006501 Предпосылки изобретения

006501
Предпосылки изобретения
Пролиферация и дифференциация клеток многоклеточных организмов регулируются гормонами и
полипептидными факторами роста. Эти диффундируемые молекулы позволяют клеткам осуществлять
коммуникацию друг с другом и действовать совместно для образования клеток и органов и репарации
поврежденной ткани. Примеры гормонов и факторов роста включают в себя стероидные гормоны (например, эстроген, тестостерон), паратиреоидный гормон, фолликулостимулирующий гормон, интерлейкины, тромбоцитарный фактор роста (PDGF), эпидермальный фактор роста (EGF), гранулоцитарномакрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), эритропоэтин (ЕРО) и кальцитонин.
Гормоны и факторы роста влияют на клеточный метаболизм путем связывания с рецепторами. Рецепторы могут быть интегральными мембранными белками, которые связаны с путями передачи сигналов в клетке, такими как системы вторичных мессенджеров. Другие классы рецепторов являются растворимыми молекулами, такими как факторы транскрипции. Особый интерес представляют рецепторы для
цитокинов, молекул, которые стимулируют пролиферацию и/или дифференцировку клеток. Примеры
цитокинов включают в себя эритропоэтин (ЕРО), который стимулирует развитие эритроцитов; тромбопоэтин (ТРО), который стимулирует развитие клеток мегакариоцитарной линии дифференцировки; и гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), который стимулирует развитие нейтрофилов.
Эти цитокины применимы в восстановлении нормальных уровней кровяных клеток в пациентах, страдающих от анемии, тромбоцитопении и нейтропении, или получающих химиотерапию по поводу рака.
Продемонстрированные in vivo активности этих цитокинов иллюстрируют огромный клинический
потенциал или потребность в отношении других цитокинов, агонистов цитокинов и антагонистов цитокинов. Данное изобретение удовлетворяет эти потребности путем обеспечения нового рецептора гемопоэтического цитокина, а также относящихся к нему композиций и способов.
Данное изобретение обеспечивает такие полипептиды для этих и других применений, которые должны быть очевидны лицам с обычной квалификацией в данной области из приведенных здесь описаний.
Сущность изобретения
В первом аспекте настоящего изобретения заявляется выделенный полинуклеотид, кодирующий
полипептид zalpha11 рецептора цитокина человека класса I полной длины или его функциональные компоненты, включающие последовательности аминокислот, выбранные из группы, состоящей из
(a) последовательности от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 237 (His) SEQ ID
NO:2 (цитокинсвязывающий домен);
(b) последовательности от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 255 (Leu) SEQ ID
NO:2 (цитокинсвязывающий домен и трансмембранный домен);
(c) последовательности от аминокислоты номер 256 (Lys) до аминокислоты номер 538 (Ser) SEQ ID
NO:2 (внутриклеточный домен);
(d) последовательности от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 538 (Ser) SEQ ID
NO:2 (зрелый полипептид);
(e) последовательности от аминокислоты номер 1 (Met) до аминокислоты номер 538 (Ser) SEQ ID
NO:2 (полипептид полной длины) или последовательностей, которые по меньшей мере на 90% гомологичны указанным, и полученных согласно тому, как раскрыто в описании.
Во втором аспекте настоящего изобретения заявляется выделенный полинуклеотид, кодирующий
полипептид zalpha11 рецептора цитокина человека класса I полной длины или его функциональные компоненты, включающий последовательность полинуклеотидов, выбранную из группы, состоящей из
(a) полинуклеотидной последовательности от нуклеотида 69 до нуклеотида 1682 SEQ ID NO:1 (полинуклеотид, кодирующий полипептид полной длины);
(b) полинуклеотидной последовательности от нуклеотида 1 до нуклеотида 1614 SEQ ID NO:4 (вырожденный полинуклеотид по отношению к указанному в (а), кодирующий полипептид полной длины);
(c) полинуклеотидной последовательности от нуклеотида 126 до нуклеотида 779 SEQ ID NO:1 (полинуклеотид, кодирующий цитокинсвязывающий домен);
(d) полинуклеотидной последовательности от нуклеотида 126 до нуклеотида 833 SEQ ID NO:1 (полинуклеотид, кодирующий цитокинсвязывающий домен и трансмембранный домен);
(e) полинуклеотидной последовательности от нуклеотида 834 до нуклеотида 1682 SEQ ID NO:1
(полинуклеотид, кодирующий внутриклеточный домен);
(f) полинуклеотидной последовательности от нуклеотида 126 до нуклеотида 1682 SEQ ID NO:1 (полинуклеотид, кодирующий зрелый полипептид);
Кроме того, полипептид zalpha11 включает последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из
(a) последовательности от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 237 (His) SEQ ID
NO:2 (цитокинсвязывающий домен);
(b) последовательности от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 255 (Leu) SEQ ID
NO:2 (цитокинсвязывающий домен и трансмембранный домен);
(c) последовательности от аминокислоты номер 256 (Lys) до аминокислоты номер 538 (Ser) SEQ ID
NO:2 (внутриклеточный домен);
-1-
006501
(d) последовательности от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 538 (Ser) SEQ ID
NO:2 (зрелый полипептид); и
(е) последовательности от аминокислоты номер 1 (Met) до аминокислоты номер 538 (Ser) SEQ ID
NO:2 (полипептид полной длины).
А также полипептид zalpha11 имеет последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из
(a) последовательности от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 237 (His) SEQ ID
NO:2 (цитокинсвязывающий домен);
(b) последовательности от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 255 (Leu) SEQ ID
NO:2 (цитокинсвязывающий домен и трансмембранный домен);
(c) последовательности от аминокислоты номер 256 (Lys) до аминокислоты номер 538 (Ser) SEQ ID
NO:2 (межклеточный домен);
(d) последовательности от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 538 (Ser) SEQ ID
NO:2 (зрелый полипептид); и
(e) последовательности от аминокислоты номер 1 (Met) до аминокислоты номер 538 (Ser) SEQ ID
NO:2 (полипептид полной длины).
Дополнительно полипептид содержит домен WSXWS (SEQ ID NO:3), или полипептид (а), (с), (d),
(е) дополнительно содержит трансмембранный домен, который может состоять из остатков 238 (Leu)-255
(Leu) SEQ ID NO:2.
Кроме того, полипептид (а), (b), (е), (d) дополнительно содержит внутриклеточный домен, который
может состоять из остатков 256 (Lys)-538 (Ser) SEQ ID NO:2 и содержать сайты Box I и Box II.
И, дополнительно, полипептид содержит аффинную метку.
В другом аспекте настоящего изобретения заявляется экспрессирующий вектор, содержащий следующие функционально связанные элементы:
промотор транскрипции;
сегмент ДНК, кодирующий зрелый полипептид zalpha11 рецептора цитокина человека класса I,
имеющий последовательность от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 538 (Ser) SEQ ID
NO:2; и
терминатор транскрипции,
причем промотор функционально связан с сегментом ДНК, а сегмент ДНК функционально связан с
терминатором транскрипции.
Кроме того, экспрессирующий вектор дополнительно содержит второй сегмент ДНК, экспрессирующий секреторную сигнальную последовательность, функционально связанную с сегментом ДНК,
кодирующим зрелый полипептид zalpha11.
Еще в одном аспекте настоящего изобретения заявляется культивируемая клетка, содержащая указанный экспрессирующий вектор, экспрессирующая зрелый полипептид zalpha11.
В другом аспекте настоящего изобретения заявляется экспрессирующий вектор, содержащий
промотор транскрипции;
сегмент ДНК, кодирующий цитокинсвязывающий домен полипептида zalpha11 рецептора цитокина
человека класса I, имеющий последовательность от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 237 (His) SEQ ID NO:2; и
терминатор транскрипции,
причем промотор, сегмент ДНК и терминатор функционально связаны.
Дополнительно экспрессирующий вектор может содержать
второй сегмент ДНК, экспрессирующий секреторную сигнальную последовательность, функционально связанную с сегментом ДНК, кодирующим цитокинсвязывающий домен полипептида zalpha11;
фрагмент ДНК, кодирующий трансмембранный домен полипептида zalpha11, функционально связанный с сегментом ДНК, кодирующим цитокинсвязывающий домен указанного полипептида; а трансмембранный домен содержит остатки 238 (Leu)-255 (Leu) SEQ ID NO:2;
фрагмент ДНК, кодирующий внутриклеточный домен полипептида zalpha11, функционально связанный с сегментом ДНК, кодирующим цитокинсвязывающий домен указанного полипептида, а внутриклеточный домен состоит из остатков 256 (Lys)-538 (Ser) SEQ ID NO:2.
Еще в одном аспекте настоящего изобретения заявляется культивируемая клетка, в которую был
введен экспрессирующий вектор, экспрессирующая растворимый рецепторный полипептид, zalpha11.
Кроме того, пролиферация клетки зависит от экзогенного гемопоэтического фактора роста.
В другом аспекте настоящего изобретения заявляется конструкция ДНК, кодирующая слитый белок, в состав которого входит полипептид zalpha11 рецептора цитокина человека класса I полной длины
или его функциональные компоненты, содержащая
первый сегмент ДНК, кодирующий полипептид, имеющий последовательность аминокислотных
остатков, выбранную из группы, состоящей из
(a) аминокислотной последовательности от аминокислоты номер 2 (Met) до аминокислоты номер 19
(Gly) SEQ ID NO:2 (секреторная сигнальная последовательность zaplha11);
-2-
006501
(b) аминокислотной последовательности от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер
237 (His) SEQ ID NO:2 (цитокинсвязывающий домен zalpha11);
(c) аминокислотной последовательности от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер
255 (Leu) SEQ ID NO:2 (цитокинсвязывающий домен и трансмембранный домен zalpha11);
(d) аминокислотной последовательности от аминокислоты номер 238 (Leu) до аминокислоты номер
255 (Leu) SEQ ID NO:2 (трансмембранный домен zalpha11);
(e) аминокислотной последовательности от аминокислоты номер 238 (Leu) до аминокислоты номер
538 (Ser) SEQ ID NO:2 (трансмембранный домен и внутриклеточный домен zalpha11);
(f) аминокислотной последовательности от аминокислоты номер 256 (Lys) до аминокислоты номер
538 (Ser) SEQ ID NO:2 (внутриклеточный домен zalpha11);
(g) аминокислотной последовательности от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер
538 (Ser) SEQ ID NO:2 (зрелый полипептид zalpha11); и, по меньшей мере, один другой сегмент ДНК,
кодирующий дополнительный полипептид,
причем первый и другие сегменты ДНК соединены в рамке считывания.
В следующем аспекте настоящего изобретения заявляется экспрессирующий вектор, содержащий
следующие функционально связанные элементы:
промотор транскрипции;
конструкцию ДНК, кодирующую слитый белок; и
терминатор транскрипции,
причем промотор функционально связан с конструкцией ДНК, а конструкция ДНК функционально
связана с терминатором транскрипции.
Еще в одном аспекте настоящего изобретения заявляется культивируемая клетка, содержащая указанный экспрессирующий вектор, причем клетка экспрессирует слитый белок.
В дополнительном аспекте настоящего изобретения заявляется способ получения слитого белка,
предусматривающий
культивирование указанной клетки и выделение полипептида, продуцируемого этой клеткой.
В следующем аспекте настоящего изобретения заявляется выделенный полипептид zalpha11 рецептора цитокина человека класса I полной длины или его функциональные компоненты, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из
(а) последовательности от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 237 (His) SEQ ID
NO:2 (цитокинсвязывающий домен);
(b) последовательности от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 255 (Leu) SEQ ID
NO:2 (цитокинсвязывающий домен и трансмембранный домен);
(c) последовательности от аминокислоты номер 256 (Lys) до аминокислоты номер 538 (Ser) SEQ ID
NO:2 (полный внутриклеточный домен);
(d) последовательности от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 538 (Ser) SEQ ID
NO:2 (зрелый полипептид); и
(e) последовательности от аминокислоты номер 1 (Met) до аминокислоты номер 538 (Ser) SEQ ID
NO:2 (полипептид полной длины) или последовательностей, которые по меньшей мере на 90% гомологичны указанным и получены, как раскрыто в описании.
Кроме того, выделенный полипептид содержит последовательность аминокислотных остатков, выбранную из группы, состоящей из
(a) последовательности от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 237 (His) SEQ ID
NO:2 (цитокинсвязывающий домен);
(b) последовательности от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 255 (Leu) SEQ ID
NO:2 (цитокинсвязывающий домен и трансмембранный домен);
(c) последовательности от аминокислоты номер 256 (Lys) до аминокислоты номер 538 (Ser) SEQ ID
NO:2 (внутриклеточный домен);
(d) последовательности от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 538 (Ser) SEQ ID
NO:2 (зрелый полипептид);
(e) последовательности от аминокислоты номер 1 (Met) до аминокислоты номер 538 (Ser) SEQ ID
NO:2 (полипептид полной длины).
А также полипептид zalpha11 имеет последовательность аминокислотных остатков, выбранную из
группы, состоящей из
(а) последовательности от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 255 (Leu) SEQ ID
NO:2 (цитокинсвязывающий домен);
(b) последовательности от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 255 (Leu) SEQ ID
NO:2 (цитокинсвязывающий домен и трансмембранный домен);
(c) последовательности от аминокислоты номер 256 (Lys) до аминокислоты номер 538 (Ser) SEQ ID
NO:2 (внутриклеточный домен);
(d) последовательности от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 538 (Ser) SEQ ID
NO:2 (зрелый полипептид);
-3-
006501
(e) последовательности от аминокислоты номер 1 (Met) до аминокислоты номер 538 SEQ ID NO:2
(полипептид полной длины).
Кроме того, полипептид дополнительно содержит домен WSXWS, как показано в SEQ ID NO:3, а
полипептид (а), (с), (d), (е) дополнительно содержит трансмембранный домен, который состоит из остатков 238 (Leu)-255 (Leu) SEQ ID NO:2.
Дополнительно полипептид (а), (b), (d), (е) содержит внутриклеточный домен, который может состоять из остатков 256 (Lys)-538 (Ser) SEQ ID NO:2 и дополнительно содержать сайты Box I и Box II.
Кроме того, полипептид дополнительно содержит аффинную метку, маркер биотин/авидин, радионуклид, маркер фермент/субстрат, кофактор, ингибитор, флуоресцентную индикаторную частицу, хемилюминесцентную индикаторную частицу, токсин, цитотоксичную молекулу или домен иммуноглобулина Fс.
Дополнительно полипептид состоит из последовательности аминокислотных остатков от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 237 (His) SEQ ID NO:2 (цитокинсвязывающий домен) и
дополнительно содержит трансмембранный домен гетерологичного рецептора циктокина, который является рецептором цитокина класса I.
Также полипептид может содержать трансмембранный домен и межклеточный домен из гетерологичного рецептора цитокина, который является рецептором цитокина класса I.
Кроме того, полипептид состоит из последовательности аминокислотных остатков от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 255 (Leu) SEQ ID NO:2 (цитокинсвязывающий домен и трансмембранный домен) и дополнительно содержит внутриклеточный домен гетерологичного рецептора цитокина, который является рецептором цитокина класса I.
Полипептид дополнительно состоит из последовательности аминокислотных остатков от аминокислоты номер 256 (Lys) до аминокислоты номер 538 (Leu) SEQ ID NO:2 (внутриклеточный домен) и
дополнительно содержит трансмембранный домен и цитокинсвязывающий домен гетерологичного рецептора цитокина, который является рецептором цитокина класса I.
Кроме того, выделенный полипептид состоит из последовательности аминокислотных остатков от
аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 538 (Leu) SEQ ID NO:2 (зрелый полипептид).
Еще в одном аспекте настоящего изобретения заявляется способ получения зрелого полипептида
zalpha11, предусматривающий
культивирование клетки; и
выделение полипептида zalpha11, продуцируемого этой клеткой.
В другом аспекте настоящего изобретения заявляется выделенный полипептид zalpha11, включающий
аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2 от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 237 (His) (цитокинсвязывающий домен); и, по существу, не содержащий трансмембранного и
внутриклеточного доменов, обычно связанных с гемопоэтическими рецепторами.
Кроме того, выделенный полипептид дополнительно может содержать
аффинную метку;
аффинную метку, маркер биотин/авидин, радионуклид, маркер фермент/субстрат, кофактор, ингибитор, флуоресцентную индикаторную частицу, хемилюминесцентную индикаторную частицу, токсин,
цитотоксичную молекулу или домен иммуноглобулина Fc.
В следующем аспекте настоящего изобретения заявляется способ получения цитокинсвязывающего
домена полипептида zalpha11, предусматривающий
культивирование клетки; и
выделение полипептида, продуцируемого этой клеткой.
Еще в одном аспекте настоящего изобретения заявляется способ получения антитела к полипептиду
zalpha11, предусматривающий
введение животному полипептида, выбранного из группы, состоящей из
(a) полипептида, содержащего любые из 9-519 аминокислот, которые составляют непрерывную последовательность в пределах последовательности SEQ ID NO:2 от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 538 (Ser) (зрелый полипептид);
(b) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 237 (His) (цитокинсвязывающий домен);
(c) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 от аминокислоты номер 101 (Leu) до аминокислоты номер 122 (Gly);
(d) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 от аминокислоты номер 141 (Asn) до аминокислоты номер 174 (Ala);
(e) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 от аминокислоты номер 193 (Cys) до аминокислоты номер 261 (Val);
(f) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 от аминокислоты номер 51 (Тrр) до аминокислоты номер 61 (Glu);
(g) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 от аминокислоты 136 (Ilе) до аминокислоты номер 143 (Glu);
-4-
006501
(h) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 от аминокислоты 187 (Pro) до аминокислоты номер 195 (Ser);
(i) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 от аминокислоты номер 223 (Phe) до аминокислоты номер 232 (Glu); и
(j) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 от аминокислоты номер 360 (Glu) до аминокислоты номер 368 (Asp),
причем указанный полипептид индуцирует синтез антител в организме животного, и
выделение антитела, специфически связывающегося с полипептидом zalpha11, из организма животного.
В другом аспекте настоящего изобретения заявляется моноклональное антитело, полученное при
иммунизации животного полипептидом zalpha11, выбранным из группы, состоящей из
(a) полипептида, содержащего любые из 9-519 аминокислот, которые составляют непрерывную последовательность в пределах последовательности SEQ ID NO:2 от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 538 (Ser) (зрелый полипептид);
(b) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 237 (His) (цитокинсвязывающий домен):
(c) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 от аминокислоты номер 101 (Leu) до аминокислоты номер 122 (Gly);
(d) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 от аминокислоты номер 141 (Asn) до аминокислоты номер 174 (Ala);
(e) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 от аминокислоты номер 193 (Cys) до аминокислоты номер 261 (Val);
(f) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 от аминокислоты номер 51 (Тrр) до аминокислоты номер 61 (Glu);
(g) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 от аминокислоты 136 (Ilе) до аминокислоты номер 143 (Glu);
(h) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 от аминокислоты 187 (Pro) до аминокислоты номер 195 (Ser);
(i) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 от аминокислоты номер 223 (Phe) до аминокислоты номер 232 (Glu); и
(j) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 от аминокислоты номер 360 (Glu) до аминокислоты номер 368 (Asp).
Еще в одном аспекте настоящего изобретения заявляется антитело, которое специфически связывается с полипептидом.
В дополнительном аспекте настоящего изобретения заявляется способ обнаружения в тест-пробе
присутствия модулятора активности полипептида zalpha11, предусматривающий
культивирование клетки, в которую был введен экспрессирующий вектор, причем эта клетка экспрессирует цитокинсвязывающий домен полипептида zalpha11, в присутствии и в отсутствие тестпробы; и
сравнение уровней активности указанного домена zalpha11 в присутствии и в отсутствие тестпробы при помощи биологического или биохимического анализа; и
определение по результатам сравнения присутствия модулятора активности zalpha11 в данной тестпробе.
В другом аспекте настоящего изобретения заявляется способ обнаружения лиганда рецептора
zalpha11 в тест-пробе, предусматривающий
обеспечение контактирования тест-пробы с полипептидом zalpha11, содержащим последовательность от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 237 (His) SEQ ID NO:2 (цитокинсвязвающий домен); и
выявление связывания указанного полипептида с лигандом в пробе.
Кроме того, согласно способу указанный полипептид дополнительно содержит трансмембранный и
внутриклеточный домены и указанный полипептид связан с мембраной культивируемой клетки, а стадия
выявления предусматривает измерение биологического ответа в культивируемой клетке.
А также согласно способу биологический ответ представляет собой пролиферацию клеток, активность сигнальной трансдукции или активацию транскрипции репортерного гена и полипептид иммобилизован на твердом носителе.
Дополнительно согласно способу тест-проба содержит лимфоидные клетки, гемопоэтические клетки, активированные Т-клетки или раковые клетки или кондиционированную среду из лимфоидных клеток, гемопоэтических клеток, активированных Т-клеток или раковых клеток.
Краткое описание графических материалов
Фиг. 1 представляет собой график гидрофильности Hopp-Woods zalpha11 человека.
Фиг. 2 представляет собой сопоставление zalpha11 человека (zalpha) (SEQ ID NO:2) и zalpha11 мыши (muzalp) (SEQ ID NO:85).
-5-
006501
Подробное описание изобретения
Перед подробным изложением данного изобретения может быть полезным для его понимания определение следующих терминов.
Термин «аффинная метка» используется здесь для обозначения полипептидного сегмента, который
может быть присоединен ко второму полипептиду для очистки или детектирования второго полипептида
или обеспечения сайтов для присоединения второго полипептида к субстрату. В принципе, любой пептид
или белок, для которого доступны антитело или другой агент специфического связывания, может быть
использован в качестве аффинной метки. Аффинные метки включают в себя полигистидиновый участок
(тракт), белок A (Nilsson et al., EMBO J. 4:1075, 1985; Nilsson et al., Methods Enzymol. 198:3, 1991), глутатион S-трансферазу (Smith and Johnson, Gene 67:31, 1988), аффинную метку Glu-Glu (Grussenmeyer et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7952-4, 1985), вещество Р, пептид Flag™ (Hopp et al., Biotechnology 6:120410, 1988), стрептавидинсвязывающий пептид или другой антигенный эпитоп или связывающий домен.
См., в общем, Ford et al., Protein Expression and Purification 2: 95-107, 1991. ДНК, кодирующие аффинные
метки, доступны от коммерческих поставщиков (например, Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).
Термин «аллельный вариант» используется здесь для обозначения любой из двух или нескольких
альтернативных форм гена, занимающих один и тот же хромосомный локус. Аллельная вариация возникает природно через мутацию и может приводить к фенотипическому полиморфизму в популяциях. Мутации генов могут быть молчащими (без изменения в кодируемом полипептиде) или могут кодировать
полипептиды, имеющие измененную аминокислотную последовательность. Термин аллельный вариант
используется здесь также для обозначения белка, кодируемого аллельным вариантом гена.
Термины «амино-концевой» и «карбоксил-концевой» используются здесь для обозначения положений
внутри полипептидов. Там, где позволяет контекст, эти термины используются со ссылкой на конкретную
последовательность или часть полипептида для обозначения близости или относительного положения.
Например, некоторая последовательность, расположенная карбоксил-терминально относительно ссылочной последовательности в полипептиде, расположена проксимально относительно карбоксил-конца ссылочной последовательности, но не обязательно находится при карбоксил-конце полного полипептида.
Термин «пара комплемент/антикомплемент» обозначает неидентичные части молекулы, которые
образуют нековалентно связанную, стабильную пару при подходящих условиях. Например, биотин и
авидин (или стрептавидин) являются членами-прототипами пары комплемент/антикомплемент. Другие
примеры пар комплемент/антикомплемент включают в себя пары рецептор/лиганд, пары антитело/антиген (или гаптен или эпитоп), пары смысловой/антисмысловой полинуклеотид и т.п. В случае, когда желательна последующая диссоциация пары комплемент/антикомплемент, пара комплемент/антикомплемент предпочтительно имеет аффинность связывания <109 М-1.
Термин «комплементы полинуклеотидной молекулы» обозначает полинуклеотидную молекулу,
имеющую комплементарную последовательность оснований и обращенную ориентацию в сравнении со
ссылочной последовательностью. Например, последовательность 5'-ATGCACGGG-3' комплементарна 5'CCCGTGCAT-3'.
Термин «контиг» обозначает полинуклеотид, который имеет непрерывный отрезок идентичной или
комплементарной последовательности относительно другого полинуклеотида. Говорят, что непрерывные
последовательности (контиги) «перекрывают» конкретный отрезок полинуклеотидной последовательности
либо полностью, либо вдоль частичного отрезка этого полинуклеотида. Например, характерными контигами к полинуклеотидной последовательности 5'-ATGGCTTAGCTT-3' являются 5'-TAGCTTgagtct-3' и 3'gtcgacTACCGA-5'.
Термин «вырожденная нуклеотидная последовательность» обозначает последовательность нуклеотидов, которая включает в себя один или более вырожденных кодонов (в сравнении со ссылочной полинуклеотидной молекулой, которая кодирует полипептид). Вырожденные кодоны содержат различные
триплеты нуклеотидов, но кодируют один и тот же аминокислотный остаток (т.е. триплеты GAU и GAC,
каждый, кодируют Asp).
Термин «экспрессирующий вектор» используется для обозначения молекулы ДНК, линейной или
кольцевой, которая содержит сегмент, кодирующий представляющий интерес полипептид, функционально связанный с дополнительными сегментами, которые обеспечивают его транскрипцию. Такие дополнительные элементы включают в себя промоторную и терминаторную последовательности и могут
также включать в себя одну или несколько точек начала репликации, один или несколько селектируемых
маркеров, энхансер, сигнал полиаденилирования и т.д. Экспрессирующие векторы обычно произведены
из плазмидной или вирусной ДНК или могут содержать элементы обеих.
Термин «выделенный», в применении к полинуклеотиду, обозначает, что этот полинуклеотид был
удален из его природной генетической среды и, следовательно, не содержит других посторонних или
нежелательных кодирующих последовательностей и находится в форме, подходящей для применения в
генетически сконструированных системах продуцирования белков. Такие выделенные молекулы являются молекулами, которые выделены из их природного окружения, и включают в себя кДНК-клоны и
геномные клоны. Выделенные молекулы ДНК данного изобретения не содержат других генов, с которыми они обычно связаны, но могут включать в себя природно встречающиеся 5'- и 3'-нетранслируемые
-6-
006501
районы, такие как промоторы и терминаторы. Идентификация связанных районов будет очевидной лицу
с обычной квалификацией в данной области (см., например, Dynan and Tijan, Nature 316:774-78, 1985).
«Выделенным» полипептидом или белком является полипептид или белок, который обнаруживается в условиях, иных, чем его природное окружение, например отдельно от крови и ткани животного. В
предпочтительной форме выделенный полипептид является, по существу, не содержащим других полипептидов, в частности других полипептидов животного происхождения. Предпочтительно обеспечение
полипептидов в высокоочищенной форме, т.е. имеющих чистоту более 90%, более предпочтительно чистоту более 99%. При использовании в этом контексте термин «выделенный» не исключает присутствия
того же самого полипептида в альтернативных физических формах, таких как димеры или альтернативно
гликозилированные или дериватизованные формы.
Термин «функционально (операбельно) связанные», при ссылке на ДНК-сегменты, указывает, что эти
сегменты расположены таким образом, что они функционируют совместно для их предполагаемых целей,
например транскрипция инициируется в промоторе и протекает через кодирующий сегмент до терминатора.
Термин «ортолог» обозначает полипептид или белок, полученный из одного вида, который является
функциональной копией полипептида или белка из другого вида. Различия последовательностей среди
ортологов являются результатом видообразования.
«Паралоги» являются отличающимися, но структурно родственными белками, производимыми организмом. Считается, что паралоги возникают в результате дупликации генов. Например, α-глобин, βглобин и миоглобин являются паралогами друг друга.
Термин «полинуклеотид» обозначает одно- или двухцепочечный полимер дезоксирибонуклеотидных или рибонуклеотидных оснований, считываемых от 5'-конца к 3'-концу. Полинуклеотиды включают
в себя РНК и ДНК и могут быть изолированы из природных источников, синтезированы in vitro или получены из комбинации природных и синтетических молекул. Размеры полинуклеотидов выражаются как
пары нуклеотидов (сокращенно «п.н.»), нуклеотиды («нт») или тысячи пар нуклеотидов («т.п.н.»). Там,
где позволяет контекст, два последниx термина могут описывать полинуклеотиды, которые являются
одноцепочечными или двухцепочечными. При применении этого термина к двухцепочечным молекулам
его используют для обозначения общей длины, и должно быть понятно, что он является эквивалентным
термину «пары нуклеотидов». Специалистам в данной области будет понятно, что две цепи двухцепочечного полинуклеотида могут слегка отличаться по длине и что их концы могут быть расположены зигзагами в результате ферментативного расщепления; таким образом, не все нуклеотиды в двухцепочечной
полинуклеотидной молекуле могут быть спаренными.
«Полипептид» является полимером аминокислотных остатков, соединенных пептидными связями,
получен ли он природным путем или синтетическим путем. Полипептиды, имеющие менее приблизительно 10 аминокислотных остатков, обычно называют «пептидами».
Термин «промотор» используется здесь в его признанном в данной области значении для обозначения части гена, содержащей последовательности ДНК, которые обеспечивают связывание РНКполимеразы и инициацию транскрипции. Промоторные последовательности обнаруживаются обычно, но
не всегда, в 5'-некодирующих районах генов.
«Белок» обозначает макромолекулу, содержащую одну или несколько полипептидных цепей. Белок
может включать в себя также непептидные компоненты, такие как углеводные группы. Углеводы и другие непептидные компоненты могут быть присоединены к белку клеткой, в которой продуцируется данный белок, и будут варьироваться в зависимости от типа клетки. Белки определены здесь в терминах их
аминокислотных каркасных структур; заместители, такие как углеводные группы, обычно не указаны,
но, тем не менее, они могут присутствовать.
Термин «рецептор» используется здесь для обозначения связанного с клеткой белка или полипептидной субъединицы такого белка, которые связываются с биоактивной молекулой («лигандом») и медиируют действие этого лиганда на клетку. Связывание лиганда с рецептором приводит к конформационному изменению в рецепторе (и, в некоторых случаях, мультимеризации рецептора, т.е. ассоциации
идентичных или различных субъединиц рецептора), которое вызывает взаимодействия между эффекторным доменом (доменами) и другой молекулой (молекулами) в клетке. Эти взаимодействия, в свою очередь, приводят к изменениям в метаболизме клетки. Метаболические события, связанные с взаимодействиями рецептор-лиганд, включают в себя транскрипцию генов, фосфорилирование/дефосфорилирование,
пролиферацию клеток, увеличения продуцирования циклического АМФ, мобилизацию клеточного кальция, мобилизацию мембранных липидов, клеточную адгезию, гидролиз инозитлипидов и гидролиз фосфолипидов. Рецепторы цитокинов клеточной поверхности характеризуются мультидоменной структурой,
как обсуждается более подробно ниже. Эти рецепторы закреплены в клеточной мембране трансмембранным доменом, характеризующимся последовательностью гидрофобных аминокислотных остатков
(обычно приблизительно 21-25 остатков), которая обычно фланкирована положительно заряженными
остатками (Lys или Аrg). Обычно рецепторы могут быть мембраносвязанными, цитозольными или ядерными; мономерными (например, рецептор тиреоидстимулирующего гормона, β-адренергического гормона) или мультимерными (например, PDGF-рецептор, рецептор гормона роста, IL-3-рецептор, GM-CSF-7-
006501
рецептор, G-CSF-рецептор, рецептор эритропоэтина и IL-6-рецептор). Термин «рецепторный полипептид» используется для обозначения полипептидных цепей полного рецептора и его частей, в том числе
выделенных функциональных доменов (например, лигандсвязывающих доменов).
Термин «секреторная сигнальная последовательность» обозначает последовательность ДНК, которая кодирует полипептид («секреторный полипептид»), который, как компонент большего полипептида,
направляет этот больший полипептид через секреторный путь клетки, в которой он синтезируется. Этот
больший полипептид обычно расщепляется с удалением секреторного пептида во время прохождения
через этот секреторный путь.
«Растворимый рецептор» является рецепторным полипептидом, который не связан с клеточной
мембраной. Растворимые рецепторы являются наиболее обычно лигандсвязывающими рецепторными
полипептидами, которые не имеют трансмембранного и цитоплазматического доменов. Растворимые рецепторы могут содержать дополнительные аминокислотные остатки, такие как аффинные метки, которые
обеспечивают очистку этого полипептида или обеспечивают сайты для присоединения этого полипептида к
субстрату, или последовательности константной области иммуноглобулина. Многие рецепторы клеточной
поверхности имеют природно встречающиеся, растворимые копии, которые продуцируются протеолизом.
Считается, что рецепторные полипептиды являются, по существу, не содержащими трансмембранного и
внутриклеточного полипептидных сегментов, когда они не имеют достаточных частей этих сегментов
для обеспечения мембранного прикрепления или трансдукции (передачи) сигнала, соответственно.
Термин «сплайсинговый вариант» используется здесь для обозначения альтернативных форм РНК,
транскрибированных из гена. Сплайсинговая вариация возникает природно посредством использования
альтернативных сайтов сплайсинга в транскрибируемой молекуле РНК или менее обычно между раздельно транскрибируемыми молекулами РНК и может приводить к нескольким мРНК, транскрибируемым из одного и того же гена. Сплайсинговые варианты могут кодировать полипептиды, имеющие измененную аминокислотную последовательность. Термин «сплайсинговый вариант» используют здесь
также для обозначения белка, кодируемого сплайсинговым вариантом мРНК, транскрибируемым из гена.
Должно быть понятно, что молекулярные массы и длины полимеров, определяемые неточными
аналитическими методами (например, гель-электрофорезом), являются приблизительными величинами.
Когда такая величина выражается как «около» Х или «приблизительно» X, указанная величина Х должна
пониматься как величина, определенная в точностью до ±10%.
Все цитируемые здесь ссылки включены в качестве ссылки в полном виде.
Данное изобретение основано частично на открытии новой последовательности ДНК, которая кодирует белок, имеющий структуру рецептора цитокинов класса I. Расшифрованная аминокислотная последовательность показала, что кодируемый рецептор принадлежит к подсемейству рецепторов, которое
включает в себя β-субъединицу IL-2-рецептора и β-общий рецептор (т.е. β-субъединицы IL-3-, IL-5- и
GM-CSF-рецепторов). Анализ тканевого распределения мРНК, соответствующей этой новой ДНК, показал экспрессию в лимфатическом узле, лейкоцитах периферической крови (PBL), селезенке и тимусе.
Кроме того, эта мРНК была обильной по количеству в клеточной линии Raij (ATCC No. CC1-86), полученной из лимфомы Беркитта. Этот полипептид был назван zalpha11.
Новые полипептиды zalpha11 данного изобретения были первоначально идентифицированы запросом
в базе данных EST (маркерных экспрессирующихся последовательностей). Была обнаружена EST (маркерная экспрессирующаяся последовательность), и ее соответствующая кДНК была секвенирована. Новый
полипептид, кодируемый этой кДНК, обнаружил гомологию с рецепторами цитокинов класса I. Полинуклеотидная последовательность zalpha11 кодирует всю кодирующую последовательность предсказанного
белка. Zalpha11 представляет собой новый рецептор цитокинов, который может быть вовлечен в апоптотический клеточный путь, может быть молекулой передачи сигнала клетка-клетка, рецептором фактора
роста или связанным с внеклеточным матриксом белком с активностью гормона фактора роста или т.п.
Последовательность полипептида zalpha11 была расшифрована из единственного клона, который
содержал его соответствующую полинуклеотидную последовательность. Этот клон был получен из библиотеки спинного мозга. Другие библиотеки, которые также могут быть подвергнуты поиску на такие
последовательности, включают в себя PBL, тимус, селезенку, лимфатический узел, клеточные линии
эритролейкоза человека (например, TF-1), клетки Raij, клеточные линии острого моноцитарного лейкоза,
другие линии лимфоидных и гемопоэтических клеток и т.п.
Нуклеотидная последовательность репрезентативной zalpha11-кодирующей ДНК описана в SEQ ID
NO:1 (от нуклеотида 69 до нуклеотида 1682), а расшифрованная последовательность zalpha11 из 538
аминокислот описана в SEQ ID NO:2. В его полном виде полипептид zalpha11 представляет полноразмерный полипептидный сегмент (остаток 1 (Met) - остаток 538 (Ser) SEQ ID NO:2). Домены и структурные признаки полипептида zalpha11 дополнительно описаны ниже.
Анализ полипептида zalpha11, кодируемого ДНК-последовательностью SEQ ID NO:1, выявил открытую рамку считывания, кодирующую 538 аминокислот (SEQ ID NO:2), содержащую предсказанный
секреторный сигнальный пептид из 19 аминокислотных остатков (остаток 1 (Met) - остаток 19 (Gly) SEQ
ID NO:2) и зрелый полипептид из 519 аминокислотных остатков (остаток 20 (Cys) - остаток 538 (Ser)
SEQ ID NO:2). Кроме мотива WSXWS (SEQ ID NO:3), соответствующего остаткам 214-218 SEQ ID
-8-
006501
NO:2, этот рецептор содержит цитокинсвязывающий домен из приблизительно 200 аминокислотных остатков (остатки 20 (Cys) - 237 (His) SEQ ID NO:2); линкер доменов (остатки 120 (Pro) - 123 (Pro) SEQ ID
NO:2); предпоследний район цепи (остатки 192 (Lys) - 202 (Ala) SEQ ID NO:2); трансмембранный домен
(остатки 238 (Leu) - 255 (Leu) SEQ ID NO:2); полный внутриклеточный сигнальный домен (остатки 256
(Lys) - 538 (Ser) SEQ ID NO:2), который содержит сайт передачи сигнала «Box I» (остатки 267 (Ilе) - 273
(Pro) SEQ ID NO:2) и сайт передачи сигнала «Box II» (остатки 301 (Leu) - 304 (Gly) SEQ ID NO:2). Специалистам в данной области будет понятно, что эти границы доменов являются приблизительными и
основаны на сопоставлениях с известными белками и предсказаниями укладки белка. Кроме этих доменов, консервативные признаки рецепторов в кодируемом рецепторе включают в себя (как показано в
SEQ ID NO:2), консервативный остаток Тrр в положении 138 и консервативный остаток Аrg в положении
201. Соответствующие полинуклеотиды, кодирующие эти районы, домены, мотивы, остатки и последовательности полипептида zalpha11, описанные выше, представлены в SEQ ID NO:1.
Присутствие трансмембранных районов и консервативных мотивов и мотивов с малой дисперсией
обычно коррелирует с важными структурными районами (или определяет эти районы) в белках. Районы
с малой дисперсией (например, гидрофобные кластеры) обычно присутствуют в районах структурной
важности (Sheppard, P. et al., supra). Такие районы малой дисперсии часто содержат редкие или нечастые
аминокислоты, такие как триптофан. Фланкирующие районы и районы между такими консервативными
мотивами и мотивами малой дисперсии могут быть более вариабельными, но являются часто функционально значимыми, так как они могут относиться к важным структурам или определять важные структуры и активности, такие как связывающие домены, домены биологической и ферментативной активности,
трансдукции сигнала, взаимодействия клетка-клетка, домены тканевой локализации и т.п.
Районы консервативных аминокислотных остатков в zalpha11, описанные выше, могут быть использованы в качестве инструментов для идентификации новых членов семейства. Например, полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) может быть использована для амплификации последовательностей, кодирующих консервативные районы, из РНК, полученной из множества источников тканей или клеточных линий. В частности, высоковырожденные праймеры, сконструированные из zalpha11, применимы для этой цели. Конструирование и использование таких вырожденных
праймеров может быть легко выполнено лицами с квалификацией в данной области.
Данное изобретение обеспечивает полинуклеотидные молекулы, в том числе молекулы ДНК и РНК,
которые кодируют описанные здесь полипептиды zalpha11. Специалистам в данной области будет понятно, что, в связи с вырожденностью генетического кода, возможна значительная вариация среди этих
полинуклеотидных молекул. SEQ ID NO:4 является вырожденной последовательностью ДНК, которая
включает в себя все ДНК, которые кодируют полипептид zalpha11 SEQ ID NO:2. Специалистам в данной
области будет понятно, что вырожденная последовательность SEQ ID NO:4 обеспечивает также все последовательности РНК, кодирующие SEQ ID NO:2, путем замены U (урацилом) Т (тимина). Таким образом, кодирующие полипептид zalpha11 полинуклеотиды, содержащие район от нуклеотида 1 до нуклеотида 1614 SEQ ID NO:4, и их РНК-эквиваленты рассматриваются данным изобретением. Табл. 1 дает
однобуквенные коды, используемые в SEQ ID NO:4 для обозначения положений вырожденных нуклеотидов. «Разрешения» представляют собой нуклеотиды, обозначенные кодовой буквой. «Комплемент»
указывает код для комплементарного нуклеотида (комплементарных нуклеотидов). Например, код Y
обозначает либо С, либо Т, а его комплемент R обозначает А или G, причем А является комплементарным Т, а G является комплементарным С.
Таблица 1
Нуклеотид
Разрешение
Комплемент
Разрешение
А
А
Т
Т
С
С
G
G
G
G
С
С
Т
Т
А
А
R
A|G
Y
С|Т
Y
С|Т
R
A|G
М
А|С
К
G|T
К
G|T
М
А|С
S
C]G
S
C|G
W
А|Т
W
А|Т
H
А|С|Т
D
A|G|T
B
C|G|T
V
A|C|G
V
A|C|G
В
C|G|T
D
A|G|T
H
A|C|T
N
A|C|G|T
N
A|C|G|T
-9-
006501
Вырожденные кодоны, используемые в SEQ ID NO:4, включающие в себя все возможные кодоны
для конкретной аминокислоты, представлены в табл. 2.
Таблица 2
Специалисту с обычной квалификацией в данной области будет понятно, что некоторая двусмысленность вводится в определение вырожденного кодона, представляющего все возможные кодоны, кодирующие каждую аминокислоту. Например, вырожденный кодон для серина (WSN) может, в некоторых
обстоятельствах, кодировать аргинин (AGR), а вырожденный кодон для аргинина (MGN) может, в некоторых обстоятельствах, кодировать серин (AGY). Сходная взаимосвязь существует между кодонами,
кодирующими фенилаланин и лейцин. Таким образом, некоторые полинуклеотиды, охватываемые вырожденной последовательностью, могут кодировать вариантные аминокислотные последовательности,
но специалист с обычной квалификацией в данной области может легко идентифицировать такие вариантные последовательности сравнением с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2. Вариантные последовательности могут быть легко тестированы на функциональность, как описано здесь.
Специалисту с обычной квалификацией в данной области будет также понятно, что различные виды
могут проявлять "предпочтительное (преферентивное) использование кодонов". В общем, см., Grantham,
et al., Nuc. Acids Res. 8: 1893-912, 1980; Haas, et al., Curr. Biol. 6: 315-24, 1996; Wain-Hobson, et al., Gene
13: 355-64, 1981; Grosjean and Fiers, Gene 18: 199-209, 1982; Holm, Nuc. Acids Res. 14: 3075-87, 1986;
Ikemura, J. Mol. Biol. 158: 573-97, 1982. В применении здесь термин "предпочтительное (преферентивное)
использование кодонов" или "предпочтительные (преферентивные) кодоны" является термином данной
области, относящимся к кодонам трансляции белка, которые наиболее часто используются в клетках определенных видов, отдавая, следовательно, предпочтение одному или немногим представителям возможных кодонов, кодирующих каждую аминокислоту (cм. табл. 2). Например, аминокислота треонин
(Thr) может кодироваться АСА, АСС, ACG или ACT, но в клетках млекопитающих наиболее обычно
используемым кодоном является АСС; в других видах, например в клетках насекомых, дрожжей, вирусов или бактерий, могут быть предпочтительными другие кодоны Thr. Предпочтительные кодоны для
конкретных видов могут быть введены в полинуклеотиды данного изобретения различными способами,
известными в этой области. Введение предпочтительных последовательностей кодонов в рекомбинантную ДНК может, например, усиливать продуцирование этого белка, делая трансляцию белка более эффективной в конкретном типе клеток или виде. Таким образом, вырожденная последовательность кодонов, описанная в SEQ ID NO:4, служит в качестве матрицы для оптимизации экспрессии полинуклеотидов в различных типах клеток и видах, обычно используемых в данной области и описанных здесь. Последовательности, содержащие предпочтительные кодоны, могут быть тестированы и оптимизированы
для экспрессии в различных видах и тестированы на функциональность, как описано здесь.
В предпочтительных вариантах данного изобретения выделенные полинуклеотиды будут гибридизоваться с районами одинакового размера SEQ ID NO:1 или с комплементарной ей последовательностью
при строгих условиях. Обычно строгие условия выбирают таким образом, чтобы температура была приблизительно на 5°С ниже, чем точка термического плавления (Тm) для специфической последовательности при определенных ионной силе и рН. Тm является температурой (при определенных ионной силе и
- 10 -
006501
рН), при которой 50% последовательности-мишени гибридизуются с точно совместимым зондом. Многочисленные уравнения для расчета Тm известны в данной области и являются специфическими для
ДНК, РНК и гибридов ДНК-РНК и полинуклеотидных последовательностей-зондов варьирующей длины
(см., например, Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Second Edition (Cold Spring Harbor
Press 1989); Ausubel et al., (eds.), Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Inc., 1987);
Berger and Kimmel (eds.), Guide to Molecular Cloning Techniques (Academic Press, Inc. 1987); и Wetmur,
Crit. Rev. Biochim. Mol. Biol. 26:227 (1990)). Программное обеспечение для анализа последовательности,
такое как OLIGO 6.0 (LSR; Long Lake, MN) и Primer Premier 4.0 (Premier Biosoft International; Palo Alto,
CA), а также сайты в Интернете, являются доступными инструментами для анализа конкретной последовательности и расчета Тm на основе определенных пользователем критериях. Такие программы могут
также анализировать конкретную последовательность при определенных условиях и идентифицировать
подходящие зондовые последовательности. Обычно гибридизацию более длинных полинуклеотидных
последовательностей (например, >50 пар оснований) выполняют при температуре приблизительно на 2025°С ниже рассчитанной Тm. Для меньших зондов (например, <50 пар оснований) гибридизацию обычно
проводят при Тm или на 5-10°С ниже. Это позволяет достичь максимальной скорости гибридизации для
гибридов ДНК-ДНК и ДНК-РНК. Более высокие степени строгости при более низких температурах могут быть достигнуты добавлением формамида, который снижает Тm гибрида приблизительно на 1°С для
каждого 1% формамида в буферном растворе. Условия гибридизации подходящей строгости эквивалентны инкубации от приблизительно 5 ч до ночи при приблизительно 42°С в растворе, содержащем приблизительно 40-50% формамида, до приблизительно 6X SSC, приблизительно 5Х раствора Денхардта, от 0
до приблизительно 10% сульфата декстрана и приблизительно 10-20 мкг/мл денатурированной коммерчески доступной ДНК-носителя. Обычно такие строгие условия включают в себя температуры 20-70°С и
гибридизационный буфер, содержащий до 6х SSC и 0-50% формамид; затем гибридизацию сопровождают промыванием фильтров в SSC до приблизительно 2х SSC. Например, подходящая строгость промывки эквивалентна 0,1X SSC-2X SSC при 55°С-65°С. Различные степени строгости могут быть использованы во время гибридизации и промывания для достижения максимального специфического связывания с
последовательностью-мишенью. Обычно промывки после гибридизации выполняют при увеличивающихся степенях строгости для удаления негибридизовавшихся полинуклеотидных зондов из гибридизованных комплексов. Строгие условия гибридизации и промывок зависят от длины зонда, отраженной в
Тm, используемых гибридизационных и промывочных растворов и рутинно определяются эмпирически
специалистом в данной области.
Как отмечалось ранее, выделенные полинуклеотиды данного изобретения включают в себя ДНК и
РНК. Способы выделения ДНК и РНК хорошо известны в данной области. Обычно РНК выделяют из
ткани или клетки, которая продуцирует большие количества РНК zalpha11. Такие ткани и клетки идентифицируют Нозерн-блоттингом (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:5201, 1980) и включают в себя PBL,
селезенку, тимус и лимфатические ткани, клетки Raji, линии клеток эритролейкоза человека (например,
TF-1), линии клеток острого моноцитарного лейкоза, другие лимфоидные и гемопоэтические клеточные
линии и т.п. Тотальная РНК может быть получена с использованием экстракции изотиоцианатом гуанидиния с последующим выделением центрифугированием в градиенте CsCl (Chirgwin et al., Biochemistry
18: 52-94, 1979). Поли(А)+ РНК получают из тотальной РНК с использованием способа Aviv and Leder,
(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69: 1408-1412 (1972)). Комплементарную ДНК (кДНК) получают из поли (А)+
РНК при помощи известных способов. Альтернативно может быть выделена геномная ДНК. Затем полинуклеотиды, кодирующие полипептиды zalpha11, идентифицируют и выделяют, например, с использованием гибридизации или полимеразной цепной реакции (ПЦР) (Mullis, U.S. Patent No. 4683202).
Полноразмерный клон, кодирующий zalpha11, может быть получен общепринятыми процедурами
клонирования. Клоны комплементарной ДНК (кДНК) являются предпочтительными, хотя для некоторых
применений (например, экспрессиии в трансгенных животных) могут быть предпочтительными использование геномного клона или модификация клона кДНК с целью включения по меньшей мере одного
геномного интрона. Способы получения клонов кДНК и геномных клонов хорошо известны и находятся
в пределах обычной квалификации в данной области и включают в себя использование описанной здесь
последовательности или ее частей для зондирования или праймирования библиотеки. Экспрессионные
библиотеки могут быть зондированы антителами к zalpha11, фрагментам рецептора или другим партнерам специфического связывания.
Полинуклеотиды данного изобретения могут быть также синтезированы с использованием автоматических приборов для синтеза ДНК. В настоящее время предпочтительным способом является фосфорамидитный способ. Если химически синтезированная двухцепочечная ДНК требуется для такого применения, как синтез гена или фрагмента гена, то каждую комплементарную цепь получают отдельно.
Получение коротких полинуклеотидов (60-80 п.н.) является технически простым и может быть выполнено синтезом комплементарных цепей и затем их отжигом. Однако для получения более длинных полинуклеотидов (>300 п.н.) обычно используют специальные стратегии, так как эффективность связывания
каждого цикла во время химического синтеза ДНК редко является 100%. Для преодоления этой пробле- 11 -
006501
мы синтетические гены (двухцепочечные) собирают в модулярной форме из одноцепочечных фрагментов, имеющих длину 20-100 нуклеотидов.
Один из способов для построения синтетического гена требует первоначального получения набора
перекрывающихся, комплементарных олигонуклеотидов, каждый из которых имеет длину между 20 и 60
нуклеотидами. Каждый внутренний участок этого гена имеет комплементарные 3'- и 5'-концевые удлинения, сконструированные для образования пар нуклеотидов точно с соседним участком. Таким образом,
после сборки данного гена процесс завершают заделыванием разрывов (ников) вдоль каркасов этих двух
цепей с использованием ДНК-лигазы Т4. Кроме кодирующей белок последовательности, синтетические
гены могут быть сконструированы с концевыми последовательностями, которые облегчают встраивание
в сайт рестрикционной эндонуклеазы (рестриктазы) клонирующего вектора. Кроме того, должны быть
добавлены другие последовательности, которые содержат сигналы для правильной инициации и терминации транскрипции и трансляции.
Альтернативным способом получения полноразмерного гена является синтез описанного набора
перекрывающихся олигонуклеотидов (40-100 нуклеотидов). После отжига 3' и 5' коротких перекрывающихся комплементарных районов (6-10 нуклеотидов) большие промежутки (гэпы) все еще остаются, но
эти короткие районы спаренных нуклеотидов являются как достаточно длинными, так и стабильными
для удерживания вместе этой структуры. Гэпы заполняются, и ДНК-дуплекс завершается через ферментативный синтез ДНК ДНК-полимеразой I E. coli. После завершения ферментативного синтеза разрывы
(ники) заделываются ДНК-лигазой Т4. Двухцепочечные конструкции последовательно связывают друг с
другом с образованием полной последовательности гена, которую проверяют анализом последовательности ДНК. См. Glick and Pasternak, Molecular Biotechnology, Principles and Applications of Recombinant
DNA (ASM Press, Washington, D.C. 1994); Itakura et al., Annu. Rev. Biochem. 53:323-56, 1984; и Climie et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:633-7, 1990.
Далее, данное изобретение обеспечивает копии полипептидов и полинуклеотидов из других видов
(ортологи). Эти виды включают в себя, но не ограничиваются ими, виды млекопитающих, птиц, земноводных, пресмыкающихся, рыб, насекомых и другие виды позвоночных и беспозвоночных. Особый интерес представляют собой полипептиды zalpha11 из других видов млекопитающих, в том числе полипептиды мышей, свиньи, овцы, коровы, псовых, кошачьих, лошадиных видов и полипептиды других приматов. Ортологи zalpha11 человека могут быть клонированы с использованием информации и композиций,
обеспеченных данным изобретением, в сочетании с общепринятыми способами клонирования. Например, кДНК может быть клонирована с использованием мРНК, полученной из типа ткани или клеток, которые экспрессируют этот белок. Подходящие источники мРНК могут быть идентифицированы зондированием Нозерн-блотов зондами, сконструированными из описанных здесь последовательностей. Затем
готовят библиотеку из мРНК позитивной ткани или линии клеток. Затем кодирующая полипептид
zalpha11 кДНК может быть выделена различными способами, такими как зондирование полной или частичной кДНК человека или одним или несколькими наборами вырожденных зондов, основанных на описанных последовательностях. Эта кДНК может быть также клонирована с использованием полимеразной
цепной реакции, или ПЦР (Mullis, supra), с применением праймеров, сконструированных из описанной
здесь характерной последовательности zalpha11 человека. В дополнительном способе, эта библиотека
кДНК может быть использована для трансформации или трансфекции клеток-хозяев, и экспрессия представляющей интерес кДНК может быть детектирована антителом к полипептиду zalpha11. Подобные
способы могут быть применены также для выделения геномных клонов.
Субъединицы рецепторов цитокинов характеризуются мультидоменной структурой, содержащей
внеклеточный домен, трансмембранный домен, который закрепляет этот полипептид в клеточной мембране, и внутриклеточный домен. Внеклеточный домен может быть лигандсвязывающим доменом, а
внутриклеточный домен может быть эффекторным доменом, участвующим в трансдукции (передаче)
сигнала, хотя лигандсвязывающая и эффекторная функции могут находиться на различных субъединицах мультимерного рецептора. Лигандсвязывающий домен сам является мультидоменной структурой.
Мультимерные рецепторы включают в себя гомодимеры (например, изоформы αα и ββ PDGF-рецептора,
рецептор эритропоэтина, MPL и G-CSF-рецептор), гетеродимеры, каждая из субъединиц которых имеет
лигандсвязывающие и эффекторные домены (например, изоформа αβ PDGF-рецептора), и мультимеры,
имеющие компоненты-субъединицы с, по существу, различными функциями (например, рецепторы IL-2,
IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7 и GM-CSF). Некоторые субъединицы рецепторов являются общими для множества рецепторов. Например, субъединица AIC2B, которая сама не может связывать лиганд, но включает
в себя домен внутриклеточной трансдукции сигнала, является компонентом рецепторов IL-3 и GM-CSF.
Многие рецепторы цитокинов могут быть помещены в одно из четырех родственных семейств на основе
их структуры и функции. Например, гемопоэтические рецепторы отличаются присутствием домена, содержащего консервативные остатки цистеина и мотива WSXWS (SEQ ID NO:3). Структура рецепторов
цитокинов обсуждалась в обзоре Urdal, Ann. Reports Med. Chem. 26:221-228, 1991 и Cosman, Cytokine
5:95-106, 1993. Под селективным давлением потребности организмов в приобретении новых биологических функций новые члены семейств рецепторов, по-видимому, возникают из дупликации существую- 12 -
006501
щих генов рецепторов, приводя к существованию мультигенных семейств. Таким образом, члены семейств содержат остатки (признаки) предкового гена (гена предков), и эти характерные признаки могут
быть использованы в выделении и идентификации дополнительных членов семейств. Таким образом,
суперсемейство рецепторов цитокинов подразделяется на несколько семейств, например семейство иммуноглобулинoв (в том числе рецепторы CSF-1, MGF, IL-1 и PDGF); семейство гематопоэтинов (в том
числе β-субъединица IL-2-рецептора, α-субъединица GM-CSF-рецептора, β-субъединица GM-CSFрецептора; и рецепторы G-CSF, ЕРО, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7 и IL-9); семейство TNF-рецепторов (в том
числе рецепторы TNF (р80), TNF (р60), CD27, CD30, CD40, Fas и NGF).
Анализ последовательности zalpha11 предполагает, что он является членом того же самого подсемейства рецепторов, что и подсемейство β-субъединицы IL-2-рецептора, IL-3-, IL-4- и IL-6-рецепторов.
Некоторые рецепторы в этом подсемействе (например, G-CSF) связываются с образованием гомодимеров, которые осуществляют передачу сигнала. Другие члены этого подсемейства (например, IL-6-, IL-11и LIF-рецепторы) объединяются со второй субъединицей (называемой β-субъединицей) для связывания
лиганда и трансдукции сигнала. Специфические β-субъединицы связываются со множеством специфических субъединиц рецепторов цитокинов. Например, β-субъединица gp130 (Hibi et al., Cell 63:1149-1157,
1990) связывается с субъединицами рецепторов, специфическими для IL-6, IL-11 и LIF (Gearing et al.,
EMBO J. 10:2839-2848, 1991; Gearing et al., U.S. Patent No. 5284755). Онкостатин М связывается с гетеродимером LIF-рецептора и gp130. CNTF связывается с тримерными рецепторами, содержащими CNTFрецептор, LIF-рецептор и субъединицы gp130.
Полинуклеотидная последовательность для мышиного ортолога zalpha11 человека была идентифицирована и показана в SEQ ID NO:84, а соответствующая аминокислотная последовательность показана
в SEQ ID NO:85. Анализ мышиного полипептида zalpha11, кодируемого последовательностью ДНК SEQ
ID NO:84, выявил открытую рамку считывания, кодирующую 529 аминокислот (SEQ ID NO:85), содержащих предсказанный секреторный сигнальный пептид из 19 аминокислотных остатков (остаток 1 (Met)остаток 19 (Ser) SEQ ID NO:85) и зрелый полипептид из 510 аминокислот (остаток 20 (Cys) - остаток 529
(Ser) SEQ ID NO:2). Кроме мотива WSXWS (SEQ ID NO:3), соответствующего остаткам 214-218 SEQ ID
NO:85, этот рецептор содержит цитокинсвязывающий домен из приблизительно 200 аминокислотных
остатков (остатки 20 (Cys)-237 (His) SEQ ID NO:85); линкер доменов (остатки 120 (Pro)-123 (Pro) SEQ ID
NO:85); предпоследний район цепи (остатки 192 (Lys)-202 (Ala) SEQ ID NO:85); трансмембранный домен
(остатки 238 (Met)-254 (Leu) SEQ ID NO:85); полный внутриклеточный домен передачи сигнала (остатки
255 (Lys)-529 (Ser) SEQ ID NO:85), который содержит сайт передачи сигнала «Box I» (остатки 266 (Ilе)273 (Pro) SEQ ID NO:85) и сайт передачи сигнала «Box II» (остатки 301 (Ile)-304 (Val) SEQ ID NO:2).
Сравнение аминокислотных последовательностей полипептидов человека и мыши выявило, что как человеческий полипептид, так и полипептид-ортолог содержат соответствующие структурные признаки,
описанные выше (см., например, фиг. 2). Зрелая последовательность для мышиного zalpha11 начинается
при Cys20 (как показано в SEQ ID NO:85), который соответствует Cys20 (как показано в SEQ ID NO:2) в
человеческой последовательности. Существует приблизительно 63% идентичность между мышиной и
человеческой последовательностями на протяжении всей аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:85. Существует приблизительно 69% идентичность между мышиной и человеческой последовательностями zalpha11 на протяжении внеклеточного цитокинсвязывающего домена, соответствующего остатками 20 (Cys)-237 (His) SEQ ID NO:2 и остаткам 20 (Cys)-237 (His)
SEQ ID NO:85. Существует приблизительно 60% идентичность между мышиной и человеческой последовательностями zalpha11 на протяжении внутриклеточного домена передачи сигнала, соответствующего остаткам 256 (Lys)-538 (Ser) SEQ ID NO:2 и остаткам 255 (Lys)-529 (Ser) SEQ ID NO:85. Приведенные
выше процентные идентичности определяли с использованием программы FASTA с ktup=1, penalty открывания гэпа=12, penalty удлинения гэпа=2 и матрицей замен=BLOSUM62, с другими параметрами по
умолчанию. Соответствующие полинуклеотиды, кодирующие описанные выше районы, домены, мотивы, остатки и последовательности мышиного полипептида zalpha11, показаны в SEQ ID NO:84.
Специалистам в данной области будет понятно, что последовательность, описанная в SEQ ID NO:1,
представляет отдельный аллель ДНК zalpha11 человека и что ожидается существование аллельной вариации и альтернативного сплайсинга. Aллельные варианты этой последовательности могут быть клонированы зондированием библиотек кДНК или геномных библиотек из различных индивидуумов в соответствии со стандартными процедурами. Aллельные варианты последовательности ДНК, показанной в
SEQ ID NO:1, в том числе варианты, содержащие молчащие мутации, и варианты, в которых мутации
приводят к изменениям в последовательности аминокислот, находятся в объеме данного изобретения,
так же как и белки, которые являются аллельными вариантами SEQ ID NO:2. кДНК, генерируемые из
образованных альтернативным сплайсингом мРНК, которые сохраняют свойства полипептида zalpha11,
включены в объем данного изобретения, так же как полипептиды, кодируемые такими кДНК и мРНК.
Aллельные варианты и сплайсинговые варианты этих последовательностей могут быть клонированы
зондированием библиотек кДНК или геномных библиотек из различных индивидуумов или тканей в соответствии со стандартными процедурами, известными в данной области.
- 13 -
006501
Данное изобретение обеспечивает также выделенные полипептиды zalpha11, которые являются, по
существу, одинаковыми с полипептидами SEQ ID NO:2 и их ортологами. Термин "по существу одинаковый" используется здесь для обозначения полипептидов, имеющих по меньшей мере 70%-ную, более
предпочтительно по меньшей мере 80%-ную идентичность последовательностям, показанным в SEQ ID
NO:2, или их ортологам. Такие полипептиды будут более предпочтительно по меньшей мере на 90% и
наиболее предпочтительно по меньшей мере на 95% или более идентичны SEQ ID NO:2 или ее ортологам. Процентную идентичность последовательности определяют общепринятыми способами. См., например, Altschul et al., Bull. Math. Bio. 48: 603-616 (1986) и Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 89: 10915-10919 (1992). Вкратце, две последовательности аминокислот сопоставляют выстраиванием для оптимизации оценок сопоставления с использованием penalty открывания гэпа 10 и penalty удлинения гэпа 1 и оценочной матрицы "blosom 62" Henikoff and Henikoff (ibid.), показаной в табл. 3 (аминокислоты представлены с использованием стандартных однобуквенных кодов). Затем процентную идентичность рассчитывают как
Общее число идентичных совпадений________________ х 100
[Длина более длинной последовательности плюс число гэпов, введенных
в более длинную последовательность для сопоставления этих двух последовательностей]
Таблица 3
Идентичность последовательности полинуклеотидных молекул определяют подобными способами
с использованием отношения, описанного выше.
Специалистам в данной области должно быть понятно, что имеется много установленных алгоритмов для сопоставления аминокислотных последовательностей. Алгоритм поиска сходства «FASTA»
Pearson и Lipman представляет собой подходящий способ сопоставления белков для исследования уровня идентичности, разделяемой описанной здесь аминокислотной последовательностью и аминокислотной последовательностью возможного варианта zalpha11. Алгоритм FASTA описан Pearson and Lipman,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988) и Pearson, Meth. Enzymol. 183:63 (1990).
Вкратце, FASTA сначала характеризует сходство последовательностей путем идентификации районов, общих у запрашиваемой последовательности (например, SEQ ID NO:2) и тест-последовательности,
которые имеют либо более высокую плотность идентичностей (если переменная ktup=1), либо пар идентичностей (если ktup=2), без учета консервативных аминокислотных замен, инсерций или делеций. Затем
десять районов с наиболее высокой плотностью идентичностей повторно оценивают сравнением сходства всех спаренных аминокислот с использованием матрицы аминокислотных замен, а концы районов
«подравнивают» для включения только остатков, которые способствуют наивысшей оценке. Если имеется несколько районов с оценками, большими, чем величина «отсечения» (рассчитанная по предварительно определенной формуле на основе длины данной последовательности и ее величины ktup), то приведенные в порядок подравниванием первоначальные районы исследуют для определения, могут ли эти
районы быть соединены с образованием приближенного сопоставления с гэпами. Наконец, районы с
- 14 -
006501
наивысшей оценкой двух аминокислотных последовательностей сопоставляют с использованием модификации алгоритма Needleman-Wunsch-Sellers (Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:444 (1970); Sellers,
SIAM J. Appl. Math. 26:787 (1974)), который делает возможными инсерции и делеции аминокислот.
Предпочтительными параметрами для анализа FASTA являются ktup=1, penalty открывания гэпа=10,
penalty удлинения гэпа=1 и оценочная матрица=ВLOSUM62, с другими параметрами, установленными
по умолчанию. Эти параметры могут быть введены в программу FASTA модификацией файла оценочной
матрицы («SMATRIX»), как объясняется в приложении 2 Pearson, Neth. Enzymol. 183:63 (1990).
Программа FASTA может быть использована для определения идентичности последовательности
молекул нуклеиновых кислот с использованием приведенного выше отношения. Для сравнений нуклеотидных последовательностей величина ktup может быть в диапазоне между 1 и 6, предпочтительно от 3
до 6, наиболее предпочтительно 3, с другими параметрами, установленными по умолчанию.
Таблица BLOSUM62 (табл. 3) является матрицей замен аминокислот, полученной из приблизительно 2000 локальных множественных сопоставлений сегментов белковых последовательностей, представляющих высококонсервативные районы более чем 500 групп родственных белков (Henikoff and Henikoff,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1992)). Таким образом, частоты замен BLOSUM62 могут быть использованы для определения консервативных аминокислотных замен, которые могут быть введены в
аминокислотные последовательности данного изобретения. Хотя можно сконструировать аминокислотные замены на основе лишь химических свойств (как описано ниже), выражение «консервативные аминокислотные замены» предпочтительно относится к замене, представленной величиной BLOSUM62,
большей чем -1. Например, аминокислотная замена является консервативной, если эта замена характеризуется величиной BLOSUM62 0, 1, 2 или 3. В соответствии с этой системой предпочтительные консервативные аминокислотные замены характеризуются величиной BLOSUM62 по меньшей мере 1 (например,
1, 2 или 3), хотя более предпочтительные консервативные аминокислотные замены характеризуются величиной BLOSUM62 по меньшей мере 2 (например, 2 или 3).
Вариантные полипептиды zalpha11 или, по существу, гомологичные полипептиды zalpha11 характеризуются тем, что они имеют одну или несколько аминокислотных замен, делеций или присоединений.
Эти изменения предпочтительно имеют минорный характер, то есть замены консервативных аминокислот (см. табл. 4) и другие замены, которые не влияют значимо на укладку или активность полипептида;
небольшие делеции, обычно от одной до ~30 аминокислот; и небольшие амино- или карбоксил-концевые
удлинения, такие как аминоконцевой остаток метионина, небольшой линкерный пептид до приблизительно 20-25 остатков, или аффинная метка. Таким образом, данное изобретение включает в себя полипептиды из приблизительно от 489 до приблизительно 568 аминокислотных остатков, которые включают
в себя последовательность, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 90% и более предпочтительно на 95% или более идентична соответствующему району SEQ ID NO:2. Полипептиды, содержащие аффинные метки, могут дополнительно содержать сайт протеолитического расщепления между полипептидом zalpha11 и этой аффинной меткой. Подходящие сайты включают в себя сайты расщепления
тромбином и сайты расщепления фактором Ха.
Таблица 4
Замены консервативных аминокислот
Аргинин
Основные
Лизин
Гистидин
Глутаминовая кислота
Кислые
Аспарагиновая кислота
Глутамин
Полярные
Аспарагин
Лейцин
Гидрофобные
Изолейцин
Валин
Фенилаланин
Ароматические
Триптофан
Тирозин
Глицин
Аланин
Небольшие
Серин
Треонин
Метионин
Данное изобретение дополнительно обеспечивает далее множество других слитых полипептидов и
родственных мультимерных белков, содержащих один или несколько слитых полипептидов. Например,
полипептид zalpha11 может быть получен в виде слитого полипептида для димеризации белка, как описано в патентах США с №№ 5155027 и 5567584. Предпочтительная димеризация белков в этом отноше- 15 -
006501
нии включает в себя домены константной области иммуноглобулина. Слитые белки иммуноглобулинzalpha11 могут экспрессироваться в генетически сконструированных клетках с получением множества
мультимерных аналогов zalpha11. Вспомогательные домены могут быть слиты с полипептидами zalpha11
для нацеливания их на специфические клетки, ткани или макромолекулы (например, коллаген). Полипептид zalpha11 может быть слит с двумя или более частями молекулы, такими как аффинная метка для
очистки белка и нацеливающий домен. Слитые (гибридные) полипептиды могут также содержать один или
несколько сайтов расщепления, в частности, между доменами. См. Tuan et al., Connective Tissue Research
34:1-9, 1996.
Белки данного изобретения могут также содержать не встречающиеся природно аминокислотные
остатки. Не встречающиеся природно аминокислоты включают в себя, без ограничения, транс-3метилпролин, 2,4-метанпролин, цис-4-гидроксипролин, транс-4-гидроксипролин, N-метилглицин, аллотреонин, метилтреонин, гидроксиэтилцистеин, гидроксиэтилгомоцистеин, нитроглутамин, гомоглутамин, пипеколиновую кислоту, тиазолидинкарбоновую кислоту, дегидропролин, 3- и 4-метилпролин, 3,3диметилпролин, трет-лейцин, норвалин, 2-азафенилаланин, 3-азафенилаланин, 4-азафенилаланин и 4фторфенилаланин. В данной области известны несколько способов для включения природно не встречающихся аминокислотных остатков в белки. Например, может быть использована система in vitro, в
которой нонсенс-мутации подавляются с использованием химически аминоацилированных супрессорных тРНК. Способы синтеза аминокислот и аминоацилирования тРНК известны в данной области.
Транскрипцию и трансляцию плазмид, содержащих нонсенс-мутации, проводят в бесклеточной системе,
содержащей экстракт Е. coli S30 и коммерчески доступные ферменты и другие реагенты. Белки очищают
хроматографией (см., например, Robertson et al., J. Am. Chem. Soc. 113: 2722, 1991; Ellman et al.. Methods
Enzymol. 202: 301, 1991; Chung et al., Science 259: 806-9, 1993 и Chung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:
10145-9, 1993). Во втором способе трансляцию проводят в ооцитах Xenopus микроинъекцией мутированной мРНК и химически аминоацилированных супрессорных тРНК (Turcatti et al., J. Biol. Chem. 271:
19991-8, 1996). В третьем способе клетки Е. coli культивируют в отсутствие природной аминокислоты,
которую предстоит заменить (например, фенилаланина), и в присутствии желательной природно не
встречающейся аминокислоты (аминокислот) (например, 2-азафенилаланина, 3-азафенилаланина, 4азафенилаланина или 4-фторфенилаланина). Природно не встречающаяся аминокислота включается в
этот белок вместо ее природной копии. См. Koide et al., Biochem. 33: 7470-7476, 1994. Природно встречающиеся аминокислотные остатки могут быть превращены в природно не встречающиеся разновидности химической модификацией in vitro. Химическая модификация может комбинироваться с сайтнаправленным мутагенезом для дополнительного расширения диапазона замен (Wynn and Richards, Protein Sci.
2: 395-403, 1993).
Аминокислотные остатки zalpha11 могут быть заменены ограниченным числом неконсервативных
аминокислот, аминокислот, которые не кодируются генетическим кодом, не встречающихся природно
аминокислот и неприродных аминокислот.
Незаменимые аминокислоты в полипептидах данного изобретения могут быть идентифицированы в
соответствии с процедурами, известными в данной области, такими как сайт-направленный мутагенез
или аланинсканирующий мутагенез (Cunningham and Wells, Science 244:1081-5, 1989; Bass et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 88: 4498-502, 1991). В последнем способе отдельные мутации аланина вводят при
каждом остатке в молекуле и полученные в результате мутантные молекулы тестируют на биологическую активность (например, на связывание лиганда и трансдукцию сигнала), как описано ниже, для
идентификации аминокислотных остатков, которые являются критическими для активности данной молекулы. См. также Hilton et al., J. Biol. Chem. 271: 4699-4708, 1996. Сайты взаимодействия лигандрецептор, белок-белок или другого биологического взаимодействия могут быть также определены физическим анализом структуры, определяемой такими способами, как ядерный магнитный резонанс, кристаллография, дифракция электронов или фотоаффинное мечение, в связи с мутацией аминокислот
предполагаемого сайта контакта. См., например, de Vos et al., Science 255: 306-312, 1992; Smith et al., J.
Mol. Biol. 224: 899-904, 1992; Wlodaver et al., FEBS Lett. 309: 59-64, 1992. Идентичности незаменимых
аминокислот могут быть также выведены из анализа гомологии с родственными рецепторами.
Могут быть выполнены определения аминокислотных остатков, которые находятся в районах или
доменах, которые являются критическими для сохранения структурной целостности. В этих районах
можно определить специфические остатки, которые будут более или менее устойчивыми к изменению
или сохранению общей третичной структуры молекулы. Способы анализа структуры последовательности включают в себя, но не ограничиваются ими, сопоставление множественных последовательностей с
высокой идентичностью аминокислот или нуклеотидов и компьютерный анализ с использованием доступного программного обеспечения (например, программа просмотра Insight II® и инструменты моделирования гомологии; MSI, San Diego, CA), склонности к образованию вторичной структуры, бинарные
распределения, комплементарную упаковку и скрытые полярные взаимодействия (Barton, Current Opin.
Struct. Biol. 5: 372-376, 1995 и Cordes et al., Current Opin. Struct. Biol. 6: 3-10, 1996). Обычно при конструировании модификаций для молекул или идентификации специфических фрагментов определение
структуры будет сопровождаться оценкой активности модифицированных молекул.
- 16 -
006501
Изменения аминокислотной последовательности выполняют в полипептидах zalpha11 таким образом, чтобы минимизировать разрушение структуры более высокого порядка, существенной для биологической активности. Например, когда полипептид zalpha11 содержит одну или несколько спиралей, изменения в аминокислотных остатках будут выполняться таким образом, чтобы не нарушить геометрию
спиралей и другие компоненты молекулы, где изменения в конформации уменьшают некоторую критическую функцию, например связывание данной молекулы с ее партнерами связывания. Эффекты изменений аминокислотной последовательности могут быть прогнозированы, например, компьютерным моделированием, как описано выше, или определены анализом структуры кристалла (см., например, Lapthorn
et al., Nat. Struct. Biol. 2: 266-268, 1995). Другие способы, которые хорошo известны в данной области,
сравнивают укладку вариантного белка со стандартной молекулой (например, нативным белком). Например, может быть сделано сравнение распределения цистеина в вариантной и стандартной молекулах.
Масс-спектрометрия и химическая модификация с использованием восстановления и алкилирования
обеспечивают способы для определения остатков цистеина, которые ассоциированы с дисульфидными
связями или свободны от таких ассоциаций (Bean et al., Anal. Biochem. 201: 216-226, 1992; Gray, Protein
Sci. 2: 1732-1748, 1993 и Patterson et al., Anal. Chem. 66:3727-3732, 1994). Обычно считается, что, если
модифицированная молекула не имеет такого же распределения дисульфидных связей, что и стандартная
молекула, укладка может быть нарушенной. Другим хорошо известным и общепринятым способом измерения укладки является круговой дихроизм (КД). Измерение и сравнение КД-спектров, генерируемых
модифицированной молекулой и стандартной молекулой, является рутиной (Johnson, Proteins 7: 205-214,
1990). Кристаллография представляет собой другой хорошо известный способ для анализа укладки и
структуры. Ядерный магнитный резонанс (ЯМР), ферментативное пептидное картирование и картирование эпитопов также являются известными способами для анализа сходства укладки и структуры между
белками и полипептидами (Schaanan et al., Science 257: 961-964, 1992).
Может быть получен профиль гидрофильности Hopp/Woods белковой последовательности zalpha11,
показанной в SEQ ID NO:2 (Hopp et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 78: 3824-3828, 1981; Hopp, J. Immun. Meth.
88: 1-18, 1986 и Triquier et al., Protein Engineering 11: 153-169, 1998). См. фиг. 1. Этот профиль основан на
скольжении окна для шести остатков. Скрытые остатки G, S и Т и экспонированные (открытые) остатки
Н, Y и W не принимаются во внимание. Например, в zalpha1 гидрофильные районы включают в себя
аминокислотные остатки 55-60 SEQ ID NO:2, аминокислотные остатки 56-61 SEQ ID NO:2, аминокислотные остатки 139-144 SEQ ID NO:2, аминокислотные остатки 227-232 SEQ ID NO:2 и аминокислотные
остатки 364-369 SEQ ID NO:2.
Специалистам в данной области будет понятно, что гидрофильность или гидрофобность следует
учитывать при конструировании модификаций в аминокислотной последовательности полипептида
zalpha11, так чтобы не нарушить общий структурный и биологический профиль. Особый интерес для
замены представляют гидрофобные остатки, выбранные из группы, состоящей из Val, Leu и Ilе, или из
группы, состоящей из Met, Gly, Ser, Ala, Туr и Тrр. Например, остатки, устойчивые к замене, могли бы
включать в себя такие остатки, как показано в SEQ ID NO:2. Однако остатки цистеина могли бы быть
относительно неустойчивыми к замене.
Идентичности незаменимых аминокислот могут быть также выведены из анализа сходства последовательности между членами рецепторов цитокинов класса I с zalpha11. С использованием способов,
таких как анализ «FASTA», описанный выше, районы высокого сходства идентифицируют в семействе
белков и используют для анализа аминокислотной последовательности для консервативных районов.
Альтернативным подходом к идентификации вариантного полинуклеотида zalpha11 на основе структуры
является определение, может ли молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая потенциальный вариантный полинуклеотид zalpha11, гибридизоваться с молекулой нуклеиновой кислоты, имеющей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1, как обсуждалось выше.
Другими способами идентификации незаменимых аминокислот в полипептидах данного изобретения
являются процедуры, известные в данной области, такие как сайт-направленный мутагенез или аланинсканирующий мутагенез (Cunningham and Wells, Science 244: 1081 (1989); Bass et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 88: 4498 (1991), Coombs and Corey, «Site-Directed Mutagenesis and Protein Engineering» in Proteins:
Analysis and Design, Angeletti (ed.), pages 259-311 (Academic Press, Inc. 1998)). В последнем способе отдельные мутации аланина вводят при каждом остатке в молекуле и полученные в результате мутантные
молекулы тестируют на биологическую активность, как описано ниже, для идентификации аминокислотных остатков, которые являются критическими для активности данной молекулы. См. также Hilton et
al., J. Biol. Chem. 271: 4699 (1996).
Данное изобретение относится также к функциональным фрагментам полипептидов zalpha11 и молекулам нуклеиновых кислот, кодирующим такие функциональные фрагменты. «Функциональный»
zalpha11 или его фрагмент, определенный здесь, отличается его пролиферативной и дифференцирующей
активностью, его способностью индуцировать или ингибировать специализированные клеточные функции или его способностью специфически связываться с антителом против zalpha11 или лигандом
zalpha11 (растворимым или иммобилизованным). Как описано ранее, zalpha11 характеризуется структурой рецептора цитокина класса I. Таким образом, данное изобретение дополнительно обеспечивает сли- 17 -
006501
тые (гибридные) белки, включающие в себя (а) полипептидные молекулы, содержащие описанные здесь
внеклеточный или внутриклеточный домены; и (b) функциональные фрагменты, содержащие один или
несколько из этих доменов. Другая полипептидная часть слитого белка может состоять из другого рецептора цитокина класса I, например β-субъединицы IL-2-рецептора и β-субъединицы, общей для ряда рецепторов (т.е. β-субъединиц IL-3-, IL-5- и GM-CSF-рецепторов) или из ненативного и/или неродственного секреторного сигнального пептида, который облегчает секрецию слитого белка.
Рутинный делеционный анализ молекул нуклеиновых кислот может быть проведен для получения
функциональных фрагментов молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид zalpha11. В качестве иллюстрации, молекулы ДНК, имеющие нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1 или ее
фрагменты, могут быть расщеплены нуклеазой Ваl31 с получением ряда «вмонтированных» делеций.
Затем эти фрагменты ДНК вставляют в экспрессирующие векторы в правильной рамке считывания и
экспрессированные полипептиды выделяют и тестируют на активность zalpha11 или на способность связываться с антителами против zalpha11 или лигандом zalpha11. Альтернативой расщеплению экзонуклеазой является использование олигонуклеотид-направленного мутагенеза для введения делеций или стопкодонов для особого определения получения желательного фрагмента zalpha11. Альтернативно, определенные фрагменты полинуклеотида zalpha11 могут быть синтезированы с использованием полимеразной
цепной реакции.
Стандартные способы идентификации функциональных доменов хорошо известны лицам с обычной
квалификацией в данной области. Например, исследования на одном или на обоих концах укороченных
интерферонов суммированы Horisberger and Di Marco, Pharmac. Ther. 66:507 (1995). Кроме того, стандартные способы для функционального анализа белков описаны, например, Treuter et al., Molec. Gen. Genet. 240:
113 (1993); Content et al., «Expression and preliminary deletion analysis of the 42 kDa 2-5A synthetase induced by
human interferon» in Biological Interferon Systems, Proceedings of ISIR-TNO Meeting on Interferon Systems,
Cantell (ed.), pages 65-72 (Nijhoff 1987); Herschman, «The EGF Receptor» in Control of Animal Cell Proliferation
1, Boynton et al., (eds.) pages 169-199 (Academic Press 1985); Coumailleau et al., J. Biol. Chem. 270:29270
(1995); Fukunaga et al., J. Biol. Chem. 270:25291 (1995); Yamaguchi et al., Biochem. Pharmacol. 50:1295
(1995) и Meisel et al., Plant Molec. Biol. 30:1 (1996).
Многочисленные аминокислотные замены могут быть произведены и тестированы с использованием известных способов мутагенеза и скрининга, таких как описанные Reidhaar-Olson and Sauer (Science
241:53-57, 1988) или Bowie and Sauer (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156, 1989). Вкратце, эти авторы описывают способы одновременной рандомизации двух или более положений в полипептиде, отбора
на функциональный полипептид и затем секвенирования мутагенизированных полипептидов для определения спектра допустимых замен в каждом положении. Другие способы, которые могут быть использованы, включают в себя способ фагового представления (например, Lowman et al., Biochem. 30: 1083210837, 1991; Ladner et al., U.S. Patent No. 5 223 409; Huse, WIPO Publication WO 92/062045) и районнаправленный мутагенез (Derbyshire et al., Gene 46: 145, 1986; Ner et al., DNA 7: 127, 1988).
Варианты описанных последовательностей ДНК и полипептида zalpha11 могут быть образованы
перетасовкой ДНК, описанной Stemmer, Nature 370: 389-91, 1994, Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:
10747-51, 1994 и WIPO Publication WO 97/20078. Вкратце, вариантные ДНК генерируют посредством
гомологичной рекомбинации in vitro случайной фрагментацией исходной ДНК с последующей повторной сборкой при помощи ПЦР, приводящей к случайно введенным точковым мутациям. Этот способ
может быть модифицирован с использованием семейства исходных ДНК, таких как аллельные варианты
или ДНК из различных видов, для введения дополнительной вариабельности в этот процесс. Отбор или
скрининг на желательную активность с последующими дополнительными повторениями мутагенеза и
анализа обеспечивает быструю "эволюцию" последовательностей посредством отбора на желательные
мутации с одновременным отбором против вредных изменений.
Способы мутагенеза, описанные выше, могут комбинироваться с высокопроизводительными автоматизированными способами скрининга для обнаружения активности клонированных мутагенизированных полипептидов рецепторов zalpha11 в клетках-хозяевах. Предпочтительные анализы включают в себя
анализы пролиферации и анализы связывания лиганда на основе биосенсора, которые описаны ниже.
Мутагенизированные молекулы ДНК, кодирующие активные рецепторы или их части (например, лигандсвязывающие фрагменты, домены передачи сигналов и т.п.), могут быть извлечены из клеток-хозяев и
быстро секвенированы с использованием современного оборудования. Эти способы делают возможным
быстрое определение важности индивидуальных аминокислотных остатков в представляющем интерес
полипептиде и могут применяться к полипептидам неизвестной структуры.
Кроме того, белки данного изобретения (или их полипептидные фрагменты) могут быть соединены
с другими биоактивными молекулами, в частности другими цитокинами, для обеспечения полифункциональных молекул. Например, одна или несколько спиралей из zalpha11 могут быть соединены с другими
цитокинами для усиления их биологических свойств или эффективности получения.
Таким образом, данное изобретение обеспечивает ряд новых, гибридных молекул, у которых сегмент, содержащий одну или несколько спиралей zalpha11, слит с другим полипептидом. Слияние пред- 18 -
006501
почтительно производят сплайсингом на уровне ДНК, чтобы сделать возможной экспрессию химерных
молекул в рекомбинантных системах получения. Полученные молекулы анализируют затем на такие
свойства, как улучшенная растворимость, улучшенная стабильность, пролонгированный полупериод выведения, улучшенные уровни экспрессии и секреции и фармакодинамику. Такие гибридные молекулы
могут, кроме того, содержать дополнительные аминокислотные остатки (например, полипептидный линкер) между компонентами-белками или компонентами-полипептидами.
При помощи обсуждаемых здесь способов специалист с обычной квалификацией в данной области
может идентифицировать и/или получить многочисленные полипептидные фрагменты или варианты
SEQ ID NO:2, которые сохраняют активность трансдукции сигналов или лигандсвязывающую активность. Например, можно получить «растворимый рецептор» zalpha11 путем получения множества полипептидов, которые являются, по существу, гомологичными цитокинсвязывающему домену (остаткам 20
(Cys)-237 (His) SEQ ID NO:2 или ее аллельным вариантам или видовым ортологам) и сохраняют лигандсвязывающую активность белка zalpha11 дикого вида. Такие полипептиды могут включать в себя дополнительные аминокислоты, например, из части или полных трансмембранного и внутриклеточного
доменов. Такие полипептиды могут также содержать дополнительные полипептидные сегменты, как в
общем виде описано здесь, такие как метки, аффинные метки и т.п.
Для любого полипептида zalpha11, в том числе вариантов, растворимых рецепторов и слитых полипептидов или белков, специалист с обычной квалификацией в данной области сможет легко получить
полностью вырожденную полинуклеотидную последовательность, кодирующую такой вариант, с использованием информации, приведенной в табл. 1 и 2 выше.
Полипептиды zalpha11 данного изобретения, в том числе полноразмерные полипептиды, биологически активные фрагменты и гибридные полипептиды, могут продуцироваться в генетически сконструированных клетках-хозяевах в соответствии с общепринятыми способами. Подходящими клеткамихозяевами являются те типы клеток, которые могут быть трансформированы или трансфицированы экзогенной ДНК и выращены в культуре, и они включают в себя бактерии, грибковые клетки и культивируемые высшие эукариотические клетки. Эукариотические клетки, в частности культивируемые клетки
многоклеточных организмов, являются предпочтительными. Способы манипулирования клонированными молекулами ДНК и введения экзогенной ДНК в различные клетки-хозяева описаны в Sambrook et al.,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,
NY, 1989 и Ausubel et al. (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987.
В общих чертах, последовательность ДНК, кодирующую полипептид zalpha11, функционально связывают с другими генетическими элементами, требующимися для ее экспрессии, обычно включающими
в себя промотор и терминатор транскрипции, в экспрессирующем векторе. Этот вектор обычно будет
содержать один или несколько селектируемых маркеров и одну или несколько точек инициации репликации, хотя специалистам в данной области будет понятно, что в некоторых системах селектируемые
маркеры могут быть обеспечены на отдельных векторах и репликация экзогенной ДНК может быть
обеспечена интеграцией в геном клетки-хозяина. Выбор промоторов, терминаторов, селектируемых маркеров, векторов и других элементов является предметом рутинного конструирования в пределах обычной
квалификации в данной области. Многие такие элементы описаны в литературе и являются доступными
через коммерческих поставщиков.
Для направления полипептида zalpha11 в секреторный путь клетки-хозяина в экспрессирующем
векторе обеспечивают секреторную сигнальную последовательность (также известную как лидерная последовательность, пре-пропоследовательность или пре-последовательность). Секреторная сигнальная
последовательность может быть сигнальной последовательностью zalpha11 или может быть произведена
из другого секретируемого белка (например, t-PA (тканевого активатора плазминогена)) или синтезирована de novo. Секреторная сигнальная последовательность функционально соединена с последовательностью ДНК zalpha11, т.е. эти две последовательности соединены в правильной рамке считывания и правильно помещены для направления вновь синтезированного полипептида в секреторный путь клеткихозяина. Секреторные сигнальные последовательности обычно расположены 5' (слева) от последовательности ДНК, кодирующей представляющий интерес полипептид, хотя некоторые сигнальные последовательности могут быть расположены в другом месте в представляющей интерес последовательности
ДНК (см., например, Welch et al., U.S. Patent No. 5 037 743; Holland et al., U.S. Patent No. 5 143 830).
Альтернативно, секреторная сигнальная последовательность, содержащаяся в полипептидах данного изобретения, используется для направления других полипептидов в секреторный путь. Данное изобретение обеспечивает такие гибридные (слитые) полипептиды. Может быть изготовлен сигнальный гибридный полипептид, в котором секреторная сигнальная последовательность, полученная из аминокислотных остатков 1 (Met)-19 (Gly) SEQ ID NO:2, функционально связана с другим полипептидом с использованием способов, известных в этой области и описанных здесь. Секреторная сигнальная последовательность, содержащаяся в гибридных полипептидах данного изобретения, предпочтительно слита на
амино-конце с дополнительным пептидом для направления этого дополнительного пептида в секреторный путь. Такие конструкции имеют многочисленные применения, известные в данной области. Например, эти новые гибридные конструкции с секреторной сигнальной последовательностью могут направ- 19 -
006501
лять секрецию активного компонента обычно несекретируемого белка. Такие гибридные белки могут
быть использованы in vivo и in vitro для направления пептидов через секреторный путь.
Культивируемые клетки млекопитающих являются подходящими хозяевами в данном изобретении.
Способы введения экзогенной ДНК в клетки-хозяева млекопитающих включают в себя опосредованную
фосфатом кальция трансфекцию (Wigler et al., Cell 14:725, 1978; Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics
7:603, 1981; Graham and Van der Eb, Virology 52:456, 1973), электропорацию (Neumann et al., EMBO J.
1:841-845, 1982), опосредованную ДЭАЭ-декстраном трансфекцию (Ausubel et al., ibid.) и опосредованную липосомами трансфекцию (Hawley-Nelson et al., Focus 15:73, 1993; Ciccarone et al., Focus 15:80, 1993)
и вирусные векторы (Miller and Rosman, BioTechniques 7:980-90, 1989; Wang and Finer, Nature Med. 2:714716, 1996). Получение рекомбинантных полипептидов в культивируемых клетках млекопитающих описано, например, Levinson et al., U.S. Patent No. 4 713 339; Hagen et al., U.S. Patent No. 4 784 950; Palmiter et
al., U.S. Patent No. 4 579 821; и Ringold, U.S. Patent No. 4 656 134. Подходящие культивируемые клетки
млекопитающих включают в себя клеточные линии COS-1 (АТСС No. CRL 1650), COS-7 (ATCC No. CRL
1651), ВНК (АТСС No. CRL 1632), ВНК 570 (АТСС No. CRL 10314), 293 (АТСС No. CRL 1573; Graham et
al., J. Gen. Virol. 36:59-72 (1977)) и линии клеток яичника китайского хомячка (например, СНО-К1; АТСС
No. CCL 61). Дополнительные подходящие клеточные линии известны в данной области и доступны из
общественных депозитариев, таких как American Type Culture Collection, Rockville, Maryland. В общем,
предпочтительны сильные промоторы транскрипции, такие как промоторы из SV-40 или цитомегаловируса. См., например, U.S. Patent No. 4 956 288. Другие подходящие промоторы включают в себя промоторы из генов металлотионеина (U.S. Patent No. 4 579 821 и U.S. Patent No. 4 601 978) и основной поздний промотор аденовируса.
Отбор с лекарственным средством обычно применяют для отбора на культивируемые клетки млекопитающих, в которые была встроена чужеродная ДНК. Такие клетки обычно называют "трансфектантами". Клетки, которые культивировались в присутствии селективного агента и способны передавать
представляющий интерес ген их потомству, называют "стабильными трансфектантами". Предпочтительным селектируемым маркером является ген, кодирующий устойчивость к антибиотику неомицину. Отбор проводят в присутствии лекарственного средства типа неомицина, такого как G-418 или т.п. Системы отбора могут быть также использованы для увеличения уровня экспрессии представляющего интерес
гена, т.е. для способа, называемого "амплификацией". Амплификацию проводят культивированием
трансфектантов в присутствии низкого уровня селективного агента и затем увеличением количества селективного агента для отбора клеток, которые продуцируют высокие уровни продуктов введенных генов.
Предпочтительным амплифицируемым селектируемым маркером является дигидрофолатредуктаза, которая сообщает клеткам устойчивость к метотрексату. Другие гены устойчивости к лекарственным средствам (например, устойчивости к гигромицину, множественной устойчивости к лекарственным средствам, пуромицинацетилтрансферазе) также могут быть использованы. Альтернативные маркеры, которые
вводят измененный фенотип, такие как зеленый флуоресцентный белок или белки клеточной поверхности, такие как CD4, CD8, MHC класса I, щелочная фосфатаза плаценты, могут быть использованы для
сортинга трансфицированных клеток от нетрансфицированных клеток такими способами, как FACSсортинг (сортинг клеток с возбуждением флуоресценции) или способ разделения при помощи магнитных
гранул.
Другие высшие эукариотические клетки могут быть также использованы в качестве хозяев, в том
числе клетки растений, клетки насекомых и клетки птиц. Применение Agrobacterium rhizogenes в качестве вектора для экспрессии генов в клетках растений рассмотрено Sinkar et al., J. Biosci. (Bangalore) 11:4758, 1987. Трансформация клеток насекомых и получение в них чужеродных полипептидов описаны
Guarino et al. , U.S. Patent No. 5 162 222 и WIPO publication WO 94/06463. Клетки насекомых могут быть
инфицированы рекомбинантным бакуловирусом, обычно произведенным из вируса ядерного полиэдроза
Autographa californica (AcNPV). См. King L.A. and Possee R.D., The Baculovirus Expression System: A
Laboratory Guide, London, Chapman and Hall; O'Reilly D.R. et al., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory
Manual, New York, Oxford University Press., 1994; и Richardson, C.D., Ed., Baculovirus Expression Protocols.
Methods in Molecular Biology, Totowa, NJ, Humana Press, 1995. Второй способ получения рекомбинантного zalpha11-бакуловируса использует систему на основе транспозона, описанную Luckow (Luckow, V.A.,
et al., J. Virol. 67: 4566-79, 1993). Эта система, которая использует векторы-переносчики, продается в наборе Bac-to-Bac™ (Life Technologies, Rockville, MD). Эта система использует вектор-переносчик, pFastBac1™ (Life Technologies), содержащий транспозон Тn7, для перемещения ДНК, кодирующей полипептид zalpha11, в геном бакуловируса, поддерживаемый в Е. coli, в виде большой плазмиды, названной
"бакмидой". См. Hill-Perkins, M.S. and Possee, R.D., J. Gen. Virol. 71: 971-6. 1990; Bonning, B.C. et al., J.
Gen. Virol. 75: 1551-6, 1994 и Chazenbalk, G.D., and Rapoport, В., J. Biol. Chem. 270: 1543-9, 1995. Кроме
того, векторы-переносчики могут содержать в рамке считывания с ДНК, кодирующей метку эпитопа, на
С- или N-конце экспрессируемого полипептида zalpha11, например, метку эпитопа Glu-Glu (Grussenmeyer, Т. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 7952-4, 1985). При помощи способа, известного в данной области, вектор-переносчик, содержащий zalpha11, трансформируют в Е. соli и подвергают скринингу на бакмиды, которые содержат прерванный ген lacZ, свидетельствующий о рекомбинантном бакуловирусе.
- 20 -
006501
Бакмидную ДНК, содержащую рекомбинантный геном бакуловируса, выделяют при помощи известных
способов и используют для трансфекции клеток Spodoptera frugiperda, например клеток Sf9. Затем получают рекомбинантный вирус, экспрессирующий zalpha11. Исходные материалы рекомбинантного вируса
готовят способами, обычно используемыми в данной области.
Этот рекомбинантный вирус используют для инфицирования клеток-хозяев, обычно клеточной линии, полученной из осенних "походных (ратных) червей", Spodoptera frugiperda. См., в общих чертах,
Glick and Pasternak, Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA, ASM Press,
Washington, D.C., 1994. Другой подходящей клеточной линией является клеточная линия High FiveO™
(Invitrogen), произведенная из Trichoplusia ni (U.S. Patent № 5 300 435). Для выращивания и поддержания
этих клеток используют коммерчески доступные бессывороточные среды. Подходящими средами являются Sf900 II™ (Life Technologies) или ESF 921™ (Expression Systems) для клеток Sf9; или Ex-cellO405™
(JRH Biosciences, Lenexa, KS) или Express FiveO™ (Life Technologies) для клеток T. ni. Используемые
процедуры, в общем, описаны в доступных лабораторных руководствах (King, L.A. and Possee, R.D. ibid.;
O'Reilly, D.R. et al., ibid.; Richardson, C.D., ibid.). Последующая очистка полипептида zalpha11 из супернатанта может быть достигнута с использованием описанных здесь способов.
Грибковые клетки, в том числе дрожжевые клетки, могут быть также использованы в данном изобретении. Виды дрожжей, представляющие особый интерес в этом отношении, включают в себя Saccharomyces
cerevisiae, Pichia pastoris и Pichia methanolica. Способы трансформации клеток S. cerevisiae экзогенной
ДНК и получения из них рекомбинантных полипептидов описаны, например, Kawasaki, U.S. Patent No. 4
599 311; Kawasaki et al., U.S. Patent No. 4 931 373; Brake, U.S. Patent No. 4 870 008; Welch et al., U.S. Patent
No. 5 037 743 и Murray et al., U.S. Patent No. 4 845 075. Трансформированные клетки отбирают по фенотипу, определяемому селектируемым маркером, обычно по устойчивости к лекарственному средству или
по способности расти в отсутствие определенного питательного вещества (например, лейцина). Предпочтительной векторной системой для применения в Saccharomyces cerevisiae является векторная система РОТ1, описанная Kawasaki et al. (U.S. Patent No. 4 931 373), которая позволяет отбирать трансформированные клетки по росту в содержащей глюкозу среде. Подходящие промоторы и терминаторы для
применения в дрожжах включают в себя промоторы и терминаторы из генов гликолитических ферментов
(см., например, Kawasaki, U.S. Patent No. 4 599 311; Kingsman et al., U.S. Patent No. 4 615 974 и Bitter, U.S.
Patent No. 4 977 092) и генов алкогольдегидрогеназы. См. также патенты США с №№ 4 990 446, 5 063 154, 5
139 936 и 4 661 454. Системы трансформации для других дрожжей, в том числе Hansenula polymorpha,
Schizosaccharomyces роmbе, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Ustilago maydis, Pichia pastoris,
Pichia methanolica, Pichia guillermondii и Candida maltosa, известны в данной области. См., например,
Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132:3459-3465, 1986 и Cregg, U.S. Patent No. 4 882 279. Клетки Aspergillus
могут быть использованы в соответствии со способами McKnight et al., U.S. Patent No. 4 935 349. Способы трансформации Acremonium chrysogenum описаны Sumino et al., U.S. Patent No. 5 162 228. Способы
трансформации Neurospora описаны Lambowitz, U.S. Patent No. 4 486 533.
Применение Pichia methanolica в качестве хозяина для получения рекомбинантных белков описано в
WIPO Publications WO 97/17450, WO 97/17451, WO 98/02536 и WO 98/02565. Молекулы ДНК для применения в трансформации Р. methanolica обычно получают в виде двухцепочечных кольцевых плазмид, которые предпочтительно линеаризуют перед трансформацией. Для получения полипептидов в Р. methanolica
предпочтительно, чтобы промотор и терминатор в этой плазмиде были промотором и терминатором гена
Р. methanolica, таким как ген утилизации спирта Р. methanolica (AUG1 или AUG2). Другие применимые
промоторы включают в себя промоторы генов дигидроксиацетонсинтазы (DHAS), формиатдегидрогеназы (FMD) и каталазы (CAT). Для облегчения интеграции этой ДНК в хромосому хозяина предпочтительно иметь весь сегмент экспрессии этой плазмиды, фланкированный на обоих концах последовательностями ДНК хозяина. Предпочтительным селектируемым маркером для применения в Pichia methanolica
является ген ADE2 Р. methanolica, который кодирует фосфорибозил-5-аминоимидазолкарбоксилазу
(AIRC; ЕС 4.1.1.21), который позволяет клеткам-хозяевам ade2 расти в отсутствие аденина. Для крупномасштабных, промышленных процессов, где желательно минимизировать применение метанола, предпочтительно использовать клетки-хозяева, в которых делетированы оба гена утилизации метанола
(AUG1 и AUG2). Для получения секретируемых белков предпочтительны клетки-хозяева, дефектные по
генам вакуолярных протеаз (РЕР4 и PRB1). Электропорацию используют для облегчения введения плазмиды, содержащей ДНК, кодирующую представляющий интерес полипептид, в клетки Р. methanolica. Предпочтительно трансформировать клетки Р. methanolica электропорацией с использованием экспоненциально
затухающего, пульсирующего электрического поля, имеющего напряженность поля от 2,5 до 4,5 кВ/см,
предпочтительно примерно 3,75 кВ/см, и константу времени (t) от 1 до 40 мс, наиболее предпочтительно
примерно 20 мс.
Прокариотические клетки-хозяева, в том числе штаммы бактерий Escherichia coli, Bacillus и другие
роды, также являются применимыми клетками-хозяевами в данном изобретении. Способы трансформации этих хозяев и экспрессии клонированных в них чужеродных ДНК хорошо известны в данной области (см, например, Sambrook et al., ibid.). При экспрессии полипептида zalpha11 в бактериях, таких как Е.
coli, этот полипептид может сохраняться в цитоплазме, обычно в виде нерастворимых гранул, или может
- 21 -
006501
быть направлен в периплазматическое пространство бактериальной секреторной последовательностью. В
первом случае эти клетки лизируют и гранулы извлекают и денатурируют при помощи, например, гуанидинизотиоцианата или мочевины. Затем денатурированный полипептид может быть повторно уложен
и димеризован путем разведения продукта денатурации, например, диализом против раствора мочевины
и комбинацией восстановленного и окисленного глутатиона, с последующим диализом против забуференного солевого раствора. В последнем случае этот полипептид может быть извлечен из периплазматического пространства в растворимой и функциональной форме путем разрушения этих клеток (например,
обработкой ультразвуком или осмотическим шоком) для высвобождения содержимого периплазматического пространства и извлечения этого белка, посредством чего устраняется необходимость денатурации
и повторной укладки.
Трансформированные и трансфицированные клетки-хозяева культивируют в соответствии с общепринятыми процедурами в культуральной среде, содержащей питательные вещества и другие компоненты, необходимые для роста выбранных клеток-хозяев. Различные подходящие среды, в том числе среды
с определенным составом среды и комплексные среды, известны в данной области и обычно включают в
себя источник углерода, источник азота, незаменимые аминокислоты, витамины и минеральные соединения. Среды могут также содержать такие компоненты, как факторы роста или сыворотка, если требуется. Среда для выращивания будет обычно производить отбор на клетки, содержащие экзогенно добавленную ДНК, посредством, например, отбора с использованием лекарственного средства или недостаточности незаменимого питательного компонента, который дополняется селектируемым маркером,
имеющимся на экспрессирующем векторе или котрансфицируемым в клетку-хозяина. Клетки Р.
methanolica культивируют в среде, содержащей адекватные источники углерода, азота и микроэлементов,
при температуре приблизительно 25-35°С. Жидкие культуры обеспечивают достаточной аэрацией с использованием общепринятых средств, таких как встряхивание небольших колб или барботирование ферментеров. Предпочтительной культуральной средой для Р. methanolica является YEPD (2% D-глюкоза,
2% Бакто™ пептон (Difco Laboratories, Detroit, MI), 1% бакто™ дрожжевой экстракт (Difco Laboratories),
0,004% аденин и 0,006% L-лейцин).
В одном аспекте данного изобретения рецептор цитокинов zalpha11 (в том числе трансмембранный
и внутриклеточный домены) получают в культивируемой клетке и эту клетку используют для скрининга
на лиганды для этого рецептора, в том числе природный лиганд, а также на агонисты и антагонисты природного лиганда. Для суммирования этого подхода кДНК или ген, кодирующие рецептор, объединяют с
другими генетическими элементами, требующимися для их экспрессии (например, промотором транскрипции), и полученный экспрессирующий вектор встраивают в клетку-хозяина. Клетки, которые экспрессируют эту ДНК и продуцируют функциональный рецептор, отбирают и используют в разнообразных системах скрининга.
Клетки млекопитающих, пригодные для экспрессии новых рецепторов данного изобретения и
трансдукции опосредованного рецептором сигнала, включают в себя клетки, которые экспрессируют βсубъединицу, такую как gр130, и клетки, которые коэкспрессируют gр130 и LIF-рецептор (Gearing et al.,
EMBO J. 10:2839-2848, 1991; Gearing et al., U.S. Patent No. 5284755). В этом отношении, обычно предпочтительно использовать клетку, которая является отвечающей на другие цитокины, которые связываются
с рецепторами в том же самом подсемействе, такие как IL-6 или LIF, поскольку такие клетки будут содержать требующийся путь (пути) трансдукции сигнала. Предпочтительные клетки этого типа включают
в себя линию клеток TF-1 человека (АТСС No. CRL-2003) и клеточную линию DA-1 (Branch et al. , Blood
69:1782, 1987; Broudy et al., Blood 75:1622-1626, 1990). Альтернативно, подходящие клетки-хозяева могут
быть сконструированы для продуцирования β-субъединицы или другого клеточного компонента, требующегося для желательного клеточного ответа. Например, мышиная клеточная линия BaF3 (Palacios
and Steinmetz, Cell 41:727-734, 1984; Mathey-Prevot et al., Mol. Cell. Biol. 6:4133-4135, 1986), клеточная
линия почки детеныша хомячка (ВНК) или клеточная линия CTLL-2 (АТСС TIB-214) могут быть трансфицированы для экспрессии мышиной субъединицы gр130 или мышиной gр130 и рецептора LIF, кроме
zalpha11. Обычно предпочтительно использовать клетку-хозяина и рецептор (рецепторы) из одного и
того же вида, однако, этот подход позволяет сконструировать клеточные линии, экспрессирующие множественные субъединицы рецепторов из любого вида, преодолевая потенциальные ограничения, возникающие из видовой специфичности. Альтернативно, видовые гомологи кДНК рецептора человека могут
быть клонированы и использованы в клеточных линиях из того же самого вида, например мышиная
кДНК в клеточной линии BaF3. Клеточные линии, которые зависят от одного гемопоэтического фактора
роста, такого как IL-3, могут быть, следовательно, сконструированы таким образом, что они становятся
зависимыми от лиганда zalpha11.
Клетки, экспрессирующие функциональный zalpha11, используют в тестах-скринингах. Многочисленные подходящие анализы известны в данной области. Эти анализы основаны на детектировании биологического ответа в клетке-мишени. Одним из таких анализов является анализ пролиферации. Клетки
культивируют в присутствии или в отсутствие тест-соединения и пролиферацию клеток детектируют,
например, измерением включения тритированного тимидина или колориметрическим анализом, осно- 22 -
006501
ванным на метаболическом расщеплении красителя Alymar Blue™ (AccuMed, Chicago, IL) или 3-(4,5диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолийбромида (МТТ) (Mosman, J. Immunol. Meth. 65:55-63, 1983).
Альтернативный формат анализа использует клетки, которые дополнительно конструируют для экспрессии репортерного гена. Репортерный ген связывают с промоторным элементом, который является чувствительным к связанному с данным рецептором пути, и этот анализ детектирует активацию транскрипции
данного репортерного гена. Предпочтительным промоторным элементом в этой связи является сывороточный чувствительный элемент или SRE (см., например, Shaw et al., Cell 56:563-572, 1989). Предпочтительным подобным геном является ген люциферазы (de Wet et al., Mol. Cell. Biol. 1:125, 1987). Экспрессию гена люциферазы детектируют по люминесценции с использованием способов, известных в данной
области (например, Baumgartner et al., J. Biol. Chem. 269:19094-29101, 1994; Schenborn and Goiffin, Promega Notes 41:11, 1993). Наборы для анализа с люциферазой являются коммерчески доступными, например, из Promega Corp., Madison, WI. Клеточные линии-мишени этого типа могут быть использованы для
скрининга библиотек химикалиев, клеточно-кондиционированных культуральных сред, грибковых бульонов, почвенных проб, проб воды и т.п. Например, банк проб клеточно- или тканекондиционированных
сред может быть анализирован на клетку-мишень для идентификации клеток, которые продуцируют лиганд. Затем положительные клетки используют для получения библиотеки кДНК в экспрессирующем
векторе для клеток млекопитающих, который разделяют на два пула, трансфицируют в клетки-хозяева и
экспрессируют. Затем пробы сред из трансфицированных клеток анализируют, с последующим разделением пулов, повторно трансфицируют, субкультивируют и повторно анализируют положительные клетки для выделения клональной клеточной линии, экспрессирующей лиганд. Пробы сред, кондиционированные почкой, печенью, селезенкой, тимусом, другими лимфоидными тканями или Т-клетками, являются предпочтительными источниками лиганда для использования в процедурах скрининга.
Природный лиганд для zalpha11 может быть также идентифицирован мутагенизацией цитокинзависимой клеточной линии, экспрессирующей zalpha11, и культивированием ее в условиях, которые производят отбор на аутокринный рост. См. WIPO publication WO 95/21930. В типичной процедуре клетки,
экспрессирующие zalpha11, мутагенизируют, например, с EMS. Затем клеткам дают придти в нормальное состояние в присутствии требуемого цитокина, затем переносят в культуральную среду, не содержащую цитокина. Выжившие клетки подвергают скринингу на продуцирование лиганда для zalpha11,
например, добавлением растворимого (лигандсвязывающего) рецепторного полипептида в культуральную среду или анализом кондиционированной среды на клетки дикого типа и трансфицированные клетки, экспрессирующие zalpha11. Предпочтительные клеточные линии для применения в данном способе
включают в себя клетки, которые трансфицируют для экспрессии gр130 или gр130 в сочетании с LIFрецептором. Предпочтительные подобные линии клеток-хозяев включают в себя трансфицированные
клетки CTLL-2 (Gillis and Smith, Nature 268:154-156, 1977) и трансфицированные клетки BaF3.
Кроме того, способ секреторной ловушки, использующий растворимый рецепторный полипептид
zalpha11, может быть использован для выделения лиганда zalpha11 (Aldrich et al., Cell 87:1161-1169,
1996). Экспрессионную библиотеку кДНК, полученную из известного или предполагаемого источника
лиганда, трансфицируют в клетки COS-7. Вектор этой библиотеки кДНК обычно имеет начало репликации SV40 для амплификации в клетках COS-7 и промотор CMV для высокой экспрессии. Трансфицированные клетки COS-7 выращивают в монослое и затем фиксируют и делают проницаемыми. Затем меченый или биотин-меченый растворимый рецептор zalpha11, описанный здесь, помещают в контакт с этим
слоем клеток и дают связать клетки в монослое, которые экспрессируют антикомплементарную молекулу, т.е. лиганд zalpha11. Таким образом, клетка, экспрессирующая лиганд, будет связана с рецепторными
молекулами. Антитело против метки (анти-Ig для Ig-гибридов, М2 или анти-FLAG для FLAG-меченых
гибридов, стрептавидин и т.п.), которое конъюгировано с пероксидазой хрена (HRP) используют для визуализации клеток, с которыми связан меченый или биотин-меченый растворимый рецептор zalpha11.
HRP катализирует депонирование тирамидного реагента, например тирамид-FITC. Коммерчески доступный набор может быть использован для этого детектирования (например, Renaissance TSA-Direct™ Kit;
NEN Life Science Products, Boston, MA). Клетки, которые экспрессируют лиганд рецептора zalpha11,
идентифицируют под флуоресцентным микроскопом в виде зеленых клеток и выскребают для последующего клонирования лиганда с использованием процедур для спасения плазмид, как описано в Aldrich
et al., supra, с последующими раундами анализа с секреторной ловушкой до тех пор, пока не будут идентифицированы отдельные клоны.
Рецепторная активность полипептида zalpha11 может быть измерена биосенсорным микрофизиометром на основе кремния, который измеряет скорость внеклеточного подкисления или экскрецию протонов, связанную со связыванием рецептора и последующими физиологическими клеточными ответами.
Примером устройства является микрофизиометр Cytosensor™, изготовляемый Molecular Devices, Sunnyvale,
CA. Разнообразные клеточные ответные реакции, такие как пролиферация клеток, ионный транспорт,
продуцирование энергии, воспалительный ответ, регуляторная и рецепторная активация и т.п., могут
быть измерены этим способом. См., например, McConnell, H.M. et al., Science 257:1906-1912, 1992; Pitchford,
S. et al., Meth. Enzymol. 228:84-108, 1997; Arimilli, S. et al., J. Immunol. Meth. 212:49-59, 1998; Van Liefde,
I. et al., Eur. J. Pharmacol. 346:87-95, 1998. Микрофизиометр может быть использован для анализа эука- 23 -
006501
риотических, прокариотических, прикрепленных или неприкрепленных клеток. Путем измерения изменений внеклеточного подкисления в клеточных средах во времени микрофизиометр измеряет непосредственно клеточные ответные реакции на различные стимулы, в том числе агонисты, лиганды или антагонисты полипептида zalpha11. Предпочтительно микрофизиометр используют для измерения ответов экспрессирующей zalpha11 эукариотической клетки в сравнении с контрольной эукариотической клеткой,
которая не экспрессирует полипептид zalpha11. Экспрессирующие zalpha11 эукариотические клетки
включают в себя клетки, в которые был трансфицирован zalpha11, как описано здесь, с образованием
клетки, которая отвечает на модулирующие zalpha11 стимулы, или клетки, природно экспрессирующие
zalpha11, такие как экспрессирующие zalpha11 клетки, полученные из лимфоидной ткани, ткани селезенки, ткани тимуса или PBL. Различия, измеренные по увеличению или уменьшению во внеклеточном подкислении в ответной реакции клеток, экспрессирующих zalpha11, относительно контроля, являются прямым измерением модулируемых zalpha11 клеточных ответов. Кроме того, такие модулированные
zalpha11 ответы могут анализироваться при действии различных стимулов. С использованием микрофизиометра обеспечен также способ идентификации агонистов и антагонистов полипептида zalpha11, предусматривающий обеспечение клеток, экспрессирующих полипептид zalpha11, культивирование первой
порции этих клеток в отсутствие тест-соединения, культивирование второй порции этих клеток в присутствии тест-соединения и детектирование увеличения или уменьшения в клеточной ответной реакции
второй порции клеток в сравнении с первой порцией клеток. Антагонисты и агонисты, в том числе природный лиганд для полипептида zalpha11, могут быть быстро идентифицированы с использованием этого способа.
Дополнительные анализы, обеспечиваемые данным изобретением, включают в себя применение
гибридных рецепторных полипептидов. Эти гибридные полипептиды подразделяются на два основных
класса. В первом классе внутриклеточный домен zalpha11, содержащий приблизительно остатки 256
(Lys)-528 (Ser) SEQ ID NO:2, соединен с лигандсвязывающим доменом второго рецептора. Предпочтительно, чтобы второй рецептор был рецептором гемопоэтического цитокина, таким как mpl-рецептор
(Souyri et al., Cell 63:1137-1147, 1990). Этот гибридный рецептор будет дополнительно содержать трансмембранный домен, который может происходить из любого рецептора. Затем конструкцию ДНК, кодирующую этот гибридный рецептор, встраивают в клетку хозяина. Клетки, экспрессирующие гибридный
рецептор, культивируют в присутствии лиганда для связывающего домена и анализируют на ответную
реакцию. Эта система обеспечивает средство для анализа трансдукции сигнала, опосредованной
zalpha11, с использованием легкодоступных лигандов.
Эта система может быть также использована для определения, способны ли конкретные клеточные
линии отвечать на сигналы, трансдуцируемые zalpha11. Второй класс гибридных рецепторных полипептидов включает в себя внеклеточный (лигандсвязывающий) домен zalpha11 (приблизительно остатки 20
(Cys)-237 (His) SEQ ID NO:2) с цитоплазматическим доменом второго рецептора, предпочтительно рецептора цитокина, и трансмембранным доменом. Трансмембранный домен может происходить из любого рецептора. Гибридные рецепторы этого второго класса экспрессируются в клетках, о которых известно, что они способны отвечать на сигналы, передаваемые вторым рецептором. Вместе эти два класса
гибридных рецепторов способны использовать широкий спектр клеточных типов в системах анализа на
основе рецепторов.
Клетки, которые, как обнаруживается, экспрессируют zalpha11, используют затем для приготовления библиотеки кДНК, из которой кодирующая лиганд кДНК может быть выделена, как описано выше.
Таким образом, данное изобретение обеспечивает, кроме новых рецепторных полипептидов, способы для
клонирования полипептидных лигандов для этих рецепторов.
Тканеспецифичность экспрессии zalpha11 предполагает роль в раннем развитии тимоцитов и регуляции иммунного ответа. Эти процессы включают в себя стимуляцию пролиферации и дифференцировки
клеток в ответ на связывание одного или нескольких цитокинов с их родственными рецепторами. Ввиду
тканевого распределения, наблюдаемого для этого рецептора, агонисты (в том числе природный лиганд)
и антагонисты имеют огромный потенциал в применениях как in vitro, так и in vivo. Соединения, идентифицированные в качестве агонистов рецептора, применимы для стимуляции пролиферации и развития
клеток-мишеней in vitro и in vivo. Например, соединения-агонисты применимы в качестве компонентов
определенных сред для культуры клеток и могут использоваться отдельно или в комбинации с другими
цитокинами и гормонами для замены сыворотки, которую обычно применяют в клеточной культуре. Таким образом, агонисты применимы в специфической стимуляции роста и/или развития Т-клеток, Вклеток и других клеток лимфоидной и миелоидной линий дифференцировки и гемопоэтических клеток в
культуре.
Лиганды-агонисты для zalpha11 могут быть полезны в стимуляции клеточно-опосредованного иммунитета и для стимуляции пролиферации лимфоцитов, например в лечении инфекций, включающих в
себя иммуносупрессию, в том числе некоторых вирусных инфекций. Дополнительные применения
включают в себя супрессию опухолей, когда злокачественное превращение приводит к опухолевым
клеткам, которые являются антигенными. Лиганды-агонисты могли бы использоваться для индукции
цитотоксичности, которая может быть опосредована активацией эффекторных клеток, таких как Т-клет- 24 -
006501
ки, NK-клетки (природные клетки-убийцы) или LAK-клетки (лимфоид-активируемые клетки-убийцы),
или индуцирована непосредственно через апоптотические пути. Лиганды-агонисты могут быть также
использованы в лечении лейкопений путем увеличения уровней пораженного клеточного типа и усиления регенерации набора Т-клеток после трансплантации костного мозга.
Лиганды-антагонисты или соединения-антагонисты могут найти применение в супрессии иммунной системы, например в лечении аутоиммунных заболеваний, в том числе ревматоидного артрита, множественного склероза, сахарного диабета, воспалительного заболевания пищеварительного тракта, болезни Крона и т.д. Иммуносупрессия может быть также использована для уменьшения отторжения
трансплантатов и имплантатов тканей или органов и для лечения Т-клеточно-специфических лейкозов
или лимфом ингибированием пролиферации пораженного клеточного типа.
Zalpha11 может быть также использован в диагностических системах для обнаружения уровней лиганда в кровотоке. В родственном варианте, антитела или другие агенты, которые специфически связываются с zalpha11, могут быть использованы для детектирования рецепторных полипептидов в кровообращении. Повышенные или пониженные уровни полипептидов лиганда или рецептора могут свидетельствовать о патологических состояниях, в том числе о раке. Растворимые рецепторные полипептиды могут способствовать патологическому процессу и могут быть прямым маркером скрытого заболевания.
Например, повышенные уровни растворимого IL-2-рецептора в сыворотке человека были ассоциированы
с большим разнообразием воспалительных и неопластических состояний, таких как инфаркт миокарда,
астма, тяжелая псевдопаралитическая миастения, ревматоидный артрит, острый Т-клеточный лейкоз, Вклеточные лимфомы, хронический лимфоцитарный лейкоз, рак ободочной кишки, рак молочной железы
и рак яичника (Heaney et al., Blood 87:847-857, 1996).
Лигандсвязывающий полипептид рецептора zalpha11, или «растворимый рецептор», может быть
получен экспрессией укороченной ДНК, кодирующей цитокинсвязывающий домен zalpha11 (приблизительно остатки 20(Cys)-237 (His) человеческого рецептора (SEQ ID NO:2)) или соответствующий район
рецептора не человека. Предпочтительно, чтобы внеклеточный домен был получен в форме, по существу, не содержащей полипептидных сегментов трансмембранного и внутриклеточного доменов. Кроме
того, лигандсвязывающие полипептидные фрагменты в цитокинсвязывающем домене zalpha11, описанном выше, могут служить в качестве растворимых рецепторов zalpha11 для описанных здесь применений. Для направления экспорта рецепторного полипептида из клетки-хозяина ДНК рецептора связывают
со вторым ДНК-сегментом, кодирующим секреторный пептид, такой как секреторный пептид t-PA или
секреторный пептид zalpha11. Для облегчения очистки секретируемого рецепторного полипептида Сконцевое удлинение, такое как полигистидиновая метка, вещество Р, пептид FLAG™ (Hopp et al.,
Bio/Technology 6:1204-1210, 1988; доступный из Eastman Kodak Co., New Haven, CT) или другой полипептид или белок, для которого доступны антитело или другой агент специфического связывания, может
быть слито с рецепторным полипептидом.
В альтернативном подходе, рецепторный внеклеточный домен может экспрессироваться в виде
слитого белка с константными областями тяжелой цепи иммуноглобулина, обычно с Fc-фрагментом,
который содержит домены двух константных областей и не содержит вариабельной области. Такие
слияния обычно секретируются в виде мультимерных молекул, где Fc-части связаны друг с другом дисульфидной связью, а два рецепторных полипептида выстроены в тесной близости друг с другом. Слитые белки этого типа могут быть использованы для аффинной очистки родственного лиганда из раствора, в качестве инструмента анализа in vitro, для блокирования сигналов in vitro посредством специфического «оттитровывания» лиганда и в качестве антагонистов in vivo путем введения их парентерально для
связывания находящегося в кровотоке лиганда и выведения его из кровотока. Для очистки лиганда химеру zalpha11-иммуноглобулин добавляют к пробе, содержащей лиганд (например, клеточно-кондиционированной культуральной среде или экстрактам тканей) в условиях, которые облегчают связывание рецептор-лиганд (обычно при почти физиологических температуре, рН и ионной силе). Затем комплекс
химера-лиганд выделяют смешиванием с использованием белка А, который иммобилизован на твердом
носителе (например, на нерастворимых гранулах смолы). Затем лиганд элюируют при помощи общепринятых химических способов, таких как градиент соли или рН. Альтернативно, сама химера может быть
связана с твердым носителем, причем связывание и элюцию проводят, как описано выше. Собранные
фракции могут быть повторно фракционированы до тех пор, пока не будет достигнут желаемый уровень
чистоты.
Кроме того, растворимые рецепторы zalpha11 могут быть использованы в качестве «стока лиганда»,
т.е. антагониста, для связывания лиганда in vivo или in vitro в терапевтических или других применениях,
когда присутствие лиганда является нежелательным. Например, в случае раков, которые экспрессируют
большое количество биоактивного лиганда zalpha11, растворимые рецепторы zalpha11 могут быть использованы в качестве прямых антагонистов этого лиганда in vivo и могут способствовать снижению
прогрессирования и симптомов, связанных с данным заболеванием. Кроме того, растворимый рецептор
zalpha11 может быть использован для замедления прогрессирования раков, которые сверхэкспрессируют
рецепторы zalpha11, связыванием лиганда in vivo, который в противном случае усиливал бы пролиферацию этих раков. Подобно применениям in vitro для zalpha11, растворимый рецептор может быть исполь- 25 -
006501
зован, например, в качестве инструмента негативного отбора для отбора клеточных линий, которые растут в отсутствие лиганда zalpha11.
Кроме того, растворимый рецептор zalpha11 может быть использован in vitro или в диагностических
применениях для детектирования экспрессирующих лиганд zalpha11 раков in vivo или в пробах тканей.
Например, растворимый рецептор zalpha11 может быть конъюгирован с радиоактивной меткой или
флуоресцентной меткой, как описано выше, и использован для детектирования присутствия лиганда в
пробе ткани с применением анализа связывания in vitro типа лиганд-рецептор или анализа с флуоресцентной визуализацией. Кроме того, радиоактивно меченный растворимый рецептор zalpha11 мог бы
вводиться in vivo для детектирования экспрессирующих лиганд твердых опухолей при помощи способа
радиотомографии, известного в данной области.
Анализ тканевого распределения мРНК, соответствующей этой новой ДНК, показал экспрессию в
лимфоидных тканях, в том числе в тимусе (вилочковой железе), селезенке, лимфатических узлах и лейкоцитах периферической крови. Эти данные указывают на роль рецептора zalpha11 в пролиферации,
дифференцировке и/или активации иммунных клеток и предполагают роль в развитии и регуляции иммунных ответов. Эти данные предполагают также, что взаимодействие zalpha11 с его лигандом может
стимулировать пролиферацию и развитие миелоидных клеток и может, подобно IL-2, IL-6, LIF, IL-11 и
OSM (Baumann et al., J. Biol. Chem. 268:8414-8417, 1993), индуцировать белковый синтез острой фазы в
гепатоцитах.
Предпочтительно очищать полипептиды данного изобретения до ≥80% чистоты, более предпочтительно до ≥90% чистоты, еще более предпочтительно до ≥95% чистоты и особенно предпочтительно до
фармакологически чистого состояния, т.е. до чистоты более 99,9%, в отношении загрязняющих макромолекул, в частности, других белков и нуклеиновых кислот, и инфекционных и пирогенных агентов.
Предпочтительно очищенный полипептид является, по существу, не содержащим других полипептидов,
в частности других полипептидов животного происхождения.
Экспрессируемые рекомбинантные полипептиды zalpha11 (или химерные или слитые полипептиды
zalpha11) могут быть очищены с использованием фракционирования и/или общепринятых способов и
сред очистки. Для фракционирования проб могут быть использованы осаждение сульфатом аммония и
кислотная или хаотропная экстракция. Примеры стадий очистки могут включать в себя применение гидроксиапатита, гель-фильтрацию, жидкостную экспресс-хроматографию белков (FPLC) и высокоэффективную жидкостную хроматографию с обращенной фазой. Подходящие хроматографические среды
включают в себя производные декстрана, агарозу, целлюлозу, полиакриламид, специальные диоксиды
кремния и т.п. Предпочтительными являются производные PEI, DEAE, QAE и Q. Примеры хроматографических сред включают в себя среды, дериватизованные фенильной, бутильной или октильной группами,
такие как Phenyl-Sepharose FF (Pharmacia), Toyopearl butyl 650 (Toso Haas, Montgomeryville, PA), OctylSepharose (Pharmacia) и т.п.; или полиакриловые смолы, такие как Amberchrom CG 71 (Toso Haas) и т.п.
Подходящие твердые носители включают в себя стеклянные гранулы, смолы на основе диоксида кремния, целлюлозные смолы, агарозные гранулы, сшитые агарозные гранулы, полистироловые гранулы,
сшитые полиакриламидные смолы и т.п., которые являются нерастворимыми в условиях, в которых они
должны использоваться. Эти носители могут быть модифицированы реакционноспособными группами,
позволяющими присоединение белков посредством аминогрупп, карбоксильных групп, сульфгидрильных групп, гидроксильных групп и/или углеводных частей молекул. Примеры химических способов связывания включают в себя активацию цианогенбромидом, активацию N-гидроксисукцинимидом, активацию эпоксидом, активацию сульфгидрильными группами, активацию гидразидом и карбоксил- и аминопроизводные для способов сочетания с использованием карбодиимида. Эти и другие твердые среды являются хорошо известными и широко используемыми в данной области и доступны из коммерческих
источников. Способы связывания рецепторных полипептидов со средами-носителями хорошо известны в
данной области. Выбор конкретного способа является рутинным и определяется отчасти свойствами выбранного носителя. См., например. Affinity Chromatography: Principles & Methods, Pharmacia LKB
Biotechnology, Uppsala, Sweden, 1988.
Полипептиды данного изобретения могут быть выделены путем использования их биохимических,
структурных и биологических свойств. Например, адсорбционная хроматография с иммобилизованным
ионом металла (IMAC) может быть использована для очистки богатых гистидином белков или белков,
имеющих полигистидиновые метки. Вкратце, гель сначала загружают ионами двухвалентного металла с
образованием хелата (Sulkowski, Trends in Biochem. 3:1-7, 1985). Богатые гистидином белки будут адсорбироваться на этом матриксе с различными аффинностями в зависимости от используемого иона металла
и будут элюироваться конкурентной элюцией, понижением рН или применением сильных хелатообразователей. Другие способы очистки включают в себя очистку гликозилированных белков аффинной хроматографией с иммобилизованным лектином и ионообменной хроматографией (Methods in Enzymol., Vol.
182:529-39, "Guide to Protein Purification", M. Deutscher, (ed.), Acad. Press, San Diego, 1990). В дополнительных вариантах данного изобретения может быть сконструирован гибрид представляющего интерес
- 26 -
006501
полипептида и аффинной метки (например, мальтозусвязывающего белка, домена иммуноглобулина) для
облегчения очистки.
Кроме того, при помощи способов, описанных в данной области, слитые полипептиды или гибридные белки zalpha11 конструируют с использованием районов или доменов zalpha11 данного изобретения
в комбинации с районами или доменами других белков семейства рецепторов цитокинов человека или
гетерологичных белков (Sambrook et al., ibid., Altschul et al., ibid., Picard, Cur. Opin. Biology, 5:511-5, 1994
и приведенные в них ссылки). Эти способы позволяют определить биологическую важность более крупных доменов или районов в представляющем интерес полипептиде. Такие гибриды могут изменять кинетику реакции, связывание, сужать или расширять субстратную специфичность или изменять клеточную
локализацию полипептида и могут быть применены к полипептидам неизвестной структуры.
Слитые полипептиды или белки могут быть получены способами, известными в данной области,
посредством получения каждого компонента слитого белка и химического конъюгирования их. Альтернативно, полинуклеотид, кодирующий один или несколько компонентов слитого белка в правильной
рамке считывания, может быть получен с использованием известных способов и экспрессирован при
помощи описанных здесь способов. Например, часть домена (доменов) или весь домен, сообщающий
биологическую функцию, может быть подвергнут обмену между zalpha11 данного изобретения и функционально эквивалентным доменом (доменами) из другого члена семейства цитокинов. Такие домены
включают в себя, но не ограничиваются ими, секреторную сигнальную последовательность, внеклеточный связывающий цитокин домен, трансмембранный домен и внутриклеточный передающий сигнал домен, сайты Box I и Box II, как описано здесь. Можно было бы ожидать, что такие гибридные белки имеют биологические функциональные особенности, которые являются одинаковыми или подобными особенностям полипептидов данного изобретения или белков других известных семейств, в зависимости от
сконструированного слитого полипептида. Кроме того, такие слитые белки могут проявлять другие
свойства, как описано здесь.
Стандартные способы молекулярной биологии и клонирования могут быть использованы для обмена эквивалентных доменов между полипептидом zalpha11 и полипептидами, с которыми их сливают.
Обычно сегмент ДНК, который кодирует представляющий интерес домен, например описанный здесь
домен zalpha11, функционально (операбельно) связывают в рамке считывания по меньшей мере c одним
другим сегментом ДНК, кодирующим дополнительный полипептид (например, домен или район из рецептора другого цитокина, такого как IL-2-рецептор), и встраивают в подходящий экспрессирующий
вектор, как описано здесь. Обычно конструкции ДНК конструируют таким образом, что несколько сегментов ДНК, кодирующих соответствующие районы полипептида, функционально связывают в рамке
считывания для получения единой конструкции, кодирующей весь слитый белок или его функциональную часть. Например, конструкция ДНК кодировала бы от N-конца до С-конца слитый белок, содержащий сигнальный полипептид, за которым следуют цитокинсвязывающий домен, затем трансмембранный
домен и внутриклеточный передающий сигнал домен. Такие слитые белки могут быть экспрессированы,
выделены и тестированы на активность, как описано здесь.
Полипептиды zalpha11 или их фрагменты могут быть также получены при помощи химического
синтеза. Полипептиды zalpha11 могут быть мономерами или мультимерами; гликозилированными или
негликозилированными; пэгилированными или непэгилированными и могут содержать или могут не содержать исходный аминокислотный остаток метионин.
Полипептиды данного изобретения могут быть также синтезированы эксклюзивным (т.е. только)
твердофазным синтезом, частичными твердофазными способами, конденсацией фрагментов или классическим синтезом в растворе. Способы синтеза полипептидов хорошо известны в данной области. См.,
например, Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149, 1963; Kaiser et al., Anal. Biochem. 34:595, 1970. После
полного синтеза желаемого пептида на твердом носителе комплекс пептид-смола обрабатывают реагентом, который отщепляет полипептид от смолы и удаляет большую часть защитных групп боковых цепей.
Такие способы хорошо разработаны в данной области.
Активность молекул данного изобретения может быть измерена с использованием различных тестов, которые измеряют дифференцировку и пролиферацию клеток. Такие тесты хорошо известны в данной области.
Белки данного изобретения применимы, например, в лечении лимфоидных, иммунных, воспалительных, связанных с селезенкой, кровью и костями нарушений и могут быть измерены in vitro с использованием культивируемых клеток или in vivo путем введения молекул данного изобретения подходящему животному-модели. Например, клетки-хозяева, экспрессирующие растворимый рецепторный полипептид zalpha11, могут быть заделаны в альгинатную среду и инъецированы (имплантированы) в животных-реципиентов. Микроинкапсулирование в альгинат-поли-L-лизин, инкапсулирование в мембрану с
избирательной проницаемостью и диффузионные камеры являются средствами заключения в них трансфицированных клеток млекопитающих или первичных клеток млекопитающих. Эти типы неиммуногенных «инкапсулирований» делают возможной диффузию белков и других макромолекул, секретируемых
или высвобождаемых захваченными клетками в реципиентное животное. Наиболее важно, что капсулы
маскируют и защищают чужеродные заделанные в них клетки от иммунного ответа реципиентного жи- 27 -
006501
вотного. Такие инкапсулирования могут продлевать жизнь инъецируемых клеток от нескольких часов
или дней («голые клетки») до нескольких недель («заделанные» клетки). Альгинатные нити обеспечивают простое и быстрое средство для получения заделанных клеток.
Материалы, необходимые для получения альгинатных нитей, известны в данной области. В примерной процедуре 3% альгинат готовят в стерильной Н2О и стерильно фильтруют. Непосредственно перед приготовлением альгинатных нитей раствор альгината снова фильтруют. Приблизительно 50% суспензию клеток (содержащую приблизительно 5х105 -приблизительно 5х107 клеток/мл) смешивают с 3%
раствором альгината. 1 мл суспензии альгинат/клетки экструдируют в 100 мМ стерильно профильтрованный раствор CaCl2 на протяжении периода времени ~15 мин с образованием «нити». Затем экструдированную нить переносят в раствор 50 мМ CaCl2 и затем в раствор 25 мМ CaCl2. Затем эту нить промывают деионизованной водой перед нанесением покрытия на нить инкубированием в 0,01% растворе поли-L-лизина. Наконец, нить промывают лактированным раствором Рингера и вытягивают из раствора в
цилиндр шприца (без иглы). Затем к шприцу присоединяют иглу с большим отверстием и нить инъецируют внутрибрюшинно в реципиента в минимальном объеме лактированного раствора Рингера.
Подход in vivo для тестирования белков данного изобретения включает в себя вирусные системы
доставки. Примеры вирусов для этой цели включают в себя аденовирус, герпесвирус, ретровирусы, вирус коровьей оспы и аденоассоциированный вирус (AAV). Aденовирус, двухцепочечный ДНК-вирус,
является в настоящее время наиболее исследованным вектором переноса генов для доставки гетерологичной нуклеиновой кислоты (в отношении обзора см. Т.C. Becker et al., Meth. Cell Biol. 43:161-89, 1994
и J.T. Douglas and D.T. Curiel, Science & Medicine 4:44-53, 1997). Аденовирусная система предоставляет
несколько преимуществ: (i) аденовирус может вместить относительно большие инсерционные сегменты
(вставки) ДНК; (ii) может выращиваться до высокого титра; (iii) инфицирует широкий спектр типов клеток млекопитающих и (iv) может быть использован с большим числом различных промоторов, в том
числе вездесущих, тканеспецифических и регулируемых промоторов. Поскольку аденовирусы являются
стабильными в кровотоке, они могут вводиться также внутривенной инъекцией.
С использованием аденовирусных векторов, в которых части аденовирумного генома делетированы, инсерционные сегменты (вставки) включают в вирусную ДНК прямым лигированием или гомологичной рекомбинацией с котрансфицируемой плазмидой. В приводимой в качестве примера системе основной ген Е1 был делетирован из вирусного вектора и вирус не реплицировался, пока ген Е1 не обеспечивался клеткой-хозяином (примером является клеточная линия 293 человека). При внутривенном введении интактным животным аденовирус, прежде всего, поражал печень. Если эта аденовирусная система
доставки имеет делецию гена Е1, этот вирус не может реплицироваться в клетках-хозяевах. Однако ткань
хозяина (например, печень) будет экспрессировать и процессировать (и, если присутствует секреторная
сигнальная последовательность, секретировать) гетерологичный белок. Секретированные белки будут
входить в кровоток в высоковаскуляризованной печени, и могут быть определены действия на инфицированное животное.
Кроме того, аденовирусные векторы, содержащие различные делеции вирусных генов, могут быть
использованы в попытке уменьшения или элиминации иммунных ответов на вектор. Такие аденовирусы
являются лишенными Е1 и, кроме того, содержат делеции Е2А или Е4 (Lusky, M. et al., J. Virol. 72:20222032, 1998; Raper, S.E. et al., Human Gene Therapy 9:671-679, 1998). Кроме того, сообщалось, что делеция
Е2b снижает иммунные ответы (Amalfitano, A. et al., J. Virol. 72:926-933, 1998). Кроме того, посредством
делеции всего аденовирусного генома могут быть помещены очень большие инсерции гетерологичной
ДНК. Генерирование так называемых «безвольных» аденовирусов, в которых все вирусные гены делетированы, является особенно выгодным для инсертирования больших инсерционных сегментов гетерологичной ДНК. В качестве обзора, см. Yeh, P. and Perricaudet, M. FASEB J. 11:615-623, 1997.
Аденовирусная система может быть также использована для получения белков in vitro. Культивированием инфицированных аденовирусом не-293 клеток в условиях, в которых эти клетки не являются
быстро делящимися, эти клетки могут продуцировать белки в течение продолжительных периодов времени. Например, клетки ВНК выращивают до конфлюэнтности в клеточных фабриках (кассетах биореакторов для крупномасштабного производства клеток), затем экспонируют аденовирусному вектору, кодирующему представляющий интерес секретируемый белок. Затем клетки выращивают в бессывороточных условиях, которые позволяют инфицированным клеткам выживать в течение нескольких недель без
существенного деления клеток. Альтернативно, инфицированные аденовирусным вектором клетки 293
могут выращиваться в виде прикрепленных клеток или в виде суспензионной культуры при относительно высокой плотности клеток для продуцирования значительных количеств белка (см. Garnier et al.,
Cytotechnol. 15:145-55, 1994). В случае любого протокола, экспрессируемый, секретируемый гетерологичный белок может периодически выделяться из супернатанта, лизата или мембранных фракций клеточной культуры, в зависимости от локализации экспрессируемого белка в клетке. В протоколе с продуцированием инфицированными клетками 293 также могут быть эффективно получены несекретируемые
белки.
Ввиду тканевого распределения, наблюдаемого для zalpha11, агонисты (в том числе природный лиганд/субстрат/кофактор и т.д.) и антагонисты имеют огромный потенциал в применениях как in vitro, так
- 28 -
006501
и in vivo. Соединения, идентифицированные в качестве агонистов zalpha11, применимы для стимуляции
роста иммунных и гемопоэтических клеток in vitro и in vivo. Например, zalpha11 и соединения-агонисты
применимы в качестве компонентов определенных сред для культуры клеток и могут использоваться
отдельно или в комбинации с другими цитокинами и гормонами для замены сыворотки, которую обычно
применяют в клеточной культуре. Таким образом, агонисты применимы в специальной стимуляции роста и/или развития Т-клеток, В-клеток и других клеток лимфоидной и миелоидной линий дифференцировки в культуре. Кроме того, растворимый рецептор zalpha11, агонист или антагонист могут быть использованы in vitro в тесте для измерения стимуляции образования колоний из первичных культур выделенного костного мозга. Такие тесты хорошо известны в данной области.
Антагонисты применимы также в качестве реагентов исследования для характеристики сайтов
взаимодействия лиганд-рецептор. Ингибиторы активности zalpha11 (антагонисты zalpha11) включают в
себя антитела против zalpha11 и растворимых рецепторов zalpha11, а также другие пептидные и непептидные агенты (в том числе рибозимы).
Zalpha11 может быть использован также для идентификации модуляторов (например, антагонистов)
его активности. Тест-соединения добавляют к описанным здесь тестам для идентификации соединений,
ингибирующих активность zalpha11. Кроме этих описанных здесь тестов, пробы могут быть тестированы
на ингибирование активности zalpha11 в многочисленных анализах, предназначенных для измерения
связывания, олигомеризации zalpha11 или стимуляции/ингибирования zalpha11-зависимых клеточных
ответных реакций. Например, экспрессирующие zalpha11 клеточные линии могут быть трансфицированы конструкцией с репортерным геном, которая отвечает на стимулируемый zalpha11 клеточный путь.
Конструкции с репортерным геном этого типа известны в данной области и обычно будут содержать
чувствительный к zalpha11 ДНК-элемент, функционально связанный с геном, кодирующим детектируемый тестом белок, такой как люцифераза. Чувствительные ДНК-элементы могут включать в себя, но не
ограничиваются ими, циклический АМФ-чувствительный элемент (CRE), гормон-чувствительные элементы (HRE), инсулин-чувствительный элемент (IRE) (Nasrin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:5273-7,
1990) и сыворотка-чувствительные элементы (SRE) (Shaw et al., Cell 56:563-72, 1989). Циклический
АМФ-чувствительные элементы рассматриваются в обзоре Roestler et al., J. Biol. Chem 263 (19):9063-6;
1988 и Habener, Molec. Endocrinol. 4 (8): 1087-94; 1990. Гормон-чувствительные элементы рассматриваются в Beato, Cell 56:335-44; 1989. Соединения-кандидаты, растворы, смеси или экстракты или кондиционированные среды от различных типов клеток тестируют на их способность усиливать активность
рецептора zalpha11, определяемую увеличением стимуляции zalpha11 экспрессии репортерного гена.
Тесты этого типа будут детектировать соединения, которые непосредственно стимулируют активность
трансдукции (передачи) сигнала zalpha11 через связывание рецептора или стимуляцией иным образом
части каскада сигналов. Таким образом, обеспечен способ идентификации агонистов полипептида
zalpha11, предусматривающий обеспечение клеток, чувствительных к полипептиду zalpha11, культивирование первой порции этих клеток в отсутствие тест-соединения, культивирование второй порции этих
клеток в присутствии тест-соединения и детектирование увеличения клеточного ответа второй порции
этих клеток в сравнении с первой порцией этих клеток. Кроме того, третья клетка, содержащая конструкцию с репортерным геном, описанную выше, но не экспрессирующая рецептор zalpha11, может быть
использована в качестве контрольной клетки для оценки неспецифической, или не опосредованной рецептором zalpha11, стимуляции данного репортера. Таким образом, агонисты, в том числе природный
лиганд, применимы для стимуляции или увеличения функции полипептида zalpha11.
Лигандсвязывающий полипептид zalpha11, такой как цитокинсвязывающий домен, описанный
здесь, может быть также использован для очистки лиганда. Этот полипептид иммобилизуют на твердом
носителе, таком как гранулы из агарозы, сшитой агарозы, стекла, целлюлозных смол, смол на основе диоксида кремния, полистирола, сшитого полиакриламида, или подобных материалах, которые являются
стабильными в условиях использования. Способы связывания полипептидов с твердыми носителями известны в данной области и включают в себя аминную химию, активацию цианогенбромидом, активацию
N-гидроксисукцинимидом, активацию эпоксидом, сульфгидрильную активацию и гидразидную активацию. Полученную среду обычно готовят в форме колонки и жидкости, содержащих лиганд, пропускают
через эту колонку 1 или несколько раз, чтобы позволить лиганду связаться с рецепторным полипептидом. Затем этот лиганд элюируют при помощи изменений концентрации соли, хаотропных агентов (гуанидина-НСl) или рН для разрушения связывания лиганд-рецептор.
Тест-система, которая использует лигандсвязывающий рецептор (или антитело, один член пары
комплемент/антикомплемент) или его связывающий фрагмент, и коммерчески доступный биосенсорный
прибор (BIAcore™, Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ; или технологию SELDI™, Ciphergen, Inc., Palo
Alto, CA) могут быть выгодно использованы. Такой рецептор, антитело, член пары комплемент/антикомплемент или фрагмент иммобилизуют на поверхности рецепторного кристалла. Применение этого
прибора описано Karlsson, J. Immunol. Methods 145: 229-240, 1991 и Cunningham and Wells, J. Mol. Biol.
234: 554-63, 1993. Такой рецептор, антитело, член пары или фрагмент присоединяют ковалентно при помощи аминной или сульфгидрильной химии к волокнам декстрана, которые присоединены к пленке золота в проточной ячейке. Тест-пробу пропускают через эту ячейку. Если лиганд, эпитоп или противопо- 29 -
006501
ложный член пары комплемент/антикомплемент присутствует в этой пробе, он будет связываться с иммобилизованным рецептором, антителом или членом пары, соответственно, вызывая изменение в показателе преломления среды, которое детектируется как изменение в резонансе поверхностных плазмонов
золотой пленки. Эта система позволяет определить скорости включения и выключения (on- и offскорости), из которых может быть рассчитана аффинность связывания и сделана оценка стехиометрии
связывания.
Лигандсвязывающие рецепторные полипептиды могут быть также использованы в других системах
анализа, известных в данной области. Такие системы включают в себя анализ Скетчарда для определения
аффинности связывания (см. Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51: 660-672, 1949) и калориметрические анализы (Cunningham et al., Science 253: 545-48, 1991; Cunningham et al., Science 245: 821-25, 1991).
Полипептиды zalpha11 могут быть также использованы для получения антител, которые связываются с эпитопами, пептидами или полипептидами zalpha11. Полипептид zalpha11 или его фрагмент служит в качестве антигена (иммуногена) для инокуляции животного и индукции иммунного ответа. Специалисту с квалификацией в данной области будет ясно, что антигены или иммуногенные эпитопы могут
состоять из отрезков аминокислот в более длинном полипептиде, от приблизительно 10 аминокислот и
до полной длины полипептида или более длинного полипептида в зависимости от конкретного полипептида. Подходящие антигены включают в себя полипептид zalpha11, кодируемый SEQ ID NO:2 от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 538 (Ser) или его фрагмент из непрерывных аминокислот 9-519. Предпочтительными пептидами для применения в качестве антигенов являются цитокинсвязывающий домен, внутриклеточный передающий сигнал домен, сайты Box I и Box II, описанные здесь, и
гидрофильные пептиды zalpha11, такие как предсказанные специалистом в данной области из графика
гидрофобности, определенные, например, из профиля гидрофильности Hopp/Woods на основе скользящего окна для шести остатков, со скрытыми остатками G, S и Т и экспонированными (открытыми) остатками Н, Y и W (см. фиг. 1). Гидрофильные пептиды zalpha11 включают в себя пептиды, содержащие
аминокислотные последовательности, выбранные из группы, состоящей из (1) аминокислоты номер 51
(Тrр) - аминокислоты номер 61 (Glu) SEQ ID NO:2; (2) аминокислоты номер 136 (Ile) - аминокислоты
номер 143 (Glu) SEQ ID NO:2; (3) аминокислоты номер 187 (Pro) - аминокислоты номер 195 (Ser) SEQ ID
NO:2; (4) аминокислоты номер 223 (Phe) - аминокислоты номер 232 (Glu) SEQ ID NO:2 и (5) аминокислоты номер 360 (Glu) - аминокислоты номер 368 (Asp) SEQ ID NO:2. Кроме того, подходящими антигенами являются консервативные мотивы и вариабельные районы между консервативными мотивами
zalpha11. Кроме того, соответствующие районы мышиного полипептида zalpha11 (SEQ ID NO:85) могут
быть использованы для генерирования антител против мышиного zalpha11. Антитела, генерированные из
этого иммунного ответа, могут быть выделены и очищены, как описано выше. Способы получения и выделения поликлональных и моноклональных антител хорошо известны в данной области (см., например
Current Protocols in Immunology, Cooligan, et al., (eds.). National Institutes of Health, John Wiley and Sons,
Inc., 1995; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor,
NY, 1989 и Hurrell, J.G.R., Ed., Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, CRC Press,
Inc., Boca Raton, FL, 1982).
Как должно быть очевидно специалисту с обычной квалификацией в данной области, поликлональные антитела могут быть получены инокуляцией различных теплокровных животных, таких как лошади,
коровы, козы, овцы, собаки, куры, кролики, мыши и крысы, полипептидом zalpha11 или его фрагментом.
Иммуногенность полипептида zalpha11 может быть увеличена путем применения адъюванта, такого как
квасцы (гидроксид алюминия) или полный или неполный адъювант Фрейнда. Полипептиды, применимые для иммунизации, включают в себя также слитые (гибридные) полипептиды, такие как гибриды
zalpha11 или его части с полипептидом иммуноглобулина или с мальтозусвязывающим белком. Полипептидный иммуноген может быть полноразмерной молекулой или ее частью. Если эта часть полипептида является "гаптен-подобной", такая часть может быть предпочтительно соединена или связана с макромолекулярным носителем (таким как гемоцианин фиссуреллы (KLH), бычий сывороточный альбумин
(БСА) или столбнячный токсоид) для иммунизации.
В применении здесь термин "антитела" включает в себя поликлональные антитела, аффинноочищенные поликлональные антитела, моноклональные антитела и антигенсвязывающие фрагменты,
такие как протеолитические F(ab')2- и Fab-фрагменты. Также включены генетически сконструированные
интактные антитела или фрагменты, такие как химерные антитела, Fv-фрагменты, одноцепочечные антитела и т.п., а также синтетические антигенсвязывающие пептиды и полипептиды. Антитела не из человека могут быть "очеловечены" (гуманизированы) прививкой CDR не человека на каркасные и константные области иммуноглобулина человека или включением полных вариабельных доменов не человека
(необязательно "окутыванием" их подобной человеческой поверхностью путем замены экспонированных
остатков, результатом чего является "облицованное" антитело). В некоторых случаях "гуманизированные" антитела могут сохранять остатки иммуноглобулина не человека в каркасных доменах вариабельной области человека для усиления характеристик правильного связывания. Посредством "гуманизирования" антител может быть увеличен биологический полупериод существования в организме, и потенциал неблагоприятных иммунных реакций при введении людям уменьшается.
- 30 -
006501
Альтернативные способы генерирования или отбора антител, применимые здесь, включают в себя
экспонирование in vitro лимфоцитов белку или пептиду zalpha11 и отбор библиотек представления антител в фаговых или подобных векторах (например, посредством использования иммобилизованного или
меченого белка или пептида zalpha11). Гены, кодирующие полипептиды, имеющие потенциальные домены связывания полипептида zalpha11, могут быть получены скринингом случайных пептидных библиотек, представленных на фагах (фаговое представление) или на бактериях, таких как Е. coli. Нуклеотидные последовательности, кодирующие эти полипептиды, могут быть получены различными путями, такими как случайный мутагенез или случайный синтез полинуклеотидов. Эти случайные библиотеки
представления пептидов могут быть использованы для скрининга на пептиды, которые взаимодействуют
с известной мишенью, которая может быть белком или полипептидом, таким как лиганд или рецептор,
биологическая или синтетическая макромолекула или органические или неорганические вещества. Способы создания и скрининга таких случайных библиотек представления пептидов известны в данной области (Ladner et al., US Patent No. 5 223 409; Ladner et al., U.S. Patent No. 4 946 778; Ladner et al., U.S. Patent
No. 5 403 484 и Ladner et al., U.S. Patent No. 5 571 698), и случайные библиотеки представления пептидов
и наборы для скрининга таких библиотек коммерчески доступны, например, из Clontech (Palo Alto, CA),
Invitrogen Inc. (San Diego, CA), New England Biolabs, Inc. (Beverly, MA) и Pharmacia LKB Biotechnology
Inc. (Piscataway. NJ). Случайные библиотеки представления пептидов могут быть подвергнуты скринингу с использованием последовательностей zalpha11, описанных здесь, для идентификации белков, которые связываются с zalpha11. Эти "связывающие пептиды", которые взаимодействуют с полипептидами
zalpha11, могут быть использованы для мечения клеток; для выделения гомологичных полипептидов
аффинной очисткой; они могут быть прямо или опосредованно конъюгированы с лекарственными средствами, токсинами, радионуклидами и т.п. Эти связывающие пептиды могут быть также использованы в
аналитических способах, например, для скрининга экспрессионных библиотек и нейтрализующей активности. Связывающие пептиды могут быть также использованы для диагностических тестов для определения уровней полипептидов zalpha11 в кровотоке; для обнаружения или количественного определения
растворимых полипептидов zalpha11 как маркера скрытых патологии или заболевания. Эти связывающие
пептиды могут также действовать как «антагонисты» zalpha11 для блокирования связывания zalpha11 и
трансдукции сигнала in vitro и in vivo. Эти анти-zalpha11-связывающие пептиды были бы полезны для
ингибирования действия лиганда, который связывается с zalpha11.
Антитела определяются как специфически связывающие, если 1) они проявляют пороговый уровень связывающей активности и/или 2) они не имеют значимой перекрестной реактивности с родственными полипептидными молекулами. Во-первых, описанные здесь антитела специфически связываются,
если они связываются с полипептидом, пептидом или эпитопом zalpha11 с аффинностью, по меньшей
мере в 10 раз большей, чем аффинность связывания с контрольным (не zalpha11) полипептидом. Предпочтительно, чтобы эти антитела проявляли аффинность связывания (Ка) 106 моль-1 или большую, предпочтительно 107 моль-1 или большую, более предпочтительно 108 моль-1 или большую и наиболее предпочтительно 109 моль-1 или большую. Аффинность связывания антитела может быть легко определена
специалистом с обычной квалификацией в этой области, например, при помощи анализа Скетчарда
(Scatchard, G., Ann. NY Acad. Sci. 51: 660-672, 1949).
Во-вторых, антитела специфически связываются, если они не имеют значимой перекрестной реактивности с родственными полипептидами. Антитела не имеют значимой перекрестной реактивности с
родственными полипептидными молекулами, например, если они обнаруживают полипептид zalpha11,
но не обнаруживают известные родственные полипептиды, используемые в стандартном Вестерн-блот
анализе (Ausubel et al., ibid.). Примеры известных родственных полипептидов включают в себя ортологи,
белки из того же вида, которые являются членами семейства белков (например, IL-6), полипептиды
zalpha11 и zalpha11 не человека. Кроме того, антитела могут быть "скринированы (просеяны) против"
известных родственных полипептидов для выделения популяции, которая специфически связывается с
полипептидами данного изобретения. Например, антитела, индуцированные к zalpha11, адсорбируют с
родственными полипептидами, прикрепленными к нерастворимому матриксу; антитела, специфические
для zalpha11, будут протекать через этот матрикс при подходящих буферных условиях. Такое "просеивание" позволяет выделить поликлональные и моноклональные антитела, не имеющие перекрестной реактивности с близкородственными полипептидами (Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.),
Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988; Current Protocols in Immunology, Cooligan, et al. (eds.). National
Institutes of Health, John Wiley and Sons, Inc., 1995). Скрининг и выделение специфических антител хорошо известны в этой области (см. Fundamental Immunology, Paul (eds.). Raven Press, 1993; Getzoff et al.,
Adv. in Immunol. 43: 1-98, 1988; Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Goding, J.W. (eds.). Academic
Press Ltd., 1996; Benjamin et al., Ann. Rev. Immunol. 2: 67-101, 1984).
Различные анализы, известные лицам с обычной квалификацией в данной области, могут быть использованы для детектирования антител, которые специфически связывают белки и пептиды zalpha11.
Примеры анализов описаны подробно в Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (Eds.), Cold
Spring Harbor Laboratory Press, 1988. Характерные примеры таких анализов включают в себя конкурентный иммуноэлектрофорез, радиоиммуноанализ, радиоиммунопреципитацию, твердофазный иммунофер- 31 -
006501
ментный анализ (ELISA), дот-блот или Вестерн-блот анализ, ингибиторный или конкурентный анализ и
сэндвич-анализ. Кроме того, антитела могут быть подвергнуты скринингу на связывание с белком или
полипептидом дикого типа в сравнении с мутантным белком или полипептидом zalpha11.
Антитела к zalpha11 могут быть использованы для мечения клеток, экспрессирующих zalpha11; для
выделения zalpha11 аффинной очисткой; для диагностических тестов для определения уровней в кровотоке полипептидов zalpha11; для обнаружения или количественного определения растворимого zalpha11
как маркера скрытых патологии или заболевания; в аналитических способах с использованием FACS;
для скрининга экспрессионных библиотек; для генерирования антиидиотипических антител и в качестве
нейтрализующих антител или в качестве антагонистов для блокирования активности zalpha11 in vitro и in
vivo. Подходящие прямые тэги (маркеры) или метки включают в себя радионуклиды, ферменты, субстраты, кофакторы, ингибиторы, флуоресцентные маркеры, хемилюминесцентные маркеры, магнитные
частицы и т.п.; непрямые тэги (маркеры) или метки могут выводить на первое место применение пары
биотин-авидин или других пар комплемент/антикомплемент в качестве промежуточных продуктов. Описанные здесь антитела могут быть также прямо или опосредованно конъюгированы с лекарственными
средствами, токсинами, радионуклидами и т.п., и эти конъюгаты могут быть использованы для диагностических или терапевтических применений in vivo. Кроме того, антитела к zalpha11 или его фрагментам
могут быть использованы in vitro для обнаружения денатурированного zalpha11 или его фрагментов в
анализах, например Вестерн-блотах или других анализах, известных в этой области.
Антитела к zalpha11 могут быть использованы для мечения клеток, экспрессирующих рецептор, и
определения уровней экспрессии zalpha11; для аффинной очистки, в диагностических тестах для определения уровней в кровотоке растворимых рецепторных полипептидов, в аналитических способах, использующих клеточный сортинг с возбуждением флуоресценции. Бивалентные антитела могут быть использованы в качестве агонистов для имитации действия лиганда zalpha11.
Описанные здесь антитела могут быть также прямо или опосредованно конъюгированы с лекарственными средствами, токсинами, радионуклидами и т.п., и эти конъюгаты могут быть использованы для
диагностических или терапевтических применений in vivo. Например, антитела или связывающие полипептиды, которые узнают zalpha11 данного изобретения, могут быть использованы для идентификации
или обработки тканей или органов, которые экспрессируют соответствующую антикомплементарную
молекулу (например, рецептор zalpha11). Более конкретно, антитела против zalpha11 или их биоактивные
фрагменты или части могут быть связаны с детектируемыми или цитотоксическими молекулами и доставлены в млекопитающее, имеющее клетки, ткани или органы, экспрессирующие молекулу zalpha11.
Подходящие детектируемые молекулы могут быть прямо или опосредованно присоединены к полипептидам, которые связывают zalpha11 («связывающим полипептидам», в том числе описанным здесь
связывающим пептидам), антителам или их биоактивным фрагментам или частям. Подходящие детектируемые молекулы включают в себя радионуклиды, ферменты, субстраты, кофакторы, ингибиторы, флуоресцентные маркеры, хемилюминесцентные маркеры, магнитные частицы и т.п. Подходящие цитотоксические молекулы могут быть прямо или опосредованно присоединены к этому полипептиду или антителу и включают в себя бактериальные или растительные токсины (например, дифтерийный токсин, экзотоксин Pseudomonas, рицин, абрин и т.п.), а также терапевтические радионуклиды, такие как иод-131,
рений-188 или иттрий-90 (либо непосредственно присоединенные к полипептиду или антителу, либо
опосредованно присоединенные, например, через хелатирующую часть молекулы). Связывающие полипептиды или антитела могут быть также конъюгированы с цитотоксическими лекарственными средствами,
такими как адриамицин. Для непрямого присоединения детектируемой или цитотоксической молекулы
эта детектируемая или цитотоксическая молекула может быть конъюгирована с членом пары комплемент/антикомплемент, где другой член связан с этим связывающим полипептидом или частью антитела.
Для этих целей примером комплементарной/антикомплементарной пары является биотин/стрептавидин.
В другом варианте гибридные белки полипептид-токсин или гибридные белки антитело-токсин могут быть использованы для нацеленного ингибирования или разрушения клетки или ткани (например,
для обработки раковых клеток или тканей). Альтернативно, если связывающий полипептид имеет множественные функциональные домены (а именно, активирующий домен или лигандсвязывающий домен,
плюс нацеливающий домен), гибридный белок, включающий в себя только нацеливающий домен, может
быть пригодным для направления детектируемой молекулы, цитотоксической молекулы или комплементарной молекулы в представляющий интерес тип клеток или тканей. В тех случаях, когда гибридный
белок только с единственным доменом включает в себя комплементарную молекулу, антикомплементарная
молекула может быть конъюгирована с детектируемой или цитотоксической молекулой. Таким образом,
такие гибридные белки, содержащие домен-комплементарную молекулу, представляют характерный для
определенного типа клеток нацеливающий носитель для клетко/тканеспецифической доставки характерных для этого типа клеток конъюгатов антикомплементарно-детектируемых/цитотоксических молекул.
В другом варианте гибридные белки zalpha11-связывающий полипептид-цитокин или антителоцитокин могут быть использованы для усиления убивания in vivo тканей-мишеней (например, раков крови, лимфоидов, ободочной кишки и костного мозга), если гибридсвязывающий полипептид-цитокин или
антитело против zalpha11 поражает гиперпролиферативную клетку (см., в общем, Hornick et al., Blood
- 32 -
006501
89:4437-47, 1997). Они описывают слитые белки, способные нацеливать цитокин в желаемый участок
действия, обеспечивая посредством этого повышенную локальную концентрацию цитокина. Подходящие антитела против zalpha11 поражают нежелательную клетку или ткань (т.е. опухоль или лейкоз), и
слитый цитокин медиирует улучшенный лизис клетки-мишени эффекторными клетками. Подходящие
цитокины для этой цели включают в себя, например, интерлейкин-2 и гранулоцитарно-макрофагальный
колониестимулирующий фактор (GM-CSF).
Альтернативно, слитые с zalpha11-связывающим полипептидом или антителом белки, описанные
здесь, могут быть использованы для усиления убивания in vivo тканей-мишеней прямой стимуляцией
модулируемого zalpha11 апоптотического пути, приводящего к некрозу гиперпролиферативных клеток,
экспрессирующих zalpha11.
Биоактивные содержащие связывающий полипептид или антитело конъюгаты, описанные здесь,
могут доставляться перорально, внутривенно, внутриартериально или внутрипротоково или могут быть
введены локально в предполагаемом месте действия.
Состоящие из четырехспирального пучка цитокины, которые связываются с рецепторами цитокинов, а также другие белки, продуцируемые активированными лимфоцитами, играют важную биологическую роль в дифференцировке клеток, активации, рекрутинге и гомеостазе клеток во всем теле. Терапевтическая применимость включает в себя лечение заболеваний, которые требуют иммунной регуляции, в
том числе аутоиммунных заболеваний, таких как ревматоидный артрит, множественный склероз, тяжелая псевдопаралитическая миастения, системная красная волчанка и диабет. Антагонисты или агонисты
zalpha11, в том числе растворимые рецепторы и природный лиганд, могут быть важными в регуляции
воспаления и, следовательно, были бы полезны в лечении ревматоидного артрита, астмы, язвенного колита, воспалительного заболевания пищеварительного тракта, болезни Крона и сепсиса. Возможна роль
антагонистов или агонистов zalpha11, в том числе растворимых рецепторов и природного лиганда, в медиировании онкогенеза, и, следовательно, они были бы полезны в лечении рака. Антагонисты или агонисты zalpha11, в том числе растворимые рецепторы и природный лиганд, могут быть потенциальными
терапевтическими агентами в супрессии иммунной системы, что было бы важным для уменьшения отторжения трансплантата. Лиганд zalpha11 может иметь применение в предупреждении реакции трансплантат против хозяина.
Альтернативно, антагонисты или агонисты zalpha11, в том числе растворимые рецепторы и природный лиганд, могут активировать иммунную систему, что было бы важным в бустинге иммунитета к инфекционным заболеваниям, лечении пациентов с ослабленным иммунитетом, таких как ВИЧ+ пациенты,
или в улучшении вакцин. В частности, антагонисты или агонисты zalpha11, в том числе растворимые
рецепторы и природный лиганд, могли бы модулировать, стимулировать или размножать NK-клетки или
их потомство и могли бы обеспечивать терапевтическую пользу в лечении вирусных инфекций и в качестве антинеопластического фактора. Считается, что NK-клетки играют главную роль в элиминации метастатических опухолевых клеток, и пациенты как с метастазами, так и с твердыми опухолями имеют пониженные уровни активности NK-клеток (Whiteside et al., Curr. Top. Microbiol. Irnmunol. 230:221-244,
1998).
Полинуклеотиды, кодирующие полипептиды zalpha11, применимы в способах генной терапии, где
желательно увеличить или ингибировать активность zalpha11. Если млекопитающее имеет мутированный или отсутствующий ген zalpha11, этот ген zalpha11 может быть введен в клетки этого млекопитающего. В одном варианте ген, кодирующий полипептид zalpha11, вводят in vivo в вирусном векторе. Такие
векторы включают в себя аттенуированный или дефектный ДНК-вирус, такой как, но не ограничиваемый
ими, вирус простого герпеса (HSV), вирус папилломы, вирус Эпстайна-Барр (EBV), аденовирус, аденоассоциированный вирус (AAV) и т.п. Предпочтительными являются дефектные вирусы, которые полностью или почти полностью лишены вирусных генов. Дефектный вирус не является инфекционным после
введения в клетку. Применение дефектных вирусных векторов делает возможным введение в клетки в
специфической, локализованной зоне, без опасения по поводу того, что этот вектор может инфицировать
другие клетки. Примеры конкретных векторов включают в себя, но не ограничиваются ими, вектор дефектного вируса простого герпеса 1 (HSV1) (Kaplitt et al., Molec. Cell. Neurosci., 2: 320-30, 1991), аттенуированный аденовирусный вектор, такой как вектор, описанный Stratford-Perricaudet et al., J. Clin. Invest.
90; 626-30, 1992, и дефектный аденоассоциированный вирусный вектор (Samulski et al., J. Virol., 61: 3096101, 1987; Samulski et al., J. Virol., 63; 3822-8, 1989).
В другом варианте ген zalpha11 может быть введен в ретровирусном векторе, например, как описано в Anderson et al., U.S. Patent No. 5 399 346; Mann et al., Cell, 33:153, 1983; Temin et al., U.S. Patent No. 4
650 764; Temin et al., U.S. Patent No. 4 980 289; Markowitz et al., J. Virol. 62:1120, 1988; Temin et al., U.S.
Patent No. 5 124 263; International Patent Publication No. WO 95/07358, published March 16, 1995 by Dougherty
et al.; и Kuo et al., Blood, 82:845, 1993. Альтернативно этот вектор может быть введен липофекцией in
vivo с использованием липосом. Синтетические катионные липиды могут быть использованы для получения липосом для трансфекции in vivo гена, кодирующего маркер (Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 84: 7413-7, 1987; Mackey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 8027-31, 1988). Использование липофекции для введения экзогенных генов в специфические органы in vivo имеет определенные практиче- 33 -
006501
ские преимущества. Молекулярное нацеливание липосом в специфические клетки является одной областью преимущества. Более конкретно, направление трансфекции в конкретные клетки представляет одну
область преимущества. Например, направление трансфекции в конкретные типы клеток было бы особенно выгодным в ткани с клеточной гетерогенностью, такой как поджелудочная железа, печень, почка и
мозг. Липиды могут быть химически связаны с другими молекулами для нацеливания. Нацеленные пептиды (например, гормоны или нейротрансмиттеры), белки, такие как антитела, или непептидные молекулы могут быть связаны с липосомами химически.
Возможно удалить эти клетки из тела; ввести этот вектор в виде "голой" ДНК-плазмиды и затем повторно имплантировать эти трансформированные клетки в тело. "Голые" ДНК-векторы для генной терапии могут быть введены в желательные клетки-хозяева способами, известными в данной области, например трансфекцией, электропорацией, микроинъекцией, трансдукцией, клеточным слиянием, ДЭАЭдекстрановым способом, кальций-фосфатным осаждением, с использованием генного "дробовика" (шотган-способа) или с использованием переносчика ДНК-вектора. См., например, Wu et al., J. Biol. Chem.
267: 963-7, 1992; Wu et al., J. Biol. Chem. 263:14621-4, 1988.
Антисмысловая методология может быть использована для ингибирования транскрипции гена
zalpha11, например, для ингибирования клеточной пролиферации in vivo. Конструируются полинуклеотиды, которые комплементарны сегменту кодирующего zalpha11 полинуклеотида (например, полинуклеотида, представленного в SEQ ID NO:1) для связывания с кодирующей zalpha11 мРНК и ингибирования трансляции такой мРНК. Такие антисмысловые олигонуклеотиды применимы для ингибирования
экспрессии кодирующих полипептиды zalpha11 генов в клеточной культуре или в субъекте.
Кроме того, в качестве молекулы клеточной поверхности полипептид zalpha11 может быть использован в качестве мишени для введения генной терапии в клетку. Это применение было бы полезным, в
частности, для введения терапевтических генов в клетки, в которых обычно экспрессируется полипептид
zalpha11, такие как лимфоидная ткань и PBL или раковые клетки, которые экспрессируют полипептид
zalpha11. Например, вирусная генная терапия, описанная выше, может быть нацелена на специфические
типы клеток, в которых экспрессируется клеточный рецептор, такой как полипептид zalpha11, а не вирусный рецептор. Антитела или другие молекулы, которые узнают молекулы zalpha11 на поверхности
клетки-мишени, могут быть использованы для направления этого вируса для инфицирования и введения
генного терапевтического материала в эту клетку-мишень. См. Woo, S.L.C., Nature Biotech. 14:1538,
1996; Wickham, T.J. et al., Nature Biotech. 14:1570-1573, 1996; Douglas, J.T. et al., Nature Biotech. 14:15741578, 1996; Rihova, В., Crit. Rev. Biotechnol. 17:149-169, 1997 и Vile, R.G. et al., Mol. Med. Today 4:84-92,
1998. Например, биспецифическое антитело, содержащее вирус-нейтрализующий Fab-фрагмент, связанный с zalpha11-специфическим антителом, может быть использовано для направления этого вируса к
клеткам, экспрессирующим рецептор zalpha11, и позволит эффективно ввести этот вирус, содержащий
генетический элемент, в клетки. См., например, Wickham, T.J., et al., J. Virol. 71:7663-7669, 1997 и Wickham,
T.J., et al., J. Virol. 70:6831-6838, 1996.
Данное изобретение обеспечивает также реагенты, которые найдут применение в диагностических
приложениях. Например, ген zalpha11, зонд, содержащий ДНК или РНК zalpha11 или их субпоследовательность, могут быть использованы для определения, присутствует ли ген zalpha11 на хромосоме 16 или
имела ли место мутация. Zalpha11 локализован в районе 16р11.1 хромосомы 16 (см. пример 3). Детектируемые хромосомные аберрации в локусе гена zalpha11 включают в себя, но не ограничиваются ими,
анеуплоидию, изменения копийности гена, инсерции, делеции, изменения сайтов рестрикции и реаранжировки. Такие аберрации могут быть детектированы с использованием полинуклеотидов данного изобретения путем применения молекулярно-генетических способов, таких как анализ полиморфизма длины фрагментов рестрикции (RELP), флуоресцентных способов гибридизации in situ, анализа коротких
тандемных повторов (STR) с использованием ПЦР-способов и других способов анализа генетического
сцепления, известных в данной области (Sambrook et al., ibid; Ausubel et al., ibid; Marian, Chest 108:25565, 1995).
Точное знание положения гена может быть полезным для ряда целей, в том числе 1) определения,
является ли последовательность частью существующего контига, и получения дополнительных окружающих генетических последовательностей в различных формах, таких как YAC, ВАС или кДНКклоны; 2) обеспечения возможного гена-кандидата для наследственного заболевания, который обнаруживает сцепление с тем же самым хромосомным районом; и 3) перекрестно-ссылочных модельных организмов, таких как мышь, которые могут способствовать определению, какую функцию может иметь конкретный ген.
Ген zalpha11 локализован в районе 16р11.1 хромосомы 16. Несколько генов известной функции
картированы в этом районе. Например, альфа-субъединица рецептора цитокина (IL-4), члена семейства
рецепторов гемопоэтина, картирована в 16р12.1-р11.2. Эта субъединица может образовывать гетеродимер с zalpha11. Кроме того, зонды полинуклеотида zalpha11 могут быть использованы для обнаружения
отклонений от нормы или генотипов, связанных с дефектами в рецепторе IL-4, например таких, которые
участвуют в некоторых аллергических воспалительных нарушениях и астме (Deichman, K.А. et al., Exp.
Allergy 28:151-155; 1998; Mitsuyasu, H. et al., Nature Genet. 19:119-120, 1998). Кроме того, зонды поли- 34 -
006501
нуклеотида zalpha11 могут быть использованы для детектирования отклонений от нормы или генотипов,
связанных с воспалительным заболеванием пищеварительного тракта, где маркер восприимчивости картирован на 16p12-q13 (Cho, J.H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 95:7502-7507, 1998). Далее, зонды полинуклеотида zalpha11 могут быть использованы для детектирования отклонений от нормы или генотипов,
связанных с локусами гемоглобина, локализованными в 16pter-p13.3, и в частности дефектов гемоглобина альфа, ассоциированных с синдромами альфа-талассемии, такими как иммунная водянка плода (обзор
Chui, M.P. and Waye, J.S. Blood 91:2213-2222, 1998). Кроме того, среди других генных локусов, локусы
для опухоли Вильмса, типа III (16q), синдрома Rubenstein-Taybi (16р13.3), тяжелого поликистозного заболевания детей (16р13.3), все проявляются в патологических состояниях человека, а также картированы
в этом районе генома человека. См. Online Mendellian Inheritance of Man (OMIM) gene map и ссылки в
ней, в отношении этого района хромосомы 16 на общественно доступном сервере WWW (http://www3.
Ncbi. Nlm. Nih. Gov/htbin-post/Omim/getmap? Chromosome=16p11.1). Все эти гены служат возможными
генами-кандидатами для наследственных болезней, которые обнаруживают сцепление с одним и тем же
хромосомным районом, в котором находится ген zalpha11.
Подобным образом, дефекты в самом локусе zalpha11 могут приводить к наследственному патологическому состоянию человека. Молекулы данного изобретения, такие как полипептиды, антагонисты,
агонисты, полинуклеотиды и антитела данного изобретения, могли бы способствовать детектированию,
предупреждению диагноза и лечению, связанным с генетическим дефектом zalpha11.
Мыши, "сконструированные" для экспрессии гена zalpha11, называемые "трансгенными мышами",
и мыши, которые обнаруживают полное отсутствие функции гена zaiphall, называемые "мышами с нокаутом (гена)", также могут быть получены (Snouwaert et al., Science 257: 1083, 1992; Lowell et al., Nature
366: 740-42, 1993; Capecchi, M.R., Science 244:1288-1292, 1989; Palmiter, R.D. et al., Annu. Rev. Genet.
20:465-499, 1986). Например, трансгенные мыши, которые сверхэкспрессируют zalpha11, либо повсюду,
либо под контролем тканеспецифического промотора или рестриктированного в отношении ткани промотора, могут быть использованы для выяснения, обусловливает ли сверхэкспрессия определенный фенотип. Например, сверхэкспрессия полипептида zalpha11 дикого типа, фрагмента полипептида или его
мутанта может изменять нормальные клеточные процессы, приводя к фенотипу, который идентифицирует ткань, в которой экспрессия zalpha11 является функционально релевантной, и может указывать на терапевтическую мишень для zalpha11, его агонистов или антагонистов. Например, предпочтительной
трансгенной мышью для «конструирования» является мышь, которая экспрессирует «доминантнонегативный» фенотип, такой, при котором сверхэкспрессируется внеклеточный цитокинсвязывающий
домен zalpha11 с присоединенным трансмембранным доменом (приблизительно аминокислоты 20 (Cys)25 (Leu) SEQ ID NO:2). Кроме того, такая сверхэкспрессия может приводить к фенотипу, который обнаруживает сходство с заболеваниями человека. Подобным образом, мыши с нокаутом zalpha11 могут быть
использованы для определения, где zalpha11 является абсолютно необходимым in vivo. Фенотип мышей
с нокаутом предсказывает эффекты in vivo, которые может иметь антагонист zalpha11, такой как описанные здесь. кДНК мышиного или человеческого zalpha11 может быть использована для выделения мышиной мРНК, кДНК или геномной ДНК zalpha11, которые затем используют для получения мышей с нокаутом гена. Эти мыши могут быть использованы для исследования гена zalpha11 и белка, кодируемого
им, в системе in vivo и могут быть использованы в качестве моделей in vivo для соответствующих заболеваний человека. Кроме того, экспрессия трансгенными мышами антисмысловых полинуклеотидов
zalpha11 или направленных против zalpha11 рибозимов, описанных здесь, может быть использована аналогично экспрессии трансгенных мышей, описанной выше.
Для фармацевтического применения растворимые рецепторные полипептиды данного изобретения
готовят для парентеральной, в частности внутривенной или подкожной, доставки в соответствии с общепринятыми способами. Внутривенное введение может быть болюсной инъекцией или инфузией на протяжении обычного периода времени одного-нескольких часов. Обычно фармацевтические композиции
будут включать в себя растворимый рецепторный полипептид zalpha11 в комбинации с фармацевтически
приемлемым носителем, таким как солевой раствор, забуференный солевой раствор, 5% декстроза в воде
или т.п. Композиции могут дополнительно содержать один или несколько наполнителей, консервантов,
солюбилизаторов, буферящих агентов, альбумин для предупреждения потери белка на поверхностях
флаконов и т.д. Способы приготовления композиций хорошо известны в данной области и описаны, например, в Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA,
19th ed., 1995. Терапевтические дозы обычно будут находиться в диапазоне от 0,1 до 100 мкг/кг массы
тела в сутки, предпочтительно 0,5-20 мг/кг в сутки, причем точная доза должна определяться врачом в
соответствии с принятыми стандартами, с учетом природы и тяжести подлежащего лечению состояния,
особенностей пациента и т.д. Определение дозы находится в пределах обычной квалификации специалиста в данной области. Белки могут вводиться, для остро требующегося лечения, на протяжении 1 недели
или менее, часто на протяжении периода 1-3 дней или могут вводиться, в продолжительном лечении, на
протяжении нескольких месяцев или лет. Обычно, терапевтически эффективное количество растворимого рецепторного полипептида zalpha11 составляет количество, достаточное для получения клинически
значимого эффекта.
- 35 -
006501
Далее данное изобретение иллюстрируется следующими ниже неограничительными примерами.
Примеры
Пример 1. Идентификация zalpha11 человека с использованием EST-последовательности для получения полноразмерного zalpha11.
Сканирование базы данных транслируемых ДНК привело к идентификации маркерной экспрессирующейся последовательности (EST), которая оказалась членом семейства рецепторов цитокинов класса
I и была названа zalpha11.
Подтверждение этой EST-последовательности было выполнено анализом последовательности
кДНК, из которой происходила эта EST. Этот кДНК-клон был получен и секвенирован с использованием
следующих праймеров: ZC 447 (SEQ ID NO:5), ZC 976 (SEQ ID NO:6), ZC 19345 (SEQ ID NO:7), ZC
19346 (SEQ ID NO:8), ZC 19349 (SEQ ID NO:9), ZC 19350 (SEQ ID NO:10), ZC 19458 (SEQ ID NO:11), ZC
19459 (SEQ ID NO:12), ZC 19460 (SEQ ID NO:13), ZC 19461 (SEQ ID NO:14), ZC 19572 (SEQ ID NO:15),
ZC 19573 (SEQ ID NO:16), ZC 19657 (SEQ ID NO:17). Вставка (инсерция) была 2945 п.н. и была полноразмерной.
Пример 2. Тканевое распределение.
Нозерн-блот-анализы проводили с использованием Нозерн™ блотов множественных тканей человека (MTN I, MTN II и MTN III) (Clontech). кДНК, описанные в примере 1, использовали в ПЦР-реакции
с использованием олигонуклеотидов (олиго) ZC 19181 (SEQ ID NO:18) и ZC 19182 (SEQ ID NO:19) в качестве праймеров. Условия ПЦР были следующими: 94°С в течение 1,5 мин; 35 циклов при 94°С в течение
15 с, затем 68°С в течение 30 с; 72°С в течение 10 мин; 4°С в течение ночи. Пробу продукта ПЦР-реакции подвергали электрофорезу на 1,5% агарозном геле. Наблюдали полосу ожидаемого размера 175 п.н.
ПЦР-фрагмент 175 п.н. очищали на геле с использованием коммерчески доступного набора (QiaexII™;
Qiagen) и затем радиоактивно метили 32P-dCTP с использованием Rediprime II™ (Amersham), системы мечения со случайным праймированием, в соответствии с описаниями изготовителя. Затем зонд очищали при помощи колонки Nuc-Trap™ (Stratagene) в соответствии с инструкциями изготовителя. Раствор ExpressHyb™
(Clontech) использовали для предгибридизации и в качестве гибридизационного раствора для Нозернблотов. Гибридизация имела место в течение ночи при 65°С с использованием 1-2х106 имп./мин/мл меченого зонда. Затем блоты промывали 4 раза в течение 15 мин в 2Х SSC/1% ДСН при 25°С с последующим
промыванием в 0,1X SSC/0,1 ДСН при 50°С. Транскрипты приблизительно 3 т.п.н. и 5 т.п.н. детектировали в лимфатическом узле, лейкоцитах периферической крови и вилочковой железе (тимусе).
Дот-блоты получали с использованием блотов Human RNA Master Blots™ (Clontech). Способы и
условия для дот-блотов были такими же, что и условия для блотов множественных тканей, описанных
выше. Дот-блот имел наиболее сильный сигнал в тимусе, лимфатическом узле и селезенке.
Нозерн-анализ проводили также с использованием клеточной линии MTN™ рака человека (Clontech).
кДНК, описанную в примере 1, использовали в ПЦР-реакции с применением олиго ZC 19907 (SEQ ID
NO:20) и ZC 19908 (SEQ ID NO:21) в качестве праймеров. Условия ПЦР были следующими: 35 циклов
при 95°С в течение 1 мин, затем 60°С в течение 1 мин; 72°С в течение 1,5 мин; 4°С в течение ночи. Пробу продукта ПЦР-реакции подвергали электрофорезу на 1,5% агарозном геле. Наблюдали полосу ожидаемого размера 1,2 т.п.н. ПЦР-фрагмент 1,2 т.п.н. очищали на геле с использованием коммерчески доступного набора (QiaQuickII™ Gel Extraction Kit; Qiagen) и затем радиоактивно метили 32P-dCTP с использованием Prime-It II™ (Stratagene), системы мечения со случайным праймированием, в соответствии
с описаниями изготовителя. Затем зонд очищали при помощи колонки Nuc-Trap™ (Stratagene) в соответствии с инструкциями изготовителя. Раствор ExpressHyb™ (Clontech) использовали для предгибридизации и в качестве гибридизационного раствора для Нозерн-блотов. Гибридизация имела место в течение
ночи при 65°С с использованием 1-2х106 имп./мин/мл меченого зонда. Затем блоты промывали 4 раза в
течение 15 мин в 2Х SSC/1% ДСН при 25°С с последующими двумя 30-минутными промываниями в
0,1X SSC/0,1 ДСН при 50°С. Сильный сигнал наблюдали в клеточной линии Raji, полученной из лимфомы Беркитта.
Пример 3.
Хромосомное картирование гена zalpha11 на основе ПЦР.
Zalpha11 картировали на хромосоме 16 с использованием коммерчески доступной панели «GeneBridge 4 Radiation Hybrid Panel» (Research Genetics, Inc., Hunstsville, AL). GeneBridge 4 Radiation Hybrid
Panel содержит пригодные для ПЦР ДНК из каждого из 93 радиационных (облученных) гибридных клонов, плюс две контрольные ДНК (HFL-донор и А23-реципиент). Общественно доступный сервер WWW
(http://www-genome. Wi. Mit. Edu/cgibin/contig/rhmapper.pl) позволяет картирование относительно карты
радиационных гибридов генома человека (карты радиационных гибридов «WICGR») Центра исследований
генома Whitehead Institute/MIT Center for Genome Research, которая была сконструирована с использованием панели радиационных гибридов GeneBridge 4 Radiation Hybrid Panel.
Для картирования гена zalpha11 с панелью GeneBridge 4 RH Panel реакции по 20 мкл устанавливали
в 96-луночном микротитрационном планшете (Stratagene, La Jolla, CA) и использовали термоциклер "RoboCycler Gradient 96" (Stratagene). Каждая из этих 95 ПЦР-реакций состояла из 2 мкл 10Х реакционного
буфера для ПЦР-реакции (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA), 1,6 мкл смеси dNTP (2,5 мМ каждый,
- 36 -
006501
PERKIN-ELMER, Foster City, CA), 1 мкл смыслового праймера ZC 19954 (SEQ ID NO:22), 1 мкл антисмыслового праймера ZC 19955 (SEQ ID NO:23), 2 мкл "RediLoad" (Research Genetics, Inc., Huntsville, AL),
0,4 мкл 50Х смеси Advantage KlenTaq Polymerase (Clontech), 25 нг ДНК из индивидуального гибридного
клона или контроля и ddH2O для общего объема 20 мкл. На реакции наслаивали равное количество минерального масла и их герметизировали. Условия ПЦР-циклера были следующими: 1 начальный цикл 4минутной денатурации при 94°С, 35 циклов 45 с при 94°С, 45 с при 68°С и 1 мин при 72°C; с последующими 7 мин при 72°С. Реакции разделяли электрофорезом на 2% агарозном геле (Life Technologies).
Результаты показали, что Zalpha11 картируется 9,54 cR_3000 от каркасного маркера WI-3768 на хромосоме 16 карты радиационных (облученных) гибридов WICGR. Проксимальный и дистальный каркасные
маркеры были WI-3768 и TIGR-A002K05, соответственно. Применение окружающих маркеров помещает
zalpha11 в район 16р11.1 на интегрированной карте LDB хромосомы 16 (The Genetic Location Database,
University of Southhampton, сервер WWW: (http://cedar.genetics.soton.ас.uk/public_html/).soton.ac.uk/public_html/).
Пример 4. Конструирование химеры полипептидов человека MPL-zalpha11: внеклеточный и ТМдомен MPL, слитые с внутриклеточным передающим сигнал доменом zalpha11.
Внеклеточный и трансмембранный домены MPL-рецептора выделяли из плазмиды, содержащей
MPL-рецептор плазмиды (PHZ1/MPL) с использованием ПЦР с праймерами ZC17212 (SEQ ID NO:24) и
ZC19914 (SEQ ID NO:25). Условия реакции были следующими: 95°С в течение 1 мин; 35 циклов при
95°С в течение 1 мин, 45°С в течение 1 мин, 72°С в течение 2 мин; затем 72°С в течение 10 мин; затем
пропитывание при 10°С. ПЦР-продукт подвергали электрофорезу на 1% агарозе с низкой точкой плавления (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) и фрагмент MPL-рецептора приблизительно 1,5 т.п.н. выделяли с использованием набора для экстракции гелей Qiaquick™ (Qiagen) согласно инструкциям изготовителя.
Внутриклеточные домены zalpha11 выделяли из плазмиды, содержащей кДНК рецептора zalpha11, с
использованием ПЦР с праймерами ZC19913 (SEQ ID NO:26) и ZC20097 (SEQ ID NO:27). Полинуклеотидная последовательность, соответствующая кодирующей zalpha11-рецептор последовательности, показана в SEQ ID NO:1 от нуклеотида 69 до нуклеотида 1682. Условия реакции были такие же, что и описанные выше. ПЦР-продукт подвергали электрофорезу на 1% агарозе с низкой точкой плавления (Boehringer
Mannheim) и фрагмент zalpha11 приблизительно 900 т.п.н. выделяли с использованием набора для экстракции гелей Qiaquick согласно инструкциям изготовителя.
Каждый из выделенных фрагментов, описанных выше, смешивали при отношении объемов 1:1 и
использовали в ПЦР-реакции с применением ZC17212 (SEQ ID NO:24) и ZC20097 (SEQ ID NO:27) для
создания химеры MPL-zalpha11. Условия реакции были следующими: 95°С в течение 1 мин; 35 циклов
при 95°С в течение 1 мин; 55°С в течение 1 мин, 72°С в течение 2 мин; затем 72°С в течение 10 мин; затем пропитывание при 10°С. Полный ПЦР-продукт подвергали электрофорезу на 1% агарозе с низкой
точкой плавления (Boehringer Mannheim) и химерный фрагмент MPL-zalpha11 приблизительно 2,4 т.п.н.
выделяли с использованием набора для экстракции гелей Qiaquick™ (Qiagen) согласно инструкциям изготовителя. Химерный фрагмент MPL-zalpha11 расщепляли EcoRI (BRL) и XbaI (Boehringer Mannheim)
согласно инструкциям изготовителя. Весь продукт расщепления подвергали электрофорезу на 1% агарозе с низкой точкой плавления (Boehringer Mannheim) и отщепленную химеру MPL-zalpha11 выделяли с
использованием набора для экстракции гелей Qiaquick™ (Qiagen) согласно инструкциям изготовителя.
Полученную отщепленную химеру MPL-zalpha11 встраивали в экспрессирующий вектор, как описано
ниже.
Реципиентный экспрессирующий вектор pZP-5N расщепляли EcoRI (BRL) и HindIII (BRL) согласно
инструкциям изготовителя и очищали на геле, как описано выше. Этот векторный фрагмент объединяли
с отщепленной EcoRI и XbaI химерой MPL-zalpha11, выделенной, как описано выше, и XbaI/HindIIIлинкерным фрагментом в реакции лигирования. Лигирование проводили с лигазой Т4 (BRL) при 15°С в
течение ночи. Пробу лигирования подвергали электрофорезу в электрокомпетентных относительно
DH10B ElectroMAX™ клетках Е. coli (25 мкФ, 200 Ом, 2,3 В). Трансформанты высевали на чашки с
LB+ампициллин и отдельные колонии подвергали скринингу при помощи ПЦР для подтверждения химеры MPL-zalpha11 с использованием ZC17212 (SEQ ID NO:24) и ZC20097 (SEQ ID NO:27) с применением условий ПЦР, описанных выше.
Подтверждение последовательности химеры MPL-zalpha11 выполняли при помощи анализов последовательности с использованием следующих праймеров: ZC12700 (SEQ ID NO:28), ZC5020 (SEQ ID
NO:29), ZC6675 (SEQ ID NO:30), ZC7727 (SEQ ID NO:31), ZC8290 (SEQ ID NO:32), ZC19572 (SEQ ID
NO:15), ZC6622 (SEQ ID NO:33), ZC7736 (SEQ ID NO:34) и ZC9273 (SEQ ID NO:35). Вставка была приблизительно 2,4 т.п.н. и была полноразмерной.
Пример 5. Пролиферация на основе химеры MPL-zalpha11 в ВАF3-тесте с использованием Alamar
Blue.
А. Конструирование клеток BaF3, экспрессирующих химеру MPL-zalpha11.
BaF3, интерлейкин-3- (IL-3)-зависимую прелимфоидную клеточную линию, полученную из мышиного костного мозга (Palacios and Steinmetz, Cell 41:727-734, 1985; Mathey-Prevot et al., Mol. Cell. Biol.
6:4133-4135, 1986), поддерживали в полной среде (среде RPMI (JRH Bioscience Inc., Lenexa, KS), допол- 37 -
006501
ненной 10% инактивированной нагреванием фетальной телячьей сывороткой, 2 нг/мл мышиного IL-3
(mIL-3) (R & D, Minneapolis, MN), 2 мМ L-glutaMax-1™ (Gibco BRL), 1 мМ пируватом натрия (Gibco
BRL) и PSN-антибиотиками (Gibco BRL)) . Перед электрофорезом ДНК pZP-5N/MPL-zalpha11 (пример 4)
получали и очищали с использованием набора Qiagen Maxi Prep kit (Qiagen) согласно инструкциям изготовителя. Клетки BaF3 для электропорации промывали 1 раз в среде RPMI и затем ресуспендировали в среде
RPMI при плотности клеток 107 клеток/мл. 1 мл ресуспендированных клеток BaF3 смешивали с 30 мкг
ДНК плазмиды pZP-5N/MPL-zalpha11 и переносили в отдельные одноразовые камеры для электропорации (Gibco BRL). После 15-минутного инкубирования при комнатной температуре клетки подвергали
двум последовательным электрошокам (800 МФ/300 В; 1180 МФ/300 В), подаваемым прибором для
электропорации (CELL-PORATOR™; Gibco BRL). После 5 мин восстановления до нормы электропорированные клетки переносили в 50 мл полной среды и помещали в термостат на 15-24 ч (37°С, 5% CO2).
Затем эти клетки откручивали и ресуспендировали в 50 мл полной среды, содержащей Geneticin™
(Gibco) для отбора (500 мкг/мл G418) в колбу Т-162 для выделения G418-резистентного пула. Пулы
трансфицированных клеток BaF3, далее называемых клетками BaF3/MPL-zalpha11, анализировали на
способность передачи сигнала, как описано ниже.
В. Тестирование способности передачи сигнала клеток BaF3/MPL-zalpha11 с использованием теста
пролиферации с Alamar Blue.
Клетки BaF3/MPL-zalpha11 откручивали и промывали в полной среде, как описано выше, но без
mIL-3 (далее называемой «не содержащей mIL-3 средой»). Клетки откручивали и промывали 3 раза для
гарантии удаления mIL-3. Затем клетки считали в гемоцитометре. Клетки высевали в 96-луночный
планшет при 5000 клеток на лунку в объеме 100 мкл на лунку с использованием не содержащей mIL-3
среды.
Пролиферацию клеток BaF3/MPL-zalpha11 оценивали с использованием тромбопоэтина (ТРО), разведенного не содержащей mIL-3 средой до концентраций 500, 250, 125, 62 нг/мл, 30, 15, 7,5, 3,75, 1,8, 0,9,
0,5 и 0,25 нг/мл. 100 мкл разведенного ТРО добавляли к клеткам BaF3/MPL-zalpha11. Общий объем теста
равен 200 мкл. Негативные контроли оценивали параллельно с использованием только не содержащей
mIL-3 среды, без добавления ТРО. Тест-планшеты инкубировали при 37°С, 5% СO2 в течение 3 дней,
после чего добавляли Alamar Blue (Accumed, Chicago, IL) при 20 мкл на лунку. Alamar Blue дает флуорометрические показания на основе числа живых клеток и является, следовательно, прямым измерением
пролиферации клеток в сравнении с негативным контролем. Планшеты опять инкубировали при 37°С,
5% СO2 в течение 24 ч. Планшеты считывали на планшет-ридере Fmax™ (Molecular Devices Sunnyvale,
CA) с использованием программы SoftMax™ Pro при длинах волн 544 (возбуждение) и 590 (эмиссия).
Результаты подтвердили способность передачи сигнала внутриклеточной части zalpha11-рецептора,
так как тромбопоэтин индуцировал пролиферацию приблизительно в 10 раз более высокую, чем уровень
фона, при 62 нг/мл и больших концентрациях.
Пример 6. Конструирование экспрессирующего вектора, экспрессирующего полноразмерный zalpha11.
Полный zalpha11-рецептор выделяли из плазмиды, содержащей кДНК zalpha11-рецептора, при помощи ПЦР с использованием праймеров ZC19905 (SEQ ID NO:36) и ZC19906 (SEQ ID NO:37). Условия реакции были следующими; 95 °С в течение 1 мин; 35 циклов при 95°С в течение 1 мин; 55°С в течение 1 мин,
72°С в течение 2 мин; затем 72°С в течение 10 мин; затем пропитывание при 10°С. ПЦР-продукт подвергали электрофорезу на 1% агарозе с низкой точкой плавления (Boehringer Mannheim) и кДНК zalpha11
приблизительно 1,5 т.п.н. выделяли с использованием набора для экстракции гелей Qiaquick™ (Qiagen)
согласно инструкциям изготовителя.
Очищенную кДНК zalpha11 расщепляли BamHI (Boehringer Mannheim) и EcoRI (BRL) согласно инструкциям изготовителя. Весь продукт расщепления подвергали электрофорезу на 1% агарозе с низкой
точкой плавления (Boehringer Mannheim) и очищали отщепленный фрагмент zalpha11 с использованием
набора для экстракции гелей Qiaquick согласно инструкциям изготовителя. Полученный отщепленный
zalpha11-фрагмент встраивали в экспрессирующий вектор, как описано ниже.
Реципиентный экспрессирующий вектор pZP-5N расщепляли BamHI (Boehringer Mannheim) и
EcoRI (BRL) согласно инструкциям изготовителя и очищали на геле, как описано выше. Этот векторный
фрагмент объединяли с отщепленным BamHI (Boehringer Mannheim) и EcoRI (BRL) zalpha11-фрагментом, выделенным, как описано выше, в реакции лигирования. Лигирование проводили с лигазой Т4
(BRL) при 15°С в течение ночи. Пробу лигирования подвергали электрофорезу в электрокомпетентных
относительно DH10B ElectroMAX™ клетках Е. coli (25 мкФ, 200 Ом, 2,3 В). Трансформанты высевали на
чашки с LB+ампициллин и отдельные колонии подвергали скринингу при помощи ПЦР для подтверждения последовательности zalpha11 с использованием ZC19905 (SEQ ID NO:36) и ZC19906 (SEQ ID NO:37)
с применением условий ПЦР, описанных выше.
Подтверждение последовательности MPL-zalpha11 выполняли при помощи анализов последовательности с использованием следующих праймеров: ZC12700 (SEQ ID NO:28), ZC5020 (SEQ ID NO:29),
ZC20114 (SEQ ID NO:38), ZC19459 (SEQ ID NO:12), ZC19954 (SEQ ID NO:39) и ZC20116 (SEQ ID
NO:40). Вставка была приблизительно 1,6 т.п.н. и была полноразмерной.
- 38 -
006501
Пример 7. Пролиферация на основе zalpha11 в ВАF3-тесте с использованием Alamar Blue.
А. Конструирование клеток BaF3, экспрессирующих zalpha11-рецептор.
Клетки BaF3, экспрессирующие полноразмерный zalpha11-рецептор, конструировали, как в примере 5А выше, с использованием 30 мкг экспрессирующего вектора zalpha11, описанного в примере 6 выше. Клетки BaF3, экспрессирующие мРНК zalpha11-рецептора, были названы BaF3/zalpha11. Эти клетки
использовали для скрининга на активность zalpha11, как описано ниже в примерах 8 и 12.
Пример 8. Скрининг активности zalpha11 с использованием клеток BaF3/zalpha11 при помощи теста
пролиферации с Alamar Blue.
А. Источник первичных клеток обезьяны, используемый для тестирования на присутствие активности zalpha11.
Кондиционированную среду от первичных клеток селезенки обезьяны использовали для тестирования
на присутствие активности, как описано ниже. Клетки селезенки обезьяны активировали 5 нг/мл форбол12-миристат-13-ацетата (ФМА) (Calbiochem, San Diego, СА) и 0,5 мкг/мл иономицина™ (Calbiochem) в
течение 72 ч. Супернатант от этих стимулированных клеток селезенки обезьяны использовали для анализа пролиферации клеток BaF3/zalpha11, как описано ниже.
В. Скрининг на активность zalpha11 с использованием клеток BaF3/zalpha11 при помощи теста пролиферации с Alamar Blue.
Клетки BaF3/zalpha11 откручивали и промывали в не содержащей mIL-3 среде. Клетки откручивали
и промывали 3 раза для гарантии удаления mIL-3. Затем клетки считали в гемоцитометре. Клетки высевали в 96-луночный планшет при 5000 клеток на лунку в объеме 100 мкл на лунку с использованием не
содержащей mIL-3 среды.
Пролиферацию клеток BaF3/zalpha11 оценивали с использованием кондиционированной среды от
активированных клеток селезенки обезьяны (см. пример 8А выше), которая была разведена не содержащей mIL-3 средой до концентраций 50, 25, 12,5, 6,25, 3,125, 1,5, 0,75 и 0,375%. 100 мкл разведенной кондиционированной среды добавляли к клеткам BaF3/zalpha11. Общий объем теста равен 200 мкл. Тестпланшеты инкубировали при 37°С, 5% CO2 в течение 3 дней, после чего добавляли Alamar Blue (Accumed,
Chicago, IL) при 20 мкл на лунку. Планшеты опять инкубировали при 37°С, 5% СО2 в течение 24 ч.
Планшеты считывали на планшет-ридере Fmax™ (Molecular Devices), как описано выше.
Результаты подтвердили пролиферативный ответ клеток BaF3/Zalpha11 на фактор, присутствующий в активированных кондиционированных средах клеток селезенки обезьяны. Этот ответ согласно
измерениям был приблизительно в 4 раза выше фона при концентрации 50%. Клетки BaF3 дикого типа
не пролиферировали в ответ на этот фактор, что указывает на то, что этот фактор является специфическим для Zalpha11-рецептора.
С. Источник первичных клеток человека, используемый для выделения активности zalpha11.
По 100 мл крови брали из шести доноров. Кровь извлекали с использованием 10Х 10 мл вакуумных
пробирок (vacutainer), содержащих гепарин. Кровь объединяли из шести доноров (600 мл), разводили 1:1
в ЗФР и разделяли с использованием Ficoll-Paque® PLUS (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden). Выход выделенных первичных клеток человека после разделения на градиенте фиколла был равен 1,2х109 клеток.
Клетки суспендировали в 9,6 мл буфера MACS (ЗФР, 0,5% ЭДТА, 2 мМ ЭДТА). 1,6 мл клеточной
суспензии извлекали и добавляли 0,4 мл микрогранул CD3 (Miltenyi Biotec. Auburn, СА). Смесь инкубировали в течение 15 мин при 4°С. Клетки, меченные гранулами CD3, промывали 30 мл буфера MACS и
затем ресуспендировали в 2 мл буфера MACS.
Колонку VS+ (Miltenyi) готовили согласно инструкциям изготовителя. Затем колонку VS+ помещали в магнитное поле VarioMACS™ (Miltenyi). Колонку уравновешивали 5 мл буфера MACS. Затем выделенные первичные клетки человека наносили на эту колонку. СD3-негативным клеткам давали пройти
через колонку. Колонку промывали 9 мл (3х3мл) буфера MACS. Затем колонку удаляли из магнитного
поля и помещали над пробиркой из falcon на 15 мл. CD3+ клетки элюировали добавлением 5 мл буфера
MACS на колонку и связавшиеся клетки вымывали с использованием поршня (плунжера), обеспечиваемого изготовителем. Инкубирование этих клеток с CD3-магнитными гранулами, промывки и стадии колонки VS+ (инкубирование-элюция), описанные выше, повторяли еще 5 раз. Полученные CD3+ фракции
из шести разделений на колонке объединяли. Общий выход CD3+ отобранных Т-клеток человека был
равен 3х108 клеток.
Пробу объединенных CD3+ отобранных Т-клеток человека брали для окрашивания и сортинга на
клеточном сортере с возбуждением флуоресценции (FACS) для оценки их чистоты. CD3+ отобранные Тклетки человека содержали 91% CD3+ клеток.
CD3+ отобранные Т-клетки человека активировали инкубированием в RPMI+5% ФТС+ФМА 10 нг/мл
и иномицине 0,5 мкг/мл (Calbiochem) в течение 13 ч при 37°С. Супернатант от этих активированных
CD3+ отобранных Т-клеток человека тестировали на активность zalpha11, как описано ниже.
D. Тестирование супернатанта от активированных CD3+ отобранных Т-клеток человека на
zalpha11-активность с использованием клеток BaF3/zalpha11 и теста пролиферации с использованием
Alamar Blue.
- 39 -
006501
Клетки BaF3/zalpha11 откручивали и промывали в не содержащей mIL-3 среде. Клетки откручивали
и промывали 3 раза для гарантии удаления mIL-3. Затем клетки считали в гемоцитометре. Клетки высевали в 96-луночный планшет при 5000 клеток на лунку в объеме 100 мкл на лунку с использованием не
содержащей mIL-3 среды.
Пролиферацию клеток BaF3/zalpha11 оценивали с использованием кондиционированной среды от
активированных CD3+ отобранных Т-клеток человека (см. пример 8С выше), разведенной не содержащей mIL-3 средой до концентраций 50, 25, 12,5, 6,25, 3,125, 1,5, 0,75 и 0,375%. 100 мкл разведенной кондиционированной среды добавляли к клеткам BaF3/zalpha11. Общий объем теста равен 200 мкл. Тестпланшеты инкубировали и анализировали, как описано в примере 8В выше.
Результаты подтвердили пролиферативный ответ клеток BaF3/zalpha11 на фактор, присутствующий
в активированной кондиционированной среде CD3+ отобранных Т-клеток человека. Этот ответ согласно
измерениям был приблизительно в 10 раз выше фона при концентрации 50%. Клетки BaF3 дикого типа
не пролиферировали в ответ на этот фактор, что указывает на то, что этот фактор является специфическим для Zalpha11-рецептора.
Пример 9. Конструирование экспрессирующих векторов млекопитающих, которые экспрессируют
растворимые рецепторы zalpha11: zalpha11CEE, zalpha11CFLG, zalpha11CHIS и zalpha11-Fc4.
A. Конструирование экспрессирующего вектора млекопитающих, содержащего zalpha11CEE,
zalpha11CFLG, zalpha11CHIS.
Получали экcпрессирующий вектор для экспрессии растворимого внеклеточного домена полипептида zalpha11, pC4zalpha11CEE, причем эта конструкция предназначена для экспрессии полипептида
zalpha11, содержащего предсказанный инициирующий метионин и укороченного вблизи предсказанного
трансмембранного домена, имеющего С-концевую Glu-Glu-метку (SEQ ID NO:41).
ПЦР-генерируемый фрагмент ДНК zalpha11 700 п.н. создавали с использованием ZC19931 (SEQ ID
NO:42) и ZC19932 (SEQ ID NO:43) в качестве ПЦР-праймеров для добавления сайтов рестрикции Asp718
и BamHI. Плазмиду, содержащую кДНК zalpha11-рецептора, использовали в качестве матрицы. ПЦР-амплификацию фрагмента zalpha11 проводили следующим образом: 25 циклов при 94°С в течение 0,5 мин;
5 циклов при 94°С в течение 10 с, 50°С в течение 30 с, 68°С в течение 45 с; затем выдерживание при 4°С.
Реакцию очищали экстракцией смесью хлороформ/фенол и осаждением изопропанолом и расщепляли
Asp718 и BamHI (Gibco BRL) согласно инструкциям изготовителя. Полосу предсказанного размера, 700 п.н.,
визуализировали при помощи электрофореза на 1% агарозном геле, вырезали и эту ДНК очищали с использованием системы очистки QiaexII™ (Qiagen) согласно инструкциям изготовителя.
Вырезанную ДНК субклонировали в плазмиду рС4ЕЕ, которая была разрезана BamHI и Asp718. Экспрессирующий вектор pC4zalpha11CEE использует сигнальный пептид нативного zalpha11 и присоединяет
Glu-Glu-метку (SEQ ID NO:41) к С-концу полинуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид zalpha11. Плазмида рС4ЕЕ является экспрессирующим вектором млекопитающих, содержащим экспрессионную кассету, имеющую мышиный промотор металлотионеина-1, множественные сайты рестрикции для встраивания кодирующих последовательностей, стоп-кодон и терминатор гормона роста человека.
Эта плазмида имеет также начало репликации Е. coli, экспрессионную единицу селектируемых маркеров
млекопитающих, имеющую промотор, энхансер и начало репликации SV40, ген DHFR и терминатор SV40.
Приблизительно 30 нг рестрикционно отщепленной zalpha11-вставки и приблизительно 12 нг расщепленного вектора лигировали в течение ночи при 16°С. 1 мкл каждой реакции лигирования независимо электропорировали в DH10B-компетентные клетки (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) согласно инструкциям изготовителя, и высевали на LB-планшеты, содержащие 50 мг/мл ампициллина, и инкубировали в
течение ночи. Колонии подвергали скринингу при помощи рестрикционного анализа ДНК, полученных
из 2 мл жидких культур индивидуальных колоний. Последовательность вставки положительных клонов
подтверждали анализом последовательности. Крупномасштабное получение плазмиды проводили с использованием набора QIAGEN® Maxi prep kit (Qiagen) согласно инструкциям изготовителя.
Тот же самый процесс использовали для получения растворимых рецепторов zalpha11 с С-концевой
His-меткой, состоящей из 6 остатков His подряд, и С-концевой FLAG-меткой (SEQ ID NO:49), zalpha11CFLAG. Для конструирования этих конструкций вышеуказанный вектор имеет либо HIS, либо
FLAG®-метку вместо glu-glu-метки (SEQ ID NO:41).
В. Экспрессионная конструкция млекопитающих для растворимого рецептора zalpha11, zalpha11-Fc4.
Экспрессионную плазмиду, содержащую весь полинуклеотид или его часть, кодирующую zalpha11,
конструировали гомологичной рекомбинацией. Фрагмент кДНК zalpha11 выделяли при помощи ПЦР,
которая включает в себя полинуклеотидную последовательность из внеклеточного домена рецептора
zalpha11. Два праймера использовали в получении этого фрагмента zalpha11: (1) каждый из праймеров
для ПЦР включает в себя от 5' к 3' концу: 40 п.н. фланкирующей последовательности вектора (5' от
вставки) и 17 п.н., соответствующих 5'-концу внеклеточного домена zalpha11 (SEQ ID NO:44); и (2) 40 п.н.
5'-конца полинуклеотидной последовательности Fc4 (SEQ ID NO:45) и 17 п.н., соответствующих 3'-концу внеклеточного домена zalpha11 (SEQ ID NO:46). Фрагмент Fc4 для слияния с zalpha11 генерировали
при помощи ПЦР сходным образом. Двумя праймерами в получении фрагмента Fc4 были (1) 5'-праймер,
состоящий из 40 п.н. последовательности из 3'-конца внеклеточного домена zalpha11 и 17 п.н. 5'-конца
- 40 -
006501
Fc-4 (SEQ ID NO:47) и (2) 3'-праймер, состоящий из 40 п.н. векторной последовательности (3' от вставки)
и 17 п.н. 3'-конца Fc-4 (SEQ ID NO:48).
ПЦР-амплификацию каждой из реакций, описанных выше, проводили следующим образом: 1 цикл
при 94°С в течение 2 мин; 25 циклов при 94°С в течение 30 с, 60°С в течение 30 с, 72°С в течение 1 мин;
1 цикл при 72°С в течение 5 мин; с последующим выдерживанием при 4°С. 10 мкл из 100 мкл ПЦРреакции подвергали электрофорезу на 0,8% LMP-агарозном геле (Seaplaque GTG) с 1хТВЕ-буфером для
анализа. Остальные 90 мкл ПЦР-реакции осаждали добавлением 5 мкл 1 М NaCl и 250 мкл абсолютного
этанола. Используемый экспрессирующий вектор получали из плазмиды pCZR199 (депонированный в
American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209 и названный
No. 98668) и разрезали SmaI (BRL). Экспрессирующий вектор был произведен из плазмиды pCZR199 и
представляет собой экспрессирующий вектор млекопитающих, содержащий экспрессионную кассету,
имеющую немедленно ранний промотор CMV, консенсусный интрон из вариабельной области локуса
тяжелой цепи мышиного иммуноглобулина, множественные сайты рестрикции для встраивания кодирующих последовательностей, стоп-кодон и терминатор гормона роста человека. Этот экспрессирующий
вектор имеет также начало репликации Е. coli, экспрессионную единицу селектируемых маркеров млекопитающих, имеющую промотор, энхансер и начало репликации SV40, ген DHFR и терминатор SV40.
Этот используемый экспрессирующий вектор конструировали из pCZR199 заменой промотора металлотионеина немедленно ранним промотором CMV.
100 мкл компетентных дрожжевых клеток (S. cerevisiae) объединяли с 10 мкл, содержащими приблизительно 1 мкг каждой из вставок zalpha11 и Fc4 и 100 нг расщепленного SmaI (BRL) экспрессирующего
вектора, и переносили в кювету для электропорации 0,2 см. Смеси дрожжи/ДНК подвергали электрошокам
при 0,75 кВ (5 кВ/см), «неопределенном» числе Ом, 25 мкФ. В каждую кювету добавляли 600 мкл 1,2 М
сорбита и дрожжи высевали в двух аликвотах по 300 мкл на две чашки URA-D и инкубировали при 30°С.
Спустя приблизительно 48 ч Ura+ дрожжевые трансформанты из отдельной чашки ресуспендировали в 1 мл H2O и откручивали быстро для осаждения дрожжевых клеток. Клеточный осадок ресуспендировали в 1 мл лизисного буфера (2% тритон Х-100, 1% ДСН, 100 мМ NaCl, 10 мМ Трис, рН 8,0, 1 мМ
ЭДТА). 500 мкл лизисной смеси добавляли в пробирку Эппендорфа, содержащую 300 мкл промытых
кислотой стеклянных гранул и 200 мкл смеси фенол/хлороформ, встряхивали на вортексе 2 или 3 раза с
интервалами 1 мин, с последующим 5-минутным откручиванием в центрифуге Эппендорфа при максимальной скорости. 30 мкл водной фазы переносили в свежую пробирку и ДНК осаждали 600 мкл этанола
(EtOH) с последующим центрифугированием в течение 10 мин при 4°С. Осадок ДНК ресуспендировали в
100 мкл Н2O.
Трансформацию электрокомпетентных клеток Е. coli (DH10B, Gibco BRL) проводят с 0,5-2 мл препдрожжевой ДНК и 40 мкл клеток DH10B. Клетки подвергали электроимпульсам при 2,0 кВ, 25 мФ и 400 Ом.
После электропорации 1 мл SOC (2% бактотриптон (Difco, Detroit, MI), 0,5% дрожжевой экстракт
(Difco), 10 MM NaCl, 2,5 мМ КСl, 10 мМ MgCl2, 10 мМ MgSO4, 20 мМ глюкоза) высевали в аликвотах
250 мкл на четыре LB АМР чашки (LB-бульон (Lennox), 1,8% бактоагар (Difco), 100 мг/л ампициллина).
Индивидуальные клоны, улавливающие правильную экспрессионную конструкцию для zalpha11-Fc4,
идентифицировали рестрикционным расщеплением для подтверждения присутствия вставки zalpha11-Fc4
и для подтверждения, что различные последовательности ДНК были корректно соединены друг с другом. Вставку положительных клонов подвергали анализу последовательности. При крупномасштабном
получении плазмидную ДНК выделяют с использованием набора QIAGEN Maxi kit (Qiagen) согласно
инструкциям изготовителя.
Пример 10. Трансфекция и экспрессия растворимых рецепторных полипептидов zalpha11.
Клетки ВНК 570 (АТСС No. CRL-10314), пассаж 21, высевали в чашки при 1,2х106 клеток на лунку
(6-луночная чашка) в 800 мкл бессывороточной (ВС) среды DMEM (DMEM, Gibco/BRL High Glucose),
(GIBCO BRL, Gaithersburg, MD). Эти клетки трансфицировали экспрессионными плазмидами, содержащими zalpha1CEE/CFLG/CHIS, описанными выше (см. пример 9), с использованием липофектина™
(Gibco BRL) в бессывороточной (ВС) среде DMEM. 3 мкг zalpha11/CFLG/CHIS отдельно разводили в
пробирки на 1,5 мл до общего объема 100 мкл БС-DMEM. В отдельных пробирках 15 мкл липофектина™ (Gibco BRL) смешивали с 100 мкл БС-DMEM. Смесь с липофектином™ инкубировали при комнатной температуре в течение 30-45 мин, затем добавляли смесь ДНК и давали инкубироваться приблизительно 10-15 мин при комнатной температуре.
Всю смесь ДНК:липофектин™ добавляли к посеянным клеткам и равномерно распределяли на них.
Чашки инкубировали при 37°С в течение приблизительно 5 ч, затем переносили в отдельные чашки
MAXI 150 мм в конечном объеме 30 мл DMEM/5% фетальная телячья сыворотка (ФТС) (Hyclone, Logan,
UT). Чашки инкубировали при 37°С, 5% CO2, в течение ночи и смесь ДНК:липофектин™ заменяли свежей селективной средой (5% ФТС/DMEM с 1 мкМ метотрексата (МТХ) на следующий день).
Приблизительно при 10-12 днях после трансфекции чашки промывали 10 мл БС-DMEM. Промывочную среду отсасывали и заменяли 7,25 мл бессывороточной DMEM. Затем стерильные тефлоновые
сетки (Spectrum Medical Industries, Los Angeles, CA), предварительно пропитанные в БС-DMEM, помещали на колонии клональных клеток. Затем на эту сетку помещали стерильный нитроцеллюлозный
- 41 -
006501
фильтр, предварительно пропитанный в БС-DMEM. Метки для ориентации на нитроцеллюлозе переносили на чашку с культурой. Затем эти чашки инкубировали в течение 5-6 ч в термостате при 37°С, 5% CO2.
После инкубирования фильтры/сетки удаляли и среду отсасывали и заменяли средой 5%
ФТС/DMEM с 1 мкМ МТХ. Затем фильтры блокировали в 10% нежирном сухом молоке/буфере Вестерн
А (Вестерн А: 50 мМ Трис, рН 7,4, 5 мМ ЭДТА, 0,05% NP-40, 150 мМ NaCl и 0,25% желатин) в течение
15 мин при комнатной температуре на ротационном шейкере. Затем фильтры инкубировали с конъюгатами антитело против Glu. Glu, антитело против FLAG® или антитело против HIS-HRP (пероксидаза хрена),
соответственно, в 2,5% нежирном сухом молоке/буфере Вестерн А в течение 1 ч при комнатной температуре на ротационном шейкере. Затем фильтры промывали 3 раза при комнатной температуре буфером
Вестерн А в течение 5-10 мин на одну промывку. Фильтры проявляли реагентом ultra ECL (Amersham
Corp., Arlington Heights, IL) в соответствии с указаниями изготовителя и визуализировали на приборе для
получения изображений Lumi-Imager (Roche Corp.).
Положительные экспрессирующие клональные колонии механически выскребали в 12-луночные
чашки в одном мл 5% ФТС/DMEM с 5 мкМ МТХ, затем выращивали до конфлюэнтности. Затем пробы
кондиционированных сред тестировали на уровни экспрессии при помощи электрофореза в ДСН-ПААГ
и Вестерн-анализа. Три наиболее сильно экспрессирующих клона для каждой конструкции выскребали;
два из трех замораживали в качестве резерва, а один размножали для тестирования на микоплазму и
крупномасштабного посева в клеточной фабрике.
В. Экспрессия растворимого рецептора zalpha11-Fc4 в клетках млекопитающих.
Клетки ВНК 570 (АТСС No. CRL-10314) высевали в чашки 10 см для культуры ткани и давали им
расти до приблизительно 50-70% конфлюэнтности в течение ночи при 37°С, 5% CO2, в среде
DMEM/ФТС (DMEM, Gibco/BRL High Glucose, (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD), 5% фетальной телячьей
сыворотке (Hyclone, Logan, UT), 1 мМ L-глутамине (JRH Biosciences, Lenexa, KS), 1 мМ пирувате натрия
(Gibco BRL)). Затем клетки трансфицировали плазмидой, содержащей zalpha11-Fc4 (см. пример 9), с использованием липофектамина™ (Gibco BRL) в бессывороточной (БС) среде (DMEM, 10 мг/мл трансферрина, 5 мг/мл инсулина, 2 мг/мл фетуина, 1% L-глутамина и 1% пирувата натрия). Плазмиду, содержащую zalpha11-Fc4, разводили в пробирках на 15 мл до общего конечного объема 640 мл БС-средой. 35 мл
липофектамина™ (Gibco BRL) смешивали с 605 мл БС-среды. Эту смесь с липофектамином™ добавляли
к смеси ДНК и давали инкубироваться в течение приблизительно 30 мин при комнатной температуре. 5 мл
ВС-среды добавляли к смеси ДНК:липофектамин™. Клетки промывали 1 раз 5 мл БС-среды, отсасывали
и добавляли смесь ДНК:липофектамин™. Клетки инкубировали при 37°С в течение 5 ч, затем в каждую
чашку добавляли 6,4 мл среды DMEM/10% ФТС, 1% PSN. Чашки инкубировали при 37°С в течение ночи
и смесь ДНК:липофектамин™ заменяли свежей средой 5% ФТС/DMEM на следующий день. В день 2
после трансфекции клетки разделяли в селективную среду (среду DMEM/ФТС, описанную выше, с добавлением 1 мМ метотрексата (Sigma Chemical Co., St. Louis, МО)) в чашках 150 мм при разведении 1:10,
1:20 и 1:50. Среду на этих клетках заменяли свежей селективной средой в день 5 после трансфекции.
Приблизительно в день 10 после трансфекции две культуральные чашки 150 мм с устойчивыми к метотрексату колониями из каждой трансфекции трипсинизировали и клетки объединяли и высевали в колбу
Т-162 и переносили в крупномасштабную культуру.
Пример 11. Очистка растворимых рецепторов zalpha11 из клеток ВНК 570.
А. Очистка полипептида zalpha11CEE из ВНК 570.
Если нет других указаний, все операции проводили при 4°С. Следующую процедуру использовали
для очистки полипептида zalpha11, содержащего С-концевые метки Glu-Glu (ЕЕ). 30 л кондиционированной среды из клеточной фабрики концентрировали до 1,6 л при помощи спирального картриджа Amicon
S10Y3 на ProFlux A30. Раствор протеазного ингибитора добавляли к концентрированным 1,6 л кондиционированной среды клеточной фабрики от трансфицированных клеток ВНК 570 (см. пример 10) до конечных концентраций 2,5 мМ этилендиаминотетрауксусной кислоты (ЭДТА, Sigma Chemical Co. St. Louis,
МО), 0,003 мМ лейпептина (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN), 0,001 мМ пепстатина (Boehringer
Mannheim) и 0,4 мМ Pefabloc (Boehringer Mannheim). Пробы извлекали для анализа и общий объем замораживали при -80°С до начала очистки. Концентрации общего целевого белка концентрированной кондиционированной среды клеточной фабрики определяли при помощи электрофореза в ДСН-ПААГ и
Вестерн-блот-анализа с антителами против ЕЕ, конъюгированными с HRP (пероксидазой хрена).
100 мл субстрата для колонки анти-EE-G-Sepharose (приготовленной, как описано ниже) выливали
в стеклянную колонку Waters АР-5, 5 см х 10 см. Колонку упаковывали проточно и уравновешивали на
BioCad Sprint (PerSeptive BioSystems, Framingham, MA) забуференным фосфатом солевым раствором
(ЗФР) рН 7,4. Концентрированную кондиционированную среду клеточной фабрики оттаивали, стерильно
фильтровали с фильтром 0,2 мкм, рН доводили до 7,4, затем наносили на колонку в течение ночи со скоростью тока 1 мл/мин. Колонку промывали 10 колоночными объемами (КО) забуференного фосфатом
солевого раствора (ЗФР, рН 7,4), затем элюировали с подачей элюента через пробку 200 мл ЗФР (рН 6,0),
содержащего 0,5 мг/мл ЕЕ-пептида (Anaspec, San Jose, CA), при скорости тока 5 мл/мин. Используемый
ЕЕ-пептид имеет последовательность EYMPME (SEQ ID NO:41). Колонку промывали 10 колоночными
объемами (КО) ЗФР, затем элюировали 5 колоночными объемами 0,2 М глицина, рН 3,0. рН элюируемой
- 42 -
006501
глицином колонки доводили до 7,0 2 колоночными объемами 5Х ЗФР, затем уравновешивали в ЗФР (рН
7,4). Фракции по 5 мл собирали на протяжении всей элюционной хроматографии и поглощение при 280 и
215 нм подвергали мониторингу; проходящие через колонку и промывочные пулы также сохраняли и
анализировали. Фракции пика элюции ЕЕ-полипептида анализировали на целевой белок электрофорезом
в ДСН-ПААГ с окрашиванием серебром и Вестерн-блоттингом с конъюгированным антителом анти-EEHRP. Представляющие интерес фракции элюции полипептида объединяли и концентрировали с 60 мл до
5,0 мл с использованием центрифужного концентратора с мембраной, отсекающей молекулярную массу
10000 Да (Millipore, Bedford, MA), согласно инструкциям изготовителя.
Для отделения zalpha11CEE от других соочищающихся белков концентрированные слитые фракции
элюции полипептида подвергали очистке на POROS HQ-50 (сильной анионообменной колонке из PerSeptive
BioSystems, Framingham, MA) при рН 8,0. Колонку 1,0х6,0 см заливали и проточно упаковывали на BioCad
Sprint. Колонку загружали противоионом и затем уравновешивали в 20 мМ Трис рН 8,0 (Трис(гидроксиметиламинометан)). Пробу разводили 1:13 (для уменьшения ионной силы ЗФР), затем наносили на колонку POROS HQ при скорости тока 5 мл/мин. Колонку промывали 10 колоночными объемами (КО) 20 мМ
Трис рН 8,0, затем элюировали 40 колоночными объемами градиента 20 мМ Трис/1 М хлорид натрия
(NaCl) при скорости тока 10 мл/мин. Фракции по 1,5 мл собирали на протяжении всей хроматографии и
поглощение при 280 и 215 нм подвергали мониторингу. Фракции пика элюции анализировали электрофорезом в ДСН-ПААГ с окрашиванием серебром. Представляющие интерес фракции объединяли и концентрировали до 1,5-2 мл с использованием центрифужного концентратора с мембраной, отсекающей
молекулярную массу 10000 Да (Millipore, Bedford, MA), согласно инструкциям изготовителя.
Для отделения полипептида zalpha11CEE от свободного пептида ЕЕ и любых примесных соочищающихся белков объединенные концентрированные фракции подвергали хроматографии на колонке
1,5х90 см Sephadex S200 (Pharmacia, Piscataway, NJ), уравновешенной и загруженной в ЗФР при скорости
тока 1,0 мл/мин, при помощи BioCad Sprint. Фракции по 1,5 мл собирали на протяжении всей хроматографии и поглощение при 280 и 215 нм подвергали мониторингу. Фракции пика элюции характеризовали
при помощи электрофореза в ДСН-ПААГ с окрашиванием серебром и объединяли только наиболее чистые фракции. Этот материал представлял очищенный полипептид zalpha11CEE.
Этот очищенный материал подвергали наконец очистке на колонке 4 мл ActiClean Etox (Sterogene)
для удаления любых оставшихся эндотоксинов. Пробу пропускали через уравновешенную ЗФР колонку
под действием силы тяжести 4 раза, затем колонку промывали 1 раз 3 мл ЗФР и эту промывку объединяли с «очищенной» пробой. Затем этот материал стерильно фильтровали (0,2 мкм) и хранили при -80°С до
приготовления аликвот.
На Вестерн-блотированных, окрашенных Кумасси синим и серебром гелях электрофореза в ДСНПААГ полипептид zalpha11CEE был одной основной полосой со средней молекулярной массой 50000 Да.
Подвижность этой полосы была одинаковой на восстанавливающем и на невосстанавливающем гелях.
Концентрацию белка очищенного материала определяли согласно анализу БСА (Pierce, Rockford) и
белок делили на аликвоты и хранили при -80°С в соответствии с обычными процедурами авторов изобретения. На IEF-гелях (изоэлектрическое фокусирование) белок перемещался с PI менее 4,5. Концентрация полипептида zalpha11CEE была 1,0 мг/мл.
Очищенный полипептид zalpha11CEE готовили для инъекции в кроликов и отсылали в R & R Research
and Development (Stanwood, WA) для получения антител. Кроликов инъецировали для получения сыворотки против huzalpha-CEE-BHK (пример 15 ниже).
Для получения анти-ЕЕ-cефарозы объем слоя 100 мл протеин G-cефарозы (Pharmacia, Piscataway,
NJ) промывали 3 раза 100 мл ЗФР, содержащего 0,02% азида натрия, с использованием фильтрующего
элемента 0,45 мкм Nalgene на 500 мл. Гель промывали 6,0 объемами 200 мМ триэтаноламина, рН 8,2
(ТЭА, Sigma, St. Louis, МО) и добавляли равный объем раствора антител против ЕЕ, содержащего 900 мг
антитела. После инкубирования в течение ночи при 4°С несвязавшееся антитело удаляли промыванием
смолы 5 объемами 200 мМ ТЭА, как описано выше. Смолу ресуспендировали в 2 объемах ТЭА, переносили в подходящий резервуар и добавляли диметилпимилимидат-2НСl (Pierce, Rockford, IL), растворенный в ТЭА, до конечной концентрации 36 мг/мл protein G-Sepharose-геля. Гель качали при комнатной
температуре в течение 45 мин и жидкость удаляли при помощи фильтрующего элемента, как описано
выше. Затем неспецифические сайты на этом геле блокировали инкубированием в течение 10 мин при
комнатной температуре с 5 объемами 20 мМ этаноламина в 200 мМ ТЭА. Затем гель промывали 5 объемами ЗФР, содержащего 0,02% азида натрия, и хранили в этом растворе при 4°С.
В. Очистка полипептида zalpha11CFLAG из ВНК 570.
Если нет других указаний, все операции проводили при 4°С. Следующую процедуру использовали
для очистки полипептида zalpha11, содержащего С-концевые метки FLAG® (FLG) (Sigma-Aldrich Co.). 30 л
кондиционированной среды из клеточной фабрики концентрировали до 1,7 л при помощи спирального
картриджа Amicon S10Y3 на ProFlux A30. Раствор протеазного ингибитора добавляли к концентрированным 1,7 л кондиционированной среды клеточной фабрики от трансфицированных клеток ВНК 570
(см. пример 10) до конечных концентраций 2,5 мМ этилендиаминотетрауксусной кислоты (ЭДТА, Sigma
Chemical Co. St. Louis, МО), 0,003 мМ лейпептина (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN), 0,001 мМ пеп- 43 -
006501
статина (Boehringer Mannheim) и 0,4 мМ Pefabloc (Boehringer Mannheim). Пробы брали для анализа и общий объем замораживали при -80°С до начала очистки. Концентрации общего целевого белка кондиционированной среды клеточной фабрики определяли при помощи электрофореза в ДСН-ПААГ и Вестернблот-анализа с антителами против FLAG® (Kodak), конъюгированными с HRP (пероксидазой хрена). Колонку 125 мл анти-FLAG® М2-агарозного аффинного геля (SIGMA-Aldrich Co.) выливали в стеклянную
колонку Waters АР-5, 5 см х 10 см. Колонку упаковывали проточно и уравновешивали на BioCad Sprint
(PerSeptive BioSystems, Framingham, MA) забуференным фосфатом солевым раствором (ЗФР) рН 7,4.
Концентрированную кондиционированную среду клеточной фабрики оттаивали, стерильно фильтровали
с фильтром 0,2 мкм, рН доводили до 7,4, затем наносили на колонку в течение ночи со скоростью тока
1 мл/мин. Колонку промывали 10 колоночными объемами (КО) зафуференного фосфатом солевого раствора (ЗФР, рН 7,4), затем элюировали с подачей элюента через пробку 250 мл ЗФР (рН 6,0), содержащего 0,5 мг/мл FLAG® (Sigma-Aldrich Co.) пептида, при скорости тока 5 мл/мин. Используемый FLAG®пептид имеет последовательность DYKDDDDK (SEQ ID NO:49). Колонку промывали 10 колоночными
объемами (КО) ЗФР, затем элюировали 5 колоночными объемами 0,2 М глицина, рН 3,0. рН элюируемой
глицином колонки доводили до 7,0 2 колоночными объемами 5Х ЗФР, затем уравновешивали в ЗФР (рН
7,4). Фракции по 5 мл собирали на протяжении всей элюционной хроматографии и поглощение при 280 и
215 нм подвергали мониторингу; проходящие через колонку и промывочные пулы также сохраняли и
анализировали. Фракции пика элюции FLАG®-полипептида анализировали на целевой белок электрофорезом в ДСН-ПААГ с окрашиванием серебром и Вестерн-блоттингом с конъюгированным антителом
анти-FLAG®-НRР. Представляющие интерес фракции элюции полипептида объединяли и концентрировали с 80 до 12 мл с использованием центрифужного концентратора с мембраной, отсекающей молекулярную массу 10000 Да (Millipore, Bedford, MA), согласно инструкциям изготовителя.
Для отделения zalpha11CFLG от других соочищающихся белков слитые фракции элюции полипептида подвергали очистке на POROS HQ-50 (сильной анионообменной колонке из PerSeptive BioSystems,
Framingham, MA) при рН 8,0. Колонку 1,0х6,0 см заливали и проточно упаковывали на BioCad Sprint.
Колонку загружали противоионом и затем уравновешивали в 20 мМ Трис рН 8,0 (Трис(гидроксиметиламинометан)). Пробу разводили 1:13 (для уменьшения ионной силы ЗФР), затем наносили на колонку
POROS HQ-50 при скорости тока 5 мл/мин. Колонку промывали 10 колоночными объемами (КО) 20 мМ
Трис рН 8,0, затем элюировали 40 колоночными объемами градиента 20 мМ Трис/1 М хлорид натрия
(NaCl) при скорости тока 10 мл/мин. Фракции по 1,5 мл собирали на протяжении всей хроматографии и
поглощение при 280 и 215 нм подвергали мониторингу. Фракции пика элюции анализировали электрофорезом в ДСН-ПААГ с окрашиванием серебром. Представляющие интерес фракции объединяли и концентрировали до 1,5-2 мл с использованием центрифужного концентратора с мембраной, отсекающей
молекулярную массу 10000 Да (Millipore, Bedford, MA), согласно инструкциям изготовителя.
Для отделения полипептида zalpha11CFLG от свободного пептида FLAG® и любых примесных соочищающихся белков объединенные концентрированные фракции подвергали хроматографии на колонке 1,5х90 см Sephacrye S200 (Pharmacia, Piscataway, NJ), уравновешенной и загруженной в ЗФР при скорости тока 1,0 мл/мин при помощи BioCad Sprint. Фракции по 1,5 мл собирали на протяжении всей хроматографии и поглощение при 280 и 215 нм подвергали мониторингу. Фракции пика элюции характеризовали при помощи электрофореза в ДСН-ПААГ с окрашиванием серебром и объединяли только наиболее чистые фракции. Этот материал представлял очищенный полипептид zalpha11CFLG.
Этот очищенный материал подвергали, наконец, очистке на колонке 4 мл ActiClean Etox (Sterogene)
для удаления любых оставшихся эндотоксинов. Пробу пропускали через уравновешенную ЗФР колонку
под действием силы тяжести 4 раза, затем колонку промывали 1 раз 3 мл ЗФР и эту промывку объединяли с «очищенной» пробой. Затем этот материал стерильно фильтровали (0,2 мкм) и хранили при -80°С до
приготовления аликвот.
На Вестерн-блотированных, окрашенных Кумасси синим и серебром гелях электрофореза в ДСНПААГ полипептид zalpha11CFLG был одной основной полосой со средней молекулярной массой 50000 Да.
Подвижность этой полосы была одинаковой на восстанавливающем и на невосстанавливающем гелях.
Концентрацию белка очищенного материала определяли согласно анализу БСА (Pierce, Rockford,
IL) и белок делили на аликвоты и хранили при -80°С в соответствии с обычными процедурами авторов
изобретения. На IEF-гелях (изоэлектрическое фокусирование) белок перемещался с PI менее 4,5. Концентрация полипептида zalpha11CFLG была 1,2 мг/мл.
С. Очистка полипептида zalpha11-Fc4 из трансфицированных клеток ВНК 570.
Если нет других указаний, все операции проводили при 4°С. Следующую процедуру использовали
для очистки полипептида zalpha11, содержащего С-концевое слияние с IgG/Fc человека (zalpha11-Fc4;
примеры 8 и 9). 12000 мл кондиционированной среды от клеток ВНК 570, трансфицированных zalpha11Fc4 (пример 10), фильтровали через стерилизующий фильтр 0,2 мм и затем дополняли раствором протеазных ингибиторов, до конечных концентраций 0,001 мМ лейпептина (Boehringer Mannheim, Indianapolis,
IN), 0,001 мМ пепстатина (Boehringer Mannheim) и 0,4 мМ Pefabloc (Boehringer Mannheim). Протеин Gcефарозу (объем слоя 6 мл, Pharmacia Biotech) упаковывали и промывали 500 мл ЗФР (Gibco BRL). Дополненную кондиционированную среду пропускали через колонку при скорости тока 10 мл/мин с после- 44 -
006501
дующим промыванием 1000 мл ЗФР (BRL/Gibco). Полипептид zalpha11-Fc4 элюировали из колонки 0,1 М
глицином рН 3,5 и фракции по 2 мл собирали непосредственно в 0,2 мл 2 М Триса рН 8,0 для доведения
конечного рН до 7,0 в этих фракциях.
Элюированные фракции характеризовали при помощи электрофореза в ДСН-ПААГ и Вестернблоттинга с антителами против Fc человека (Amersham). Вестерн-блот-анализ гелей восстанавливающего
электрофореза в ДСН-ПААГ выявил иммунореактивный белок 80000 кДа во фракциях 2-10. Окрашенные серебром гели электрофореза в ДСН-ПААГ также выявили полипептид zalpha11-Fc4 80000 кДа во
фракциях 2-10. Фракции 2-10 объединяли.
Концентрацию белка объединенных фракций определяли согласно анализу БСА (Pierce, Rockford,
IL) и материал делили на аликвоты и хранили при -80°С в соответствии с обычными процедурами заявителей. Концентрация белка объединенных фракций была 0,26 мг/мл.
Пример 12. Тест с использованием растворимых рецепторов zalpha11CEE, zalpha11CFLG и (мутантного) растворимого рецептора zalpha11-Fc-4 в конкурентном ингибиторном анализе.
Клетки BaF3/zalpha11 откручивали и промывали в не содержащей mIL-3 среде. Клетки откручивали
и промывали 3 раза для гарантии удаления mIL-3. Затем клетки считали в гемоцитометре. Клетки высевали в 96-луночный планшет при 5000 клеток на лунку в объеме 100 мкл на лунку с использованием не
содержащей mIL-3 среды.
Как среду от активации клеток селезенки обезьяны, так и CD3+ отобранные клетки, описанные в
примере 8 выше, добавляли в отдельных экспериментах при концентрациях 50, 25, 12,5%, 6,25, 3,125,
1,5, 0,75 и 0,375%, с растворимыми рецепторами zalpha11 или без них (конструкциями СЕЕ, C-FLAG и
Fc4; см. пример 10 и 11) при 10 мкг/мл. Общий объем теста был 200 мл.
Тест-планшеты инкубировали при 37°С, 5% СO2 в течение 3 дней, после чего добавляли Alamar
Blue (Accumed) при 20 мкл на лунку. Планшеты опять инкубировали при 37°С, 5% СO2 в течение 24 ч.
Планшеты считывали на планшет-ридере Fmax™ (Molecular Devices), как описано выше (пример 5). Результаты продемонстрировали полное ингибирование клеточного роста каждой из различных конструкций растворимых рецепторов zalpha11 при 10 мкг/мл, подтверждая, что этот фактор в каждой пробе был
специфическим для рецептора zalpha11.
Кривые титрования с разведениями этих растворимых рецепторов также определяли с использованием описанного выше теста. Как zalpha11CEE, так и zalpha11CFLG, растворимые рецепторы zalpha11,
были способны полностью ингибировать рост при такой низкой концентрации, как 20 нг/мл. Мутантный
растворимый рецептор zalpha11-Fc4 был эффективным только при 1,5 мкг/мл.
Пример 13. Экспрессия zalpha11 человека в Е. coli.
А. Конструирование экспрессирующего вектора pCZR225, который экспрессирует слитый полипептид huzalpha11/MBP-6Н.
Экспрессионную плазмиду, содержащую полинуклеотид, кодирующий растворимый рецептор
zalpha11 человека, слитый на С-конце с мальтозусвязывающим белком (МБР), конструировали гомологичной рекомбинацией. Полинуклеотидная последовательность для слитого полипептида растворимого
рецептора MBP-zalpha11 показана в SEQ ID NO:50 с соответствующей белковой последовательностью,
показанной в SEQ ID NO:51. Слитый полипептид, названный huzalpha11/MBP-6Н, в примере 14 содержит МБР-часть (аминокислоты 1 (Met)-388 (Ser) SEQ ID NO:51), слитую с растворимым рецептором
zalpha11 человека (аминокислоты 389 (Cys)-606 (His) SEQ ID NO:51). Фрагмент кДНК zalpha11 человека
(SEQ ID NO:52) выделяли с использованием ПЦР. Два праймера использовали в получении фрагмента
zalpha11 человека в ПЦР-реакции: (1) праймер ZC20187 (SEQ ID NO:53), содержащий 40 п.н. векторной
фланкирующей последовательности и 25 п.н., соответствующих амино-концу zalpha11 человека, и (2)
праймер ZC20185 (SEQ ID NO:54), содержащий 40 п.н. 3'-конца, соответствующих фланкирующей векторной последовательности, и 25 п.н., соответствующих карбоксил-концу zalpha11 человека. Условия
ПЦР-реакции были следующими: 25 циклов 94°С в течение 30 с, 50°С в течение 30 с и 72°С в течение 1 мин,
с последующим пропитыванием при 4°С, реакции проводили в двух повторностях. 2 мкл из 100 мкл
ПЦР-реакции подвергали электрофорезу на 1,0% агарозном геле с 1 х ТВЕ-буфером для анализа и наблюдали ожидаемый фрагмент приблизительно 660 п.н. Оставшиеся 90 мкл ПЦР-реакции объединяли со
второй ПЦР-пробиркой, осаждали 400 мкл абсолютного этанола. Осажденную ДНК использовали для
рекомбинации в разрезанный Sma1 реципиентный вектор рТАР98 для получения конструкции, кодирующей слитый полипептид MBP-zalpha11, как описано ниже.
Плазмиду рТАР98 получали из плазмид pRS316 и pMAL-c2. Плазмида pRS316 является челночным
вектором Saccharomyces cerevisiae (Hieter P. and Sikorski, R., Genetics 122:19-27, 1989). pMAL-c2 (NEB)
является экспрессионной плазмидой Е. coli. Она несет промотор tac, запускающий МаlЕ (ген, кодирующий
МВР), за которым следуют His-метка, сайт расщепления тромбина, клонирующий сайт и терминатор
rrnB. Вектор рТАР98 конструировали с использованием гомологичной рекомбинации дрожжей. 100 нг
разрезанной EcoRI pMAL-c2 рекомбинировали с 1 мкг разрезанной PvuI pRS316, 1 мкг линкера и 1 мкг
разрезанной ScaI/EcoRI pRS316. Линкер состоял из олигонуклеотидов ZC19372 (SEQ ID NO:55) (100
пмоль):ZC19351 (SEQ ID NO:56) (1 пмоль):ZC19352 (SEQ ID NO:57) (1 пмоль) и ZC19371 (SEQ ID
NO:58) (100 пмоль), объединенных в ПЦР-реакции. Условия ПЦР-реакции были следующими: 10 циклов
- 45 -
006501
94°С в течение 30 с, 50°С в течение 30 с и 72°С в течение 30 с; затем пропитывание при 4°С. ПЦРпродукты концентрировали осаждением 100% этанолом.
100 мкл компетентных дрожжевых клеток (S. cerevisiae) объединяли с 10 мкл, содержащими приблизительно 1 мкг ПЦР-продукта рецептора zalpha11 человека, описанного выше, и 100 нг расщепленного SmaI вектора рТАР98 и переносили в кювету для электропорации 0,2 см. Смесь дрожжи/ДНК подвергали электрошокам при 0,75 кВ (5 кВ/см), «неопределенным» числом Ом, 25 мкФ. В каждую кювету добавляли 600 мкл 1,2 М сорбита и дрожжи высевали в двух аликвотах по 300 мкл на две чашки URA-D и
инкубировали при 30°С.
Спустя приблизительно 48 ч Ura+ дрожжевые трансформанты из отдельной чашки ресуспендировали в 1 мл Н2O и откручивали быстро для осаждения дрожжевых клеток. Клеточный осадок ресуспендировали в 1 мл лизисного буфера (2% тритон Х-100, 1% ДСН, 100 MM NaCl, 10 мМ Трис, рН 8,0, 1 мМ
ЭДТА). 500 мкл лизисной смеси добавляли в пробирку Эппендорфа, содержащую 300 мкл промытых
кислотой стеклянных гранул и 200 мкл смеси фенол/хлороформ, встряхивали на вортексе 2 или 3 раза с
интервалами 1 мин с последующим 5-минутным откручиванием в центрифуге Эппендорфа при максимальной скорости. 30 мкл водной фазы переносили в свежую пробирку и ДНК осаждали 600 мкл этанола
(EtOH) с последующим центрифугированием в течение 10 мин при 4°С. Осадок ДНК ресуспендировали в
100 мкл Н2O.
Трансформацию электрокомпетентных клеток Е. coli (МС1061, Casadaban et al., J. Mol. Biol. 138,
179-207) проводили с 1 мкл преп-дрожжевой ДНК и 40 мкл клеток МС1061. Клетки подвергали электроимпульсам при 2,0 кВ, 25 мФ и 400 Ом. После электропорации 0,6 мл SOC (2% бакто™-триптон (Difco,
Detroit, MI), 0,5% дрожжевой экстракт (Difco), 10 мМ NaCl, 2,5 MM KCl, 10 мМ MgCl2, 10 мМ MgSO4, 20 мМ
глюкоза) высевали в виде одной аликвоты на чашки с ММ/СА+АМР 100 мг/л (Pryor and Leiting, Protein
Expression and Purification 10:309-319, 1997).
Клетки, несущие правильную экспрессионную конструкцию для рецептора zalpha11 человека,
идентифицировали по экспрессии. Клетки выращивали в ММ/СА с 100 мкг/мл ампициллина в течение 2
ч при встряхивании при 37°С. 1 мл культуры индуцировали 1 мМ IPTG. Спустя 2-4 ч 250 мкл каждой
культуры смешивали с 250 мкл промытых кислотой стеклянных гранул и 250 мкл буфера Торнера с 5%
βМЭ и красителем (8 М мочевина, 100 мМ Трис рН 7,0, 10% глицерин, 2 мМ ЭДТА, 5% ДСН). Пробы
встряхивали на вортексе в течение 1 мин и нагревали до 65°С в течение 10 мин. 20 мкл наносили на дорожку на 4-12% ПААГ для электрофореза (NOVEX). Разделение на гелях происходило в буфере 1xMES.
Положительные клоны были названы pCZR225, и их подвергали секвенированию. Полинуклеотидная
последовательность слитого белка МВР-zalpha11 показана в SEQ ID NO:50.
В. Бактериальная экспрессия слитого полипептида huzalpha11/MBP-6H.
1 мкл ДНК секвенирования использовали для трансформации штамма BL21. Клетки подвергали
электроимпульсам при 2,0 кВ, 25 мкФ и 400 Ом. После электропорации добавляли 0,6 мл ММ/СА со
100 мг/л ампициллина.
Клетки выращивали в ММ/СА с 100 мкг/мл ампициллина в течение 2 ч при встряхивании при 37°С.
1 мл культуры индуцировали 1 мМ IPTG. Спустя 2-4 ч 250 мкл каждой культуры смешивали с 250 мкл
промытых кислотой стеклянных гранул и 250 мкл буфера Торнера с 5% βМЭ и красителем (8 М мочевина, 100 мМ Трис рН 7,0, 10% глицерин, 2 мМ ЭДТА, 5% ДСН). Пробы встряхивали на вортексе в течение
1 мин и нагревали до 65°С в течение 10 мин. 20 мкл наносили на дорожку на 4-12% ПААГ для электрофореза (NOVEX). Разделение на гелях происходило в буфере 1xMES. Положительные клоны были использованы для выращивания для очистки слитого белка huzalpha11/MBP-6Н (пример 14 ниже).
Пример 14. Очистка растворимого рецептора huzalpha11/MBP-6Н из ферментации Е. coli.
Если нет других указаний, все операции проводили при 4°С. Следующую процедуру использовали
для очистки растворимого рецепторного полипептида huzalpha11/MBP-6Н. Клетки Е. coli, содержащие
конструкцию pCZR225 и экспрессирующие растворимый рецептор huzalpha11/MBP-6Н (пример 13), выращивали в cупербульоне II (12 г/л казеина, 24 г/л дрожжевого экстракта, 11,4 г/л дикалий-фосфата, 1,7 г/л
монокалий-фосфата; Becton Dickenson, Cockeysville, MD) и замораживали в 0,5% глицерине. 20 г замороженных клеток в cупербульоне II + глицерин использовали для очистки белка. Замороженные клетки
оттаивали и разводили 1:10 в растворе протеазного ингибитора (буфера для экстракции) перед лизисом
этих клеток и высвобождением растворимого рецепторного белка huzalpha11/MBP-6Н. Разведенные
клетки содержали конечные концентрации 20 мМ Трис (JT Baker, Philipsburg, NJ), 100 мМ хлорид натрия
(NaCl, Mallinkrodt, Paris, KY), 0,5 мМ фенилметилсульфонилфторид (PMSF, Sigma Chemical Co., St. Louis,
МО), 2 мкг/мл лейпептина (Fluka, Switzerland) и 2 мкг/мл апротинина (Sigma). Систему разрушения клеток French Press (Constant Systems Ltd., Warwick, UK) с температурой от -7 до -10°С и 30 кф/кв.дюйм использовали для лизиса клеток. Разведенные клетки проверяли на разрушение считываниями А600 до и
после French Press. Лизированные клетки центрифугировали при 18000 g в течение 45 мин для удаления
дебриса разрушенных клеток и супернатант использовали для очистки белка. Концентрации общего белка супернатанта определяли по БСА-способу (Pierce, Rockford, IL) согласно инструкциям изготовителя.
- 46 -
006501
Субстрат колонки (25 мл) Talon Metall Affinity (Clontech, Palo Alto, CA) (приготовленный, как описано ниже) выливали в стеклянную колонку Bio-Rad, 2,5 см диаметр х 10 см высота. Колонку упаковывали и уравновешивали под действием силы тяжести 10 колоночными объемами (КО) буфера для уравновешивания Talon (20 мМ Трис, 100 мМ NaCl, pH 8,0). Супернатант периодически наносили на аффинную смолу Talon Metall Affinity resin и качали в течение ночи. Смолу выливали обратно в колонку и промывали 10 колоночными объемами буфера для уравновешивания Talon под действием силы тяжести,
затем проводили элюцию под действием силы тяжести 140 мл буфера для элюции (буфер для уравновешивания Talon + 200 мМ имидазол, Fluka Chemical). Talon-колонку очищали 5 колоночными объемами
20 мМ 2-(N-морфолино)этансульфоновой кислоты рН 5,0 (MES, Sigma), 5 колоночными объемами дистиллированной H2O, затем хранили в смеси 20% этанол/0,1% азид натрия. Фракции по 14 мл собирали на
протяжении всей элюционной хроматографии и фракции считывали по поглощению при 280 и 320 нм и
белок определяли по БСА-способу; проходящий через колонку и промывочный пулы также сохраняли и
анализировали. Фракции элюции представляющего интерес белка объединяли и наносили сразу на
aмилозную смолу (New England Biolabs, Beverly, MA).
Для получения более чистого полипептида huzalpha11/MBP-6Н объединенные фракции элюции с
Talon-аффинной колонки подвергали хроматографии на aмилозной смоле (22 мл) при рН 7,4. Колонку
Bio-Rad с диаметром 2,5 см и высотой 10 см заливали, упаковывали и уравновешивали в 10 колоночных
объемах aмилозного буфера для уравновешивания 20 мМ Трис (JT Baker), 100 мМ NaCl (Mallinkrodt), 1 мМ
ПМСФ (Sigma), 10 мМ бета-меркаптоэтанол (ВМЕ, ICN Biomedicals Inc., Aurora, ОН) рН 7,4. Пробу наносили под действием силы тяжести при скорости тока 0,5 мл/мин. Колонку промывали 10 колоночными
объемами aмилозного буфера для уравновешивания, затем элюировали ~2 колоночными объемами смеси
aмилозный буфер для уравновешивания + 10 мМ мальтоза (Fluka, Biochemical Switzerland) под действием
силы тяжести. Фракции по 5 мл собирали на протяжении всей хроматографии и измеряли поглощение
при 280 и 320 нм. Амилозную колонку регенерировали 1 колоночным объемом дистиллированной H2O,
5 колоночными объемами 0,1% (мас./об.) ДСН (Sigma), 5 колоночными объемами дистиллированной
Н2O и затем 5 колоночными объемами aмилозного буфера для уравновешивания.
Представляющие интерес фракции объединяли и диализовали в Slide-A-Lyzer (Pierce) с 4х4л ЗФР
рН 7,4 (Sigma) для удаления низкомолекулярных примесей, смены буфера и обессоливания. После замен
ЗФР собранный материал представлял собой очищенный полипептид huzalpha11/MBP-6Н. Очищенный
полипептид huzalpha11/MBP-6Н анализировали электрофорезом на ДСН-ПААГ с окрашиванием Кумасси и Вестерн-блот-анализом с антикроличьим антителом, конъюгированным с пероксидазой хрена (HRP)
(Rockland, Gilbertsville, PA). Концентрация полипептида huzalpha11/MBP-6Н была 1,92 мг/мл, как определено БСА-анализом.
Очищенный полипептид huzalpha11/MBP-6Н готовили для инъекции в кроликов и отсылали в R & R
Research and Development (Stanwood, WA) для получения антител. Кроликов инъецировали для получения антисыворотки против huzalpha11/MBP-6Н (пример 15 ниже).
Пример 15. Поликлональные антитела к zalpha11.
Поликлональные антитела получали иммунизацией двух самок новозеландских белых кроликов
очищенным полипептидом huzalpha11/MBP-6Н (пример 14) или очищенным рекомбинантным растворимым рецептором zalpha11CEE (пример 11А). Соответствующие поликлональные антитела были названы
кроличье антитело анти-huzаlрhа11/МВР-6Н и кроличье антитело анти-huzalpha11-CEE-BHK, соответственно. Каждый кролик получал исходную внутрибрюшинную инъекцию (IP) 200 мг очищенного белка в
полном адъюванте Фрейнда (Pierce, Rockford, IL) с последующими бустерными инъекциями IP 100 мг
очищенного белка в неполном адъюванте Фрейнда каждые 3 недели. Спустя 7-10 недель после введения
третьей бустерной инъекции производили кровоизвлечение у животных и собирали сыворотку. Затем
кроликам продолжали вводить бустер-инъекции и брали кровь каждые 3 недели.
Zalpha11-специфические поликлональные антитела очищали аффинно из сывороток кроликов с использованием колонки CNBr-SEPHAROSE 4В protein (Pharmacia LKB), которую готовили с использованием 10 мг очищенного полипептида huzalpha11/MBP-6Н (пример 14) на грамм CNBr-SEPHAROSE с
последующим 20Х диализом в ЗФР в течение ночи. Zalpha11-специфические антитела характеризовали
проверкой титра при помощи ELISA с применением 1 мг/мл подходящего белкового антигена в качестве
мишени антител. Нижним порогом детектирования (LLD) кроличьего аффинно очищенного антитела
анти-huzаlрhа11/МВР-6Н является разведение 500 пг/мл. LLD кроличьего аффинно очищенного антитела
анти-huzalpha11-CEE-BHK является разведение 50 пг/мл.
Пример 16. Идентификация клеток, экспрессирующих zalpha11-рецептор, при помощи ОТ-ПЦР.
Специфические типы клеток человека выделяли и подвергали скринингу на экспрессию zalpha11
при помощи ОТ-ПЦР. В-клетки выделяли из свежих миндалин человека механическим разрушением через найлоновые клеточные деформаторы (100 мкм) (Falcon™; Bection Dickenson, Franklin Zakes, NJ). Вклеточные суспензии обогащали CD19+ В-клетками положительным отбором с магнитной колонкой
VarioMACS VS+ и CD19 микрогранулами (Miltenyi Biotec, Auburn, СА) согласно инструкциям изготовителя. Т-клетки и моноциты выделяли из прикрепленных проб крови человека. CD3+ Т-клетки очищали
положительным отбором с использованием CD3 микрогранул VarioMACS, а моноциты очищали при
- 47 -
006501
помощи колонок отрицательного отбора VarioMACS (Miltenyi) согласно инструкциям изготовителя.
Пробы из каждой популяции окрашивали и анализировали клеточным сортингом с возбуждением флуоресценции (FACS) (Bection Dickinson, San Jose, CA) для определения процента обогащения и полученных
выходов. CD19+ В-клетки имели чистоту приблизительно 96%, CD3+ Т-клетки имели чистоту приблизительно 95%, и моноциты имели чистоту приблизительно 96%.
РНК получали при помощи стандартного в данной области способа из всех трех типов, которые
были либо покоящимися, либо активированными. РНК выделяли из покоящихся клеток непосредственно
из описанных выше колоночных препаратов. CD19+ и CD3+ клетки активировали культивированием при
500000 клеток/мл в среде RPMI + 10% ФТС, содержащей ФМА 5 нг/мл (Calbiochem, La Jolla, CA) и иономицин 0,5 мкг/мл (Calbiochem), в течение 4 и 24 ч. Моноциты активировали культивированием в RPMI
+ 10% ФТС, содержащей LPS 10 нг/мл (Sigma St. Louis МО) и rhIFN-γg 10 нг/мл (R & D, Minneapolis,
MN), в течение 24 ч. Клетки собирали и промывали в ЗФР. РНК получали из клеточных осадков с использованием набора RNeasy Midiprep™ (Qiagen, Valencia, CA) согласно инструкциям изготовителя и
синтез первой цепи кДНК выполняли с набором Superscript II™ (Gibco BRL, Grand Island, NY) согласно
инструкциям изготовителя.
Олигонуклеотиды ZC19907 (SEQ ID NO:20) и ZC19908 (SEQ ID NO:21) использовали в ПЦР-реакции для скрининга вышеописанных проб на фрагмент 1,2 т.п.н., соответствующий zalpha11-сигналу.
ПЦР-амплификацию проводили с полимеразой Taq (BRL Grand Island NY) и следующими условиями: 35 циклов 95°С в течение 1 мин, 60°С в течение 1 мин, 72°С в течение 30 с; 1 цикл при 72°С в течение 10 мин и
пропитывание при 4°С. 10 мкл каждого реакционного объема 50 мкл подвергали электрофорезу на 2%
агарозном геле 1ХТАЕ для идентификации полученных продуктов. ПЦР-продукты оценивали как (-) отсутствие продукта, (+) видимая полоса, (++) увеличенное присутствие полосы и (+++) наиболее преобладающая полоса, результаты показаны в табл. 5 ниже.
Таблица 5
Источник кДНК
Активация
ПЦР-продукт
0 ч покоящиеся
+
CD19+ клетки
4 ч активированные
++
24 ч активированные
+++
0 ч покоящиеся
CD3+ клетки
4 ч активированные
++
24 ч активированные
0 ч покоящиеся
Моноциты
24 ч активированные
Эти результаты показывают, что zalpha11-сигнал присутствует в покоящихся CD19+ В-клетках и увеличивается митогенной активацией. Он, по-видимому, экспрессируется CD3+ Т-клетками человека только
после 4 ч активации. Нет видимого сигнала ни в покоящихся, ни в активированных моноцитах человека.
Пример 17. Иммуногистохимия zalpha11.
А. Препараты клеток и тканей.
Положительные контрольные ткани состояли из клеток BaF3, трансфицированных zalpha11 (пример
7) и лимфоидных тканей, которые, как известно, экспрессируют zalpha11, в том числе лимфатического
узла, селезенки и тимуса мышей, полученных из HSD (Harlan Sprague Dawley, Indianapolis, IN), лимфатического узла и селезенки обезьян, полученных из Регионального Центра исследований приматов (University
of Washington, Seattle, WA), лимфатического узла и селезенки человека, полученных из CHTN (Cleveland,
ОН). Отрицательные контроли, проводимые на каждой из проб ткани, включали (1) нетрансфицированные
клетки BaF3, (2) печень и мозг мышей и человека, которые, как известно, не экспрессируют zalpha11,
(3) окрашивание буфером для разведения антител (Ventann Bioteck Systems, Tucson AZ) в отсутствие
первичного антитела и (4) использование растворимого белка zalpha11 в конкурентных экспериментах.
Испытывали пробы других клеток. Тестировали как нестимулированные, так и стимулированные
клетки HL60. Клетки HL60 являются промиелоцитарной клеточной линией, которая может быть дифференцирована в миелоидную или гранулоцитарную линию дифференцировки различными реагентами.
Стимулированные пробы HL60 готовили следующим образом: клетки HL60 обрабатывали 10 нг/мл форбол-миристат-ацетата (ФМА) (Sigma, St. Louis, МО) в течение 48 ч для дифференцировки в клетки моноцитарной линии; и (2) клетки HL60 обрабатывали 1,25% ДМСО (Sigma) в течение 4 дней для дифференцировки в нейтрофилподобные клетки. Кроме того, исследовали полиморфонуклеарные (PMN) клетки
человека, гранулоциты человека, лимфоциты периферической крови человека (PBL) и моноциты человека из свежей крови человека (полученные в лаборатории с использованием рутинных способов в данной
области). Эти клетки и ткани, описанные выше, фиксировали в течение ночи в 10% NBF (Surgipath,
Richmond, IL) и заделывали в parapalst X-tra (Oxford Scientific, St. Louis, МО) и делали срезы 5 мкм на
микротоме Reichart-Jung 2050 (Leica Instruments GmbH, Nussloch, Germany).
- 48 -
006501
В. Иммуногистохимия.
Тканевые микроскопические препараты депарафинизировали, гидратировали в буфере (воде) и
подвергали паровой обработке HIER в буфере Antigen Retrieval Citra buffer (BioGenex, San Roman, CA) в
течение 20 мин. 5% нормальную козью сыворотку (Vector, Burlingame, CA) использовали для блокирования неспецифического связывания в течение 10 мин. Иммуноцитохимические анализы-скрининги проводили с использованием поликлональных антител к растворимому рецепторному белку zalpha11 (кроличье антитело анти-huzalpha11/MBP-6Н и кроличье антитело анти-huzalpha11-CEE-ВНК, см. пример 15)
в качестве первичных антител, при разведениях 1:200 и 1:400, соответственно. Конъюгированные с биотином козьи антитела против кроличьего IgG (Vector, Cat. NO. BA-1000, 1,5 мг/мл) использовали в качестве вторичного антитела при разведении 1:200. В отдельных пробах конкуренцию белков проводили с
использованием добавления растворимого рецепторного белка zalpha11CEE (в 10-кратном избытке)
(пример 11А) к первичному антителу для предблокирования иммунной реакции первичных антител. Эту
конкуренцию использовали в качестве контроля на специфичность кроличьих поликлональных антител в
отношении zalpha11. Детектирование проводили на приборе Ventana ChemMate 500 с использованием набора ChemMate DAB kit (меченый стрептавидином-биотином набор с применением конъюгата стрептавидин-пероксидаза хрена и DAB-субстрата) согласно инструкциям изготовителя и с использованием контрастного красителя гематоксилина изготовителя в течение 30 с (Ventana Bioteck Systems, Tucson, AZ).
Высокую экспрессию zalpha11 наблюдали в ФМА-активированных клетках. Низкий уровень экспрессии наблюдали в PBL и клетках HL60 без стимуляции. Субпопуляция клеток в селезенке, тимусе и
лимфатическом узле мыши обнаружила положительное окрашивание. Лимфатический узел и селезенка
как человека, так и обезьяны и клетки HL60 со стимуляцией ДМСО обнаружили минимальное окрашивание или вообще не обнаружили окрашивания. Сигнал, наблюдаемый в этих клетках и тканях, большей
частью устранялся в результате конкуренции при использовании избытка растворимого рецепторного
белка zalpha11. Отрицательные контрольные ткани мозга и печени не обнаружили окрашивания.
Пример 18. Идентификация мононуклеарных клеток периферической крови (PBMNC), которые
экспрессируют рецептор zalpha11, с использованием поликлональных кроличьих антисывороток к растворимому рецептору zalpha11.
200 мл свежей гепаринизированной крови получали из нормального донора. Кровь разводили 1:1 в
ЗФР и разделяли в градиенте Ficoll-Paque PLUS (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) и лимфоциты собирали на границе раздела. Клетки промывали 2Х в ЗФР и ресуспендировали в RPMI + 5% ФТС при концентрации 2х 106 клеток/мл.
Для определения, действует ли на экспрессию рецептора zalpha11 активированное состояние лимфоцитов, т.е. между покоящимися или активированными клетками, использовали несколько состояний
стимуляции: 1) нестимулированные, т.е. только среда (среда RPMI + 5% ФТС); 2) стимулированные
ФМА 10 нг/мл + иономицин 0,5 мкг/мл (оба из (Calbiochem)); и 3) активация ФГА (фитогемагглютининР, Difco/VWR). Клетки инкубировали при 37°С в течение 17 ч, затем собирали для окрашивания для детектирования рецептора zalpha11.
Использовали протокол непрямого окрашивания. Вкратце, лимфоциты человека суспендировали в
буфере для окрашивания (ЗФР + 0,02% NaN3 + БСА 1%, сыворотка здорового человека 2%) и высевали
при 2х105 клеток в 50 мкл на лунку в 96-луночном микротитрационном планшете. Антитела к растворимому рецептору zalpha11 СЕЕ (пример 15) использовали для определения, окрашиваются ли они вместе с
В-клеточным (CD-19), Т-клеточным (CD-3) или моноцитарным (CD-14) маркером на выделенных лимфоцитах человека. Кроличьи поликлональные сыворотки к растворимому рецептору zalpha11 (кроличьи
анти-huzalpha11-СЕЕ-ВНК) (пример 15) при 10 мкг/мл использовали в качестве антитела для идентификации zalpha11 на лимфоцитах. Второе антитело, козьи антитела против кроличьего Ig-FITC (Biosource,
Camarillo, CA) использовали для визуализации связывания кроличьего антитела анти-huzalpha11-CEEBHK с рецепторами zalpha11. Другие антитела одновременно использовали для окрашивания Т-клеток
(CD3-PE; PharMingen, San Diego, CA), В-клеток (CD19-PE) (PharMingen) и моноцитов (CD-14-PE)
(PharMingen) для идентификации совместного окрашивания антитела против рецептора zalpha11 на этих
типах клеток. Различные контроли использовали для определения неспецифического связывания и уровней фона окрашивания: (1) посторонние кроличьи поликлональные сыворотки использовали в качестве
неспецифического контроля, и (2) одно вторичное антитело использовали для определения фонового связывания этого реагента. Очищенный растворимый рецептор zalpha11CEE (пример 1) использовали приблизительно в 10-кратном избытке в качестве конкурентного ингибитора для подтверждения специфичности кроличьего антитела анти-huzalpha11-CEE-BHK в отношении растворимого рецептора zalpha11.
После посева этих клеток и добавления первичных и одновременно окрашивающих антител клетки
инкубировали на льду в течение 30 мин, промывали 2Х буфером для окрашивания и окрашивали вторичным антителом, козьими антителами против кроличьего Ig-FITC (Biosource), в течение 30 мин на льду.
Клетки промывали 2Х буфером для окрашивания и ресуспендировали при 200 мкл на лунку в буфере для
окрашивания, содержащем жизнеспособный штамм 7AA.D при конечной концентрации 1 мкг/мл (Sigma,
St. Louis, МО). Пробы считывали на приборе FACS-Caliber (Bection Dickinson, San-Jose, СА) и жизнеспособные клетки анализировали.
- 49 -
006501
Кроличьи поликлональные антитела к рецептору zalpha11 окрашивали покоящиеся В-клетки. Сигнал на покоящихся В-клетках был более ярким, чем сигнал, полученный с использованием посторонних
кроличьих сывороток, и сигнал уменьшался в большей степени на В-клетках, чем на Т-клетках, с добавлением избытка растворимого рецептора zalpha11CEE. Этот эксперимент повторяли с использованием
разделенных В-клеток и Т-клеток, и результаты были очень похожими. Опять окрашивание поликлональными кроличьими антителами анти-huzalpha11CEE-BHK к рецептору zalpha11 было наивысшим на
покоящихся В-клетках.
Пример 19. Экспрессия рецептора zalpha11 в различных тканях с использованием количественной
ОТ-ПЦР реального времени.
А. Праймеры и зонды для количественной ОТ-ПЦР.
Количественная ОТ-ПЦР реального времени с использованием системы детектирования последовательностей ABI PRISM 7700 (РЕ Applied Biosystems, Inc., Foster City, СА) была описана ранее (См. Heid,
С.A. et al., Genome Research 6:986-994, 1996; Gibson, U.E.M. et al., Genome Research 6:995-1001, 1996;
Sundaresan, S. et al., Endocrinology 139:4756-4764, 1998). Этот способ включает в себя применение генспецифического зонда, содержащего как репортерный, так и гасящий флуоресцентные красители. Когда
зонд является интактным, излучение репортерного красителя гасится вследствие тесной близости гасящего красителя. Во время ПЦР-удлинения с использованием ген-специфических прямого и обратного
праймеров зонд расщепляется 5'-нуклеазной активностью полимеразы Taq, что высвобождает репортерный краситель из зонда, приводя к увеличению флуоресцентного излучения.
Праймеры и зонды, используемые для количественных ОТ-ПЦР-анализов реального времени экспрессии zalpha11, сконструированы с использованием программного обеспечения для конструирования
праймеров Primer Express™ (PE Applied Biosystems, Foster City, CA). Праймеры для zalpha11 человека
сконструированы простирающимися с oхватыванием интрон-экзонного сочленения для элиминации амплификации геномной ДНК. Прямой праймер, ZC22277 (SEQ ID NO:59), и обратный праймер, ZC22276
(SEQ ID NO:60), использовали в ПЦР-реакции (ниже) в концентрации приблизительно 300 нМ для синтеза продукта 143 п.н. Соответствующий зонд zalpha11 TaqMan®, названный ZG31 (SEQ ID NO:61), был
синтезирован и помечен РЕ Applied Biosystems. Зонд ZG31 метили на 5'-конце репортерным флуресцентным красителем (6-карбоксифлуоресцеином) (FAM) (РЕ Applied Biosystems) и на 3'-конце гасящим флуоресцентным красителем (6-карбокситетраметилродамином) (TAMRA) (РЕ Applied Biosystems).
В качестве контроля для тестирования целостности и качества тестируемых проб РНК все пробы РНК
(ниже) подвергали скринингу на рРНК с использованием набора праймеров и зондов из РЕ Applied Biosystems
(cat No. 4304483). Этот набор содержит прямой праймер рРНК (SEQ ID NO:66) и обратный праймер рРНК
(SEQ ID NO:67), рРНК-зонд TaqMan® (SEQ ID NO:68). рРНК-зонд был помечен на 5'-конце репортерным
флуоресцентным красителем VIC (РЕ Applied Biosystems) и на 3'-конце гасящим флуоресцентным гасителем TAMRA (РЕ Applied Biosystems). Результаты с рРНК служат также в качестве эндогенного контроля и позволяют нормализовать результаты по экспрессии мРНК zalpha11, наблюдаемые в тест-пробах.
Пробы РНК из CD3, CD19 и моноцитарных типов клеток человека получали и описывали, как в
примере 16 выше. Контрольную РНК получали с использованием набора RNeasy Miniprep™ Kit (Qiagen,
Valencia, CA) согласно инструкциям изготовителя из приблизительно 10 млн клеток BaF3, экспрессирующих рецептор zalpha11 человека (пример 7).
В. Количественная ОТ-ПЦР реального времени.
Относительные уровни мРНК zalpha11 определяли анализом проб тотальной РНК с использованием
одностадийного способа ОТ-ПЦР (РЕ Applied Biosystems). Тотальную РНК из клеток BaF3, экспрессирующих рецептор zalpha11 человека, выделяли стандартными способами и использовали для получения
стандартной кривой, используемой для количественного определения. Кривая состояла из 10-кратных
серийных разведении в диапазоне от 2,5-2,6 х 10-4 нг/мкл для скрининга рРНК и 250-0,025 нг/мкл для
скрининга zalpha11, причем каждую точку стандартной кривой анализировали в трех повторностях. Пробы тотальной РНК из CD3, CD19 клеток и моноцитов человека также анализировали в трех повторностях
для уровней транскрипта zalpha11 человека и для уровней рРНК в качестве эндогенного контроля. В общем объеме 25 мкл каждую пробу РНК подвергали одностадийной ОТ-ПЦР-реакции, содержащей приблизительно 25 нг тотальной РНК в буфере А (50 мМ КСl, 10 мМ Трис-НСl); внутренний стандартный
краситель, карбокси-х-родамин (ROX); подходящие праймеры (приблизительно 50 нМ рРНК-праймеры
(SEQ ID NO:66 и SEQ ID NO:67) для проб рРНК; и приблизительно 300 нМ праймеры ZC22277 (SEQ ID
NO:59) и ZC22276 (SEQ ID NO:60) для проб zalpha11); подходящий зонд (приблизительно 50 нМ рРНКзонд TaqMan® (SEQ ID NO:68) для проб рРНК, приблизительно 100 нМ ZG31 (SEQ ID NO:61) для проб
zalpha11); 5,5 мМ MgCl2; 300 мкМ каждого из d-CTP, d-ATP и d-GTP и 600 мкМ d-UTP; обратную транскриптазу MuLV (0,25 Е/мл); ДНК-полимеразу AmpliTaq™ Gold (0,025 Е/мкл) (РЕ Applied Biosystems) и
ингибитор РНКазы (0,4 Е/мкл) (РЕ Applied Biosystems). Условия термоциклирования ПЦР были следующими: начальная стадия обратной транскрипции (ОТ) из одного цикла при 48°С в течение 30 мин; с последующей стадией активации AmpliTaq Gold™ (PE Applied Biosystems) из 1 цикла при 95°С в течение
10 мин; с последующими 40 циклами амплификации при 95°С в течение 15 с и 60°С в течение 1 мин.
- 50 -
006501
Относительные уровни РНК zalpha11 определяли с использованием способа стандартных кривых,
как описано изготовителем, РЕ Biosystems (User Bulletin No. 2: ABI Prism 7700 Sequence Detection System,
Relative Quantitation of Gene Expression, December 11, 1997). Измерения рРНК использовали для нормализации уровней zalpha11, а пробу РНК покоящихся CD3+ клеток использовали в качестве калибратора.
Покоящиеся CD3+ клетки выбирали произвольно в качестве калибратора и давали им величину 1,00.
Остальные пробы сравнивали относительно калибратора. Данные показаны в табл. 6 ниже.
Таблица 6
Проба
Покоящиеся
4 ч стимуляция
24 ч стимуляция
CD3
1,00
15,27
16,70
CD19
20,14
65,08
25,42
Моноциты
0,05
Нет данных
0,26
Наблюдали 15-кратное увеличение в экспрессии рецептора zalpha11 в CD3+ при 4 и 24 ч. Покоящиеся CD19 имели 20-кратное увеличение в экспрессии рецептора относительно покоящихся CD3+. 3-кратное увеличение имело место с 4-часовой стимуляцией, которое возвращалось к уровню покоящихся клеток при 24 ч. Моноциты не обнаружили детектируемой экспрессии рецептора zalpha11 в этом анализе.
Пример 20. Идентификация клеток, экспрессирующих рецептор zalpha11, с использованием гибридизации in situ.
Специфические ткани человека выделяли и подвергали скринингу на экспрессию zalpha11 in situ.
Получали различные ткани человека, делали срезы и подвергали их гибридизации in situ, в том числе
тимус, селезенку, миндалину, лимфатический узел и легкое. Ткани фиксировали в 10% забуференном
формалине и заключали в парафин с использованием стандартных способов (пример 17). Делали срезы
тканей при 4-8 мкм. Препараты тканей готовили с использованием стандартного протокола («Development
of non-isotopic in situ hybridization» в http://dir.niehs. nih. gov/dirlep/ish.html). Вкратце, срезы тканей депарафинизировали при помощи HistoClear (National Diagnostics, Atlanta, GA) и затем дегидратировали этанолом. Затем их расщепляли протеиназой К (50 мкг/мл) (Boehringer Diagnostics, Indianapolis, IN) при
37°С в течение 2-20 мин. Эта стадия сопровождалась ацетилированием и регидратацией тканей.
Два in situ зонда, генерируемыx ПЦР, были сконструированы на основе последовательности
zalpha11 человека. Были сконструированы два набора олигонуклеотидов для генерирования зондов для
отдельных районов кДНК zalpha11: (1) олигонуклеотиды ZC23684 (SEQ ID NO:62) и ZC23656 (SEQ ID
NO:63) использовали для генерирования зонда 413 п.н. для zalpha11; и (2) олигонуклеотиды ZC23685
(SEQ ID NO:64) и ZC23657 (SEQ ID NO:65) использовали для генерирования зонда 430 п.н. для zalpha11.
Второй зонд находится на 1500 п.н. 3' от первого зонда zalpha11. Антисмысловой олигонуклеотид из каждого набора также содержал рабочую последовательность для промотора РНК-полимеразы Т7, чтобы
сделать возможной легкую транскрипцию антисмыловых РНК-зондов из этих ПЦР-продуктов. Условия
ПЦР-реакции были следующими: 30 циклов при 94°С в течение 30 с, 60°С в течение 1 мин, 72°С в течение 1,5 мин. ПЦР-продукты очищали ротационными колонками Qiagen с последующими экстракцией
смесью фенол/хлороформ и осаждением этанолом. Зонды затем метили диоксигенином (Boehringer) или
биотином (Boehringer) с использованием системы транскрипции in vitro (Promega, Madison, WI) согласно
инструкциям изготовителя.
Гибридизацию in situ проводили с меченным диоксигенином или биотином зондом zalpha11 (см. выше). Зонд добавляли к микроскопическим перпаратам (предметным стеклам) в концентрации 1-5 пмоль/мл в
течение 12-16 ч при 55-60°С. Затем препараты промывали в 2Х SSC и 0,1X SSC при 50°С. Сигналы усиливали с использованием тирамидного усиления сигналов (TSA) (TSA, in situ непрямой набор; NEN) и визуализировали с набором Vector Red substrat kit (Vector Lab) согласно инструкциям изготовителя. Затем предметные стекла окрашивали контрастным красителем гематоксилином (Vector Laboratories, Burlingame, CA).
Сигнал наблюдали в тимусе, миндалине, легком и лимфатическом узле. Положительно окрашивающиеся клетки, по-видимому, являются лимфоцитами и родственными клетками.
Пример 21. Выделение мышиного рецептора zalpha11.
А. Скрининг мышиной геномной библиотеки.
Исходную частичную последовательность мышиного zalpha11 получали зондированием мышиной
геномной библиотеки полинуклеотидным зондом рецептора zalpha11 человека, содержащим полную
кДНК. кДНК zalpha11 человека генерировали при помощи ПЦР с праймерами ZC19905 (SEQ ID NO:36)
и ZC19906 (SEQ ID NO:37) и плазмиду, содержащую полноразмерный zalpha11 человека (например,
примера 1), использовали в качестве матрицы. Условия ПЦР были следующими: 35 циклов при 98°С в
течение 1 мин, 68°С в течение 1 мин и 72°С в течение 2 мин; затем 1 цикл при 72°С в течение 10 мин.
ПЦР-продукт подвергали электрофорезу на 1% агарозе с низкой точкой плавления (Boehringer
Mannheim) и кДНК zalpha11 человека приблизительно 1,5 т.п.н. выделяли с использованием набора для
экстракции гелей Qiaquick™ (Qiagen) согласно инструкциям изготовителя. Эту кДНК zalpha11 человека
использовали для скрининга мышиной библиотеки геномной ДНК (ниже).
- 51 -
006501
Используемой мышиной библиотекой геномной ДНК была клонированная библиотека embl3
SP6/T7 lambda BamHI (Clontech, Palo Alto, CA). Эту библиотеку, представляющую 7,2x105 БОЕ, высевали на «газон» хозяина Е. coli K802 на чашках 24 NZY. Подъемы бляшек выполняли с использованием
фильтров Hybond-N (Amersham Pharmacia, Bucklingamshire, England, UK) согласно инструкциям изготовителя. Фильтры денатурировали в 1,5 М NaCl и 0,5 М NaOH в течение 10 мин и затем нейтрализовали в
1,5 М NaCl и 0,5 М Трис-НСl (рН 7,2) в течение 10 мин. ДНК прикрепляли к фильтру с использованием
сшивающего агента STRATALINKER UV (Stratagene) при 1200 Дж. Фильтры предварительно промывали
для удаления клеточного дебриса при 65°С в буфере для предварительной промывки (0,25 x SSC, 0,25%
ДСН и 1 мМ ЭДТА), со сменой раствора 3 раза в течение 45 мин (в целом). Фильтры предгибридизовали
в течение ночи при 50°С в растворе Expresshyb™ (Clontech), содержащем 0,1 мг/мл денатурированной
ДНК спермы лосося. Приблизительно 50 нг очищенной кДНК zalpha11 человека (см. выше) метили 32P с
использованием системы мечения Rediprime II Random Prime Labeling System (Amersham Pharmacia) согласно инструкциям изготовителя. Невключившуюся радиоактивность удаляли из кДНК-зонда zalpha11 с
использованием push-колонки NucTrap™ (Stratagene, La Jolla, CA). Фильтры гибридизовали в растворе
Expresshyb™ (Clontech), содержащем приблизительно 0,5-приблизительно 1x106 имп./мин/мл кДНКзонда zalpha11, приблизительно 0,1 мг/мл денатурированной ДНК спермы лосося и 0,5 мкг/мл денатурированной ДНК cot-1. Гибридизация имела место в течение ночи при 50°С. Фильтры промывали в 2х SSC,
0,1% ДСН при комнатной температуре в течение 2 ч (со сменой промывок несколько раз), затем температуру повышали до 60°С на 1 ч (со сменой буфера 1 раз). Экспонирование в течение ночи при -80°С
обнаружило 6 бляшек, представляющих первичные изоляты.
Для получения вторичных изолятов бляшек 6 бляшек, представляющих первичные изоляты, извлекали пастеровской пипеткой и элюировали в течение ночи при 4°С в 1 мл SM (0,1 М NaCl, 50 мМ Трис
рН 7,5, 10 мМ MgSO4, 0,02% желатина), содержащем несколько капель хлороформа. После определения
титров фага приблизительно 12,5Х оцененного количества фага в исходной извлеченной «пробке» (12,5Х
покрытие) 6 первичных изолятов высевали на газон клеток Е. coli K802, заделанных в 10 мМ
MgSO4/NZY верхней агарозы, на макси-чашках NXY и выращивали в течение ночи при 37°С. Подъемы
бляшек производили с использованием фильтров Hybond-N (Amersham Pharmacia) согласно инструкциям
изготовителя. Фильтры фиксировали, как описано выше. Эти фильтры второго раунда предварительно
промывали для удаления клеточного дебриса при 65°С в буфере для предварительной промывки (2х SSC,
0,1% ДСН и 1 мМ ЭДТА), со сменой раствора 3 раза в течение 45 мин (в целом). Затем фильтры второго
раунда предгибридизовали и кДНК-зонд zalpha11 готовили, как описано выше.
Фильтры второго раунда гибридизовали, как описано выше, в растворе Expresshyb™ (Clontech), содержащем приблизительно 106 имп/мин/мл кДНК-зонда zalpha11 и приблизительно 0,1 мг/мл денатурированной ДНК спермы лосося. Гибридизация имела место в течение ночи при 50°С. Условия промывок,
описанные выше для первичного скрининга, повторяли для этого вторичного скрининга. После экспонирования в течение ночи при -80°С две из 6 первоначальных первичных бляшек были подтверждены как
положительные во втором скрининге. Положительные бляшки, гибридизующиеся с кДНК zalph11 человека
во втором скрининге, извлекали в виде «пробки» пастеровской пипеткой, и они были названы 7b1 и 20b1.
Выделенные бляшки No. 7b1 и 20b1 элюировали в 200 мкл SM в течение ночи при 4°С. Серийные
10-кратные разведения в диапазоне от 10-2 до 10-6 каждого изолята высевали на клетки-хозяева Е. coli
K802 для определения титра. Изолят 20b1 имел титр 4х103 БОЕ/мкл, и им занимались далее. Готовили 4
чашки посевом 105 БОЕ на чашку на конфлюэнтные клетки (газоны) Е. coli K802 для получения препарата
ДНК фага. Чашки выращивали при 37°С в течение приблизительно 6,5 ч, пока фаговый лизис не начинал
становиться конфлюэнтным. Затем фаг элюировали в течение ночи при 4°С в 12 мл SM на одну чашку.
Затем чашки встряхивали при комнатной температуре в течение 1 ч, супернатант удаляли; добавляли 1%
хлороформ и супернатант встряхивали опять в течение 15 мин. ДНК фага 20b1 получали с использованием
системы для очистки препаратов ДНК Wizard Lambda Preps DNA (Promega, Madison, WI; разделы IV и VI).
Пробы ДНК фага 20b1 разрезали несколькими рестриктазами для получения ДНК-фрагментов для
блоттинга по Саузерну. Продукты расщепления подвергали электрофорезу на 1% ТВЕ-агарозном геле.
Гель вымачивали в 0,25 М НСl в течение 30 мин; промывали в дистиллированной Н2O; вымачивали в 0,5 М
NaOH и 1,5 М NaCl в течение 40 мин с одной сменой раствора и нейтрализовали в 1,5 М NaCl и 0,5 М
Трис-НСl (рН 7,2) в течение 40 мин с одной сменой раствора. Систему быстрого переноса TURBOBLOTTER™
Rapid Downward Transfer System (Schleicher & Schuell, Keene, NH) использовали для переноса этой ДНК
на мембрану Nytran/BA-S (Schleicher & Schuell) в течение ночи. ДНК прикрепляли к Nytran при помощи
сшивающего агента STRATALINKER UV (Stratagene LA Jolla, CA) при 1200 Дж. Блот предгибридизовали, как описано выше. Приблизительно 50 нг кДНК zalpha11 человека метили и очищали для зонда, как
описано выше. Фильтры гибридизовали, как описано выше, в растворе Expresshyb™ (Clontech), содержащем приблизительно 106 имп./мин/мл кДНК-зонда zalpha11 и приблизительно 0,1 мг/мл денатурированной ДНК спермы лосося. Гибридизация имела место в течение ночи при 50°С. Блот промывали, как
описано выше, и экспонировали на пленке в течение ночи при -80°С.
Анализ по Саузерну обнаружил ДНК-фрагмент, полученный из продукта расщепления BamHI/StuI,
который гибридизовался с кДНК-зондом zalpha11 человека в ожидаемом диапазоне размеров 1,3-1,6 т.п.н.
- 52 -
006501
Этот фрагмент использовали далее. Приблизительно 3 мкг ДНК 20b1 разрезали 20 единицами BamHI
(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) и 20 единицами StuI (NEB, Beverly, MA) в течение 2 ч при 37°С.
Продукт расщепления подвергали электрофорезу на 1% ТВЕ-геле и дублетные полосы 1,3 т.п.н. и 1,6 т.п.н.
вырезали из геля и ДНК экстрагировали из агарозы с использованием набора для экстракции гелей Qiaquick™ (Qiagen, Valencia, CA). Вследствие низкого выхода ДНК из этого получения было невозможно
определить дополнительным анализом с расщеплением рестриктазами, были ли фрагменты, которые
гибридизовались с кДНК-зондом zalpha11 человека, BamHI/StuI- или StuI/StuI-фрагментами. Таким образом, лигирования тупых концов с использованием 5 мкл дублетного фрагмента 1,3 т.п.н. и 5 мкл дублетного фрагмента 1,3 т.п.н. выполняли с использованием набора для ПЦР-клонирования Zero Blunt PCR
Cloning Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA). Лигирование тупых концов давало положительные клоны как с
фрагментами 1,6 т.п.н., так и с одним из фрагментов 1,3 т.п.н.. Эти клоны расщепляли EcoRI (Life
Technologies), которая фланкирует Т-выступающий сайт, где встраивали фрагменты 1,6 и 1,3 т.п.н. Другой Саузерн-блоттинг проводили для определения, какой фрагмент был исходным фрагментом, гибридизующимся с кДНК-зондом zalpha11 человека. 1% ТВЕ-гель обрабатывали и ДНК переносили на Nytranблот, как описано выше.
Этот блот предгибридизовали, как описано выше, в 10 мл гибридизационного раствора. Получали
отличающийся зонд полинуклеотида zalpha11 человека. Другой фрагмент кДНК zalpha11 человека из
полноразмерной кДНК zalpha11 генерировали для применения в качестве зонда в ПЦР с олигонуклеотидами ZC19905 (SEQ ID NO:36) и ZC20097 (SEQ ID NO:27). Условия ПЦР-реакции были следующими:
95°С в течение 1 мин; 35 циклов 95°С в течение 1 мин, 55°С в течение 1 мин и 72°С в течение 2 мин; затем 1 цикл при 72°С в течение 10 мин. ПЦР-продукт подвергали электрофорезу на 1% агарозе с низкой
точкой плавления (Boehringer Mannheim) и кДНК zalpha11 человека приблизительно 1,5 т.п.н. выделяли с
использованием набора для экстракции гелей Qiaquick™ (Qiagen) согласно инструкциям изготовителя.
Приблизительно 50 нг этого выделенного кДНК-фрагмента zalpha11 человека метили 32P и очищали, как
описано выше. Фильтры гибридизовали в растворе Expresshyb™ (Clontech), содержащем приблизительно
106 имп./мин/мл кДНК-зонда zalpha11, приблизительно 0,1 мг/мл денатурированной ДНК спермы лосося
и 0,5 мкг/мл денатурированной ДНК cot-1. Гибридизацию и промывание выполняли, как описано выше.
Блот экспонировали на пленке 1,5 ч при -80°С, и вставка 1,3 т.п.н. сильно гибридизовалась с зондом
zalpha11 человека.
Этот клон секвенировали и обнаружили, что он содержит 3' кодирующий экзон мышиного zalpha11
с терминирующим кодоном и последовательностью интрона выше по ходу транскрипции. Использовали
следующие секвенирующие праймеры: ZC3424 (SEQ ID NO:86), ZC694 (SEQ ID NO:87), ZC24399 (SEQ
ID NO:88) и ZC24400 (SEQ ID NO:89). Геномная последовательность мышиного zalpha11, включающая в
себя 3'-экзон, показана в SEQ ID NO:69. Кодирующая последовательность 3'-экзона начинается при нуклеотиде 543 и заканчивается при нуклеотиде 1262 в SEQ ID NO:69, кодируя 240 аминокислот (SEQ ID NO:70).
В. ПЦР-скрининг панели мышиных кДНК.
Панель доступных у себя в лаборатории и коммерческих мышиных кДНК (Clontech; Life Technologies,
Gaithersburg, MD) подвергали скринингу при помощи ПЦР с использованием ZC24432 (SEQ ID NO:71) и
ZC24433 (SEQ ID NO:72) в качестве праймеров (приблизительно по 20 пмоль каждого). Условия ПЦРреакции были следующими: 94°С, 2 мин; 32 цикла 94°С в течение 20 с, 64°С в течение 30 с и 72°С в течение 30 с; затем 1 цикл при 72°С в течение 5 мин. Селезенка, дендритные клетки, неонатальная кожа,
костный мозг мышей, клетки BaF3 дикого типа, клетки EL4 и легкое мышей обнаружили сильно выраженные ПЦР-продукты предсказанного размера 450 п.н.
С. 5'-RACE с вмонтированными праймерами.
5'-RACE-реакции (быстрая амплификация концов кДНК) проводили с использованием 20 пмоль
каждого из праймеров ZC9739 (SEQ ID NO:73) и ZC24434 (SEQ ID NO:74) и marathon (марафонской)кДНК CD90+ отобранных клеток селезенки мыши в качестве матрицы. Marathon-кДНК получали с использованием набора для амплификации marathon-кДНК (Clontech) согласно инструкциям изготовителя.
Условия ПЦР-реакции были следующими: 94°С в течение 1 мин; 5 циклов 94°С в течение 20 с и 70°С в
течение 1,5 мин; затем 25 циклов 94°С в течение 20 с, 64°С в течение 20 с и 70°С в течение 1,5 мин; затем 1 цикл при 72°С в течение 5 мин.
Для обогащения в отношении 5'-RACE-продукта мышиного zalpha11 проводили 5'-RACE с вмонтированными (nested) праймерами с использованием описанных выше условий ПЦР-реакции для начальной 5'-RACE, за исключением использования вмонтированных праймеров ZC24431 (SEQ ID NO:75) и
ZC9719 (SEQ ID NO:76) и 1 мкл разведения 1/20 исходной 5'-RACE-реакции (выше) в качестве матрицы.
Продукты очищали гель-электрофорезом, ДНК элюировали с использованием набора для экстракции
агарозных гелей Qiaex II (Qiagen) и субклонировали с использованием набора для клонирования ТОТО
ТА Cloning Kit (Invitrogen). Положительные клоны идентифицировали при помощи ПЦР колоний с использованием 10 пмоль каждого из ZC24431 (SEQ ID NO:75) и ZC24511 (SEQ ID NO:77). Условия ПЦРреакции были следующими: 94°С, 2 мин; 35 циклов 94°С в течение 20 с, 64°С в течение 20 с и 72°С в
течение 30 с; затем 1 цикл при 72°С в течение 5 мин. Секвенировали два субклона из каждой из 5'-RACEреакций с вмонтированными праймерами. Все эти клоны содержали часть последовательности zalpha11,
- 53 -
006501
но не были полными. Компилированную последовательность получали из неполных 5'-RACE-клонов и
3'-последовательности экзона (SEQ ID NO:70) с получением предварительной частичной последовательности полинуклеотида и соответствующего полипептида мышиного zalpha11. Эта предварительная последовательность частичной кДНК мышиного zalpha11 показана в SEQ ID NO:78 (5'-конец) и SEQ ID
NO:80 (3'-конец); имелись приблизительно 330 нуклеотидов еще неизвестной последовательности между
SEQ ID NO:78 (5'-концом) и SEQ ID NO:80 (3'-концом) для получения полной кДНК мышиного zalpha11
(см. ниже). Соответствующие аминокислотные последовательности для SEQ ID NO:78 и SEQ ID NO:80
показаны в SEQ ID NO:79 (N-конец) и SEQ ID NO: 81 (С-конец), соответственно.
D. Полноразмерная ПЦР.
Были сконструированы праймеры из мышиногс UTR выше по ходу транскрипции (слева) от инициирующего Met и ниже по ходу транскрипции (справа) от терминирующего кодона для полноразмерной
ПЦР. 20 пмоль каждого из праймеров ZC24616 (SEQ ID NO:82) и ZC24615 (SEQ ID NO:83) использовали
в ПЦР-реакциях с использованием марафонской кДНК мышиных дендритных клеток или библиотеки
кДНК кожи новорожденных мышей, имеющейся в лаборатории, в качестве матрицы. Условия ПЦРреакции были следующими: 94°С, 1 мин; 30 циклов 94°С в течение 20 с и 66°С в течение 2 мин; затем 1
цикл при 72°С в течение 5 мин. ПЦР-продукты очищали гель-электрофорезом и кДНК элюировали с использованием набора для экстракции гелей Qiaquick и субклонировали с использованием набора для
клонирования ТА (Invitrogen). Секвенировали 2 субклона из каждой ПЦР-реакции. Использовали следующие секвенирующие праймеры: ZC694 (SEQ ID NO:87), ZC3424 (SEQ ID NO:86), ZC24431 (SEQ ID
NO:75), ZC24511 (SEQ ID NO:77), ZC24806 (SEQ ID NO:90) и ZC24807 (SEQ ID NO:91). Последовательность полноразмерной кДНК мышиного zalpha11 показана в SEQ ID NO:84. Соответствующая аминокислотная последовательность показана в SEQ ID NO:85.
Из приведенного выше описания должно быть понятно, что, хотя здесь были описаны для иллюстрации характерные варианты данного изобретения, различные модификации могут быть произведены без
отклонения от идеи и сферы действия данного изобретения. Таким образом, данное изобретение не ограничивается ничем, кроме прилагаемой формулы изобретения.
Перечень последовательностей
- 54 -
006501
- 55 -
006501
- 56 -
006501
- 57 -
006501
- 58 -
006501
- 59 -
006501
- 60 -
006501
- 61 -
006501
- 62 -
006501
- 63 -
006501
- 64 -
006501
- 65 -
006501
- 66 -
006501
- 67 -
006501
- 68 -
006501
- 69 -
006501
- 70 -
006501
- 71 -
006501
- 72 -
006501
- 73 -
006501
- 74 -
006501
- 75 -
006501
- 76 -
006501
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Выделенный полинуклеотид, кодирующий полипептид zalpha11 рецептора цитокина человека
класса I полной длины или его функциональные компоненты, включающие последовательности аминокислот, выбранные из группы, состоящей из
(a) последовательности от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 237 (His) SEQ ID
NO:2 (цитокинсвязывающий домен);
(b) последовательности от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 255 (Leu) SEQ ID
NO:2 (цитокинсвязывающий домен и трансмембранный домен);
(c) последовательности от аминокислоты номер 256 (Lys) до аминокислоты номер 538 (Ser) SEQ ID
NO:2 (внутриклеточный домен);
(d) последовательности от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 538 (Ser) SEQ ID
NO:2 (зрелый полипептид);
(e) последовательности от аминокислоты номер 1 (Met) до аминокислоты номер 538 (Ser) SEQ ID
NO:2 (полипептид полной длины) или последовательностей, которые по меньшей мере на 90% гомологичны указанным, и полученных согласно тому, как раскрыто в описании.
2. Выделенный полинуклеотид, кодирующий полипептид zalpha11 рецептора цитокина человека
класса I полной длины или его функциональные компоненты, включающий последовательность полинуклеотидов, выбранную из группы, состоящей из
(a) полинуклеотидной последовательности от нуклеотида 69 до нуклеотида 1682 SEQ ID NO:1 (полинуклеотид, кодирующий полипептид полной длины);
(b) полинуклеотидной последовательности от нуклеотида 1 до нуклеотида 1614 SEQ ID NO:4 (вырожденный полинуклеотид по отношению к указанному в (а), кодирующий полипептид полной длины);
(c) полинуклеотидной последовательности от нуклеотида 126 до нуклеотида 779 SEQ ID NO:1 (полинуклеотид, кодирующий цитокинсвязывающий домен);
(d) полинуклеотидной последовательности от нуклеотида 126 до нуклеотида 833 SEQ ID NO:1 (полинуклеотид, кодирующий цитокинсвязывающий домен и трансмембранный домен);
(e) полинуклеотидной последовательности от нуклеотида 834 до нуклеотида 1682 SEQ ID NO:1
(полинуклеотид, кодирующий внутриклеточный домен);
(f) полинуклеотидной последовательности от нуклеотида 126 до нуклеотида 1682 SEQ ID NO:1 (полинуклеотид, кодирующий зрелый полипептид).
3. Выделенный полинуклеотид по п.1, где полипептид zalpha11 включает последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из
(a) последовательности от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 237 (His) SEQ ID
NO:2 (цитокинсвязывающий домен);
(b) последовательности от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 255 (Leu) SEQ ID
NO:2 (цитокинсвязывающий домен и трансмембранный домен);
(c) последовательности от аминокислоты номер 256 (Lys) до аминокислоты номер 538 (Ser) SEQ ID
NO:2 (внутриклеточный домен);
(d) последовательности от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 538 (Ser) SEQ ID
NO:2 (зрелый полипептид) и
(e) последовательности от аминокислоты номер 1 (Met) до аминокислоты номер 538 (Ser) SEQ ID
NO:2 (полипептид полной длины).
4. Выделенный полинуклеотид по п.3, где полипептид zalpha11 имеет последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из
(a) последовательности от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 237 (His) SEQ ID
NO:2 (цитокинсвязывающий домен);
(b) последовательности от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 255 (Leu) SEQ ID
NO:2 (цитокинсвязывающий домен и трансмембранный домен);
(c) последовательности от аминокислоты номер 256 (Lys) до аминокислоты номер 538 (Ser) SEQ ID
NO:2 (межклеточный домен);
(d) последовательности от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 538 (Ser) SEQ ID
NO:2 (зрелый полипептид) и
(e) последовательности от аминокислоты номер 1 (Met) до аминокислоты номер 538 (Ser) SEQ ID
NO:2 (полипептид полной длины).
5. Выделенный полинуклеотид по п.1, где полипептид дополнительно содержит домен WSXWS
(SEQ ID NO:3).
6. Выделенный полинуклеотид по п.1, где полипептид (а), (с), (d), (е) дополнительно содержит
трансмембранный домен.
7. Выделенный полинуклеотид по п.6, где трансмембранный домен состоит из остатков 238 (Leu)255 (Leu) SEQ ID NO:2.
- 77 -
006501
8. Выделенный полинуклеотид по п.1, где полипептид (a), (b), (e), (d) дополнительно содержит
внутриклеточный домен.
9. Выделенный полинуклеотид по п.8, где внутриклеточный домен состоит из остатков 256 (Lys)538 (Ser) SEQ ID NO:2.
10. Выделенный полинуклеотид по п.9, где внутриклеточный домен дополнительно содержит сайты
Box I и Box II.
11. Выделенный полинуклеотид по п.1, где полипептид дополнительно содержит аффинную метку.
12. Экспрессирующий вектор, содержащий следующие функционально связанные элементы:
промотор транскрипции;
сегмент ДНК, кодирующий зрелый полипептид zalpha11 рецептора цитокина человека класса 1,
имеющий последовательность от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 538 (Ser) SEQ ID
NO:2; и
терминатор транскрипции,
причем промотор функционально связан с сегментом ДНК, а сегмент ДНК функционально связан с
терминатором транскрипции.
13. Экспрессирующий вектор по п.12, где он дополнительно содержит второй сегмент ДНК, экспрессирующий секреторную сигнальную последовательность, функционально связанную с сегментом
ДНК, кодирующим зрелый полипептид zalpha11.
14. Культивируемая клетка, содержащая экспрессирующий вектор по п.12, экспрессирующая зрелый полипептид zalpha11.
15. Экспрессирующий вектор, содержащий
промотор транскрипции;
сегмент ДНК, кодирующий цитокинсвязывающий домен полипептида zalpha11 рецептора цитокина
человека класса I, имеющий последовательность от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 237 (His) SEQ ID NO:2; и
терминатор транскрипции,
причем промотор, сегмент ДНК и терминатор функционально связаны.
16. Экспрессирующий вектор по п.15, дополнительно содержащий второй сегмент ДНК, экспрессирующий секреторную сигнальную последовательность, функционально связанную с сегментом ДНК,
кодирующим цитокинсвязывающий домен полипептида zalpha11.
17. Экспрессирующий вектор по п.15, дополнительно содержащий фрагмент ДНК, кодирующий
трансмембранный домен полипептида zalpha11, функционально связанный с сегментом ДНК, кодирующим цитокинсвязывающий домен указанного полипептида.
18. Экспрессирующий вектор по п.17, где трансмембранный домен содержит остатки 238 (Leu)-255
(Leu) SEQ ID NO:2.
19. Экспрессирующий вектор по п.15, дополнительно содержащий фрагмент ДНК, кодирующий
внутриклеточный домен полипептида zalpha11, функционально связанный с сегментом ДНК, кодирующим цитокинсвязывающий домен указанного полипептида.
20. Экспрессирующий вектор по п.19, где внутриклеточный домен состоит из остатков 256 (Lys)538 (Ser) SEQ ID NO:2.
21. Культивируемая клетка, в которую был введен экспрессирующий вектор по п.15, экспрессирующая растворимый рецепторный полипептид, zalpha11.
22. Клетка по п.21, пролиферация которой зависит от экзогенного гемопоэтического фактора роста.
23. Конструкция ДНК, кодирующая слитый белок, в состав которого входит полипептид zalpha11
рецептора цитокина человека класса I полной длины или его функциональные компоненты, содержащая
первый сегмент ДНК, кодирующий полипептид, имеющий последовательность аминокислотных
остатков, выбранную из группы, состоящей из
(a) аминокислотной последовательности от аминокислоты номер 2 (Met) до аминокислоты номер 19
(Gly) SEQ ID NO:2 (секреторная сигнальная последовательность zaplha11);
(b) аминокислотной последовательности от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер
237 (His) SEQ ID NO:2 (цитокинсвязывающий домен zalpha11);
(c) аминокислотной последовательности от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер
255 (Leu) SEQ ID NO:2 (цитокинсвязывающий домен и трансмембранный домен zalpha11);
(d) аминокислотной последовательности от аминокислоты номер 238 (Leu) до аминокислоты номер
255 (Leu) SEQ ID NO:2 (трансмембранный домен zalpha11);
(e) аминокислотной последовательности от аминокислоты номер 238 (Leu) до аминокислоты номер
538 (Ser) SEQ ID NO:2 (трансмембранный домен и внутриклеточный домен zalpha11);
(f) аминокислотной последовательности от аминокислоты номер 256 (Lys) до аминокислоты номер
538 (Ser) SEQ ID NO:2 (внутриклеточный домен zalpha11);
(g) аминокислотной последовательности от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер
538 (Ser) SEQ ID NO:2 (зрелый полипептид zalpha11) и
по меньшей мере один другой сегмент ДНК, кодирующий дополнительный полипептид,
- 78 -
006501
причем первый и другие сегменты ДНК соединены в рамке считывания.
24. Экспрессирующий вектор, содержащий следующие функционально связанные элементы:
промотор транскрипции;
конструкцию ДНК по п.23, кодирующую слитый белок; и
терминатор транскрипции,
причем промотор функционально связан с конструкцией ДНК, а конструкция ДНК функционально
связана с терминатором транскрипции.
25. Культивируемая клетка, содержащая экспрессирующий вектор по п.24, причем клетка экспрессирует слитый белок.
26. Способ получения слитого белка, предусматривающий
культивирование клетки по п.25 и
выделение полипептида, продуцируемого этой клеткой.
27. Выделенный полипептид zalpha11 рецептора цитокина человека класса I полной длины или его
функциональные компоненты, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из
(a) последовательности от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 237 (His) SEQ ID
NO:2 (цитокинсвязывающий домен);
(b) последовательности от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 255 (Leu) SEQ ID
NO:2 (цитокинсвязывающий домен и трансмембранный домен);
(c) последовательности от аминокислоты номер 256 (Lys) до аминокислоты номер 538 (Ser) SEQ ID
NO:2 (полный внутриклеточный домен);
(d) последовательности от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 538 (Ser) SEQ ID
NO:2 (зрелый полипептид) и
(e) последовательности от аминокислоты номер 1 (Met) до аминокислоты номер 538 (Ser) SEQ ID
NO:2 (полипептид полной длины) или последовательностей, которые по меньшей мере на 90% гомологичны указанным и получены, как раскрыто в описании.
28. Выделенный полипептид по п.27, который содержит последовательность аминокислотных остатков, выбранную из группы, состоящей из
(a) последовательности от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 237 (His) SEQ ID
NO:2 (цитокинсвязывающий домен);
(b) последовательности от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 255 (Leu) SEQ ID
NO:2 (цитокинсвязывающий домен и трансмембранный домен);
(c) последовательности от аминокислоты номер 256 (Lys) до аминокислоты номер 538 (Ser) SEQ ID
NO:2 (внутриклеточный домен);
(d) последовательности от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 538 (Ser) SEQ ID
NO:2 (зрелый полипептид).
(e) последовательности от аминокислоты номер 1 (Met) до аминокислоты номер 538 (Ser) SEQ ID
NO:2 (полипептид полной длины).
29. Выделенный полипептид по п.27, где полипептид zalpha11 имеет последовательность аминокислотных остатков, выбранную из группы, состоящей из
(a) последовательности от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 255 (Leu) SEQ ID
NO:2 (цитокинсвязывающий домен);
(b) последовательности от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 255 (Leu) SEQ ID
NO:2 (цитокинсвязывающий домен и трансмембранный домен);
(c) последовательности от аминокислоты номер 256 (Lys) до аминокислоты номер 538 (Ser) SEQ ID
NO:2 (внутриклеточный домен);
(d) последовательности от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 538 (Ser) SEQ ID
NO:2 (зрелый полипептид);
(e) последовательности от аминокислоты номер 1 (Met) до аминокислоты номер 538 SEQ ID NO:2
(полипептид полной длины).
30. Выделенный полипептид по п.27, дополнительно содержащий домен WSXWS, как показано в
SEQ ID NO:3.
31. Выделенный полипептид по п.27, где полипептид (а), (с), (d), (e) дополнительно содержит
трансмембранный домен.
32. Выделенный полипептид по п.31, где трансмембранный домен состоит из остатков 238 (Leu)255 (Leu) SEQ ID NO:2.
33. Выделенный полипептид по п.27, где полипептид (а), (b), (d), (e) дополнительно содержит внутриклеточный домен.
34. Выделенный полипептид по п.33, где внутриклеточный домен состоит из остатков 256 (Lys)-538
(Ser) SEQ ID NO:2.
35. Выделенный полипептид по п.34, где внутриклеточный домен дополнительно содержит сайты
Box I и Box II.
- 79 -
006501
36. Выделенный полипептид по п.27 или 28, дополнительно содержащий аффинную метку, маркер
биотин/авидин, радионуклид, маркер фермент/субстрат, кофактор, ингибитор, флуоресцентную индикаторную частицу, хемилюминесцентную индикаторную частицу, токсин, цитотоксичную молекулу или
домен иммуноглобулина Fc.
37. Выделенный полипептид по п.29, состоящий из последовательности аминокислотных остатков
от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 237 (His) SEQ ID NO:2 (цитокинсвязывающий
домен) и дополнительно содержащий трансмембранный домен гетерологичного рецептора цитокина.
38. Выделенный полипептид по п.37, где гетерологичный рецептор цитокина является рецептором
цитокина класса I.
39. Выделенный полипептид по п.37, дополнительно содержащий трансмембранный домен и межклеточный домен из гетерологичного рецептора цитокина.
40. Выделенный полипептид по п.39, где гетерологичный рецептор цитокина является рецептором
цитокина класса I.
41. Выделенный полипептид по п.29, состоящий из последовательности аминокислотных остатков
от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 255 (Leu) SEQ ID NO:2 (цитокинсвязывающий
домен и трансмембранный домен) и дополнительно содержащий внутриклеточный домен гетерологичного рецептора цитокина.
42. Выделенный полипептид по п.41, где гетерологичный рецептор цитокина является рецептором
цитокина класса I.
43. Выделенный полипептид по п.29, состоящий из последовательности аминокислотных остатков
от аминокислоты номер 256 (Lys) до аминокислоты номер 538 (Leu) SEQ ID NO:2 (внутриклеточный
домен) и дополнительно содержащий трансмембранный домен и цитокинсвязывающий домен гетерологичного рецептора цитокина.
44. Выделенный полипептид по п.43, где гетерологичный рецептор цитокина является рецептором
цитокина класса I.
45. Выделенный полипептид по п.29, состоящий из последовательности аминокислотных остатков
от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 538 (Leu) SEQ ID NO:2 (зрелый полипептид).
46. Способ получения зрелого полипептида zalpha11, предусматривающий
культивирование клетки по п.14 и
выделение полипептида zalpha11, продуцируемого этой клеткой.
47. Выделенный полипептид zalpha11, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID
NO:2 от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 237 (His) (цитокинсвязывающий домен)
и, по существу, не содержащий трансмембранного и внутриклеточного доменов, обычно связанных с
гемопоэтическими рецепторами.
48. Выделенный полипептид по п.47, дополнительно содержащий аффинную метку.
49. Выделенный полипептид по п.47, дополнительно содержащий аффинную метку, маркер биотин/авидин, радионуклид, маркер фермент/субстрат, кофактор, ингибитор, флуоресцентную индикаторную частицу, хемилюминесцентную индикаторную частицу, токсин, цитотоксичную молекулу или домен иммуноглобулина Fc.
50. Способ получения цитокинсвязывающего домена полипептида zalpha11, предусматривающий
культивирование клетки по п.21 и
выделение полипептида, продуцируемого этой клеткой.
51. Способ получения антитела к полипептиду zalpha11, предусматривающий
введение животному полипептида, выбранного из группы, состоящей из
(а) полипептида, содержащего любые из 9-519 аминокислот, которые составляют непрерывную последовательность в пределах последовательности SEQ ID NO:2 от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 538 (Ser) (зрелый полипептид);
(b) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 237 (His) (цитокинсвязывающий домен);
(c) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 от аминокислоты номер 101 (Leu) до аминокислоты номер 122 (Gly);
(d) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 от аминокислоты номер 141 (Asn) до аминокислоты номер 174 (Ala);
(e) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 от аминокислоты номер 193 (Cys) до аминокислоты номер 261 (Val);
(f) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 от аминокислоты номер 51 (Тrр) до аминокислоты номер 61 (Glu);
(g) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 от аминокислоты 136 (Ilе) до аминокислоты номер 143 (Glu);
(h) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 от аминокислоты 187 (Pro) до аминокислоты номер 195 (Ser);
- 80 -
006501
(i) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 от аминокислоты номер 223 (Phe) до аминокислоты номер 232 (Glu); и
(j) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 от аминокислоты номер 360 (Glu) до аминокислоты номер 368 (Asp),
причем указанный полипептид индуцирует синтез антител в организме животного, и
выделение антитела, специфически связывающегося с полипептидом zalpha11, из организма животного.
52. Моноклональное антитело, полученное при иммунизации животного полипептидом zalpha11,
выбранным из группы, состоящей из
(a) полипептида, содержащего любые из 9-519 аминокислот, которые составляют непрерывную последовательность в пределах последовательности SEQ ID NO:2 от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 538 (Ser) (зрелый полипептид);
(b) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 237 (His) (цитокинсвязывающий домен);
(c) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 от аминокислоты номер 101 (Leu) до аминокислоты номер 122 (Gly);
(d) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 от аминокислоты номер 141 (Asn) до аминокислоты номер 174 (Ala);
(e) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 от аминокислоты номер 193 (Cys) до аминокислоты номер 261 (Val);
(f) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 от аминокислоты номер 51 (Тrр) до аминокислоты номер 61 (Glu);
(g) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 от аминокислоты 136 (Ilе) до аминокислоты номер 143 (Glu);
(h) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 от аминокислоты 187 (Pro) до аминокислоты номер 195 (Ser);
(i) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 от аминокислоты номер 223 (Phe) до аминокислоты номер 232 (Glu); и
(j) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 от аминокислоты номер 360 (Glu) до аминокислоты номер 368 (Asp).
53. Антитело, которое специфически связывается с полипептидом по п.27.
54. Способ обнаружения в тест-пробе присутствия модулятора активности полипептида zalpha11,
предусматривающий
культивирование клетки, в которую был введен экспрессирующий вектор по п.15, причем эта клетка экспрессирует цитокинсвязывающий домен полипептида zalpha11, в присутствии и в отсутствие тестпробы; и
сравнение уровней активности указанного домена zalpha11 в присутствии и в отсутствие тестпробы при помощи биологического или биохимического анализа; и
определение по результатам сравнения присутствия модулятора активности zalpha11 в данной тестпробе.
55. Способ обнаружения лиганда рецептора zalpha11 в тест-пробе, предусматривающий
обеспечение контактирования тест-пробы с полипептидом zalpha11, содержащим последовательность от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 237 (His) SEQ ID NO:2 (цитокинсвязывающий домен); и
выявление связывания указанного полипептида с лигандом в пробе.
56. Способ по п.55, согласно которому указанный полипептид дополнительно содержит трансмембранный и внутриклеточный домены.
57. Способ по п.55, согласно которому указанный полипептид связан с мембраной культивируемой
клетки, а стадия выявления предусматривает измерение биологического ответа в культивируемой клетке.
58. Способ по п.57, согласно которому биологический ответ представляет собой пролиферацию
клеток, активность сигнальной трансдукции или активацию транскрипции репортерного гена.
59. Способ по п.55, согласно которому полипептид иммобилизован на твердом носителе.
60. Способ по п.56, согласно которому тест-проба содержит лимфоидные клетки, гемопоэтические
клетки, активированные Т-клетки или раковые клетки или кондиционированную среду из лимфоидных
клеток, гемопоэтических клеток, активированных Т-клеток или раковых клеток.
- 81 -
006501
Фиг. 1А
- 82 -
006501
Фиг. 1В
- 83 -
006501
Фиг. 1С
- 84 -
006501
Фиг. 1D
- 85 -
006501
Фиг. 1Е
- 86 -
006501
Фиг. 1F
- 87 -
006501
Фиг. 1G
- 88 -
006501
Фиг. 1Н
- 89 -
006501
Фиг. 1I
- 90 -
006501
Фиг. 1J
- 91 -
006501
Фиг. 1K
Фиг. 1L
- 92 -
006501
Фиг. 2А
Фиг. 2В
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2/6
- 93 -