Liquid ALT (SGPT) Reagent Set Каталожный № HTI-A7526 Каталожные номера: Уровень снижения абсорбции прямо пропорционален активности АЛТ. HTI-A7526-120 HTI-A7526-600 Реагенты Назначение Набор предназначен для количественного определения аланинаминотрансферазы (АЛТ) в сыворотке крови. Клиническое значение Активность фермента аланинаминотрансферазы (АЛТ) определяется во многих тканях. Наиболее высокая активность АЛТ обнаружена в ткани печени, сердца, скелетной мускулатуры и почек. Однако, АЛТ считается более специфичным для печени, чем АСТ. При заболеваниях печени и желчного пузыря, таких как цирроз, метастатическая карцинома, вирусный гепатит происходит повышение уровня АЛТ. Повышение уровня АЛТ происходит и при таких состояниях как мышечная дистрофия, дерматомиозиты, острый панкреатит, инфекционный мононуклеоз. История метода Ультрафиолетовый метод для определения АЛТ был описан Henley в 1955 году и Wroblewski и La Due в 1956. Henry и соавт. в 1960 году. В 1974 году комитет по ферментам Скандинавского Общества Клинической Химии и Клинической Физиологии (Scandinavian Society for Clinical Chemistry and Clinical Physiology) рекомендовали этот метод в оптимальной модификации. В 1980 году Международная Федерация Клинической Химии (IFCC) рекомендовала совместное использование лактадегидрогеназа-НАДH. Процедура, описанная далее, основана на этом методе. Принцип теста L-аланин + α-кетоглутарат Пируват + NADH + H+ АЛТ ЛДГ Пируват + L-глутамат L-Лактат + NAD+ + H2O АЛТ катализирует перенос аминогрупп с L-аланина на α-кетоглутарат с образованием пирувата и Lглутамата. Лактатдегидрогеназа подвергается окислению, при этом NADH окисляется до NAD. После смешивания реагента А и реагента В концентрация L-аланиновой кислоты 500 мМ, α-кетоглутаровой кислоты 15 мМ, Лактатдегидрогеназы (микробная) > 2000 МЕ/мл, NADH 0,18 мМ, Буфер, 100мМ, Буфер рН 7,5+0,1, азид натрия 0,01. Стабилизаторы. Подготовка реагентов Смешать 5 объемов реагента R1 и 1 объем реагента R2 (например, 250 мл реагента R1 и 50 мл реагента R2). Хранение реагентов и стабильность 1. 2. Хранить в холодильнике при 2-80С. Неоткрытый набор можно использовать до истечения срока годности, который указан на этикетке набора. Растворенные реагенты стабильны в течение 2 дней при комнатной температуре (18250С) и 14 дней в холодильнике при 2-80С. Непригодные для анализа реагенты Не использовать реагент если: 1. Начальная абсорбция рабочего реагента против воды при 340 нм больше 0,800. 2. Изменились свойства реагента. Предостережения 1. Только для in vitro диагностики 2. Реагент R1 содержит в качестве консерванта раствор азида натрия <0.1% (w/v). Азид натрия при контакте с металлом может образовывать взрывоопасные соединения. Поэтому при удалении реагентов в сточные трубы (свинец) необходимо смывать их большим количеством проточной воды. Сбор и хранение образцов 1. Использовать только свежие, негемолизированные образцы сыворотки крови. 2. Концентрация фермента стабильна в течение 3 дней при комнатной температуре (15-300С), 7 дней в холодильнике при 2-80С и 30 суток в холодильнике при -200С. Влияние других соединений 1. Билирубин при концентрации 30 мг/дл, гемоглобин при концентрации 400 мг/дл, не оказывают влияние на результаты исследования. Liquid ALT (SGPT) Reagent Set Каталожный № HTI-A7526 Материалы, входящие в состав набора Реагенты АЛТ (SGPT): реагент R1, реагент R2. Материалы необходимые, поставляемые но не 1. 2. 3. 4. Автоматические пипетки. Пробирки Таймер Биохимический анализатор, для измерения абсорбции при длине волны 340 нм. 5. Термостатируемый блок / водяная баня (370С). Автоматический метод определения Wavelength: Assay Type: Sample/Reagent Ratio: Reaction Direction: Temperature: Lag Time: Read Time: Low Normal: High Normal: 340 nm Kinetic 1:10 Decreasing 37°C 60 seconds 60 seconds 5 U/L 34 U/L Существуют параметры измерения концентрации АЛТ на других анализаторах. Необходимо связываться со службой технической поддержки. Ручной метод определения 1. Приготовить рабочий реагент в соответствии с инструкцией. 2. Внести по 1,0 мл реагента в каждую пробирку. Инкубировать в течение 5 минут при 370С. 3. Настроить спектрофотометр на «0» по воде при 340. 4. Внести по 100 мкл исследуемых образцов сыворотки крови. Перемешать. Инкубировать в течение 1 минуты при 370С. 5. После инкубации измерить абсорбцию. Прогреть реакционную смесь до 370С. Повторить измерение 2 раза с интервалом в 1 минуту. 6. Определить изменение абсорбции в минуту (∆А/мин) 7. ∆А/мин помноженная на фактор 1768 (смотрите Подсчёт результатов) даст результат в IU/L. Замечания к проведению процедуры 1. Если используется спектрофотометр с автоматическим температурным контролем реакционной кюветы, считывание абсорбции должно проводиться в отдельной кювете. 2. Очень низкое последнее считывание, вместе с небольшим изменением абсорбции между считываниями могут отражать очень большой уровень АЛТ. Разбавьте и проведите тест заново если необходимо. Ограничения 1. В мутных и сильно иктеричных образцах начальная абсорбция может быть очень высокой. Рекомендовано для анализа использовать 50 мкл образца. Полученные результаты необходимо умножить на 2. 2. Если в исследуемом образце предполагаемая концентрация фермента выше, чем 500 МЕ/мл, то необходимо провести разведение: 1 объем исследуемой плазмы/сыворотки на 1 объем изотонического солевого раствора. Полученные результаты необходимо умножить на 2. Калибровка Процедура стандартизована по миллимолярной абсорбции NADH (6,22 при 340 нм) при стандартных условиях. Подсчет результатов Одна международная единица(IU/L) – это то количество фермента, которое при определенных условиях катализирует превращение 1 мкмоль субстрата за 1 минуту. АЛТ(МЕ/л)=(∆Аbs/минХ1,10Х1000)/(6,22Х0,10Х1,0)= =∆А/минХ1768 Где: ∆А/мин – изменение абсорбции в минуту. 1,10 – общий объем реакционной смеси (мл) 1000 – перевод МЕ/мл в МЕ/л. 6,22 – миллимолярная абсорбция NADH 0,10 – объем исследуемого образца, мл. 1,0 – длина светового пути, см. Пример подсчета: ∆А/мин = 0.12 тогда, 0,12Х1768=212 МЕ/л Внимание: если объемы реакционной смеси изменены, необходимо сделать пересчет результатов в соответствии с формулой. Международные единицы: для перевода в международные единицы (nkat/l) умножить концентрацию фермента в МЕ/л на 16,67. Liquid ALT (SGPT) Reagent Set Каталожный № HTI-A7526 Контроль качества Рекомендовано при каждом проведении серии анализов включать коммерческие контрольные сыворотки (патологические и нормальные) с известной концентрацией АЛТ. Рекомендовано в каждой лаборатории устанавливать свою частоту проведения контроля качества. Концентрация у практически здоровых лиц АЛТ: 4-24 МЕ/л при 300С, до 4-36 МЕ/мл при 370С. В каждой лаборатории необходимо устанавливать свои границы нормальных значений. Характеристики теста Линейность: 0-500 МЕ/л Сравнение Проведен корреляционный анализ результатов, полученных на данных тест-наборах и другого коммерческого тест-набора. Коэффициент корреляции составил 0,999, регрессионный анализ: у=0,96Х+3,2. (n=128, диапазон концентраций 7-625 МЕ/мл). Точность Внутри серии Среднее S.D. 30 106 381 0.7 0.8 3.1 C.V.% От серии к серии Среднее S.D. C.V.% 2.3 0.7 0.8 31 118 382 2.3 1.4 0.9 0.7 1.7 2.5 Чувствительность Определялась по изменению абсорбции изотонического солевого раствора при 340 нм и в образце сыворотки крови с известной концентрацией. Были проведены серии из 10 исследований. Результаты показали, что абсорбция в АЛТ реагенте практически не отличается от таковой в нулевом стандарте. Изменение абсорбции на 0,0004 примерно эквивалентно активности АСТ 1 МЕ/л. Произведено High Technology Inc. 109 Production Rd Walpole, MA 02081 USA Fax: 1 508 660-22-24 e-mail: medtech@htmed.com