токсичность КФ

ПРИМЕНЕНИЕ
КЛЕТОЧНЫХ
ТЕХНОЛОГИЙ В СЕЛЕКЦИИ РАСТЕНИЙ
Калашникова Е.А. – доктор биологических наук
профессор кафедры генетики
и биотехнологии РГАУ-МСХА
имени К.А. Тимирязева
1
Современная биотехнология - наука о
генно-инженерых и клеточных методах и
технологиях создания и использования
генетически
трансформированных
(модифицированных) растений, животных,
микроорганизмов и вирусов в целях
интенсификации производства и получения
новых
видов
продуктов
различного
назначения.
2
НАПРАВЛЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ ПО
КЛЕТОЧНОЙ БИОТЕХНОЛОГИИ РАСТЕНИЙ
1 - ПОЛУЧЕНИЕ ВЕЩЕСТВ ВТОРИЧНОГО
СИНТЕЗА;
2 - РАЗМНОЖЕНИЕ И ОЗДОРОВЛЕНИЕ
ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА;
3 - В СЕЛЕКЦИИ РАСТЕНИЙ;
3
МЕТОДЫ КУЛЬТУРЫ ТКАНИ В СЕЛЕКЦИИ
ОСНОВНЫЕ
1 - КЛЕТОЧНАЯ И ТКАНЕВАЯ
СЕЛЕКЦИЯ;
2 - СОМАТИЧЕСКАЯ ГИБРИДИЗАЦИЯ;
3 - СОЗДАНИЕ ТРАНСГЕННЫХ
РАСТЕНИЙ
ВСПОМОГАТЕЛЬНЫЕ
1 - ОПЛОДОТВОРЕНИЕ В
УСЛОВИЯХ IN VITRO;
2 - КУЛЬТУРА ИЗОЛИРОВАННЫХ ЗАРОДЫШЕЙ;
3 - КЛОНАЛЬНОЕ МИКРОРАЗМНОЖЕНИЕ ЦЕННЫХ
ГИБРИДОВ;
4 - ПОЛУЧЕНИЕ ГАПЛОИДНЫХ
РАСТЕНИЙ;
5 - КРИОСОХРАНЕНИЕ
4
Оплодотворение in vitro
Причины несовместимости:
физиологические
(несоответствие
во
времени
созревания пыльцы и т. д.);
морфологические (короткая пыльцевая трубка или
блокирование ее роста на разных этапах развития
и т. д.).
Способы:
а) культивирование на искусственной агаризованной
питательной среде завязи с нанесенной на нее
готовой пыльцой;
б) завязь вскрывается и на питательную среду
переносятся кусочки плаценты с семяпочками,
вблизи которых или непосредственно на ткани
плаценты культивируется готовая пыльца.
5
КУЛЬТУРА ИЗОЛИРОВАННЫХ ЗАРОДЫШЕЙ преодоление постгамной несовместимости растений.
Постгамная несовместимость при отдаленной
гибридизации возникает после оплодотворения.
Часто при этом образуются щуплые невсхожие
семена. Причиной может быть расхождение во
времени развития зародыша и эндосперма. Из-за
слабого развития эндосперма зародыш бывает
неспособен к нормальному прорастанию. В
таких случаях из зрелой щуплой зерновки
изолируют зародыш и выращивают его в
питательной среде.
6
Культура изолированных зародышей
Зародыш
Каллусная ткань
П Проросток ПП Адвентивные почки
Различные сегменты:
гипокотиель, корень,
семядольные листья,
меристема
Адвентивные почки
РАСТЕНИЯ-РЕГЕНЕРАНТЫ
7
Получение растений – регенерантов
кабачка при использовании метода
эмбриокультуры
8
Технологическая схема размножения и сохранения ценных
генотипов хвойных растений с применением эмбриокультуры
(Е.А. Калашникова, 1989)
Изолированные зародыши
Формирование микропобегов
Образование адвентивных почек
Укоренение микропобегов
9
Искусственное
микоризообразование на корнях
пробирочных растений ели
обыкновенной в условиях in vitro
10
11
Получение гаплоидных
растений in vitro
12
Исходное растение
андрогенез
Изолированные
пыльники
и микроспоры
Индукция прямого
эмбриогенеза
гиногенез
партеногенез
Изолированные
завязи
и семяпочки
Изолированные
зародыши
Индукция каллусной ткани
Растения-регенеранты
13
Факторы, влияющие на
эмбриогенез в культуре
изолированных пыльников
•
•
•
•
Генетические;
Физиологические;
Предобработка соцветий;
Состав питательной среды (минеральный и
гормональный состав и др.);
• Условия культивирования.
14
Содержание микроспор, находящихся на разных стадиях развития в
пыльнике в зависимости от места расположения бутона в главном и
боковых соцветиях растения рапса (гибрид WF Титан)
Место
расположения
бутона в соцветии,
см
1и2
стадии
3-6
стадии
7-9
стадии
Центр бутона
82,3 6,5
3,1 0,8
0
1-2 ряд
22,4 0,5
75,1 1,1
0
3-4 ряд
10,1 1,6
87,5 1,5
0
5-6 ряд
0
10,4 2,1
80,7 4,1
> 6 ряда
0
0
98,8 2,5
15
16
Прямая регенерация соматических эмбриоидов
на изолированных пыльниках яровой пшеницы
(Беккужина, 1993)
17
Асинхронное формирование эмбриоидов: 1 –
глобулярная стадия, 2 – сердцевидная стадия, 3 –
стадия торпедо, 4 - проросток
1
2
3
4
18
19
Гаплоидные растения рапса, адаптированные к
почвенным условиям:
а – на 14 сутки, б – через 5 месяцев
а
б
20
Обработка растений-регенерантов рапса
раствором колхицина
21
А
Б
Число хлоропластов в замыкающих клетках устьиц
А – гаплоидное растение Б – диплоидное растение
А
Б
Число хромосом в клетках меристемы корня
А – гаплоидное растение Б – диплоидное растение
22
Соцветия рапса: а – гаплоидные растения без
обработки колхицином,
б – гаплоидные растения рапса после
обработки колхицином.
а
б
23
Схема получения растений-регенерантов из
изолированных семяпочек белокочанной капусты
24
І цикл селекции
ІІ цикл селекции
ІІІ цикл селекции
Пыльники
Пыльники
Пыльники
АБК+, NaCl+
АБК+, NaCl+
АБК+, NaCl+
Эмбриоиды
Эмбриоиды
Эмбриоиды
Микроклональное
размножение
NaCl+
Регенерация
растений
Семенное
поколение R0
Регенерация
растений
Микроклональное
размножение
Семенное
поколение R1
Регенерация
растений
Семенное
поколение R2
Тестирование
Схема селекции пшеницы на уровне репродуктивных клеток
25
Криосохранение растений
Цель данной технологии - сохранение в культуре in
vitro генофонда и обеспечение селекционеров в
любое время генотипом, имеющим искомые
признаки:
1) необходимая пыльца для проведения гибридизации;
2) уникальные и единичные семена, в том числе не
выносящие обезвоживания;
3) трансформированные, мутантные, гибридные клетки
разных видов растений, способных к морфогенезу in
vitro;
4) зиготические и соматические зародыши и т. д.
26
Криосохранение (-1960 С) ценных сортов декоративных и
сельскохозяйственных растений (по данным Попова А.С., 2004)
27
Этапы криосохранения:
1 – подготовка растительной ткани к замораживанию
(культивирование
на
питательных
средах
с
криопротектором: диметилсульфоксид (ДМСО, 5—10%),
глицерин
(10—20%),
а
также
непроникающие
высокомолекулярные — поливинилпиролидон (ПВП),
декстран, полиэтиленгликоль (ПЭГ) с молекулярной массой
6000), медленное замораживание;
2 – хранение в жидком азоте (-1960);
3 – размораживание ( на водяной бане)
28
Программный замораживатель
29
Металлические дюары с жидким азотом, где хранится
растительный материал
30
Основные методы клеточной
инженерии растений
31
СОМАТИЧЕСКАЯ ГИБРИДИЗАЦИЯ создание
неполовых
гибридов
путем
слияния
изолированных
протопластов,
полученных из соматических клеток.
Изолированные протопласты,
полученные из семядольной
хвои сосны обыкновенной
32
Схема получения и
культивирования
протопластов
33
КЛЕТОЧНАЯ СЕЛЕКЦИЯ РАСТЕНИЙ – метод
выделения
генетически
модифицированных
мутантных клеток и сомаклональных вариаций с
помощью селектиыных условий.
Для проведения клеточной селекции используют следующие
приемы:
— прямая (позитивная) селекция, при которой выживает лишь
определенный искомый мутантный тип клеток;
— непрямая (негативная) селекция, основанная на избирательной
гибели неустойчивых делящихся клеток, но требующая
дополнительной идентификации у них мутационных изменений;
— тотальная селекция, при которой индивидуально тестируются
все клеточные клоны;
— визуальная селекция и неселективный отбор, когда вариантная
линия может быть идентифицирована среди всей популяции
клеток визуально или при использовании биохимических методов
(тонкослойная или жидкостная хроматография, радиоиммунный
анализ, микроспектрофотометрия и др.).
34
Создание форм растений, устойчивых к
биотическим и абиотическим факторам
окружающей среды
генная инженерия
1-идентификация и клонирование
генов;
2-создание банка генов;
3-расшифровка механизмов полигенной детерминации признаков
и свойств биологических объектов;
4-создание надежных векторных
систем;
5-высокая экспрессия генов.
клеточная инженерия
1-недостаточно высокая частота
регенерации клеток;
2-узкий спектр сомаклональной
вариабельности;
3-слабая экспрессия генов, контролирующих важные хозяйственно-ценные признаки 35
ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ ПРИ
КЛЕТОЧНОЙ СЕЛЕКЦИИ
КАЛЛУСНАЯ
ТКАНЬ
СУСПЕНЗИОННАЯ
КУЛЬТУРА
1- Медленный рост ткани
2- Неравноценное действие
токсических веществ
3- Потеря регенерационной
способности при длительном культивировании
ИЗОЛИРОВАННЫЕ
ПРОТОПЛАСТЫ
Низкая частота регенерации одиночных
клеток или ее полное отсутствие
36
ПЕРВИЧНЫЙ ЭКСПЛАНТ
СУСПЕНЗИЯ
ЧИСТАЯ КУЛЬТУРА
ПАТОГЕНА
КАЛЛУС
ПОЛУЧЕНИЕ КУЛЬТУРАЛЬНОГО
ФИЛЬТРАТА (КФ) ПАТОГЕНА
КУЛЬТИВИРОВАНИЕ
КЛЕТОК И ТКАНЕЙ НА
СЕЛЕКТИВНЫХ СРЕДАХ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОРОГОВЫХ
КОНЦЕНТРАЦИЙ КФ НА
КАЛЛУСНЫХ И СУСПЕНЗИОННЫХ КУЛЬТУРАХ
ОТБОР УСТОЙЧИВЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ
РАЗМНОЖЕНИЕ УСТОЙЧИВЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ
РЕГЕНЕРАЦИЯ РАСТЕНИЙ ИЗ УСТОЙЧИВЫХ КЛЕТОК
37
Селективные факторы
Совместное
культивированке
каллусных клеток
с фитопатогненом
Присутствие в
питательной среде
фитотоксинов
Присутствие в
питательной среде
культурального
фильтрата
патогена
38
Неморфогенный каллус
пшеницы
Морфогенный каллус
пшеницы
39
Каллусогенез и
морфогенез
первичных эксплантов
моркови
Зависимость
каллусогенеза
и морфогенеза
пшеницы от
концентрации 2,4-Д
40
Среда Чапека
Среда
Мурасига-Скуга
41
60
Мурасига-Скуга
50
Чапека
токсичность КФ, %
токсичность КФ, %
70
40
30
20
10
0
9
14
19
23
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
30
среда Чапека
среда Мурасига-Скуга
5
10 20 30 40 50 60 70
дни наблюдений
возраст КФ, дни
Токсичность КФ, полученного при
культивировании патогена A. radicina на разных
питательных средах
Токсичность КФ, полученного при
культивировании патогена R. solani на разных
питательных средах
токсичность,%
120
100
80
7 дней
11 дней
14 дней
60
40
20
0
0
25
50
75
концентрация КФ,%
Зависимость токсичности КФ от его концентрации и времени
выращивания гриба S. nodorum в жидкой питательной среде
42
контроль
7
среда Чапека
среда Мурасига-Скуга
Ростовой индекс, Ri
6
5
4
3
2
1
0
0
10%
20%
30%
40%
50%
Концентрация КФ, %
Ростовой индекс суспензионной культуры моркови, культивируемой на
средах с различной концентрацией КФ патогена
43
140
3
ростовой инднкс
3,5
120
100
80
60
40
0
2,5
2
1,5
1
0,5
20
I
II
III
IV
контроль
10% КФ
20% КФ
0
V
0
№ пассажа
30%
40%
50%
концентрация КФ, %
30% КФ
контроль
жизнеспособность, %
ростовой индекс
160
I пассаж
IV пассаж
VIII пассаж
100
80
60
40
20
0
1
2
3
4
5
6
7
8
номер пассажа
контроль
10% КФ
20% КФ
30% КФ
44
Растения-регенеранты моркови после селекции in vitro
Растения-регенеранты пшеницы после селекции in vitro45
Содержание гормонов ( мкг/г сух. масса) в суспензионной культуре моркови
при культивировании ее в стандартных и стрессовых условиях на разных
пассажах
№
пассажа
Вариант
ФИТОГОРМОНЫ
ИУК
ЦК
АБК
ГК
линия 906
I
IV
VIII
Контроль
0,0846
261,65
-
0,3995
КФ 40%
0,029
6,51
-
1,7905
Контроль
0,0138
128,33
-
0,2701
КФ 40%
0,102
90,69
-
0,8397
Контроль
0,0083
8,91
-
0,0952
КФ 40%
0,126
92,05
-
0,8759
сорт Rondo
I
IV
VIII
Контроль
0,0397
13,75
-
2,6311
КФ 40%
0,013
7,48
-
3,1268
Контроль
0,0154
6,84
-
0,5390
КФ 40%
0,018
4,26
1,029
0,3251
Контроль
0,0106
4,92
-
0,7781
КФ 40%
0,0209
16,24
0,72
2,105546
одержание гормонов ( мкг/г сух. массы) в растениях-регенерантах морков
Генотип
Линия
906
Сорт
Rondo
Вариант
ФИТОГОРМОНЫ
ИУК
ЦК
АБК
ГК
Контроль
0,1936
572,77
-
39,965
В
результате
селекции
0,2306
2274,58
-
550,346
Контроль
19,960
28,09
-
186,764
В
результате
селекции
23,264
6027,39
-
439,258
47
Контроль
Селекция in vitro
48
Лигнификация клеточной стенки клеток
суспензионной культуры сорта «Дезире»
49
Суммарное содержание растворимых фенольных соединений (мг/г
сырой массы) в суспензионной культуре и в растениях-регенерантах
моркови, культивируемых в стандартных и стрессовых условиях
(присутствие КФ патогена A. radicina)
0,4
0,6
0,35
0,5
0,3
0,4
0,25
контроль
0,3
30%
0,2
50%
контроль
0,2
30%
0,15
50%
0,1
0,05
0,1
0
0
I
I
IV
№ пассажа
VIII
IV
VIII
№ пассажа
1,8
1,6
1,4
1,2
1
0,8
Сорт Rondo
Линия 906
0,6
0,4
0,2
0
контроль
в результате
селекции
50
фенольные соединения, мг/г
свежей массы
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
Невский
Удача
основная среда
Дезире
Жуковский
ранний
основная среда + КФ
Изменение в содержании фенольных соединений в суспензионных
культурах различных генотипов картофеля при воздействии КФ (30%)
51
Схема хроматограммы этанольных экстрактов фенольных соединений в каллусных
52
тканях подсолнечника, культивируемых в стандартных и стрессовых условиях
RAPD спектры ДНК каллусной ткани
пшеницы
моркови
53
RAPD спектры ДНК
растений-регенерантов
моркови (после селекции)
RAPD спектры ДНК
растений-регенерантов
пшеницы (после селекции)
54
Спасибо за внимание!
55