эмбрионального и фетального гемоглобинов

На правах рукописи
Бисалиева Рината Альбкалиевна
ИММУНОХИМИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ
ЭМБРИОНАЛЬНОГО И ФЕТАЛЬНОГО ГЕМОГЛОБИНОВ
НА РАННИХ ЭТАПАХ ОНТОГЕНЕЗА
03.00.04 – биохимия
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Краснодар 2009
2
Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Астраханская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (ГОУ ВПО АГМА Росздрава)
Научный руководитель:
доктор медицинских наук, доцент
Никулина Дина Максимовна
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор
Павлюченко Иван Иванович
доктор медицинских наук, профессор
Ефременко Виталий Иванович
Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение
высшего профессионального образования «Самарский государственный
медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и
социальному развитию» (ГОУ ВПО «СамГМУ Росздрава», г. Самара)
Защита состоится 20 ноября 2009 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 208.038.02 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Кубанский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (ГОУ ВПО КГМУ Росздрава) (350063 г.
Краснодар, ул. Седина, 4, тел. {861} 262-73-75).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО КГМУ Росздрава.
Автореферат разослан «___» _________ 2009 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета
Д 208.038.02 профессор
Л.А. Скорикова
3
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования. Исследования процесса внутриутробного развития человека представителями различных специальностей в течение длительного времени не снизили актуальности этой проблемы [И.В.
Алексеев и соавт., 1995; С.Б. Назаров, Л.С. Горожанин, 1996]. Появление
современных технологий позволяет изучать и детализировать на новом
уровне условия и факторы, влияющие на развитие плода [А.В. Лукьяненко,
1987].
В результате дифференциальной активности генов в процессе онтогенеза изменяется качественный набор белков. С этой точки зрения хрестоматийным примером является гетерогенная система гемоглобина, определяемая цепями глобина α, β, γ, ε, соотношение которых в крови существенно изменяется в процессе индивидуального развития организма, а также
при патологических состояниях. Субъединицы глобина, являющиеся продуктами активности структурных генов, при различных сочетаниях определяют тип гемоглобина: эмбриональный (HbP) – ε4, α 2ε2; фетальный
(HbF) – α2γ2; взрослый (HbA1) – α2β2. Поэтапная смена данных типов гемоглобина обусловлена изменением гомеостатических условий организма в
процессе онтогенеза с преимущественным функционированием более приспособленного к этим условиям типа [Н.Ф. Стародуб, Ю.Н. Токарев, 1986;
Н.Ф. Стародуб, 1987; А.Ф. Топунов, Н.Э. Петрова, 2001].
Особый интерес представляет изучение антенатальных гемоглобинов:
эмбрионального и фетального, являющихся основными типами во внутриутробном периоде развития человека. Несмотря на значительное число работ, посвященных изучению разных типов гемоглобина в онтогенезе и при
патологии, в литературе описаны лишь некоторые физико-химические
свойства фетального гемоглобина, которые носят противоречивый характер, и практически нет данных по эмбриональному гемоглобину. Определена клинико-диагностическая ценность фетального гемоглобина при ряде
4
патологических состояний, сопровождающихся перестройками интенсивности кроветворения и оксигенации тканей [Г.И. Козинец, 1980; О.Н. Дьякова, 1999; Д.М. Никулина и соавт., 2002; А.Б. Агапова, 2003; А.Б. Агапова, Д.М. Никулина, Т.Н. Панова, 2003]. В последнее время появились сведения об использовании HbF в качестве «индикатора» процесса развития
некоторых онкологических заболеваний человека [M. Wolk, J.E. Martin, R.
Constantin, 2004]. Прикладная значимость эмбрионального гемоглобина до
сих пор остается не изученной, что связано с устоявшимся мнением об отсутствии у этого белка диагностической ценности, так как активность его
гена полностью репрессирована как у детей, так и у взрослых. Хотя в литературе имеются единичные сведения о возобновлении синтеза этого белка
у недоношенных детей с аномалиями развития [Е.Ф. Морщакова, А.Д.
Павлов, А.Г. Румянцев, 1999]. Следует отметить, что в доступной литературе мы не нашли работ по иммунохимическому изучению продукции
этих белков в онтогенезе. В этой связи представленная работа является актуальной и имеет важное научное и практическое значение.
Цель исследования. Получить новые данные о свойствах, динамике
синтеза на ранних этапах анте- и постнатального онтогенеза и возможном
клиническом использовании эмбрионального и фетального типов гемоглобина.
Задачи исследования:
1. Определить и уточнить физико-химические свойства эмбрионального и фетального типов гемоглобина.
2. Разработать способ выделения и очистки эмбрионального гемоглобина и модифицировать способ выделения и очистки фетального гемоглобина.
3. Смоделировать моноспецифические иммунодиффузионные тестсистемы на эмбриональный и фетальный гемоглобины.
5
4. Определить уровень HbP и HbF в различные сроки анте- и постнатального онтогенеза человека, в том числе при осложненном развитии плода.
Научная новизна работы: Впервые разработан алгоритм выделения
и очистки эмбрионального гемоглобина. Впервые получена и апробирована иммунохимическая тест-система на эмбриональный гемоглобин. Разработан способ количественного определения фетального гемоглобина. Проведен количественный иммунохимический анализ динамики продукции
эмбрионального и фетального гемоглобинов на ранних этапах анте- и
постнатального онтогенеза человека и установлены особенности их синтеза при осложненном развитии плода.
Научно-практическая значимость
Разработанный метод выделения и очистки эмбрионального гемоглобина и модифицированный метод выделения и очистки фетального гемоглобина позволяют экономить исходный биоматериал, реактивы, временные и финансовые ресурсы. Полученные белковые препараты Hb могут
быть использованы для научных исследований и для практического применения.
Результаты изучения биосинтеза эмбрионального и фетального гемоглобинов в онтогенезе могут служить основой для дальнейших исследований, в ходе которых будут разработаны алгоритмы оценки состояния
эритрона при различной патологии.
Выявленные качественные и количественные изменения гемоглобинового
спектра у недоношенных детей могут быть использованы в качестве маркера
степени зрелости и оценки тяжести гипоксии новорожденных.
Внедрение результатов работы: Результаты работы используются при
обучении студентов, интернов, ординаторов, аспирантов и слушателей
курсов ФПО на кафедрах биохимии с курсом клинической лабораторной
диагностики, сестринского дела и ухода за больными с курсом перинато-
6
логии, педиатрии лечебного факультета ГОУ ВПО АГМА Росздрава.
Разработанные иммунохимические тест-системы на эмбриональный и фетальный гемоглобины используются для оценки состояния новорожденных детей в
МУЗ «Клинический родильный дом» г. Астрахани.
В 2007 и 2008 годах новые способы и иммунохимические тестсистемы для лабораторной оценки состояния новорожденных, включающие результаты данного исследования, были удостоены 2 золотых медалей
на VII и VIII Московских международных салонах инноваций и инвестиций. В 2007 году инвестиционный проект «Новые иммунохимические тестсистемы для лабораторной диагностики осложненного течения беременности, гипоксии и деструктивных процессов» был представлен на выставке:
«Инновационные достижения России» XI Петербургского международного
экономического форума.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
1. Выявленные физико-химические особенности HbP и HbF по подвижности в носителях и отношению к осаждающим агентам служат основой
разработанных способов их выделения и очистки.
2. Смоделированные иммунохимические тест-системы на HbP и HbF
для качественного и количественного анализа их продукции в биологических объектах позволили уточнить динамику изменений концентрации
HbP и HbF на этапах развития эмбриона и плода, выражающейся в разнонаправленном характере с 5 по 12 недели гестации.
3. Уровни HbP и HbF у недоношенных детей зависят от гестационного
возраста и особенностей течения неонатального периода и могут служить
маркером степени зрелости плода, тяжести внутриутробной гипоксии.
Апробация результатов исследования. Материалы диссертации доложены и обсуждены на научных заседаниях кафедры биологической химии с курсом клинической лабораторной диагностики ГОУ ВПО АГМА Росздрава, на
проблемных комиссиях ГОУ ВПО АГМА Росздрава, на итоговых и темати-
7
ческих конференциях ГОУ ВПО АГМА Росздрава; на 5-й и 6-й научнопрактических конференциях с международным участием «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины», Астрахань-Москва,
2006, 2008; на международной научной конференции, посвященной 450-летию города Астрахани, Астрахань, 2007; на международной научной конференции «Молодежь – медицине будущего», Одесса, 2009.
Результаты работы были представлены на IV международном конкурсе
научных работ молодых ученых журнала «Лечащий врач», Москва, 2007.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 24 научные работы, из них 2 в журналах, рекомендованных ВАК для публикации результатов, полученных при выполнении диссертаций на соискание ученой степени кандидата медицинских наук, получен 1 патент на изобретение.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 123
страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, методического раздела, результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, приложения. Библиография включает в себя 127 отечественных и 56 зарубежных источников. Иллюстрированный материал представлен 17 таблицами,
21 рисунком.
Диссертационная работа выполнена на базе кафедры биохимии с
курсом КЛД ГОУ ВПО «Астраханская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» в соответствии с планом научных исследований в рамках внутривузовской научной комплексной работы «Изучение диагностической значимости иммунохимических тест-систем на железосодержащие белки человека при соматической патологии» (КОД ГАСНТИ 31.27.03), номер государственной регистрации 01200614203.
8
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материал и методы исследования. Объектом исследования явились эмбриональный и фетальный гемоглобины человека в эмбриональных
тканях, выделенных из абортивного материала от женщин со сроком беременности 4–12 недель, и в крови новорожденных различных периодов гестации.
Для решения поставленной задачи было исследовано:
- 126 образцов эмбриональных тканей, распределенных по 9 группам
в зависимости от срока эмбриогенеза (в неделях);
- 145 образцов пуповинной крови (ПК) новорожденных детей, составивших три группы: 52 доношенных здоровых ребенка; 14 новорожденных
с гестационным возрастом (ГВ) 28-31 недели; 31 - с ГВ 32-34 недели; 48 –
с ГВ 35-36 недель.
- 78 образцов венозной крови недоношенных детей (две группы с ГВ
28-34 и ГВ 35-36 недель) с различными проявлениями гипоксии.
Все 349 образцов исследуемого материала были протестированы на
содержание HbP и HbF иммунодиффузионными методами с помощью авторских тест-систем.
В работе использовали иммунохимические и биохимические методы
исследований (солевое осаждение, гель-проникающая и ионообменная
хроматография; иммунизация лабораторных животных и моделирование
тест-систем; различные виды иммуноэлектрофореза и т.д.), а также статистические методы.
Приготовление антигенов (Аг) и получение антисывороток (Ас) для
создания моноспецифических тест-систем на HbP и HbF наряду с их конструированием составило существенную часть собственных исследований.
В качестве Аг использовали белковые препараты, полученные из биологических образцов крови и тканей сочетанием методов высаливания,
гель-проникающей и ионообменной хроматографии. Исходным биомате-
9
риалом для выделения и очистки HbP служил абортивный материал от беременных женщин сроком 7-9 недель.
Исходным биоматериалом для выделения и очистки HbF служила пуповинная кровь, собранная в родах и помещенная в пластиковые одноразовые пробирки с антикоагулянтом (10 мкл 10% ЭДТА на 1 мл крови) для
предотвращения образования сгустка. Фракцию эритроцитов отмывали от
примеси сывороточных белков путем многократного центрифугирования
при 3000 об/мин в течение 20 мин и повторного их ресуспендирования в
изотоническом растворе NaCl (0,15 М).
Вследствие трудностей получения плодовых тканей после 12-й недели
гестации изучение продукции антенатальных типов гемоглобина у плодов
проводили в ПК недоношенных детей. Поскольку ПК идентична крови
плода того ГВ, при котором произошли роды, то изучение гемоглобинового спектра в ПК недоношенных новорожденных разных сроков гестации
может дать ценную информацию о развитии кроветворения в позднем фетогенезе.
Идентификацию Аг проводили классическими иммунохимическими
методами: двойной встречной иммунодиффузией в агаровом геле по Оухтерлони и методом радиальной иммунодиффузии по Манчини в модификации Фехей и Мак-Келви.
Процесс получения Ас состоял из следующих этапов: приготовления
иммунизирующего Аг (иммуногена); иммунизации животного; оценки полученной Ас.
Результаты исследований были обработаны с помощью пакета статистического анализа Statistica 6, SPSS V 10.0.5, программ «STATLAND»,
«EXСEL-97», «Basic Statistic» c учетом стандартных методик вариационной статистики, включая вычисление критерия t Стьюдента для оценки достоверности различий. Данные представлены в виде М±m, различия считались статистически достоверными при p≤0,05.
10
Результаты исследования и их обсуждение. В соответствии с задачами
исследования
были
изучены
иммунохимические
и
физико-
химические свойства HbP и HbF, разработаны оптимальные способы их
выделения и очистки, с последующим получением моноспецифических Ас
и формированием тест-систем на HbP и HbF.
Определены особенности физико-химических свойств разных типов
Hb путем осаждения сульфатом аммония, ацетоном, разбавленными растворами кислот и щелочей. Проведено изучение относительной электрофоретической подвижности (ОЭП) HbA1, HbA2, HbF и HbP в полиакриламидном (ПААГ) и агарозном гелях. С помощью метода изоэлектрофокусирования в ПААГ были определены отдельные изоформы гемоглобинов по
pI (изоэлектрическая точка). Этот параметр, также как и ОЭП, характеризует поверхностный заряд макромолекул. Установленные нами различия в
физико-химических характеристиках HbF и HbP, легли в основу разработанных нами методов их выделения и очистки (табл. 1).
Наиболее целесообразным для выделения HbP и HbF является сочетание методов щелочного осаждения и ионообменной хроматографии. Основные этапы выделения препаратов HbP и HbF и количественные характеристики процесса представлены в таблицах 2, 3. Новые способы выделения и очистки воспроизводимы, доступны, не требуют расхода дорогостоящих реактивов и позволяют получать HbP и HbF человека в любых количествах для аналитических и препаративных целей.
Анализ чистоты полученных препаратов осуществляли методом вертикального электрофореза в ПААГ (рис. 1, 2).
Разработанные схемы выделения препаратов HbP и HbF обладают
достаточно высокими суммарными количественными показателями, в
частности, степенью очистки и итоговым выходом конечного продукта.
11
Таблица 1
Сравнительный анализ физико-химических свойств гемоглобинов,
полученных самостоятельно и другими авторами
Ф/х свойства
Растворимость в воде
Отнощение к сульфату
аммония (в % насыщенности): оптимум осаждения
диапазон осаждения
Относительная электрофоретическая подвижность по альбумину:
в агарозе
в ПААГ
Изоэлектрическая точка
Резистентность к действию щелочей
Пероксидазная и каталазная активность
Характеристические
окраски:
белки (амидочерный)
общее железо (красная
кровяная соль)
гемоглобины (бензидин,
гваякол)
гликопротеиды (Шифф)
липопротеиды (судан)
Гомогенность
при э/ф в агарозе
в ПАА Г
HbA1
HbA2
HbF
HbP
+
+
+
+
55*
50*
70*
65*
30-65*
30-65*
40-80*
35-80*
0,258±0,009*
0,29-0,30**
0,610±0,022*
0,63-0,68**
7,0*
6,95-7,18**
Неустойчив***
0,206±0,007*
-****
0,537±0,020*
0,51-0,525**
7,3*
7,4-7,6**
Неустойчив***
0,217±0,008*
0,30-0,35**
0,512±0,019*
0,50-0,52**
7,1*
6,9-7,15**
Устойчив***
Активен***
Активен***
Активен***
+***
+***
+***
+***
+***
+***
+***
+***
+***
+***
+***
+***
-***
-***
-***
-***
-***
-***
-***
-***
Гомогенен ***
Гомогенен ***
Гомогенен ***
Гомогенен ***
Гомогенен ***
Гомогенен ***
0,309±0,0*
-****
0,679±0,024*
-****
6,85*
-****
Относительно устойчив*
Устойчив**
Активен***
Гомоген. ***
Гетерог. ***
* - собственные данные
** - данные других авторов (Стародуб Н.Ф. (1987), Иржак Л.И. (1985))
*** - собственные и литературные данные совпадают
**** - данные в литературе отсутствуют
12
Таблица 2
Этапы выделения HbP
Основные этапы выделения
Общий
белок,
мг/л
165000
36000
Исходный материал
Гомогенизация и экстрагирование
Щелочное осаждение
Ионообменная хроматография
5450
1770
Кол-во Целевой Степень
продукта, продукт, очистки
мг/л
%
HbР
1850
1,12
1
960
2,66
2,38
630
565
11,56
31,92
10,32
28,50
Выход
HbР (%)
100
51,89
34,05
30,54
Рис. 1. Анализ чистоты полученного препарата HbP
1. Очищенный препарат HbP
2. Гемолизат эритроцитов донора
3. Полуочищенный препарат HbF
Таблица 3
Этапы выделения HbF
Основные этапы выделения
Исходный материал
Общий Кол-во Целевой
белок, продукта, продукт,
мг/л
мг|л
%
240000
3750
1,61
Степень Выход
очистки HbF (%)
HbF
1
100
Получение гемолизата
128000
3100
2,42
1,5
82,66
Щелочное осаждение
4650
2800
60,21
37,40
76,66
Ионообменная хроматография
2900
2540
85,58
53,16
67,73
13
Рис.2. Анализ чистоты полученного препарата HbF
1 - Гемолизат пуповинной крови;
2 – альбумин;
3 – очищенный препарат HbF;
4 – полуочищенный препарат.
Полученные препараты HbP и HbF использовали для иммунизации
кроликов и получения моновалентных Ас на эмбриональный и фетальный
гемоглобины. Их иммунная специфичность к HbР и HbF доказана сопоставлением в ИДА (иммунодиффузионный анализ) с различными антигенами (рис. 3, 4).
Рис.3. Контроль специфичности антисыворотки на эмбриональный
гемоглобин
1 - антисыворотка на эмбриональный гемоглобин;
2 – антисыворотка на HbF;
3 – неудавшаяся антисыворотка на HbP;
4 – гемолизат пуповинной крови;
5 – очищенный препарат HbA1;
6 - экстракт тканей эмбриона 7-8 нед.;
Э - очищенный препарат HbP;
Sd – сыворотка крови взрослого донора;
Г – гемолизат крови взрослого донора.
Линии преципитации давали положительное окрашивание бензидином и гваяколом, что подтверждало еще раз гемоглобиновую природу антигена и доказывало специфичность полученной антисыворотки.
14
В редких случаях при взаимодействии с другими антигенами проводили дробное истощение антисывороток соответствующими белковыми
фракциями. После каждого истощения проводили повторный контроль Ас
путем иммунодиффузии (рис.5).
Рис.4. Контроль специфичности антисыворотки на фетальный гемоглобин
1 - антисыворотка на HbF; 2 – гемолизат пуповинной крови;
3 – очищенный препарат HbF; 4 – очищен. препарат HbA1;
5 – очищенный препарат HbA2; 6 – очищен. препарат HbР;
7 – сыворотка крови донора.
Рис. 5. Истощение антисыворотки на фетальный
гемоглобин
1 – неистощенная антисыворотка;
2 – истощенная антисыворотка на HbF;
3 – антисыворотка на альфафетопротеин;
4 – гемолизат крови плода 28 нед.;
Sd – сыворотка крови взрослого донора.
Сопоставление полученных моновалентных антисывороток на HbР и
HbF в ИДА давало полное перекрещивание преципитационных линий (рис.
6), что служило доказательством неидентичности полученных антисывороток.
Важным этапом контроля специфичности являлось сопоставление
полученной антисыворотки с эталонной антисывороткой на фетальный
гемоглобин, полученной ранее в научной лаборатории кафедры биохимии
с курсом КЛД АГМА (г. Астрахань). Эталонная антисыворотка на HbF
была получена иммунизацией кролика очищенным препаратом HbF, для
подтверждения чистоты которого был проведен анализ N-концевых аминокислот в Институте молекулярной биологии РАН, г. Москва.
15
Рис. 6. Контроль специфичности антисывороток на
HbP и HbF
1 –антисыворотка на HbF;
2 - антисыворотка на HbР;
3 – сывороточный альбумин;
4 – очищенный препарат HbA1;
5 – экстракт тканей эмбриона 10-12 недель.
Путем подбора эквивалентных разведений антигена и антисыворотки
сформированы моновалентные иммунохимические тест-системы для количественного определения HbР и HbF.
Для моделирования моновалентных иммунохимических тест-систем
разводили препарат HbP или экстракт тканей эмбриона (7-9 недель). Причем рабочим разведением очищенного препарата являлось ½, экстракта 1/8-1/16 . Чувствительность смоделированных тест-систем составила от 4
до 5 мг/л.
В зависимости от качества Ас были разработаны тест-системы на HbF
с близкой чувствительностью в диапазоне от 2 до 3 мг/л, в которых тестантигеном являлся гемолизат пуповинной крови в рабочем разведении:
1/256-1/512. Характеристика моноспецифических антисывороток на HbP и
HbF представлена в таблицах 4,5.
Полученные тест-системы позволяют определять содержание HbP методом иммунодиффузионного титрования в агаре по Оухтерлони в модификации Храмковой и Абелева с последующей полуколичественной оценкой результатов реакции (рис. 7).
Рис. 7. Полуколичественный анализ HbP методом
титрования в РИД по Оухтерлони
1 – моновалентная антисыворотка на HbP;
2 и 5 – тест-антиген (HbP в рабочем разведении);
3, 4, 6, 7 – исследуемая проба в разведении 1; 1/2; 1/4;
1/8 соответственно.
16
Таблица 4
Характеристика полученных тест-систем на HbP
Шифр Ас
Разведение антигена
Макси- Оптимальное мальное
Максимальное разведение антисыворотки
Абсолютная
чувствительность тестсистем (мг/л)
As 31 (II)
1/64
1/4-1/8
1/2
5
Наличие дополнительных линий
преципитации
нет
As 433 (III)
1/64
1/8-1/16
1/4
4
нет
Количественное определение HbF проводили методом радиальной
иммунодиффузии по Манчини. По стандартным образцам строили кривую
зависимости квадрата диаметра кольца преципитации от концентрации антигена. По калибровочной кривой рассчитывали концентрацию HbF в
опытных пробах. При этом для каждой антисыворотки необходимо построение собственной калибровочной кривой.
Таблица 5
Характеристика полученных тест-систем на HbF
Шифр Ас
Разведение антигена
МаксиОптимальное
мальное
Максимальное
разведение
антисыворотки
As39 (I)
1/1000
1/64
1/16
Абсолютная чувствительность тестсистем
(мг/л)
3
Наличие дополнительных линий
преципитации
As39 (II)
1/2000
1/128
1/16
3
нет
As41 (I)
1/4000
1/256
1/16
2
нет
As41 (II)
1/4000
1/128
1/16
2
нет
нет
Для количественного определения HbF был разработан способ с использованием метода ракетного электрофореза в агаровом геле в варианте
Laurell C.B. и Merrill D. с предварительной обработкой препаратов HbF
раствором ДСН (додецилсульфата натрия) (рис. 8). Связано это с тем, что
гемоглобин имеет меньшую электрофоретическую подвижность в агаро-
17
вом носителе, чем IgG, что усложняет образование пиков преципитации.
ДСН, абсорбируясь на молекуле гемоглобина, придает ему выраженный
отрицательный заряд, что увеличивает электрофоретическую подвижность
к аноду.
Опытным путем отрабатывали оптимальное образование пиков преципитации с подбором состава, ионной силы и рН рабочего буфера и концентрация обрабатывающего вещества (ДСН), а также рабочие разведения
исследуемых образцов. Высоту пиков преципитации соотносили с разведениями стандартного HbF и по этим данным строили калибровочную
кривую.
Рис.8. Количественное определение HbF
методом ракетного электрофореза:
1-2 – образцы HbF, не обработанные ДСН;
3-7 – образцы HbF, обработанные ДСН
Анализ качества разработанного способа показал следующие его преимущества: регистрацию только фетального гемоглобина, обеспечиваемую
специфичностью моновалентной антисыворотки к HbF; высокую чувствительность метода (нижний порог чувствительности 1,7±0,29 мг/л).
Результаты количественного определения HbP и HbF в 126 образцах
эмбриональных тканей, разделенных на 9 групп в зависимости от срока гестации, представлены на рис. 9.
Динамика количественных изменений HbР и HbF носила разнонаправленный характер: уровень HbР плавно снижался, составляя при 8
неделях ГВ всего 12% от максимального значения, а HbF – к 12 неделям
18
возрастал в 4 раза по сравнению с исходными значениями. Такое угасание
синтеза HbР объясняется начавшимися после 5-й недели внутриутробного
развития атрофическими процессами в желточном мешке, который является местом синтеза данного белка. Синтез HbF, по мнению Н.А. Торубаровой (1991), связан с новым этапом в развитии гемопоэза – эмбриональное и
фетальное кроветворение наступает с 5-ой недели и продолжается до конца гестационного периода, но в отличие от внеэмбрионального имеет органную локализацию – печень, функционирующую наиболее активно после 12-й недели внутриутробного периода.
80
концентрация (мг/л)
70
60
50
HbP
40
HbF
30
20
10
0
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Срок гестации (недели)
Рис 9. Анализ концентраций эмбрионального и фетального
типов гемоглобина в раннем эмбриогенезе человека
Изучение HbP и HbF в пуповинной крови новорожденных позволило
установить наличие фетального гемоглобина в 100 % случаев (табл. 6).
Выявлено значительное повышение концентрации HbF в группе недоношенных детей на фоне достоверной обратной зависимости от сроков гестации, что соответствует представлениям о динамике синтеза фетального
гемоглобина, уровень которого резко снижается после рождения. Наиболее
низкое содержание HbF было обнаружено у здоровых доношенных ново-
19
рожденных детей, у которых анте- и интранатальный период прошли без
осложнений – 109,67±4,4 мг/л, наиболее высокие у глубоконедоношенных
новорожденных (28-31 недели) - 412±17,4 мг/л.
HbP обнаруживали в значительной части, но не во всех образцах крови. Число отрицательных случаев нарастало с увеличением ГВ недоношенных новорожденных. В крови доношенных здоровых детей HbP при
уровне чувствительности примененного метода не был обнаружен ни в одном случае.
Таблица 6
Содержание HbP и HbF в пуповинной крови недоношенных детей
Кровь недоношенных
новорожденных
**
28 – 31 недели
***
32-34 недели
****
35-36 недель
Всего
*Кровь здоровых доношенных новорожденных
Концентрация HbP при
положительных результатах,
мг/л
14
4,64±0,78
n
Отрицательные
результаты
n
%
Концентрация HbF, мг/л
n
M±m
P
31
5,89±0,66
9
29,03
31
394±30,1
Р***<0,0
5
р*<0,001
48
4,48±0,48
12
25
48
368±34,1
р**<0,05
93
52
4
28,57
14
412±17,4
25
-
52
93
100
-
109,7±4,4
Обнаружены различия по частоте выявляемости HbP в гестационных
группах (табл. 7) в зависимости от концентрации. В группе с ГВ 28-34 недели превалировала частота выявления HbP на уровне 5-10 мг/л, а в группе
с ГВ 35-36 недель лишь на уровне 2,5 мг, что может служить показателем
зрелости и адаптационных возможностей плода к внеутробному существованию.
20
В связи с этим было проведено сопоставление средних концентраций
HbP в крови у недоношенных и особенностей течения раннего неонатального периода. Обоснованным представлялось изучение связи содержания
HbP в крови детей с различными проявлениями гипоксии ЦНС. Для этого
мы исследовали 78 образцов венозной крови новорожденных, взятой в
первые сутки жизни.
Таблица 7
Зависимость частоты выявления HbP от его концентрации
в крови недоношенных новорожденных
Кровь недоношенных
новорожденных
n
28 – 31 недели
32-34 недели
28 – 34 недели
35-36 недель
14
31
45
48
Частота выявления HbP ( %)
при концентрации в мг/л
2-3
5
10
15
14,29
28,57
28,57
0,00
9,68
19,35
32,26
9,68
11,11
22,22
31,11
6,67
29,17
20,83
20,83
4,17
28-36 недель
93
20,43
21,51
25,81
5,38
Так, при гипоксически-ишемическом поражении ЦНС средние концентрации HbP почти в 2 раза были ниже, чем при более тяжелой патологии – гипоксически-геморрагическом поражении ЦНС, причем самая высокая концентрация 15 мг/л была обнаружена при ВЖК III-IV степени.
При исследовании уровня HbF в крови недоношенных новорожденных детей (ГВ 28-34 недели) с различными формами гипоксического поражения ЦНС выявлена наиболее высокая концентрация при гипоксически-ишемическом поражении ЦНС - 476,2±18,4 мг/л, что в 1,47 раза превышает
продукцию
фетального
гемоглобина
при
гипоксически-
геморрагическом поражении.
Следовательно, изменение уровней HbP и HbF, с одной стороны, может отражать степень зрелости новорожденного, с другой стороны, являться критерием оценки развития гипоксических состояний. Последний факт
требует дальнейших детальных исследований для формирования практических рекомендаций.
21
ВЫВОДЫ:
1. Установлено, что антенатальные типы гемоглобинов (HbР, HbF) отличаются по показателям относительной электрофоретической подвижности в агарозе и ПААГ, изоэлектрической точки, устойчивости к действию щелочей. Причем, HbР обладает менее выраженной щелочной
резистентностью, чем HbF.
2. Разработан способ выделения и очистки HbР и модифицирован алгоритм получения HbF на основе выявленных физико-химических особенностей изученных типов гемоглобина, в результате которых получены препараты достаточной степени чистоты для последующего использования их в качестве антигенов при иммунизации лабораторных животных.
3. Показана возможность использования смоделированных иммунохимических тест-систем на HbР и HbF для качественного и количественного
анализа их продукции в биологических объектах. В качестве тестантигенов при иммунодиффузии по Оухтерлони использованы очищенный препарат HbР или экстракт эмбриональных тканей, стандартом в
радиальной иммунодиффузии по Манчини и ракетном иммуноэлектрофорезе по Лоурелю - выделенный из пуповинной крови новорожденных
HbF.
4. Определенная иммунохимическим тестированием динамика продукции
эмбрионального Hb в период 4-12 недель гестации совпадает с литературными данными. Его максимальная концентрация наблюдалась в 5
недель, однако некоторые авторы указывают на 8 недель гестации. Изменения концентрации HbP и HbF с 5 по 12 недели имеют разнонаправленный характер.
5. Выявлено достоверное различие частоты выявления HbP на уровне 5-10
мг/л в группе недоношенных детей с ГВ 28-34 недели (в 1,5 раза выше)
по сравнению с группой гестационного возраста 35-36 недель. Уровень
22
HbF у недоношенных детей с ГВ 28-31 недели в 3,8 раза, ГВ 32-34 недели – в 3,6 раза, ГВ 35-36 недель – в 3,4 раза выше, чем в группе доношенных новорожденных детей.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
1. Иммунохимическая идентификация HbР и HbF является преимущественной по сравнению с рутинными методами. Количественное определение HbF можно проводить методом Манчини или иммуноэлектрофорезом по Лоурелю с предварительной обработкой исследуемых образцов ДСН.
2. Смоделированные иммунохимические тест-системы на HbP и HbF следует применять для выявления антенатальных типов гемоглобина в
биологических образцах для оценки степени зрелости плода.
3. Результаты определения динамики продукции HbР и HbF в онтогенезе
могут быть использованы как исходные данные для дальнейшего изучения состояния эритрона при патологических состояниях.
РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:
1. Бисалиева Р.А., Кривенцев Ю.А., Никулина Д.М., Краморенко П.В. Разработка способа выделения эмбрионального гемоглобина и моделирование
иммунохимической тест-системы на // Материалы научно-практической
конференции с международным участием «Достижения фундаментальных
наук в решении актуальных проблем медицины». – Астрахань-ВолгоградМосква. – 2006. - С. 34-37.
2. Кривенцев Ю.А., Бисалиева Р.А., Никулина Д.М., Краморенко П.В., Семенова Т.Б. Иммунохимический анализ продукции эмбрионального гемоглобина в раннем эмбриогенезе человека // Материалы научнопрактической конференции с международным участием «Достижения
фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины». – Астрахань-Волгоград-Москва. – 2006. – С. 58-62.
3. Кривенцев Ю.А., Бисалиева Р.А., Ковалева Н.А., Лада Л.В. Получение
специфической антисыворотки на фетальный гемоглобин // Материалы
научно-практической конференции с международным участием «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины».
– Астрахань-Волгоград-Москва. – 2006. – С. 62-65.
23
4. Кривенцев Ю.А., Никулина Д.М., Бисалиева Р.А., Пичугина Н.А. Разра-
ботка способа количественного определения фетального гемоглобина человека // Материалы научно-практической конференции с международным
участием «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных
проблем медицины». – Астрахань-Волгоград-Москва. – 2006. – С. 65-68.
5. Никулина Д.М., Кривенцев Ю.А., Бахмутова Л.А., Бисалиева Р.А., Штепо М.В., Лапеко С.В. Определение эмбрионального гемоглобина в крови
новорожденных с внутриутробной гипоксией // Материалы научнопрактической конференции с международным участием «Достижения
фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины». – Астрахань-Волгоград-Москва. – 2006. – С. 72-73.
6. Кривенцев Ю.А., Бисалиева Р.А., Носков И.А. Изучение воздействия детергентов на эмбриональный гемоглобин // Вестник Астраханского государственного технического университета. – 2006. - №6. - Т. 35. – С. 69-72.
*7. Кривенцев Ю.А., Никулина Д.М., Бисалиева Р.А. Иммунохимический
анализ концентрации фетального гемоглобина в крови новорожденных
мальчиков и девочек с внутриутробной гипоксией // Омский научный
вестник. – 2006. - №9. – Т.46. – С. 272-274.
*8. Кривенцев Ю.А., Никулина Д.М., Бисалиева Р.А., Борисова Н.В. Иммунохимический анализ содержания эмбрионального гемоглобина в крови
больных с онкогематологической патологией // Омский научный вестник.
– 2006. - №8-1. – С. 279-281.
9. Кривенцев Ю.А., Никулина Д.М., Бисалиева Р.А., Борисова Н.В. Экспрессия ε-гена эмбрионального гемоглобина при гематологической патологии // Успехи современного естествознания. – М. – 2007. - №3. – С. 7275.
10. Кривенцев Ю.А., Бисалиева Р.А., Семенова Т.Б., Никулина Д.М., Краморенко П.В. Изучение относительной электрофоретической подвижности
анте- и постнатальных типов гемоглобина человека // Астраханский медицинский журнал. – 2007. – Т. 2. - №2. – С. 102.
11. Никулина Д.М., Кривенцев Ю.А., Бахмутова Л.А., Бисалиева Р.А., Лапеко С.В., Штепо М.В., Огуль Л.А. Фетальный и эмбриональный типы гемоглобина в крови новорожденных с внутриутробной гипоксией // Астраханский медицинский журнал. – 2007. – Т. 2. - №2. – С. 132-133.
12. Бисалиева Р.А., Кривенцев Ю.А., Яблокова И.Ю., Ким И.В., Вафина
Р.А. Изучение подходов к выделению и очистке эмбрионального гемоглобина // Материалы конференции молодых ученых АГМА. – 2007. – С. 3031.
13. Кико Е.Е., Бисалиева Р.А., Кривенцев Ю.А., Ким И.В., Яблокова И.Ю.,
Вафина Р.А. Иммунохимическое определение эмбрионального гемоглобина у больных гемобластозами // Материалы VI Всероссийской конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной онкологии». – М.: НИА-Природа 2007. – С. 107-109.
24
14. Кривенцев Ю.А., Никулина Д.М., Бисалиева Р.А. Способ количественного определения фетального гемоглобина человека. Патент № 2310204
РФ (7 с.).- Приоритет от 13.03.2006.- Опубл. 10.11.2007.- БИ № 31 (III ч.).
15. Бисалиева Р.А., Кривенцев Ю.А., Краморенко П.В. Иммунохимический
анализ продукции фетального гемоглобина в раннем эмбриогенезе человека // Материалы конференции молодых ученых ГОУ ВПО «АГМА Росздрава». – Астрахань. – 2008. – С. 4-6.
16. Бисалиева Р.А., Кривенцев Ю.А., Никулина Д.М., Краморенко П.В.,
Дьячкова Т.Б. Иммунохимический анализ продукции антенатальных гемоглобинов в раннем эмбриогенезе человека // Российский иммунологический журнал (РАН). – М. «Наука». – 2008. – Т.2 (11), № 2-3. – С. 327.
17. Кривенцев Ю.А., Никулина Д.М., Бисалиева Р.А. Моделирование нового способа определения плодового гемоглобина человека // Астраханский
медицинский журнал. – Астрахань. – 2008. – Т. 3. - №2. – С. 53-55.
18. Кривенцев Ю.А., Бисалиева Р.А., Батуев Д.Г., Яблокова И.Ю., Вафина
Р.А., Мустафаев И.М.-А. Пополнение сведений по физико-химическим
свойствам гемоглобина типов: A1, A2, F и P // Астраханский медицинский
журнал. – 2008. – Т. 3. - №3. – С. 20-22.
19. Кривенцев Ю.А., Никулина Д.М., Заклякова Л.В., Бисалиева Р.А., Борисова Н.В., Кико Е.Е., Ким И.В. Иммунохимический тест на антенатальные гемоглобины в гематологии // Астраханский медицинский журнал. –
2008. – Т. 3. - №3. – С. 106-110.
20. Никулина Д.М., Кривенцев Ю.А., Бисалиева Р.А. Иммунохимический
тест на примитивный гемоглобин: перспективы внедрения // Астраханский
медицинский журнал. – 2008. – Т. 3. - №3. – С. 185-188.
21. Бисалиева Р.А., Штепо М.В., Кривенцев Ю.А., Никулина Д.М. Железосодержащие белки в крови новорожденных с внутриутробной гипоксией //
«Молодь – медицинi майбутнього»: мiжнародна наукова конференцiя студентiв та молодих вчених, присвячена 150-рiччю з дня народження проф.
М.Ф. Гамалеi. 23-24 квiтня 2009 року: тези доповiдей. – Одесса: Одес.
Держ. Мед.ун-т, 2009. – С. 71.
22. Кривенцев Ю.А., Бисалиева Р.А., Никулина Д.М., Носков И.А. Разработка оптимального алгоритма для создания иммунохимической тестсистемы на примитивный гемоглобин человека // Вестник Российской военно-медицинской академии.- Приложение (часть II). – 2009. - №1 (25). –
С. 450.
23. Никулина Д.М., Кривенцев Ю.А., Бахмутова Л.А., Бисалиева Р.А., Лапеко С.В. Эмбриональный гемоглобин как критерий оценки гипоксии новорожденных // Вестник Российской военно-медицинской академии.- Приложение (часть II). – 2009. - №1 (25). – С. 450-451.
24. Бахмутова Л.А., Кривенцев Ю.А., Никулина Д.М., Лапеко С.В., Бисалиева Р.А. Антенатальные гемоглобины в оценке течения раннего неонатального периода у новорожденных с задержкой внутриутробного разви-
25
тия // Вестник Российской военно-медицинской академии.- Приложение
(часть II). – 2009. - №1 (25). – С. 451.
* - работа, опубликована в журнале, включенном ВАК в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
Hb - гемоглобин
HbP – эмбриональный или примитивный гемоглобин
HbF – фетальный гемоглобин
HbA – взрослый гемоглобин
Аг – антиген, иммуноген
Ас – антисыворотка
ПК – пуповинная кровь
ГВ – гестационный возраст
ОЭП – относительная электрофоретическая подвижность
ПААГ – полиакриламидный гель
pI – изоэлектрическая точка
РИД – радиальная иммунодиффузия
ИДА – иммунонодиффузионный анализ
ДСН – додецилсульфат натрия
ЦНС – центральная нервная система
ВЖК – внутрижелудочковое кровозлияние
26
Бисалиева Рината Альбкалиевна
ИММУНОХИМИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ
ЭМБРИОНАЛЬНОГО И ФЕТАЛЬНОГО ГЕМОГЛОБИНОВ
НА РАННИХ ЭТАПАХ ОНТОГЕНЕЗА
03.00.04 – Биохимия
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Тираж 100 экз. Подписано в печать хх.хх.09г. Заказ № ххххх
Издательство ГОУ ВПО «Астраханская государственная медицинская академия Росздрава», 414000, г. Астрахань, ул. Бакинская, 121