Гемоглобины человека-иммунобиохимическая характеристика и
реклама
На правах рукописи Кривенцев Юрий Алексеевич ГЕМОГЛОБИНЫ ЧЕЛОВЕКА: ИММУНОБИОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ 03.00.04. ─ Биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук Москва ─ 2009 2 Работа выполнена в государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Астраханская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор АГМА Никулина Дина Максимовна Официальные оппоненты: член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор Терентьев Александр Александрович доктор медицинских наук, профессор Хватов Валерий Борисович доктор медицинских наук, профессор Сучков Сергей Викторович Ведущая организация: – ГОУ ВПО «Московский государственный медикостоматологический университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию», Адрес: 127473, Москва, ул. Делегатская, д. 20/1. Защита диссертации состоится 28 декабря 2009 г. в 15.00. часов на заседании Диссертационного Совета Д.208.072.01 при ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу: 117997, Москва, ул. Островитянова, 1. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО РГМУ по адресу: 117997, Москва, ул. Островитянова, 1. Автореферат разослан 15 сентября 2009 г. Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор П.Х. Джанашия 3 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. В последние годы повышается интерес к отдельным типам гемоглобина как диагностически значимым маркерам. Существует разнообразие (талассемии, онкопатология, патологических гипоксии диагностически-прогностическое и значение состояний др.), имеет при не красной которых только крови важное изменение количества общего гемоглобина крови, но и отдельных его типов. К наиболее физиологически и диагностически значимым типам гемоглобина человека относятся гемоглобины взрослого HbА1, HbА2, фетальный гемоглобин (HbF) и эмбриональный гемоглобин (HbP). В современной клинической практике большинства стран для количественного анализа гемоглобинов в качестве стандартных применяются колориметрические циангемоглобиновые методы, рекомендованные комитетом по стандартизации Европейского и Международного Общества по Гематологии (Deutscher Normenausschuss, Normentwurf DIN 58931, 1964), основным из которых является унифицированный гемоглобинцианидный метод [Зорина Н.В., 1980; Делекторская Л.Н., 1992; Гаранина Е.Н., 1997]. Большинство колориметрических методов количественного определения гемоглобина не отличаются избирательностью: с их помощью определяется лишь общее количество гемоглобина крови, а не отдельных его типов. Даже в случае определения щелочеустойчивой фракции гемоглобина по Зингеру и Бетке регистрируются несколько типов гемоглобина, а не только фетальный [Betke K., 1958; Betke K., 1979]. Кроме того, методы Бетке и Зингера несовершенны при определении малых концентраций гемоглобина. Методика определения гемоглобинов путем электрофореза в геле крахмала, агарозы или ацетата целлюлозы при рН 8,4-8,6 [Huisman, T.H.J. 1996, Тиц Н.У. 1997, Fairbanks, V.P. 1999] является полуколичественной. В современной медицинской лабораторной практике четко прослеживается тенденция перехода от определений фракций веществ к 4 индикации каждого вещества фракции в отдельности, что, очевидно, повышает качество диагностики и оценки состояния пациента. Безусловно, современная медицина нуждается в появлении новой схемы тестирования гемоглобинового спектра человека, которая позволяла бы определять уровень каждого из основных типов гемоглобина. В последние годы появились единичные работы по изучению отдельных типов гемоглобина с помощью иммунохимических тест-систем [Никулина Д.М. 2002; Токарев Ю.Н. 2003]. Огромным преимуществом иммунохимических методов является их высокая специфичность, которую обеспечивают интимные избирательные взаимодействия: антиген–антитело. Кроме того, к преимуществам иммунохимических методов можно отнести высокую чувствительность, позволяющую количественно определять белки в малых пробах, а также то, что эти методы позволяют исследовать сложные биологические смеси без какойлибо предварительной очистки и выделения исследуемого белка. Таким образом, моделирование моноспецифических иммунохимических тест-систем на основные типы гемоглобина (HbА1, HbF, HbP и др.), разработка комплексной схемы оценки гемоглобинового спектра крови и их внедрение в клиническую практику актуально и целесообразно. Цель исследования: оптимизация клинической оценки состояния красной крови путем пополнения фундаментальных сведений по основным типам гемоглобина и формирования комплексной иммунохимической схемы оценки гемоглобинового спектра. Задачи исследования 1. Провести сравнительное иммунобиохимическое изучение физико- химических свойств HbА1, HbА2, HbF и HbP. 2. Разработать рациональные способы выделения и очистки основных типов гемоглобина. 3. Смоделировать моновалентные иммунохимические тест-системы на гемоглобины А1, А2, F и P. 5 4. Разработать способы количественного иммунохимического анализа основных типов гемоглобина. 5. Определить сроки начала и динамику продукции HbР и HbF на ранних этапах онтогенеза человека. 6. Создать комплексную схему оценки гемоглобинового спектра крови на основе иммунохимических тест-систем и установить ее клиникодиагностическое значение при патологии эритрона и заболеваниях, сопровождающихся гипоксией. Научная новизна исследования Пополнены фундаментальные данные по физико-химическим свойствам HbA1, HbA2, HbF, получены новые сведения по некоторым физико-химическим свойствам эмбрионального гемоглобина: относительной электрофоретической подвижности в полиакриламидном и агарозном гелях, изоэлектрической точке, степени щелочной резистентности и отношению к осаждающим агентам, на основании чего разработаны и апробированы оригинальные алгоритмы их выделения и очистки. Сконструирована моновалентная иммунохимическая тест-система на эмбриональный гемоглобин. Смоделированы и успешно апробированы новые точные и надежные оптимальные алгоритмы количественного анализа по гемоглобинам A1, A2, F и P. Впервые разработана комплексная схема количественной оценки гемоглобинового спектра, отличающаяся точностью, специфичностью, надежностью и экономичностью. Уточнены сроки начала продукции антенатальных гемоглобинов и проведен параллельный иммунохимический анализ динамики концентрации HbР и HbF в раннем эмбриогенезе. Впервые выявлен HbР и отмечено повышение концентарции HbF в крови больных эритремией, сублейкемическим миелозом, острым и хроническим миелолейкозом, что доказывает значение этих белков как канцероэмбриональных антигенов в диагностике миелопролиферативных 6 заболеваний. Впервые показано появление HbР и достоверное изменение уровня HbF в крови новорожденных с тяжелой внутриутробной гипоксией, задержкой внутриутробного развития и глубокой недоношенностью, доказывающее диагностическую роль тестов на HbP и HbF при патологии новорожденных. Впервые отмечено значительное превышение концентрации фетального гемоглобина в крови больных опийной наркоманией и алкоголизмом. Практическая значимость работы Предложенные оригинальные алгоритмы выделения и очистки гемоглобинов А1, А2, F и P, позволят экономить исходный биоматериал, реактивы, временные и финансовые ресурсы. Полученные белковые препараты могут быть использованы для научных исследований и для практического применения. Разработаны и используются в клинической практике следующие тесты: способ количественного анализа HbF ракетным электрофорезом с додецилсульфатом натрия, способ полуколичественного анализа HbP путем трехэтапной иммунодиффузии по Оухтерлони, способ количественного анализа HbA1 и HbA2 радиальной иммунодиффузией по Манчини. Составлена инструкция по применению сформированного набора реагентов для иммунохимической индикации HbF, HbP, HbA1 и HbA2. Разработана и используется в гемоглобинового клинической спектра, практике основанная комплексная на сочетании схема оценки оптических и иммунохимических методов индикации гемоглобинов. Результаты диссертационного исследования и предложенные рекомендации могут быть использованы в работе клинико-диагностических лабораторий, поликлинических, гематологических, педиатрических, неонатологических, наркологических, пульмонологических, кардиологических, онкологических и терапевтических лечебно-профилактических учреждений. Внедрение результатов исследования позволит оптимизировать способы 7 аналитической и препаративной работы с основными типами гемоглобина человека, осуществлять более точный и полный анализ гемоглобинового статуса и состояния красной крови, что будет способствовать улучшению диагностики, лечения и прогноза заболеваний, сопровождающихся изменением концентрации общего гемоглобина или отдельных его типов. Внедрение результатов исследования в практику Разработанные в диссертации методики и полученные результаты исследований внедрены в практическую деятельность КДЛ учебно-научнодиагностического центра ГОУ ВПО АГМА; МУЗ «Клинический родильный дом» г. Астрахань; ГУЗ Александро-Мариинской ОЦКБ, г. Астрахань; НУЗ Медико-санитарная часть, г. Астрахань; МУЗ клиническая больница №5, г. Астрахань. Теоретические положения используются в учебном процессе на биохимии с курсом клинической лабораторной диагностики, патологической физиологии ГОУ ВПО АГМА Росздрава. Материалы научных исследований используются в научных разработках и в педагогическом процессе на всех факультетах на кафедрах биохимии с курсом клинической лабораторной диагностики и патологической физиологии Астраханской государственной медицинской академии. Положения, выносимые на защиту: 1. При очистке основных типов гемоглобина наиболее эффективны методы фракционирования, основанные на разделении по изоэлектрической точке: ионообменная хроматография и препаративный электрофорез. При электрофоретическом разделении гемоглобинов оптимальным является диапазон рН рабочего буфера от 6,0 до 6,6. Значительное влияние на электрофоретическую подвижность HbA1, HbA2, HbF и HbP в агарозе и ПААГ оказывают додецилсульфат натрия, тритон, мочевина и бихромат калия. На ранних этапах выделения HbP следует использовать модифицированную методику щелочной денатурации с 40-секундной экспозицией в 1,2 н NaOH. 8 2. Оптимальными для количественного определения основных типов гемоглобина являются методы иммунохимического анализа. Разработаны точные алгоритмы селективного количественного анализа HbA1, HbA2, HbF и HbP, основанные на методах двойной иммунодиффузии, ракетного иммуноэлектрофореза и РИД по Манчини. Создана и внедрена в клиническую практику комплексная схема количественной оценки гемоглобинового спектра по основным типам гемоглобина, основанной на модифицированных иммунохимических методах. 3. Иммунохимическим путем проведен количественный анализ динамики концентраций HbР и HbF в раннем эмбриогенезе (с 4 по 12 нед гестации), и уточнены сроки начала продукции антенатальных гемоглобинов. 4. Доказано значение HbP и HbF как канцероэмбриональных антигенов в диагностике миелопролиферативных заболеваний, оценке степени тяжести и прогноза гипоксии новорожденных, ЗВУР и глубокой недоношенности. Впервые отмечено значение иммунохимического теста на HbF в оценке тяжести и эффективности лечения больных опийной наркоманией и алкогольной зависимостью. Апробация работы Основные положения диссертации доложены на V научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» 2001; на III съезде биохимического общества РАН (Санкт-Петербург, 2002); на 2-й и 3-й научно-практической конференции и школе-семинаре для молодых ученых с международным участием «Белки-маркеры патологических состояний» (Астрахань-Москва, 2001, 2003); на научно-практической конференции с международным участием «Современные достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины» (Астрахань-Москва, 2004), (Астрахань-Волгоград-Москва, 2006), (Астрахань-Москва 2008); на VIII Международной научной конференции «Эколого-биологические проблемы бассейна Каспийского моря» (Астрахань, 2005); на международной научной 9 конференции, посвященной 450-летию г. Астрахани (Астрахань. 2007), на VI Всероссийской конференции молодых ученых вопросы «Актуальные клинической и экспериментальной онкологии» (Москва. 2007), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск. 2008), межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные проблемы кардиологии Всероссийской научной детей и взрослых-2009» конференции «Актуальные (Астрахань. вопросы 2009), клиники, диагностики и лечения больных в многопрофильном лечебном учреждении» (С-Пб., 2009). Материалы диссертации были представлены на выставке: «Инновационные достижения России» XI Петербургского международного экономического форума (С-Петербург. 2007). Публикации По материалам диссертации опубликована 41 научная работа, в том числе 12 в рецензируемых научных изданиях, рекомендуемых ВАК, 1 патент. Структура и объем работы: Диссертация изложена на 264 страницах текста, иллюстрирована 34 таблицами, 39 рисунками, состоит из введения, обзора литературы, главы методов исследования, 6 глав собственных экспериментальных и клинических исследований, обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций. Указатель литературы содержит 251 отечественных и 139 иностранных авторов. Личное участие автора в получении результатов исследования Основной материал, представленный в диссертации, получен, обработан и проанализирован лично автором. Исследования проведены на кафедре биохимии с курсом клинической лабораторной диагностики АГМА, КДЛ учебно-научно-диагностического центра ГОУ ВПО АГМА; МУЗ «Клинический родильный дом»; ГУЗ Александро-Мариинской ОЦКБ, санитарная часть, МУЗ клиническая больница №5, г. Астрахань. НУЗ Медико- 10 СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования Исследование было проведено в период с 2003 по 2009 гг. на биологическом и клиническом материале общей численностью 1288 образцов. Объектом исследования являлись изучаемые гемоглобины типов А1, А2, F и P, источники получения которых приведены в табл. № 1. Таблица 1 Перечень использованного в работе материала Материал Число образцов Место получения биоматериала г. Астрахань Биоматериал: Эмбриональный материал 170 Плоды 12 Пуповинная кровь здоровых новорожденных Кровь беременных 62 Кровь здоровых доноров 84 Станция переливания крови Пуповинная кровь новорожденных Кровь кардиологических больных Кровь наркологических больных Кровь гематологических больных: Гемобластозы 196 МУЗ «Клинический родильный дом» НУЗ Медико-санитарная часть наркологический УНЛЦ АГМА Анемии 64 57 Отделение гинекологии МУЗ КБ №5 Отделение патанатомии ГУЗ АМ ОЦКБ МУЗ «Клинический родильный дом» Клинический материал: Здоровые доноры (группы контроля) ВСЕГО 49 138 244 212 1288 Отделение гематологии ГУЗ АМ ОЦКБ НУЗ Медико-санитарная часть Станция переливания крови 11 Биоматериал использовали как при изучении физико-химических свойств HbA1, HbA2, HbF и HbP, так и в разработке новых способов выделения и очистки названных белков. Исходным материалом для очистки HbA1 и HbA2 являлась кровь доноров и здоровых беременных женщин; для очистки фетального гемоглобина - пуповинная кровь здоровых новорожденных и ткани плодов; для очистки HbP – эмбриональный материал сроком гестации 5-9 нед. Постановку и верификацию диагнозов в обследуемых группах проводили при участии квалифицированных специалистов. Исследованный клинический материал был разделен по нозологии на три группы: 1) Гепаринизированная кровь больных миелоприлиферативными заболеваниями. Всего было обследовано 244 образца крови (табл. 2). Т.к. в обследуемый спектр нозологии входили заболевания с редкой встречаемостью (эритремия, сублейкемический миелоз, эритроцитоз), если число вариант в выборке не превышало 20, применяли алгоритмы статистической обработки для малых групп. Таблица 2 Перечень использованного в работе материала Исследуемый материал (кровь больных) Эритремия Сублейкемический миелоз Хронический миелолейкоз Острый миелолейкоз Острый и хронический лимфолейкоз Эритроцитоз ВСЕГО Количество проб 36 34 76 36 56 6 244 2) Гепаринизированная пуповинная кровь новорожденных, в количестве 196 образцов (табл. 3). 3) Гепаринизированная периферическая кровь наркологических больных (табл. 1). Были обследованы образцы крови от 138 человек, из них: 52 образца от пациентов с алкогольной зависимостью; 44 – от больных опийной наркоманией и 42 пробы от здоровых взрослых (контрольная группа). Возраст 12 больных составил от 18 до 43-х лет. Клинический статус обследуемых соответствовал острому абстинентному синдрому. Таблица 3. Перечень использованного в работе материала Количество проб Исследуемый материал (пуповинная кровь новорожденных) Всего Мальчики Девочки Здоровые дети (контрольная группа) 62 33 29 Дети с тяжелой внутриутробной гипоксией 52 27 25 Дети с тяжелой внутриутробной гипоксией 43 21 22 и задержкой внутриутробного развития Дети с тяжелой внутриутробной гипоксией 39 18 21 и глубокой недоношенностю (масса тела не более 1000 г.) ВСЕГО 196 99 97 Кровь брали пункцией кубитальной вены или пальца у взрослых людей, у новорожденных - из пуповины сразу после ее рассечения, у плодов - из сердца. Забор крови производили в пробирки с добавленным в них раствором гепарина. Эмбриональные ткани получали в ходе экстренных и запланированных медицинских абортов при участии квалифицированного врача-гинеколога, с письменного согласия пациенток. После получения материал упаковывали в стерильные, герметично закрытые емкости, которые тут же транспортировали в научную лабораторию кафедры биохимии с курсом КЛД в охлажденном состоянии. Хранили материал в морозильной камере при температуре -180С. При изучении физико-химических свойств HbA1, HbA2, HbF и HbP, и при разработке новых способов выделения и очистки названных белков применяли методы механически-термического гемолиза, комбинированной щелочной денатурации (поэтапная обработка гемолизата раствором сульфата аммония 50% насыщенности и 1,2 М раствором едкого натра с последующей седиментацией при 8000 g), препаративного электрофореза в агаровом геле на 0,1 М цитратном буфере рН 6,0 (в авторской модификации), электрофореза в полиакриламидном геле, ионообменной и гель-проникающей хроматографии 13 (Л.А.Зильбер, ред., 1968; Davis 1964; Ornstein 1964; Г.Детерман, 1970; Г.Маурер, 1971; Э.Руослахти, 1979; Л.А.Остерман, 1985; Э.Гааль и соавт., 1982; X. Фримель, ред., 1987; О.Микеш, ред., 1982; Р.Скоупс, 1985; А.М.Егоров и соавт., 1991). Идентификацию полученных препаратов проводили методами ИХА. Всего протестировано свыше 4500 образцов биоматериала. Моновалентные антисыворотки на изучаемые типы гемоглобина получали самостоятельно методом иммунизации кроликов породы «шиншилл» дробными дозами чистого антигена с адъювантом Фрейнда по общепринятой схеме. При моделировании иммунохимических тест-систем применяли: выделение α-цепей пара-хлормеркурибензоатом, истощение антисывороток путем иммуноаффинной хроматографии на Bio Gel P-200, электрофорез в агаре, иммуноэлектрофорез по Грабару и Уильямсу (Grabar P. et al. 1958). Для индикации белков в био- и клиническом материале использовали: · оптические методы определения: унифицированный гемоглобинцианидный метод (по инструкции Департамента государственного контроля качества, эффективности, безопасности лекарственных средств и медицинской техники МЗ РФ 17.06.2000), определение фетального гемоглобина по Зингеру в модификации Бетке (Betke, K. 1979); определение общего белка биуретовым методом (набор реагентов фирмы «Vital», экстинкцию измеряли на фотоэлектроколориметре «Spicol-11») или спектрофотометрически при 280 и 260 нм по Варбургу. · иммунохимические методы: иммунодиффузионное титрование по Ouchterlony в модификации Н.И.Храмковой и Г.И.Абелева, РИД по Манчини в модификации Фехей и Мак-Келви (Fahey, J.L. 1965), ракетный электрофорез в агаровом геле в варианте Laurell C.B. и Merrill D в авторской модификации. Для статистической обработки и анализа полученных результатов исследования, а также построения графиков был использован лицензионный пакет прикладных программ статистического анализа Excel-2003 (Microsoft), Statistica 6.0 (StatSoft. Inc.). Для каждой выборки вычисляли средние величины 14 (М), среднее квадратичное отклонение (σ), среднюю ошибки средней арифметической (m). Проводили дисперсионный анализ с подсчетом степеней свободы (νмеж и νвну) и критерия дисперсии (F). С целью определения значимости Р различий сопоставляемых величин применялся критерий t Стьюдента и однофакторный дисперсионный анализ с вычислением критерия F Фишера. Различие считали достоверным при Р<0,05. Для оценки межгрупповой зависимости (коэффициент проводился линейный корреляции - r). корреляционный Корреляция анализ считалась Пирсона высокой при приближении модульной величины r к единице. Статистические взаимосвязи между показателями оценивались применением корреляционного, регрессионного анализа и методов многомерной статистики (Гланц С., 1999). Результаты исследования и их обсуждение Сравнительное изучение физико-химических свойств основных типов гемоглобина (HbA1, HbA2, HbF и HbP) показало, что все изучаемые типы являются водорастворимыми хромопротеидами с электрофоретической подвижностью β-глобулинов. Установлено, что все методы обратимого и необратимого осаждения, за исключением осаждения слабыми растворами кислот и щелочей, не позволяют разделять типы гемоглобина, однако могут быть использованы для очистки Hb от других белков и концентрирования препаратов гемоглобина. Показаны значительные отличия разных типов гемоглобина в способности осаждаться сульфатом аммония, что может быть использовано при их разделении. Установлено, что HbP резистентен к действию щелочей, но его устойчивость ниже, чем у HbF (табл. 4). Экспериментально показано, что из четырех основных типов гемоглобина, как в ПААГ, так и в агарозном гелях максимальную электрофоретическую подвижность (как по альбумину, так и по гемоглобину А1) имеет эмбриональный гемоглобин, второй по скорости миграции - HbA1. В агарозном 15 геле минимальную подвижность среди названных протеинов имеет HbA2, а в ПААГ – HbF (рис. 1). Степень корреляции относительной электрофоретической подвижности изучаемых протеинов, как по альбумину, так и по гемоглобину А1, оказалась положительной и высокой (в агарозе: r = 0,88; в ПААГ: r = 0,91). Таблица 4 Сравнительный анализ физико-химических свойств гемоглобинов Ф/х свойства Растворимость в воде Отношение к осаждающим реагентам 0,5% риванол этанол HbA1 + HbA2 + HbF + HbP + осаждается обратимо*** осаждается обратимо*** осаждается обратимо*** осаждается обратимо*** осаждается обратимо*** осаждается обратимо*** осаждается обратимо*** осаждается обратимо*** 55* 50* 70* 65* 30-65* 30-65* 40-80* 35-80* Отнощение к сульфату аммония (в % насыщенности): оптимум осаждения диапазон осаждения Относительная электрофоретическая подвижность по альбумину: в агарозе в ПААГ Изоэлектрическая точка Резистентность к действию щелочей Пероксидазная и каталазная активность Характеристические окраски: белки (амидочерный) общее железо (красная кровяная соль) на гемоглобины (бензидин, гваякол) гликопротеиды (Шифф) липопротеиды (судан) Гомогенность 0,258±0,009* 0,29-0,30** 0,610±0,022* 0,63-0,68** 7,0±0,1* 6,95-7,18** Неустой-чив*** 0,206±0,007* -**** 0,537±0,020* 0,51-0,525** 7,3±0,15* 7,4-7,6** Неустойчив*** 0,217±0,008* 0,30-0,35** 0,512±0,019* 0,50-0,52** 7,1±0,13* 6,9-7,15** Устой-чив*** Активен*** Активен*** Активен*** 0,309±0,010* -**** 0,679±0,024* -**** 6,85±0,1* -**** Относительно устойчив* Устойчив** Активен*** +*** +*** +*** +*** +*** +*** +*** +*** +*** -*** -*** Гомогенен при э/ф в агарозе и ПААГ*** +*** -*** -*** Гомогенен при э/ф в агарозе и ПААГ*** +*** -*** -*** Гомогенен при э/ф в агарозе и ПААГ*** +*** -*** -*** Гомогенен при э/ф в агарозе, гетерогенен при э/ф в ПААГ*** * - собственные данные ** - данные других авторов (Стародуб Н.Ф. (1987), Иржак Л.И. (1985)) *** - собственные и литературные данные совпадают -**** - данные в литературе отсутствуют 16 0 0,2 0,4 0,6 HbA 1 0 0,2 0, 4 0,8 Hb A 2 Hb F 0 ,6 HbA 1 Hb A 2 1 1,4 Hb P 0,8 Hb F 1,2 Рис.1. Относительная электрофоретическая подвижность основных типов гемоглобина (по HbA1) при электрофорезе в агарозном геле (верхний рисунок) и в полиакриламидном геле (нижний рисунок) 1 1, 2 Hb P Можно констатировать несовпадение литературных и полученных нами средних значений относительной электрофоретической подвижности по HbA1 в ПААГ и агарозном геле и по HbF в агарозе. При этом полученные результаты заслуживают доверия в силу большой выборки количества проведенных идентичных экспериментов. Впервые получены статистически достоверные данные по относительной электрофоретической подвижности HbP в полиакриламидном и агарозном гелях и HbA2 в агарозном геле и значению его изоэлектрической точки (t=3,29; Р<0,01). Получены новые данные по действию некоторых детергентов на HbP. Отмечено, что действие тритонов различных видов снижает электрофоретическую подвижность HbP, мочевина и бихромат калия не изменяют электрофоретической подвижности HbP, но делают его фракцию гетерогенной. Впервые показано, что ДСН меняет вектор 17 электрофоретической подвижности HbP на противоположный и увеличивает скорость движения этого белка. Разработка новых способов выделения и очистки по каждому из изучаемых типов гемоглобина проводилась с учетом полученных на предыдущем этапе данных. Разработаны и апробированы оригинальные способы очистки по каждому из изучаемых типов гемоглобина. Новизна разработок состоит, прежде всего, в подборе оптимального методического сочетания и алгоритма выполнения способа получения чистого препарата по каждому белку. Наиболее эффективным по большинству показателей является разработанный способ выделения и очистки фетального гемоглобина (рис. 2). Применение данного алгоритма приводит к получению белка наибольшей степени очистки с высоким его процентом в полученном препарате. Кроме того, данный способ оказывается наиболее экономным по биопродукту, выход которого довольно высок (табл. 5). 1 - гемолизат пуповинной крови; 2 – альбумин; 3 – очищенный препарат HbF; 4 – полуочищенный препарат. 1 – Очищенный препарат HbP; 2 - гемолизат крови взрослого человека. Рис. 2. Анализ чистоты полученных препаратов HbF и HbР методом электрофореза в ПААГ. 18 Таблица 5 Анализ качества выделения HbF Основные этапы выделения Исходный материал Получение гемолизата Щелочное осаждение Ионообменная хроматография Общий белок, мг/л 240189±316,2 128163±293,9 4651±188,5 2912±192,3 Кол-во Целевой Степень продукта, продукт очистки мг|л ,% HbF 3751±68,0 1,56 1 3118±73,2 2,42 1,55 2816±54,9 60,21 38,59 2542±46,5 85,58 54,86 Выход HbF (%) 100 82,66 76,66 67,73 σ= 30,81. F = 5,3. Способ выделения HbA1 по эффективности и чистоте получаемого продукта практически не уступает способу очистки HbF, а по простоте и дешевизне превосходит его (табл. 6). Таблица 6 Анализ качества выделения HbA1 Основные этапы выделения Исходный материал Получение гемолизата Препаративный электрофорез Разведение Общий Целевой Степень Кол-во Выход белок, продукт очистки продукта, мг|л HbA1 (%) мг/л ,% HbA1 215112±218,1 145039±172,9 67,44 1 100 165128±221,5 138128±155,0 83,64 1,24 95,17 53506±183,3 51640±129,3 95,52 1,42 35,62 535±32,4 516,4±64,8 95,52 1,42 0,36 σ= 68,17. F = 4,8. Менее эффективными по характеристикам оказались предлагаемые способы получения HbA2 и HbP (табл. 7 и 8; рис. 2). Это логично, учитывая, что HbA2 является минорным, а HbP получают из «грязного» абортивного материала сложным и трудоемким способом. Тем не менее, чистота каждого из полученных препаратов оказалось достаточной для получения качественных моновалентных иммунохимических антисывороток. Очищенные препараты использовали, в частности, для получения специфических антисывороток методом иммунизации кроликов. 19 Таблица 7 Анализ качества выделения HbP Общий Кол-во Целевой Степень белок, продукта, продукт очистки мг/л мг|л , (%) HbР 165019±492,8 1851±64,9 1,12 1 Основные этапы выделения Исходный материал Гомогенизация и 36113±378,5 экстрагирование Щелочное осаждение 5451±91,6 Ионообменная хроматография 1770±79,2 Выход HbР (%) 100 961±85,3 2,66 2,38 51,89 630±77,1 565±58,0 11,56 31,92 10,32 28,50 34,05 30,54 σ=36,00. F = 6,1. Таблица 8 Анализ качества выделения HbA2 Основные этапы выделения Исходный материал Получение гемолизата Препаративный электрофорез Ионообменная хроматография Общий Кол-во Целевой Степень Выход белок, продукта, продукт очистки HbA2 (%) мг/л мг/л , (%) HbA2 221814±369,0 2951±155,8 1,33 1 100 125603±294,5 2612±94,6 2,07 1,56 88,47 26934±119,7 1931±89,7 7,17 5,39 65,42 2361±128,6 35,32 26,564 28,26 834±39,6 σ= 51,88. F =6,4. Иммунохимическое сопоставление полученной антисыворотки на HbP с антигенными композитами (рис. 3) показало ее специфичность по отношению к экстракту тканей эмбриона и очищенному препарату HbP. Идентификация методом иммуноэлектрофореза с экстрактом тканей эмбриона (рис. 4) также регистрировала одну дугу в зоне подвижности гемоглобинов. Линии преципитации давали положительное гваяколовым методами. Параллельное эмбриональной ткани и того же окрашивание титрование бензидиновым нативного и экстракта препарата, подвергнутого щелочной денатурации, показало, что в обоих случаях тестируемая антисыворотка работала идентично до одинаковых разведений, что служило свидетельством специфичности полученной антисыворотки к HbР. 20 Рис. 3. Контроль специфичности антисыворотки на HbP 1 - антисыворотка на эмбриональный гемоглобин; 2 – антисыворотка на HbF; 3 – сыворотка крови кролика без антител на HbP; 4 – гемолизат пуповинной крови; 5 – очищенный препарат HbA2; 6 - экстракт тканей эмбриона 6-12 нед.; Э - очищенный препарат HbP; Sd – сыворотка крови взрослого донора; Г – гемолизат крови взрослого донора. Рис. 4. Идентификация антисыворотки на HbР методом иммуноэлектрофореза. Sd - сыворотка крови взрослого донора; Эм – экстракт тканей эмбриона 6-12 нед.; 1 – полиспецифическая антисыворотка на белки плазмы донора; 2 – антисыворотка на HbР 21 Полученные антисыворотки на фетальный гемоглобин подвергались контролю качества по тому же алгоритму, что и антисыворотки на эмбриональный гемоглобин: ИДА, иммуноэлектрофорез, специфическое окрашивание и параллельное титрование нативного и подвергнутого щелочной денатурации препаратов HbF. По всем названным тестам показана полная моноспецифичность полученных антисывороток к HbF. Иммунохимический анализ антисывороток на гемоглобин A2, как правило, выявлял дополнительную линию преципитации на HbA1, которая исчезала после истощения антисыворотки, методом аффинной сорбциии с αцепями гемоглобина антисывороток на (в авторской гемоглобины модификации). A1 и A2, Контроль проводимый качества методами иммунодиффузионного анализа, иммуноэлектрофореза и специфического окрашивания показал их полную специфичность. В результате проведенной работы впервые разработана специфическая иммунохимическая тест-система на эмбриональный гемоглобин, в которой тест-антигеном является очищенный препарат HbР в рабочем разведении: 1/2 или экстракт тканей эмбриона (срок – 6-9 недель) в рабочем разведении 1/81/16. Порог чувствительности тест-системы 4,25±0,22 мг/л, (Р<0,01). Смоделированы специфические иммунохимические тест-системы на: фетальный гемоглобин, в которой тест-антигеном является гемолизат пуповинной крови в рабочем разведении: 1/64-1/256, порог чувствительности 2,21±0,26 мг/л, (Р<0,005); гемоглобин А1, тест-антигеном является гемолизат крови взрослых доноров в рабочем разведении: 1/128-1/512, порог чувствительности 3,24±0,18 мг/л, (Р<0,01); гемоглобин А2, в которых тестантигеном является очищенный препарат HbА2 в рабочем разведении: 1/321/64, порог чувствительности 4,42±0,19 мг/л, (Р<0,01). 22 Иммунохимические моновалентные антисыворотки были использованы для моделирования оптимальных способов индикации изучаемых типов гемоглобина. Для количественного анализа фетального гемоглобина разработан способ ракетного электрофореза в агаровом геле в собственной модификации (патент №2310204. от 10.11.2007), основанный на полученных данных о повышении скорости электрофоретической миграции гемоглобинов, обработанных ДСН (рис. 5). Эмпирически подобраны оптимальные параметры проведения методики, построена стандартная калибровочная кривая. Корреляционный анализ Пирсона показал высокую прямую линейную зависимость концентрации HbF в исследуемых образцах от квадрата диаметра кольца преципитации (r=0,96; P<0,001). Преимущества способа: селективность; упрощение способа; высокая чувствительность (порог чувствительности 1,7±0,29 мг/л); точность (максимальная погрешность ±2%); достоверность определения, в том числе и при определении малых величин гемоглобина (Р<0,01; F=8,4); экономия временных трудозатрат (10-12 часов). Рис. 5. Определение HbF методом ракетного электрофореза: лунки 1-2 – образцы HbF, не обработанные ДСН; лунки 3-7 – образцы HbF, обработанные ДСН 23 Предложен и успешно апробирован способ восходящей трехэтапной индикации HbP, включающий: РИД-тестирование в тест-системе с двойным наполнением лунки антисывороткой (порог чувствительности 2,13±0,19 мг/л); классическое РИД-тестирование (порог чувствительности 4,25±0,22 мг/л) и титрование в тест-системе в кратных разведениях антигена. В каждом последующем этапе тестировали только пробы, положительно прореагировавшие на предыдущем этапе. Для определения HbP в материале с заведомо высокой концентрацией HbP разработан модификации метод Фехей радиальной и Мак-Келви. иммунодиффузии Сравнительный по Манчини анализ в качества предлагаемых методов определения эмбрионального гемоглобина (табл. 9) показал, что и полуколичесвенный анализ по Оухтерлони и количественный по Манчини, в равной степени, характеризуются высокой точностью, специфичностью, достоверностью и надежностью. Таблица 9 Сравнительный анализ предлагаемых способов количественного определения HbP Характеристика Полуколичесвенный Количественный анализ по Оухтерлони анализ по Манчини Избирательность Специфичен Специфичен регистрации HbР Чувствительность Порог чувствительности Порог чувствительности 2,17±0,33 мг/л 2,8±0,4 мг/л Точность получаемых Максимальная Максимальная результатов погрешность ±2,7% погрешность ±3,1% Достоверность Достоверен, Р<0,01 Достоверен, Р<0,01 определения Время проведения Около 12 часов Около 36 часов Разработаны и успешно апробированы способы количественного анализа HbА1 и HbA2, основанные на методе радиальной иммунодиффузии по Манчини в модификации Фехей и Мак-Келви. Способы отличаются: специфичностью, чувствительностью (порог чувствительности от 2,1±0,32 до 2,9±0,41 мг/л; 24 σ=0,08); точностью (максимальная погрешность ±2,8%); достоверностью определения, в том числе и при определении малых величин гемоглобина (Р<0,01; F=6,9); экономией трудозатрат за счет сокращения времени методики (не более 12 часов). Создана новая гемоглобинового спектра комплексная схема по основным типам количественной гемоглобина. оценки Алгоритм предлагаемой схемы включает: определение общего Hb унифицированным гемоглобинцианидным методом; определение HbA2, HbF и HbP (при необходимости) описанными методами иммунохимической индикации и определение уровня HbА1, как разности между количеством общего Hb и HbA2, HbF, HbP. В рамках этой работы проведен сравнительный анализ HbА1 HbА2 и HbF описанными иммунохимическими способами, параллельно с определением общего Hb гемоглобинцианидным методом, в большой выборке доноров (табл. 10). Анализ показал, что средние значения концентрации HbА1 HbА2 и HbF, в пересчете на относительные единицы от общего Hb составляют 94,3%, 2,1% и 2,9% соответственно. Таблица 10 Показатели общего гемоглобина и его изоформ в исследуемой группе Тип Hb Общий Hb HbА1 HbA2 HbF Методика определения Унифицированный гемоглобинцианидны метод Радиальная иммунодиффузия по Манчини в модификации Фехей и Мак-Келви Радиальная иммунодиффузия по Манчини в модификации Фехей и Мак-Келви Ракетный электрофорез в предлагаемой модификации Концентрац ия (г/л) 145,8±24,4 σ % Hb 15,62 100 137,5±19,7 13,09 94,3 3,07±0,12 0,10 2,1 4,24±0,19 0,16 2,9 Статистический анализ показал высокую положительную корреляцию между суммой концентраций HbА1, HbA2 и HbF (в мг/л), определенных 25 иммунохимически и концентрацией общего гемоглобина, определенной гемоглобинцианидным методом (r=0,98). Ошибка метода составляет 0,68%. Преимущества разработанной схемы: комплексность анализа по общему Hb и важнейшим его изоформам; специфичность; высокая чувствительность (порог чувствительности от 1,7±0,29 до 2,13±0,3 мг/л); точность (максимальная погрешность ±1,2%); достоверность определения экономия (р<0,001); трудозатрат за счет исключения из общей схемы этапа иммунохимического определения HbА1. Разработанные на предыдущем этапе алгоритмы выявления HbF и HbP были успешно использованы для анализа продукции антенатальных типов гемоглобина (HbF и HbP) в раннем эмбриогенезе человека. Настоящее исследование позволило иммунохимическим путем количественно определить динамику продукции HbР и HbF в раннем эмбриогенезе (рис. 6). Проведен полный анализ динамики концентраций HbР и HbF в доступном временном диапазоне гестационного возраста. Полученные данные являются достоверными и характеризуются малым разбросом и удовлетворительной дисперсией средних величин (F - от 5,6 до 6,3). Иммунохимически определены сроки начала продукции антенатальных гемоглобинов: HbР - с 4-й недели ГВ, HbF – с 5-й недели. Показана высокая достоверная зависимость продукции антенатальных гемоглобинов от сроков гестации (в диапазоне с 4 по 12 неделю). Для эмбрионального гемоглобина эта корреляция является нелинейной отрицательной (r=-0,898); для фетального гемоглобина – количественных положительной показателей (r=0,936), HbР и HbF т.е. в динамика изменений эмбриогенезе носила разнонаправленный характер (r = -0,94). В изучении клинико-диагностического значения иммунохимических тестсистем на гемоглобины типов А1, А2, F и P наибольшего внимания заслуживают результаты миелоприлиферативные по заболевания трем крови, нозологическим патология группам: новорожденных, 26 сопровождающаяся хронической гипоксией и наркологическая патология. Данные по количественному анализу HbA1 и HbA2 во всех перечисленных группах заболеваний, не имели достоверных отличий от аналогичных репрезентативных показателей в группах здоровых лиц, следовательно, имели информативную ценность нулевой гипотезы. Сведения по антенатальным типам гемоглобина (HbF и HbP), напротив, отличались новизной и фундаментально-прикладной значимостью. 80 концентрация (мг/л ) 70 60 50 HbP 40 HbF 30 20 10 0 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Срок гестации (недели) Рис. 6. Анализ концентраций эмбрионального и фетального типов гемоглобина в раннем эмбриогенезе человека При анализе гемоглобинового спектра в крови больных миелопролиферативными заболеваниями мы исходили из предположения, что названные формы патологии, связанные с понижением степени дифференцировки клеток миелоидного ростка (в т.ч. и эритроидных клеток) должны сопровождаться индукцией генов эмбриоспецифических белков, в частности, ε-гена HbP и γ-гена HbF. 27 Как и ожидалось, исходя из цитологической специфики данных опухолей эмбриональный гемоглобин не выявлен в контрольной группе и у больных острым и хроническим лимфолейкозом. Уровень фетального гемоглобина в крови больных острым и хроническим лимфолейкозами также не имел достоверных отклонений от такового в группе контроля (P>0,3). Эмбриональный эритремией гемоглобин впервые выявлен выявления 67,78%), сублейкемическим (частота в крови больных миелозом (49,41%), острым (24,44%) и хроническим миелолейкозом (и 20,53%). Причем средние концентрации положительным эмбрионального результатом были гемоглобина близки к в выборках с порогу чувствительности разработанной тест-системы на HbP в классическом РИД-тестировании (4,25±0,22 мг/л). Средняя концентрация HbP у больных эритремией составила 4,07±0,23 мг/л; сублейкемическим миелозом - 3,89±0,25 мг/л; острым миелолейкозом - 3,71±0,20 мг/л; хроническим миелолейкозом - 3,27±0,19 мг/л. Математический анализ полученных результатов показал их статистическую значимость (Р<0,005; t>4,95; F>5,2) (рис. 7). 70 60 50 40 % 30 20 10 0 1 2 3 4 5 1 контрольная группа 2 эритремия 3 сублейкемический миелоз 4 острый миелолейкоз 5 хронический миелолейкоз 6 лимфолейкозы 6 Рис. 7. Частота выявления HbP при некоторых гемобластозах 28 Отмечено значительное достоверное (t>4,66; Р<0,005) повышение концентарции фетального гемоглобина в крови больных эритремией (на 78,8% выше референтных значений), сублейкемическим миелозом (на 42,7%), острым (на 58,06%) и хроническим (на 70,20%) миелолейкозом. Для максимальной верификации полученных результатов по HbF, в тех же выборках было проведено их конвертирование в относительные величины: процент от общего гемоглобина в каждой нозологической группе. Полученные данные (в %), в целом адекватно соотносились с результатами иммунохимического тестирования HbF (в мг/л) (рис. 8). 9 8 7 % 6 5 4 3 2 1 0 1 2 3 4 5 1 контрольная группа 2 эритремия 3 сублейкемический миелоз 4 острый миелолейкоз 5 хронический миелолейкоз 6 лимфолейкозы 6 Рис. 8. Относительные величины HbF (в %) от общего Hb при миелопролиферативных заболеваниях Полученные результаты свидетельствуют, что эмбриональный и фетальный гемоглобины могут рассматриваться как канцероэмбриональные антигены, иммунохомическая регистрация которых может повысить качество диагностики миелопролиферативных заболеваний. Следует отметить, что в силу дешевизны, простоты и доступности (для проведения тестов на HbP и HbF 29 по предложенной схеме достаточно 0,1 мл крови из пальца), разработанные иммунохимические тесты на HbP и HbF могут применяться в скринингобследовании групп риска по данной нозологии. Проведен широкий иммунохимический анализ гемоглобинового спектра у новорожденных с внутриутробной гипоксией и сопутствующей патологией (табл. 11). Показано значительное достоверное (t=5,52; Р<0,002; F>4,8) повышение уровня HbF в крови новорожденных с тяжелой внутриутробной гипоксией (на 30,08% выше, чем в группе контроля), и, особенно, с задержкой внутриутробного развития в сочетании с тяжелой внутриутробной гипоксией (на 68,46%). Концентрация HbF в крови новорожденных с массой тела менее 1000 г, наоборот, оказалась на 58,25% ниже, чем в контрольной группе (t=7,3; Р<0,001; F=9,2). Таблица 11 Результаты количественного определения HbF у новорожденных по клиническому диагнозу Исследуемые группы Здоровые дети (контрольная группа) n 62 Дети с тяжелой внутриутробной 52 гипоксией Дети с тяжелой ВГ и задержкой 43 внутриутробного развития Дети с тяжелой ВГ и глубокой 39 недоношенностью (масса тела не более 1000 г.) Всего 196 Концентрация Стандартное HbF (мг/л) отклонение (σ) 1096,7±64,1 45,3 1426,6±73,5 52,1 1847,7±98,2 69,7 458,1±32,0 23,8 σ по генеральной совокупности 4,95. F = 6,8. Сравнительный иммунохимический анализ HbF у новорожденных по половому признаку впервые показал, что уровень фетального гемоглобина в крови новорожденных девочек достоверно (t=4,8; Р=0,001; F=7,1) превышает таковой у новорожденных мальчиков (рис. 9). И если в группе здоровых детей эта разница невелика, то в группе новорожденных с внутриутробной гипоксией 30 уровень HbF в крови новорожденных девочек значительно выше, чем у мальчиков (t=7,2; Р<0,0005; F=6,7). HbP не выявлялся иммунохимически в крови здоровых новорожденных и в крови новорожденных с различными формами внутриутробной гипоксии 3000 1250 2500 1200 2000 Мальчики 1500 Девочки 1000 Концентрация HbF (мг/л) Концентрация HbF (мг/л) легкой и средней степени тяжести. 1150 Мальчики 1100 Девочки 1050 500 1000 0 950 Рис. 9. Сравнительный анализ концентрации HbF в крови здоровых новорожденных мальчиков и девочек (левый рисунок) и новорожденных с внутриутробной гипоксией (правый рисунок) Эмбриональный гемоглобин впервые выявлен в крови новорожденных с тяжелой внутриутробной гипоксией (33,82% от общей выборки). Показано, что в крови новорожденных девочек с тяжелой степенью ВГ HbP выявлялся в два раза чаще (табл. 12), чем у новорожденных мальчиков с той же патологией (42,76% и 23,85% соответственно). Анализ статистической значимости полученных результатов показал высокую степень достоверности как по нозологическому (Р=0,001; F=8,6), так и по половому признаку (Р=0,003; F=6,4). Определение концентрации HbP (полуколичественный анализ) проводилось только у пациентов с положительным тестом на этот белок. Средняя концентрация эмбрионального гемоглобина в крови новорожденных с 31 тяжелой внутриутробной гипоксией с позитивной индикацией составила 3,81±0,21 мг/л; среди них, у девочек - 3,96±0,24 мг/л; у мальчиков - 3,65±0,18 мг/л. Таблица 12 Частота выявления HbP у новорожденных с внутриутробной гипоксией тяжелой степени Пол Число Среднее число Частота обследованных положительных тестов выявления (в на HbP %) Мальчики 26 6,2 23,85 Девочки Всего 29 55 12,4 18,6 42,76 33,82 Повышение уровня HbF и появление HbP при гипоксии, очевидно, объясняется тем, что эти протеины имеет бóльшее сродство к кислороду, чем гемоглобин взрослого, следовательно увеличение уровня антенатальных гемоглобинов в крови способствует более оптимальному тканевому газообмену в условиях тканевой гипоксии. Значительный разброс средних концентраций HbF и частоты выявления HbP в крови новорожденных мальчиков и девочек с внутриутробной компенсаторными гипоксией можно возможностями объяснить женского более организма высокими в этом онтогенетическом периоде. Иммунохимический анализ гемоглобинового спектра у наркологических больных с алкогольной зависимостью и опийной наркоманией дал ценные сведения по HbF. Впервые показно значительное превышение концентрации фетального гемоглобина в крови больных алкогольной зависимостью и опийной наркоманией почти в три раза, по сравнению с уровнем концентрации HbF в крови доноров контрольной группы (табл. 13). Анализ статистической значимости полученных результатов показал высокую степень достоверности как в группе больных опийной наркоманией (t=7,21; Р<0,001), так и в группе больных алкоголизмом (t=6,38; Р<0,001). 32 Таблица 13 Результаты количественного определения HbF в крови наркологических больных и здоровых доноров n Концентрац Стандарт Процент ия HbF ное HbF от Исследуемая группа (мг/л) отклонен общего Hb ие (σ) Кровь больных 44 1631±83 68,69 3,76 алкоголизмом Кровь больных опийной 52 1848±99 74,01 4,26 наркоманией Кровь здоровых 42 650±47 36,23 1,51 (контрольная группа) σ по генеральной совокупности 60,81, F = 5,7. νмеж = 2. Активация γ-гена фетального гемоглобина у наркологических больных, по нашему мнению, объясняется тем, что метаболические нарушения, возникающие в результате хронической интоксикации психоактивными веществами, затрагивают процессы аэробного окисления, что неизбежно приводит к развитию гипоксических состояний. А HbF, как было сказано выше является хромопротеидом, эволюционно адаптированным к стабилизации тканевого газообмена в условиях хронической гипоксии. С другой стороны, возможно в результате хронической интоксикации ПАВ, в некоторых гемопоэтических стволовых клетках возникает трансформация генетических структур, ведущая к изменению интенсивности синтеза фетального гемоглобина. ВЫВОДЫ 1. Получены новые достоверные сведения (Р<0,01) по некоторым физикохимическим свойствам эмбрионального гемоглобина: относительной электрофоретической подвижности в полиакриламидном и агарозном гелях, изоэлектрической точке, степени щелочной резистентности и отношению к 33 осаждающим агентам. Аналогичные сведения по HbA1, HbA и HbF уточнены и дополнены. 2. Отмечено изменение электрофоретической подвижности HbP под действием тритонов, мочевины и бихромата калия. Показано, что ДСН меняет вектор электрофоретической подвижности гемоглобинов на противоположный и увеличивает их скорость движения, что было положено в основу разработки способа количественного определения HbF. 3. Разработаны и апробированы эффективные алгоритмы выделения и очистки четырех типов гемоглобина со степенью чистоты HbF - 85,58%; HbР 30,54%; HbA1 - 95,52%; HbA2 - 35,32%, позволившие получить моновалентные антисыворотки на HbA1, HbA2, HbF и HbP. 4. Впервые сконструирована селективная иммунодиффузионная тестсистема на эмбриональный гемоглобин с порогом чувствительности 4,25±0,22 мг/л и смоделированы иммунохимические тест-системы на фетальный гемоглобин с чувствительностью 2,21±0,26 мг/л; на гемоглобин А1 и А2- с порогом чувствительности 3,24±0,18 мг/л и 4,42±0,19 мг/л соответственно. 5. Разработаны и успешно апробированы оптимальные алгоритмы количественного анализа изучаемых типов гемоглобина, отличающиеся простотой, специфичностью точностью (Р<0,01), (погрешность <3%), экономичностью: индикация HbP модифицированным методом двойной иммунодиффузии (чувствительность 2,17±0,33 мг/л); количественное определение HbF методом ракетного иммуноэлектрофореза (чувствительность 1,7±0,29 мг/л); количественный анализ HbA1 и HbA2 по Манчини (чувствительность 2,1±0,32 мг/л и 2,9±0,41 мг/л соответственно). 6. Создана и успешно апробирована на больших выборках клинического материала комплексная схема количественной оценки гемоглобинового спектра по основным типам гемоглобина, отличающаяся специфичностью, надежностью (коэффициент Пирсона 0,98), чувствительностью (порог от 34 1,7±0,29 до 2,13±0,3 мг/л), точностью (±1,2%), достоверностью (р<0,001), экономичностью. 7. Показана высокая достоверная зависимость продукции антенатальных гемоглобинов от сроков гестации в раннем эмбриогенезе человека (4-12 недель гестации): для эмбрионального гемоглобина корреляция является нелинейной отрицательной, r=-0,89; для фетального – положительной, r=0,94. Установлены сроки начала продукции HbР с 4-й недели гестационного возраста, HbF – с 5-й недели. 8. Доказано значение HbP и HbF как канцероэмбриональных антигенов в диагностике миелопролиферативных заболеваний: Эмбриональный гемоглобин впервые выявлен в крови больных эритремией (частота выявления 67,78%), сублейкемическим миелозом (49,41%), острым (24,44%) и хроническим миелолейкозом (20,53%). Отмечено достоверное повышение концентрации фетального гемоглобина в крови больных эритремией (превышение референтных значений на 78,8%), сублейкемическим миелозом (на 42,7%), острым (на 58,06%,) и хроническим (на 70,20%) миелолейкозом. 9. Определена диагностическая роль тестов на HbP и HbF при патологии новорожденных: впервые выявлен HbP в крови новорожденных с тяжелой внутриутробной гипоксией (33,82%); отмечено повышение уровня HbF в крови новорожденных с тяжелой внутриутробной гипоксией на 30,08%, - с ЗВУР в сочетании с тяжелой внутриутробной гипоксией на 68,46% и снижение концентрации HbF в крови новорожденных с массой тела менее 1000 г на 58,25%. Отмечена корреляция уровней HbP и HbF с полом новорожденных (r=0,96 и r=0,93). 10. Установлено диагностическое значение иммунохимического теста на фетальный гемоглобин при наркологической патологии. Впервые отмечено достоверное превышение концентрации фетального гемоглобина в крови больных опийной наркоманией (на 184,3% превышает полученные 35 референтные величины) и алкогольной зависимостью (выше на 150,9%) (Р<0,001). Практические рекомендации 1. При очистке основных типов гемоглобина рекомендуется использовать методы фракционирования, основанные на разделении по изоэлектрической точке (с учетом полученных данных по величинам рI): ионообменную хроматографию и препаративный электрофорез. При применении электрофоретических методов разделения гемоглобинов в качестве рабочего буфера эффективнее использовать буферы с рН от 6,0 до 6,6 (цитратный, ацетатный и др.). модифицированную На ранних методику этапах щелочной выделения денатурации HbP использовать с 40-секундной экспозицией в 1,2 н NaOH. 2. При получении антисывороток на HbA2, HbF и HbP использовать только очищенные препараты этих протеинов. Иммунизацию проводить по описанной комбинированной схеме (адъювант Фрейнда и алюмовокалиевые квасцы). Проводить истощение α-цепями гемоглобина на Bio-Gel 300. При иммунизации препаратом HbA1, эффективно его предварительное разведение в 500-2000 раз. 3. Внедрить в клинико-лабораторную практику метод ракетного иммуноэлектрофореза с ДСН для количественного определении HbF; трехэтапную методику РИД-тестирования при индикации HbP; РИД по Манчини в количественном анализе HbA1 и HbA2. При применении названных методов определения гемоглобинов пользоваться смоделированными калибровочными графиками. 4. Внедрить разработанную схему количественного анализа гемоглобинового спектра для комплексной оценки уровней HbA1, HbA2, HbF и HbP. 36 5. Рекомендуется использовать разработанные тесты на HbF и HbP при скрининг-анализе и диагностике миелопролиферативных заболеваний: эритремии, сублейкемического миелоза, острых и хронических миелолейкозов. 6. Дополнять классические схемы оценки степени тяжести и прогноза гипоксии новорожденных, ЗВУР и глубокой недоношенности, иммунохимическими тестами на эмбриональный и фетальный гемоглобины. 7. В оценке тяжести и эффективности лечения больных опийной наркоманией и алкогольной зависимостью целесообразно дополнение общепринятых схем тестом на HbF. Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Nikulina D.M., Kriventsev Y.A., Djachina M.N. Immunochemical test- systems for diagnostics and estimations to efficiency of the treatment of the inflammatory process // International journal of immunorehabilitation. - Israel. - Maj 2000. - V.2. - №2. P.12. 2. Агапова А.Б., Дьякова О.Н., Кривенцев Ю.А. диагностической иммунодиффузионной тест-системы на Разработка фетальный гемоглобин // Материалы конференции молодых ученых с международным участием “Белки-маркеры патологических состояний”. – Астрахань-Москва. – 2001. – С.101-102. 3. Агапова А.Б., Кривенцев Ю.А. Получение чистого антигена и моделирование тест-системы на фетальный гемоглобин // Материалы 82-й итоговой студенческой научной конференции АГМА. Астрахань. - 2001. – С.13. 4. Никулина Д.М., Дьякова О.Н., Кривенцев Ю.А., Корноухова И.Ю., Агапова А.Б. Фетальный гемоглобин как тест для диагностики гипоксических состояний // Материалы III съезда биохимического общества РАН. – С-Пб. 2002. – С.131. 37 5. Дьякова Никулина Д.М., Сентюрова Л.Г., Кривенцев Ю.А., Агапова А.Б., О.Н. Отчет о научно-исследовательской работе разработка иммунохимических тест-систем для выявления и оценки гипоксических состояний и деструкции тканей в организме человека // Отчет включен в национальный фонд РФ. Инвентарный № 02.2.00403489. 6. Метелкина Е.В., Коханов А.В., Агапова А.Б., Кривенцев Ю.А., Суринков Д.Б. Железосодержащие белки в остром периоде черепно-мозговой и скелетной травмы // Материалы научно-практической конференции и школысеминара для молодых учёных с международным участием «Современные достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины». - Астрахань-Москва. – 2004. – с.114-118. 7. Бисалиева Р.А., Кривенцев Ю.А., Никулина Д.М., Краморенко П.В. Разработка способа выделения эмбрионального гемоглобина и моделирование иммунохимической тест-системы на него / Материалы научно-практической конференции с международным участием «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины». – Астрахань-Волгоград-Москва. – 2006. – С.34-37. 8. Кривенцев Ю.А., Бисалиева Р.А., Ковалева Н.А., Лада Л.В. Получение специфической антисыворотки на фетальный гемоглобин / Материалы научно-практической конференции с международным участием фундаментальных «Достижения наук в решении актуальных проблем медицины». – Астрахань-Волгоград-Москва. – 2006. – С.62-65. 9. Коханов А.В., Метелкина Е.В., Кривенцев Ю.А., Белопасов В.В. Суточные ритмы показателей системы эритрона у больных с тяжелой черепномозговой травмой / Труды Астраханской государственной медицинской академии. – Астрахань. – 2006. - Т.33. – С.264-267. 10. Кривенцев Ю.А., Бисалиева Р.А., Никулина Д.М., Краморенко П.В., Семенова Т.Б. гемоглобина в Иммунохимический анализ продукции эмбрионального раннем эмбриогенезе человека / Материалы научно- 38 практической конференции с международным участием «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины». – Астрахань-Волгоград-Москва. – 2006. – С.58-62. 11. Кривенцев Ю.А., Никулина Д.М., Бисалиева Р.А., Пичугина Н.А. Разработка способа количественного определения фетального гемоглобина человека / Материалы научно-практической конференции с международным участием «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины». – Астрахань-Волгоград-Москва. – 2006. – С.65-68. 12. Никулина Д.М., Кривенцев Ю.А., Бахмутова Л.А., Бисалиева Р.А., Штепо М.В., Лапеко С.В. Определение эмбрионального гемоглобина в крови новорожденных практической с внутриутробной конференции с гипоксией международным / Материалы участием научно- «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины». – Астрахань-Волгоград-Москва. – 2006. – С.72-73. 13. Коханов А.В., Метелкина Е.В., Кривенцев Ю.А., Белопасов В.В. Суточные ритмы показателей системы эритрона у больных с тяжелой черепномозговой травмой // Труды Астраханской государственной медицинской академии. – Астрахань. – 2006. - Т.33. – С.264-267. 14. Кривенцев Ю.А., Бисалиева Р.А., Носков И.А. воздействия детергентов на эмбриональный гемоглобин Изучение // Вестник Астраханского государственного технического университета. - Астрахань. – 2006. - №6. - Т.35. – С.69-72. 15. Бахмутова Л.А., Кривенцев Ю.А., Огуль Л.А. Выявление эмбрионального гемоглобина в крови новорожденных с внутриутробной гипоксией // Вопросы практической педиатрии. – М. – 2006. – Т.1. - №4. – С.12. 16. Кривенцев Ю.А., Никулина Д.М., Бисалиева Р.А., Борисова Н.Б., Бисалиев Р.В. Экспрессия ε-гена эмбрионального гемоглобина при гематологической патологии // Успехи современного естествознания. – М. – 2007. - №3. – С.72-75. 39 17. Кривенцев Ю.А., Никулина Д.М., Бисалиева Р.А. Иммунохимический анализ концентрации фетального гемоглобина в крови новорожденных мальчиков и девочек с внутриутробной гипоксией // Омский научный вестник. – Омск. – 2006. - №9. – Т.46. – С.272-274. 18. Кривенцев Ю.А., Никулина Д.М., Бисалиева Р.А., Борисока Н.В. Иммунохимический анализ содержания эмбрионального гемоглобина в крови больных с онкогематологической патологией // Омский научный вестник. – Омск. – 2006. - №8. – Т.44. – С.279-281. 19. Кривенцев Ю.А., Бисалиева Р.А., Никулина Д.М., Носков А.И. Моделирование нового способа количественного анализа плодового гемоглобина человека // Фундаментальные исследования. М. 2007. №4. С.76-78. 20. Кривенцев Ю.А., Бисалиева Р.А., Семенова Т.Б., Никулина Д.М., Краморенко П.В. Изучение относительной электрофоретической подвижности анте- и постнатальных типов гемоглобина человека / Астраханский медицинский журнал. – Астрахань. – 2007. - №2. – С.102. 21. Никулина Д.М., Кривенцев Ю.А., Бахмутова Л.А., Бисалиева Р.А., Лапеко С.В., Штепо М.В., Огуль Л.А. гемоглобина в крови новорожденных Фетальный и эмбриональный типы с внутриутробной гипоксией / Астраханский медицинский журнал. – Астрахань. – 2007. - №2. – С.132-133. 22. Бисалиева Р.А., Кривенцев Ю.А., Яблокова И.Ю., Ким И.В., Вафина Р.А. Изучение подходов к выделению и очистке эмбрионального гемоглобина / Материалы конференции молодых ученых АГМА. – 2007. – С.30-31. 23. Кико Е.Е., Бисалиева Р.А., Кривенцев Ю.А., Ким И.В., Яблокова И.Ю., Вафина Р.А. Иммунохимическое определение эмбрионального гемоглобина у больных гемобластозами / Материалы VI Всероссийской конференции молодых ученых «Актуальные вопросы экспериментальной онкологии». – М. – 2007. – С.107-109. клинической и 40 24. Кривенцев Ю.А., Никулина Д.М., Бисалиева Р.А. человека // Вестник Астраханского Гемоглобины государственного технического университета. - Астрахань. – 2007. - №6. - Т.41. – С.34-41. 25. Кривенцев Ю.А., Никулина Д.М. Строение и биологическая роль белков гемоглобинового профиля / Гриф УМО 897 от 10.12.2007. Изд-во АГМА, Астрахань, 2007. 101 с. 26. Кривенцев Ю.А., Никулина Д.М., Бисалиева Р.А. Способ количественного определения фетального гемоглобина человека // Бюллетень «Изобретения. Полезные модели». - М. - 10.11.2007. - №31 (III ч.), С.666. 27. Никулина Д.М., Воробьева Т.Б., Кривенцев Ю.А. Стадиоспецифические белки как маркеры развития плода и состояния новорожденного // Материалы IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. – Новосибирск. – 2008. – С.474. 28. Бисалиева Р.А., Кривенцев Ю.А., Краморенко П.В. Иммунохимический анализ продукции фетального гемоглобина в раннем эмбриогенезе человека // Материалы конференции молодых ученых ГОУ ВПО «АГМА Росздрава». – Астрахань. – 2008. – С.4-6. 29. Бисалиева Р.А., Кривенцев Ю.А., Никулина Д.М., Краморенко П.В., Дьячкова Т.Б. гемоглобинов Иммунохимический в раннем анализ эмбриогенезе продукции человека антенатальных // Российский иммунологический журнал (РАН). – М. «Наука». 2008. – Т.2(11), № 2-3. С. 327. 30. Кривенцев Ю.А., Никулина Д.М., Бисалиева Р.А. Моделирование нового способа определения плодового гемоглобина человека // Астраханский медицинский журнал. – Астрахань. – 2008. – Т.3. - №2. – С.53-55. 31. Кривенцев Ю.А., Бисалиева Р.А., Батуев Д.Г., Яблокова И.Ю., Вафина Р.А.., Мустафаев И.М.-А. Пополнение сведений по физико- химическим свойствам гемоглобина типов: A1, A2, F и P // Материалы 6-й международной научно-практической конференции «Достижения 41 фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины». – Астраханский медицинский журнал. Астрахань-Москва. 2008. Т.3. №3. С.20-22. 32. Кривенцев Ю.А., Никулина Д.М., Заклякова Л.В., Бисалиева Р.А., Борисова Н.В., Кико Е.Е., Ким И.В. Иммунохимический тест на антенатальные гемоглобины в гематологии // Материалы 6-й международной научнопрактической конференции «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины». – Астраханский медицинский журнал. – Астрахань-Москва. – 2008. – Т.3. - №3. – С.106-110. 33. Коханов А.В., Никулина Д.М., Кривенцев Ю.А., Белопасов В.В., Метелкина Е.В. Фетальный гемоглобин как маркер гипоксии при черепномозговой травме // Материалы 6-й международной научно-практической конференции «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины». – Астраханский медицинский журнал. – АстраханьМосква. – 2008. – Т.3. - №3. – С.171-173. 34. Никулина Иммунохимический внедрения.// Д.М., тест Материалы Кривенцев на 6-й примитивный Ю.А., Бисалиева гемоглобин: международной Р.А. перспективы научно-практической конференции «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины». – Астраханский медицинский журнал. – АстраханьМосква. – 2008. – Т.3. - №3. – С.185-188. 35. Бисалиева Р.А., Кривенцев Ю.А., Бисалиев Р.В., Кальной В.С. Иммунохимический анализ фетального гемоглобина в крови наркологических больных // Наркология. – М. – 2009. - №1(85). – С.95-97. 36. Кривенцев Ю.А., Бисалиева Р.А., Никулина Д.М. Модификация способа количественного анализа эмбрионального гемоглобина человека // Материалы межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные проблемы кардиологии детей и взрослых-2009». – Астрахань. 2009. С.138-140. 37. Бисалиева Р.А., Штепо М.В., Кривенцев Ю.А., Никулина Д.М. Железосодержащие белки в крови новорожденных с внутриутробной гипоксией 42 // Материалы международна наукова конференцiя студентiв та молодих вчених «Молодь медицинi майбутнього». – Одесса. – 2009. – С.71. 38. Кривенцев Ю.А., Бисалиева Р.А., Никулина Д.М., Носков А.И. Разработка оптимального алгоритма для создания иммунохимической тестсистемы на примитивный гемоглобин человека // Вестник российской военномедицинской академии. - С.-Пб. – 2009. - №1(25). – С.450. 39. Никулина Д.М., Кривенцев Ю.А., Бахмутова Л.А., Бисалиева Р.А., Лапеко С.В. Эмбриональный гемоглобин как критерий оценки гипоксии новорожденных // Вестник российской военно-медицинской академии. - С.-Пб. – 2009. - №1(25). – С.450-451. 40. Бахмутова Л.А., Кривенцев Ю.А., Никулина Д.М., Лапеко С.В., Бисалиева Р.А. Антенатальные гемоглобины в оценке течения раннего неонатального периода у новорожденных с задержкой внутриутробного развития // Вестник российской военно-медицинской академии. - С.-Пб. – 2009. - №1(25). – С.451. 41. Бахмутова Л.А., Никулина Д.М., Кривенцев Ю.А. Клиническое значение изучения антенатальных типов гемоглобина для прогноза ранней адаптации у недоношенных новорожденных детей // Вопросы современной педиатрии. – 2009. – Т.8. - №2. – С.120-122. Патент на изобретение Кривенцев Ю.А., Никулина Д.М., Бисалиева Р.А. Способ количественного определения фетального гемоглобина человека // Патент на изобретение №2310204. Зарегистрировано изобретений РФ 10.11.2007. г. Москва. – 7 с. в Государственном реестре 43 Список использованных сокращений Hb гемоглобин HbA1 и HbA2 гемоглобины взрослого HbP эмбриональный или примитивный гемоглобин HbF фетальный гемоглобин pI изоэлектрическая точка νвну внутригрупповая степень свободы АФП альфа-фетопротеин ВГ внутриутробная гипоксия ГВ гестационный возраст ГПХ (ГФ) гель-проникающая хроматография (гель-фильтрация) ДСН додецилсульфат натрия ЗВУР задержка внутриутробного развития ИДА иммунодиффузионный анализ ИФА иммуноферментный анализ ИХ ионообменная хроматография ИХА иммунохимический анализ ОЭП относительная электрофоретическая подвижность ПААГ полиакриламидный гель ПАВ психоактивные вещества ПК пуповинная кровь РИД радиальная иммунодиффузия 44 КРИВЕНЦЕВ Юрий Алексеевич ГЕМОГЛОБИНЫ ЧЕЛОВЕКА: ИММУНОБИОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ 03.00.04. ─ Биохимия Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук Тираж 100 экз. Подписано в печать 14.09.09 г. Заказ № 2679 Издательство ГОУ ВПО «Астраханская государственная медицинская академия Росздрава», 414000, г. Астрахань, ул. Бакинская, 121
