35 Íîâîñòè êëåòî÷íûõ òåõíîëîãèé

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Íîâîñòè êëåòî÷íûõ òåõíîëîãèé
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ÊËÎÍÈÐÎÂÀÍÈÅ
Ñðàâíèòåëüíîå ãåíîìíîå èññëåäîâàíèå êëîíèðîâàííûõ
è íîðìàëüíûõ ýìáðèîíîâ
Òåõíîëîãèÿ ïåðåíîñà ñîìàòè÷åñêîãî ÿäðà â ýíóêëåèðîâàííûé îâîöèò èìååò áîëüøîå çíà÷åíèå äëÿ áèîìåäèöèíû
è ñåëüñêîãî õîçÿéñòâà, òàê êàê ýòî óíèêàëüíûé ñïîñîá ïîëó÷åíèÿ ãåíåòè÷åñêè èäåíòè÷íûõ ðîäèòåëüñêèì êëåòîê èëè
æèâîòíîå-êëîí. Îäíàêî, âñå èñcëåäîâàòåëüñêèå ãðóïïû îòìå÷àþò êðàéíå íèçêóþ ÷àñòîòó ðîæäåíèÿ æèçíåñïîñîáíîãî
æèâîòíîãî èç òàêîãî ýìáðèîíà (nuclear transfer, NT-ýìáðèîí). Êàê ïðàâèëî, åùå ïðè ðàííåì ýìáðèîíàëüíîì ðàçâèòèè
íàáëþäàþòñÿ çíà÷èòåëüíûå íàðóøåíèÿ â òêàíå- è îðãàíîãåíåçå, íåñîâìåñòèìûå ñ æèçíüþ. È õîòÿ óæå ïîëó÷åíî íåìàëî êëîíèðîâàííûõ æèâîòíûõ ðàçëè÷íûõ âèäîâ, ïîëíîñòüþ
êîíòðîëèðîâàòü ïðîöåññ è íàïðàâëåííî óâåëè÷èâàòü åãî
ýôôåêòèâíîñòü ïîêà íå óäàåòñÿ. Îäíîé èç îñíîâíûõ ïðè÷èí
íèçêîé ýôôåêòèâíîñòè òåõíîëîãèè ñ÷èòàåòñÿ íàðóøåíèå
ýïèãåíåòè÷åñêîãî êîíòðîëÿ ðàáîòû ãåíîâ, âñëåäñòâèå ýòîãî - íåïðàâèëüíîå ðàçâèòèå ýìáðèîíà. Òåì íå ìåíåå, ðåïðîãðàììèðîâàíèå ñîìàòè÷åñêîãî ÿäðà ïðè åãî ïåðåíîñå äîñòîâåðíî ïîêàçàíî, è óäà÷íûå ñëó÷àè êëîíèðîâàíèÿ
äîêàçûâàþò èçìåíåíèÿ â ãåííîé àêòèâíîñòè è «ñíÿòèå»
ýïèãåíîìíîé èíôîðìàöèè.
Íåäàâíî áûëà ïðîâåäåíà ðàáîòà ïî ñðàâíåíèþ ýêñïðåññèè ãåíîâ â íåñêîëüêèõ NT-ýìáðèîíàõ êîðîâ íà ñòàäèè áëàñòîöèñòû, ñ ñîìàòè÷åñêèìè êëåòêàìè - äîíîðàìè ÿäåð è ñ
íîðìàëüíî îïëîäîòâîðåííûìè áëàñòîöèñòàìè. Àíàëèç áîëåå
5000 òûñÿ÷ ãåíîâ, ïðîâåäåííûé ïðè ïîìîùè ìèêðî÷èïîâ,
ïîêàçàë, ÷òî ýêñïðåññèÿ ãåíîâ â NT-ýìáðèîíàõ ñèëüíî îòëè÷àåòñÿ îò ñîìàòè÷åñêèõ êëåòîê-äîíîðîâ è ìèíèìàëüíî
îòëè÷àåòñÿ îò íîðìàëüíûõ áëàñòîöèñò. Ýòî äîêàçûâàåò, ÷òî
ïåðåíåñåííûå â îîöèòû ÿäðà ïðåòåðïåâàþò çíà÷èòåëüíîå
ïåðåïðîãðàììèðîâàíèå íà ñòàäèè áëàñòîöèñòû, è ïðîáëåìû, âîçíèêàþùèå ïðè ðàçâèòèè òêàíåé è îðãàíîâ èç
NT-ýìáðèîíîâ, âîçìîæíî, ñâÿçàíû ñ îøèáêàìè ýòîãî ôåíîìåíà, çíà÷åíèå êîòîðûõ óâåëè÷èâàåòñÿ â ïðîöåññå îðãàíîãåíåçà.
Ïðè ñðàâíåíèè êàðòèíû òðàíñêðèïöèè óäàëîñü âûÿâèòü 29
% ãåíîâ, ïî-ðàçíîìó ýêñïðåññèðóþùèõñÿ â NT-ýìáðèîíàõ è
ñîìàòè÷åñêèõ êëåòêàõ-äîíîðàõ ÿäåð. Ýòè ãåíû îòíîñÿòñÿ ê
ñëåäóþùèì ñèãíàëüíûì ïóòÿì: îêèñëèòåëüíîå ôîñôîðèëèðîâàíèå, êëåòî÷íûé öèêë, ñèíòåç ÀÒÔ, öèêë òðèêàðáîíîâûõ
êèñëîò, ìåòàáîëèçì ïóðèíîâ, ïèðóâàòà, ãëèêîëèç è ãëþêîíåîãåíåç, à òàêæå àïîïòîç. Èññëåäîâàòåëè ïðîàíàëèçèðîâàëè
â NT-ýìáðèîíàõ 94 ãåíà, êîòîðûå ýêñïðåññèðóþòñÿ â ýòèõ
êëåòêàõ íà âûñîêîì óðîâíå. Èç íèõ 23 ãåíà çíà÷èòåëüíî
ñèëüíåå ýêñïðåññèðîâàëèñü â èññëåäóåìûõ îáðàçöàõ, ïî
ñðàâíåíèþ ñ äîíîðíûìè ñîìàòè÷åñêèìè êëåòêàìè. Ñðåäè
íèõ - ðàíåå îïèñàííûå ODC1, PECAM1, CCNE1 - ãåíû,
ñïåöèôè÷íûå äëÿ ýìáðèîíàëüíûõ ñòâîëîâûõ êëåòîê (ÝÑÊ).
Òàêèì îáðàçîì, ïðèíèìàÿ âî âíèìàíèå ðàçëè÷èÿ â óðîâíå
ýêñïðåññèè îïèñàííûõ ãåíîâ, ìîæíî ïðåäïîëîæèòü, ÷òî ÿäðî
ñîìàòè÷åñêîé êëåòêè ïðåòåðïåâàåò çíà÷èòåëüíîå ïåðåïðîãðàììèðîâàíèå ïîñëå ïåðåíîñà â ÿéöåêëåòêó.
Ïðîôèëü ýêñïðåññèè ãåíîâ áûë ñðàâíåí ó NT-ýìáðèîíîâ è ýìáðèîíîâ, ïîëó÷åííûõ âñëåäñòâèå èñêóññòâåííîé
èíñåìèíàöèè (artificial insemination, AI-ýìáðèîíû) è èñêóññòâåííîãî îïëîäîòâîðåíèÿ (in vitro fertilization, IVF-ýìáðèîíû).
Îêàçàëîñü, ÷òî àêòèâíîñòü ãåíîâ â NT-ýìáðèîíàõ áîëåå ñõîæà ñ òàêîâîé â AI-ýìáðèîíàõ, òîãäà êàê ðàçëè÷èÿ ìåæäó NTè IVF-ýìáðèîíàìè áîëåå çíà÷èòåëüíûå. Èíòåðåñíî, ÷òî ïðè
ñðàâíåíèè èíäèâèäóàëüíûõ ýìáðèîíîâ âíóòðè ãðóïïû áîëåå
îäíîðîäíûìè ÿâëÿþòñÿ NT-ýìáðèîíû, à IVF-ýìáðèîíû –
íàèáîëåå ðàçíîðîäíûå. Ñõîæàÿ êàðòèíà ãåííîé ýêñïðåññèè
ó NT-ýìáðèîíîâ òàêæå ïîäòâåðæäàåò ìåõàíèçì ïåðåïðîãðàììèðîâàíèÿ ÿäðà. Ðàçëè÷èÿ ìåæäó IVF-ýìáðèîíàìè ìîãëè
âîçíèêíóòü âñëåäñòâèå êóëüòèâèðîâàíèÿ èëè ãåíåòè÷åñêèõ
ðàçëè÷èé ìàòåðåé-äîíîðîâ ÿéöåêëåòîê.
Íåñìîòðÿ íà ñõîæóþ ãåííóþ ýêñïðåññèþ ìåæäó NT- è
AI-ýìáðèîíàìè, 50 ãåíîâ (îêîëî 1 %) îòëè÷àþòñÿ ïî óðîâíþ òðàíñêðèïöèè. Ñðåäè íèõ 8 ýêñïðåññèðóþòñÿ òîëüêî â
NT-ýìáðèîíàõ, à 17 – òîëüêî â AI-ýìáðèîíàõ. Âîçìîæíî,
ýòè ãåíû ñâÿçàíû ñ ðàçëè÷èÿìè ðàçâèòèÿ in vitro è in vivo.
Äëÿ íåêîòîðûõ èç ýòèõ ãåíîâ îïèñàíû ôóíêöèè, íàïðèìåð,
TFAP2A íåîáõîäèì äëÿ ôîðìèðîâàíèÿ íåðâíîé òðóáêè è
Êëåòî÷íàÿ òðàíñïëàíòîëîãèÿ è òêàíåâàÿ èíæåíåðèÿ ¹ 1 (3), 2006
36
Íîâîñòè êëåòî÷íûõ òåõíîëîãèé
ðàçâèòèÿ ñåðäå÷íîé ìûøöû [1], à MEIS2 è DUSP6 íåîáõîäèìû äëÿ ðàçâèòèÿ êîíå÷íîñòåé [2, 3], (folate receptor 1) èãðàåò
ðîëü â òðàíñïîðòíîé ñèñòåìå ìåæäó ìàòåðèíñêèì è ýìáðèîíàëüíûì îðãàíèçìàìè [4]. Âñå ýòè ãåíû òðàíñêðèáèðóþòñÿ
íà íèçêîì óðîâíå â NT-ýìáðèîíàõ è, âîçìîæíî, ÿâëÿþòñÿ
ïðè÷èíîé íàðóøåíèé ðàçâèòèÿ êëîíèðîâàííûõ æèâîòíûõ.
Ñ äðóãîé ñòîðîíû, ìíîæåñòâî àíîìàëèé ðàçâèòèÿ êëîíèðîâàííûõ æèâîòíûõ ìîãóò áûòü âûçâàíû íàðóøåíèÿìè èìïðèíòèíãà. Èññëåäîâàòåëè ïðîàíàëèçèðîâàëè ýêñïðåññèþ
21 ãåíà, èìïðèíòèðîâàííûõ ó ìûøè è ÷åëîâåêà. Ñðåäè ýòèõ
ãåíîâ 20 ýêñïðåññèðîâàëèñü îäèíàêîâî ó NT-, AI- è IVF-ýìáðèîíîâ. È òîëüêî îäèí ãåí – CD81 – àêòèâíûé â ïëàöåíòå
ìûøè, ïî-ðàçíîìó ýêñïðåññèðîâàëñÿ ó NT- è AI-ýìáðèîíîâ.
Âîçìîæíî, ýòî íàðóøåíèå ïîñëóæèëî ïðè÷èíîé äëÿ òàê íàçûâàåìîãî large offspring syndrome, ÷àñòî íàáëþäàåìîãî â ñëó÷àå NT. Íîðìàëüíàÿ ýêñïðåññèÿ äðóãèõ èìïðèíòèðîâàííûõ
ãåíîâ ïîäòâåðæäàåò òåîðèþ î ïåðåïðîãðàììèðîâàíèè ÿäðà.
Íàðóøåíèå ýêñïðåññèè ãåíîâ, ñöåïëåííûõ ñ Õ-õðîìîñîìîé, íàáëþäàëîñü ó êëîíèðîâàííûõ óìåðøèõ æèâîòíûõ
è NT-ýìáðèîíîâ. Íî èç 123 èçâåñòíûõ ÷åëîâå÷åñêèõ ãåíîâ,
ñöåïëåííûõ ñ Õ-õðîìîñîìîé, ó÷åíûå íå íàøëè íè îäíîãî,
ýêñïðåññèðóþùåãîñÿ ïî-ðàçíîìó â AI- è NT-ýìáðèîíàõ.
Èññëåäîâàòåëè ïðåäïîëàãàþò, ÷òî êëþ÷åâîå ñîáûòèå â ðàííåì ðàçâèòèè – èíàêòèâàöèÿ Õ-õðîìîñîìû – âîçìîæíî, ó
êîðîâ ïðîèñõîäèò ïîçæå, ÷åì òå ñðîêè ðàçâèòèÿ, âî âðåìÿ
êîòîðûõ ïðîâîäèëè èññëåäîâàíèÿ.
Ïðè àíàëèçå ãåíîâ, ó÷àñòâóþùèõ â ðåãóëÿöèè ìåòèëèðîâàíèÿ è ìîäèôèêàöèè õðîìàòèíà, íå óäàëîñü âûÿâèòü ðàçíèöû â ýêñïðåññèè ãåíîâ ïî ñðàâíåíèþ ñ íîðìàëüíûìè
ýìáðèîíàìè. Íà îñíîâàíèè ñâîèõ äàííûõ ó÷åíûå ñäåëàëè
âûâîä, ÷òî ïåðåïðîãðàììèðîâàíèå ñîìàòè÷åñêîãî ÿäðà,
ïåðåíåñåííîãî â öèòîïëàçìó ÿéöåêëåòêè, êàñàåòñÿ è ýïèãåíåòè÷åñêèõ èçìåíåíèé.
Èç 434 ãåíîâ, íåïîñðåäñòâåííî âîâëå÷åííûõ â ïðîöåññû ðàííåãî ðàçâèòèÿ, ó÷åíûì óäàëîñü âûÿâèòü ëèøü 5 äèôôåðåíöèàëüíî ýêñïðåññèðóþùèõñÿ ìåæäó NT- è AI-ýìáðèîíàìè, òîãäà êàê ó IVF-ýìáðèîíîâ òàêèõ ãåíîâ 14 ïî
ñðàâíåíèþ ñ NT, è 24 ïî ñðàâíåíèþ ñ AI-ýìáðèîíàìè. Ýòè
ðåçóëüòàòû ïîêàçûâàþò, êàêîå âëèÿíèå èìååò äëÿ ðàííåãî
ðàçâèòèÿ èñêóññòâåííîå îïëîäîòâîðåíèå. Òðè ãåíà áûëè àêòèâíû èñêëþ÷èòåëüíî ó AI-ýìáðèîíîâ (AKAP11, CCL2 è
PPAP26), âîçìîæíî, îíè îòâå÷àþò çà óñïåøíîå ðàçâèòèå
íîðìàëüíî îïëîäîòâîðåííûõ ýìáðèîíîâ èëè àêòèâèðóþòñÿ
â îòâåò íà óñëîâèÿ ðàçâèòèÿ in vivo.
Ïîäâîäÿ èòîã ðàáîòû, ìîæíî ñêàçàòü, ÷òî ó÷åíûì óäàëîñü âûÿâèòü áîëåå 300 ãåíîâ, êîòîðûå íå ìåíÿþò ñâîåé
àêòèâíîñòè â òðåõ èññëåäîâàííûõ òèïàõ ýìáðèîíîâ, ÷òî ìîæåò ñâèäåòåëüñòâîâàòü îá èõ ïåðâîñòåïåííîé âàæíîñòè íà
ðàííèõ ýòàïàõ ðàçâèòèÿ. Êðîìå ýòîãî, äîñòîâåðíî áûëî
ïîêàçàíî, ÷òî õàðàêòåð ýêñïðåññèè ãåíîâ ïðè ïåðåíîñå ñîìàòè÷åñêîãî ÿäðà â ÿéöåêëåòêó íà ðàííèõ ýòàïàõ áîëåå áëèçîê ê òàêîâîìó â íîðìàëüíî îïëîäîòâîðåííûõ ýìáðèîíàõ
(AI-ýìáðèîíû). Àíàëèç, ïðîâîäèìûé íà ñòàäèè áëàñòîöèñòû
ïîêàçàë, ÷òî ñîìàòè÷åñêîå ÿäðî ïðåòåðïåâàåò ðåïðîãðàììèðîâàíèå, è ýêñïðåññèÿ ãåíîâ ìåíÿåòñÿ â ñîîòâåòñòâèè ñ ãåííîé àêòèâíîñòüþ ðàííåãî ýìáðèîíà.
Îñòà¸òñÿ íåÿñíûì, ïî÷åìó èñêóññòâåííîå îïëîäîòâîðåíèå, â êîòîðîì ó÷àñòâóþò ÿäðà ïîëîâûõ êëåòîê, íà ðàííèõ
ýòàïàõ ñèëüíåå îòëè÷àåòñÿ îò íîðìàëüíîãî îïëîäîòâîðåíèÿ, ÷åì êëîíèðîâàíèå. Âîçìîæíàÿ ïðè÷èíà - èñïîëüçîâàíèå íåçðåëûõ îîöèòîâ è èõ äëèòåëüíîå êóëüòèâèðîâàíèå.
Íåîáõîäèìû äàëüíåéøèå èññëåäîâàíèÿ íà áîëåå ïîçäíèõ
ñðîêàõ ðàçâèòèÿ. Ïî ðåçóëüòàòàì ðàáîòû ìîæíî ïðåäïîëîæèòü, ÷òî ïåðåíîñ ÿäðà äàåò áîëüøå øàíñîâ äëÿ ðàçâèòèÿ
ýìáðèîíà, îäíàêî òàêîå ïîëîæåíèå íå ñîâñåì îáîñíîâàííî, òàê êàê èçâåñòíû ìíîãèå ôóíêöèè ñïåðìàòîçîèäà â îïëîäîòâîðåíèè ïîìèìî ïåðåäà÷è ãåíåòè÷åñêîãî íàáîðà.
Êðîìå àêòèâàöèè îîöèòà, ñïåðìàòîçîèäû òàêæå âíîñÿò
ñâîþ ÐÍÊ, íåîáõîäèìóþ äëÿ ðàííåãî êîíòðîëÿ ðàáîòû ãåíîâ
[5, 6], èõ õðîìàòèí èìååò ñïåöèôè÷åñêóþ êàðòèíó ìåòèëèðîâàíèÿ, êîòîðóþ íå ìîæåò âîññîçäàòü îâîöèò. Òàêèì îáðàçîì, íåëüçÿ ïðåäïîëàãàòü ëó÷øåå ðàçâèòèå ýìáðèîíà ïðè
ïåðåíîñå ñîìàòè÷åñêîãî ÿäðà â ÿéöåêëåòêó, ÷åì ïðè èñêóññòâåííîì îïëîäîòâîðåíèè. Îäíàêî, ìîæíî óòâåðæäàòü, ÷òî
îîïëàçìà îêàçûâàåò îãðîìíîå âëèÿíèå íà õðîìàòèí è ðàáîòó ãåíîâ, ïåðåñòðàèâàÿ èõ â ñîîòâåòñòâèè ñ ïîòðåáíîñòÿìè ðàííåãî ýìáðèîíàëüíîãî ðàçâèòèÿ. Ñ öåëüþ âûÿñíåíèÿ
ãåíåòè÷åñêèõ ðàçëè÷èé ìåæäó êëîíèðîâàííûìè è íîðìàëüíûìè ýìáðèîíàìè ìûøè íà ñòàäèè áëàñòîöèñòû áûëà ïðîâåäåíà àíàëîãè÷íàÿ ðàáîòà è â ëàáîðàòîðèè Rudolf Jaenisch
[7]. Ó÷åíûå ïîäòâåðäèëè, ÷òî ïî ãåííîé àêòèâíîñòè è ïî
ðàçâèòèþ íà ýòîé ñòàäèè ÝÑÊ ìûøè èç ýòèõ ýìáðèîíîâ
àáñîëþòíî èäåíòè÷íû è èìåþò îäèíàêîâûé ïîòåíöèàë äëÿ
èñïîëüçîâàíèÿ â òåðàïåâòè÷åñêèõ öåëåé [7].  òî æå âðåìÿ,
îãðàíè÷åííûå ñðîêè ðàçâèòèÿ, ïðè êîòîðûõ ïðîâîäèëèñü
èññëåäîâàíèÿ, íå äàþò ïðàâà óòâåðæäàòü, ÷òî ýòî ïåðåïðîãðàììèðîâàíèå äîñòàòî÷íî äëÿ äàëüíåéøåãî ðàçâèòèÿ
îðãàíèçìà.
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Êëåòî÷íàÿ òðàíñïëàíòîëîãèÿ è òêàíåâàÿ èíæåíåðèÿ ¹ 1 (3), 2006
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