 26. – p. 5462. 50. Ernst, T. Inactivating mutations of the histone methyltransferase gene EZH2 98 in myeloid disorders / T. Ernst, A.J. Chase, J. Score, C.E. Hidalgo-Curtis, C. Bryaent, A.V. Jones, K. Waghorn, K. Zoi, F.M. Ross et al. // Nat Genet. – 2010. – N 42. – p. 722-726. 51. Faed, M. Ring F chromosome mosaicism (46,XY,20r/46,XY) in an epileptic child without apparent hematological disease / M. Faed, H.G. Morton, J. Robertson // J Med Genetics. – 1972. – N 9. – p. 470-472. 52. Fialkow, P.J. Chronic myelocytic leukemia: origin of some lymphocytes from leukemic stem cells / P.J. Fialkow, A.M. Denman, R.J. Jacobson, M.N. Lowenthal // J Clin Invest. – 1978. – N 62. – p. 815-823. 53. Fialkow, P.J. Chronic myelocytic leukemia: clonal origin in a stem cell common to the granulocyte, erythrocyte, platelet and monocyte/macrophage / P.J. Fialkow, R.J. Jacobson, T. Papayannopoulou // Am J Med. – 1977. – N 63. – p. 125130. 54. Flores-Figueroa, E. Mesenchymal stem cells in myelodysplastic syndromes: phenotypic and cytogenetic characterization / E. Flores-Figueroa, R.M Arana-Trejo, G. Gutierrez-Espindola, A. Perez-Cabrera, H. Mayani // Leuk Res. – 2005. – N 29. – p. 215-224. 55. Flores-Figueroa, E. Functional analysis of myelodysplastic syndromesderived mesenchymal stem cells / E. Flores-Figueroa, J.J. Montesinos, P. FloresGuzman, G. Gutierrez-Espindola, RM. Arana-Trejo, S. Castillo-Medina, A. PerezCabrera, E. Hernandez-Estevez, L. Arriaqa, H. Mayani // Leuk Res. – 2008. – N 32. – p. 1407-1416. 56. Flores-Figueroa, E. Distinctive contact between CD34+ hematopoietic progenitors and CXC12+ CD271+ mesenchymal stromal cells in benign and myelodysplastic bone marrow / E. Flores-Figueroa, S. Varma, K. Montgomery, P.L. Greenberg, D. Gratzinger // Lab investig. – 2012. – N 92. – p. 1330-1341. 57. Ford, C.E. The chromosomes of man / C.E. Ford, J.L. Hamerton // Nature. – 1956. – N 10. – p. 1020-1023. 58. Fuchigami, K. Absolute number of circulating CD34+ cells is abnormally low in refractory anemias and extremely high in RAEB and RAEB-t; novel pathologic 99 features of myelodysplastic syndromes identified by highly sensitive flow cytometry / K. Fuchigami, H. Mori, T. Matsuo, M. Iwanaga, K. Nagai, K. Kuriyama, M. Tomonaga // Leuk Res. – 2000. – N 24. – p. 163-174. 59. Gangenahalli, G.U. Hematopoietic stem cell antigen CD34: role in adhesion or homing / G.U. Gangenahalli, VK. Singh, Y.K. Verma, P. Gupta, R.K. Sharma, R. Chandra, P.M. Luthra // Stem Cell Dev. – 2006. – N 15. – p. 305-313. 60. Genest, P. Partial deletion of a group-F (19-20) chromosome in a physically handicapped psychiatric male patient / P. Genest, M. Bouchard, J. Poty // J Med Genetics. – 1971. – N 8. – p. 374-377. 61. Geneva, A. Daland. Differentiation of pernicious anemia and certain other macrocytic anemias by the distribution of red blood cell diameters / Geneva A. Daland, Clark W. Heath, George R. Minot // Blood. – 1946. – N 1. – p. 67-75. 62. Gerritsen, W.R. Clonal analysis of myedysplastic syndrome: monosomy 7 is expressed in the myeloid lineage,but not in the lymphoid lineage as detected by fluorescent in situ hybridization / W.R. Gerritsen, J. Donohue, J. Bauman, S.C. Jhanwar, N.A. Kernan, H. Castro-Malaspina, R.J. O,Reilly, J.H. Bourhis // Blood. – 1992. – N 80. – p. 217-224. 63. Geyh, S. Analysis of mesenchymal stromal cells and their interactions with CD34 stem and progenitor cells in patients with myelodysplastic syndromes / S. Geyh, P.R. Cadeddu, J. Fröbel, I. Bruns, F. Zohren, A.N. Hünerlitürkoglu, G. Kobbe, N. Germing, R. Haas, T. Schroeder // Blood, ASH Annual Meeting Abstracts. – 2011. – N 118. – abstr. 2393. 64. Gilbert, H.S. A reappraisal of the ―myeloproliferative disease‖ concept / H.S. Gilbert // Mt Sinai J Med. – 1970. – N 37. – p. 426-435. 65. Glenn, L.D. Failure of karyotypic instability to predict clinical progression in patients with dysmyelopoietic syndromes / L.D. Glenn, W.G. Sanger, A. Kessinger, W.P. Vaughan // Hematol Pathol. – 1988. – N 2. – p. 239-248. 66. Goodman, R.M. Unusual chromosomal findings in a case of myelofibrosis / R.M. Goodman, B.A. Bouroncle, F. Miller, C. North // J Hered. – 1968. – N 59. – p. 348-350. 100 67. Greaves, M.F. 'Target' cells, differentiation and clonal evolution in chronic granulocytic leukaemia: a 'model' for understanding the biology of malignancy. / M.F. Greaves // In: New York: Praeger Publishers. – 1982. – p. 15-47. 68. Greenberg, P.L. International scoring system for evaluating prognosis in myelodysplastic syndromes / P.L. Greenberg, C. Cox, M.M. LeBeau, P. Fenaux, P. Moreal, G. Sanz, M. Sanz, T. Vallespi, T. Hamblin et al. // Blood. – 1997. – N 89. – p. 2079-2088. 69. Greenberg, P.L. Revised International Prognostic Scoring System (IPSS-R) for myelodysplastic syndromes / P.L. Greenberg, H. Tuechler, J. Schanz, G. Sanz, G. Garcia-Manero, F. Sole, J.M. Bennett, D. Bowen, P. Fenaux et al. // Blood. – 2012. – N 120. – p. 2454-2465. 70. Grüneberg, H. The anemia of flexed-tailed mice (Mus musculus L.) / H. Grüneberg // Journal of Genetics. – 1942. – N 44. – p. 246-272. 71. Guba, S.C. Bone marrow stromal fibroblasts secrete interleukin-6 and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor in the absence of inflammatory stimulation: Demonstration by serum-free bioassay, enzyme-linked immunoabsorbant assay and reverse transcriptase polymerase chain reaction / S.C. Guba, C.I. Sartor, L.R. Gottschalk, J. Ye-Hu, T. Milligan, S.C. Emerson // Blood. – 1992. – N 80. – p. 1190-1198. 72. Haase, D. Cytogenetic features in myelodysplastic syndrome. / D. Haase // Ann Hematol. – 2008. – N 87. – p. 515-526. 73. Haase, D. Evidence for malignant transformation in acute myeloid leukemia at the level of early hematopoietic stem cells by cytogenetic analysis of CD34 + subpopulations / D. Haase, M. Feuring-Bruske, S. Konemann, C. Fonatsch, C. Troff, W. Verbeek, A. Pekrun, W. Hiddemann, B. Wormann // Blood. – 1995. –N 86. – p. 2906-2912. 74. Haase, D. Cytogenetic analysis of CD34+ subpopulations in AML and MDS characterized by the expression of CD38 and CD117 / D. Haase, M. Feuring-Buske, C. Schafer, Schoch C, C. Troff, B. Gahn, W. Hiddemann, B. Wörmann // Leukemia. – 1997. – N 1. – p. 674-679. 101 75. Haase, D. Involvement of CD34+ Stem Cells in Malignant Transformation in AML and MDS — Genetic Analysis of Sorted Subpopulations by Classical and Molecular Cytogenetics / D. Haase, M. Feuring-Buske, C. Schoch, C. Schafer, F. Griesinder, C. Troff, B. Gahn, W. Hiddemann, B. Wormann // Hematol blood transfusion. – 1998. – N 39. – p. 19-28. 76. Hamilton-Paterson, J.L. Pre Leukaemic Anaemia / J.L. Hamilton-Paterson // Acta Haematol. - 1949. – N 52. – p. 309-316. 77. Healy, L. The stem cell antigen CD34 functions as a regulator of hemopoietic cell adhesion / L. Healy, K. Gale, F. Grosveld, M. Greaves, T. Enver // Proc Natl Acad USA. – 1995. – N 92. – p. 12240-12244. 78. Heuser, M. Loss of MLL5 results in pleiotropic hematopoietic defects, reduced neutrophil immune function, and extreme sensitivity to DNA demethylation / M. Heuser, D.B. Yap, M. Leung, T.R. de Algara, A. Tafech, S. McKinney, J. Dixon, R. Thresher, B. Colledge et al. // Blood. – 2009. – N 113. – p. 1432-1443. 79. Hofman, W.K. Myelodysplastic syndromes / W.K. Hofman, M. Lubbert, D. Phillip, H. Koeffer // The Hematology Journal. – 2004. – N 5. – p. 1-8. 80. ISCN (2005): An international system for human cytogenetic nomenclature / L.G. Shaffer, N. Tommerup // S. Karger, Basel. – 2005. – 130 p. 81. Iwata, M. Reduced expression of inducible gelatinase B/matrix metalloproteinase-9 in monocytes from patients with myelodysplastic syndrome: correlation of inducible levels with the percentage of cytogenetically marked cells and with marrow cellularity / M. Iwata, M. Pillai, A. Ramakrishnan, R.C. Hackman, H.J. Deeg, G. Opdenakker, B. Torok-Storb // Blood. – 2007. – N 109. – p. 85-92. 82. Jacobs, A. Myelodysplastic syndromes: pathogenesis, functional abnormalities, and clinical implications. / A. Jacobs // J Clin Pathol. – 1985. – N 38. – p. 1201-1217. 83. Jacobs, R.H. Prognostic implications of morphology and karyotype in primary myelodysplastic syndromes / R.H. Jacobs, M.A. Cornbleet, J.W. Vardiman, R.A. Larson, M.M. le Beau, J.D. Rowley // Blood. – 1986. – N 67. – p. 1765-1772. 84. Jaffe, E.S. WHO classification of tumours of haematopoietic and lymphoid 102 tissues / E.S. Jaffe, N.L. Harris, H. Stein, J.W. Vardiman // 3rd edn. Lyon. IARC Press. – 2001. – 352 p. 85. Jaju, R.J. Combined immunophenotyping and FISH identifies the involvement of B-cells in 5q-syndrome / R.J. Jaju, M. Jones, J. Boultwood, S. Kelly, D.Y. Mason, J.S. Wainscoat, L. Kearney // Genes Chromosomes. – 2000. – N 29. – p. 276-280. 86. Janssen, J.W. Clonal analysis of myelodysplastic syndromes: Evidence of multipotent stem cell origin / J.W. Janssen, M. Buschle, M. Layton, H.G. Drexler, J. Lyons, H. van den Berghe, H. Heimpel, B. Kubanek, E. Kleihauer, G.J. Mufti et al. // Blood. – 1989. – N 73. – p. 248-254. 87. Kere, J. Monosomy 7 in Granulocytes and Monocytes in Myelodysplastic Syndrome. / J. Kere, T. Ruutu, A. de la Chapelle // N Engl J Med. – 1987. – N 316. – p. 499-503. 88. Kiladjian, J.J. Cytolytic function and survival of natural killer cells are severely altered in myelodysplastic syndromes / J.J. Kiladjian, E. Bourgeous, I. Lobe, T. Braun, G. Visentin, J.H. Bourhis, P. Fenaux, S. Chouaib, A. Caignard // Leukemia. – 2006. – N 20. – p. 463-470. 89. Kim, M. Quantity of clonal cells detected by conventional cytogenetic analysis correlates with bone marrow blasts and survival in myelodysplastic syndrome / M. Kim, S. Chung, S.-S. Yooh, B.K. Kim, H.K. Kim, D.S. Lee // Leuk Res. – 2012. – N 36. – p. 163-168. 90. Klaus, M. Reserves, functional, immunoregulatory, and cytogenetic properties of bone marrow mesenchymal stem cells in patients with myelodysplastic syndromes / M. Klaus, E. Stavroulaki, M.-C. Kastrinaki, P. Fragioudaki, K. Giannikou, M. Psyllaki, C. Pontikoglou, D. Tsoukatou, C. Mamalaki, H.A. Papadaki // Stem Cells Develop. – 2010. - N 19. – p. 1043-1054. 91. Knospe, W.H. Smouldering acute leukaemia / W.H. Knospe, S.A. Gregory // Arch Intern Med. – 1971. – N 127. – p. 910-918. 92. Kronke, J. Biology of myelodysplastic syndrome / J. Kronke, B.L. Ebert // Hematology Education: the education program for annual congress of the EHA. – 103 2012. – N 6. – p. 237-244. 93. Lancrin, C. The haemangioblast generates hematopoietic cells through a haemogenic endothelium stage / C. Lancrin, P. Sroczynska, C. Staphenson, T. Allen, V. Kouskoff, G. Lacaud // Nature. – 2009. – N 457. – p. 892-895. 94. Langer-Safer, P.R. Immunological method for mapping genes on Drosophila polytene chromosomes / P.R. Langer-Safer, M. Levine, D.C. Ward // Proc Natl Acad Sci USA. – 1982. – N 79. – p. 4381-4385. 95. Lanza, F. Structural and functional features of the CD34 antigen: an update / F. Lanza, L. Healy, D.R. Sutherland // J Biol Regul Homeost Ag. – 2001. – N 15. – p. 1-13. 96. Le Beau, M.M. Cytogenetic and molecular delineation of a region of chromosome 7 commonly deleted in malignant myeloid diseases / M.M. le Beau, R. Espinosa, E.M. Davis, J.D. Eisenbart, R.A. Larson, E.D. Green // Blood. – 1996. – N 88. – p. 1930-1935. 97. Linder, D. Glucose-6-phosphate dehydrogenase mosaicism: utilization as a cell marker in the study of leiomyomas / D. Linder, S.M. Gartler // Science. – 1965. – N 150. – p. 67-69. 98. List, A. Lenalidomide in the myelodysplastic syndrome with chromosome 5q deletion / A. List, G. Dewald, J. Bennett, A. Giagounidis, A. Raza, E. Feldman, B. Powell, P. Greenberg, D. Thomas et al. // New Engl J Med. – 2006. – N 355. – p. 1456-1465. 99. López-Holgado, N. Analysis of hematopoietic progenitor cells in patients with myelodysplastic syndromes according to their cytogenetic abnormalities / N. López-Holgado, J.L. Arroyo, C. Pata, E. Villarón, F. Sánchez Guijo, A. Martín, J.M. Hernández Rivas, A. Orfao, J.F. San Miguel, M.C. Del Cañizo Fernández-Roldán // Leuk Res. – 2004. – N 28. – p. 1181-1187. 100. Lopez-Villar, O. Both expanded and uncultured mesenchymal stem cells from MDS patients are genomically abnormal, showing a specific genetic profile for the 5q- syndrome / O. Lopez-Villar, J.L. Garcia, F.M. Sanchez-Guijo, C. Robledo, E.M. Villaron, P. Hernandez-Campo, N. Lopez-Holqado, M. Diez-Campelo, M.V. 104 Barbado et al. // Leukemia. – 2008. – N 23. – p. 664-672. 101. Malcovati, L. Impact of the degree of anemia on the outcome of patients with myelodysplastic syndrome and its integration into the WHO classification-based Prognostic Scoring System (WPSS) / L. Malcovati, M.G. Della Porta, C. Strupp, I. Ambaglio, A. Kuendgen, K. Nachtkamp, E. Travaglino, R. Invernizzi, C. Pascutto et al. // Haematologica. – 2011. – N 96. – 1433-40. 102. Mallo, M. Fluorescence in situ hybridization improves the detection of 5q31 deletion in myelodysplastic syndromes without cytogenetic evidence of 5q- / M. Mallo, L. Arenillas, B. Espinet, M. Salido, J.M. Hernández, E. Lumbreras, M. del Rey, E. Arranz, S. Ramiro et al. // Haematologica. – 2008. – N 93. – p. 1001-1008. 103. Marsh, J.C. Recurrent graft failure following syngeneic bone marrow transplantation for aplastic anaemia / J.C. Marsh, N. Harhalakis, C. Dowding, E.C. Gordon-Smith, J.M. Hows // Bone Marrow Transplant. – 1989. – N 4. – p. 581-585. 104. Marcondes, A.M. Myeloid malignancies and marrow microenvironment: some recent studies in patients with MDS / A.M. Marcondes, A. Ramakrishman, H.J. Deeg // Curr Cancer The Rev. – 2009. – N 5. – p. 310-314. 105. Marisavljevic, D. Biological implications of circulating CD34+ cells in myelodysplastic syndromes / D. Marisavljevic, N. Kraguljac-Kurtovic // J Buon. – 2010. – N 15. – p. 753-757. 106. Michels, S.D. Therapy-related acute myeloid leukemia and myelodysplastic syndrome: a clinical and morphologic study of 65 cases / S.D. Michels, R.W. McKenna, D.C. Arthur, R.D. Brunning // Blood. – 1985. – N 65. – p. 1364-1372. 107. Millard, R.E. Further observations on patients with a chromosomal abnormality associated with polycythaemia vera / R.E. Millard, S.D. Lawler, H.E. Kay, C.B. Cameron // Br J Haematol. – 1968. – N 14. – p. 363-374. 108. Mitsiades, C.S. The role of the bone microenvironment in the pathophysiology and therapeutic management of multiple myeloma: interplay of growth factors, their receptors and stromal interactions / C.S. Mitsiades, N.S. Mitsiades, N.C. Munshi, P.G. Richardson, K.C. Anderson // Eur J Cancer. – 2006. – N 105 42. – p. 1564-1573. 109. Miura, I. Involvement of natural killer cells in patients with myelodysplastic syndrome carrying monosomy 7 revealed by the application of fluorescence in situ hybridization to cells collected by means of fluorescence-activated cell sorting / I. Miura, Y. Kobayashi, N. Takahashi, K. Saitoh, A.B. Miura // Br J Haematol. – 2000. – N 110. – p. 876-879. 110. Monreal, M.B. Increased immature hematopoietic progenitor cells CD34+/CD38dim in myelodysplasia / M.B. Monreal, M.L. Pardo, M.A. Pavlovsky, I. Fernandez, C.S. Corrado, I. Giere, S. Sapia, S. Pavlovsky // Cytometry B Clin Cytom. – 2006. – N 70. – p. 63-70. 111. Mueller, M.M. Friends and foes – bipolar effects of the tumor stroma in cancer / M.M. Mueller, N.E. Fusenig // Nature Rev Cancer. – 2004. – N 4. – p. 834849. 112. Mufti, G.J. Coexistent myelodysplasia and plasma cell neoplasia / G.J. Mufti, T.J. Hamblin, G.P. Clein, C. Race // Br J Haematol. – 1983. – N 54. – p. 91-96. 113. Muguruma, Y. Reconstitution of the functional human hematopoietic microenvironment derived from human mesenchymal stem cells in the murine bone marrow compartment / Y. Muguruma, T. Yahata, H. Miyatake, T. Sato, T. Uno, J. Itoh, S. Kato, M. Ito, T. Hotta, K. Ando // Blood. – 2006. – N 107. – p. 1878-1887. 114. Musilova, J. Chromosome study of 85 patients with myelodysplastic syndrome / J. Musilova, K. Michalova / Cancer Genet Cytogenet. – 1988. – N 33. – p. 39-50. 115. Naveiras, O. Bone marrow adipocytes as negative regulators of the hematopoietic microenvironment / O. Naveiras, V. Nardi, P.L. Wenzel, P.V. Hauschka, F. Fahey, G.Q. Daley // Nature. – 2009. – N 460. – p. 259-263. 116. Nilsson, L. Involvement and functional impairment of the CD34 +CD38Thy+ hematopoietic stem cells pool in myelodysplastic syndromes with trisomy 8 / L. Nilsson, I. Astrand-Grundstrom, K. Anderson, I. Arvidsson, P. Hokland, D. Bryder, L. Kjeldsen, B. Johansson, E. Hellström-Lindberg et al. // Blood. – 2002. – N 100. – p. 259-267. 106 117. Nilsson, L. Isolation and characterization of hematopoietic progenitor/stem cells in 5q-deleted myelodysplastic syndromes: evidence for involvement at the hematopoietic stem cell level / L. Nilsson, I. Astrand-Grundstrom, I. Arvidsson, B. Jacobsson, E. Hellstrom-Lindberg, R. Hast, SE. Jacobsen // Blood. – 2000. – N 96. – p. 2012-2021. 118. Nimer, S.D. MDS: A stem cell disorder – but what exactly is wrong with the primitive hematopoietic cells in this disease? / S.D. Nimer // Hematology ASH Education Program. – 2008. – p. 43-51. 119. Nowell, P.C. A minute chromosome in human chronic granulocytic leukemia / P.C. Nowell, D.A. Hungerford // Science. – 1960. – N 132. – p. 1497-1501. 120. Omatsu, Y. The essential functions of adipo-osteogenic progenitors as the hematopoietic stem and progenitor cell niche / Y. Omatsu, T. Sugiyama, H. Kohara, G. Kondoh, N. Fujii, K. Kohno, T. Nagasawa // Immunity. – 2010. – N 33. – p. 387-399. 121. Paget S. The distribution of secondary growths in cancer of the breast / S. Paget // The Lancet. – 1889. – N 1. – p. 571-573. 122. Pang, W.W. Hematopoietic stem cell and progenitor cell mechanisms in myelodysplastic syndromes / W.W. Pang, J.V. Pluvinagea, E.A. Price, K. Sridhar, D.A. Arber, P.L. Greenberg, S.L. Schrier, C.Y. Park, I.L. Weissman // Proc Natl Acad Sci USA. – 2013. – N 110. – p. 3011-3016. 123. Pasquali, F. Pathogenetic significance of ―pure‖ monosomy 7 in myeloproliferatie disorders. Analysis of 14 cases / F. Pasquali, P. Bernasconi, R. Casalone, M. Fraccaro, C. Bernasconi, M. Lazzarino, E. Morra, E.P. Alessandrino, M.A. Marchi, R. Sanger // Hum Genet. – 1982. – N 62. – p. 40-51. 124. Pierre, R.V. Cytogenetic studies in preleukemia: Studies before and after transition to acute leukemia in 17 subjects / R.V. Pierre // Blood Cells. – 1975. – N 1. – p. 163-170. 125. Pilo, F. The evolving clinical scenario of myelodysplastic syndrome: The need for a complete and up to date upfront diagnostic assessment / F. Pilo, A.A. di Tucci, P. Dessalvi, A. Caddori, E. Angelucci // Eur J of Int Med. – 2010. – N 2. – p. 490–495. 107 126. Pittenger, M.F. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells / M.F. Pittenger, A.M. Mackay, S.C. Beck, R.K. Jaiswal, R. Douglas, J.D. Mosca, M.A. Moorman, D.W. Simonetti, S. Craig, D.R. Marshak // Science. – 1999. – N 284. – p. 143-147. 127. Prchal, J.T. A common progenitor for myeloid and lymphoid cells / J.T. Prchal, D.W. Throckmorton, A.J. Carrol, E.W. Fuson, R.A. Gams, J.F. Prchal // Nature. – 1978. – N 274. – p. 590-591. 128. Raaijmakers, M. Bone progenitor dysfunction induces myelodysplasia and secondary leukemia / M. Raaijmakers, S. Mukherjee, S. Guo, S. Zhanq, T. Kobayashi, J.A. Schoonmaker, B.L. Ebert, F. Al-Shahrour, R.P. Hasserjian et al. // Nature. – 2010. – N 464. – p. 852-857. 129. Ramakrishman, A. The stromal component of the marrow microenvironment is not derived from the malignant clone in MDS / A. Ramakrishman, N. Awaya, E. Bryant, B. Torok-Storb // Blood. – 2006. – N 108. – p. 772-773. 130. Ramakrishnan, A. A novel role for the marrow microenvironment in initiating and sustaining hematopoietic disease / A. Ramakrishnan, H.J. Deeg // Expert Opin Biol Ther. – 2009. – N 9. – p. 21-28. 131. Raskind, W.H. Evidence for a multistep pathogenesis of a myelodysplastic syndrome / W.H. Raskind, N. Tirumali, R. Jacobson, J. Singer, P.J. Fialkow // Blood. – 1984. – N 63. – p. 1318-1323. 132. Rhoads, C.P. Refractory anemia: analysis of 100 cases / C.P. Rhoads, W.H. Barker // JAMA. – 1938. – N 110. – p. 794-796. 133. Rigolin, G.M. Clinical importance of interphase cytogenetics detecting occult chromosome lesions in myelodysplastic syndromes with normal karyotype / G.M. Rigolin, R. Bigoni, R. Milani, F. Cavazzini, M.G. Roberti, A. Bardi, P. Agostini, M. Della Porta, A. Tieghi // Leukemia. – 2001. – N 15. – p. 1841-1847. 134. Rowley, J.D. Nonrandom chromosome abnormalities in acute leukemic and dysmyelopoietic syndromes in patients with previously treated malignant disease / J.D. Rowley, H.M. Golomb, J.W. Vardiman // Blood. – 1981. – N 58. – p. 759-67. 108 135. Saitoh, K. Fluorescence in situ hybridization of progenitor cells obtained by fluorescence-activated cell sorting for the detection of cells affected by chromosome abnormality trisomy 8 in patients with myelodysplastic syndromes / K. Saitoh, I. Miura, N. Takahashi, A.B. Miura // Blood. – 1998. – N 92. – p. 2886-2892. 136. Schanz, J. New comprehensive cytogenetic scoring system for primary myelodysplastic syndromes (MDS) and oligoblastic acute myeloid leukemia after MDS derived from an international database merge / J. Schanz, H. Tu chler, F. Sol e, M. Mallo, E. Luño, J. Cervera, I. Granada, B. Hildebrandt, M.L. Slovak et al. // J Clin Oncol. – 2012. – N 30. – p. 820-829. 137. Schroeder, T.M. Functional impairment and decreased osteogeneic differentiation capacity of mesenchymal stromal cells (MSC) from patients with myelodysplastic syndromes (MDS) result in insufficient stromal support for CD34 Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPC) / T.M. Schroeder, S. Geyh, R.-P. Cadeddu, J. Frobel, S. Arends, A.-N. Hunerliturkoglu, A. Kundgen, D. Hemsen, R. Fenk et al. // Onkologie. – 2012. – N 35. –– p. 16-17. 138. Seabright, M. Rapid banding technique for human chromosomes / M. Seabright // The Lancet. – 1971. – N 2. – p. 971-972. 139. Second International Workshop on Chromosomes in Leukemia: Chromosomes in preleukemia. Cancer Genet Cytogenet . – 1979. – N 2. – p. 108-113. 140. Sloand, E.M. Preferential suppression of trisomy 8 compared with normal hematopoietic cell growth by autologous lymphocytes in patients with trisomy 8 myelodysplastic syndrome / E.M. Sloand, L. Mainwaring, M. Fuhrer, S. Ramkissoon, A.M. Risitano, K. Keyvanafar, J. Lu, A. Basu, A.J. Barrett, N.S. Young // Blood. – 2005. – N 106. – p. 841-51. 141. Sloand, E.M. CD34 cells from patients with trisomy 8 myelodysplastic syndrome (MDS) express early apoptotic markers but avoid programmed cell death by up- regulation of antiapoptotic proteins / E.M. Sloand, L. Pfanes, G. Chen, S. Shah, E.E. Solomou, J. Barrett, N.S. Young // Blood. – 2007. – N 109. – p. 2399-2405. 142. Soenen-Cornu, V. Mesenchymal cells generated from patients with myelodysplastic syndromes are devoid of chromosomal clonal markers and support 109 short - and long-term hematopoiesis in vitro / V. Soenen-Cornu, C. Tourino, M.L. Bonnet, M. Guillier, S. Flamant, R. Kotb, A. Bernheim, J.H. Bourhis, C. Preudhomme, P. Fenaux, A.G. Turhan // Oncogene. – 2005. – N 24. – p. 2441-2448. 143. Song, L.-X. Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Myelodysplastic Syndromes: Cytogenetic Characterization / L.-X. Song, J. Guo, Q. He, L.-P. Yang, Sh.-Ch. Gu, X. Zhang, L.-Y. Wu, X. Li, Ch.-K. Chang // Acta Haematol. – 2012. – N 128. – p. 170–177. 144. Steensma, D.P. Historical perspectives on myelodysplastic syndromes / D.P. Steensma // Leuk Res. – 2012. – N 36. – p. 1441–1452. 145. Stier, S. Osteopontin is a hematopoietic stem cell niche component that negatively regulates stem cell pool size / S. Stier, Y. Ko, R. Forkert, C. Lutz, T. Neuhaus, E. Grunewald, T. Cheng, D. Dombkowski, L.M. Calvi, S.R. Rittling, D.T. Scadden // J Exp Med. – 2005. – N 201. – p. 1781-1791. 146. Swerdlow, S.H. WHO Classification of tumors of haematopoietic and lymphoid tissues / S.H. Swerdlow, E. Campo, N.L. Harris, E.S. Jaffe, S.A. Pileri, H. Stein, J. Thiele, J.W. Vardiman // 4th edn, Lyon: IARC Press. – 2008. – 439 p. 147. Suciu, S. Results of chromosome studies and their relation to morphology, course, and prognosis in 120 patients with de novo myelodysplastic syndrome / S. Suciu, R. Kuse, H.J. Weh, D.K. Hossfeld // Cancer Genet Cytogenet. – 1990. – N 4. – p. 15-26. 148. Sugiyama, T. Maintenance of the hematopoietic stem cell pool by CXCL12-CXCR4 chemokine signaling in bone marrow stromal cell niches / T. Sugiyama, H. Kohara, M. Noda, T. Nagasawa // Immunity. – 2006. – N 25. – p. 977988. 149. Sullivan, S.A. Circulating CD34+ cells: an adverse prognostic factor in the myelodysplastic syndromes / S.A. Sullivan, K.A. Marsden, R.M. Lowenthal, D.M. Jupe, M.E. Jones // Am J Hematol. – 1992. – N 39. – p. 96–101. 150. Taichman, R.S. Human osteoblasts support human hematopoietic progenitor cells in vitro bone marrow cultures / R.S. Taichman, M.J. Reilly, S.G. Emerson // Blood. – 1996. – N 87. – p. 518-524. 110 151. Tehranchi, R. Persistent malignant stem cells in del(5q) myelodysplasia in remission / R. Tehranchi, P.S. Woll, K. Andreson, N. Buza-Vidas, T. Mizukami, A.J. Mead, I. Astrand-Grundstrom, B. Strombeck, A. Horvat, H. Ferry et al. // N Engl J Med. – 2010. – N 363. – p. 1025-1037. 152. Tjio, J.H. The chromosome number of man / J.H. Tjio, A. Levan // Hereditas. – 1956. – N 42. – p. 1-6. 153. Tomonaga, M. Sequential karoyotypic evolutions and bone marrow aplasia preceding acute myelomonocytic transformation from myelodysplastic syndrome / M. Tomonaga, Y. Tomonaga, M. Kusano, M. Ichimaru // Br J Haematol. – 1984. – N 58. – p. 53-60. 154. Tricot, G. The myelodysplastic syndromes: different evolution patterns based on sequential morphological and cytogenetic investigations / G. Tricot, M.A. Boogaerts, C. de Wolf-Peeters, H. van den Berghe, R.L. Verwilghen // Br J Haematol. – 1985. – N 59. – p. 659-670. 155. Trost, D. Molecular cytogenetic profiling of complex karyotypes in primary myelodysplastic syndromes and acute myeloid leukemia / D. Trost, B. Hildebrandt, M. Beier, N. Müller, U. Germing, B. Royer-Pokora // Cancer Genet Cytogenet. – 2006. – N 165. – p. 51–63. 156. Van den Berghe, H. The 5q– Anomaly / H. van den Berghe, K. Vermaelen, C. Mecucci, D. Barbieri, G. Tricot // Cancer Genet Cytogenet. – 1985. – N 17. – p. 189-255. 157. Van Epps, D.E. Harvesting, characterization, and culture of CD34+ cells from human bone marrow, peripheral blood, and cord blood / D.E. van Epps, J. Bender, W. Lee, M. Schilling, A. Smith, S. Smith, K. Unverzagt, P. Law, J. Burgess // Blood cells. – 1994. – N 20. – p. 411-423. 158. Varga, G. Inappropriate Notch activity and limited mesenchymal stem cell plasticity in the bone marrow of patients with myelodysplastic syndromes / G. Varga, J. Kiss, J. Varkonyj, V. Vas, P. Paloczi, F. Uher // Pathol Oncol Res. – 2007. – N 13. – p. 311-319. 159. Vehmeyer, K. Increased peripheral stem cell pool in MDS: an indication of 111 disease progression? / K. Vehmeyer, D. Haase, F. Alves // Leuk Res. – 2001. – N 25. – p. 955–959. 160. Walkley, C.R. A microenvironment-induced myeloproliferative syndrome caused by retinoic acid receptor gamma deficiency / C.R. Walkley, G.H. Olsen, S. Dworkin, S.A. Fabb, J. Swann, G.A. McArthur, S.V. Westmoreland, P. Chambon, D.T. Scadden, L.E. Purton // Cell. – 2007. – N 129 – p. 1097–1110. 161. Waller, E.K. The ‗common stem cell‘ hypothesis reevaluated: human fetal bone marrow contains separate populations of hematopoietic and stromal progenitors / E.K. Waller, J. Olweus, F. Lund-Johansen, S. Huang, M. Nguyen, G.R. Guo, L. Terstappen // Blood. – 1995. – N 85. – p. 2422–2435. 162. Warlick, E.D. Myelodysplastic Syndromes: Review of Pathophysiology and Current Novel Treatment Approaches / E.D. Warlick, B.D. Smith // Curr Canc Drug Targ. – 2007. – N 7. – p. 541-558. 163. Watt, F.M. Out of eden: Stem cell and their niches / F.M. Watt, B.L. Hogan // Science. – 2000. – N 287. – p. 1427-1430. 164. Werner, M. Chromosome analysis in patients with myelodysplastic syndrome: correlation with bone marrow histopathology and prognosis significance / M. Werner, H. Maschek, V. Kaloutsi, H. Chritz, A. Georgii // Virchows Arch A Pathol Anat Histopathol. – 1992. – N 421. – p. 47-52. 165. Westers, T.M. Standardization of flow cytometry in myelodysplastic syndromes: a report from an International Consortium and the European Leukemia Net Working Group / T.M. Westers, R. Ireland, W. Kern, C. Alhan, J.S. Balleisen, P. Bettelheim, K. Burbury, M. Cullen, J.A. Cutler, M.G. Della Porta et al.// Leukemia. – 2012. – N 26. – p. 1730- 1741. 166. White, N.J. Deletion of chromosome 20q in myelodysplasia can occur in a multipotent precursor of both myeloid cells and B cells / N.J. White, E. Nacheva, F.A. Asimakopoulos, D. Bloxham, B. Paul, A.R. Green // Blood. – 1994. – N 83. – p. 28092816. 167. Will, B. Stem and progenitor cells in myelodysplastic syndromes show aberrant stage-specific expansion and harbor genetic and epigenetic alterarions / B. 112 Will, L. Zhou, T.O. Vogler, S. Ben-Neriah, C. Schinke, R. Tamari, Y. Yu, T.D. Bhagat, S. Bhattacharyya et al. // Blood. – 2012. – N 120. – p. 2076-2086. 168. Yunis, J.J. Refined chromosome analysis as an independent prognostic indicator in de novo myelodysplastic syndromes / J.J. Yunis, R.E. Rydell, M.M. Oken, M.A. Arnesen, M.G. Mayer, M. Lobell // Blood. – 1986. – N 67. – p. 1721-1730. 169. Zhang, Z.X. Cytogenetic analysis of human bone marrow derived mesenchymal stem cells passaged in vitro / Z.X. Zhang, LX. Guan, K. Zhang, S. Wang, P.C. Cao, Y.H. Wang, Z. Wang, L.J. Dai // Cell Biol Int. – 2007. – N 31. – p. 645-648. 113 Приложение 1 Таблица 20 Результаты цитогенетических исследований общей популяции клеток костного мозга и МСК № Пол, пациен- возраст та Клетки костного мозга МСК Диагноз Кариотип Маркер FISH (%) № пассажа МСК 46,ХY[20] 46,ХY,-7,inv(9) (p13q21), i(17)(9q10), +22[19]/ 46,ХY, inv(9)(p13q21)[1] 2 46,ХY[20] -7(80%) 5 46,ХY, inv(9)(p13q21)[20] -7(0%) 4 46,ХХ[20] del(5q)(0%) 4 46,ХY[20] - н/м 5 46,ХХ[20] -7(0%) - н/м - 001 М, 74 МДС: РАИБ-2 002 М, 33 МДС: РАИБ-2 003 Ж, 49 МДС: 5q- 004 М, 63 005 Ж, 57 del(5q)(75%) нет, IgH (14q34)(0%) МДС: РАИБ-2 del(5q)(90%) -7(90%) МДС: РА 45,ХХ,del(5)(q31;q35),-7[20] 006 Ж, 61 МДС: РЦМД 45,ХХ,-7[17]/46,ХХ[3] 007 Ж, 53 МДС: РА 46,ХХ[20] 008 М, 57 МДС: РЦМД 46,ХY[20] 46,ХХ[20] 46,ХY,i(14)(q10)[7]/ 46,ХY[13] -7(60%) нет, -5/del(5q), -7/del(7q), +8 (0%) нет, -5/del(5q), -7/del(7q), +8 (0%) Кариотип Маркер FISH (%) 114 009 М, 63 МДС: РАИБ-2 46,ХY,inv(9)(p13q21)[20] 010 М, 60 МДС: РАИБ-1 46,ХY[20] 011 Ж, 64 МДС: РАИБ-2 46,ХХ[20] 012 Ж, 67 МДС: РАИБ-2 013 Ж, 55 МДС: 5q- 014 Ж, 60 МДС: РЦМД 015 М, 42 МДС: РАИБ-1 016 М, 58 017 М, 60 МДС: РЦМД МДС: РЦМД н/м 46,ХХ,del5(q15q33)[11]/ 46,ХХ[9] н/м 51,ХY,+Y,+3,+6,+8, del(9) (q13),+del(9) (q13)[19]/46,ХY[1] 45-46,ХY,-?5,-13,der(19), add(q13?or p13?),-20,+mar х2,+mar?del(13q21)[15]/ 45-46,ХY idem,+dmin[2]/ 46,ХY[3] 46,ХY[20] 3 46,ХY,t(2;22) (p10;q11), inv(9)(p13q21)[1]/ 46,ХY,inv(9)(p13q21) [19] 2 46,ХY[7] 3 46,ХХ[20] 3 46,ХХ[20] del(5q)(0%) del(7q)(0%) del(5q)(85%) 2 46,ХХ[20] del(5q)(0%) +8(67%) - н/м +Y(77%) +8(76%) 3 46,ХY[20] +Y(0%) del(5q)(74%) -20(70%) 2 46,ХY,add(2q)[7]/ 46,ХY[13] del(5q)(0%) 2 46,ХY[20] нет, -5/del(5q), -7/del(7q), +8 (0%) нет, -5/del(5q), -7/del(7q), +8 (0%) нет,-5/del(5q), -7/del(7q), +8 (0%) del(5q)(84%) del(7q)(84%) нет, -5/del(5q), -7/del(7q), +8 (0%) 115 018 Ж, 29 МДС: РЦМД 46,ХХ[20] 019 М, 73 МДС: РАКС 46,ХY[20] 020 М, 77 МДС: РАИБ-1 021 М, 56 МДС: РЦМД 46,ХY[20] 022 Ж, 61 МДС: РЦМД 46,ХХ,inv(3)(q21;q26)[11] 023 Ж, 51 МДС: РЦМД 46,ХХ[20] 024 Ж, 44 МДС: РЦМД 46,ХХ [20] 025 Ж, 37 МДС: РАКС 46,ХХ[20] 026 Ж, 71 МДС: РЦМД 46,ХХ[20] 027 М, 43 МДС: РАКС 46,ХY[20] н/м нет, -5/del(5q), -7/del(7q), +8 (0%) нет, -5/del(5q), -7/del(7q), +8 (0%) нет, -5/del(5q), -7/del(7q), +8 (0%) 2 46,ХХ[20] 2 46,ХY[20] - н/м 2 46,XY[20] inv(3)(45%) нет, -5/del(5q), -7/del(7q), +8 (0%) нет, -5/del(5q), -7/del(7q), +8 (0%) нет, -5/del(5q), -7/del(7q), +8 (0%) нет, -5/del(5q), -7/del(7q), +8 (0%) нет, -5/del(5q), -7/del(7q), +8 (0%) 2 46,ХХ[20] inv(3)(0%) 2 46,ХХ[20] - н/м - н/м - н/м 2 46,ХY[20] 116 del(5q)(80%) +21(52%) - del(5q)(27%) - МДС: РАИБ-1 46,ХY,del(5)(q15q33)[10]/ 46,ХY[10] 46,ХY,del(5)(q15q33)[7]/ 46,ХY[11] 46,ХX,del(5)(q15q33)[3]/ 46,ХX[6] del(5q)(76%) - н/р МДС: РАИБ-2 45,ХХ,-7[18]/46,ХХ[2] -7(67%) -7(23%) +Х(20%) - н/р 2 46,ХX[7] -7(0%) +Х(4%) +8(19%) нет, -5/del(5q), -7/del(7q), +8 (0%) нет, -5/del(5q), -7/del(7q), +8 (0%) 2 46,ХX[20] 2 46,ХY[20] 2 46,ХX[7] 46,ХY[20] -7(45%) - н/р нет, -5/del(5q), -7/del(7q), +8 (0%) 2 46,ХY[20] - н/м 3 46,ХХ[20] 028 М, 48 МДС: РЦМД 029 М, 62 МДС: 5q- 030 Ж, 52 031 Ж, 73 032 Ж, 48 МДС: РАИБ-1 45,ХХ,-7[5]/ 47,ХХХ[9]/46,ХХ[6] 033 Ж, 38 МДС: РАИБ-2 46,ХX[20] 034 М, 64 МДС: РЦМД 46,ХY[20] 035 Ж, 53 МДС: РЦМД 46,ХX[20] 036 М, 63 в-МДС: РАИБ-2 037 М, 19 ОМЛ 45,ХY,-7[18]/46ХY[2] 038 М, 77 ОМЛ 46,ХY[20] 039 Ж, 58 ОМЛ 46,ХХ[20] 117 040 М, 76 ОМЛ 041 Ж, 64 в-ОМЛ 042 Ж, 66 ОМЛ 043 Ж, 59 ОМЛ 46,ХY[20] 47,ХХ,del(9)(q22),del(12) (p13),-?21,+mar, del(21)(?q11) +mar[5]/ 46,ХХ[15] 46-47,ХХ,der(3),?-5 or ?del(5)(q13q33),?der(7) or ?del(7)(22),del(p10) (q22), der(12)add (q24), -?17 or ?der(17) add(p11) or ?t(7;17) (p10q10),+mar1-2[20] н/м del(5q)(67%) 3 46,ХY[20] del(5q)(0%) +21(25%) - н/м +21(0%) * 2 46,ХХ[20] нет, -5/del(5q), -7/del(7q), +8 (0%) - н/р Примечание: М – мужчина, Ж – женщина, МДС - миелодиспластический синдром, МСК – мезенхимальные стромальные клетки, РА – рефрактерная анемия, РАИБ – рефрактерная анемия с избытком бластов, РЦМД – рефрактерная цитопения с мультилинейной дисплазией, вМДС – вторичный МДС, ОМЛ - острый миелоидный лейкоз, в-ОМЛ – вторичный ОМЛ, н/м – нет митозов, н/р – нет роста, - не исследовали 118 Таблица 21 Характеристика лабораторных показателей пациентов с МДС. Распределение по группам риска в соответствии с критериями шкал IPSS, WPSS и IPSS-R № п-та 001 002 003 004 005 006 007 008 009 010 011 012 013 014 015 016 017 018 019 020 021 022 Гем (г/л) 77 72 84 103 84 93 71 119 120 94 67 70 75 61 85 59 68 138 92 92 111 88 Л АЧН Тр 9 (х10 /л) (х109/л)(х109/л) 7,7 4,8 134 2,1 0,3 6 4,2 2,9 496 6,6 4,0 90 3,4 0,9 309 2,7 0,4 44 2,5 1,0 10 3,5 1,8 46 3,1 1,5 130 2,7 0,1 55 3,9 1,6 61 2,0 0,7 62 2,6 1,6 266 2,5 2,0 150 2,2 0,2 25 5,8 3,5 55 5,5 4,2 405 5,1 3,4 50 7,6 5,0 475 5,8 3,1 68 2,7 1,2 84 5,3 4,4 130 БК ТЗ КМ(%) 19,0 Да 12,0 Да 4,9 Нет 14,8 Нет 4,9 Нет 0,4 Да 2,4 Да 0,4 Нет 19,0 Да 9,0 Да 17,0 Да 11,0 Да 3,6 Да 4,9 Да 5,3 Да 1,4 Да 0,0 Да 2,8 Нет 2,0 Нет 8,5 Нет 4,6 Нет 1,0 Нет IPSS (баллы) WPSS (баллы) Промежуточный-2(1,5) Высокий (4) Высокий(3) Очень высокий (6) Низкий (0) Очень низкий (0) Промежуточный-2 (2) Высокий (4) Промежуточный-2(1,5) Промежуточный (2) Промежуточный-2(1,5) Высокий (4) Промежуточный-1(0,5) Низкий (1) Низкий (0) Низкий (1) Промежуточный-2(1,5) Высокий (4) Промежуточный-1(1) Высокий (3) Промежуточный-2(2) Высокий (4) Высокий (3) Очень высокий (6) Низкий (0) Низкий (1) Промежуточный-1(0,5) Высокий (3) Промежуточный-2(2) Очень высокий (5) Промежуточный-2(1,5) Высокий (4) Низкий (0) Промежуточный (2) Низкий (0) Низкий (1) Низкий (0) Очень низкий (0) Низкий (0) Низкий (1) Промежуточный-1(0,5) Промежуточный (2) IPPS-R (баллы) Высокий (5,5) Очень высокий (9) Низкий (3) Высокий (5,5) Промежуточный (5) Высокий (5,5) Промежуточный(4,5) Низкий (2) Промежуточный (4) Высокий (5) Высокий (6) Очень высокий (8,5) Промежуточный (3,5) Промежуточный (4,5) Очень высокий (8,5) Высокий (6) Низкий (2,5) Низкий (2,5) Низкий (2) Низкий (2,5) Промежуточный (4) 119 023 024 025 026 027 028 029 030 031 032 033 034 035 036 89 69 98 71 85 94 89 62 88 102 90 63 80 92 6,0 4,5 2,3 2,9 3,7 6,0 3,3 3,8 3,0 2,8 2,2 2,2 2,7 3,3 3,8 2,7 0,9 2,0 2,0 4,5 0,8 2,4 1,7 2,0 0,4 1,7 0,8 1,5 330 16 168 207 170 710 604 34 79 47 37 44 56 40 2,4 4,0 0,4 0,8 0,0 3,2 4,9 6,0 12,4 7,0 18,2 3,6 1,2 11,4 Нет Да Нет Да Нет Нет Да Да Да Нет Да Да Да Нет Низкий (0) Низкий (1) Промежуточный-1(0,5) Промежуточный (2) Промежуточный-1(0,5) Очень низкий (0) Низкий (0) Промежуточный (2) Низкий (0) Очень низкий (0) Низкий (0) Низкий (1) Промежуточный-1(0,5) Низкий (1) Промежуточный-1(1) Высокий (3) Высокий (3) Очень высокий (6) Промежуточный-2(1,5) Высокий (4) Высокий (2,5) Очень высокий (5) Промежуточный-1(0,5) Промежуточный (2) Промежуточный-1(0.5) Промежуточный (2) - Низкий (3) Промежуточный (4,5) Низкий (2) Низкий (2,5) Низкий (2) Низкий (3) Низкий (3) Высокий (5,5) Очень высокий (7,5) Высокий (6) Очень высокий (7,5) Промежуточный (4,5) Низкий (2,5) - Примечание: Гем – гемоглобин; Л – лейкоциты; АЧН – абсолютное число нейтрофилов; Тр – тромбоциты; БК – бластные клетки; КМ – костный мозг; ТЗ – трансфузионная зависимость.
