Текст - 1.593 Mb - ФГБОУ ВО Красноярский ГАУ
реклама
0 Министерство сельского хозяйства Российской Федерации Красноярский государственный аграрный университет БИОХИМИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ С ОСНОВАМИ БИОТЕХНОЛОГИИ Учебное пособие Красноярск 2010 1 Министерство сельского хозяйства Российской Федерации Красноярский государственный аграрный университет БИОХИМИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ С ОСНОВАМИ БИОТЕХНОЛОГИИ Рекомендовано Сибирским региональным учебно-методическим центром высшего профессионального образования для межвузовского использования в качестве учебного пособия для студентов специальностей 260201.65 «Технология хранения и переработки зерна», 260202.65 «Технология хлеба, кондитерских и макаронных изделий», 260204.65 «Технология жиров, эфирных масел и парфюмерно-косметических продуктов», 260504.65 «Технология консервов и пищеконцентратов» всех форм обучения Красноярск 2010 2 ББК 28.4я73 Б 63 Рецензенты: Рубчевская Л.П. – д-р хим. наук, проф. каф. «Химическая технология древесины и биотехнология» СибГТУ Сорокин Н.Д. – д-р биол. наук, проф. СФУ Авторы: Машанов А.И., Величко Н.А., Федорова О.С., Машанов А.А. Б 63 Биохимия микроорганизмов с основами биотехнологии: учеб. пособие / А.И. Машанов [и др.]; Краснояр. гос. аграр. ун-т. – Красноярск, 2010. – 232с. Рассмотрены вопросы метаболизма – обмена веществ у микроорганизмов, даны характеристика биотехнологических процессов, способы получения витаминов, антибиотиков, ферментов, белковых препаратов с использованием микроорганизмов. Предназначено для студентов специальностей 260201.65 «Технология хранения и переработки зерна», 260202.65 «Технология хлеба, кондитерских и макаронных изделий», 260204.65 «Технология жиров, эфирных масел и парфюмерно-косметических продуктов», 260504.65 «Технология консервов и пищеконцентратов» всех форм обучения. ББК 28.4я73 Редактор В.А. Сорокина Санитарно-эпидемиологическое заключение № 24.49.04.953.П. 000381.09.03 от 25.09.2003 г. Подписано в печать 15.02.10. Формат 60х84/16. Бумага тип. № 1. Печать – ризограф. Усл. печ. л. 14,5 Тираж 110 экз. Заказ №327 Издательство Красноярского государственного аграрного университета 660017, Красноярск, ул. Ленина, 117 © Машанов А.И., Величко Н.А., Федорова О.С., Машанов А.А., 2010 © Красноярский государственный аграрный университет, 2010 3 Оглавление ВВЕДЕНИЕ ................................................................................................................. 6 ГЛАВА 1 МЕТАБОЛИЗМ МИКРООРГАНИЗМОВ ............................................ ..8 1.1 Дыхание………………………………………………………………19 1.1.1 Этапы энергетического обмена ........................................................ 20 1.1.2 Цикл Кребса .......................................................................................23 1.1.3 Анаэробное дыхание ........................................................................ 25 1.2 Фотосинтез ............................................................................................28 1.3 Питание микроорганизмов ................................................................. 32 1.3.1 Типы питания .................................................................................... 36 1.3.2 Классификация микроорганизмов по типу питания ..................... 40 1.4 Ферменты ............................................................................................. 42 1.4.1 Структура, механизм действия и свойства ферментов................. 44 1.4.2 Классификация ферментов .............................................................. 47 ГЛАВА 2 ТИПЫ БРОЖЕНИЯ ............................................................................... 51 2.1 Спиртовое брожение ........................................................................... 55 2.2 Молочнокислое брожение .................................................................. 58 2.3 Пропионовокислое брожение ............................................................ 63 2.4 Маслянокислое брожение .................................................................. 67 2.5 Ацетонобутиловое брожение ............................................................. 68 2.6 Смешанное брожение ......................................................................... 69 ГЛАВА 3 БИОСИНТЕЗ ОСНОВНЫХ БИОПОЛИМЕРОВ И РЕГУЛЯЦИЯ МЕТАБОЛИЗМА ........................................................... 71 3.1 Биосинтез аминокислот ...................................................................... 72 3.2 Биосинтез нуклеиновых кислот .........................................................73 3.3 Биосинтез углеводов ........................................................................... 73 3.4 Биосинтез липидов ..............................................................................75 3.5 Регуляция метаболизма ..................................................................... 75 ГЛАВА 4 МИКРООРГАНИЗМЫ И ИХ РОЛЬ В УТИЛИЗАЦИИ ПРИРОДНЫХ БИОПОЛИМЕРОВ .......................................................... ..80 4.1 Превращения безазотистых органических веществ ......................... 80 4.2 Превращение микроорганизмами соединений азота ........................ 86 4.3 Разложение других азотсодержащих соединений ............................ 94 ГЛАВА 5 ХАРАКТЕРИСТИКА БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ……………………………………………………………………………….97 5.1 Классификация процессов ферментации ........................................ 101 5.2 Составляющие биотехнологического процесса .............................102 5.3 Оборудование для биотехнологических процессов ...................... 110 ГЛАВА 6 ПРОИЗВОДСТВО ВИТАМИНОВ НА ОСНОВЕ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ ............................................ 120 6.1 Получение витамина В2 .........................................................................................................121 4 6.2 Получение витамина В12 ................................................................... 122 6.3 Получение витамина А и β-каротина .............................................. 126 6.4 Получение витаминов группы D ..................................................... 128 ГЛАВА 7 ПРОИЗВОДСТВО АНТИБИОТИКОВ НА ОСНОВЕ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ ........................................... 131 7.1 Получение пенициллина .................................................................. 134 7.2 Применение антибиотиков ............................................................... 139 ГЛАВА 8 ПРОИЗВОДСТВО ФЕРМЕНТОВ НА ОСНОВЕ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ .................................................................................. 141 8.1 Ферментативные особенности микроорганизмов ......................... 142 8.2 Получение микробных ферментных препаратов ........................... 145 ГЛАВА 9 ПРОИЗВОДСТВО ПИЩЕВЫХ КИСЛОТ НА ОСНОВЕ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ.................. 151 9.1 Получение уксусной кислоты ..........................................................151 9.2 Получение натурального уксуса ......................................................153 ГЛАВА 10 ПРОИЗВОДСТВО ОРГАНИЧЕСКИХ КИСЛОТ НА ОСНОВЕ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ.................. 157 10.1 Получение лимонной кислоты ...................................................... 157 10.2 Получение итаконовой кислоты ................................................... 161 10.3 Получение фумаровой кислоты .................................................... 162 10.4 Получение а -кетоглутаровой кислоты.......................................... 163 ГЛАВА 11 ПРОИЗВОДСТВО ЭТИЛОВОГО СПИРТА НА ОСНОВЕ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ.................... 165 11.1 Способы получения этилового спирта .......................................... 166 ГЛАВА 12 ПРОИЗВОДСТВО БЕЛКА НА ОСНОВЕ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ ....................................................... 173 12.1 Получение кормовых дрожжей.................................. . ...................174 12.2 Получение дрожжей на основе углеводородного сырья..............179 ГЛАВА 13 КУЛЬТИВИРОВАНИЕ КЛЕТОК, ОРГАНОВ И ТКАНЕЙ РАСТЕНИЙ............................................................................ 182 13.1 Культура каллусных тканей .......................................................... 183 13.2 Стерилизация .................................................................................. 187 13.3 Питательные среды......................................................................... 188 13.4 Влияние физических факторов на рост и развитие растительных тканей ……………………………………………………………………………190 13.5 Способы культивирования изолированных клеток и тканей для получения БАВ ...................................................................................................... 191 13.6 Растения и их культура изолированных клеток и тканей как промышленные источники БАВ .......................................................................... 193 13.7 Перспективы развития клеточной инженерии ............................. 194 ГЛАВА 14 БИОТЕХНОЛОГИЯ УТИЛИЗАЦИИ ОТХОДОВ СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА И ОБОГАЩЕНИЕ КОРМОВ .................... 196 14.1 Получение водорода и биогаза....................................................... 198 5 14.2 Получение кормовых добавок ........................................................ 200 14.3 Биотрансформация растительного сырья ..................................... 203 Библиографический список .................................................................................. 207 Тесты для проверки знаний .................................................................................. 210 Ключевые слова .....................................................................................................230 Приложения ...........................................................................................................231 6 Введение Микроорганизмы – мельчайшие живые организмы, выполняют огромную космическую функцию – поддерживают процесс круговорота веществ и энергии на земле. Они являются участниками круговорота азота и углерода. В связи с этим чрезвычайно важна роль микробов-сапрофитов, которые используют для своего питания белки, углеводы, жиры и другие органические вещества, попавшие в почву вместе с мертвыми животными и растительными остатками, и минерализуют их. В результате жизнедеятельности сапрофитов сложные органические соединения, входящие в состав животных, растительных продуктов, расщепляются до более простых веществ и в конечном счете минерализуются. Белки расщепляются гнилостными микробами до аммиака, сероводорода, углекислого газа, воды. Углеводы, жиры и другие органические безазотистые соединения также подвергаются глубокому расщеплению, превращаясь в углекислый газ и воду. Аммиак, образующийся при гниении белков, поступает в почву. Нитрифицирующие бактерии превращают его в соли азотистой, а затем азотной кислоты – в калийные и натриевые селитры – важнейшие питательные вещества для растений. Углекислый газ поступает в атмосферу. Растения усваивают образовавшиеся минеральные соли азота и углекислый газ, строят из них свой белок и тело и вновь могут быть использованы в пищу животными. Животные и растения после своей гибели снова попадают в почву и подвергаются воздействию микроорганизмов. Таким образом осуществляется круговорот органических веществ в природе, без которого жизнь на нашей планете была бы невозможна. Большое значение имеют микроорганизмы в производственной деятельности человека. С помощью дрожжей получают вино, спирт, пиво, хлеб. Молочнокислые бактерии используются для приготовления кефира, сметаны, творога, простокваши. Некоторые виды молочнокислых бактерий принимают участие в квашении овощей, силосовании кормов. При производстве сыра, органических кислот, уксуса, ацетона, витаминов, ферментов, аминокислот используются различные виды микроорганизмов. В процессе своей жизнедеятельности они способны синтезировать антибиотики – пенициллин, стрептомицин, биомицин, тетрациклин, грамицидин и др. Культивируемые на сахаристых отходах сельского хозяйства кормовые дрожжи накапливают белок. Такие дрожжи используются для повышения питательной ценности кормов. 7 В настоящее время микроорганизмы широко используются при утилизации растительного сырья сельскохозяйственных и лесопромышленных производств с целью получения пищевых продуктов – спирта, органических кислот, кормовых дрожжей, а также органических удобрений. В связи с этим важным является изучение физиологических, биохимических особенностей различных видов микроорганизмов и их роли в природе, промышленности и сельском хозяйстве. Учебное пособие составлено в соответствии с Государственными требованиями по специальностям 260504.65 «Технология консервов и пищеконцентратов», 260202.65 «Технология хлеба, кондитерских и макаронных изделий», 260204.65 «Технология бродильных производств и виноделие», 260201.65 «Технология хранения и переработки зерна» очной и заочной форм обучения. Цель обучения – выработать у студентов теоретические и практические знания по биохимическим процессам, осуществляемым микроорганизмами, и использованию их на предприятиях пищевой отрасли. Учебное пособие состоит из 14 глав. В первой главе содержатся основные сведения о метаболизме микроорганизмов. Во второй главе изложены типы брожения (спиртовое, маслянокислое, пропионовокислое, ацетоно-бутиловое, смешанное). В третьей главе рассмотрены вопросы биосинтеза основных биополимеров клетки и пути регуляции метаболизма. В четвертой главе рассмотрено участие микроорганизмов в превращении безазотистых соединений азота, аммонификации белков и аминокислот, нитрофикация, денитрофикация. В пятой главе пособия даны общая характеристика биотехнологических процессов, их классификация, оборудование биотехнологических производств. Главы 6-12, посвящены производству витаминов, антибиотиков, ферментов, пищевых кислот, этилового спирта, белка на основе биотехнологических процессов. В 13 главе пособия излагаются материалы по культивированию клеток, органов и тканей растений. В 14 главе представлена биотехнология утилизации отходов сельского хозяйства и обогащения кормов с помощью микроорганизмов. В конце учебного пособия приведены библиографический список, который может быть полезным студентам, а также тесты для проверки знаний, перечень ключевых слов. Данное учебное пособие по дисциплине «Биохимия микроорганизмов с основами биотехнологии» написано впервые для технологических специальностей пищевой и перерабатывающей промышленности. 8 ГЛАВА 1 МЕТАБОЛИЗМ МИКРООРГАНИЗМОВ Основу жизни микроорганизмов, как и всех других живых существ, составляет обмен веществ с окружающей средой. Микроорганизмы обладают необычайно интенсивным обменом веществ. При благоприятных условиях внешней среды (питательные вещества, температура, кислотность) одна клетка в состоянии потребить питательных веществ во много раз превышающих ее собственную массу, переработать, извлечь нужные вещества и энергию, а продукты распада вывести в окружающую среду в виде кислот, спиртов, газов, диоксида углерода, водорода, аммиака и других в зависимости от особенностей метаболизма данного вида. Прокариотная клетка может рассматриваться как система, сложенная четырьмя подсистемами: геномом – хромосомой c аппаратом репликации; аппаратом синтеза белка (рибосомой); цитоплазмой, включающей сеть метаболических путей с обслуживающими их ферментами; мембраной с энергодающим аппаратом синтеза АТФ и транспортными системами, осуществляющими взаимодействие клетки с внеклеточной средой. Цитоплазма клеток представляет собой «котел» метаболических превращений поступающих извне веществ, с образованием энергетических субстратов для АТФ-продуцирующего блока (катаболизм) и соединений-предшественников для синтеза компонентов клетки (анаболизм), и собственно место действия ферментов. Для некоторых организмов реакции катаболизма и анаболизма представляют два отдельных потока. Однако эта сеть не составляет вполне саморегулирующейся системы и поэтому существует система сигналов, служащих для регуляции обмена. Метаболизм бактерий – одна из важнейших характеристик их функционального разнообразия. Взаимодействие между подсистемами клетки ведет к тому, что ни одна из них не способна к самостоятельному существованию, клетка представляет систему, все части которой взаимозависимы, хотя и индивидуальны. Обмен веществ представляет собой комплекс сложных, разнообразных химических и биохимических превращений веществ пищи, поступающей из внешней среды (из субстрата). Питательные вещества подвергаются расщеплению, а из образующихся более простых соединений синтезируются новые макромолекулы белков, нуклеиновых 9 кислот, полисахаридов и другие сложные вещества, характерные для данной клетки. Этот процесс называется анаболизм, или строительный (конструктивный) обмен. Биосинтез сопровождается потреблением свободной энергии, которая вырабатывается в процессах дыхания, брожения или фотосинтеза, и сохраняется в виде макроэргических связей АТФ. Для его осуществления и для других жизненных функций (движения, размножения) микроорганизмы в основном получают энергию при высвобождении ее из безазотистых органических веществ. Только небольшая их часть может использовать солнечную энергию или энергию окисления минеральных соединений. В зависимости от того, каким путем идет разложение органических веществ, различают брожение, при котором продукты частично сохраняют свою органическую природу и высвобождение энергии происходит не в полной мере без доступа свободного кислорода, в анаэробных условиях; и дыхание, или окисление, когда выделение энергии происходит в аэробных условиях, а энергия высвобождается полностью, в качестве конечных продуктов окисления выделяются минеральные вещества – вода и углекислый газ. Микроорганизмы получают энергию в результате окислительновосстановительных превращений, поступивших в клетку органических и неорганических веществ, а тратят ее на различного рода внутренние синтезы, создание собственных веществ клетки, необходимых в процессе жизни. Этот процесс называется катаболизм, или энергетический обмен. Оба эти процесса – анаболизм и катаболизм – составляют обмен веществ организма в целом. Они находятся в тесной взаимосвязи и зависимости, неотделимы друг от друга и обуславливают рост, развитие и жизнеспособность клеток и называются вместе – метаболизм. Многие промежуточные продукты процессов энергетического обмена могут служить материалом для строительного обмена и наоборот. Одно и то же вещество может служить как материалом для синтеза, так и источником для расщепления и получения энергии. Особенностью всех биохимических реакций, протекающих к клетке, являются их ферментационный характер и поэтапность, позволяющая производить превращения без нарушения температурного постоянства клетки. Метаболизм бактерий в целом характеризуется тем, что в него могут быть вовлечено огромное разнообразие субстратов, при этом 10 интенсивность протекания превращений очень велика, и их общая направленность ориентирована на размножение клеток. Конечные продукты метаболизима выделяются во внешнюю среду, что существенно влияет на субстрат и изменяет его. Этот процесс широко используется в практике переработки растительного и животного, пищевого и непищевого сырья, получении целевых продуктов на основе микробного синтеза. Этим же объясняется быстрая порча пищевых продуктов при несоблюдении требований к хранению и обработке. Пластический обмен. Совокупность реакций биологического синтеза называют пластическим обменом (или ассимиляцией). Название этого вида обмена отражает его сущность: из простых веществ, поступающих в клетку извне, образуются вещества клетки. Конструктивный метаболизм направлен на синтез основных видов биополимеров. Так, белки образуются из аминокислот, предшественниками которых в клетке служат α-кетокислоты, полисахариды из простых сахаров, синтезируемых из пирувата. Нуклеиновые кислоты синтезируются из рибозо-5-фосфата и мононуклеотидов, липиды из ацетилкоэнзима и органических кислот (ацетат, малонат). Синтез протекает как серия последовательных реакций с образованием промежуточных продуктов метаболизма, которые могут быть использованы и в других целях. Совокупность всех протекающих в клетках микроорганизмов процессов распада питательных веществ, синтеза новых соединений и превращение энергии при этом, носит название метаболической мельницы. В ней используется два вида ферментативных реакций: гидролиз и окислениевосстановление. Почти все основные питательные вещества с теми или иными изменениями проходят через метаболическую мельницу и образуют фонд углеродных скелетов (основ) для дальнейших синтезов органических специфических веществ. Важнейшая форма пластического обмена – биосинтез белков. Все многообразие свойств белковых молекул, в конечном счете, определяется первичной структурой, т.е. последовательностью аминокислот в полипептидной цепи. Хромосома содержит генетическую информацию для собственной репликации за счет предшественников (азотистых оснований), а также информацию для синтеза белка. Геном бактерий представляет постоянную для вида компоненту. Важным итогом изучения генети- 11 ческой информации бактерий было установление последовательностей оснований, соответствующих многим отдельным генам. Огромное количество отобранных эволюцией уникальных сочетаний аминокислот воспроизводится путем синтеза нуклеиновых кислот (ДНК) с такой последовательностью азотистых оснований, которая соответствует последовательности аминокислот в белках. Каждой аминокислоте в полипептидной цепочке соответствует комбинация их трех нуклеотидов – триплет, находящийся в ядерном веществе в виде молекулы ДНК, или хромосом. Эта зависимость между основаниями и аминокислотами называется генетическим кодом. Если бы одно основание определяло положение одной аминокислоты в первичной структуре какого-то белка, то этот белок мог бы содержать только четыре вида аминокислот. Если бы каждая аминокислота кодировалась двумя основаниями, то с помощью такого кода можно было бы определить 16 аминокислот. Таким образом, только код, состоящий из трех последовательно расположенных оснований, мог бы обеспечить включение в белковые молекулы всех 20 аминокислот. В такой код входит 64 разных триплета – возможные сочетания трех из четырех азотистых оснований. Некоторые аминокислоты кодируются несколькими триплетами. Эта избыточность кода имеет большое значение для повышения надежности передачи генетической информации. В каждой молекуле ДНК, состоящей из миллионов нуклеотидных пар, записана информация о последовательности аминокислот в сотнях различных белков. Существуют триплеты, функцией которых является запуск синтеза полинуклеотидной цепочки, и триплеты, которые прекращают синтез, т.е. служат «знаками препинания». Одно из основных свойств кода – его специфичность. Нет случаев, когда один и тот же триплет соответствовал бы более чем одной аминокислоте. Код универсален для всех живых организмов и никогда не перекрывается, т.е. кодные триплеты транслируются, передаются в виде информации триплета м-РНК всегда целиком. При считывании информации с молекулы ДНК невозможно использование азотистого основания одной триплкомбинации с основаниями другого триплета. Для того чтобы синтезировался белок, информация о последовательности аминокислот в его первичной структуре должна быть 12 доставлена к рибосомам. Этот процесс включает два этапа: транскрипцию и трансляцию. Транскрипция (буквально – переписывание) информации происходит путем синтеза на одной из цепей молекулы ДНК одноцепочечной молекулы РНК, последовательность нуклеотидов которой точно соответствует (комплементарна) последовательности нуклеотидов матрицы – полинуклеотидной цепи ДНК. Существуют специальные механизмы «узнавания» начальной точки синтеза, выбора цепи ДНК, с которой считывается информация, а также механизмы завершения процесса. Так образуется информационная (матричная) РНК – м-РНК. Следующий этап биосинтеза – перевод последовательности нуклеотидов в молекуле м-РНК в последовательность аминокислот – трансляция. У прокариот (бактерий и сине-зеленых водорослей), не имеющих оформленного ядра, рибосомы могут связываться с вновь синтезированной молекулой м-РНК сразу же после ее отделения от ДНК или даже до полного завершения ее синтеза. У эукариот м-РНК сначала должна быть доставлена через ядерную оболочку в цитоплазму. Перенос осуществляется специальными белками, которые образуют комплекс с молекулой РНК. Кроме транспорта м-РНК к рибосомам эти белки защищают м-РНК от повреждающего действия цитоплазматических ферментов. Рибосома представляет РНК-содержащий аппарат синтеза белка из аминокислот-предшественников, поступающих из цитоплазмы, и расходует энергию, поступающую от энергодающего мембранного аппарата. Она действует в соответствии с командами, получаемыми через РНК-полимеразу от хромосомы. Рибосомальный аппарат может подвергаться самосборке во время роста клетки при необходимости синтеза белков. Он оценивается по суммарному содержанию РНК в клетке, различному в покоящемся состоянии и в период активного роста. В цитоплазме на один из концов м-РНК (именно на тот, с которого начинался синтез молекулы в ядре) вступает рибосома и начинает синтез полипептида. Рибосома перемещается по молекуле м-РНК не плавно, а прерывисто, триплет за триплетом. По мере перемещения рибосомы по молекуле м-РНК к полипептидной цепочке одна за другой пристраиваются аминокислоты, соответствующие триплетам м-РНК. Точное соответствие аминокислоты коду триплета м-РНК обеспечивается транспортной (т-РНК). Для ка- 13 ждой аминокислоты существует своя т-РНК, один из триплетов которой комплементарен строго определенному триплету м-РНК. Точно так же каждой аминокислоте соответствует свой фермент, присоединяющий ее к т-РНК. После завершения синтеза полипептидная цепочка отделяется от матрицы – молекулы м-РНК. Молекула м-РНК может использоваться для синтеза полипептидов многократно, как и рибосома. Описание трансляции и транскрипции приведено здесь очень упрощенно. Следует помнить, что биосинтез белков – процесс чрезвычайно сложный, связанный с участием многих ферментов и затратой большого количества энергии, значительно превышающего количество энергии образующихся пептидных связей. Поразительная сложность системы биосинтеза и ее высокая энергоемкость обеспечивают высокую точность и упорядоченность синтеза полипептидов. Описанные выше процессы конструктивного обмена – синтез веществ клетки из поступивших в нее извне питательных веществ, активный перенос этих веществ через цитоплазматическую мембрану и многие другие процессы жизни – протекают с затратой энергии. Процессом, противоположным синтезу, является диссимиляция – совокупность реакций расщепления. При расщеплении высокомолекулярных соединений выделяется энергия, необходимая для реакций биосинтеза. Поэтому диссимиляцию называют еще энергетическим обменом клетки. Энергетический обмен. Реакции энергетического обмена представляют важнейшую функцию микроорганизмов, связанную с их преимущественно химическим взаимодействием со средой. Это взаимодействие полностью определяется термодинамическими закономерностями. Живые организмы могут использовать не все виды энергии, существующей в природе. Недоступными для них являются ядерная, механическая, тепловая виды энергии. Доступными для живых систем внешними источниками энергии (энергетическими ресурсами) являются электромагнитная (физическая) энергия (свет определенной длины волны) и химическая (восстановленные химические соединения). Бактерии удивительно полно используют возможности получения энергии, но в этом отношении действует ряд ограничений, обусловленных способами ее превращения. Часто энергетическими ресурсами служат биополимеры, находящиеся в окружающей среде (полисахариды, белки, нуклеиновые кислоты), а также липиды. Прежде чем быть использованными, био- 14 полимеры должны быть гидролизованы до составляющих их мономерных единиц. Процесс расщепления биополимеров не связан с образованием свободной, т.е. доступной клетке, энергии. Происходящее при этом рассеивание энергии также невелико. Химическая энергия питательных веществ заключена в различных ковалентных связях между атомами в молекуле органических соединений. Например, при разрыве такой химической связи, как пептидная, освобождается около 12 кДж энергии на 1 моль. Образовавшиеся мономеры подвергаются в клетке дальнейшим ферментативным превращениям, которые сводятся к тому, чтобы путем перестройки химической структуры получить молекулы, которые могли бы включиться на каком-либо этапе в качестве метаболитов в функционирующие клеточные катаболические системы. Таких в прокариотной клетке несколько. Основные из них: путь Эмбдена – Мейергофа – Парнаса (гликолиз), окислительный пентозофосфатный путь, путь Энтнера – Дудорова и цикл трикарбоновых кислот (ЦТК). Общее для всех катаболических путей – многоступенчатость процесса окисления исходного субстрата. На некоторых этапах окисление субстрата сопряжено с образованием энергии в определенной форме, в которой эта энергия может использоваться в самых разнообразных энергозависимых процессах. Таким образом, внешние доступные организмам источники энергии (свет, химические соединения) должны быть трансформированы в клетке в определенную форму, чтобы обеспечить внутренние потребности в энергии. Прокариоты используют для получения энергии окислительновосстановительные реакции. Разнообразные соединения, способные окисляться, называются донорами электронов. Поскольку электроны не могут существовать самостоятельно, они обязательно должны быть перенесены на молекулы, способные их воспринимать и восстанавливаться. Такие молекулы называются акцепторам электронов. Способность использовать химическую энергию присуща всем без исключения организмам. Это относится как к природе окисляемых субстратов, которыми могут быть неорганические (например, Н2, S2, S°, S2O32, NH3, Fe2+, СО) или многочисленные органические соединения, так и окислителей (О2, Fe3+, NO3-, SO4 , S, CO2, органические вещества). Микроорганизмы используют в первую очередь субстраты, дающие наибольший выигрыш энергии. Возможность использовать 15 энергию химической реакции для организмов определяется изменением свободной энергии, т.е. той энергией, которая при постоянном давлении и температуре может быть превращена в работу. Биологическое окисление (в клетках) органических веществ происходит чаще путем дегидрогенерирования. Так как атом водорода состоит из протона (Н+) и электрона (е~), перенос водорода с одного вещества на другое включает и перенос электрона. Перенос водорода (электрона) от подвергающегося окислению вещества к акцептору осуществляется различными окислительно-восстановительными ферментами. Конечным акцептором водорода может быть кислород воздуха или другое вещество, способное восстанавливаться. У прокариот известны три способа получения энергии: дыхание, фотосинтез и разные виды брожения. Все организмы в зависимости от внешнего источника энергии делятся на две группы: автотрофные и гетеротрофные. Автотрофы – это организмы, осуществляющие питание (т.е. получающие энергию) за счет неорганических соединений. К ним относятся некоторые бактерии и все зеленые растения. В зависимости от того, какой источник энергии используется автотрофными организмами для синтеза органических соединений, их делят на две группы: фототрофы и хемотрофы. Для фототрофов источником энергии служит свет, а хемотрофы используют энергию, освобождающуюся при окислительно-восстановительных реакциях. Гетеротрофы получают энергию в процессе дыхания – биологического окисления сложных органических субстратов, являющихся донорами водорода. Водород от окисляемого вещества поступает в дыхательную цепь ферментов. Дыхание называют аэробным, если роль конечного акцептора водорода выполняет свободный кислород. Микроорганизмы, способные существовать только в присутствии кислорода, называются облигатным аэробами. В качестве источников энергии – доноров водорода – хемоорганогетеротрофы в процессе дыхания могут использовать разнообразные окисляемые органические соединения: углеводы, жиры, белки, спирты, органические кислоты и т.д. Источником энергии для биосинтеза клеточных веществ у хемоавтотрофов является химическая энергия, высвобождаемая в результате окисления кислородом воздуха неорганических соединений (NH3, H2S и др.). 16 Характерная особенность процессов биологического окисления – их многостадийность, обеспечивающая постепенное выделение свободной энергии, заключенной в сложных органических субстратах. Многостадийность энергетического метаболизма принципиально необходима для жизнедеятельности любого организма. Если бы в клетке окисление сложных веществ протекало в одну стадию, то одновременное освобождение нескольких сотен килоджоулей привело бы к выделению большого количества тепла, резкому повышению температуры и к гибели клетки, поскольку эффективность использования выделенной энергии ограничена возможностями системы АДФ – АТФ. Прокариоты могут окислять органические и неорганические вещества с использованием в качестве конечного акцептора электронов не молекулярного кислорода, а целого ряда органических и неорганических соединений. Окисление происходит в результате переноса электронов через локализованную в мембране дыхательную электронтранспортную цепь, состоящую из набора переносчиков, и приводит в большинстве случаев к восстановлению молекулярного кислорода до воды. Таким образом, в процессе дыхания молекулы одних веществ окисляются, других – восстанавливаются, т.е. окислительно-восстановительные процессы в этом случае всегда межмолекулярны. Наиболее широко распространена среди прокариот способность к окислению органическиех субстратов, которое может происходить различными путями: Прямым, т.е. присоединением к веществу кислорода. Непрямым, т.е. дегидрогенерированием (отнятием водорода). Отнятый от окисляемого вещества водород переносится на другое вещество, которое при этом восстанавливается. Путем переноса электронов (е~) от одного вещества к другому. Вещество, теряющее электроны, окисляется, а присоединяющее их – восстанавливается. В зависимости от конечного акцептора водорода хемоорганотрофные микроорганизмы делят на две группы: аэробы, окисляющие органические вещества с использованием молекулярного кислорода, который и является конечным акцептором водорода; 17 анаэробы, которые в энергетических процессах не используют кислород. Конечными акцепторами водорода служат органические или неорганические соединения. В процессах дыхания и фотосинтеза освобождающаяся при переносе электронов энергия запасается первоначально в форме электрохимического трансмембранного потенциала ионов водорода ΔμΗ+, т.е. имеет место превращение химической электромагнитной энергии в электрохимическую, последняя затем может быть использована для синтеза имеющей макроэргические связи аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ). Помимо АТФ в метаболизме клетки участвуют другие богатые энергией соединения, к ним относятся нуклеотид ди-и трифосфаты, аденозинфосфосульфат, ацилфосфаты (например, карбамоилфосфат), фосфоенолпируват. Важнейшим макроэргическим соединением для анаэробов служит ацетил-КоА. Однако все эти соединения обмениваются с АТФ и поэтому она представляется как универсальный переносчик энергии. Эти соединения характеризуются тем, что по крайней мере одна из входящих в состав молекулы групп имеет высокий энергетический потенциал. При переносе этой группы происходит разрыв связи, соединяющей ее с молекулой, что приводит к резкому уменьшению свободной энергии, заключенной в молекуле химического соединения. Такие связи называются высокоэнергетическими, или макроэргическими. Присоединение группы с высоким энергетическим потенциалом к молекуле-акцептору повышает уровень ее свободной энергии, переводя таким образом молекулу в активированную форму, в которой это соединение может участвовать в биосинтетических реакциях. Молекула АТФ состоит из азотистого основания аденина, сахара рибозы и трех остатков фосфорной кислоты. Аденин, рибоза и первый фосфат образуют аденозинмонофосфат (АМФ). Если к первому фосфату присоединяется второй, получается аденозиндифосфат (АТФ). Молекула с тремя остатками фосфорной кислоты (АТФ) наиболее энергоемка. Отщепление концевого фосфата АТФ сопровождается выделением 40 кДж, а не 12 кДж энергии, как при разрыве обычных химических связей. Реакция гидролиза АТФ соответствует следующим уравнениям: АТФ + Н2О = АДФ + Ф,G°'= -7,60 ккал/моль (-31,8 кДж/моль); АТФ + Н2О = АМФ + ПФ,G '= -9,96 ккал/моль (-41,7 кДж/моль); 18 Свободная энергия гидролиза составляет АТФ от 10 до 12 ккал/моль. Основной расход АТФ идет на синтез белка (около 40%) и транспортные процессы (25%). Благодаря богатым энергией связям в молекулах АТФ клетка может накапливать большое количество энергии в очень маленьком пространстве и расходовать ее по мере надобности. Синтез АТФ осуществляется в митохондриях. Отсюда молекулы АТФ поступают в разные участки клетки, обеспечивая энергией процессы жизнедеятельности. Малые размеры молекулы АТФ позволяют ей легко диффундировать в различные участки клетки, где необходим подвод энергии извне для выполнения химической, осмотической, механической работы. Макроэргические связи очень непрочны. Их разрыв приводит к высвобождению энергии (реакция с водой), реакция может происходить только при наличии специфических ферментов. Процесс образования АТФ называется фосфорилированием, он осуществляется в митохондриях у эукариот и на мембранах в ферментных системах у прокариот. Различают несколько способов фосфорилирования: субстратное, окислительное, фотофосфорилирование. Субстратное фотофосфорилирование – наиболее простой способ. Он используется бактериями и дрожжами при брожении. АТФ может синтезироваться путем субстратного фосфорилирвания чаще всего за счет переноса фосфорильной группы от богатого энергией соединения на АДФ. Реакциями такого типа являются реакции субстратного фосфорилирования на пути анаэробного превращения сахаров. Такой способ реализуется при гликолизе, разнообразных видах брожения и некоторых других процессах. Субстратное фосфорилирование осуществляется в цитоплазме и может быть воспроизведено в бесклеточных экстрактах. Брожение – анаэробный процесс биологического окисления сложных органических субстратов, при котором конечный акцептор О2 образуется из исходного субстрата в процессе распада. В результате накапливаются в среде вещества с разной степенью окисления. Второй механизм синтеза АТФ – мембранное фосфорилирование, зависит от наличия энергизованной мембраны и связано с использованием энергии трансмембранного электрохимического гради- 19 ента ионов водорода. Этот механизм реализуется в процессах дыхания (окислительное фосфорилирование) и фотосинтеза (фотофосфорилирование). 1.1 Дыхание Дыхание (окислительное фосфорилирование) используют многие аэробные микроорганизмы, к которым относят грибы, некоторые дрожжи и многие бактерии, подобно высшим организмам (растениям, животным), окисляют органические вещества полностью до минеральных веществ – углекислого газа и воды. Процесс этот (дыхание) и состоит из сложных окислительно-восстановительных реакций, последним акцептором электронов и протонов в нем является молекулярный кислород. Перенос электронов от донора к акцептору осуществляется по градиенту окислительного потенциала через ряд последовательно функционирующих переносчиков. Часть из них закреплена в мембране, а часть находится в цитоплазме и сопрягает эти два компонента клетки. Набор переносчиков характерен для каждого организма. Комплекс переносчиков электронов работает как универсальная структура для всех окисляемых веществ, лишь бы в метаболизме была реакция, совмещающая окислительное преобразование субстрата с цепью переноса электронов, на конце которой находится окислитель, например, для О2 – цитохромоксидаза. Вместе с тем универсальным продуктом реакции должна быть генерация АТФ. Она осуществляется мембранным ферментом АТФ-синтазой, катализирующим синтез АТФ путем конверсии энергии трансмембранного электрохимического градиента ΔμΗ+ в энергию АТФ. Для синтеза АТФ необходима разность окислительновосстановительных потенциалов порядка 200 мВ. Ниже этого порогового значения АТФ не может быть синтезирована. Для образования энергии в форме трансмембранного потенциала подобных ограничений нет. Поэтому энергия Δ μΗ+ может образовываться и потребляться клеткой в условиях, когда синтез АТФ невозможен. Таким образом, хотя каждая форма клеточной энергии может быть использована для осуществления химической, механической и осмотической работы, между ними существует определенное «разделение труда», например, большинство биосинтезов обеспечивается энергией АТФ, активный транспорт – энергией ΔμΗ+. В результате 20 окисления высокомолекулярных органических соединений образуется энергия, которая выделяется в среду или накапливается в виде макроэргических фосфатных связей АТФ. Фотофосфорилирование характерно для растений, водорослей и цианобактерий, зеленых и пурпурных бактерий. Эти группы фотосинтезирующих организмов способны улавливать энергию солнечного света посредством специальных пигментов (хлорофиллы, каротиноиды). Фотофосфорилирование происходит в световой фазе при поглощении кванта света пигментной системой и переносе электрона, отданного молекулой хлорофилла. Процесс аналогичен окислительному фосфорилированию аэробных микроорганизмов, так, как АТФ образуется при транспорте электронов через цепь переноса, преобразуется световая энергия в энергию химических связей. 1.1.1 Этапы энергетического обмена Первый этап – подготовительный. На этом этапе молекулы дии полисахаридов, жиров, белков распадаются на мелкие молекулы: глюкозу, глицерин и жирные кислоты, аминокислоты; крупные молекулы нуклеиновых кислот – на нуклеотиды. На этом этапе выделяется небольшое количество энергии, которая рассеивается в виде теплоты. Второй этап – бескислородный, или неполный, осуществляющийся в цитоплазме клеток. Он называется также анаэробным дыханием (гликолизом). Гликолиз (путь Эмбдена – Мейергофа – Парнаса) Он довольно универсален и свойствен многим аэробным и анаэробным микроорганизмам. 1. Вначале происходит активирование глюкозы путем фосфорилирования при участии АТФ и фермента фосфотрансферазы (гексокиназы). К молекуле глюкозы от молекулы аденозинтрифосфорной кислоты присоединяется концевой фосфатный остаток, обладающий макроэргической связью. Образуется глюкозо-6-фосфат, а АТФ превращается в аденозиндифосфорную кислоту (АДФ). 2. Глюкозо-6-фосфат путем изомеризации при участии фермента глюкозофосфатизомеразы переходит во фруктозо-6-фосфат. 3. Фруктозо-6-фосфат затем фосфорилируется за счет АТФ при участии соответствующей фосфотрансферазы (фосфофруктокиназы). Образуется фруктозо-1,6-дифосфат, а АТФ превращается в АДФ. 21 Вторичное фосфорилирование молекулы гексозы приводит к ее дальнейшему активированию. 4. Фруктозо-1,6-дифосфат расщепляется при участии фермента альдолазы на две молекулы фосфотриоз. Одна из них – фосфодиоксиацетон, другая – фосфат глицеринового альдегида. Оба эти вещества легко могут превращаться друг в друга. Дальнейшему превращению подвергаются две молекулы 3фосфо-глицеринового альдегида, так как фосфат диоксиацетона под действием фермента триозофосфатизомеразы превращается в 3фосфо-глицериновый альдегид. 5. Следующим этапом является окисление 3фосфоглицеринового альдегида. Эта реакция катализируется дегидрогеназой, коферментом которой является НАД·Н2, в окислении участвует фосфорная кислота. Молекула 3-фосфоглицеринового альдегида присоединяет фосфат, а водород переносится на кофермент НАД, который восстанавливается в НАД·Н2. Освобождающаяся при окислении фосфоглицеринового альдегида энергия сосредоточивается в макроэргической связи образующейся 1,3-дифосфоглицериновой кислоты. 6. В дальнейшем фосфатная группа 1,3-дифосфоглицериновой кислоты, имеющая макроэргическую связь, при участии фермента фосфоглицераткиназы переносится на молекулу аденозиндифосфорной кислоты. Образуется 3-фосфоглицериновая кислота, а АДФ превращается в АТФ. Таким образом, свободная энергия окисления альдегидной группы запасается в молекуле АТФ. 7. 3-Фосфоглицериновая кислота под влиянием фермента фосфоглицеромутазы превращается в 2-фосфоглицериновую кислоту. 8. Под действием фермента энолазы 2-фосфоглицериновая кислота, теряя воду, переходит в енольную форму фосфопировиноградной кислоты. При этом происходит перераспределение внутримолекулярной энергии, большая часть которой сосредоточивается в форме макроэргической фосфатной связи фосфоенолпировипоградной кислоты. 9. Фосфоенолпировиноградная кислота дефосфорилируется, образуется АТФ и пировиноградная кислота. Гликолитическое расщепление глюкозы до пировиноградной кислоты происходит без участия кислорода (анаэробная стадия) и заканчивается выходом двух молекул НАД·Н2 и две молекул АТФ. Синтезируется четыре молекулы, но 2 из них расходуются на фосфорилирование новой молекулы глюкозы. 22 В результате гликолиза молекула глюкозы распадается на две молекулы пировиноградной кислоты (С3Н4О3). В реакциях расщепления глюкозы участвуют фосфорная кислота и АДФ. В суммарном виде это выглядит так: С6Н12О6 + 2Н3РО4 + 2АДФ 2С3Н6О3 + 2АТФ + 2H2 О. У дрожжевых грибов молекула глюкозы без участия кислорода превращается в этиловый спирт и диоксид углерода (спиртовое брожение): С6Н12О6 + 2Н3РО4 + 2АДФ 2 С2Н5ОН + 2СО2 + 2АТФ + 2Н2О. У других микроорганизмов гликолиз может завершаться образованием ацетона, уксусной кислоты и т.д. Во всех случаях распад одной молекулы глюкозы сопровождается образованием двух молекул АТФ. В ходе бескислородного расщепления глюкозы в виде химической связи в молекуле АТФ сохраняется 40 % энергии, а остальная рассеивается в виде теплоты. Третий этап энергетического обмена – стадия аэробного дыхания, или кислородного расщепления. Реакции этой стадии энергетического обмена также катализируются ферментами. Вещество, отдающее водород или электроны, называется донором, а присоединяющие – акцептором. Переносы Н¯ и е¯ осуществляется специальными окислительно-восстановительными ферментами и без них невозможен. Все эти реакции многоступенчаты. АН2 + В А + ВН2 + энергия Q донор акцептор окисляется восстанавливается. Для аэробов конечным акцептором в многостадийном процессе окисления через ряд промежуточных соединений может быть кислород молекулярный, усваиваемый из атмосферы, для анаэробов конечным акцептором может быть органическое или неорганическое вещество, в зависимости от свойств микроорганизма. Различают полное и неполное окисление. Суммарная реакция полного окисления углеводов С6Н12О6 + 6 О2 6 СО2 + 6Н2О + 2820 кДж. Начальная стадия процесса до образования ПВК идентична брожению, но затем ПВК может быть окислена полностью в результате ряда последовательных реакций. Промежуточные соединения могут быть использованы клеткой для других целей. 23 Кислородное дыхание сопровождается выделением большого количества энергии и аккумуляцией ее в молекулах АТФ. Суммарное уравнение аэробного дыхания выглядит следующим образом: 2С3Н6О3 + 6О2 + 36Н3РО4 + 36АДФ — 6СО2 + 6Н2О + 36АТФ + 36Н2О. При доступе кислорода в клетке образовавшиеся во время предыдущего этапа вещества окисляются до конечных продуктов – Н2О и СО2. Таким образом, при полном окислении двух молекул пировиноградной кислоты образуются 36 молекул АТФ. Следовательно, основную роль в обеспечении клетки энергией играет аэробное дыхание. Классификация микроорганизмов по отношению к кислороду воздуха имеет градацию: Строгие – т.е. существуют только в условиях наличия (аэробы) или отсутствия (анаэробы) кислорода. Факультативные – т.е. при определенных условиях и постепенности способны синтезировать новые ферментные системы и в изменяющихся условиях перейти на другой способ получения энергии. В качестве энергетического материала в процессе дыхания микроорганизмы часто используют углеводы. При этом сложные ди-, три- и полисахариды ферментативным путем гидролизуются до моносахаров, которые и подвергаются окислению. Обязательным промежуточным продуктом в процессе биологического окисления глюкозы является пировиноградная кислота. 1.1.2 Цикл Кребса В процессе дыхания аэробных микроорганизмов пировиноградная кислота в дальнейшем подвергается полному окислению до СО2 и Н2О, вступая в сложный цикл превращений с образованием три- и дикарбоновых кислот, последовательно окисляющихся (отщепляется Н2) и декарбоксилирующихся (отщепляется СО2), носящий название цикл Кребса, или цикл трикарбоновых кислот (ЦТК). ПВК включается в цикл через промежуточное соединение ацетил-КоА, который образуется в результате взаимодействия ПВК с HSKoA. Последовательно протекающие реакции цикла: гидролиз, дегидрирование, дегидратация, декарбоксилирование – приводят к полному окислению аце- 24 тил-КоА и регенерации фермента HSKoA. Водород, отнятый дегидрогеназами в цикле, передается в дыхательную цепь ферментов, которая у аэробов кроме НАД включает ФАД, систему цитохромов и конечный акцептор водорода – кислород. Передача водорода по этой цепи сопровождается образованием АТФ. Первый этап фосфорилирования связан с передачей водорода от первичной дегидрогеназы на ФАД. Второе фосфорилирование происходит при переходе электрона с цитохрома б на цитохром с (схема окисления), третье – при передаче электрона кислороду. Таким образом, на каждые два атома водорода (электрона), поступивших в дыхательную цепь, синтезируется три молекулы АТФ. Окисление одной молекулы пировиноградной кислоты сопровождается выделением трех молекул углекислого газа и пяти пар водородных атомов. Водород, отщепленный от окисляемых в цикле Кребса кислот, посредством коферментов (НАД и НАДФ) соответствующих дегидрогеназ передается по так называемой «дыхательной цепи», состоящей из комплекса ферментов, к конечному акцептору – молекулярному кислороду. Водород восстановленного НАД-2Н передается на кофермент (ФАД) флавинового фермента, который восстанавливается в ФАД2Н. С восстановленной флавиновой дегидрогеназы водород передается на цитохром цитохромной системы, при этом атом водорода расщепляется на ион водорода (Н+) и электрон (е~). Цитохром из окисленной формы превращается в восстановленную. Восстановленный цитохром передает электроны следующему цитохрому и т.д. Цитохромы попеременно то восстанавливаются, то окисляются, что связано с изменением валентности железа, содержащегося в их простетической группе. Последний цитохром передает электроны цитохромоксидазе, восстанавливая ее кофермент. Завершающей реакцией является окисление восстановленной цитохромоксидазы молекулой кислорода. Кислород за счет передачи ему (с цитохромоксидазы) электронов активируется и приобретает способность соединяться с ионами водорода (Н+), в результате чего образуется вода. На этом и заканчивается у аэробов полное окисление исходного органического вещества. Освобождающаяся при переносе электронов в дыхательной цепи энергия затрачивается на синтез АТФ из АДФ и неорганического 25 фосфата. Образование АТФ одновременно с процессом переноса протона и электрона по дыхательной цепи ферментов называется окислительным фосфорилированием. В некоторых случаях электрон включается в дыхательную цепь на уровне ФАД или даже цитохромов. При этом соответственно уменьшается количество синтезируемых молекул АТФ. Суммарный энергетический итог процесса окисления 1 моля глюкозы составляет 38 молекул АТФ, из них 24 при окислении ПВК в цикле Кребса с передачей водорода дыхательную цепь ферментов. Таким образом, основное количество энергии запасается именно на этой стадии. Замечательно, что цикл Кребса универсален, то есть характерен как для бактерий и простейших, так и для клеток высших животных и растений. Промежуточные соединения цикла частично используются для синтеза клеточного вещества. Окисление питательных веществ не всегда идет до конца, в этом случае в среде накапливаются промежуточные продукты окисления. Неполное окисление органических соединений из жира. Дыхание обычно связано с полным окислением органического субстрата. Другими словами, конечные продукты распада, например, углеводов – только СО2 и Н2О. Некоторые бактерии, в частности, представители рода Pseudomonas и ряд грибов, не до конца окисляют углеводы. Образующиеся не полностью окисленные органические соединения, такие, как глюконовая, фумаровая, лимонная, молочная, уксусная кислоты и другие, аккумулируются в среде. Дыхание указанных организмов иногда неправильно называют аэробным, или окислительным, брожением, в то время как неполное окисление имеет гораздо меньше общего с брожением, чем с обычным дыханием. Неполное окисление, например, протекает лишь в присутствии кислорода, а брожение кислорода не требует. С энергетической точки зрения неполное окисление – выгодный для микроорганизмов процесс. 1.1.3 Анаэробное дыхание Эубактерии, у которых источником энергии служат процессы окисления неорганических соединений, были обнаружены в конце XIX в., и их открытие связано с именем С.Н. Виноградского. В качестве источников энергии хемолитотрофы могут использовать довольно широкий круг неорганических соединений, окисляя их при дыха- 26 нии. Дыхательные цепи хемолитотрофов содержат те же типы переносчиков, что и хемоорганотрофов. Разнообразие наблюдается только на периферических участках энергетического метаболизма, так как для окисления неорганических соединений, связанного с получением энергии, необходимы соответствующие ферментные системы. Например, у Thiobacillus ferrooxidans, получающего энергию в результате окисления двухвалентного железа, дыхательная цепь дополнена медьсодержащим белком рустицианином, непосредственно акцептирующим электроны с Fe2+. Используемые в качестве доноров электронов неорганические соединения различаются окислительно-восстановительными потенциалами. Хемолитоавтотрофные бактерии получают энергию в результате окисления неорганических соединений: Н2, NH4+, NO2-, Fe2+, H2S, S°, SO32-, S2O3-, CO. В большинстве случаев эти бактерии имеют цепь переноса электронов, во многих отношениях сходную с соответствующей системой других аэробных микроорганизмов. Перенос электронов по данной цепи приводит к образованию АТФ. Некоторые микроорганизмы способны использовать для окисления органических или неорганических веществ не молекулярный кислород, а другие окисленные соединения, например, соли азотной, серной и угольной кислоты, превращающиеся при этом в более восстановленные соединения. Процессы идут в анаэробных условиях, и их называют анаэробным дыханием: 2HNO3 + 12Н+ N2 + 6Н2О + 2Н+ ; H2SO4 + 8Н+ H2S + 4Н2О. У микроорганизмов, осуществляющих такое дыхание, конечным акцептором электронов будет не кислород, а неорганические соединения – нитраты, сульфаты и карбонаты. Таким образом, различия между аэробным и анаэробным дыханием заключаются в природе конечного акцептора электронов. Микроорганизмы, осуществляющие процесс дыхания за счет окисленных соединений азота и хлора, относятся к факультативным анаэробам. Они имеют две ферментные системы, позволяющие им переключаться с одного типа дыхания на другой в зависимости от присутствия в среде того или иного акцептора. При наличии двух акцепторов будет в первую очередь использоваться тот, который позволит получить больше энергии. Аэробное 27 дыхание дает три фосфорилирования, анаэробное два, тем не менее, если концентрация нитратов в среде намного больше, чем кислорода, то идет анаэробный процесс, так как решающим условием в этом случае является свободная энергия восстановления акцептора, которая прямо зависит от его концентрации. Основные типы анаэробного дыхания приведены в таблице. Энергетический процесс Нитратное дыхание и нитрификация Сульфатное и серное дыхание «Железное» дыхание Конечный акцептор электронов Продукты восстановления NO3, NO2 N02, NO, N2O, N2 So42-, S0 H2S Fe 3+ Fe 2+ Карбонатное дыхание CO2 CH4, ацетат Фумаратное дыхание Фумарат Сукцинат Анаэробное дыхание за счет нитратов называется денитрификацией. Окисленные соединения серы, хрома, углерода играют роль конечных акцепторов для разных видов микроорганизмов, относящихся к облигатным анаэробам. Сульфаты при этом восстанавливаются до сульфидов, диоксид углерода до метана, через ряд промежуточных последовательных ферментативных превращений. Свойство микроорганизмов переносить электроны на нитраты, сульфаты и карбонаты обеспечивает в достаточной степени полное окисление органического или неорганического вещества без использования молекулярного кислорода и обусловливает возможность получения большего количества энергии, чем при брожении. Микроорганизмы, для которых характерно анаэробное дыхание, имеют набор ферментов электронтранспортной цепи, цитохромоксидаза в них заменяется нитратредуктазой (при использовании в качестве акцептора электронов нитрата) или аденилсульфатредуктазой (при использовании сульфата), или другими ферментами. Микроорганизмы, способные осуществлять анаэробное дыхание за счет нитратов, – факультативные анаэробы, они относятся главным образом к родам Pseudomonas и Bacillus. Микроорганизмы, использующие сульфаты в анаэробном дыхании, относятся к анаэбам и принадлежат к родам Desulfovibrio, Desulfomonas и Desulfotomaculum. 28 При анаэробном дыхании выход энергии только на 10% ниже, чем в аэробном. Как разновидность способа получения энергии без использования кислорода, зачастую в экстремальных условиях микроорганизмы используют химические окислительно-восстановительные реакции, что еще раз подчеркивает их эффективность в преобразовании субстратов любого типа и высокую способность приспособиться к изменяющимся условиям. 1.2 Фотосинтез У фотосинтезирующих микроорганизмов процесс преобразования световой энергии, приводящий к синтезу АТФ и образованию восстановителя, необходимого для фиксации СО2, состоит из двух фаз: световой и темновой. В световой фазе кванты света – фотоны – улавливаются и взаимодействуют с молекулами специальных пигментов – бактериохлорофиллом, в результате чего эти молекулы на очень короткое время переходят в более богатое энергией «возбужденное» состояние. Затем избыточная энергия возбужденных молекул преобразуется в теплоту или испускается в виде света. Другая ее часть передается ионами водорода, всегда имеющимися в водном растворе вследствие диссоциации воды. Образовавшиеся атомы водорода непрочно соединяются с органическими молекулами – переносчиками водорода. Ионы гидроксила ОН- отдают свои электроны другим молекулам и превращаются в свободные радикалы ОН -. Радикалы ОНвзаимодействуют друг с другом, в результате чего образуются вода и молекулярный кислород. 4ОН- = О2 + 2Н2О. Таким образом, источником молекулярного кислорода, образующегося в процессе фотосинтеза и выделяющегося в атмосферу, является фотолиз – разложение воды под влиянием света. Кроме фотолиза воды, энергия света используется в световой фазе на восстановление НАДФ и синтеза АТФ. Это очень эффективный процесс: в хлоропластах образуется в 30 раз больше АТФ, чем в митохондриях тех же растений с участием кислорода. Таким путем накапливается энергия, необходимая для процессов, происходящих в темновой фазе фотосинтеза. Энергия света поглощается пигментами светособираюших антенных комплексов и передается в реакционный центр (РЦ), в кото- 29 ром происходит превращение электромагнитной формы энергии в энергию электрохимическую. Фотохимически активный хлорофилл или бактериохлорофилл РЦ переходит в электронно-возбужденное состояние и окисляется, отдавая электрон первичному акцептору. Дальнейшие процессы связаны с переносом электрона по электронтранспортной цепи (ЭТЦ), сопряженным с синтезом АТФ. Природа акцепторов электронов и состав переносчиков электронов у разных групп фототрофов различаются. Существенно, что часть переносчиков является общими для фотосинтетической и дыхательной электронтранспортной цепи, обусловливая у бактерий взаимосвязь процессов фотосинтеза и дыхания. Различают циклический или нециклический путь переноса электронов. Циклический путь, свойственный, например, пурпурным бактериям, обеспечивает синтез АТФ, но не восстановителя. Поэтому восстановление НАД у этих микроорганизмов происходит в результате АТФ-зависимого обратного переноса электронов. У зеленых серобактерий перенос электронов осуществляется по нециклическому пути, обеспечивая синтез АТФ и восстановление НАД. Донором электронов у цианобактерий, растений и эукариотных фототрофов является молекула воды, при этом кислород выделяется в окружающую среду. Это процесс оксигенного фотосинтеза, который имеет наибольшее распространение. Для пурпурных и зеленых бактерий характерен бескислородный, или аноксигенный, фотосинтез, так как он не способен использовать воду и донором электронов у них служит соединения серы, S°, Н2, Fe2+ или некоторые органические соединения. Главный акцептор электронов большинства микроорганизмов этой группы – СО2,. Но могут восстанавливаться также и нитрат, азот, ионы водорода. В комплексе химических реакций темновой фазы, для течения которой свет не обязателен, ключевое место занимает связывание СО2. В этих реакциях участвуют молекулы АТФ, синтезированные во время световой фазы, и атомы водорода, образовавшиеся в процессе фотолиза воды и связанные с молекулами-переносчиками: 6СО2 + 24Н C6H12О6 + 6Н2О. Ассимиляция углекислого газа фотосинтезирующими микроорганизмами происходит через пентозофосфатный восстановительный цикл, или цикл Кальвина. В этом цикле связывание СО2 происходит посредством активированной молекулы пентозы –рибулозо-1,5- 30 дифосфата. Для синтеза одной молекулы глюкозы требуется шесть оборотов цикла, затрачивается энергия 18 АТФ и 12 НАДФ·Н2. Поскольку молекулярный кислород не участвует в реакциях образования АТФ ни в одном из типов фотосинтеза, он может протекать в строго анаэробных условиях. И поэтому большинство микроорганизмов с бескислородным фотосинтезом – строгие анаэробы, у факультативных аэробов фотосинтетическое фосфорилирование подавляется кислородом. Помимо энергетических затрат на биосинтетические процессы, связанные с ростом, определенная часть клеточной энергии всегда тратится на процессы, не связанные непосредственно с ростом, они называются процессами поддержания жизнедеятельности. К специфическим функциям поддержания жизнедеятельности относятся: обновление клеточного материала, осмотическая работа, обеспечивающая поддержание концентрационных градиентов между клеткой и внешней средой, подвижность клетки и др. Энергию, расходующуюся на осуществление перечисленных функций, обозначают как энергию поддержания жизнедеятельности. Когда бактерии находятся в условиях, в которых у них по каким-либо причинам отсутствует рост и, следовательно, нет надобности в энергии для биосинтезов, у них и в этом случае не прекращаются определенные метаболические процессы. Примером крайнего проявления состояния покоя служат бактериальные эндоспоры, метаболическая активность которых находится на уровне, не всегда регистрируемом современными приборами. Однако и в этом случае она не равна нулю. В покоящихся организмах концентрации большинства молекул поддерживаются не статически, а динамически, т.е. процессы распада органических соединений и компенсирующие их биосинтетические процессы продолжаются и в состоянии кажущегося покоя. Активно обновляющимися клеточными веществами являются молекулы ферментных белков, РНК, материал клеточных стенок и мембран. Динамическое состояние свойственно почти всем метаболитам и структурам клетки, различие наблюдается только в отношении скоростей процессов обновления различных клеточных компонентов. Исключение составляют молекулы ДНК и некоторых бактериальных белков. В отношении ДНК понятно, что динамическое состояние генетического материала повышает опасность возникновения 31 ошибок при его обновлении и связанные с этим летальные последствия для организма. В условиях активного роста энергия, используемая в процессах обновления, составляет лишь небольшую часть общих энергетических расходов клетки. Значительная часть энергии поддержания жизнедеятельности расходуется на совершение осмотической работы. Энергия поддержания жизнедеятельности обычно составляет 10 –20 % всей энергии, расходуемой в энергозависимых процессах. Энергетический метаболизм в целом сопряжен с биосинтетическими и другими энергозависимыми процессами, происходящими в клетке, для протекания которых он поставляет энергию, восстановитель и необходимые промежуточные метаболиты. Сопряженность двух типов клеточного метаболизма не исключает некоторого изменения их относительных масштабов в зависимости от конкретных условий. Прокариоты, обладающие наиболее совершенными системами получения энергии (дыхание, фотосинтез), способны генерировать энергию в значительно большем количестве, чем необходимо для роста и обеспечения всех энергозависимых клеточных функций. Возможны такие условия, когда клетка запасает энергии больше, чем тратит. В этом случае она сталкивается с проблемой консервирования энергии. В молекулах АТФ энергия не хранится в течение длительного времени. Средняя продолжительность «жизни» молекул АТФ составляет около 1/3 секунды. Энергия в форме трансмембранного электрохимического градиента ионов водорода также не может накапливаться. В этих двух мобильных формах энергия может быть вовлечена только на идущие в настоящий момент энергозависимые процессы. Проблема консервирования энергии решена прокариотами путем синтеза восстановленных высокополимерных молекул, главным образом, полисахаридов, реже липидов или полипептидов. Молекулы запасных веществ плотно упакованы в гранулах и часто окружены белковой оболочкой. В таком виде они находятся в осмотически неактивном состоянии, что очень важно для клетки. Используются запасные вещества при необходимости восполнить недостаток получаемой энергии. 32 1.3 Питание микроорганизмов Микроорганизмы, как все живые существа, нуждаются в пище. Пищей принято называть вещества, которые, попав в живой организм, служат либо источником энергии для процессов жизнедеятельности, либо материалом для построения составных частей клетки. Питательные вещества поступают в клетку из окружающей среды через всю поверхность тела, поэтому процесс происходит очень быстро и интенсивно: за сутки потребляется в 20 – 30 раз больше массы, чем собственная. Поступление питательных веществ не простой механический процесс, так как нет специальных органов для принятия пищи. Он проходит путем всасывания в виде относительно небольших молекул из водного раствора (осмотрофно) за счет диффузии и адсорбции. Это сложный физико-химический процесс, в котором большую роль играет консистенция, строение, растворимость, размеры молекул, рH среды, наличие ферментов, изоэлектрическая точка вещества и другие факторы. Цитоплазматическая мембрана обладает полупроницаемостью, она является осмотическим барьером; проницаемость ее для различных веществ неодинакова. Транспорт обеспечивает поступление веществ из среды в клетку и выделение продуктов обмена, определяя взаимодействие со средой. В деятельности осмотрофного организма первостепенное значение имеет его способность быстро и до минимальной концентрации использовать субстрат. Мембрана бактерий в принципе селективна и может лишь допускать некоторые вещества, не допуская в то же время выноса веществ из клетки. Разделение зарядов липидной мембраной как основа энергетического обмена и окислительного фосфорилирования сразу же ограничивает возможность проникновения в нее заряженных ионов. Посредством энергодающей мембраны осуществляется электрохимическое преобразование энергии во внутреннюю энергию мембраны и синтез АТФ. В мембране расположен механизм трансмембранного переноса веществ: субстратов – внутрь клетки, продуктов – наружу. Система транспорта определяет сродство клетки к субстратам метаболизма и соответственно эффективность осуществляемых ею химических реакций. Некоторые молекулы поступают в клетку путем пассивной диффузии до выравнивания концентраций. Если в клетке происходит по- 33 требление такого вещества, то создается направленный градиент и вещество проходит через липофильную мембрану. Важнейшим веществом, пассивно проходящим через мембрану, является кислород, реагирующий на внутренней стороне мембраны с цитохрдмоксидазами. Свободно проходят через мембрану молекулы воды, для которых имеются водяные поры, но не растворенные в ней вещества; вода обеспечивает осмотическое состояние клетки. Пассивная диффузия свойственна липофильным соединениям, включая спирты, жирные кислоты. Диффузия важна не только для проникновения веществ в клетку, но и для удаления из клетки продуктов обмена. Труднорастворимые и крупномолекулярные полимерные органические вещества (белки, жиры, углеводы) подвергаются предварительному гидролизу экзоферментами, расщепляются на составляющие: аминокислоты, углеводы, жирные кислоты, минеральные – на ионы, а затем поступают внутрь клетки, где являются основой для строительства собственных веществ клетки и источником энергии. Такое внеклеточное переваривание свойственно только микроорганизмам. Известно несколько путей проникновения питательных веществ в клетку: пассивная диффузия, облегченная диффузия, активный транспорт, перенос групп (радикалов). Пассивная диффузия подчиняется законам осмоса. При осмотическом проникновении веществ через полупроницаемую мембрану движущей силой является разность осмотических давлений (концентраций веществ) в растворах по обе стороны мембраны, т.е. между средой и клеткой. Такой пассивный перенос веществ – по градиенту концентрации (от более высокой к более низкой) – протекает до уравнивания концентрации и не требует затрат энергии клеткой. Кислород и вода – основные вещества, которые проникает в клетку и выделяются из нее путем пассивной диффузии. Скорость диффузии может быть увеличена за счет механизма облегченной диффузии, в котором участвуют пермеазы (от англ. permeable – проницаемый) – белки-переносчики, локализованные в цитоплазматической мембране. Пермеазы сходны с ферментами, обладают субстратной специфичностью – каждая транспортирует определенное вещество. На внешней стороне цитоплазматической мембраны пермеаза адсорбирует вещество – вступает с ним во временную связь, претерпевает конформационные изменения, диффундирует комплексно через мембрану, отдавая на внутренней стороне ее транспортируемое вещество в цитоплазму, в результате чего вещест- 34 во переносится через мембрану в область его более низкой концентрации. В клетку из питательной среды могут поступать только те вещества, для которых в цитоплазматической мембране имеются соответствующие пермеазы. Таким образом, мембрана является не только осмотическим барьером, но обладает и избирательной проницаемостью. Облегченная диффузия ускоряет процесс выравнивания концентраций, но не может привести к конпентрированию вещества внутри клетки по сравнению с внешней средой. Перенос веществ с помощью пермеаз может протекать как при пассивной диффузии, по законам осмоса – по градиенту концентрации. Это так называемая облегченная диффузия протекает без затрат энергии. В процессе дыхания в локализованной мембране дыхательной цепи осуществляется вывод протонов через мембрану и создается градиент электрохимического (трансмембранного протонного) потенциала между наружной и внутренней стороной мембраны, который обусловливает фосфорилирование (образование АТФ), или используется непосредственно транспортными системами. Трансмембранные белки представляют важнейшее приспособление клетки для взаимодействия с окружающей средой, перенос веществ из питательной среды в клетку может осуществляться белками пермеазами и транслоказами против градиента концентрации (т.е. из слабого раствора в более концентрированный) из раствора в клетку. Они осуществляют не только перенос молекул через мембрану, но и активный транспорт, который позволяет избирательно концентрировать внутри клетки необходимые ей вещества против градиента и, по сути, представляют специфическую химическую реакцию, осуществляется с затратой энергии. От активного транспорта зависит аффинность (сродство) клетки к субстрату – важнейший признак, определяющий и набор, и концентрацию используемых веществ, т.е. зависящую от концентрации кинетику роста. Такой активный перенос требует затрат энергии трансмембранного потенциала или АТФ, которая образуется в результате обмена веществ (окислительно-восстановительные реакции) внутри клетки и активизирует пермеазы. При этом концентрация транспортируемого вещества в клетке может значительно превысить его концентрацию в питательной среде. 35 Перенос через мембрану веществ без их химической модификации, осуществляемый с использованием энергии трансмембранного потенциала, включает три основных механизма: 1) унипорт, когда субстрат (обычно катион, органический или неорганический) транспортируется белком – переносчиком через мембрану, причем другие ионы при этом не переносятся; 2) симпорт, когда транспортный белок обеспечивает перенос через мембрану молекулы субстрата и одновременно протон или ион; 3) антипорт, когда осуществляется перенос субстрата; одновременно с противоположно направленным переносом протона или другого иона. В двух последних случаях молекула транспортируемого субстрата может быть как заряженной, так и незаряженной. В комплексе с диффузионными процессами разной природы имеет место и обменная адсорбция – способность электрически заряженной поверхности микробной клетки притягивать вещества с противоположенным зарядом из питательного раствора, при этом реакция среды pH определяет величину и знак заряда. Знак заряда поверхности клетки зависит от pH в сравнении с изоэлектрической точкой цитоплазмы, при кислой реакции он (+), а при щелочной (-). Адсорбированные вещества проникают внутрь через поры: у бактерии d = 9–74 нм, у грибов 4–7 нм. В этом процессе участвуют ионы Н+ НСО-3, они образуются в клетке в процессе дыхания и накапливаются в наружном слое цитоплазмы, прилегающем к оболочке, выходят наружу, обмениваясь на другие ионы (катионы и анионы). Выход продуктов распада происходит путем пассивной или облегченной диффузии. В клетке поступление веществ внутрь (биосинтетические продукты) почти всегда преобладает над распадом и способствует росту и размножению клеток. Кроме того, важное значение для скорости поступления веществ в клетку имеет концентрация питательных веществ внутри и снаружи. Внутри клетки показатели концентраций обычно выше, чем водных растворов, в которых обычно живут микроорганизмы. Разница этих давлений по обе стороны цитоплазматической мембраны обеспечивает поступление воды и других веществ путем пассивной диффузии, без затраты энергии. Скорость этого процесса невелика и обеспечивает поступление лишь некоторых веществ. При постоянном токе воды внутрь клетки 36 цитоплазма находится в набухшем состоянии и плотно прижата к оболочке. Такое постоянное напряжение клеточного содержимого называется тургором и является одним из наиболее важных условий роста клетки. При увеличении концентрации клеточного раствора – добавлении соли или сахара – бактериальная клетка обезвоживается, цитоплазма сокращается, отходит от стенок клетки, она становится вялой и расслабленной, т.е. наступает плазмолиз, что может привести к гибели. Иногда его создает человек искусственно. При консервировании избыток концентрации соли или сахара создает условия, неблагоприятные для микроорганизмов, что способствует сохранению продуктов. Наиболее устойчивы к плазмолизу: сенная палочка, стафилококки, сарцины. Легко поддаются плазмолизу: кишечная палочка, холерный вибрион, возбудитель сибирской язвы. Поэтому часто при лечении кишечных расстройств рекомендуют принимать концентрированные растворы солей Mq, Ca, Na, K и других в комплексе. Однако в природе существуют и осмофильные микробы, которые благодаря своим физиологическим особенностям обмена и строения успешно развиваются на средах с высокими концентрациями. 1.3.1 Типы питания Пища должна содержать такие вещества, которые удовлетворяли бы потребность микроорганизма в химических элементах, необходимых для синтеза веществ и структур клетки. В зависимости от того, какие химические элементы поступают из веществ питательной среды, последние называют их источниками (источник углерода, азота, фосфора и т.д.). Известно, что до 90 % и более сухой массы клеток микроорганизмов составляют четыре химических элемента – водород, кислород, углерод и азот, которые наряду с серой и фосфором составляют группу биогенных элементов, входящих в состав всех биополимеров клетки. Кислород и водород все микроорганизмы получают из воды. Потребности различных микроорганизмов в отношении источников углерода и азота весьма разнообразны. 37 Источники углерода. Углерод в сухом веществе клеток составляет около 50%, поэтому этот элемент должен составлять основную долю питательных веществ. В зависимости от используемого в конструктивном обмене источника углерода, микроорганизмы делят на две группы: автотрофы и гетеротрофы. Автотрофы в качестве единственного источника углерода для синтеза органических веществ тела используют углекислоту (СО2). Гетеротрофы не могут использовать в качестве источника углерода только углекислый газ, они нуждаются в готовых органических соединениях. Разница между ними в том, что гетеротрофы не обладают способностью использовать минеральные соединения в качестве энергетического материала при усвоении углерода из углекислоты. Соответственно по источнику углерода различают и типы питания: автотрофный и гетеротрофный. Автотрофы для превращения не имеющей энергетической ценности углекислоты в органические вещества нуждаются в постороннем источнике энергии. Одни автотрофы в этих целях используют световую энергию – этот процесс называется фотосинтезом. Другие используют химическую энергию, высвобождающуюся при окислении простых неорганических соединений, – этот процесс называется хемосинтезом. Источники азота. Все автотрофные микроорганизмы усваивают азот из неорганических соединений. У хемогетеротрофов по отношению к источнику азота, как и по отношению к источнику углерода, проявляется избирательность. Паразиты используют органические азотсодержащие вещества клеток хозяина. Источником азота для сапрофитов могут служить как органические, так и неорганические азотсодержащие соединения. Одни способны расти только на субстратах, содержащих сложные азотсодержащие вещества (азотистые основания, пептиды, большой набор аминокислот), так как сами синтезировать их из более простых соединений не способны. Другие могут развиваться при ограниченном числе органических соединений азота, например, в субстратах, содержащих только некоторые аминокислоты и даже одну-две из них, а все остальные необходимые для синтеза белков клетки синтезируют сами. Они дезаминируют взятые аминокислоты, а образующийся аммиак используют в реакциях аминирования оксикислот или чаще кетокислот, например: 38 NH3 + Н2 + НООССН2СОСООН HOOCCH2CHNH2COOH + Н2О. щавелевоуксусная аспарагиновая кислота. Синтез новых аминокислот может протекать и без дезаминирования взятых из субстрата аминокислот (без промежуточного образования аммиака) путем их перестройки (переаминирования) – переноса аминогруппы с аминокислоты на кетокислоты при участии ферментов аминотрансфераз. Многие сапрофиты (бактерии, грибы, дрожжи) вообще не нуждаются в органических соединениях азота, используя неорганические его соединения, лучшими из которых являются соли аммония. Азот в состав компонентов клетки входит главным образом в восстановленной форме. Используя в качестве источника азота нитраты или нитриты, микроорганизмы восстанавливают эти окисленные формы азота с образованием аммиака, который и используется в биосинтетических процессах. Существуют сапрофиты, которые используют свободный азот атмосферы. Они переводят его в связанное состояние – восстанавливают в аммиак. Эти микроорганизмы называют азотфиксаторами. Специфичностью отношений микроорганизмов к источникам углерода и азота определяется круговорот этих элементов в природе. Эта особенность гетеротрофов проявляется и при порче многих пищевых продуктов, при смене развития одних форм другими. Питательные вещества обычно усваиваются легче, если их молекулярное строение близко к строению веществ цитоплазмы клетки. Количество питательных веществ, необходимых для поддержания жизни микробной клетки, очень велико. За сутки клетка может переработать объем пищи, в 25 – 30 раз превышающий ее собственный. По потребностям в азотсодержащих веществах микроорганизмы разделяются на: аминогетеротрофы, нуждающиеся в органическом азоте готовых аминокислот; аминоавтотрофы, синтезируюшие белки из минеральных источников или простейших форм органического азота типа мочевины; нитрифицирующие бактерии, ассимилирующие азот из аммиачных и аминокислых солей. азотфиксирующие бактерии усваивают элементарный азот. В обменных процессах подавляющее большинство прокариот использует азот в восстановленном виде, поэтому нитраты перед включением в органические соединения должны быть переведены в 39 аммиачную форму. Это соли аммония, мочевины, органические соединения (аминокислоты или пептиды). Восстановление нитратов до аммиака осуществляется посредством последовательного действия двух ферментов – нитрат- и нитритредуктазы. Для синтеза клеточных веществ нужны и различные зольные элементы: сера, фосфор, калий, кальций, магний, железо. Хотя потребность в них незначительна, но при недостатке в питательной среде даже одного из этих элементов микроорганизмы не будут развиваться, так как эти элементы входят в состав многих ферментных систем, обеспечивающих все основные реакции метаболизма. Витамины входят в состав простетических групп ферментов, обеспечивающих рост и развитие клетки, поэтому витамины нередко называют ростовыми веществами. Некоторые микроорганизмы способны сами синтезировать витамины из веществ питательной среды, накапливать их и выделять из клетки наружу в количествах, значительно превышающих собственные потребности. Такие микроорганизмы используют для промышленного производства витаминов. Так с помощью гриба Eremothecium ashbyii получают витамин В2. Некоторые актиномицеты, пропионовокислые бактерии, метанообразующие (перерабатывающие различные органические вещества в метан) бактерии применяются для получения витамина B12. Сера входит в белки в виде группы – S-H-, – S-S – усваивается микроорганизмами из сернокислых солей, которые восстанавливаются и используются для синтеза аминокислот, содержащих серу. Серобактерии и тионовые бактерии ассимилируют молекулярную серу. Паразитические бактерии усваивают серу из органических соединений, содержащих готовую сульфгидрильную группу – SH. Фосфор входит в состав протоплазмы, фосфолипидов двухкомпонентных ферментов. Без фосфора развитие микроорганизмов невозможно. Фосфор находится в составе органических веществ только в окисленном состоянии в форме окисла P2O5. Лучшим источником фосфора являются соли ортофосфорной кислоты. Калий играет существенную роль в превращениях углеводородов и синтезе клеточного вещества. Активизирует ферментативные системы, ускоряет физиологические процессы. Магний входит в состав хлорофилла у зеленых и пурпурных серобактерий и служит активатором ряда ферментов (карбоксилаза, пептидаза, гексокиназа), иногда входит в их состав в виде комплекс- 40 ных соединений. Основная масса магния в виде ионов или магний органических соединений. Источник магния – соли. Кальций. Пока точно не установлено значение кальция, он нужен для роста, но его избыток вреден. Источником кальция являются водорастворимые соли. Железо входит в состав геминов, которые являются простетическими группами ферментов – цитохром, геминного. Без железа активность окислительных ферментов ничтожна. Наличие железа влияет на усвоение плесневыми грибами нитратного азота. Источник – сернокислые и другие соли. Для нормального роста микроорганизмов нужны: B, Zn, Mn, Co, Ni, I, Br, Mo, которые необходимы в мизерных количествах, но полноценный обмен веществ и энергии в микробной клетке без этих элементов невозможен. Для характеристики питания, использования микробных клеток при получении целевых продуктов, подбора сред для культивирования необходимо знать, в каком виде микроорганизмы способны усваивать биогены, что является источником энергии и донора электронов для протекания процессов метаболизма. Обладая прокариотным строением клетки, бактерии могут использовать только растворенные в воде вещества. Растворение твердых органических полимеров осуществляется под действием экзоферментов – гидролаз. Поэтому эту группу организмов называют гидролитики. Растворимые полимеры относятся к легкоусвояемым веществам и растворяются под действием гидролаз до низкомолекулярных веществ, транспортируемых в клетку. Например, под действием амилаз растворяется крахмал, протеаз – белковые вещества. Гидролитики разделяются на сахаролитические, пептолитические, липолитические. 1.3.2 Классификация микроорганизмов по типу питания Все прокариоты способны использовать только растворенные вещества, проходящие через мембрану, так же, как и грибы, и фототрофы. Учитывая природу основного источника углерода и природу источника энергии, используемой при синтезе органических веществ, микроорганизмы по типам питания можно подразделить на следующие группы. 41 Хемо-органо-гетеротрофы используют химические реакции в качестве источника энергии АТФ, донором электронов служат органические вещества, а свое вегетативное тело-таллом строят из органического углерода. Таким типом питания обладают многочисленные бактерии, грибы, дрожжи. Существуют за счет использования органических веществ различных субстратов животного и растительного происхождения. Такие микроорганизмы называют сапрофитами. К ним относятся микроорганизмы, которые разлагают различные органические вещества в природе (в почве, воде), вызывают порчу пищевых продуктов или используются в процессах переработки растительного и животного сырья. Многие сапрофиты всеядны, т.е. способны использовать в качестве источника углерода разнообразные органические соединения; некоторые проявляют выраженную специфичность (избирательность) в отношении источника углерода. Существуют и такие, которые используют только определенное вещество, их называют субстрат специфичными микроорганизмами. Примером могут служить целлюлозные бактерии, для которых клетчатка является единственным источником углерода. Сапрофиты наряду с органическими соединениями используют и СО2, вовлекая его в обмен веществ. Углекислый газ служит дополнительным источником углерода для биосинтеза веществ тела. Хемо-органо-автотрофы – используют химические реакции как источник АТФ, донором электронов служат органические вещества, но источником углерода для образования собственных веществ тела является углекислый газ. Хемо-лито-гетеротрофы – энергия АТФ в результате химических реакций, донор электронов – неорганические вещества, а углерод для конструктивного метаболизма (построения собственных веществ тела) – готовые органические вещества: сульфатвосстанавливающие бактерии. Хемо-лито-автотрофы – энергия – химические реакции, донор электронов – неорганические вещества, углерод – неорганический СО2. Относящиеся к этой группе бактерии живут в водоемах, почве: они специфичны в отношении окисляемого ими вещества. Это бактерии, окисляющие водород с образованием воды (водородные бактерии), аммиак до нитратов (нитрифицирующие бактерии), сероводород до серной кислоты (бесцветные тионовые серобактерии), а также окисляющие закисное железо в окисное (железобактерии). 42 Фото-лито-гетеротрофы – энергия света, донор электронов – неорганические вещества, но нуждаются для роста и построения собственных веществ тела в органическом веществе: Rhodopseudomonos, Rhodomicrobium, Thiosarcina. Фото-лито-автотрофы – энергия света, донор электронов – химические реакции, источник углерода – углекислота (неорганический): цианобактерии, водоросли, анаэробные пурпурные и зеленые серные бактерии. Это преимущественно водные бактерии, в них содержатся различные пигменты (каротиноидные, бактериохлорофиллы), поглощающие свет. Фото-органо-гетеротрофы – энергия образуется за счет света, донором электронов и источником углерода – готовые простые органические вещества: пурпурные несерные бактерии. Именно микроорганизмы играют важнейшую роль в круговороте веществ в природе благодаря своим широчайшим возможностям использовать практически любые субстраты и условия для получения энергии и пластического обмена. 1.4 Ферменты Ферменты, или энзимы, составляют самый крупный и наиболее высокоспециализированный класс белковых молекул. Ферменты синтезируются самой клеткой и выполняют в ней функции катализаторов биохимических реакций. Катализаторами называются вещества, которые, участвуя в реакции, изменяют ее скорость, но сами к концу реакции остаются химически неизмененными. Химическое взаимодействие молекул происходит только в результате их столкновения при условии, что в этот момент они обладают некоторым избытком свободной энергии G, достаточным для перехода их в активированное (переходное) состояние. Скорость реакции пропорциональна концентрации активированных молекул. Сущность действия катализатора состоит в том, что он, связывая реагирующие вещества, приводит к появлению нового переходного состояния, для которого свободная энергия активации G существенно ниже, чем в некатализируемой реакции. Следует отметить, что введение катализатора не отражается на суммарном энергетическом эффекте реакции AG и не изменяет состояния равновесия в реагирующей системе. 43 Катализ называют гомогенным, если катализатор и реагирующие вещества находятся в одной фазе, и гетерогенным, если они образуют две фазы. Ферментативный катализ обычно рассматривают как катализ гетерогенный, происходящий на поверхности гигантских белковых молекул ферментов. Подчиняясь общим закономерностям каталитических процессов, ферментативный катализ имеет ряд существенных отличий от химического. Прежде всего, ферментативный катализ протекает в живой клетке в ограниченном диапазоне температур, значений рН и давления. В большинстве случаев условия, в которых ферменты осуществляют катализ, оказываются достаточно «мягкими». Одна из важнейших особенностей ферментов как катализаторов – строгая специфичность их действия. Под специфичностью понимают способность фермента реагировать только с одним веществом (абсолютная специфичность); с группой веществ, обладающих общими структурными признаками (групповая специфичность); действовать на определенную химическую связь (относительная специфичность) или определенный стереоизомер (стереохимическая специфичность). Многие ферменты образуют в клетке так называемые мультиферментные системы, различающиеся по сложности молекулярной организации. Процесс превращения вещества с участием системы ферментов представляет собой серию последовательных реакций, каждую из которых катализирует определенный фермент. При этом продукт первой реакции служит субстратом для второй, продукт второй реакции субстратом для третьей и т.д. Такая кооперативность и строгая последовательность в действии ферментов определяет их самое существенное отличие от катализаторов иной природы. Каждая клетка имеет регуляторные механизмы, позволяющие ей в зависимости от потребностей изменять скорость отдельных биохимических реакций в результате регуляции синтеза определенных ферментов или их активности. Способность подчиняться такой регуляции – крайне важная особенность ферментов как катализаторов. Каталитическая активность ферментов чрезвычайно высока. Химическая реакция разложения пероксида водорода катализируется ионами железа. В живой клетке под воздействием фермента каталазы, содержащего железо, эта реакция протекает в 1010 раз быстрее, чем с неорганическим катализатором. 44 1.4.1 Структура, механизм действия и свойства ферментов Ферменты делятся на одно- и двухкомпонентные. Первые представляют собой простые белки, вторые – сложные. Каталитическая активность однокомпонентных ферментов обусловлена определенным пространственным расположением остатков аминокислот на отдельных участках молекулы фермента – активных центрах. Именно на них и протекают каталитические реакции. Активные центры реагируют только с тем субстратом, пространственная конфигурация которого совпадает со структурой активного центра. В основном к этой группе относятся гидролитические ферменты. Большинство ферментов относится к двухкомпонентным. Их молекула состоит из белковой части – апофермента, и небелкового компонента – кофактора. В зависимости от прочности связи с апоферментом кофактор называют простетической группой, если он прочно связан с белком, или коферментом, если эта связь слабая. Каталитической активностью обладает только кофактор, роль которого часто выполняют сложные органические комплексы, например, некоторые витамины. Апофермент усиливает каталитическую активность кофакторов и определяет специфичность действия ферментов. Один и тот же кофактор, связываясь с разными белками, может катализировать определенную реакцию, например, отщепление водорода, с десятками различных субстратов. Но в отдельности белковая и небелковая части молекулы лишены ферментативной активности, они приобретают свойства фермента только после соединения. К коферментам относят активные группы дегидрогеназ: никотинамид-аденин-динуклеотид (НАД) или никотинамид-адениндинуклеотидфосфат (НАДФ). В них входит никотиновая кислота (витамин группы В). Витамины есть и в составе других коферментов: тиамин входит в тиаминпирофосфокиназу, участвующую в обмене пирувата; пантотеновая кислота в состав кофермента. А рибофлавин представляет собой простетическую группу флавопротеиновых ферментов. Значение витаминов обусловлено как раз тем, что они входят в состав коферментов. Ферменты ускоряют химические реакции, понижая свободную энергию активации, т.е. энергию, необходимую для перевода всех молекул одного моля вещества в активное состояние. 45 Ферментативная реакция проходит через ряд последовательных стадий. В начальный момент фермент Е образует с молекулой субстрата S промежуточное соединение – фермент-субстратный комплекс ES. На последующих стадиях фермент активизирует субстрат, т. е. изменяет его таким образом, что субстрат может вступить в соответствующую химическую реакцию. Этому моменту соответствует образование каталитически активного комплекса ES'. Далее происходит собственно реакция на молекуле фермента, в результате которой получается ферментпродуктный комплекс ЕР. Процесс заканчивается выделением продукта реакции Р и регенерацией фермента. Белковая природа ферментов обусловливает их лабильность, которая выражается в том, что ферменты теряют активность под влиянием некоторых факторов. Важнейшие из них – температура и реакция среды. Зависимость активности ферментов от температуры носит сложный характер. С повышением температуры активность увеличивается, но в довольно узких пределах. Максимальная активность достигается в области оптимальной температуры, после чего начинается падение активности, связанное с денатурацией белковой части фермента при повышенных температурах и потерей в результате этого каталитической активности. Оптимальная температура, как и температура, вызывающая инактивацию, для разных ферментов неодинакова. Одни ферменты начинают терять активность уже при 40°С, другие – только при 70°С. Почти все ферменты необратимо разрушаются при 80 °С. Большинство ферментов имеют максимальную активность в нейтральной среде, но для некоторых оптимум рН может находиться в кислой или щелочной области значений. Для каждого фермента характер зависимости активности от рН определяется степенью влияния концентрации водородных и гидроксильных ионов на ионизацию функциональных групп фермента и субстрата и структуру апофермента. Активность ферментов зависит и от присутствия в среде некоторых химических соединений. Одни повышают активность ферментов и называются активаторами, другие – ингибиторы – снижают активность фермента. Различают обратимое и необратимое ингибирование. При необратимом ингибировании фермент полностью или частично теряет активность в результате необратимого разрушения или модификации его функциональных групп. 46 Обратимое ингибирование может быть конкурентным и неконкурентным. В первом случае ингибитор по структуре молекулы напоминает субстрат и может взаимодействовать с активным центром фермента, т. е. конкурировать за него с субстратом. При этом степень ингибирования зависит от соотношения концентраций субстрата и ингибитора. И поэтому действие ингибитора может быть снижено или устранено повышением концентрации субстрата. В основе неконкурентного ингибирования лежит способность ингибитора взаимодействовать с какой-либо группой молекулы фермента, существенно влияющей на его активность, но не входящей в активный центр. Кроме упомянутых видов ингибирования возможно торможение ферментативной реакции, наблюдаемое при избыточной концентрации субстрата (субстратное ингибирование). В этом случае в результате реакции фермента одновременно с двумя молекулами субстрата образуется неактивный фермент – субстратный комплекс. Ингибирование конечным продуктом осуществляется регуляторным механизмом клетки по типу обратной связи и заключается в подавлении синтеза ферментов, катализирующих реакцию, продукт которой оказывается в клетке в избытке. Каждому виду микроорганизмов свойствен определенный набор ферментов, постоянно присутствующих в клетке (конститутивные ферменты). В то же время некоторые ферменты синтезируются только тогда, когда в среде появляется соответствующий субстракт. Такие фетменты называются индуктивными. По месту действия ферменты подразделяются на внутриклеточные (эндоферменты) и ферменты, которые клетка выделяет во внешнюю среду (экзоферменты). Основные свойства ферментов: увеличивают скорость реакции, но сами в ней не расходуются; присутствие ферментов не влияет ни на природу, ни на свойства конечного продукта реакции; незначительное количество фермента обеспечивает превращение больших количеств субстрата; активность ферментов определяется реакцией среды, температурой, давлением и концентрацией субстрата и фермента, причем для каждого фермента характерен свой оптимум этих показателей; каждый фермент обладает субстратной специфичностью (взаимодействует только с определенным субстратом и продуктом его трансформации); 47 каждый фермент обладает специфичностью действия (катализирует только одну из многочисленных реакций, которым может подвергаться данный субстрат); многие ферментативные реакции обратимы. 1.4.2 Классификация ферментов В период открытия первых ферментов названия им давались по случайным признакам. Например, пепсин, обнаруженный в желудочном соке, получил свое название от греческого слова «пепсис» – пищеварение. Позднее Дюкло предложил ввести рациональную номенклатуру, где ферменты назывались по субстрату, на который они действуют, с прибавлением суффикса «аза». Так, фермент, разлагающий сахарозу, назывался сахараза, фермент, разлагающий мочевину (urea), – уреаза и т.д. Однако расширение знаний о ферментах показало, что такая номенклатура зачастую оказывается неоднозначной, так как различные реакции с одним и тем же субстратом могут катализировать разные ферменты. В настоящее время известно около 1000 ферментов. В 1961 г. Международный биохимический конгресс принял новые классификацию и номенклатуру ферментов, построенные строго на научных принципах. Согласно этой классификации все ферменты по типу катализируемой реакции делятся на шесть классов. Классы в свою очередь подразделяют на подклассы и подподклассы с порядковой нумерацией. Каждый фермент имеет четырехзначный шифр с номерами класса, подкласса, подподкласса; последняя цифра соответствует номеру фермента в соответствующем поддподклассе. Систематическое название фермента несет и химическую информацию, однако часто оказывается чересчур громоздким, поэтому в повседневной практике чаще используют тривиальные названия ферментов. В приведенной ниже характеристике классов наибольшее внимание уделено ферментам, ознакомление с которыми необходимо для понимания сущности процессов разложения органических веществ микроорганизмами. Оксиредуктазы ускоряют окислительно-восстановительные реакции, осуществляя перенос электронов или атомов водорода (е-+Н+) от окисляемого субстрата (доноpa электрона) к акцептору, который при этом восстанавливается. 48 В переносе электронов от субстрата к конечному акцептору принимают участие четыре главные группы дуктаз: первичные дегидрогеназы, вторичные дегидрогеназы, цитохромы, хиноны. Биологическое окисление органических веществ в клетке – процесс сложный и многостадийный, в котором участвует комплекс ферментов. Окисление осуществляется путем дегидрирования органического соединения. Процесс катализируют ферменты, носящие название дегидрогеназ. Коферментом для первичных дегидрогеназ служат никотин-амид-аденин-динуклеотид (НАД) и никотин-амидаденин-динуклеотид-фосфат (НАДФ). Соединяясь с различными белковыми носителями, НАД и НАДФ образуют множество ферментов, катализирующих реакцию дегидрирования разнообразных веществ. В общеv виде окислительновосстановительные реакции с участие первичных дегидрогеназ можно представить следующим уравнениями: восстановленный субстрат +НАД – окисленный субстрат + НАД·Н2 восстановленный субстрат + НАДФ – окисленный субстрат + НАДФ ·Н2. Первичные дегидрогеназы называют анаэробными, как они не могут передавать отнятый от субстрата водород непосредственно кислороду. Вторичные дегидрогеназы в качестве кофермента содержат флавин-аденин-динуклеотид (ФАД) или флавин-аденин-мононуклеотид (ФМН). Активной частью ФАД и ФМН является рибофлавин (витамин В2), непосредственно участвующий в окислительновосстановительных реакциях. Вторичные дегидрогеназы катализируют дегидрирование жирных кислот, аминокислот. Донором водорода для них, т.е. восстановленным субстратом, могут служить и восстановленные первичные дегидрогеназы. В этом случае окислительно-восстановительная реакция имеет вид и представляет собой один из вариантов регенерации первичной дегидрогеназы. НАД·Н2 + ФАД – ФАД-Н2+НАД. Кроме этой реакции регенерация первичных дегидрогеназ может происходить при их взаимодействии с окисленным органическим веществом по схеме НАД-Н2 + окисленное органическое вещество восстановленное органическое вещество + НАД Таким образом, конечным акцептором водорода для первичных дегидрогеназ служат либо ФАД и ФМН, либо окисленные органические вещества. 49 Вторичные дегидрогеназы могут передавать водород непосредственно кислороду, поэтому носят название аэробных. Однако в большинстве случаев восстановленные формы флавиновых дегидрогеназ в качестве конечного акцептора используют группу окислительно-восстановительных ферментов, составляющих цитохромную систему. Цитохромы содержат железопорфириновые простетические группы и способны переносить электроны от ФАДН2 к молекулярному кислороду за счет обратимого изменения валентности железа. Непосредственно с кислородом может реагировать только последний в цепи цитохром, называется цитохромоксидаза. Одновременно через раствор кислороду передается ионизированный атом водорода. Хиноны, способные к обратимому окислительно-восстановительному процессу в результате присоединения и отдачи атомов водорода, могут участвовать в передаче электронов от флавиновых дегидрогеназ на цитохромную систему и функционировать в полифенольной системе акцептору, составляют дыхательную цепь ферментов, длина которой зависит от вида микроорганизмов. Важнейшее значение имеет структурная организация системы окислительновосстановительных ферментов. В клетках эукариот она локализована на внутренней мембране митохондрий. Системы оксиредуктаз прокариот обнаруживаются в цитоплазматической мембране и на внутриклеточных мембранных образованиях. Помимо описанных ферментов к классу оксиредуктаз относятся каталаза, расщепляющая токсичный для клетки пероксид водорода, и пероксидаза, катализирующая реакции окисленця органических веществ пероксидами. Трансферазы катализируют перенос функциональных групп. Ферменты этого класса подразделяют в зависимости от характера переносимой группы. К трансферазам относят очень распространенные и важные для клетки ферменты – фосфоферазы, катализирующие перенос остатка фосфорной кислоты. Благодаря этой реакции в клетке целый ряд органических соединений превращается в фосфорные эфиры с повышенной химической активностью и поэтому легко вступает в последующие реакции. Гидролазы катализируют реакции гидролитического расщепления сложных органических субстратов. В зависимости от химической природы связи, на которую действуют гидролазы, различают эстеразы, осуществляющие гидролиз сложных эфиров; гликозидазы, действующие на гликозидные связи 50 углеводов; пептидазы, катализирующие гидролиз белков по пептидным связям, и т.д. У прокариот многие гидролазы относятся к внеклеточным ферментам. Лиазы катализируют негидролитическое отщепление атомных группировок с образованием двойных связей или присоединение по месту этих связей. Действуют на связи типа С=С, С=М, С=О и т.д. Изомеразы катализируют внутримолекулярные превращения, например превращение одного изомера в другой. Лигазы (синтетазы) катализируют синтез сложных органических соединений. Каждая реакция, осуществляемая в процессе метаболизма, сопровождается определенным ферментом, качественный состав продуктов реакции зависит от вида микроорганизма, генетически определен и регулируется условиями среды. 51 ГЛАВА 2 ТИПЫ БРОЖЕНИЯ Брожение – это способ получения энергии, при котором АТФ образуется в процессе анаэробного окисления органических субстратов в реакциях субстратного фосфорилирования. Из трех путей образования АТФ субстратное фосфорилирование наиболее простой. Такой тип энергетического метаболизма наиболее характерен для многих бактерий и дрожжей, осуществляющих различные виды брожения. Процесс брожения связан такими перестройками органических молекул субстрата, в результате которых на окислительных этапах процесса высвобождается часть свободной энергии, заключенной в молекуле субстрата, и происходит ее запас в молекулах АТФ. В процессе брожения, как правило, происходит расщепление углеродного скелета молекулы субстрата. Брожение – анаэробный процесс биологического окисления сложных органических субстратов для получения энергии, при котором конечный акцептор водорода (также органическое вещество) образуется в ходе распада исходного субстрата. Степень окисления и сопряженное с этим количество свободной энергии, а также характер образующихся продуктов определяются природой конечных акцепторов электронов. При брожениях конечными акцепторами электронов служат в основном органические соединения: метаболиты, образующиеся из исходных субстратов (пировиноградная кислота, ацетальдегид), или вещества, имеющиеся в среде культивирования (некоторые аминокислоты и другие органические соединения, способные восстанавливаться). В ряде брожений акцепторами электронов служат молекулы CO2, а также ионы водорода (H2). Кроме того, в отдельных случаях дополнительными акцепторами электронов могут быть некоторые достаточно окисленные неорганические соединения, такие, как нитрат, молекулярная сера. Если конечным акцептором электронов является ацетальдегид, то образуется этанол, если пируват – молочная кислота. Акцептирование электронов молекулами CO2 приводит у разных видов к возникновению формиата или ацетата, если же эту функцию выполняют ионы водорода, образуется молекулярный водород (H2). 52 Восстановленные соединения, акцептировавшие электроны, выделяются из клеток эубактерий в окружающую среду и накапливаются в ней в значительных количествах. Из-за низкого энергетического выхода процессов брожения для обеспечения энергией всех функций и биосинтетических процессов клетке приходится перерабатывать огромное количество субстрата. Собственно энергетической стороной процессов брожения является их окислительная часть, поскольку реакции, ведущие к выделению энергии, – это реакции окисления. Существует несколько исключений из этого правила: некоторые анаэробы часть энергии при сбраживании субстрата получают также в результате его расщепления. Примитивность процессов брожения заключается в том, что из субстрата в результате его анаэробного преобразования извлекается лишь незначительная доля той химической энергии, которая в нем содержится. Продукты, образующиеся в процессе брожения, все еще содержат в себе значительное количество энергии, заключавшейся в исходном субстрате. Кроме углеводов, многие бактерии способны сбраживать самые разнообразные соединения: органические кислоты, аминокислоты, пурины и другие. Несбраживаемым субстратом являются углеводороды, в них практически весь углерод имеет одну степень окисления. Условие, определяющее способность вещества к сбраживанию, – наличие в его структуре не полностью окисленных (восстановленных) атомов углерода. Только в этом случае возможна внутри- и межмолекулярная перестройка субстрата за счет сопряжения окислительных и восстановительных реакций без участия кислорода. При этом одни органические вещества служат донорами водорода и окисляются, другие – акцепторами водорода и в результате восстанавливаются. Перенос водорода от доноров к акцепторам осуществляется с помощью окислительно-восстановительных ферментов. Брожение сопровождается частичным высвобождением энергии, заключенной в органическом веществе. Поэтому среди конечных продуктов этого процесса всегда находятся не полностью окислившиеся вещества, содержащие запасы химической энергии, – спирт, молочная кислота и др. Любое брожение – процесс многоэтапный, протекающий как бы в две стадии: первая – окислительная – включает превращение глюкозы до пировиноградной кислоты с образованием двух молекул восстановленного НАД-Н2 – промежуточного акцептора водорода; во 53 второй стадии – восстановительной – НАД-Н2 водород конечному акцептору, который превращается в конечный продукт брожения. Продуктами брожений являются различные органические кислоты: молочная, масляная, уксусная, муравьиная, этиловый, бутиловый спирт, пропанол. В результате процессов брожения в среде накапливаются вещества, в которых степень окисления углерода может быть как выше, так и ниже, чем в исходном субстрате. Однако строгое равновесие окислительных и восстановительных процессов при брожении приводит к тому, что средняя степень окисления углерода остается такой же, как у субстрата. Например, при спиртовом брожении глюкозы: С6Н12О6 2СО2 + 2С2Н5ОН – образуются две молекулы: СО2, (степень окисления углерода +4) и две молекулы спирта со степенью окисления углерода 2. Средняя степень окисления углерода в продуктах брожения составляет: 2 • (+4)+2[2 • (– 2)]=0, т.е. равна степени окисления атомов углерода в исходной молекуле глюкозы. Существует несколько типов брожений, названия которым даются по конечному продукту: спиртовое (осуществляют дрожжи и некоторые виды бактерий); молочнокислое брожение (молочнокислые бактерии, некоторые грибы); пропионовокислое (пропионовые бактерии); метановое (метанообразующие бактерии); маслянокислое (маслянокислые бактерии). Многие микроорганизмы, осуществляющие процессы брожения, – облигатные анаэробы, не способные развиваться в присутствии кислорода и даже более слабых окислителей. Другие – факультативные анаэробы – могут расти как в кислородной среде, так и в бескислородной. Это отличительное свойство факультативных анаэробов объясняется тем, что они могут изменять способ образования АТФ и переключаться с окислительного фосфорилирования при наличии в среде кислорода на субстратное при его отсутствии. Первый этап превращения углеводов – подготовка к энергетическим преобразованиям, состоящая в ферментативном гидролизе углеводов до простых сахаров. Этот процесс идет вне клетки, если ис- 54 пользуется экзогенный субстрат, и внутри клетки, если организм окисляет запасные вещества. На следующем этапе, включающем несколько ферментативных реакций, происходит фосфоролиз молекулы глюкозы с участием АТФ. В результате молекула глюкозы активируется, превращаясь во фруктозо-1,6-дифосфат (ФДФ): С 6 Н12О6 +2АТФ С6Н10О6 (Н2РО3)2+2АДФ. Далее фруктозо-1,6-дифосфат превращается в фосфоглицериновый альдегид: С6Н10О6 (Н2РО3)2 — 2СзН5О3 (Н2РО3). Из фосфоглицеринового альдегида в результате семи последовательных ферментативных реакций образуется пировиноградная кислота (ПВК): 2С3Н5О3 (Н2РО3)+2НАД+4АДФ+2Н3РО4 2СН3СОСООН + 4АТФ +2НАД·Н2. На этом этапе превращения глюкозы окислительные реакции являются собственно энергетической частью процесса брожения, окисление сопряжено с образованием АТФ. К синтезу АТФ по механизму субстратного фосфорилирования ведут катаболические реакции, которые в зависимости от своей химической природы могут быть разделены на два типа. Большинство относится к окислительно-восстановительным реакциям. Богатые энергией соединения возникают в процессе брожения на этапах анаэробного окисления. Второй тип реакций связан с расщеплением субстратов или промежуточных продуктов, образующихся из них. Катализируются эти реакции ферментами, относящимися к классу лиаз. Несмотря на большое число углеродных субстратов, доступных для сбраживания, количество реакций, приводящих непосредственно к синтезу АТФ при брожениях, сравнительно невелико. Наиболее распространены следующие из них: 1) ацетилфосфат + АДФ ацетат + АТФ; 2) 1,3-фосфоглицериновая кислота + АДФ; 3) фосфоглицериновая кислота + АТФ; 4) фосфоенолпировиноградная кислота + АДФ; 5) пировиноградная кислота + АТФ. Другие реакции субстратного фосфорилирования ограничены какими-либо специфическими видами брожения. 55 Фосфорилирование осуществляется непосредственно на молекуле субстрата, поэтому и носит название субстратного. Таким образом, общий энергетический выход процесса превращения молекулы глюкозы в ПВК составляет 2АТФ, поскольку из четырех образовавшихся молекул АТФ две затрачиваются на активацию глюкозы. В реакциях энергетического обмена ПВК – ключевой метаболит. До стадии образования ПВК процесс идет одинаково у всех организмов. Конечным продуктом этого этапа кроме ПВК является и восстановленная дегидрогеназа НАД·Н2. Регенерация фермента совершается в результате окислительно-восстановительных реакций с участием ПВК или продуктов, полученных из нее. Брожение, осуществляемое микроорганизмами, имеет большое значение в природе и широко используется в практической деятельности человека. Они лежат в основе пивоварения, виноделия, квашения овощей, силосования, переработки молока в кисломолочные продукты и сыр, мочения волокнистых растений и других. Реакции дальнейшего превращения ПВК у разных микроорганизмов значительно варьируют, определяя тип брожения. 2.1 Спиртовое брожение Процесс превращения сахара микроорганизмами в этиловый спирт и углекислый газ сопровождается получением энергии в анаэробных условиях. Среди громадного числа брожений, как самопроизвольно протекающих в природе, так и искусственно вызываемых человеком, то брожение, которое возникает в содержащих сахар жидкостях и носит название алкогольного, спиртового или винного, было раньше других замечено и изучено с наибольшей тщательностью. Спиртовое брожение может происходить в самых разнообразных сахаристых жидкостях, как искусственно приготовляемых, так и естественно встречающихся в природе. Возбудителями спиртового брожения являются дрожжи. Дрожжи встречаются на поверхности растений, плодов, ягод, зерна, в воздухе, почве. Это одноклеточные, неподвижные организмы диаметром 8–15 мкм (для сравнения: диаметр бактериальной клетки 0,5–0,7 мкм). Спиртовое брожение могут вызывать и бактерии (Zymomonas mobilis, Erwinia amylovora, Sarcina ventriculi) и отдельные представи- 56 тели мукоровых грибов (Mucor racemosus, М. circinelloides и М. Mucedo), но в основном дрожжи. Мукоровые грибы и актиномицеты применяются в Азии для производства слабоалкогольных напитков крепостью 5– 6%, образуют при этом на поверхности бродящей жидкости воздушный мицелий, однако количественное соотношение между конечными и побочными продуктами, а также характер побочных продуктов отличают иные типы спиртового брожения от брожения, вызываемого дрожжами. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae по своему циклу развития, исследованному Реесом, принадлежат к так называемым аскомицетным грибам. В 1836 г. французский ученый Каньяр дела Тур установил, что спиртовое брожение связано с ростом и размножением дрожжей. Русский химик Л.А. Иванов обнаружил (1905), что добавленные к дрожжевому соку фосфаты в несколько раз повышают скорость брожения. Исследования отечественных биохимиков А.И. Лебедева, С.П. Костычева, Я.О. Парнаса и немецких биохимиков К. Нейберга, Г. Эмбдена, О. Мейергофа и других подтвердили, что фосфорная кислота участвует в важнейших этапах спиртового брожения. При спиртовом брожении ПВК превращается в этанол, как основной продукт, и СО2. Побочными продуктами, или вторичными метаболитами, являются высшие спирты, глицерин, альдегиды, органические кислоты, сложные эфиры. При обычном течении процесса он проходит при рН 3–6, если проводить его в щелочной среде, в присутствии бисульфита образуется глицерин и ацетальдегид, бикарбоната – только глицерин. Дрожжи сбраживают моно- и дисахариды по общей схеме С6Н12О6 = 2 СН3СН2ОН +2СО2. Процесс превращения сахара в спирт является сложным, протекающим ферментативно в несколько этапов: • образование фосфорилированных сахаров (из глюкозы, фруктозы, маннозы, галактозы) и 2 остатков фосфорной кислоты (из АТФ) образуется эфир 1,6 фруктозодифосфат; • углеродная цепь становится неустойчивой и под влиянием фермента альдолазы происходит разрыв ее между 3 и 4 атомами углерода с образованием фосфодиоксиацетона и 3-фосфоглицеринового альдегида, который затем превращается в фосфоглицериновую кислоту; • 3-фосфоглицериновый альдегид через образование промежуточной 1,3 дифосфоглицериновой кислоты и 3-фосфо-глицериновой и изомеризацию, образует 2-фосфоглицериновую кислоту; 57 • дегидратируется, отнимается фосфат АДФ-АТФ, образуется енольная форма пировиноградной кислоты, которая расщепляется на уксусный альдегид и углекислоту; • декарбоксилируется, под действием фермента пируватдекарбоксилазы, ПВК переходит в уксусный альдегид: СН3СОСООН СН3СНО+СО2. При участии кофермента алкогольдегидрогеназы, коферментом которого является НАД·Н2, уксусный альдегид восстанавливается до этилового спирта одновременно с регенерацией молекулы НАД. СН3СНО + НАД ·Н2 СН3СН2ОН+ НАД. Реакция восстановления уксусного альдегида в этиловый спирт является завершающим этапом спиртового брожения. Углекислый газ является одним из конечных продуктов. Роль конечного акцептора водорода при спиртовом брожении выполняет уксусный альдегид. Как при молочном, так и при спиртовом брожении превращение ПВК в конечный продукт не сопровождается запасанием энергии. Источником азота служат пептоны, аминокислоты и аммонийные соли. Дрожжи дезаминируют аминокислоты, потребляя освобождающийся при этом азот, а образующиеся при этом высокомолекулярные спирты составляют главную часть сивушных масел. Лучше всего дрожжи развиваются при рН= 4–6, устойчивы к высоким, до 70 %, концентрациям сахара и спирта (до 14%). Недостаточность выделяющейся при брожении энергии дрожжи возмещают переработкой значительно большого количества сахара, чем при дыхании. Наряду с главными продуктами брожения в небольшом количестве образуются побочные продукты: глицерин, уксусный альдегид, уксусная и янтарная кислоты, сивушные масла – смесь высших спиртов (изоамилового, изобутилового, амилового, нпропилового и др.) и некоторые другие вещества. Образование дрожжами высших спиртов связано с азотным и углеводным обменами дрожжевых клеток. Высшие спирты могут образоваться при дезаминировании и декарбоксилировании аминокислот, в реакциях переаминирования аминокислот с пировипоградной кислотой (образующейся в процессе брожения), в процессах синтеза аминокислот. Высшие спирты участвуют в формировании аромата и вкуса напитков спиртового брожения. Глицерин образуется в начальном (индукционном) периоде брожения, когда еще нет уксусного альдегида (или имеется незначи- 58 тельное его количество). В этих условиях водород, мобилизованный НАД-дегидрогеназой при окислении одних молекул фосфоглицеринового альдегида, переносится на другие молекулы этого альдегида, которые при этом восстанавливаются в фосфоглицерин. Последний дефосфорилируется и превращается в глицерин. По мере накопления в среде уксусногоальдегида наступает вторая – стационарная фаза спиртового брожения, когда акцептром водорода становится не фосфоглицериновый альдегид, а уксусный, который и восстанавливается в этиловый спирт. При нормальном процессе спиртового брожения глицерин накапливается лишь в небольшом количестве (1–3%). Сбраживание углеводов (глюкоза, ферментативный гидролизат крахмал, кислотный гидролизатов древесины) используется во многих отраслях промышленности для получения этилового спирта, глицерина, других технических и пищевых продуктов. 2.2 Молочнокислое брожение Превращение сахаров молочнокислыми бактериями с образованием в качестве основного продукта брожения молочной кислоты называется молочнокислым брожением. Наряду с ней в большом или меньшем количестве получаются побочные продукты. При молочнокислом брожении превращение углеводов, особенно на первых этапах, близко к реакциям спиртового брожения, за исключением декарбоксилирования пировиноградной кислоты, которая восстанавливается до молочной кислоты за счет водорода, получаемого от НАД-Н. По характеру брожения различают две группы молочнокислых бактерий: гомоферментативные и гетероферментативные. Гомоферментатвые (однотипнобродящие) бактерии образуют в основном (не менее 85–90 %) молочную кислоту и очень мало побочных продуктов. Этот тип молочнокислого брожения можно представить следующим общим уравнением: С6Н12О6 = 2СН3СНОНСООН. Оно вызывается молочнокислыми бактериями, факультативными анаэробами, не образующими спор. Превращение ПВК при молочнокислом брожении протекает следующим образом: СН3СОСООН + НАД · Н2 СН3СНОНСООН + НАД. 59 В этой заключительной реакции процесса сбраживания глюкозы ПВК выполняет роль конечного акцептора водорода, обеспечивая регенерацию НАД. Превращение глюкозы гетерферментативными бактериями происходит по-иному, используя окислительный пентозофосфатный путь, что определяется своеобразием комплекса ферментов у этих бактерий. Отсутствие у них фермента альдолазы меняет начальный путь превращения глюкозы. После образования активной формы глюкозо-6-фосфата, следующий этап заключается в дегидрировании глюкозо-6-фосфата, катализируемом глюкозо-6-фосфатдегидрогеназой. Особенность реакции в том, что в ней участвует НАДФ+ в качестве акцептора водорода. Образовавшийся продукт реакции очень нестоек и спонтанно или с помощью фермента лактоназы гидролизуется с образованием 6-фосфоглюконовой кислоты, которая подвергается окислительному декарбоксилированию, катализируемому фосфоглюконат-дегидрогеназой. Эта реакция приводит к образованию соответствующего пентозофосфата, НАДФ · Н2 и выделению СО2. Рибулозо-5-фосфат обратимо превращается в ксилулозо5-фосфат и рибозо-5-фосфат с участием ферментов фосфопентозоэпимеразы и фосфопентозоизомеразы соответственно. Суммарно весь процесс можно представить в виде следующего уравнения: глюкозо-6-фосфат + 2НАДФ+ = рибозо-5-фосфат + СО2 + 2НАДФ·Н2. Как видно, на этом этапе образуются 2 молекулы НАДФ · Н2, которые могут потребляться в восстановительных биосинтетических процессах, и молекула рибозо-5-фосфата, используемого в синтезе нуклеиновых кислот и пентозосодержащих коферментов. Примечательно, что ни на одном из окислительных этапов не синтезируется АТФ. Рибозо-5-фосфат при участии фермента фосфокеталазы расщепляется на фосфоглицериновый альдегид и ацетилфосфат. Фосфоглицериновыи альдегид, как и у гомоферментативных молочнокислых бактерий, превращается в пировиноградную кислоту, которая затем восстанавливается в молочную. Ацетилфосфат дефосфорилируется и превращается в уксусную кислоту или восстанавливается (через уксусный альдегид) в этиловый спирт. Таким образом, конечным акцептором водорода в этом типе брожения служат пировиноградная кислота и уксусный альдегид. 60 Окислительный пентозофосфатный путь функционирует в качестве единственного пути сбраживания углеводов у облигатных гетероферментативных молочнокислых бактерий. Эти бактерии лишены ключевых ферментов гликолитического пути, альдолазы и триозофосфатизомеразы. Большинство молочнокислых бактерий имеют два пути сбраживания углеводов: гликолитический и окислительный пентозофосфатный. Кроме глюкозы, молочнокислые бактерии сбраживают большое количество сахаров: фруктозу, галактозу, маннозу, сахарозу, лактозу, мальтозу и пентозы. При сбраживании перечисленных соединений наблюдаются некоторые отклонения от обычных схем брожения. Например, при брожении фруктозы образуются лактат, ацетат, СО2 и маннитол. Молочнокислые бактерии обладают высокой бродильной способностью и отличаются отсутствием большинства биосинтетических путей. Это обусловливает высокую требовательность рассматриваемых бактерий к источникам питания, которая удовлетворяется лишь на таких средах, как ткани растений, молоко, содержимое желудочно-кишечного тракта животных. Источником энергии для этих бактерий служат главным образом моно- и дисахариды (полисахариды сбраживают только отдельные виды). Некоторые молочнокислые бактерии способны ассимилировать органические кислоты, например, лимонную. Молочнокислые бактерии требовательны к источникам азотного питания – они используют органические формы азота. Многие молочнокислые бактерии могут ассимилировать белки, хотя лучше развиваются на аминокислотах, пептидах и полипептидах. Кроме веществ, содержащих углерод и азот, молочнокислым бактериям необходимы фосфор, калий, кальций и другие элементы, которые обычно поступают в среду с различными минеральными соединениями. Большинство молочнокислых бактерий нуждается и в ростовых веществах. Отдельным бактериям для развития требуется рибофлавин. При этом результатом их собственного обмена веществ может быть другое ростовое вещество, например, витамин B1. Молочнокислые бактерии развиваются в довольно широком диапазоне температур. Для большинства видов предпочтительны температуры от 7 до 42 °С при оптимуме 30–40 °С. Молочнокислые бактерии не образуют спор, поэтому при повышении температуры выше указанного предела быстро погибают. 61 Многие молочнокислые бактерии растут в диапазоне рН 5,5– 8,8, однако лучше размножаются при нейтральной реакции среды. В результате жизнедеятельности они значительно подкисляют питательную среду, поэтому приспособились к существованию в зоне довольно высокой кислотности среды. Палочковидные формы выносят более низкие значения реакции среды, чем кокковидные. Это кислотолюбивые организмы, оптимум для них обычно составляет рН 5,5– 5,8 и менее, как правило, они растут при рН 5,0 некоторые при рН 2,9–3,2. Наиболее важными в техническом отношении представителями гомоферментативных молочнокислых бактерий являются следующие. Молочнокислый стрептококк (Streptococcus lactis) в среде накапливает до 1 % кислоты. Минимальная температура развития 10°С, максимальная – от 40 до 45°С. Некоторые расы образуют антибиотик низин. Близкий по свойствам к S. laсtis его подвид S. laсtis subsp. diacetilactis способен, кроме сахаров, сбраживать соли лимонной кислоты с образованием ацетоина и диацетила, что обусловливаст ароматичность продуктов, в которых развивается этот стрептококк. Сливочный стрептококк (S. cremoris) применяется в заквасках вместе с молочнокислым стрептококком. Термофильный стрептококк (S. Thermophilus). Применяется имеете с палочковидными бактериями при изготовлении ряженки, томной простокваши, варенца. Болгарская палочка (Lactobacillus bulgaricus) не сбраживает сахарозу, активный кислотообразователь, накапливающий в молоке 2,5–3,5 % молочной кислоты используется при изготовлении южной простокваши, кумыса. Ацидофильная палочка (Lactobacillus acidophilus). Некоторые виды этой бактерии способны к слизеобразованию. Используется в производстве ацидофильных кисломолочных продуктов. Ацидофильные палочки вырабатывают антибиотические вещества, активные по отношению к возбудителям кишечных заболеваний. Из чистых культур ацидофильных бактерий изготовляют биопрепараты для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний. Биопрепараты добавляют в корм скоту. Дельбрюковая – зерновая термофильная палочка (L.delbrueckii), не сбраживает лактозу, поэтому в молоке не развивается. Применяется в производстве молочной кислоты и хлебопечении. 62 Молочнокислая палочка (Lactobacillus plantanim) – основной возбудитель брожения при квашении овощей и силосовании кормов. Из гетероферментативных молочнокислых бактерий наиболее важными в техническом отношении являются следующие. Lactobacillus brevis – палочковидные бактерии, сбраживающие сахара при квашении капусты и огурцов с образованием кислот (молочной и уксусной), этилового спирта и углекислого газа; Leuconostoc cremoris. При сбраживании лимонной кислоты образует диацетил. Этот лейконосток вводят в закваски для ароматизации продуктов. Некоторые виды Leuconostoc являются активными слизеобразователями. В субстратах, содержащих сахарозу, образуют много «клейкого» полисахарида декстрана. При этом субстрат приобретает густую слизистую консистенцию. Молочнокислые бактерии широко применяют в различных отраслях народного хозяйства. Особенно велика их роль в молочной промышленности. Метаболические возможности этих бактерий используются при квашении овощей, силосовании кормов (растительной массы) для животных, в хлебопечении, особенно при изготовлении ржаного хлеба. В последние годы с положительными результатами ведутся исследования по использованию молочнокислых бактерий при изготовлении некоторых сортов колбас, также в процессе созревания слабосоленой рыбы для ускорении процесса и придания продуктам новых ценных качеств (вкуса, аромата, консистеции и др.). Ряд молочнокислых продуктов готовят, используя закваску, содержащую симбиотические комплексы микроорганизмов. Например, для приготовления кефира в молоко вносят так называемые кефирные зерна, внешне напоминающие миниатюрные головки цветной капусты. Они содержат Lactobacillus bulgaricus, Streptococcus lactis, дрожжи Saccharomyces kefiri, сбраживающие лактозу. Продуктами брожения являются молочная кислота и спирт. Смешанное брожение лежит также в основе приготовления кумыса из кобыльего молока. В данном случае молочнокислое брожение осуществляют термофильные молочнокислые палочки, близкие к Lactobacillus bulgaricus, и дрожжи рода Torula, сбраживающие лактозу. Йогурт готовят внесением в пастеризованное гомогенизированное молоко чистых культур Streptococcus thermophilus й Lacttibacillus bulgaricus, a биойогурт получают 63 сквашиванием молока культурами Ldctobacithis acidophilus w Streptococcus thermophilus. Деятельность молочнокислых бактерий лежит в основе изготовления сыров. Процесс сыроделия представляет собой коагуляцию казеина молока под влиянием сычужного фермента, выделяемого из желудка жвачных животных. Промышленное значение имеет также применение молочнокислого брожения для получения молочной кислоты, которую используют в консервной, кондитерской промышленности и в производстве безалкогольных напитков. Сырьем для производства молочной кислоты брожением служат патока, крахмал и другое крахмало- и сахарсодержащее сырье. Крахмал предварительно осахаривают. Вырабатывают молочную кислоту также из молочной сыворотки за счет сбраживания содержащейся в ней лактозы. В первом случае для брожения применяют палочку Дельбрюка, во втором – L. bulgaricus и S. lactis. Спонтанно (самопроизвольно) возникающее молочнокислое брожение в продуктах, молоке, вине, пиве, безалкогольных напитках приводит к их порче – прокисанию, помутнению, ослизнению и снижению потребительских качеств. 2.3 Пропионовокислое брожение Различают несколько видов пропионовокислых бактерий семейства Рrоpionibacteriaceae рода Propionibacterium., из которых широко известны Propionibacterium freudenreichii и Propionibacterium acidipropionici. В род Propionibacterium входят грамположительные, неподвижные, не образующие спор палочковидные бактерии, размножающиеся бинарным делением. В зависимости от условий культивирования и цикла развития форма клетки может меняться до кокковидной, изогнутой или булавовидной. Типовой вид – P.freudenreichii. Источниками энергии их служат углеводы, органические кислоты, спирты и др. Бактерии рода Propionibacterium – анаэробы, но они могут развиваться в условиях низкого парциального давления кислорода. Аэротолерантность их обусловлена наличием полностью сформированной ферментной системы защиты от токсических форм кислорода (супероксидный анион, перекись водорода). У пропионовокислых бактерий обнаружены супероксиддисмутазная, каталазная и пероксидазная активность. 64 Продуктами брожения углеводов при участии пропионовокислых бактерий могут быть различные комбинации пропионата и ацетата, меньшие количества изовалериата, формиата, сукцината лактата и СО2: 3С6Н12О6 = 4СН3СН2СООН + 2СН3СООН + 2СО2 + 2Н2О. Пропионовокислые бактерии способны сбраживать лактат, образовавшийся в результате брожения под действием других бактерий, превращая его в пропионат и ацетат 3СН3СНОНСООН = 2СН3СН2СООН + СН3СООН + Н2О + СО2. Сбраживание углеводов пропионовокислыми бактериями происходит по пути Эмбдена – Мейергофа – Парнаса до стадии образования пирувата. Затем в зависимости от условий пируват может окисляться до ацетата и СО2, восстанавливаться в лактат, карбоксилироваться в оксалоацетат, который через малат и фумарат восстанавливается до сукцината. Пропионат может образовываться восстановлением пирувата или лактата либо декарбоксилированием сукцината. Химизм пропионовокислого брожения сильно изменяется в зависимости от условий. Это, по-видимому, объясняется способностью пропионовых бактерий перестраивать обмен веществ, например, в зависимости от аэрации. При доступе кислорода они ведут окислительный процесс, а в его отсутствии расщепляют гексозы путем брожения. Пропионовые бактерии способны фиксировать CO2, при этом из пировиноградной кислоты и CO2 образуется щавелевоуксусная кислота, превращающаяся в янтарную кислоту, из которой декарбоксилированием образуется пропионовая кислота. Хотя гликолитическое расщепление глюкозы с образованием в качестве обязательного промежуточного соединения пировиноградной кислоты является основным путем разложения глюкозы, кроме этого пути в группе пропионовых бактерий обнаружен окислительный пентозофосфатный путь, реакции ЦТК, активное "флавиновое дыхание" и окислительное фосфорилирование, сопряженное с электрон-транспортной системой. В процессе "флавинового дыхания" происходит перенос двух электронов с флавопротеинов на O2, сопровождающийся образованием перекиси водорода, которая разлагается бактериальной каталазой и пероксидазой. Однако "флавиновое дыхание" не связано с получением клеткой энергии. Транспорт электронов в дыхательной цепи некоторых пропионовых бактерий сопровождается образованием АТФ, что может указывать на подключение к этому процессу цитохромов, 65 однако эффективность окислительного фосфорилирования низка. Последнее, вероятно, объясняется несовершенством механизмов сопряжения. В то время как в аэробных условиях конечным акцептором электронов с НАД-H2 является O2, в анаэробных условиях им может быть нитрат, фумарат. Вклад каждого из этих путей в общий энергетический метаболизм зависит как от вида бактерий, так и от конкретных внешних условий. Все перечисленные процессы достаточно сложны, состоят из большого числа реакций, катализуемых многими ферментами. В целом у пропионовых бактерий достаточно четко просматриваются две тенденции: с одной стороны, усовершенствование основного анаэробного способа получения энергии, с другой – попытки приспособления и, более того, рационального использования молекулярного кислорода. Конструктивный метаболизм пропионовых бактерий характеризуется хорошо развитыми биосинтетическими способностями, они могут расти на простой синтетической среде с аммонийным азотом в качестве единственного источника азота при добавлении к среде пантотеновой кислоты и биотина, а для некоторых видов и тиамина. У ряда пропионовых бактерий обнаружена способность к азотфиксации. Большое количество пропионовокислых бактерий обнаруживают в рубце и пищеварительном тракте жвачных животных. В рубце присутствуют бактерии, гидролизующие целлюлозу с образованием глюкозы. Последняя затем превращается в лактат и другие вещества. Пропионовокислые бактерии сбраживают глюкозу и лактат в пропионат и ацетат, которые всасываются в кровеносную систему животного. Пропионовокислые бактерии используют в производстве твердых сычужных сыров. По окончании молочнокислого брожения лактозы в созревающем сыре наступает стадия пропионовокислого брожения, сопровождающаяся сбраживанием лактата в ацетат и пропионат, придающие сырам острый вкус. Выделяющийся при этом диоксид углерода обусловливает появление «рисунка» сыра, т.е. глазков. Кроме того, бактерий данного рода используют для получения витамина В12, образующегося в результате их жизнедеятельности в значительно больших количествах, чем у других микроорганизмов. На основе бактерий рубца, среди которых есть Propionibacterium acnes, получен препарат «Пропиовит». Он стимулирует развитие полезной микрофлоры кишечника животных, сокращает их потери от заболеваемости и гибели, увеличивает привесы животных и птиц. 66 Процессы брожения вызываемые бактериями рода Clostridium. Анаэробные бактерии рода Clostridium были открыты Л. Пастером в 1861 г. Ученый обнаружил, что некоторые представители данного рода сбраживают углеводы с образованием масляной кислоты. Хеморганогетеротрофы. Клостридии сбраживают сахара, многоатомные спирты, аминокислоты, органические кислоты, пурины и пиримидины, другие органические соединения. Ряд видов способен к фиксации молекулярного азота атмосферы. Места обитания клостридий – почва, водоемы, а также пищеварительный тракт человека и животных. Все виды рода объединены в группы в зависимости от способности сбраживать те или иные органические соединения. Сахаролитические виды Clostridium сбраживают растворимые углеводы, крахмал или пектин с образованием бутирата, ацетата, СО2 и Н2. Брожение при участии некоторых микроорганизмов группы приводит к образованию из сахаров дополнительных нейтральных соединений (бутанола, пропанола, ацетона, небольших количеств этанола). В группу входят бактерии, вызывающие маслянокислое и ацетонобутиловое брожение: С.butyricum, С. pasteurianum, С. tyrobutyricum, С. butylicum, С.acetobutylicum др. К ней можно отнести и ряд видов Clostridium – высокоспециализированных агентов анаэробного разрушения целлюлозы, причем главные конечные продукты брожения – этанол, ацетат и сукцинат, СО2 и Н2. Протеолитические виды Clostridium, сбраживающие аминокислоты, обладают сильными протеолитическими свойствами и способны к интенсивному гидролизу белков с последующим сбраживанием аминокислот. Рост микроорганизмов в средах с белком сопровождается образованием аммиака, СО2, Н2, жирных кислот и большого количества летучих соединений с неприятным запахом (индол, скатол, меркаптан). К группе относятся виды: С. sporogenes, С. реrfringens, С. histolyticum, С. botulinum. Отдельные виды Clostridium сбраживают азотсодержащие циклические соединения – пурины и пиримидины. Пурины (гуанин, гипоксантин, ксантин и др.) под влиянием С. acidi-urici и С. cylindrosporum превращаются в аммиак, ацетат и СО2. С. uraciliсит и С. oroticum сбраживают пиримидины, при этом урацил распадается до β-аланина, СО2 и NH3, а оротовая кислота – до уксусной кислоты, СО2 и NH3. 67 2.4 Маслянокислое брожение Типичный представитель маслянокислых бактерий – Clostridium butyricum. Источником углерода для маслянокислых бактерий могут служить моно- и дисахариды, некоторые полисахариды (декстрин, крахмал), лактат и пируват, маннит, глицерин и др. В сложных белковых средах при отсутствии сбраживаемого углевода маслянокислые бактерии растут плохо или не растут вовсе. Источником азота для них служат разнообразные вещества: аминокислоты, аммиачные соединения и даже молекулярный азот. Маслянокислое брожение начинается с трансформации сахаров в пируват по пути гликолиза. Конечные продукты из пирувата образуются в цепи последовательных реакций, катализуемых несколькими ферментными системами. Пируват превращается в ацетил-СоА, СО2 и Н2 при участии ферментной системы: пируват + ферредоксиноксидоредуктаза. Из ацетил-КоА через ацетилфосфат синтезируется ацетат. Синтез бутирата начинается с конденсации двух молекул ацетил-КоА, возникших в результате декарбоксилирования пирувата, что приводит к образованию ацетоацетил-КоА. Последний восстанавливается в β-оксибутирил-КоА. С отщеплением от молекулы βоксибутирил-КоА молекулы воды возникает кротонил-КоА, ферментативно восстанавливающийся в бутирил-КоА. Наконец, после гидролиза бутирил-КоА и переноса КоА на ацетат образуется бутират. Превращение ацетил-КоА в ацетилфосфат, а затем в ацетат сопровождается синтезом АТФ. Таким образом, в процессе субстратного фосфорилирования при маслянокислом брожении синтезируется третья молекула АТФ (две другие образовались в процессе гликолитического расщепления глюкозы). Суммарное уравнение маслянокислого брожения 4С6Н12О6 = 3СН3СН2СН2СООН + 2СН3СООН + 8СО2 + 8Н2 Маслянокислое брожение – не всегда желательный процесс. Например, при его развитии в заквашиваемых кормах белковая часть корма разлагается, а накопившаяся масляная кислота придает продукту неприятный запах. Вместе с тем для некоторых промышленных целей требуется чистая масляная кислота. Ее получают на заводах, специально сбраживая подготовленные среды чистой культурой маслянокислых бак- 68 терий. Образовавшуюся кислоту отделяют и очищают химическим методом. Эфиры масляной кислоты имеют приятный запах и применяются в кондитерской и парфюмерной промышленности. 2.5 Ацетонобутиловое брожение Возбудитель ацетонобутилового брожения – С. аcetobutylicum. Бактерии сбраживают моно-, ди- и полисахариды, а также глицерин, маннит, глюконат, пируват и ряд других соединений, фиксируют молекулярный азот, способны разлагать белки. Сбраживание углеводов при помощи данных бактерий происходит по пути гликолиза. Образовавшийся в результате декарбоксилирования пирувата ацетил-КоА восстанавливается в этанол, идет на синтез ацетата или конденсируется в ацето-ацетил-КоА. Последний декарбоксилируется, что приводит к образованию ацетона, или восстанавливается в бутирил-КоА, который может трансформироваться в бутират или восстанавливаться через бутиральдегид до бутанола. Суммарная схема ацетонобутилового брожения С6Н12О6 СН3СН2СН2СН2ОН + СН3СОСH3+ СН3CO2ОН +СН3СНОНСН3+ Н2 +СО2. Основные конечные продукты брожения, как видно, – бутанол, этанол, ацетон, 2-пропанол, а также ацетат и бутират. Однако характер конечных продуктов определяется как видовой принадлежностью используемого для брожения микроорганизма, так и условиями, в которых идет процесс. Установлено, что ацетонобутиловое брожение имеет двухфазный характер. В течение первой фазы наблюдается активный рост бактерий, в среде идет накопление преимущественно органических кислот. Во второй фазе брожения снижается значение рН среды, рост бактерий замедляется, преобладает синтез нейтральных продуктов – ацетона, бутанола и этанола. Двухфазность ацетонобутилового брожения связана с рН среды. Если кислотность среды в результате накопления органических кислот возрастает до рН 4,5 и более, происходит интенсивное образование нейтральных продуктов, что предупреждает дальнейшее подкисление среды, неблагоприятное для бактерий. Описанный вид брожения широко используют в промышленном производстве ацетона и бутанола из кукурузной муки и другого крахмалистого сырья. Ацетон применяют для производства искусственного 69 шелка и кожи, фотографических пленок, искусственного цемента и других продуктов, бутанол – при производстве лаков. Газы, образующиеся при ацетонобутиловом брожении, идут на синтез метанола. 2.6 Смешанное брожение Некоторые бактерии, главным образом представители кишечной микрофлоры, относящиеся к семейству Enterobacteriaceae, называемые энтеробактериями, могут осуществлять смешанное кислое и бутандиоловое брожение, при котором образуются ряд органических кислот, спирты, СО2 и Н2. Энтеробактерии – факультативные анаэробы, они представляют собой грамотрицательные подвижные, неспорообразующие палочки. К энтеробактериям относятся: • Escherichia coli (кишечная палочка) – обитает в кишечнике человека и животных; бактерия может существовать в почве и воде, обнаружение ее в питьевой воде, молоке или другом субстрате служит показателем их загрязнения фекалиями; • Salmonella – представители кишечной микрофлоры, патогенные микроорганизмы, возбудители кишечных инфекций и пищевых отравлений, обитают в почве и воде; • Shigella – возбудители кишечных инфекций; • Yersinia – возбудители чумы человека и животных; • Enterobacter, Serratia и Proteus, представители которых в основном обитают в почве и воде; • фитопатогенный род Erwinia. Превращение углеводов у этеробактерий идет по пути Эмбдена – Мейергофа – Парнаса. Основные продукты брожения – ацетат, сукцинат, лактат, этанол, глицерол, ацетон, 2,3-бутандиол, СО2 и Н2. Продукты брожения, вызываемого представителями энтеробактерий, различаются в качественном и количественном отношении. Виды родов Escherichia, Salmonella и Shigella сбраживают сахара до лактата, ацетата, сукцината и муравьиной кислоты. Кроме того, образуются СО2, Н2 и этанол. Представители родов Enterobacter, Serratia и Erwinia продуцируют меньше кислот, но больше СО2, этанола и особенно большое количество 2,3-бутанди-ола (2,3бутиленгликоля). В каждом виде брожения можно выделить две стороны: окислительную и восстановительную. Процессы окисления сводятся к отрыву электронов от определенных метаболитов с помощью специфиче- 70 ских ферментов (дегидрогеназ) и акцептированию их другими молекулами, образующимися из сбраживаемого субстрата, следовательно, в процессах брожения происходит окисление анаэробного типа. Энергии выделяется значительно меньше, так как продукты сохраняют свою органическую природу, не минерализуются до воды и углекислого газа. 71 ГЛАВА 3 БИОСИНТЕЗ ОСНОВНЫХ БИОПОЛИМЕРОВ И РЕГУЛЯЦИЯ МЕТАБОЛИЗМА Катаболизм может идти разными путями, но всегда с образованием АТФ для обеспечения биосинтеза клетки. Основную часть органических веществ микроорганизмов составляют макромолекулы, относящиеся к четырем классам: нуклеиновые кислоты, белки, полисахариды и сложные липиды. Это полимеры низкомолекулярных органических соединений, называемых предшественниками. Макромолекулы делят на классы в зависимости от того, какие низкомолекулярные органические соединения-предшественники полимеризуются при их синтезе: для нуклеиновых кислот – нуклеотиды, для белков – аминокислоты, для полисахаридов – моносахариды. Сложные липиды более разнообразны по своему составу – среди их предшественников есть жирные кислоты, многоатомные спирты, простые сахара, амины и аминокислоты. Согласно имеющимся данным, для образования макромолекул четырех главных классов требуется около 70 низкомолекулярных органических соединенийпредшественников. Кроме предшественников макромолекул, микробной клетке необходимо синтезировать около 20 коферментов и переносчиков электронов, играющих важную каталитическую роль. Считают, что для образования новой микробной клетки нужно примерно 150 небольших молекул различных органических соединений. Эти небольшие молекулы, в свою очередь, синтезируются из еще меньшего числа основных промежуточных веществ, образующихся в ходе катаболизма у хемоорганогетеротрофов или при использовании СО2 хемолитоавтотрофами. Наиболее важные промежуточные продукты – фосфорные эфиры сахаров, пируват, ацетат, оксалоацетат, сукцинат, 2-оксо-глутарат, рибоза и некоторые другие. Поставка промежуточных продуктов для биосинтеза аминокислот, углеводов и т.д. происходит главным образом при преобразованиях в цикле трикарбоновых кислот. 72 3.1 Биосинтез аминокислот Почти все микроорганизмы, за небольшим исключением, обладают способностью к синтезу всех аминокислот. Биосинтез аминокислот – первый этап биосинтеза белка – представляет собой яркий пример тесной связи катаболизма и биосинтеза. Предшественниками для биосинтеза аминокислот служат промежуточные продукты ЦТК и пентозофосфатного цикла. Так, при включении в цикл трикарбоновых кислот пируват, трансформируясь в оксалоацетат и 2-оксоглутарат, дает начало аспартату и глутамату, из которых впоследствии образуются аспарагин, глутамин, затем треонин, изолейцин, метионин, лизин, аргинин и пролин. В результате конденсации промежуточных продуктов пентозофосфатного Цикла (эритрозо-4-фосфата) и гликолиза (фосфоенолпирувата), а также последующей серии реакций образуются ароматические аминокислоты – тирозин, фенилаланин и триптофан. Микроорганизмы могут построить из промежуточных продуктов катаболизма углеводов только углеродные скелеты аминокислот. На последних этапах их биосинтеза в молекулу промежуточного продукта вводится при реакции аминирования и переаминирования аминогруппа. Превращение неорганического азота в органический осуществляется через предварительное образование ионов аммония, которые затем включаются в состав органических веществ. Ряд аминокислот (L-аланин, аспартат, глутамат и амид-Lглутамин) образуется при прямом аминировании; их называют первичными аминокислотами. Остальные аминокислоты, называемые вторичными, синтезируются путем переаминирования, т.е. в результате переноса аминогруппы от первичных аминокислот, служащих донорами, на соответствующие кетокислоты, образующиеся в ходе реакций катаболизма. Аминокислоты, в свою очередь, идут на биосинтез белков клетки, специфичных для каждого вида микроорганизмов. Синтез белка заключается в образовании пептидной связи между свободными аминокислотами. Для этого необходима предварительная химическая активация аминокислот, требующая расхода энергии АТФ. Активация заключается в присоединении аминокислоты к ферментупереносчику. Существует 20 таких ферментов, каждый из которых специализируется на активации определенной аминокислоты. Последующая 73 полимеризация происходит вследствие переноса аминокислоты с фермента-переносчика на растущую белковую цепь. В клетке микроорганизма может синтезироваться несколько тысяч различных белков, каждый из которых содержит в среднем около 200 аминокислотных остатков, связанных между собой в определенной последовательности. 3.2 Биосинтез нуклеиновых кислот Один из самых жизненно важных процессов клетки – биосинтез мононуклеотидов, поскольку рибо- и дезоксирибонуклеотиды служат прямыми предшественниками РНК, ДНК и нуклеотидных ферментов. Центральное звено биосинтеза мононуклеотидов – синтез пуриновых и пиримидиновых оснований. Все микроорганизмы, за исключением некоторых видов бактерий, способны образовывать указанные основания из очень простых предшественников: аминокислот – глицина и аспартата, а также инозиновой, адениловой, гуаниловой и уридиловой кислот. В синтезе мононуклеотидов, кроме того, участвуют фосфорная кислота и D-pибозо-5-фосфат – продукт пентозофосфатного пути превращения углеводов. Синтезированные микроорганизмами мононуклеотиды полимеризуются при участии специальных ферментов в ДНК и РНК. 3.3 Биосинтез углеводов Глюкоза и другие углеводы синтезируются из более простых соединений. Фотоавтотрофные организмы образуют гексозы в результате восстановления СО2. Гексозы, в свою очередь, трансформируются в крахмал, целлюлозу и другие полисахариды. В клетках хемоорганогетеротрофных организмов центральный процесс метаболизма – трансформация пирувата, аминокислот и других простых соединений в глюкозу и гликоген. Подобно тому, как основным путем катаболизма углеводов в клетках анаэробных и аэробных микроорганизмов служит превращение глюкозы в пируват, обратным процессом, т.е. превращением пирувата в глюкозу, является центральный путь биосинтеза моносахаридов и полисахаридов. В данный центральный биосинтетический путь вливаются два главных поддерживающих пути, которые начи- 74 наются с двух различных наборов простых, неуглеводных соединений. Один поддерживающий путь заключается в ряде реакций, обеспечивающих превращение промежуточных продуктов цикла трикарбоновых кислот в пируват. Указанный процесс характерен для всех организмов и носит название глюконеогенеза. Второй путь состоит из реакций, обусловливающих восстановление СО2 до глюкозы. Он отсутствует у хемоорганогетеротрофов и наблюдается главным образом у хемолитоавтотрофов и фотолитоавтотрофов. Глюкозо-6-фосфат, образующийся в процессе превращения по центральному пути двух молекул пирувата при затратах энергии АТФ, обусловливает синтез целого ряда соединений – свободной глюкозы, крахмала, гликогена, дисахаридов, моносахаридов, компонентов клеточной стенки (гликопептидов, тейхоевых кислот, липополисахаридов), запасных веществ клетки (гликогена, гранулезы) и других. В клетке хемолитоавтотрофных микроорганизмов процессы окисления неорганических веществ идут с выделением энергии и позволяют аккумулировать ее в клетке в форме АТФ, часть которой тратится на восстановление СО2. Усвоение СО2 у большинства исследованных хемолитоавтотрофов, как и у большинства (но не у всех) фотоавтотрофов, осуществляется через восстановительный пентозофосфатный цикл, или цикл Кальвина. Иными путями (не через цикл Кальвина) фиксируют СО2 фотоавтотрофные зеленые серные и некоторые зеленые нитчатые бактерии, а также некоторые хемоавтотрофные анаэробы – метаногены и ряд сульфат-редукторов, окисляющих Н2, и др. Цикл Кальвина имеет универсальное значение как эукариотных, так и для прокариотных микроорганизмов, использующих СО2 как основной источник углерода. Ключевым ферментом цикла Кальвина является рибулозобисфосфат-карбоксилаза, которая катализует реакцию присоединения СО2 к молекуле рибулозо-1,5-бисфосфата (РО3Н2 – СН2О·СО·СНОН – СНОН·СН2О – РО3Н2) с образованием двух молекул фосфоглицерата. Последние восстанавливаются в глицеральдегид-3-фосфат, который в результате ряда реакций трансформируется во фруктозобисфосфат, затем – в глюкозо-6-фосфат и, наконец, – в глюкозу. 75 3.4 Биосинтез липидов Липиды микроорганизмов представляют собой химически гетерогенную группу; среди них есть жиры, фосфолипиды, стероиды, изопреноиды и поли-β-оксимасляная кислота. Выделяют две группы липидов. К первой относят липиды, содержащие жирные кислоты, связанные эфирной связью, которой – липиды, состоящие из повторяющихся пятиуглеродных радикалов, подобных изопрену. Жирные кислоты обычно синтезируются отдельно и в дальнейшем с образованием эфирной связи включаются в сложные эфиры. Предшественником жирных кислот с длинной цепью, а также запасного вещества – поли-β-гидроксимасляной кислоты служит промежуточный продукт цикла трикарбоновых кислот ацетил-коэнзим А (ацетил-КоА). Важную роль в биосинтезе жирных кислот играет так называемый ацетилпереносящий белок (АПБ). Синтез жирных кислот с длинной цепью начинается с переноса ацетильной группы с ацетил-КоА на АПБ. Образовавшийся комплекс становится основанием, на которое переносятся двууглеродные соединения (С2-фрагменты). Последовательное наращивание двууглеродных остатков через ряд промежуточных продуктов к образованию С14– С18-жирных кислот. Фосфолипиды возникают при взаимодействии жирных кислот и промежуточного продукта гликолиза – диоксиацетон-фосфата, синтезируются исключительно из ацетильных групп. В указанных реакциях также большую роль играет промежуточный продукт цикла трикарбоновых кислот – ацетил-КоА. Биосинтез клеточных биополимеров является составной частью пластического обмена, регулируется ферментативно, причем ключевым метаболитом являются пировиноградная кислота и ацетилкоэнзим. 3.5 Регуляция метаболизма Процессы метаболизма обеспечивают запасание микробной клеткой энергии в биологически доступной форме, синтез низкомолекулярных структурных компонентов и сложных макромолекул, а также деление клетки. В природных условиях микроорганизмы вынуждены конкурировать с другими живыми существами, что обусловило развитие в их клетках механизмов приспособления к изменяющимся внешним условиям и способствовало оптимальному согласованию между собой различных процессов метаболизма. Оптимизация 76 касается прежде всего ферментных белков, их синтеза и функционирования. Считают, что регуляция клеточного метаболизма у микроорганизмов осуществляется на двух уровнях – синтеза ферментов и изменения их активности. Первый тип регуляции характерен для большинства метаболических путей и заключается в одновременном регулировании синтеза многих ферментов, функционирующих в одном и том же метаболическом пути. Задача подобной регуляции – обеспечить необходимое соотношение между скоростью синтеза тех или иных ферментов и скоростью синтеза белка. Сама скорость обусловлена частотой транскрипции структурного гена. В клетках микроорганизмов многие ферменты синтезируются непрерывно, вне зависимости от факторов внешней среды. Это так называемые конститутивные ферменты. В основном они участвуют в обменных процессах, связанных с синтезом различных веществ и ростом клеток. Что касается ферментов, участвующих в реакциях катаболизма, то образование многих из них регулируется посредством так называемой индукции. Например, в той или иной питательной среде имеется только одно вещество, тогда в клетках микроорганизма синтезируются ферменты для расщепления именно данного вещества. В указанном случае говорят об индукции ферментов, индуцирующем субстрате и индуцируемых ферментах. Образование ферментов, участвующих в биосинтезе, часто регулируется посредством репрессии. В этом случае ферменты определенного биосинтетического пути не синтезируются, если его конечный продукт присутствует в среде. При наличии или накоплении такого конечного продукта скорость синтеза всех ферментов, управляющих реакциями данного пути, существенно снижается. Например, путем репрессии регулируется синтез ферментов, которые участвуют в образовании пиримидинов, пуринов и аминокислот. Сигнал к остановке биосинтеза белков в таких условиях исходит из конечных продуктов процесса (репрессия конечным продуктом). Если в питательной среде присутствуют два вещества, микроорганизм в большинстве случаев использует то, которое обеспечивает более быстрый рост. Образование же ферментов, расщепляющих второе вещество, репрессируется. Указанное явление называют катаболитной репрессией. Катаболитная репрессия лежит в основе так называемой диауксии. Если в среде есть два субстрата (глюкоза и сорбит или глюкоза и ацетат), то, как показано на примере кишечной па- 77 лочки, они используются бактериями не одновременно, а последовательно. Вначале потребляется глюкоза и одновременно она ингибирует синтез ферментов, участвующих в расщеплении второго субстрата. Регуляция клеточного метаболизма на уровне активности ферментов характерна, как правило, для ключевых ферментов, участвующих в биосинтетических процессах. Каталитическая активность таких ферментов может увеличиваться под влиянием положительного эффектора – активатора или уменьшается под действием отрицательного эффектора – ингибитора. Ферменты, занимающие ключевые позиции в биосинтетических путях, в большинстве случаев сами являются регуляторными. У регуляторных ферментов кроме каталитических центров есть и особые стереоспецифичные участки – так называемые аллостерические центры. Это места связывания активаторов и ингибиторов. Подобные регуляторные ферменты называют также аллостерическими. Примером аллостерического фермента может служить фосфофруктокиназа, катализующая в процессе гликолиза фосфорилирование фруктозо-6-фосфата с образованием фруктозо-1,6-бисфосфата. В реакции участвует АТФ. Если концентрация АТФ высока, ее молекулы аллостерически ингибируют фосфофруктокиназу. При усилении биосинтетических процессов увеличивается расход АТФ, ее концентрация падает и фосфорилирование фруктозо-6-фосфата возобновляется. В тех случаях, когда конечный продукт того или иного метаболического пути начинает накапливаться в клетке в количествах, превышающих ее потребности, он может действовать как аллостерический ингибитор, что приводит к ингибированию активного фермента, контролирующего первый этап указанного пути. В результате уменьшается или даже приостанавливается дальнейшее образование самого конечного продукта. Подобное явление называют ингибированием конечным продуктом, оно является примером механизма, который регулирует один из важных аспектов метаболической активности по принципу отрицательной обратной связи. Следовательно, два типа регуляции клеточного метаболизма – индукция и репрессия ферментов, с одной стороны, и изменение активности ферментов – с другой, приводят к одному и тому же результату, а именно определяют интенсивность превращения различных субстратов по тому или иному метаболическому пути. 78 В микробной клетке существуют линейные и разветвленные пути метаболизма в этих же механизмов. Направление синтеза на определенный конечно. При линейном метаболизме ферменты действуют организованно, будучи объединенными друг с другом в мультиферментные комплексы. Последние часто связаны с цитоплазматической мембраной. Благодаря линейному расположению ферментов создается возможность для саморегуляции ингибированием по принципу отрицательной обратной связи, поэтому скорость определенного метаболического пути регулируется концентрацией его конечного продукта. Здесь каждый фермент связан с соседними – продукт, образующийся при участии одного фермента, становится субстратом для другого фермента в цепи, так продолжается до тех пор, пока весь процесс не закончится образованием конечного продукта. Результатами реакций разветвленного метаболического пути могут быть самые различные продукты. Регулирование разветвленных биосинтетических путей осуществляется с помощью усложненных вариантой продукт, обусловливается условиями, которые складываются в клетке в данное время. Регуляция образования конечного продукта осуществляется ингибированием по принципу обратной связи. В разветвленном метаболическом пути действуют и мультиферментные системы, однако, ферменты их локализованы в растворе и тесно друг с другом не связаны. Катаболические пути, в которых функционируют конститутивные ферменты, регулируются большей частью посредством аллостерических воздействий на активность ферментов. Одна из задач катаболических путей – обеспечение клетки энергией. У большинства прокариот возможности генерации энергии намного превышают потребности в ней клетки. Количество АТФ, которое можно синтезировать с помощью имеющихся в клетках аэробных прокариот ферментов гликолитического и дыхательного путей, значительно больше количества АТФ, необходимого для процессов биосинтеза и поддержания жизнедеятельности. Поэтому клетки должны обладать способностью контролировать потребление энергодающих субстратов и, следовательно, выработку клеточной энергии. Основной принцип контроля прост: АТФ синтезируется только тогда, когда он необходим, интенсивность энергетических процессов у прокариот регулируется внутриклеточным содержанием АТФ. Адениловые нуклеотиды относятся к числу важнейших эффек- 79 торов. АМФ и АДФ действуют как положительные эффекторы, стимулирующие скорость энергетических процессов и, следовательно, повышающие выход АТФ. Наоборот, АТФ служит отрицательным эффектором, сигнализирующим о превышении процессов образования АТФ над его потреблением. В результате регуляции процессов синтеза и распада АТФ в клетке поддерживается стационарное энергетическое состояние, характеризующееся так называемым энергетическим зарядом клетки. Величина энергетического заряда теоретически может колебаться от 1 (в клетке все адениловые нуклеотиды только в виде АТФ) до 0 (в клетке содержится только АМФ). В растущей культуре величина энергетического заряда клетки равна примерно 0,8. Уменьшение его свидетельствует об ухудшении энергообеспечения организма. Когда эта величина становится ниже 0,5, клетки погибают. Помимо адениловых нуклеотидов в регулировании энергетических процессов активную роль играют система НАД(Ф)+/ /НАД(Ф)-Н2-коферментов и величина трансмембранного электрохимического градиента ионов водорода. Преобладание аллостерического взаимодействия восстановленной или окисленной форм НАД (Ф) с ферментами катаболического пути приводит соответственно к понижению или повышению их активности. Достижение определенного порогового значения трансмембранного электрохимического градиента ионов водорода на энергопреобразующей мембране служит определенным сигналом, тормозящим поступление ионов водорода против градиента. Процессы клеточного транспорта находятся под контролем тех же механизмов, что и внутриклеточные анаболические и катаболические процессы. Получение мутантов с нарушениями в системе регуляции клеточного метаболизма, приводящими к сверхсинтезу определенных метаболитов, широко используется для получения аминокислот, витаминов, полисахаридов и других веществ, имеющих практическое значение. 80 ГЛАВА 4 МИКРООРГАНИЗМЫ И ИХ РОЛЬ В УТИЛИЗАЦИИ ПРИРОДНЫХ БИОПОЛИМЕРОВ Основные компоненты отмерших растительных тканей – углеводорододы, целлюлоза и гемицеллюлоза, лигнин, пектиновые вещества. Большая молекулярная масса не позволяет этим молекулам проникать через цитоплазматическую мембрану бактериальной клетки. Они должны быть превращены в простые соединения, и только тогда они станут доступными для использования. Микроорганизмы имеют экзоферменты, способные разрушить природные биополимеры до более мелких молекул. Направление метаболизма, то есть путь биохимических превращений и получаемые продукты, определяется условиями протекания процессов и ассоциативными природными культурами, участвующими в процессах утилизации этих веществ. 4.1 Превращение безазотистых органических веществ Целлюлоза. Клетчатка, или целлюлоза, представляет собой один из наиболее сложных полисахаридов, отличающийся большой устойчивостью. Животными она совершенно не усваивается, так как они не имеют гидролитических ферментов целлюлазы и целлобиазы. В состав целлюлозы входит более 50% всего органического углерода биосферы, это наиболее распространенный полисахарид растительного мира, высшие растения на 40 – 70% состоят из целлюлозы. Целлюлоза – линейный гомополисахарид, состоящий из соединенных 3-1,4-гликозидными связями глюкозных остатков. Молекулярная масса полисахарида – до 500 000. В молекуле целлюлозы может содержаться до 14 000 молекул D-глюкозы. Целлюлозные волокна представляют собой пучки микрофибрилл и мицеллы (кристаллиты) – весьма плотно упакованные цепочки макромолекул, чередующиеся с некристаллическими участками. Процесс расщепления целлюлозы протекает следующим образом: при действии на целлюлозу фермента эндоглюконазы образуются олигосахара различной степени полимеризации, а также дисахарид целлобиоза. 81 Целлобиаза катализирует расщепление целлобиозы на две молекулы глюкозы. Все ферменты целлюлазного комплекса бактерий, за исключением целлобиазы, внеклеточные. В связи с большим количеством синтезируемой в природе целлюлозы микроорганизмы, ее разлагающие, играют очень важную роль в процессе минерализации органического вещества и круговороте углерода. Разнообразие микрофлоры, способной преобразовывать целлюлозу в почве, позволяет трансформировать это вещество в различных условиях среды: наличия аэрации, то есть доступности молекулярного кислорода, при разных уровнях рН, при низких или высоких условиях влажности и температуры. В кислой среде преимущественно осуществляют эти превращения грибы, в нейтральной или щелочной – бактерии. Для большинства микроорганизмов, разлагающих целлюлозу, характерна высокая специфичность по отношению к этому веществу. Разложение целлюлозы осуществляют аэробные микроорганизмы (бактерии и грибы) и анаэробные мезофильные и термофильные бактерии. Аэробное разложение целлюлозы. Группа аэробных целлюлозоразлагающих микроорганизмов наиболее богато представлена в почве. Бактерии рода Cytophaga, Sporocytophaga, разлагающие целлюлозу в большом количестве, встречаются в навозе и почвах, удобренных навозом. В расщеплении целлюлозы принимают участие миксобактерии порядка Myxobacteriales, семейств Мухососсасеае (род Myxococcus), Archangiaceae (род Archangium), Sorangiaceae (роды Sorangium и Polyangium), широко распространенные в почвах разных климатических зон, что приводит к образованию веществ гумусной природы и улучшению доступности углеродного питания для растений и других видов гетеротрофов. Могут усваивать целлюлозу единичные виды Pseudomonas (P. fluorescens var. cellulosae) и некоторых других бактерий. Актиномицеты и грибы, обитающие в относительно бедных, кислых почвах, в аэробных условиях медленно разрушают целлюлозу. К актиномицетам, разлагающим целлюлозу, относятся представители родов Streptomyces (Streptomyces cellulosae), Streptosporangium, Micromonospora (Micromonospora chalcea); к грибам – представители родов Fusarium, Chaetomium, а также отдельные виды – Trichoderma viride, Aspergillus fumigatus, Botrytis cinerea, Rhizoctonia solani, Myrothecium verrucaria. В разрушении целлюлозы участвуют и хитридиомицеты, среди кото- 82 рых много паразитов. При полном аэробном разложении целлюлозы из образовавшейся глюкозы в основном получается два продукта – СО2 и Н2О. Могут накапливаться и небольшие количества органических кислот как промежуточных продуктов процесса неполного окисления в цикле Кребса: янтарная, фумаровая, щавелеуксусная, лимонная и др., что зависит от других почвенных условий. Анаэробное разложение целлюлозы. Большинство представителей анаэробных целлюлозоразлагающих бактерий, найденных в природе, относят к семейству Bacillaceae, роду Clostridium. Эти виды обитают в почвах, компосте, навозе, речном иле и сточных водах. Клостридии устойчивы к кислотности и распространены не только в нейтральных, но и кислых почвах. Типичный представитель рода, участвующий в разложении целлюлозы при температуре 30 – 40 °С, – Clostridium omelianskii. Впервые вид выделен известным микробиологом В. Л. Омелянским в 1902 г. Этот микроорганизм имеет палочковидную форму (4–8 х 0,3–0,5 мкм), подвижен. Для него характерны толстые споры, поэтому спорообразующая клетка сильно раздувается и становится похожей на барабанную палочку. Разлагать целлюлозу может и другой мезофильный вид – С. cellobioраrит. Среди анаэробных целлюлозоразлагающих бактерий, встречающихся в почве, навозе и компостах, есть и термофилы. Они активно сбраживают целлюлозу. Так, оптимальная температура для развития С. thermocellum около 60 °С, биологический максимум приближается к 70 °С; при 40, 45 °С эта бактерия развивается слабо. К термофильным целлюлозоразлагающим анаэробам относится и вид Thermoanaerobacter ethanolicus, выделенный из горячих источников. В рубце жвачных животных обитают специфичные облигатные анаэробные целлюлозоразлагающие бактерии. Они вызывают разложение целлюлозы кормов до глюкозы, которая затем сбраживается с образованием органических кислот (уксусной, пропионовой, масляной, молочной, муравьиной, янтарной и др.), спиртов и газов (СО2 и Н2). Разложение целлюлозы в рубце животных осуществляется при участии кокковидных и палочковидных бактерий: Ruminococcus flavefaciens, Ruminococcus albus, Bacteroides succinogenes, Butyrivibrio fibrisolvens, Ruminobacter parvum. Бактерии рубца очень важны для нормального питания жвачных животных. При анаэробном распаде целлюлозы первоначальный продукт ее гидролиза – глюкоза в дальнейшем подвергается сбраживанию, в результате чего возникает много органических веществ, состав которых 83 различается у отдельных культур микроорганизмов. Метан как продукт анаэробного разложения целлюлозы выделяется, видимо, не в результате деятельности бактерий, использующих полисахариды, а вследствие жизнедеятельности вторичного бактериального населения – микробного биоценоза, утилизирующего продукты первичного разложения целлюлозы. В конце этой пищевой цепи находятся метаногены (архебактерии), продуктом жизнедеятельности которых является метан. Имеющиеся в растениях моно- и дисахариды, а также низкомолекулярные полисахариды (крахмал, инулин, камеди и т.п.) легко разрушаются различными микроорганизмами. Гемицеллюлозы наряду с лигнином и пектинами входят в состав межклеточного вещества растительных тканей, в значительных количествах содержатся в древесине, соломе, кукурузных початках и т. д. Как и целлюлоза, они присутствуют в клеточной стенке. Кроме растений, гемицеллюлозы обнаружены у грибов и дрожжей; входят в состав внеклеточных полисахаридов. Гемицеллюлозы – гетерополисахариды, состоящие из пентоз (ксилозы, арабинозы) или гексоз (глюкозы, маннозы, галактоз). Многие гемицеллюлозы содержат также уроновые кислоты. Перечисленные вещества активно разлагаются грибами, аэробными и анаэробными бактериями. В этих процессах участвует значительно больше видов микроорганизмов, чем в разложении целлюлозы. Микробное население, участвующее в разложении гемицеллюлоз растений, очень разнообразно. Это связано с неодинаковым химическим составом указанных полисахаридов у разных растений, что оказывает влияние и на характер конечных продуктов распада. К микроорганизмам, обладающим гемицеллюлозоразлагающими свойствами, относят бактерии родов Clostridium, Bacillus, Cytophaga, Sporocytophaga (например, Sporocytophaga myxococcoides), Vibrio, Streрtomyces; грибы родов Aspergillus, Rhizopus, Fomes, Polyporus и др. Первое время, после того как растительные остатки попадают в почву, гемицеллюлозная фракция полисахаридов разлагается со значительной скоростью, затем процесс замедляется. Это, вероятно, результат химической гетерогенности гемицеллюлозных фракций: одни разлагаются медленнее, другие – быстрее. Скорость превращения гемицеллюлоз микроорганизмами почвы зависит и от условий среды – температуры, влажности, рН среды. 84 Лигнин. Растения, особенно древесные, содержат большое количество лигнина во вторичных слоях клеточной оболочки и как основной компонент в составе межклеточного вещества и вторичных слоях клеточной стенки. Лигнин, содержащийся в растениях разных видов, родов и семейств растительного царства, химически неоднороден. Даже в одном растении в зависимости от фазы развития химический состав лигнина может меняться. Лигнин устойчив к воздействию микроорганизмов, разлагается значительно медленнее, чем целлюлоза и гемицеллюлоза. В аэробном разложении лигнина могут принимать участие многие представители класса Bаsidiomycetes. Так, при умеренной температуре лигнин усваивают многие высшие грибы родов Clavaria, Armillariella, Fomes, Polystictus, Polyporus и Ustiliria. Активны по отношению к лигнину Fusarium lactis, F. nivala, Trichoderma lignorum, Alternaria tenuis, Stremphylium botrypsum. Лигнин деполимеризуется до простых ароматических веществ, таких, как ванилин и другие метоксилированные ароматические структуры. Ферментная система микроорганизмов, воздействующих на лигнин, внеклеточная и представлена лигниназами – специфичными пероксидазами. В связи с тем, что лигнин разрушается относительно медленно, он накапливается в почве, и продукты разложения служат основой при образовании гумусовых веществ. Пектиновые вещества – сложные полисахариды, полигалактурониды – неразветвленные полимеры, состоящие из остатков Dгалактуроновых кислот, соединенных 1,4-гликозидными связями, которые содержат межклеточные вещества растительных тканей, первичные и вторичные клеточные стенки. Бактерии и грибы воздействуют на пектин, протопектин и пектиновую кислоту в аэробных и анаэробных условиях. В почве обнаружено большое число микроорганизмов, разлагающих пектиновые вещества (до 1 млн клеток на 1 г почвы). Высокой пектинолитической активностью обладают представители семейства Bacillaceae – аэробные бактерии рода Bacillus(В. macerans, В. polymyxd) и анаэробные рода Clostridium(С. pectinovorum, С. felsineum, С. aurantibutyricum, С. pectinolyticum, С.corallinum, С. flavum и др.), а также многие грибы. Пектины разлагаются и под влиянием фитопатогенных грибов (Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum) и бактерий (Erwinia carotovora), использующих эту свою способность для проникновения в ткани растений. 85 Продукты распада пектиновой кислоты (галактоза, арабиноза и др.) подвергаются окислению или сбраживанию при воздействии разнообразных микроорганизмов. При анаэробиозе это маслянокислые бактерии, относящиеся к роду Clostridium (С. pectinovorum, C. felsineum). Продуктами распада С. pectinovorum служат масляная и уксусная кислоты, а также газы Н2 и СО2, а в культуре C. febineum кроме указанных веществ образуется и небольшое количество ацетона и бутанола. Углеводороды относят к группе химически стойких органических веществ, несбраживаемых субстратов, так как являются полностью восстановленными органическими веществами и окислительновосстановительные реакции внутри молекул субстрата, как в случае брожения, невозможны. Однако они могут разлагаться многими микроорганизмами, но только в аэробных условиях. Возможность усвоения микроорганизмами парафинов доказана русским ученым В.О. Таусоном. Установлено, что разрушать углеводороды в природе могут представители родов Arthrobacter, Methylomonas, Methylococcus, Pseudomonas, Flavobacterium, Streptococcus, Nocardia, Mycobacterium, а также дрожжи рода Candida и ряд мицелиальных грибов. Окисляясь, углеводороды не только обеспечивают микроорганизмы энергией, но и служат материалом для синтеза структурных компонентов клетки. Среди алифатических углеводородов, подвергающихся микробиологическому воздействию, наибольший интерес представляют газообразные углеводороды. Большинство микроорганизмов, развивающихся на углеводородах данной группы, принадлежат к родам Methylomonas, Hyphomicrobium, Pseudomonas, Mycobacterium, Nocardia и др. К облигатным окислителям метана относят представителей семейства Methylomonadaceae, родов Methylomonas, Methylobacterium, Methylococcus, Methylosinus и Methylocystis. Перечисленные виды принадлежат к группе метилотрофных микроорганизмов. Они окисляют метан до метилового спирта. Известно большое число микроорганизмов, способных развиваться на алканах, имеющих от одного до 34 атомов углерода. Описаны виды, обитающие на циклических (нафтеновых) углеводородах. Хорошо изучены бактерии, усваивающие моноциклические (бензол, толуол, ксилол) и полициклические (нафталин, фенантрен, антрацен) ароматические углеводороды. Это представители родов Arthrobacter, Pseudomonas, Nocardia, дрожжи и др. 86 Окисление углеводородов с участием микроорганизмов обычно происходит при помощи адаптивных ферментов. Конечные продукты окисления углеводородов – диоксид углерода и вода, однако обнаруживаются и промежуточные продукты – спирты, органические кислоты, эфиры и другие соединения. Для успешного протекания процесса окисления необходимо наличие воды, доступного молекулярного кислорода, а также дополнительных источников азота и фосфора, так как в углеводородах этих элементов нет. Окисление жиров и жирных кислот. Жиры и жирные кислоты также подвергаются трансформации под влиянием микроорганизмов. Первая стадия расщепления жира – гидролиз, осуществляемый при действии фермента липазы. Сущность процесса может быть показана на примере тристеарина: 3С3Н5(С17Н35О2)3 + 3Н2О С3Н5(ОН)3 + 3С17Н35СООН. Тристеарин Глицерин Стеариновая кислота Также происходит разрушение жиров и другого химического состава. Образующиеся в результате гидролиза глицерин и жирные кислоты претерпевают дальнейшие превращения вплоть до полного окисления. Высокомолекулярные жирные кислоты труднорастворимы и окисляются очень медленно. Наиболее энергично воздействует на жиры Pseudomonas fluorescens – бесспоровая подвижная палочка, образующая на питательной среде зеленоватый пигмент. В разложении жира также участвуют Pseudomonas pyacyanea, Serratia marcescens, представители родов Bacillus (В. mycoides, В. mesentericus), Clostridium (С. perfringens, С. sporo-genes и др.) и многие другие микроорганизмы. Перечисленные виды не только разлагают жир на глицерин и жирные кислоты, но и окисляют последние до СО2 и Н2О. В разложении жира и жирных кислот принимают участие мицелиальные грибы родов Aspergillus, Penicillium. 4.2 Превращение микроорганизмами соединений азота Большинству растений недоступен газообразный азот, в огромном количестве находящийся в воздухе, а из разнообразных азотных соединений, встречающихся в почве, они могут усваивать только минеральные, причем в основном в аммонийной восстановленной форме. Поэтому микроорганизмы осуществляют важнейшую функцию обогащения почв доступными соединениями азота. 87 Превращения азота и содержащих этот элемент соединений в почве довольно сложны, но в них можно выделить основные направления, определяющие круговорот азота в природе. Аммонификация белков и аминокислот. Минерализация азотсодержащих соединений. Органические азотсодержащие соединения в тканях растений и животных, попадая в почву, подвергаются минерализации до аммонийных соединений. Часть растительных остатков трансформируется в содержащее азот почвенное вещество – гумус. Белки животных и растительных остатков (экскременты, трупы животных и растительные ткани) разлагают в почве разнообразные микроорганизмы, родов Pseudomonas, Bacillus, Clostridium. Среди органических соединений, составляющих клетку, первое место по количеству занимают белки – на их долю приходится не менее 50% сухой массы клетки. Значительная часть белков попадает в почву с остатками отмерших растений, животных и микроорганизмов. При разложении белков и других азотсодержащих соединений в почве при участии микроорганизмов азот освобождается в виде аммиака. Указанный процесс называют аммонификацией, или минерализацией азота. Белки подвергаются разложению как аэробными, так и анаэробными бактериями, а также актиномицетами и грибами. Особенно активны представители семейства Pseudomonadaceae, рода Pseudomonas (P. fluorescens, P. aeruginosa), семейства Васillaсеае, рода Bacillus (В. mycoides, В. cereus, В. subtilis) и рода Clostridium (С. sporogenes, С. putrificus) семейства Enterobacteriaceae, рода Proteus (P. vulgaris) и другие. В состав белков обычно входит 20 аминокислот. Аминокислоты в полимерной цепи белка располагаются так, что конец одной аминокислоты связан с началом другой пептидной связью. Такие полимерные молекулы, называемые полипептидными цепями, содержат до сотен аминокислотных звеньев. Белковая молекула включает одну или несколько полипептидных цепей. При гидролизе простых белков образуются только аминокислоты, сложных - как аминокислоты, так и другие органические и неорганические продукты. Молекулы белков и большинства пептидов велики и не могут проходить через цитоплазматическую мембрану микроорганизмов. Поэтому они расщепляются экзоферментами. Протеолитические ферменты, или протеазы, выделяемые клетками микроорганизмов в окружающую среду, осуществляют гидролиз ряда пептидных связей в молекулах белков. Образующиеся при этом частицы белковой мо- 88 лекулы (полипептиды и олигопептиды) поступают внутрь клеток микроорганизмов, где разрушаются внутриклеточными протеолитическими ферментами – пептидазами до свободных аминокислот. Последние используются для синтеза белков клетки или подвергаются дальнейшему расщеплению. Внутриклеточное или внеклеточное расщепление аминокислот может идти следующими четырьмя путями: дезаминирование RCH2CHNH2COOH RCH = СНСООН + NH3; окислительное дезаминирование RCHNH2COOH + 1/2О2 RCOCOOH + NH3; восстановительное дезаминирование RCHNH2COOH + 2Н RCH2COOH + NH3; декарбоксилирование RCHNH2COOH RCH2NH2 + СО2. Аминокислоты минерализуются с различной скоростью. Некоторые из них (треонин, метионин) более устойчивы, другие (аргинин, триптофан), наоборот, разлагаются легко. После дезаминирования углеродный остаток подвергается воздействию микробов в аэробных или анаэробных условиях до образования СО2 и различных органических соединений. Если в среде есть амиды, то первоначально они разлагаются до аминокислот и только затем уже могут быть трансформированы тем или иным путем. При аэробном распаде белка основными конечными продуктами процесса бывают СО2, аммиак, сульфаты и вода. В анаэробных условиях при распаде белка образуются аммиак, амины, СО2, органические кислоты (жирные и ароматические – бензойная, ферулиновая и др.), меркаптаны, а также вещества с неприятным запахом – индол, скатол, крезол и сероводород. При анаэробном разрушении белков могут образовываться токсичные соединения, в частности первичные амины (диамины) или птомаины. К числу последних относят кадаверин, который получается из лизина NH2CH2(CH2)3CHNH2COOH NH2CH2(CH2)3CH2NH2 + СО2. Лизин Кадаверин Накапливающиеся в анаэробных условиях в почве продукты разложения белков фитотоксичны, поэтому они нередко угнетающе действуют на растения. В дальнейшем эти соединения (каждое самостоятельно) подвергаются более глубокой трансформации. 89 Нитрификация. Аммиак, образующийся в почве, навозе и воде при разложении органических веществ, довольно быстро окисляется до азотистой, а затем азотной кислоты. Такой процесс называют нитрификацией. До середины XIX в., точнее, до работ Л. Пастера, явление образования нитратов объясняли как химическую реакцию окисления аммиака атмосферным кислородом, причем предполагалось, что почва в этом процессе играет роль катализатора. Л. Пастер предположил, что образование нитратов – микробиологический процесс. Однако лишь в 1890–1892 гг. С.Н. Виноградский, применив особую методику, изолировал чистые культуры нитрификаторов. Ученый предположил, что нитрифицирующие бактерии не растут на обычных питательных средах, содержащих органические вещества, это объяснило неудачи его предшественников. Действительно, нитрификаторы оказались хемолитоавтотрофами, т.е. бактериями, использующими энергию окисления аммиака или азотистой кислоты для синтеза органических веществ из СО2 (хемосинтез). Поэтому их клетки очень чувствительны к присутствию в среде органических соединений. Нитрифицирующие бактерии удалось выделить на минеральных питательных средах. Нитрификаторы – одноклеточные грамотрицательные бактерии, облигатные аэробы. С.Н. Виноградский установил, что существуют две группы нитрификаторов: одни окисляют аммиак до азотистой кислоты (NH4+ , NO2-) (первая фаза нитрификации): NH4 + 1/2O2 Н2О + 2Н+ другие – окисление азотистой кислоты до азотной (NO2 -, NО3-) (вторая фаза нитрификации): NO2- +1/2O2 NО3-. Представителей обеих групп относят к семейству Nitrobacteriaceae. Бактерии первой фазы нитрификации представлены родами: Nitrosomonas, Nitrosococcus, Nitrosospira, Nitrosolobus и Nitrosovibrio. Нитрифицирующие бактерии культивируют на простых минеральных средах, содержащих аммиак или нитриты (окисляемые субстраты) и диоксид углерода (основной источник углерода). Источником азота для этих организмов служат аммиак, гидроксиламин и нитриты. Нитрифицирующие бактерии развиваются при рН 6,0 – 8,6, оптимум реакции среды составляет рН 7,5 – 8,0. При значениях ниже рН 6,0 и выше рН 9,2 бактерии не развиваются. Вторую фазу нитрификации осуществляют представители родов Nitrobacter, Nitrospira и Nitrococcus. 90 Следовательно, аммиак – продукт жизнедеятельности аммонифицирующих бактерий – использует для получения энергии Nitrosomonas, а нитриты, образующиеся в процессе жизнедеятельности последних, служат источником энергии для Nitrobacter. Процесс нитрификации осуществляется на цитоплазматической и внутрицитоплазматических мембранах и проходит в несколько этапов. Первым продуктом окисления аммиака становится гидроксиламин, затем превращающийся в нитроксил (NOH) или пероксонитрит (ONOOH), последний, в свою очередь, преобразуется в дальнейшем в нитрит, а нитрит в нитрат. Кроме первой реакции (образования гидроксиламина из аммония), все последующие превращения сопровождаются синтезом макроэргических связей в виде АТФ. Нитрификаторы осуществляют фиксацию СО2 через восстановительный пентозофосфатный цикл (цикл Кальвина). В результате последующих реакций образуются не только углеводы, но и другие важные для бактерий соединения – белки, нуклеиновые кислоты, жиры и т.д. Нитрификаторы не растут на обычных питательных средах, так как большое количество легкоусвояемых органических веществ, содержащихся в таких средах, задерживает их развитие. Однако в природе такие бактерии хорошо развиваются в черноземах, навозе, компостах, т.е. в местах, где содержится много органического вещества. Указанное противоречие оказывается несущественным, если сравнивать количество легкоокисляемого углерода в почве с теми концентрациями органического вещества, которые нитрификаторы должны выдерживать в культурах. Так, органическое вещество почв представлено главным образом гуминовыми веществами, на которые приходится в черноземе 71–91% общего углерода, а легкоусвояемые водорастворимые органические вещества составляют не более 0,1% общего углерода. Следовательно, нитрификаторы не встречают в почве больших количеств легкоусвояемого органического вещества. Вместе с тем при нитрификации происходит лишь перевод одного питательного для растений вещества – аммиака в другую форму – азотную кислоту. В растительном организме соли азотной кислоты перед включением в синтез должны быть восстановлены, на что тратится энергия. Аммоний же используется непосредственно. Азот в органических формах растениям практически недоступен. 91 Способны осуществлять нитрификацию и некоторые гетеротрофные микроорганизмы. К ним относятся бактерии из родов Pseudomonas, Arthrobacter, Corynebacteriит, Nocardia и отдельные виды грибов из родов Fusarium, Aspergillus, Penicillium, Cladosporium. Установлено, что Arthrobacter sp. в присутствии органических субстратов вызывает окисление аммиака с образованием гидроксиламина, а затем нитрита и нитрата. Некоторые бактерии вызывают нитрификацию таких азотсодержащих органических веществ, как амиды, амины, гидроксамовые кислоты, нитросоединения (алифатические и ароматические), оксимы и другие. Однако считают, что гетеротрофная нитрификация не служит источником энергии для перечисленных организмов. Гетеротрофная нитрификация встречается в естественных условиях (почвах, водоемах и субстратах). Она может приобретать главенствующее значение, особенно в атипичных условиях (например, при высоком содержании органических С- и N-соединений в щелочной почве). Гетеротрофные микроорганизмы не только способствуют окислению азота в таких условиях, но и вызывают образование и накопление токсичных веществ, соединений канцерогенного и мутагенного, а также химиотерапевтического действия, которые вредны для человека и животных даже в относительно низких концентрациях. При определенных условиях имеющиеся в почве минеральные формы азота переходят в недоступные для растений соединения. Один из таких процессов возникает вследствие бурного развития микроорганизмов, которые потребляют азот и переводят его в белок цитоплазмы. Подобный процесс называют иммобилизацией азота. Биологически закрепленный азот не теряется из почвы. После отмирания микроорганизмов белковые вещества минерализуются и превращаются в аммиак. Иммобилизация представляет собой процесс, обратный минерализации. Превращение азотсодержащих соединений по пути минерализации или, наоборот, иммобилизации полностью определяется соотношением азота и углерода в органическом веществе, вносимом в почву. Если субстрат имеет узкое соотношение С : N, то при его разложении накапливается аммиак, поскольку микроорганизмам не хватает углеродсодержащих соединений для ассимиляции азота. Экспериментальные данные показывают, что в среднем на каждые 100 г разложенного органического вещества (50 г С) микроорганизмы потребляют 2 г азота (С : N = 25). 92 При внесении в почву массы, богатой углеводами и бедной азотом, происходит потребление минерального азота. В общем можно считать, что органические соединения с соотношением С :N, близким к 20–25 : 1 и менее, способствуют накоплению минеральных форм азота в почве, а вещества с более широким соотношением этих элементов вызывают иммобилизацию азотных запасов. Денитрификация. При определенных условиях нитраты могут восстанавливаться до молекулярного азота и улетучиваются из почвы. Нитраты восстанавливают до газообразного азота бактерии, главным образом рода Pseudomonas. Значительное количество азотсодержащих соединений микроорганизмы ассимилируют, они способны вызывать как мобилизационные процессы и накапливать доступные для растений минеральные азотсодержащие вещества, так и диаметрально противоположные им – иммобилизационные, обедняющие почву ценными для растений соединениями. В почве совершается ряд процессов, в результате которых окисленные формы азота (нитраты, нитриты) восстанавливаются до оксидов азота или молекулярного азота. Это приводит к существенным потерям из почвы ценных для растений соединений. Восстановление нитратов и нитритов до газообразных азотных соединений происходит в результате прямой и косвенной денитрификации. Под прямой денитрификацией подразумевают биологическое восстановление нитратов, а под косвенной – химическое их восстановление. Микроорганизмы обладают способностью восстанавливать нитраты в процессах как биосинтеза, так и катаболизма. Восстановление нитратов, осуществляемое при биосинтезе и приводящее к образованию азотсодержащих клеточных компонентов, носит название ассимиляционной нитратредукции. Такой процесс способны выполнять растения и многие микроорганизмы. В процессе диссимиляционной нитратредукции, или денитрификации, нитраты используются как окислители органических веществ вместо молекулярного кислорода, что обеспечивает микроорганизмы необходимой энергией. При этом происходит восстановление нитратов до таких конечных газообразных продуктов, как NO, N2O или N2 (в зависимости от вида микроорганизма и условий среды). Денитрификация осуществляется микроорганизмами в анаэробных условиях и ингибируется кислородом воздуха. Нитраты в 93 анаэробных условиях выполняют роль акцепторов электронов, которые поступают от окисляемых соединений – органических или неорганических. В тех случаях, когда донорами электронов служат органические соединения, денитрификацию осуществляют хемоорганогетеротрофы, а если неорганические – хемолитоавтотрофы. В процессе денитрификации участвуют ферменты, содержащие молибден (FeS-белки – нитратредуктаза А и нитритредуктаза), локализованные на клеточных мембранах. Начальный этап восстановления нитратов при денитрификации катализуется ферментом нитратредуктазой А. Синтез данного фермента в клетках бактерий в присутствии нитрата идет только в анаэробных условиях. В аэробных условиях нитратредуктаза А не образуется. Денитрификацию в системе энергетического метаболизма называют также анаэробным, или нитратным, дыханием. При нитратном дыхании хемоорганогетеротрофов органические вещества полностью окисляются до СО2 и Н2О, азот нитратов теряется в газообразной форме. Энергетические возможности процесса окисления органических субстратов с участием нитратов вполне сопоставимы с энергетическими возможностями процесса аэробного дыхания, т.е. с участием свободного кислорода. Большинство органических субстратов, использующихся в аэробном окислении, может быть потреблено при отсутствии О2, если в среде имеются нитраты. Существование денитрификаторов в анаэробных условиях обеспечивают не только нитраты, но и нитриты. Способностью к нитратному дыханию обладает большое число родов бактерий. Первый этап процесса – восстановление нитратов в нитриты – идет при участии разнообразных микроорганизмов, как прокариот, так и эукариот (водоросли, грибы и дрожжи). Полное восстановление нитратов до газообразных продуктов (NO, N2O, N2) могут осуществлять только прокариоты. В наибольшей степени способность к полному восстановлению нитратов распространена у представителей родов Pseudomonas (P. fluorescens, P. stutzeri, P. aeruginosa) и Bacillus (В. licheniformis и др.). К хемолитоавтотрофным бактериям-денитрификаторам относят Thiobacillus denitrificans, Thiomicrospira denitrificans, Paracoccus denitrificans. Сероокисляющие Thiobacillus denitrificans и Thiomicrospira denitrificans способны размножаться в анаэробных условиях, исполь- 94 зуя в качестве источника энергии и восстановителя элементарную серу или тиосульфат. В обмене веществ Paracoccus denitrificans нитраты выступают окислителями водорода (Н2), восстанавливаясь при этом полностью до N2. Денитрифицирующие бактерии – факультативно анаэробные организмы, способные восстанавливать нитраты только в анаэробных условиях. В присутствии свободного кислорода эти бактерии переходят на аэробное дыхание (обладают полной дыхательной системой), а нитраты потребляют лишь как источник азота (ассимиляционная нитратредукция). Некоторые денитрификаторы способны и к процессу азотфиксации. В результате микробиологической денитрификации в атмосферу ежегодно поступает из почв и водоемов 270–330 млн т азота. Азот почвы может теряться и в результате различных химических реакций (косвенная денитрификация). Молекулярный азот образуется химическим путем при реакции между азотистой кислотой и аминокислотами или солями аммония. 4.3 Разложение других азотсодержащих соединений Нуклеиновые кислоты входят в состав нуклеопротеидов. Нуклеиновые кислоты – РНК и ДНК – органические вещества большой молекулярной массы, представляющие собой полимеры. При их гидролизе освобождаются пуриновые и пиримидиновые соединения, сахар и фосфорная кислота. Сахар в РНК представлен рибозой, в ДНК – дезоксирибозой. Пурины – аденин и гуанин – найдены как в молекулах РНК, так и в молекулах ДНК. Из пиримидинов – цитозин обнаружен в РНК и ДНК, урацил – только в РНК, а тимин – только в ДНК. Длинные молекулы нуклеиновых кислот при разложении деполимеризуются. Сначала отщепляются небольшие фрагменты, которые затем распадаются на отдельные мононуклеотиды. Процесс расщепления идет при участии ферментов рибонуклеазы и дезоксирибонуклеазы, синтезируемых некоторыми видами грибов, актиномицетами и рядом бактерий. На следующем этапе от мононуклеотидов под воздействием нуклеотидаз отщепляется фосфорная кислота, затем – сахар, пуриновые и пиримидиновые основания. В зависимости от типа обмена веществ микроорганизмов сахар в дальнейшем может окисляться кислородом до СО2 и Н2О или подвер- 95 гаться брожению с образованием органических кислот и спиртов. Азотсодержащие основания разлагаются до мочевины и аминокислот и, в конце концов, до аммиака и органических кислот. К азотсодержащим органическим соединениям, часто встречающимся в природе, относятся мочевина, мочевая и гиппуровая кислоты. Мочевина присутствует в моче человека и животных, ее могут синтезировать почвенные грибы. Так, до 13% сухой массы плодовых тел шампиньонов составляет мочевина. Это же соединение образуется при гидролитическом распаде аргинина под действием фермента аргиназы. На земном шаре за год организмы синтезируют до 30 млн т мочевины, что составляет существенные ресурсы азота: мочевина содержит 46% этого элемента и используется как удобрение. Под действием микроорганизмов, содержащих фермент уреазу, мочевина в несколько этапов превращается в аммиак и диоксид углерода: CO (NH2)2 + 2Н2О (NH4)2CO3 2NH3 + СО2 + Н2О. Многие бактерии и грибы, синтезирующие уреазу, могут использовать мочевину как источник азота для синтеза белков. Обычно бактерии, разлагающие мочевину, называют уробактериями. Эти организмы могут развиваться при высокой щелочности среды (рН 9– 10), что позволяет им вызывать распад значительного количества мочевины до аммиака. Из специфических уробактерий наиболее важны Micrococcus urea из семейства Micrococcaceae, Bacillus pasteurii из семейства Bacillaceae, а также Spomsarcina urea. Физиологический смысл распада мочевины, сводится к переводу аминной формы азота в более легкоусвояемую аммиачную. Мочевая и гиппуровая кислоты также играют важную роль в белковом обмене млекопитающих, пресмыкающихся, насекомых и птиц. В экскрементах змей содержится до 90% мочевой кислоты, а в помете птиц – 25%. В моче млекопитающих мочевой кислоты содержится незначительное количество. Мочевая и гиппуровая кислоты быстро распадаются под влиянием гидролитических ферментов ряда микроорганизмов. Разложение мочевой кислоты в местах скопления помета птиц (гуано) в условиях засушливого климата приводит к накоплению нитратов. Образующийся в таких местах в массе аммиак подвергается окислению нитрифицирующими бактериями. В связи с низкой влажностью нитраты из гуано не вымываются, а накапливаются. Все это обусловило возникновение богатых залежей нитратов 96 в Чили, Перу, Южной Африке и на островах Карибского моря. Гуано содержит 9% азота, 13% фосфорной кислоты, калий, кальций, различные микроэлементы, поэтому используется как удобрение в сельском хозяйстве. Хитин. Разложение хитина осуществляют многие почвенные микроорганизмы, он постоянно присутствует в почве. Это азотсодержащий полисахарид, полимер ацетилглюкозамина. Хитин содержится в наружном скелете беспозвоночных животных, в панцирных покровах насекомых, в клеточной стенке многих грибов, в частности базидиомицетов и аскомицетов. Способностью разлагать хитин обладают около 50 видов бактерий родов Pseudomonas, Flavobacterium, Bacillus, Cytophaga, Streptomyces, Nocardia и Micromonospora. Из грибов активно воздействуют на это вещество мукоровые грибы и аспергиллы (Aspergillus fumigatus), а также Mortierella. Особенно легко разлагается хитин актиномицетами. Известны и миксобактерии, усваивающие хитин, например, скользящая бактерия Chitinophaga pinensis. Под действием синтезируемого микроорганизмами фермента хитиназы хитин вначале разлагается на хитобиозу и хитотриозу, попутно образуется небольшое количество N-аце-тилглюкозамина. Затем хитобиоза и хитотриоза расщепляются в присутствии хитобиазы до уксусной кислоты, глюкозы и аммиака. 97 ГЛАВА 5 ХАРАКТЕРИСТИКА БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ Технология – это совокупность способов, приемов для получения из исходного материала (сырья) практически ценного продукта. Биотехнология – междисциплинарная область научнотехнического прогресса, возникшая на стыке биологических, химических и технологических наук, целенаправленное получение ценных для народного хозяйства и различных областей человеческой деятельности продуктов, в процессе которого используется биохимическая деятельность микроорганизмов, изолированных клеток или их компонентов. В последние десятилетия постоянно вырастает потребность в изучении и практическом применении микробиологических процессов, многие из них давно используются в крупномасштабных производствах (производство кормового белка, этанола, антибиотиков, витаминов, аминокислот и органических кислот). Потребности людей в животном белке удовлетворяется лишь на 40%, синтез растительного белка протекает с относительно низкой эффективностью, поэтому на единицу площади сохраняется невысокий уровень продуктивности в сельском хозяйстве, причем на Земле лишь 10% суши обрабатывается для посевов. Остальные – неудобные горы, пустыни, тундра, каменистые почвы. Очевидные трудности в сельском хозяйстве связаны также с потребностью в воде, к определенному уровню температуры, необходимостью защиты растений от вредных насекомых, болезней, внесения азотных и других видов удобрений, так как растения забирают эти элементы из почвы. Для культивирования микроорганизмов не нужны большие площади и вышеперечисленные условия. Стоимость белковых микробных препаратов не зависит от погоды. Скорость роста микроорганизмов значительно превышает рост других живых организмов при создании им благоприятных условий. При этом микроорганизмы имеют мобильные ферментативные системы, позволяющие им использовать для получения энергии и собственного роста практически любые органические и многие неорганические субстраты, образуя при этом продукты, которые трудно или невозможно получить обычными технологиями. 98 В мире происходит исчезновение традиционных видов топлива – нефти и природного газа, а с помощью микроорганизмов можно получать дополнительные источники энергии в виде биогаза, этанола, водорода за счет использования ими отходов промышленности и сельского хозяйства, а также солнечной энергии. Микробиологические производства могут работать как безотходные, сохранять чистоту окружающей среды, а также трансформировать и подвергать детоксикации ядовитые отходы других производств, необходимо только подобрать условия и технологические решения для конкретных случаев. С помощью микроорганизмов, обладающих лигнолитическими и целюлозолитическими ферментами, возможно превращение этих веществ в белковые продукты, биоэтанол, метан с одновременной очисткой окружающей среды, так как целлюлоза составляет основную часть промышленных и бытовых отходов. Работы ведутся и в направлении биологической деструкции нефти и нефтепродуктов, как наиболее частого загрязнителя природы, с помощью искусственно созданных сообществ (ценозов) микроорганизмов, способных в естественных условиях разлагать нефть на более низкомолекулярные вещества и утилизировать их до включения в естественный оборот веществ. Биотехнология по сравнению с химической технологией имеет ряд преимуществ: • возможность получать вещества, не синтезируемые химическим путем (ферменты, белки, гормоны, ДНК, некоторые аминокислоты); • все биотехнологические процессы наносят меньший ущерб окружающей среде, так как они близки к естественным процессам; • микроорганизмы обладают высокой скоростью роста и накопления клеточной массы, по сравнению с другими организмами; • в качестве сырья для производства можно использовать дешевые отходы сельского хозяйства или промышленности; • технология и оборудование биологических производств более просты. Принципиальное отличие биотехнологических процессов от чисто химических заключается в следующем: • чувствительность биологических агентов к физикомеханическим воздействиям; 99 • наличие межфазового переноса веществ (по типу жидкость – клетки, газ – жидкость – клетки); • требования условий асептики; • низкие скорости протекания многих процессов в целом; • нестабильность целевых продуктов; • пенообразование; • сложность механизмов регуляции роста и биосинтеза. Биотехнологический процесс – это процесс, основными компонентами которого являются: биологический агент (микроорганизмы), субстрат в доступной для усвоения микроорганизмами форме, специальная аппаратура, способная поддерживать выбранный режим культивирования и методология регулирования и управления процессом Организуя биохимическую деятельность микроорганизмов, преследуются цели получения ценных продуктов естественными способами, когда эти вещества затратно или невозможно получить другими способами. Процесс ферментации – это процесс, в котором происходит преобразование исходного сырья в целевой продукт с использованием биохимической деятельности микроорганизмов или изолированных клеток. Этот процесс может осуществляться несколькими способами, в зависимости от поставленных целей и возможностей микроорганизмов: 1. Наращивание клеточной массы (культивирование, выращивание микроорганизмов), которая и представляет собой продукт. К такому классу технологий относится получение пекарских и кормовых дрожжей, многих вакцин. 2. Образование (биосинтез) в процессе роста и развития клеток ценных биохимических продуктов – первичных или вторичных метаболитов, некоторые из них выделяются в среду (внеклеточные продукты), некоторые накапливаются в биомассе (внутриклеточные продукты). В этих случаях производство существует ради получения целевых продуктов, а не самой биомассы, которая часто является балластом. 3. Биотрансформация – процесс, в результате которого под воздействием биохимической деятельности микроорганизмов или ферментов происходит изменение химического состава исходного химического вещества. Отличие от рассмотренного процесса биосинтеза состоит в том, что при этом обычно происходят относительно небольшие изменения в химической структуре вещества, оно не синтезируется заново из относительно более простых веществ. Кроме того, в процессе биотрансформации используют обычно уже готовый био- 100 логический агент – клетки микроорганизмов или ферменты, в ходе самого процесса биотрансформации они не образуются. Пример процесса биотрансформации – превращение глюкозы фруктозу под воздействием фермента глюкозоизомеразы. Оба сахара имеют одну формулу С6Н12О6, но различную пространственную структуру молекулы. Биокатализ – процесс, в котором уже полученный ранее фермент или биомасса микроорганизмов используются как катализаторы биохимического процесса синтеза продукта из исходного сырья и реагентов. 4. Биодеструкция – потребление микроорганизмами из окружающей среды веществ, которые являются нежелательными примесями (загрязнениями) при очистке сточной воды и почв. Здесь биомасса микроорганизмов служит промежуточным агентом, по окончании процесса она становится ненужной, очищенная вода удаляется, а биомасса активного ила, которая потребляет загрязнения, все время отводится от системы и затем обезвреживается или перерабатывается для получения из нее других полезных продуктов. Либо в случае очистки территорий биомасса микроорганизмов остается в почве, обогащая ее органическими веществами и участвуя в восстановлении свойств почвы. Такие процессы применяют при биологической очистке сточных вод и загрязненных участков. 5. Выщелачивание с помощью микроорганизмов, т.е. перевод в растворенное состояние некоторых веществ, находящихся в твердых телах. Примером является микробиологическое выщелачивание ценных металлов из руд – меди, цинка, урана и др. 6. Особым случаем является использование биохимической деятельности микроорганизмов с целью образования газов и за счет этого создания, например, пористых материалов. Так, для этого используют дрожжи при приготовлении хлеба. Одно из назначений дрожжей при получении пива или шампанского – также создать в среде высокую концентрацию растворенного диоксида углерода, чтобы вино или пиво хорошо пенилось. В последнее время получил широкое распространение процесс получения биогаза (в основном метана или водорода) как источника энергии на основе растительных отходов с использованием возможностей микроорганизмов. Рассмотренные шесть основных направлений биохимической деятельности микроорганизмов являются основой для получения широкого класса продуктов биотехнологии. 101 Требования к качеству и составу продуктов, предъявляемые различными отраслями народного хозяйства, в значительной степени определяют многообразие технологических режимов микробиологических производств и соответственно аппаратурное оформление процессов. 5.1 Классификация процессов ферментации По признаку целевого продукта процесса ферментация может быть следующих типов: 1. Ферментация, в которой целевым продуктом является сама биомасса микроорганизмов, именно такие процессы часто обозначают словами «культивирование», «выращивание». 2. Целевым продуктом является не сама биомасса, а продукты метаболизма – внеклеточные или внутриклеточные; такие процессы часто называют процессами биосинтеза. 3. Задачей ферментации является утилизация определенных компонентов исходной среды; к таким процессам относятся биоокисление, метановое брожение, биокомпостирование и биодеградация. Исходную среду в процессах ферментации или ее основной компонент обозначают словом «субстрат». По основной фазе, в которой протекает процесс ферментации, различаются: 1. Поверхностная (твердофазная) ферментация (культивирование на агаровых средах, на зерне, производство сыра и колбас, биокомпостирование). 2. Глубинная (жидкофазная) ферментация, где биомасса микроорганизмов суспендирована в жидкой питательной среде, через которую при необходимости продувается воздух и другие газы. 3. Газофазная ферментация, в которой процесс протекает на твердом носителе, где закрепляются микроорганизмы, но сами частицы носителя взвешены в потоке газа, насыщенном аэрозолем питательной среды. Подобный способ ферментации используется довольно редко, в основном при очистке газов от вредных и одорирующих примесей. По отношению к кислороду различают аэробную, анаэробную и факультативно-анаэробную ферментацию – по аналогии с классификацией самих микроорганизмов. Продуценты – аэробы биоло- 102 гически активных веществ нуждаются при глубинном культивировании в специальном снабжении их кислородом. По отношению к свету – световая (фототрофная) и темновая (хемотрофная) ферментация. По степени защищенности от посторонней микрофлоры – асептическая, условно асептическая и неасептическая ферментация. Иногда асептическую ферментацию называют стерильной, что неверно: в среде есть целевые микроорганизмы, но нет чужеродных. В условно асептической ферментации допускается некоторый уровень попадания посторонней микрофлоры, которая способна сосуществовать основной или по содержанию не превышает определенного предела. По числу видов микроорганизмов различают ферментации на основе монокультуры (или чистой культуры) и смешанное культивирование, в котором осуществляется совместное развитие ассоциации двух или более культур. По способу организации процессы ферментации могут быть: периодические; периодические с подпиткой субстрата; непрерывные; полунепрерывные многоциклические; с подпиткой субстрата. отъемно-доливные; 5.2 Составляющие биотехнологического процесса Для роста биообъекта, выбранного в качестве продуцента для синтеза определенных целевых продуктов, нужны исходный жизнеспособный посевной материал; источники энергии и углерода; питательные вещества для синтеза биомассы; отсутствие факторов, ингибирующих его рост; соответствующие физико-химические условия (рН, температура, аэрация и другие). Штамм – культура микроорганизма, наследственная однородность которой поддерживается отбором по специфическим фенотипическим признакам, ему принадлежит ключевая роль в производстве. Штамм – «продуцент» – штамм микроорганизмов, биологический объект, предназначенный для осуществления биотехнологического производства, его природа и физиолого-биоимические свойства определяют все другие качественные характеристики процесса. Продуценты могут быть получены различными способами. Если природный микроорганизм обладает каким-либо ферментом для осуществления биотехнологического процесса (например, гидроли- 106 за), то отбор ведут по наивысшей активности данного фермента, либо по повышенной его концентрации в клетке. Обычно это достигается отбором мутантных форм. Все культуры, используемые в промышленности, подвергают селекции. Отобранные мутантные штаммы хранятся при соответствующих условиях, стабилизирующих полезные свойства микроорганизмов. Хранение музейной культуры. Производственные культуры (продуценты) хранятся в специальных лабораторных коллекциях и носят название музей микроорганизмов. Для проведения качественного биотехнологического процесса необходимо поддерживать чистую культуру продуцента. В зависимости от его физиологических свойств и способности сохранять полезные производственные свойства в музейных коллекциях используют: периодические пересевы (от 1 раза в две недели до 1 раза в полгода) на твердых или полутвердых (полужидких) средах; хранение в полужидком агаре под маслом (например, вазелиновым), которое позволяет делать пересевы в 2–3 года; спорообразующие объекты (дрожжи, бациллы) можно хранить в запаянных ампулах; лиофильно высушенные культуры неспорообразующих клеток; культуры, замороженные в жидком азоте. При любом способе хранения необходимо проводить периодическую проверку музейных культур на сохранение ими продуцирующей активности. Существуют специфичные методы проверки сохранения свойств биообъекта в зависимости от задач биотехнологического производства. Перед запуском биотехнологического процесса необходимо получить иннокулят (засевную культуру), что обычно достигается масштабированием. Культура микроорганизмов – микроорганизмы, выращенные в искусственных условиях в жидкой или плотной питательной среде. Посевной материал готовится в лаборатории в несколько стадий. Сначала выделяется чистая культура – это культура микроорганизмов, полученная из одной клетки. Затем проводятся исследования этой культуры на чистоту, на антибиотическую активность. Далее приступают к наработке засевной партии. Выращивают культуру, выделяют моноизоляты, масштабируют до необходимого объема. Засевная культура хранится в холодильнике при температуре 0 +4 С на скошенном МПА в лаборатории приготовления посевного материала, где поддерживается в активном состоянии. 107 Из пробирки музейного материала получают омоложенную культуру, затем отсевают на чашку Петри с последующим рассевом на 5–10 чашек. При выращивании посевных доз инокулята применяют принцип масштабирования, то есть проводят последовательное наращивание биомассы продуцента в колбах, бутылях, далее в серии ферментеров. Каждый последующий этап данного процесса отличается по объему от предыдущего обычно на порядок. Каждый моноизолят рассевают на два скошенных МПА. Затем культуру из пробирки переносят в колбы с ферментационной средой для выращивания посевного инокулята. После проверки активности и контроля на чистоту культуры засевают в количестве 5 % от объема питательной среды не менее двух посевных колб объемом 700 мл. Каждой посевной колбой засевают три ферментационные колбы объемом 2 л. Ферментационные колбы проходят проверку на активность, если она удовлетворительная, то колбы снабжаются этикеткой с паспортом культуры и отправляются в цех на засев инокулятора. После стерилизации в чистый инокулятор загружают среду (коэффициент загрузки 0,5,) и стерилизуют ее сначала глухим паром в рубашку до 70 0С, а затем острым паром до 135 0С и выдерживают 20 мин. При понижении температуры до 37 1 0С аппарат готов к посеву. Выключают вентиляцию, поверхность аппарата моют 3 %-м раствором хлорамина, увлажняют пол. Посев производят ферментационной колбой через спиртовой факел в количестве 0,002 % к объему засеваемой среды. Инокулят – раствор чистой культуры штамма-продуцента на питательной среде, полученный масштабированием инокулят по стерильной посевной линии направляется далее в аппарат, в котором реализуется ферментационная стадия. Субстрат – питательная среда, сырье, предназначенное для осуществления ферментации, которое может отличаться в зависимости от поставленных задач биотехнологического процесса. Для проведения биотехнологических процессов культура биообъекта всегда должна быть предварительно выращена, то есть, накоплена биомасса. Типичный элементарный состав микроорганизма (в % к весу сухой биомассы): С-50, N-7-12, P-1-3, S-0,5-1, Mg-0,5, микроэлементы. Все клетки содержат также О2, Н2. Поэтому среда для выращивания должна включать все эти элементы в нужных соотношениях. Источник углерода в среде часто служит и источником энергии для микроорганизмов. Характерным углеродсодержащим сырьем являются уг- 108 леводы. Они используются для синтеза клеточных структур и одновременно служат источником энергии. Для промышленного биосинтеза наиболее часто применяют глюкозу или крахмал. Для успешного культивирования микроорганизмов необходимы: источник энергии и углерода (чаще углеводы); макроэлементы (в основном – азот, фосфор); микроэлементы (широкий набор: медь, кальций, магний и др.); факторы роста (ими могут быть витамины, некоторые аминокислоты, гормоны роста и пр.). Все известные среды для культивирования микроорганизмов, используемые в микробиологической практике, по составу разделяют на две основные группы: натуральные среды неопределенного состава и синтетические. Приготовление питательных сред осуществляется в специальных реакторах, оборудованных мешалками. В зависимости от растворимости и совместимости компонентов сред могут быть применены отдельные реакторы. Технология приготовления сред значительно усложняется, если в их состав входят нерастворимые компоненты. В родных биотехнологических процессах применяются различные по происхождению и количествам субстраты, поэтому процесс их приготовления варьирует. Дозирование питательных компонентов подбирается и осуществляется индивидуально на каждом производстве в соответствии с технологическим регламентом конкретного процесса. В качестве дозирующего оборудования при этом применяются весовые и объемные устройства, используемые в пищевой и химической промышленности. Транспорт веществ осуществляется насосами, ленточными и шнековыми транспортерами. Сыпучие компоненты подают в ферментеры с помощью вакуумных насосов. Часто применяют принцип предварительных смесей, то есть соли предварительно растворяют и затем транспортируют по трубопроводам, дозируя их подачу по объему. По физическому состоянию выделяют на три группы: твердые (приготовленные с агаром, желатиной или на кремневых пластинках); жидкие и сыпучие (увлажненные отруби, зерно). В промышленных условиях обычно используют натуральные среды неопределенного состава. Натуральными называют среды, которые состоят из природных соединений, продуктов животного или растительного происхождения, имеющих сложный неопределенный химический состав. В качестве природных соединений или продуктов, издавна использующихся в микробиологии, применяются различные части зеленых растений, животные ткани, солод, дрожжи, 109 фрукты и овощи, а также навоз, почву и т.д. Большинство из них используется в виде экстрактов или настоек. Преимуществом натуральных сред является то, что на них хорошо развиваются микроорганизмы большинства видов, так как в составе таких сред имеются, как правило, все компоненты, необходимые для роста и развития. Кроме того, эти среды легко приготовлять; материал для них дешев и доступен. Натуральные среды используются для поддержания организмов, для накопления биомассы или для диагностических целей. Различают природные (полные) и синтетические (минимальные) среды. Комплексные среды содержат кроме известных соединений добавку органических соединений неизвестного состава (например, пептон – продукт переработки мясоперерабатывающей промышленности; экстракт из дрожжевых клеток и т.д.). Синтетические среды имеют известный состав: соли, углеводы, аминокислоты и др. Составом таких сред легко варьировать, что позволяет оптимизировать процесс накопления биомассы биообъектом. Однако по стоимости, как правило, такие среды намного дороже комплексных, так как для получения чистых препаратов требуется работа не одного завода. В то время как для получения органических добавок сложного (неизвестного) состава можно использовать существующие производства пищевой промышленности. При использовании этих продуктов остаются жидкие стоки, имеющие сложный органический состав и требующие длительной очистки, избытка кислорода. Поэтому перспективным считается непищевое, легко возобновляемое сырье – соевая мука. В питательных средах различные источники азота могут быть представлены белками, пептидами или свободными аминокислотами. При промышленной ферментации используют кукурузный экстракт, соевую муку или гидролизаты дрожжей, а также аммоний, его соли или мочевина. Фосфор, сера и другие макро- и микроэлементы также в виде солей. Источники витаминов – автолизаты дрожжей, кукурузный экстракт. Существенное значение имеет соотношение количества присутствующих в среде азота и углерода. Их дозировку необходимо регулировать в соответствии с оптимальными границами концентрации наиболее важных веществ для данной культуры. Для каждого штамма-продуцента эта величина будет различной, изменение соотношения C:N, воздействуя на скорость роста продуцента, метаболизм, вызывает сверхсинтез ряда целевых продуктов (аминокислот, полисахаридов и др.). 110 При приготовлении среды сырье нужным образом перерабатывают по консистенции, подгоняют рН, удаляют лишние микроэлементы, если штамм не может использовать сахарозу или крахмал, проводят инверсию или ферментативный гидролиз до глюкозы. Целлюлозу подвергают кислотному гидролизу. Нефть очищают отгонкой. Питательные среды готовят в специальных реакторах с мешалкой поточным методом или прямо в ферментере. Из питательных веществ часто проблема из-за отсутствия кислорода, так как он плохо растворим в воде. Кислород в нормальных условиях может окислить только 8,3мг глюкозы (в 1 л воды – 6,2 мл кислорода, поэтому всегда нужна аэрация, т.е. подача стерильного воздуха через специальные фильтры. Ферментер заполняется примерно на 70% объема, так как при работе образуется пена. В качестве пеногасителя используются растительные и животные масла, силиконы, механические средства. При составлении сред для микроорганизмов необходимо учитывать объем выращиваемой культуры, так как часть субстрата просто может быть не использована ввиду ограничений по массообмену (так называемая остаточная концентрация субстрата). Чем меньше остаточная концентрация субстрата после достижения максимальной биомассы, тем экономичнее будет технологический процесс производства конечного продукта. На предферментационной стадии осуществляют хранение и подготовку культуры продуцента (инокулята), получение и подготовку питательных субстратов и сред, ферментационной аппаратуры, технологической и рециркулируемой воды и воздуха. Основным на этом этапе является стерилизация всего используемого материала, так как от этого зависит чистота биотехнологического процесса и качество конечного продукта. Существует несколько методов стерилизации: пастеризация – кратковременное прогревание до 70–80°С; обработка острым, глухим или текучим паром; обжиг пламенем (обычно для металлических деталей); прогревание сухим жаром при высоких температурах (стекло); обработка антисептиком рабочих помещений; автоклавирование (для сред и большинства инструментария); стерилизация озоном, радиацией, ультразвуком, ультрофиолетом. 111 Для стерилизации питательных сред используют непрерывной или периодической методы. Периодический метод применяется при использовании небольших объемов среды и состоит в том, что среда нагревается до 120– 130 0С непосредственно в ферментаторах или котлах-стерилизаторах, выдерживается при этой температуре в течение 30–60 мин, после чего охлаждается до температуры культивирования. При этом среда и оборудование стерилизуются одновременно. Непрерывный метод стерилизации применяют при использовании больших объемов среды. Питательные среды для ферментации приготовляют путем предварительного растворения сахаров и солей и тщательного суспендирования таких нерастворимых компонентов, как соевая мука и мел. Тщательная гомогенизация твердых компонентов – необходимое условие стерилизации. В твердых комках, медленно нагревающихся при стерилизации, длительность выдерживания бывает меньше расчетной, и в них сохраняется посторонняя микрофлора, способная инфицировать культуральную жидкость. Тепловая стерилизация приводит к определенным химическим изменениям в составе питательной среды. Следовательно, эффективная стерилизация в сочетании с минимальными изменениями среды может быть достигнута путем применения более высокой температуры, а также быстрого нагревания и охлаждения. Методы очистки и стерилизации воздуха. Освобождение воздуха от живых микробов может быть достигнуто уничтожением их высокой температурой, ионизирующей радиацией или УФ-облучением; применением асептиков (фенола и ртуть содержащих соединений) и т.п. Эти сложные приемы мало экономичны из-за высокой устойчивости спор и конидий к высоким температурам и ионизирующему излучению. В процессах микробиологического синтеза воздух, подаваемый на аэрацию, должен быть практически полностью очищен от примесей и микроорганизмов размером до 1мкм. Это требование заставляет отказаться от многих приемов газовой очистки (седиментация, механическая фильтрация, методы мокрой очистки – применяются в производстве белка) как неэффективных, обеспечивающих удаление только грубых частиц. По экономической причине на действующих предприятиях предпочитают удалять микробы путем пропускания воздуха через стой волокнистого (маты, бумага, картон) или насыпного (полимерметаллокерамикс) материала. Другие методы очистки газов, разработанные в химической технологии, малоэффективны и дороги. Не- 112 смотря на то, что волокнистые фильтры имеют диаметр не менее 5 мкм и слабое уплотнение, они легко задерживают большинство микроорганизмов со средним размером около 1 мкм. Для различных процессов существует огромное разнообразие аппаратуры: собственно для процесса ферментации, а также для выделения и получения готового продукта. Наиболее сложна и специфична аппаратура для ферментационной стадии. Технически наиболее сложным процессом ферментации является аэробный глубинный стерильный и непрерывный (или с подпиткой субстратом). Аппараты для поверхностной и анаэробной ферментации менее сложны и энергоемки. В современной литературе описаны сотни биореакторов, отличающихся по конструкции, принципу работы и размерам (от нескольких литров до нескольких тысяч кубометров). Многочисленность методов культивирования, чрезвычайное многообразие используемых биологических агентов привели к огромному разнообразию конструктивных решений, которые зависят от ряда факторов: типа продуцента и среды, технологии и масштабов производства, а также целевого продукта и пр. Техническое оснащение биотехнологии базируется на общих положениях технической биохимии и пищевой технологии, однако имеет свою специфику. Каждая технология, применяющая живые микробные клетки в качестве продуцента, имеет в своем составе кроме биотехнологических, также химико-технологические и физико-механические процессы, обладает своими особенностями аппаратурного оформления, требованиями к сырью и режимам, но среди них есть общие критерии, которые можно обобщить как особенности этих технологий в целом. Любое микробиологическое производство можно представить в виде последовательно выполняемых технологических стадий или этапов. В каждом конкретном микробиологическом производстве есть свои отличительные особенности. Но общими чертами всех производств являются стадии подготовки питательных сред, получения посевного материала, выращивания производственной культуры в поверхностных или глубинных условиях и выделения конечного продукта. Факторы, влияющие на ферментационные процессы, подразделяются следующим образом: физические (температура процесса, давление освещенность); химические (активная кислотность, состав и концентрация органических и неорганических веществ, ингибиторов и стимуляторов, кислорода в субстрате и др.); 113 биологические (штамм культуры микроорганизмов, степень адаптации к субстрату, концентрация биомассы при ферментации и др.); технологические (продолжительность ферментации, методы аэрации, подвода энергии, культивирования и др.). 5.3 Оборудование для биотехнологических процессов Правильный выбор и эффективная эксплуатация оборудования в значительной степени зависят от свойств перерабатываемого сырья и технологических режимов ведения процесса. Производство продуктов микробного синтеза связано с использованием больших количеств жидких и сыпучих видов сырья и сжатого воздуха. Поэтому существуют достаточно жесткие требования к оборудованию для хранения, перемещения и подготовки к микробиологической переработки исходных субстратов, стерилизации питательных сред и воздуха. Аппараты для глубинного аэробного, анаэробного и поверхностного культивирования микроорганизмов имеют свои конструктивные особенности, которые определяются многими факторами: видом сырья и продуцента, режимом культивирования, необходимостью введения других компонентов в ходе культивирования. Большое внимание уделяется механическому перемешиванию – одному из важнейших вопросов в создании ферментаторов с интенсивным массообменном. Важнейшими этапами производства любого продукта биотехнологии являются выделение, концентрирование и сушка продуктов биосинтеза. Принципы переработки различных видов сырья и получения продуктов микробного синтеза очень близки и основаны на приготовлении питательных сред, культивировании микроорганизмов, выделении, концентрировании и сушке продуктов биосинтеза. С учетом этих особенностей приводится классификация машин и аппаратов по назначению в микробиологических производствах. Ферментер (ферментатор). Одно из основных требований, которое предъявляется к ферментатору, – сохранение стерильности при интенсивной аэрации питательной среды во время всего периода культивирования. Ферментатор представляет собой герметическую цилиндрическую емкость со сферическими крышкой и днищем. Объем аппарата может быть от 0,01 до 100 м3. Высота ферментаторов в 2–2,5 раза превышает диаметр. Лучший материал для изготовления ферментаторов – нержавеющая сталь. Для увеличения пути прохождения пузырьков воздуха рекомендуются высокие узкие ферментеры 114 высотой в 3 раза больше диаметра. В высоком сосуде воздух подвергается большему давлению, увеличивая растворимость кислорода. Микроорганизмы могут использовать только растворенный кислород. Насыщение кислородом питательной среды осуществляется путем аэрации, обеспечивающей контакт между воздушной и жидкой фазами. Наибольшее распространение в микробиологической промышленности получили аэрирующие устройства барботажного типа. Для увеличения дисперсности газа и поверхности газовых пузырьков необходимо сильное хорошее перемешивание. Ферментатор снабжен термостатирующим, перемешивающим и регулирующим рН среды устройствами, оборудован системой подачи питательной среды, пеногасителя, воды, пара и т.д. При всех этих условиях происходит интенсивный рост микроорганизмов и выделение тепла (на 1г биомассы выделяется 3ккал, а при концентрации 20 г/л – около 60 ккал). Микроорганизмы могут выдержать не более 5 ккал/литр, что вызывает повышение температуры на 5 0С. Тепло, выделяемое в процессе роста микроорганизмов, отводится с помощью различных теплообменных конструкций, для чего ферментер имеет внешнюю водяную рубашку и внутренние трубчатые охладители. В процессе культивирования ведется постоянный контроль за состоянием культуры и накоплением продукта биосинтеза, фиксируется потребление основных компонентов среды, контролируется рН культуральной жидкости. Режим культивирования контролируется с помощью автоматических датчиков, фиксируется и обрабатывается на компьютерных программах, задаются нужные параметры, вносятся изменения в режим подачи кислорода, питательных элементов, воды, охлаждающих реагентов. Для успешного выращивания производственных культур большое значение имеет предотвращение пенообразования. Все ферментаторы снабжены устройствами для введения пеногасителя и контроля высоты пены в аппарате. Для снижения пенообразования используют химические пеногасители. Среди них растительные масла (касторовое, подсолнечное, соевое) и животные жиры (свиной, говяжий, бараний, костный, китовый, кашалотовый). Применяют также и механические средства (циклоны, вращающиеся в верхней части ферментатора лопасти). Использавоние противопенных агентов следует расценивать как неотъемлемую часть аэробного выращивания микроорганизмов. Все виды ферментации идентифицируются по способу загрузки сырья и выгрузки продукта. 115 Периодический процесс ведется в накопительном режиме. В течение цикла питательные вещества в среду дополнительно не вводятся, продукты обмена не удаляются. Когда содержание целевого продукта достигает максимума, процесс прекращается и содержимое отбирается. Развитие культуры начинается с лагфазы, длительность которой зависит от условий выращивания посевного материала. За этот период клетки посевного материала должны перейти из состояния голодания или отравления (например, продуктами метаболизма) в состояние, соответствующее способности к размножению. Далее следует экспоненциальная фаза, характеризующая способность культуры к размножению. В этой фазе сведено до минимума влияние лимитирующих и ингибирующих факторов. Компоненты питательной среды имеются в избытке, продукты обмена еще не накопились. В этих условиях рост культуры идет с максимально возможной скоростью, генетически заложенной в клетке. Эта фаза не может быть длительной, так как со временем популяция начинает испытывать недостаток в одном или нескольких элементах питания либо ингибирующее рост влияние накапливающихся в среде продуктов обмена. Затем скорость роста (относительная) начинает уменьшаться – наступает фаза замедления роста. Фаза замедления роста может быть очень разнообразной и самой сложной. Она может полностью отсутствовать на простых синтетических средах, когда рост сразу прекращается из-за отсутствия одного элемента питания, в особенности источника углерода и энергии. На сложных средах, содержащих несколько источников углерода, может происходить поочередное их потребление и постепенное замедление роста культуры. Достигнув некоторой максимальной величины, концентрация биомассы перестает возрастать, истощаются питательные вещества и накапливаются продукты обмена. Биомасса растет одновременно с протеканием автолиза клеток, общая концентрация остается постоянной. В периодических процессах загрузка сырья и посевного материала в аппарат производится единовременно, затем в аппарате в течение определенного времени идет процесс, а после его завершения полученная ферментационная жидкость выгружается из аппарата. Микробные клетки при периодическом культивировании претерпевают значительные изменения в течение всего периода роста, обусловленные непрерывными изменениями окружающей среды и быстрой реакцией на них клеток. 116 В непрерывных процессах загрузка и выгрузка среды протекают непрерывно и одновременно, причем скорость подачи в аппарат свежей питательной среды равна скорости отбора из аппарата ферментационной жидкости. В итоге объем среды в аппарате сохраняется постоянным в течение длительного времени, теоретически – бесконечно, а практически – до какой-нибудь неполадки. Непрерывный процесс культивирования микроорганизмов обладает существенными преимуществами перед периодическим. Непрерывная ферментация осуществляется в условиях установившегося режима, когда микробная популяция и ее продукты наиболее однородны. Применение непрерывных процессов ферментации создает условия для эффективного регулирования и управления процессами биосинтеза. Системы непрерывной ферментации могут быть организованы по принципу полного вытеснения или полного смешения. Варианты непрерывного культивирования различаются по способу поддержания культуры в динамическом равновесии. Различают открытые и замкнутые системы непрерывного культивирования. В открытых системах клетки постоянно вымываются вытекающей жидкостью со скоростью образования в системе новых клеток; в этих условиях легко достигается их устойчивая концентрация. В замкнутых системах клетки в какой-то мере задерживаются в системе, и их количество все возрастает. В этих условиях одни лимитирующие факторы сменяют другие, наконец, большая часть клеток отмирает, и такая система не в состоянии достигнуть установившегося динамического равновесия. Замкнутые системы менее пригодны, чем открытые для точного регулирования всех условий культивирования. Многоциклические процессы в основном напоминают периодические, но при выгрузке в аппарате оставляется часть ферментационной жидкости, которая служит засевным материалом для следующей ферментации, и только после этого добавляется свежая среда. Такая методика позволяет обходиться без свежего засевного материала. В отъемно-доливных процессах ферментация между разгрузкой и загрузкой аппарата протекает как периодическая, но после некоторого времени, определяемого по состоянию процесса часть ферментационной среды выгружают и добавляют свежую. В сравнении с многоциклическим процессом количество отбираемой жидкости здесь меньше, но и интервалы между отборами меньше, а количество отборов больше. При таких частых отборах и добавлениях среды процесс протекает по-другому, чем в строго периодическом процессе, 117 имеет лучшие характеристики и обеспечивает экономию в затратах на посевной материал. В периодическом процессе с подпиткой субстрата часть среды загружается в начале ферментации, а другая часть добавляется непрерывно по мере протекания процесса. Естественным завершением процесса является переполнение аппарата, поэтому необходимо переходить на строго периодический процесс с максимальным объемом среды и быстро завершать его. Полунепрерывные процессы с подпиткой субстрата являются сочетанием отъемно-доливных и подпиточных. В рассмотренном процессе с подпиткой после достижения определенного состояния происходит отбор части ферментационной жидкости из аппарата, а затем постепенное добавление субстрата до нового заполнения аппарата. В результате удается снять с одного аппарата во много раз больше культуральной жидкости, да и процесс при этом протекает значительно интенсивнее. Контроль и управление процессом ферментации осуществляется с помощью дозаторов, титраторов, различных блоков управления. Во время производственного процесса снимаются показания температуры ферментации в средней зоне (0С), температуры в нижней зоне ферментера (0С), расхода воздуха (м3/ч), давления (атм), кислотности среды (единицах рН), уровня культуральной жидкости, охлаждения. Управление современными процессами полностью автоматизировано. Параллельно ведется отбор проб для проведения лабораторного контроля состояния культуры и накопления метаболитов. Одним из основных показателей, характеризующих адекватность процесса ферментации, служит скорость роста продуцента. Скорость роста (увеличение биомассы) организмов с бинарным делением (большинство микроорганизмов относится к такому типу размножения) в периодической культуре будет пропорциональна концентрации микробной массы. Ферментационные процессы имеют многосторонние и сложные механизмы превращений как со стороны субстрата, среды, так и биомассы микроорганизмов, и эти изменения необходимо контролировать для получения целевых продуктов и регулирования процесса Обычно состояние процесса характеризуется следующими основными параметрами: концентрация биомассы микроорганизмов X; концентрация питательной среды – субстрата (его основного компонента) S; 118 концентрация продукта Р. Все эти концентрации приведены к единице объема среды. Продуктивность процесса характеризуется количеством продукта, получаемого на единицу объема биореактора (ферментера) в единицу времени. Продуктивность зависит от многих факторов: активности продуцента, коэффициента выхода продукта на единицу потребленного продукта, количества активной биомассы в ферментере и др. Динамика урожая и скорости образования целевого продукта зависят от параметров как самого ферментера (объем, скорость протока культуральной жидкости и др.), так и состояния культуры продуцента (поддержание активного штамма, так как существует гетерогенность популяций и менее активные штаммы, как правило, вытесняют штаммы-продуценты). Для подержания активного продуцента обычно используют добавку в среду селективного фактора (если это возможно) или параметры управления (температура, рН). Выход продукта или экономический коэффициент – основной показатель эффективности биотехнологического процесса. Он определяется как количество продукта, получаемого из данного количества субстрата. Данный коэффициент выражает эффективность использования субстрата для получения целевого продукта, что позволяет определить себестоимость конечного продукта. Этот коэффициент имеет четкий физический смысл, характеризующий степень перехода энергии, заключенной в субстрате, в продукт. Постферментационная стадия обеспечивает получение готовой товарной продукции и также, что не менее важно, обезвреживание отходов и побочных продуктов. В зависимости от локализации конечного продукта (клетка или культуральная жидкость) и его природы на постферментационной стадии применяют различную аппаратуру и методы выделения и очистки. После стадии культивирования микроорганизма-продуцента следующим технологическим этапом является выделение и очистка конечного продукта из культуральной жидкости. В культуральной жидкости кроме нужного продукта содержатся остатки веществ среды и микробная масса. Для многих технологических производств эта стадия начинается с разделения двух фаз, так как конечный продукт может содержаться либо в нативном растворе, либо в микробной массе. Наиболее трудоемко выделение продукта, накапливающегося в клетках. Первым этапом постферментационной стадии является фракционирование культуральной жидкости и отделение взвешенной фазы – биомассы. Наиболее распространенный для этих целей метод 119 – сепарация, осуществляемая в специальных аппаратах – сепараторах, которые работают по различным схемам в зависимости от свойств обрабатываемой культуральной жидкости. Основные проблемы возникают при необходимости выделения мелковзвешенных частиц с размером 0,5–1,0 мкм и менее (бактериальные клетки) и необходимостью переработки больших объемов жидкости (производство кормового белка, ряда аминокислот). Для повышения эффективности процесса сепарации применяют предварительную специальную обработку культуры – изменение рН, нагревание, добавление химических агентов. Процесс выделения и очистки метаболитов представляет собой ряд последовательных технологических операций, количество которых возрастает с повышением желаемой чистоты конечного продукта. Подбираются приемы, которые не сопровождаются резкими химическими воздействиями на выделяемое вещество. В производственных условиях данная технологическая стадия связана с обработкой больших объемов труднофильтруемых суспензий и потерями основного конечного продукта. Для улучшения фильтруемости и повышения качества фильтратов проводится предварительная обработка культуральной жидкости. Используют обработку электролитами, фильтрующими порошками, флокулянтами, тепловую и кислотную коагуляцию и др. В процессах выделения и очистки метаболитов применяются экстракционные и ионообменные методы. Для отделения микробной массы от культуральной жидкости применяют фильтр – прессы, сепараторы, вакуум-фильтры, центрифуги различной производительности, ее просто высушивают. Если целевой продукт находится внутри клеток (фермент, гормон и др.), то необходимо сначала разрушить клетки, а затем экстрагировать продукт на определенных носителях для последующей его концентрации. Для извлечения внутриклеточных биополимеров – белков, нуклеиновых кислот, ферментов, липидов – широко используется метод дезинтеграции. Разрушение клеточных оболочек микроорганизмов осуществляется несколькими способами: химическими, биологическими и физическими (механическими). Химические способы основаны на деструкции упорядоченных структур клеточной стенки микроорганизмов. Наиболее известные химические способы: обработка клеточной суспензии непосредственно щелочью, мочевиной, глицерином, аммиаком, перекисью водорода. В результате обработки происходит увеличение проницаемости клеточной стенки, и биополимеры с большой молекулярной массой 120 выводятся через барьеры. Процесс извлечения может сопровождаться деструкцией продукта. Биологические способы относятся к более мягким способам разрушения клеточной оболочки и выделения внутриклеточных метаботитов за счет работы литических ферментов. Развитие методов ферментативной дезинтеграции сдерживается сравнительно высокой стоимостью ферментных препаратов и отсутствием высокоочищенных литических ферментов. Ферментативные реакции обычно осуществляются в специальных реакторах с рабочей поверхностью 120 и 1800 см2. Полученные дезинтеграты освобождают от оболочек разрушенных клеток, а осветленный раствор обрабатывают так же, как КЖ. Физические способы. Физическая дезинтеграция – это процесс, происходящий при высоких скоростях и сопровождающийся быстрым перемешиванием разрушаемого материала в зоне действия дезинтегрирующих сил. Наиболее известные способы разрушения биологического материала – это замораживание и оттаивание, ультразвуковые воздействия, истирание клеток. При необходимости выделить вторичный метаболит, который находится в надосадочной жидкости, его экстрагируют из жидкости и концентрируют. Используют различные методы, в большинстве своем основанные на фильтрации, экстракции из раствора и концентрации продукта с помощью хромотографии. Разделение и очистка продуктов необходима, когда при используемых на первых этапах методах проходит много примесных соединений. Для увеличения сроков годности биотехнологических продуктов производят их обезвоживание и стабилизацию. Обычно в завершении этапов экстракции и очистки следует стадия высушивания продукта. Последнее особенно важно, так как в отрыве от естественного местообитания (клетка или среда) продукт может стать активным. Поскольку одни и те же продукты могут производиться на различных биотехнологических производствах, проводится обязательная стандартизация конечного продукта, то есть продукт должен отвечать определенным требованиям ГОСТа, как российского, так и международного. Продукты. Ассортимент продуктов, получаемых в биотехнологических процессах, чрезвычайно широк. По разнообразию и объемам производства на первом месте стоят продукты, получаемые в процессах, основанных на жизнедеятельности микроорганизмов. Эти продукты подразделяются на три основные группы: 121 1-я группа – биомасса, которая является целевым продуктом (белок одноклеточных) или используется в качестве биологического агента (биометаногенез, бактериальное выщелачивание металлов); 2-я группа – первичные метаболиты – это низкомолекулярные соединения, необходимые для роста микроорганизмов в качестве строительных блоков макромолекул, коферментов (аминокислоты, витамины, органические кислоты); 3-я группа – вторичные метаболиты (идиолиты) – это соединения, не требующиеся для роста микроорганизмов и не связанные с их ростом (антибиотики, алкалоиды, гормоны роста и токсины). Среди продуктов микробиологического синтеза – огромное количество различных биологически активных соединений, в том числе белковых и лекарственных веществ, ферментов, а также энергоносители (биогаз, спирты) и минеральные ресурсы (металлы), средства для борьбы с вредителями сельскохозяйственных культур (биоинсектициды) и биоудобрения (слайд). В связи с развитием новейших методов биотехнологии (инженерной энзимологии, клеточной и генной инженерии) спектр целевых продуктов непрерывно дополняется. Среди них все большее место занимают средства диагностики и лечения (гибридомы, моноклональные антитела, вакцины и сыворотки, гормоны, модифицированные антибиотики). 122 ГЛАВА 6 ПРОИЗВОДСТВО ВИТАМИНОВ НА ОСНОВЕ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ Витамины (от латинского vita – жизнь) – это группа низкомолекулярных органических веществ различной химической природы, необходимых любому организму в ничтожных концентрациях и выполняющих в нем каталитические и регуляторные функции. Недостаток того или иного витамина нарушает обмен веществ и нормальные процессы жизнедеятельности организма, приводит к развитию патологических состояний. Организм человека и животных не синтезирует витамины или синтезирует в недостаточном количестве и поэтому должен получать их в готовом виде с пищей. Витамины обладают исключительно высокой биологической активностью и требуются организму в очень небольших количествах: от нескольких микрограммов до нескольких миллиграммов в день. Большинство витаминов являются коферментами или их предшественниками и участвуют в многочисленных ферментативных реакциях. В природе источником витаминов являются растения и микроорганизмы. Менахиноны и кобаламины синтезируются исключительно микроорганизмами. И хотя химический синтез в производстве большей части витаминов занимает ведущее положение, микробиологические методы также имеют большое практическое значение. К водорастворимым витаминам относят: витамин С, витамины группы В (тиамин или витамин В1, рибофлавин или витамин В2, витамины В6, В12), пантотеновую кислоту и биотин. К жирорастворимым витаминам относятся витамины А, D, E. Благодаря изучению физиологии и генетики микроорганизмов продуцентов витаминов и выяснению путей биосинтеза каждого из них создана теоретическая основа для получения микробиологическим способом практически всех известных в настоящее время витаминов. Однако с помощью энзимов целесообразнее производить лишь особо сложные по строению витамины: В2, B12, β-каротин (провитамин А) и предшественники витамина D. Остальные витамины либо выделяют из природных источников, либо синтезируют химическим путем. Витамины используются в качестве лечебных препаратов, для создания сбалансированных пищевых и кормовых рационов и для интенсификации биотехнологических процессов. 123 6.1 Получение витамина В2 Витамин В2 (рибофлавин). Вплоть до 30-х годов прошлого столетия рибофлавин выделяли из природного сырья. В наибольшей концентрации он присутствует в моркови и печени трески. Из 1 т моркови можно изолировать лишь 1 г рибофлавина, а из 1 т печени – 6 г. В 1935 г. обнаружен активный продуцент рибофлавина – гриб Eremothecium ashbyii, способный при выращивании на 1 т питательной смеси синтезировать 25 кг витамина В2. Сверхсинтеза рибофлавина добиваются действием на дикие штаммы мутагенов, нарушающих механизм ретроингибирования синтеза витамина В2, флавиновыми нуклеотидами, а также изменением состава культуральной среды. Отбор мутантов ведут по устойчивости к аналогу витамина В2 – розеофлавину. Недостаток культуры Е. ashbyii – ее нестабильность. При хранении на твердых средах при комнатной, низкой температуре и даже в процессе лиофилизации гриб легко теряет способность к сверхсинтезу рибофлавина. Для сохранения штамма Е. ashbyii в активном состоянии в течение длительного времени (8–10 месяцев) рекомендуется производить систематический рассев на твердые питательные среды и отбирать наиболее интенсивно окрашенные в оранжевый цвет колонии. Яркая окраска колоний коррелирует с высокой рибофлавин-синтетической способностью. При подготовке инокулята гриб пересевают последовательно по схеме: посев на скошенную агаризованную среду в пробирке на жидкую среду, в колбы с нарастающим объемом, в инокулятор. В состав среды для роста продуцентов витамина В2 входят достаточно сложные органические вещества – соевая мука, кукурузный экстракт, сахароза, карбонат кальция, хлорид натрия, гидрофосфат калия, витамины, технический жир. Грибы весьма чувствительны к изменению состава среды и подвержены инфицированию. Перед подачей в ферментер среду подвергают стерилизации, добавляя к ней антибиотики и антисептики. Подготавливают жидкую питательную среду и посевной материал культуры дрожжей в разных емкостях – ферментере и посевном аппарате. Культивирование в ферментере ведут до начала лизиса клеток и появления спор (определяют микроскопически). Температура культивирования 28–30 0С, давление воздуха в ферментере (1–2) 104 Па, расход воздуха 1,5–2,0 л в минуту на 1 л культуральной жидкости. Выход рибофлавина около 1200 мкг/мл. 124 Для получения кормового препарата рибофлавина культуральную жидкость упаривают под вакуумом до содержания 30–40% сухих веществ. Сироп высушивают в распылительной сушилке, сухую пленку дробят в дробилке до состояния порошка, который расфасовывают. Препарат кормового витамина В2 – смесь биомассы мицелия. Е. ashbyii и сухих веществ среды – содержит не менее 15 мг рибофлавина в одном грамме, а также витамины В1, В3, В6, В12, никотиновую кислоту и 20% белка. Содержание влаги не более 8%. Клонированием генов рибофлавинового оперона в одной из созданных плазмид рекомбинантного штамма продуцента Bacillus subtilis был получен производственный штамм-продуцент витамина В2, способный синтезировать втрое больше по сравнению с Е.ashbyii количество рибофлавина всего за 40 ч ферментации. Витамином В2 витаминизируют некоторые сорта белого хлеба. Его используют также для окраски в оранжево-желтый цвет пищевых продуктов. Среди производных изоаллоксазинов имеются соединения, обладающие противоопухолевым и противовоспалительным действием. Очень важна хорошая обеспеченность флавинами кормов животных и птиц. Комбикорма должны содержать 5–6 г. рибофлавина на одну тонну. Добавки витамина В2 в корма обеспечивают нормальный рост животных, высокую яйценоскость кур и выживаемость цыплят. 6.2 Получение витамина В12 Витамин В12 открыт в 1948 году одновременно в США и Англии. В 1972 году в Гарвардском университете был осуществлен химический синтез корриноидного предшественника витамина B12. Химический синтез корнестерона – структурного элемента корринового кольца витамина, включающий 37 стадий, в крупных масштабах не воспроизведен из-за сложности процесса. Витамин B12 регулирует углеводный и липидный обмен, участвует в метаболизме незаменимых аминокислот, пуриновых и пиримидиновых оснований, стимулирует образование предшественников гемоглобина в костном мозге; применяется в медицине для лечения злокачественной анемии, лучевой болезни, заболеваний печени, полиневрита и т.п. Добавление витамина к кормам способствует более полноценному усвоению растительных белков и повышает продуктивность сельскохозяйственных животных на 10–15 %. 125 Первоначально витамин B12 получали исключительно из природного сырья, но из 1 т печени можно было выделить всего лишь 15 мг витамина. Единственный способ его получения в настоящее время – микробиологический синтез. В природе витамин В12 и родственные корринойдные соединения находят в клетках микроорганизмов, в тканях животных и некоторых высших растениях (горох, лотос, побеги бамбука, листья и стручки фасоли). Однако происхождение витамина В12 в высших растениях окончательно не установлено. Такие низшие эукариоты, как дрожжи, мицелиальные грибы, корринойды, по-видимому, не образуют. Организм животных не способен к самостоятельному синтезу витамина. Среди прокариот способность к биосинтезу корринойдов широко распространена. Активно продуцируют витамин B12 представители рода Propionibacterium. Природные штаммы пропионовокислых бактерий образуют 1,0–8,5 мг/л корринойдов, но получен мутант P.shermanii M-82, с помощью которого получают до 85мг/л витамина. В семействе Propionobacberiaceae есть и другие представители, способные к высокому накоплению витамина В12 в клетка. Это, прежде всего, Eubacterium limosum (Butyribacteriu rettgeri). Как продуценты витамина практический интерес имеют многие представители актиномицетов и родственных микроорганизмов. Истинный витамин B12 в значительных количествах синтезирует Nokardia rugosa. Путем мутации и отбора получен штамм Nokardia rugosa, накапливающий до 18 мг/л витамина В12. Активные продуценты витамина обнаружены среди представителей рода Micromonospora: M. eshinospora, M.halophitica, M.fusca M. chalceae. Высокой кабаламинсинтезирующей активностью обладают метаногенные бактерии, например, Methanosarcina barkeri, M. vacuolata и отдельные штаммы галофильного вида Methanococcus halophilus. Последний микроорганизм синтезирует более 16 мг корринойдов на один грамм биомассы. Столь высокого содержания корринойдов не отмечено ни у одного другого из изученных микроорганизмов. Корринойды синтезируют строго анаэробные бактерии из рода клостридии. У Clostridium tetanomorphum и Cl. sticrlandii аденозинкобаломин входит в состав ферментных систем, катализирующих специфические реакции изомеризации таких аминокислот, как глутаминовая, лизин и орнитин. В значительных количествах образуют витамин B12 ацетогенные бактерии Сl. thermoaceticum и Acetobacter woodi, синтезирующие аце- 126 тат из СО2. В нашей стране в качестве продуцента витамина В12 используют Рropionobacterium freudenreichii var. Shermaniil. Для получения витамина В12 бактерии культивируют периодическим методом в анаэробных условиях в среде, содержащей кукурузный экстракт, глюкозу, соли кобальта и сульфата аммония. Образующиеся в процессе брожения кислоты нейтрализуют раствором щелочи, которая непрерывно поступает в ферментер. Через 72 ч в среду вносят предшественник 5,6-ДМБ. Без искусственного введения 5,6-ДМБ бактерии синтезируют фактор В и псевдовитамин В12 (азотистым основанием служит аденин), не имеющие клинического значения. Так, выход витамина на среде с кукурузным экстрактом и глюкозой при поддержании стабильного значения рН близ нейтральных зон достигает 21–23 мг/л. Мутант пропионовокислых бактерий продуцирует до 30 мг/л витамина. Бактерии плохо переносят перемешивание. Применение уплотняющих агентов (агар, крахмал), предотвращающих оседание бактерий, а также использование высокоанаэробных условий и автоматического поддержания рН позволяет получить наиболее высокий выход витамина – 58 мг/л. Ферментацию заканчивают через 72 ч. Витамин сохраняется в клетках бактерий. Поэтому после брожения биомассу сепарируют и экстрагируют из нее витамин водой, подкисленной до рН 4,5–5,0 при 85–90°С в течение 60 мин с добавлением в качестве стабилизатора 0,25% NaNO2. При получении Ко-В12 стабилизатор не добавляют. Водный раствор витамина охлаждают, доводят рН до 6,8 – 7,0 50% раствором NaOH. К нему добавляют A12(SO4)3.18H2O и безводный FeCl3 для коагуляции белков и фильтруют через фильтр-пресс. Очистку раствора проводят ионообменной смолой СГ-1, с которой кобаламины элюируют раствором аммиака. Далее проводят дополнительную очистку водного раствора витамина органическими растворителями, упаривание и очистку на колонке с А12О3. С окиси алюминия кобаламины элюируют водным ацетоном. При этом КОВ12 может быть отделен от CN-оксикобаламина. К водно-ацетоновому раствору витамина добавляют ацетон и выдерживают при 3–4 °С 24–48 ч. Выпадающие кристаллы витамина отфильтровывают, промывают сухим ацетоном и серным эфиром и сушат в вакуум-эксикаторе. Для предотвращения разложения Ко-В12 все операции необходимо проводить в сильно затемненных помещениях или при красном свете. Таким образом, можно получить не 127 только смесь CN- и оксикобаломинов, но и коферментную форму, которая обладает высоким терапевтическим эффектом. Для химической очистки витамина B12 используется его способность образовывать аддукты с фенолом и резорцином. При этом способе отделения витамина от сопутствующих ему факторов упрощается. Промышленный концентрат цианкобаламина обрабатывают водным раствором резорцина (или фенола), выделяют комплекс витамина В12 с резорцином (или фенолом), далее разлагают его и получают кристаллический препарат. В процессе получения витамина B12 с помощью пропионовокислых бактерий применяют дорогостоящую антикоррозийную аппаратуру, сложные и дорогие питательные среды. Усовершенствование технологического процесса идет в направлении удешевления компонентов питательных сред (замена глюкозы сульфитными щелоками) и перехода с периодического культивирования на непрерывный процесс. Известны активные продуценты витамина В12 у псевдомонад, среди которых лучше других изучен штамм Pseudomonas denitrificans. MB-2436 – мутант, дающий на оптимизированной среде до 59 мг/л корриноидов. Интерес представляют термофильные бациллы, а именно, Bacillus circulans и Вас.stearothermophilus, которые растут соответственно при 60 и 75 °С и за 18 ч культивирования без соблюдения стерильных условий дают (2,0–6,0 мг/л) выхода витамина. Корринойды синтезируют Rhodopseudomonos palustric, фототрофные пурпурные бактерии Rhodobacter sphericus, Rh. capsulatus, Rhodospirilium rubrum, Chromatium vinosum и ряд других видов. Значительные количества витамина В12 образует цианобактерия Anabaena cylindrica, одноклеточные зеленые водоросли Chlorella pyrenoidosae и красные водоросли Rhodosorus marinus. Продуценты витамина В12 культивируют в средах, приготовленных на основе пищевого сырья: соевой муки, рыбной муки, мясного и кукурузного экстракта. В последние годы выявлены микроорганизмы, образующие высокие качества корриноидов при утилизации непищевого сырья. Achromobacter sp., используя изопропиловый спирт как источник углерода и энергии, накапливает до 1,1 мг/л провитамина, Pseudomonas sp. синтезирует витамин B12 в среде с метанолом или пропандиолом (до 160 мкг/л), факультативный метилотроф (FM=02T) образует в среде с метанолом до 2,6 мг/л витамина. 128 6.3 Получение витамина А и ß-каротина Витамин А и ß-каротин. Важное место в обмене веществ у животных занимает ß-каротин, который в печени превращается в витамин А (ретинол). В организме человека и животных каротины не образуются. Основные источники р-каротина для животных – растительные корма; человек получает ß-каротин также из продуктов животного происхождения, ß-каротин можно выделить из ряда растительных объектов – моркови, тыквы, облепихи, люцерны. В начале 60-х годов XX века разработана схема микробиологического синтеза ß-каротина, которая стала основой промышленного способа его получения. Установлено, что многие микроорганизмы – фототрофные бактерии, актиномицеты, плесневые грибы, дрожжи – синтезируют каротин. Характерно, что содержание ß-каротина у микроорганизмов во много раз превышает содержание этого провитамина у растений. Так, в 1 г моркови присутствует всего 60 мкг ß-каротина, в то время как в 1 г биомассы гриба Blaneslea trispora – 38 тыс. мкг. Разработаны опытные установки как периодического, так и непрерывного действия для синтеза ß-каротина, основной недостаток которых – высокая стоимость сырья и большая длительность процесса. Витамин А (ретинол). Основными источниками витамина А служат яйца, сливки, сметана, коровье молоко, сливочное масло, почки и печень крупного рогатого скота, печень некоторых рыб и морских животных: трески, палтуса, акулы, кита, тюленя и др. Суточная потребность человека в витамине А составляет 2,5 мг. Витамин А в высших растениях и микроорганизмах не синтезируется, но у них образуется его предшественники – каротиноиды. Структурные изомеры каротина способны превращаться в организме человека и животных в витамин А в результате расщепления в печени и слизистой оболочке кишечника. Каротиноиды – наиболее многочисленная и широко распространенная группа природных ферментов. Их образуют высшие растения, водоросли (хлорелла), бактерии. Кроме того, каротиноиды синтезируют некоторые мицелиальные грибы и дрожжи. Изомерные формы каротиноидов обладают различной А-витаминной активностью. Каротиноиды получают с помощью химического синтеза и путем выделения из природных источников – растений и микроорганизмов. Химическим путем получают ß -каротин, витамин А и ряд других каротиноидов, синтез которых осуществляется в заводских масштабах. 129 Из растительных материалов каротиноиды могут быть выделены экстракцией органическими растворителями, не содержащими пероксидов, на рассеянном свету в инертной атмосфере с последующим омылением и хроматографическим разделением. Перед экстрагированием биомасса гомогенизируется при охлаждении. Процесс проводят в темноте в присутствии антиоксидантов. Для извлечения пигментов используют полярные растворители, например, ацетон или метанол. Далее каротиноиды переводят в неполярные растворители, такие, как гексан или петролейный эфир. Индивидуальные пигменты получают путем хроматографирования в тонком слое силикагеля или алюминия. Впервые каротиноиды были выделены из стручков перца, позже – из желтой репы и моркови Daucus carota, откуда и получили свое название. Каротиноиды получают с помощью химического синтеза и путем выделения из природных источников – растений и микроорганизмов. Традиционными источниками получения каротиноидов служат морковь, тыква, шиповник, облепиха и др. Наряду с этим все шире в тех же целях используют мицелиальные грибы и дрожжи. Как продуценты каротиноидов представляют интерес бактерии и водоросли. Перспективными в данном направлении являются некоторые фототрофные бактерии, у которых можно регулировать выход каротиноидов. Биомассу пурпурных бактерий, богатую каротиноидами в Японии используют в качестве добавок в рационе кур, что способствует более интенсивному окрашиванию желтка. Продуцентами ß-каротина, широко применяемыми для промышленного получения этого пигмента, являются мукоровые грибы Blakeslea trispora и Choanephora conjuncta. При совместном культивировании разнополых штаммов этих грибов на специально подобранных средах выход каротина составляет около 3–4 г/л среды. Среда содержит растительные масла, керосин, поверхностно активные вещества и некоторые специальные стимуляторы. В последние годы в целях экономии для получения ß-каротина начали применять вторичные продукты отхода – кукурузный экстракт и гидрол. В качестве стимуляторов синтеза каротина используют цитрусовую пульпу и мелассу, а также циклогексан. Процесс получения бета-каротина при использовании В.trispora многостадиен. На первом этапе выращивают отдельно положительные и отрицательные штаммы гриба. Следующий этап – совместное выращивание разнополых штаммов в ферментаторе при 26 0С и дос- 130 таточно интенсивной аэрации. На третьей стадии выращивания смешанную культуру вносят в большой ферментатор и инкубируют ее в течение 6–7 суток при той же температуре и аэрации. При использовании соответствующих стимуляторов можно как увеличивать выход продукта, так и изменять его состав. Исследования получения каротиноидов продолжаются. На сегодняшний день показано, что удешевить процесс можно за счет использования отходов, остающихся при производстве целлюлозных материалов. Установлено, что синтез каротиноидов увеличивается почти в 7 раз, если источником углерода в среде будет целлобиоза. Каротиноиды широко применяются в сельском хозяйстве, медицине и пищевой промышленности. -Каротин используют главным образом в пищевой промышленности, а также при изготовлении лекарств и косметических средств. 6.4 Получение витаминов группы D Микробиологическим путем получают и эргостерин – исходный продукт жирорастворимого витамина D2. В группу витаминов D объединяют родственные соединения, важнейшими из которых являются витамины D2 и D3. В организме человека и животных эти соединения регулируют усвоение кальция и фосфора из пищи и отложение их в костной ткани. Недостаточное содержание витамина приводит к возникновению рахита. Суточная потребность человека в витаминах группы D составляет 0,025 мг/г. Витамины группы D встречаются только в животном организме. В растениях содержатся стеролы, из которых под влиянием ультрафиолетового облучения образуются витамины этой группы. Наиболее важным из этих стеролов является эргостерол, содержащийся в большом количестве в дрожжах и пленевых грибах, используемых в качестве исходного продукта при промышленном получении витамина D. Наиболее богатыми источниками витаминов группы D являются рыбий жир, печень млекопитающих и птиц. Витамины содержатся также в молоке (0,02–0,1 мкг/100 г), сливочном масле, яичных желтках (от 3,5 зимой до 12,3 мкг/100 г летом). Источником эргостерина являются фитопланктон, бурые и зеленые водоросли, но особенно богаты эргостерином дрожжи и плесневые грибы, которые и служат сырьем для его промышленного получения. Эргостерин – основной стерин дрожжей: содержание его составляет 0,2–0,5 %, но в некоторых случаях достигает 10 % от сухой 131 массы дрожжей. Культурные расы дрожжей всегда богаче стеринами, чем дикие; наибольшее количество содержат пекарские и пивные дрожжи. Из дрожжей наиболее высокие количества стеринов синтезируют штаммы Saccharomyces carlsbergensis, биомасса которых может содержать более 10 % эргостерина. Эргостеролсинтезирующей способностью обладают дрожжи рода Rhodotorula glutinis (0,7–0,9 %), Candida utilis (0,4–0,6 %), C.tropicalis (0,2–0,3 %). В мицелии грибов Aspergillus и Penicillium содержание стеринов может достигать 1,2– 1,4 % в расчете на сухой мицелий. В промышленности эргостерин получают, используя дрожжи Saccharomyces carlsbergensis и Saccharomyces. Cerenisiae, а также мицелиальные грибы. Засев производят большим количеством инокулята. Культивирование ведут при высокой температуре и сильной аэрации в среде, содержащей большой избыток источников углерода по отношению к источникам азота. Синтез стеринов не связан с ростом дрожжей. Содержание стеринов повышается по мере старения культуры и стеринообразование продолжается после остановки роста дрожжей. В анаэробных условиях дрожжи содержат мало эргостерина и много сквалена. Дрожжи, а также грибы рода Aspergillus и Penicillium используют для получения кристаллического витамина D2 или концентрата. В качестве концентрата в животноводстве применяют облученные сухие дрожжи. Для получения кристаллического витамина D2 дрожжи или мицелий грибов подвергают гидролизу раствором соляной кислоты при 110 0С. Гидролизованную массу обрабатывают спиртом при 75–78 0С и после охлаждения до 10–15 0С фильтруют. Фильтрат упаривают до содержания в нем 50 % сухих веществ и используют как концентрат витаминов группы В. Витамин D2 получают из массы, оставшейся после фильтрации. Массу промывают, сушат, размельчают и дважды обрабатывают при 78 0С трехкратным объемом спирта. Спиртовые экстракты сгущают до 70 % содержания сухих веществ. Таким образом, получают липидный концентрат, который затем омыляют раствором едкого натра. Стерины остаются в неомыленной фракции. Кристаллы эргостерина выпадают из раствора при 00С. Очистку кристаллов проводят путем перекристаллизации, последовательным промыванием 69 %-м спиртом, смесью спирта и бензола (80:20) и повторной перекристаллизацией. Полученные кристаллы 132 эргостерина сушат, растворяют в эфире, облучают, после чего отгоняют, а раствор витамина концентрируют и кристаллизуют. Источником получения эргостерина может служить мицелий грибов, остающийся как отход антибиотической промышленности и производства лимонной кислоты. 133 ГЛАВА 7 ПРОИЗВОДСТВО АНТИБИОТИКОВ НА ОСНОВЕ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ Антибиотики (антибиотические вещества) образуются различными группами организмов (бактериями, грибами, высшими растениями и животными). История открытия первого антибиотика, нашедшего широкое применение в медицинской практике, связана с именем шотландского микробиолога А. Флеминга (1881–1955 гг.). В научную литературу термин «антибиотик» был введен Ваксманом в 1942 году. Дословно термин антибиотик – «против жизни». Этот термин, несмотря на определенное несовершенство, прочно вошел не только в научный лексикон, но и в повседневный обиход. Антибиотики – специфические продукты жизнедеятельности организмов или их модификации, обладающие высокой физиологической активностью по отношению к определенным группам микроорганизмов (бактериям, грибам, водорослям), вирусам или к злокачественным опухолям, задерживая их рост или полностью подавляя их развитие. Специфичность указанных продуктов обмена состоит в том, что, во-первых, антибиотики обладают высокой биологической активностью, избирательностью биологического действия, так как не все организмы, находясь в контакте с антибиотиком, оказываются чувствительными к его действию. В этой связи микроорганизмы делятся на две группы – чувствительные к определенным антибиотикам и резистентные (устойчивые) к ним. Антибиотики различают по происхождению, химическому строению и спектру биологического действия. По химическому строению различают ациклические, алилциклические антибиотики, хиноны, полипептиды и др. По спектру биологического действия различают антибактериальные, противогрибковые и противоопухолевые. Одни антибиотики подавляют рост небольшого числа видов микроорганизмов, другие же угнетают рост многих видов. Исходя из этой особенности антибиотиков, их делят на две группы: узкого спектра действия и широкого спектра биологического действия. К первой группе относятся: бензилпенициллин, грамицидин, новобиоцин, гризеофульвин и др. Антибиотики, подавляющие рост ограниченного и небольшого числа видов или даже штаммов чувстви- 134 тельных микроорганизмов (подавляют развитие грамположительных микробов: стафилококков, стрептококков, пневмококков и др.). Ко второй группе антибиотиков, обладающих широким спектром действия, относятся тетрациклины, хлорамфеникол, трихотецин и др. Антибиотики данной группы подавляют развитие многих грамположительных и грамотрицательных (но не всех) видов бактерий и крупных вирусов – кишечной палочки, дифтерии и др. Образовавшиеся в процессе жизнедеятельности организмов антибиотики могут накапливаться внутри клеток их продуцентов и лишь в небольшом количестве выделяться в окружающую среду (грамицидин С, эндомицин, нистатин и др.), могут содержаться как внутри клеток, так и выделяться в окружающую среду (ристомицин, кандицидин) или преимущественно выделяться в среду и лишь частично содержаться в клетках продуцента (стрептомицин, тетрациклины и др.). Антибиотики – это действительно специфические вещества, образующиеся в процессе жизнедеятельности организмов. Они представляют собой конечные продукты метаболизма клеток. Каждый антибиотик может образовываться одним или несколькими, но вполне определенными штаммами микроорганизмов. Соответствующий вид микроорганизма может синтезировать в процессе жизнедеятельности один или несколько определенных антибиотика. Антибиотические вещества образуются не только в лабораторных условиях развития продуцентов этих биологически активных соединений. Они образуются непосредственно при развитии микроорганизмов в природных условиях, сохраняются определенное время в почве и проявляют заметный экологический эффект. Роль антибиотиков в метаболизме собственных продуцентов заключается в том, что, являясь мощными физиологически активными соединениями, они выполняют функцию регуляторов ферментных систем продуцирующих их организмов. При взаимодействии с микробной клеткой антибиотик может вызвать определенные нарушения процесса ее жизнедеятельности. Некоторые антибиотики (пенициллин, новобиоцин и др.) подавляют синтез оболочки бактериальной клетки в период размножения, другие (стрептомицин) действуют на цитоплазматическую мембрану бактериальной клетки, изменяя ее проницаемость. Ряд антибиотиков являются ингибиторами реакции обмена веществ микроорганизмов, связанных, в частности, с синтезом белка клетки (тетрациклины, эритромицины и др.). 135 К настоящему времени описано более 6000 антибиотических веществ, образуемых различными группами организмов и полученных в результате химической модификации основных структур ряда антибиотиков. Наибольшее число антибиотиков (более 3000) образуется актиномицетами. Продуцентами антибиотиков, выпускаемых промышленностью, являются собственно бактерии, актиномицеты и мицелиальные грибы. Антибиотики, образуемые бактериями. К антибиотикам бактериального происхождения принадлежит около 600 наименований. Однако относительно небольшое число веществ выпускается промышленностью. Среди них можно назвать грамицидины, полимиксины, бацитрацины и др. Особенностью антибиотиков бактериального происхождения является то, что они по своему химическому строению принадлежат к полипептидам (линейным или циклическим) и низкомолекулярным белкам. Один продуцент в процессе развития может образовывать несколько близких по химическому строению антибиотиков. Поэтому обычно имеют дело с группами антибиотиков, синтезируемых бактериями. Например, грамицидины включают пять форм (A, B, C, S, D), отличаются аминокислотным составом; полимиксины включают 22 формы, в состав которых наряду с аминокислотами входят диаминомасляная и метилоктановая кислоты. Антибиотики, образуемые актиномицетами, нашли широкое применение в практике. К этим антибиотическим веществам относятся соединения, имеющие разнообразное химическое строение и широкий спектр биологического действия (стрептомицины, тетрациклины). Антибиотики, образуемые мицелиальными грибами. Наибольший интерес представляют пенициллины, цефалоспорины и некоторые другие продукты жизнедеятельности грибов. Используются для подавления роста стафило-, стрепто-, пневмо-, гоно-, менингококков. В основе промышленного производства антибиотиков лежит ряд последовательных этапов: получение высокопродуктивных штаммов продуцентов; разработка наиболее благоприятных условий культивирования продуцента антибиотика с максимальным биосинтезом этого вещества; подбор и внедрение в практику соответствующих методов выделения и очистки антибиотиков; создание готовых препаратов и контроль их качества. Схема промышленного получения антибиотиков включает пять технологических стадий: подготовка среды для культивирования; 136 биосинтез антибиотиков; предварительная обработка культуральной жидкости; выделение и очистка антибиотика; получение готовой продукции, приготовление лекарственных форм, расфасовка. Для каждого продуцента антибиотиков разрабатывается своя оптимальная среда, отвечающая следующим требованиям: среда должна обеспечивать хороший рост продуцента и максимально возможное образование антибиотиков; содержать дешевые и доступные компоненты; обладать хорошей фильтрующей способностью; обеспечивать применение экономичных и эффективных приемов выделения и очистки. 7.1 Получение пенициллина В течение ряда лет пенициллин получали путем выращивания гриба Penicillum chrysogenum в стеклянных матрацах на жидкой питательной среде. Эти создавало огромные трудности в поддержании стерильности при засевах каждого матраца и требовало большой затраты рабочей силы. Учитывая, что выход антибиотика составлял всего несколько десятков единиц на 1 мл среды, себестоимость пенициллина была чрезвычайно высокой. Первая среда для глубинного образования пенициллина была разработана А. Мойсром и Р. Когхиллом в 1946 г. В ее состав входили кукурузный экстракт, лактоза, NaNCl, глюкоза, однозамещенный фосфат калия и другие соли. Эта среда была основной, на ее базе были разработаны среды, используемые при промышленном производстве пенициллина. Довольно часто для сред используют сахарозу или смесь лактозы с глюкозой в отношении один к одному. Глюкоза может выступать в качестве катаболитного репрессора и снижать биосинтез антибиотика. На средах, содержащих лактозу или сахарозу, т.е. в условиях дерепрессии, биосинтез пенициллина идет активнее. В ряде случаев вместо кукурузного экстракта применяют арахисовую муку, жмыхи, муку из хлопковых семян и другие растительные материалы. Возможность широко использовать в качестве компонентов сред продукты растительного происхождения обусловлена тем, что продуцент пенициллина P.chrysogenum образует сильные протеолитические ферменты. Протеолитические ферменты гриба способны производить дезагрегацию и протеолиз белка. Обычно максимальная протеолитическая активность гриба совпадает с максимумом выхода пенициллина. 137 Благодаря высоким протеолитическим свойствам гриба, наличие кукурузного экстракта или другого растительного материала в среде полностью обеспечивает продуцент пенициллина азотом. В качестве единственного источника углерода среды лучшим соединением для биосинтеза пенициллина признана лактоза, так как она используется грибом медленнее, чем, например, глюкоза, в результате чего в период максимального образования антибиотика лактоза еще содержится в среде. Это создает наиболее благоприятные условия для выработки пенициллина. На среде с глюкозой ускоряются все обменные процессы. Максимум образования пенициллина наблюдается приблизительно через 50 ч, т.е. через двое суток после начала развития гриба, а глюкоза используется организмом за первые 30–40 ч роста. В присутствии же лактозы максимальный выход пенициллина наблюдается через 6–7 суток, а лактоза потребляется грибом приблизительно за 16 суток. Однако в среде для развития P.chrysogenum лактозу можно заменять легко используемыми углеводами – глюкозой, сахарозой, галактозой, ксилозой, крахмалом (гидролизованным), при условии их непрерывного введения в среду. Важное значение в процессе биосинтеза пенициллина имеет сера. Продуценты антибиотика в качестве источников серы хорошо используют сульфаты (например, Nа2SО4) и тиосульфаты (например, Na2S2O3). В нейтральных и щелочных средах тяжелые металлы вступают в реакцию с фосфатами, образуя нерастворимые соли; вместе с тем они могут синтезировать хелаты с аминокислотами, ди- и трикарбоновыми кислотами, имеющимися в среде. В качестве источников фосфора P.chrysogenum может использовать как фосфаты (КН2РО4), так и фитаты (соли инозитфосфорных кислот). Продуцент пенициллина содержит фермент, нарушающий фитин, в результате чего освобождается неорганический фосфор. Для развития гриба и биосинтеза пенициллина в первой фазе оптимальная температура составляет 30 °С, во второй фазе 20 °С и необходима интенсивная аэрация культуры. Уменьшение интенсивности аэрации или ее чрезмерное увеличение снижает биосинтез антибиотика. Существенную роль при этом играет перемешивание культуры, при увеличении оборотов мешалки скорость потребления лактозы и биосинтез антибиотика возрастает. От способа перемешивания культуральной жидкости зависят форма и величина глубинных колоний, состояние которых определяет способность мицелия образовы- 138 вать пенициллин. В процессе развития P.chrysogenum в среде накапливаются продукты обмена гриба, токсичные для биосинтеза пенициллина. Высокий выход пенициллина получают при следующих условиях развития гриба: хороший рост мицелия, достаточное обеспечение культуры питательными веществами и кислородом, оптимальная температура (в период первой фазы 30 °С, в период второй фазы 20°С), уровень рН ниже 8,0 (но не ниже 7,0), медленное потребление углеводов, подходящий предшественник. Для периода фазы роста гриба желательно иметь рН среды ниже 7,0 и обязательно присутствие в среде легкодоступного источника углерода. Медленное потребление углеводов во время фазы образования пенициллина достигается либо использованием лактозы, либо дробным внесением глюкозы или другого сахара. В процессе жизнедеятельности P.chrysogenum образует разные типы пенициллинов (пенициллины G, X, F и К), отличающиеся строением радикала молекулы, антибиотической активностью и спектром биологического действия. Большую роль в процессе биосинтеза пенициллина определенного типа и в увеличении его выхода играют так называемые предшественники. Предшественниками могут служить только те органические вещества субстрата, которые в процессе биосинтез антибиотика тем или иным путем включаются в его молекулу. Получение антибиотиков – это сложная многоступенчатая биотехнологическая система, состоящая из ряда последовательных стадий: подготовка сред, оборудования и инокулята; выращивания микроорганизмов-продуцентов антибиотиков методом глубинного культивирования с одновременным контролем состояния среды и продуцента, накопления метаболитов; обработки культуральной жидкости, коагуляции частиц, находящихся во взвешенном состоянии. Отделение мицелиальной массы от нативного раствора в большинстве случаев связано со значительными трудностями. Это объясняется спецификой осадка, который обычно имеет аморфный, слизистый, бесструктурный характер и быстро забивает поры фильтрующего материала. Для улучшения фильтрации очень важно вовремя прекращать процесс ферментации. Хорошим методом коагуляции является метод образования наполнителя непосредственно в жидкости при добавлении реагентов, образующих в ней нерастворимый осадок. Выпадающий в жидкости осадок предотвращает слипание час- 139 тиц мицелия, способствует образованию гранул, благодаря чему мицелий приобретает комковатую структуру и образует при фильтрации хорошо проницаемый слой. Выделение и очистка антибиотиков. В качестве новых методов используются экстракция, осаждение, сорбция на ионообменных материалах, упаривание, сушка. Особенность этой технологической стадии определяется тем, что на первом этапе работы приходится иметь дело с небольшой концентрацией (не более 1 %) антибиотика в обрабатываемом растворе, тогда как на последующих этапах его концентрация увеличивается до 20–30%. Все это требует применения различных емкостей и объемов используемых реагентов. Ионообменная сорбция. Метод состоит в том, что при пропускании водных растворов антибиотиков через колонки с соответствующими смолами они сорбируются на них, а раствор с частью примесей, имеющих противоположный антибиотикам заряд, проходит через колонку. Адсорбированный на смоле антибиотик элюируют, в результате чего получают значительно очищенный и сконцентрированный препарат. Затем раствор антибиотика можно пропускать через ионообменную смолу, но имеющую противоположный заряд. При этом уже примеси осядут на смоле, а раствор более очищенного антибиотика пройдет через колонку. Самые распространенные молекулярные сорбенты, применяемые в производстве антибиотиков, – активированный уголь и окись алюминия. Метод осаждения основан на том, что антибиотик связывают с органическими или неорганическими веществами с целью получения соединения, выпадающего в осадок. Полученный осадок с помощью фильтров или центрифуг отделяют от нативного раствора, промывают и в ряде случаев высушивают, после чего образовавшееся соединение разлагают и антибиотик экстрагируют или вновь осаждают (стрептомицин). Метод экстракции. Преимущества экстракционных процессов в том, что они по времени протекают значительно быстрее, чем ионообменные, и аппаратурно этот процесс очень легко осуществить непрерывно. Большинство антибиотиков представляют полярные молекулы, и для их экстракции используются полярные растворители (эфиры, спирты, галогенопроизводные и др.). В неполярных растворителях (гексане, гептане, октане, бензине и др.) обычно полярные антибиотики не растворяются. 140 Одной из стадий очистки антибиотиков является концентрирование полученных экстракцией растворов путем отгонки большей части растворителя в высоком вакууме. Поскольку большинство антибиотиков в той или иной степени термолабильны, необходимо применять методы, не приводящие к потере биологической активности и не изменяющие цвета препарата. Влажность препарата должна составлять 0,5–2,0 %. В зависимости от агрегатного состояния антибиотика в конце очистки и его стабильности при повышении температуры применяют различные методы сушки: осажденнные в виде кристаллов антибиотики, имеющие сравнительно высокую стабильность (тетрациклины), подвергают сушке при атмосферном давлении и температуре до 90 0С в камерных или пневматических сушилках; осажденные малостабильные антибиотики (пенициллины) высушиваются в вакуумных сушилках при температуре порядка 40 0С; Другие антибиотики, полученные в виде концентрата, т.е. 5– 15 % водного раствора (стрептомицин, группа неомицина), весьма нестабильные в растворенном состоянии, подвергаются сушке различными методами, исключающими инактивацию и ухудшение качества; лиофильная сушка проводится путем сублимации воды из замороженного состояния под средним или глубоким вакуумом при низких температурах (минус 8 0С, минус 12 0С); скоростная сушка – высушивание в виде аэрозоля с применением распылительной сушилки при 130 0С. При этом даже термолабильные препараты не меняют своих свойств. Готовый антибиотик подвергается тщательному биологическому (определение стерильности препарата) и фармакопейному (токсичность, пирогенность, влияние на состав крови, центральную нервную систему, дыхание и другие функции организма) контролю. Величину биологической активности антибиотиков обычно приводят в условных единицах, содержащихся в 1 мл раствора или 1 мг препарата. За единицу активности антибиотика принимают минимальное количество антибиотика, которое способно подавить развитие или задержать рост стандартного штамма тест-микроб в определенном объеме питательной среды. 141 7.2 Применение антибиотиков Антибиотики находят применение в медицине, сельском хозяйстве, пищевой и консервной промышленности. В медицине антибиотики применяют при лечении заболеваний, которые ранее считались неизлечимыми или сопровождались высоким летальным исходом. К числу таких заболеваний относятся: некоторые формы туберкулеза (менингитный), который до применения антибиотиков вызывал 100 % летальный исход, чума, азиатская холера, брюшной тиф, бруцеллез, пневмония, различные септические процессы и др. Антибиотики в сельском хозяйстве. В течение многих лет антибиотики используются для стимуляции роста сельскохозяйственных животных и повышения усвояемости питательных веществ корма (тетрациклин, гризин, бацитрацин, витамицин – кормовые формы антибиотиков), для лечения различных заболеваний. Использование антибиотиков в сельском хозяйстве основано на их способности подавлять развитие болезнетворных микроорганизмов и тем самым снижать заболеваемость и смертность, а также ускорять рост. Антибиотики для кормовых целей используются в рецептуре премиксов (комплекса специальных добавок из физиологически активных веществ). Используют антибиотики в виде неочищенных препаратов, представляющих собой высушенную биомассу продуцента, которая может содержать также аминокислоты, ферменты, витамины группы В и др. Антибиотики находят применение в борьбе с фитопатогенными организмами – возбудителями заболеваний растений, легко проникают в них и остаются безвредными для растений. Против фитопатогенных грибов, возбудителя ржавчины и мучнистой росы применяют гризеофульвин; против грибкового заболевания риса – касугамицин; против паразитарных пауков и клещей плодовых деревьев – тетранастин и др. Антибиотики, применяемые в сельском хозяйстве, не должны применяться в медицинской практике. Это принципиальное условие обеспечивает снижение уровня появления резистентных форм микроорганизмов, патогенных для человека. Антибиотики в пищевой и консервной промышленности применяются при борьбе с микроорганизмами, вызывающими порчу продуктов питания. Среди них можно назвать субтилин, низин и др. Субтилин – полипептид, образуется культурой Bacillus subtilis. Применяется при консервировании овощей и позволяет смягчить термообра- 142 ботку в 2 раза, а значит сохранить витамины, вкусовые качества, консистенцию. Низин – высокомолекулярный пептид, образуемый Streptococcus lactis. Низин не используется в медицинской практике. Его применяют при консервировании томатов, зеленого горошка, цветной капусты и других продуктов, для сохранения сыров. Антибиотические вещества содержатся в высших растениях (луке, моркови, лавровом листе, кориандре, красном перце, можжевеловых ягодах и др.) и значительно снижают количество спор микроорганизмов в консервируемой массе. Использование этих веществ при консервировании мясных и рыбных продуктов, различных овощей способствует уменьшению времени термообработки и повышению качество продукции. Тетрациклиновые антибиотики и хлорамфеникол оказались эффективными препаратами для хранения свежего молока. Для сохранения мяса животных применяют два основных метода: антибиотики добавляют в пищу непосредственно перед убоем или вводят в кровеносную систему сразу после того, как животное убито и спущена кровь. Это увеличивает срок хранения мяса до двух-трех суток. Растворы тетрациклиновых антибиотиков используют для опрыскивания разделанных и охлажденных туш, а также для хранения рыбы. Рыбу погружают в морскую воду либо кладут на лед с хлортетрациклином на 1-5 мин. Концентрация антибиотика составляет 5-100 мг/л. Необходимо осторожно использовать антибиотики. Попадание их незначительных концентраций в организм человека может вызвать у него появление резистентных форм микроорганизмов, что затруднит применение антибиотиков в случае заболевания. 143 ГЛАВА 8 ПРОИЗВОДСТВО ФЕРМЕНТОВ НА ОСНОВЕ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ Ферменты – биологические катализаторы. Ферменты присущи всем живым существам, однако для их выделения используют те природные объекты, в которых содержание искомого энзима составляет не менее 1%. Для крупномасштабного получения ферментов пригодны только некоторые растительные организмы на определенной фазе их развития (проросшее зерно различных злаков и бобовых, латекс и сок зеленой массы ряда растений), а также отдельные ткани и органы животных (поджелудочная железа, слизистая оболочка желудочнокишечного тракта, сычуг крупного рогатого скота, семенники половозрелых животных). Практически неограниченный источник ферментов – микроорганизмы (бактерии, грибы, дрожжи), содержащие набор большинства известных в настоящее время энзимов, количество которых можно повысить в десятки и сотни раз методами мутагенеза, селекции и индукции биосинтеза. По объему производства ферменты занимают третье место после аминокислот и антибиотиков. Из более чем 2000 известных в настоящее время ферментов в промышленности используется около 30. Ферменты находят применение в текстильной, кожевенной, целлюлозобумажной, медицинской, химической промышленности. По прогнозам ученых, основным потребителем ферментов в ближайшем будущем остается пищевая промышленность. Главное место среди этих энзимов занимают глюкоизомераза и глюкоамилаза. Источники глюкоизомеразы: более 80 видов микроорганизмов (Bacillus sp., Streptomyces albus, S. griseus), источники глюкоамилазы: бактерии и грибы (Bacillus sp., Aspergillus niger, A. oryzae). В промышленности особенно важны ферменты, способные катализировать химические реакции в органической фазе, в частности липазы. Источники липаз: поджелудочные железы животных, семена растений, микроорганизмы (Candida lipolytica, Streptomyces flavogriseus, Aspergillus ssp., Saccharomyces lipolytica). Ферменты широко используют в медицине, например, в заместительной терапии в составе лечебных препаратов. Важнейшую область применения ферментов в медицине составляет энзимодиагностика – тестирование патологии того или иного органа человека по 144 уровню активности фермента или соотношению его множественных форм и изоферментов. Так, аспартатаминотрансфераза, изоцитратдегидрогеназа, лактатдегидрогеназа и альдоза служат для выявления инфаркта миокарда; аланинаминотрансфераза, аспартатаминотрансфераза и лактатдегидрогеназа – для диагностики заболеваний печени; глутамилтрансфераза – для блокировки отторжения органов при их пересадке и т.д. 8.1 Ферментативные особенности микроорганизмов Микроорганизмы в качестве продуцентов ферментов представляют собой интерес, поскольку их метаболизм, а следовательно, и работа ферментных систем осуществляется с очень большой интенсивностью. Помимо этого следует помнить об очень большой скорости прироста биомассы микроорганизмов. Это позволяет в течение коротких промежутков времени (иногда 24–72 ч) получить такие количества сырья для выделения ферментов, которые не могут сравниться с тем, что дают растения и животные. Важное свойство многих микроорганизмов – способность расти, используя различные дешевые субстраты, в том числе не имеющие пищевого значения (целлюлоза, углеводороды нефти, метан, метанол и др.), в связи с чем их применение в промышленности выгодно с экономической и экологической точек зрения. Многие микроорганизмы образуют ферменты, которые в большом количестве выделяются в культуральную среду. Эти ферменты в основном принадлежат гидролазам, расщепляющим белки, крахмал, целлюлозу, жиры и другие, не растворимые в воде вещества. Выделение ферментных препаратов из клеток микроорганизмов и особенно из культуральной среды после их выращивания проще и экономичнее, чем из растительных и животных тканей. Многие ферменты обнаружены только у микроорганизмов. К ним относятся, например, керотиназы, гидролизующие серусодержащие белки – кератины, входящие в состав волоса, перьев, рогов и копыт. Некоторые микроорганизмы обладают специфическими декарбоксилазами аминокислот, образуют пенициллиназу, расщепляющую пенициллин до пенициллиновой кислоты и воды. Такой фермент, как нитрогеназа, участвующая в образовании аммиака из молекулярного азота, обнаружена лишь у бактерий, способных к фиксации азота. 145 Очистка окружающей среды от ряда загрязняющих ее веществ возможна благодаря способности ферментов, образуемых микроорганизмами, разрушать компоненты пластмасс, пестициды и др. ядовитые соединения. Способность микроорганизмов развиваться в экстремальных условиях, т.е. при низких и высоких температурах, в отсутствие молекулярного кислорода, в кислых или щелочных средах, при высоких концентрациях солей, определяется характером их ферментов. Основными поставщиками ферментов из микроорганизмов до последнего времени были грибы. Сейчас все более широкое применение находят ферменты и некоторых бактерий. Ферменты микроорганизмов применяются в производстве. В своей практической деятельности человек использует ферментативную активность микроорганизмов очень давно. Культуры грибов уже несколько тысяч лет назад в Китае, Корее, Японии и некоторых других странах применяли для осахаривания крахмалистых продуктов и для получения спирта. Винокурение, хлебопечение, обработка волокнистых растений, получение кисломолочных продуктов известны человеку с давних времен. Однако использование не ферментной активности микроорганизмов, а собственно ферментов как индивидуальных химических соединений специфического и сложного строения, началось сравнительно недавно. Наиболее широкое применение получили ферменты микроорганизмов, относящиеся к гидролазам (гликозидазы, пептидазы, липазы и др.). Они воздействуют на глюкозидные, пептидные, эфирные и некоторые другие связи с участием воды. Среди гидролаз много внеклеточных ферментов. Выделяясь из клеток, они накапливаются в культуральной среде. Получение таких ферментов, как мы уже говорили, проще и дешевле, чем выделение из клеток. Поэтому гидролазы представляют особый интерес и наиболее часто используются. Гликозидазы. К гликозидазам относится большое число микробных ферментов, катализирующих гидролиз гликозидных соединений. Изучаются и применяются они давно. В эту группу входят амилолитические ферменты, гидролизующие крахмал, - и -амилазы и глюкоамилаза. Эти гидролазы, в зависимости от происхождения (животные, растения, грибы, бактерии) различаются по строению, молекулярной массе, термостабильности, оптимуму рН и другим свойствам. Многие микроорганизмы образуют -амилазу (1,4- -D- 146 глюканглюканогидролазу), гидролизующую внутренние -1,4глюкозидные связи в амилазе и амилопектине с образованием мальтозы, декстринов и небольшого количества глюкозы. Синтез -амилазы у микроорганизмов наблюдается реже. Целлюлолитические ферменты (целлюлазы) – сложный комплекс активных белков, действующих на различные участки молекул целлюлозы. С1-компонент (экзонуклеаза) действует на нативную целлюлозу (хлопок, фильтровальную бумагу); Сх-компонент (эндонуклеаза) гидролизует клетчатку, переведенную в растворимую форму (карбоксиметилцеллюлозу). Вместе с целлюлазами микроорганизмы продуцируют целлобиазу, гидролизующую целлобиозу и гемицеллюлазу, гидролизующую гемицеллюлозы. В конечном счете, гидролиз целлюлозы приводит к образованию глюкозы. Выпускаемые промышленностью препараты целлюлолитических ферментов. Эти препараты стабильны в широком диапазоне рН (от 3,0 до 8,0). Основными продуцентами целлюлаз являются мицелиальные грибы, в т.ч. Penicillium notatum, продуцируют целлюлазы и некоторые бактерии. Значительное число микроорганизмов образуют ферменты, разлагающие пектины. Пектины (полигалактурониды) состоят из остатков D-галактуроновых кислот, соединенных -1,4-глюкозидными связями. Карбоксильные группы галактуроновых кислот могут быть полностью или частично этерифицированы метанолом. Пектолитические ферменты образуют комплексы, отдельные компоненты которых расщепляют молекулу пектина в различных местах. Пектиназы (полигалактуроназы) широко распространены у микроорганизмов (грибов и бактерий); у растений они встречаются редко. Грибные пектолитические ферменты имеют оптимум рН от 3,5 до 5,0; они более стабильны. Липазы и другие гидролазы. Из ферментов, участвующих в липидном обмене, наибольший практический интерес представляют липазы (триацилглицеролазы). Продуцентами липаз, выделяемых в культуральную среду, служат многие грибы из числа Aspergillius, Mucor, Rhizopus, некоторые дрожжи (Candida) и бактерии (Pseudomonas). Липазы катализируют гидролиз триацилглицеридов с образованием жирных кислот и глицерина. Фосфокиназы расщепляют сложноэфирные связи между жирными кислотами, глицерином и фосфатидиловой кислотой. Они также имеют широкое распространение у микроорганизмов, особенно 147 часто встречаются у спорообразующих бактерий рода Clastridium и Bacillus. Пенициллиназы катализируют гидролиз пенициллина. Это имеет большое практическое значение для получения полусинтетических пенициллинов, а также для инактивирующих антибиотиков. 8.2 Получение микробных ферментных препаратов В зависимости от источника технология получения ферментных препаратов имеет свои особенности. При извлечении ферментов из растительного сырья и животных тканей технология сводится к экстракции энзимов и очистке их от сопутствующих балластных веществ. Технология ферментных препаратов микробного происхождения более сложная, так как дополнительно включает этапы культивирования микроорганизмов-продуцентов ферментов. Производство ферментных препаратов осуществляется двумя способами – поверхностным и глубинным. Поверхностный способ применяется для культивирования микроскопических грибов. Для получения посевной культуры выращивание ведут либо на твердой питательной среде или жидкой (например, споры и мицелиальная масса). Твердая питательная среда должна быть рыхлой, для ее создания используют увлажненные пшеничные отруби. Питательные среды стерилизуют, охлаждают до 35 0С и засевают суспензией конидий. Затем смесь раскладывают по кюветам и закрывают. Закрытые кюветы далее помещают в растильные камеры. Поддерживают температуру в пределах 26–300С и влажность от 95 до 55 %. Культивируют в течение 3 суток. После этого посевные кюветы выдерживают еще 72 ч при 100С. Такой препарат сохраняет способность к прорастанию в течение 15–20 суток. Глубинная культура гриба выращивается в течение 24–30 ч при 0 30 С в ферментаторах объемом 8–10 л. Полученный материал смешивают с увлажненными отрубями в количестве 1–2 % от воздушносухих отрубей. Для получения рыхлой структуры при подготовке твердых питательных сред добавляют древесные опилки (5–10 %) или солодовые ростки (15–20 %), пшеничные отруби, которые смешивают в стерилизаторе, полученную смесь увлажняют до 20–40 %. 148 Культивирование. В простерилизованную и охлажденную до 40 С питательную среду вносят посевной материал и стерильную воду для увлажнения до 58–60 %. При повышении начальной влажности будет ухудшаться аэрация растущей культуры. Если влажность уменьшается, то активность синтезируемых ферментов снижается, рост мицелия замедляется. Засеянную посевным материалом питательную среду через распределительный механизм раскладывают в кюветы или вертикальные кассеты слоем 2–3 см, которые помещают в растильные камеры. В камерах материал выдерживают в течение 22–40 ч при температуре 28–32 0С при аэрации и влажности 92–100 %. Продолжительность культивирования зависит от продуцента. Воздух, идущий на аэрацию, кондиционируют до 22–24 0С, обеспложивают на фильтрах. Для каждой растильной камеры должен быть свой кондиционер, где очищенный воздух подогревается до 30 0С и увлажняется паром до значения, близкого к 100 %. Воздух в системе циркулирует. Пройдя через камеру, воздух идет на охлаждение, затем из главного конденсатора смешивается с 10 % свежего воздуха, доводится до требуемых параметров и возвращается в камеру. Отработанный воздух пропускают через масляные и бактериальные фильтры и сбрасывают в атмосферу. Кондиционирование воздуха проводят как для очистки от пыли и посторонней микрофлоры, так и поддержания определенной температуры и насыщения влагой. По окончании культивирования готовая культура представляет собой брикет, в котором частицы питательной среды связаны мицелием. Влажность брикетов 35–58 %. С такой влажностью продукт неустойчив, ферменты легко инактивируются. Для придания стабильности культуру необходимо высушить. Для чего готовую культуру выгружают на стол выгрузки, измельчают на различных дробилках до частиц 2–3 мм. При дроблении культура гриба во избежание инактивации ферментов не должна разогреваться, минимально распыляться. Гранулы должны иметь определенную величину. Сушат культуру в сушилках различной конструкции (ленточные, шахтные, вибрационные и др.) до остаточной влажности 10–13 %. Культура гриба должна пребывать в сушилке не более 5–8 мин при 40–42 0С. Высушенную культуру фасуют в мешки по 18–30 кг. Глубинное культивирование. При глубинном культивировании микроорганизмы – продуценты выращивают в толще питательных жидких сред. В этих условиях можно культивировать как аэробные, так и анаэробные микроорганизмы. Данный способ выращивания 0 149 микроорганизмов имеет ряд преимуществ по сравнению с поверхностным способом. Глубинное культивирование позволяет изменять состав питательной среды; исключает тяжелый малопроизводительный ручной труд; упрощает механизацию и автоматизацию различных устройств, контролирующих параметры процессов. Процесс производства ферментных препаратов при глубинном культивировании состоит из следующих технологических стадий: получение посевного материала; приготовление и стерилизация питательной среды и воздуха; выращивание микроорганизмовпродуцентов; отделение биомассы от культуральной жидкости; очистка и выделение ферментов. Выделение и очистка ферментов. Выбор метода выделения и очистки ферментов микроорганизмов определяется в зависимости от локализации и целей применения. Неочищенные ферментные препараты получают путем сушки и размельчения мицелия гриба вместе с твердым субстратом или высушиванием продуцента вместе с культуральной жидкостью на распылительной сушилке. Высушенные препараты размалываются в порошок и в таком виде используются. Удельная ферментная активность таких препаратов невелика, но они дешевле и достаточно устойчивы при хранении. Таким образом получают амилазы, протеазы, целлюлазы для сельского хозяйства и некоторых отраслей промышленности. Получение сиропов производится при сгущении отделенной от биомассы культуральной жидкости, содержащей фермент. Концентрирование биологических жидкостей проводят методом вакуумвыпаривания. Высушивание ферментных препаратов производится в вакууме при распылении или из замороженного состояния. При необходимости препарат смешивают со стабилизатором или наполнителем для придания устойчивости. В промышленности высокая степень очистки ферментов не всегда нужна. Очистка должна быть очень высокой в случае использования ферментов как терапевтических препаратов. Применяют ферменты в хлебопекарном производстве, в производстве консервов, виноделии, пивоваренной и кожевенной промышленности, текстильном производстве. Применение ферментов в сельском хозяйстве развивается в двух направлениях: использование в рационах животных; обработка кормов для повышения их усвояемости. Микробные ферменты используются в различных областях ме- 150 дицины как терапевтические средства и при проведении клинических анализов. В большинстве отраслей пищевой промышленности, практике научных исследований и особенно в медицине используют только очищенные препараты ферментов, частично или полностью освобожденные от балластных веществ и полностью охарактеризованные в отношении их специфичности физико-химических свойств. Исходным материалом для получения препаратов ферментов служат: биомасса продуцента, фильтрат культуральной жидкости, экстракт из культуры микроорганизма или из тканей и органов растений и животных, из которых готовят препараты различной степени очистки. Для успешного выделения ферментов из клеточного содержимого необходимо очень тонкое измельчение исходного материала вплоть до разрушения субклеточных структур: лизосом, митохондрий, ядер и др., которые имеют в своем составе многие индивидуальные ферменты. Для этого используют специальные мельницы и гомогенизаторы, а также ультразвук, метод попеременного замораживания и оттаивания ткани. Для высвобождения ферментов из мембранных структур клетки к гомогенатам добавляют небольшие количества детергентов (твин, тритон Х-100) или обрабатывают их энзимами – лизоцимом, целлюлазой, лецитиназой С. Особое внимание при выделении ферментов уделяют проведению всех операций в условиях, исключающих денатурацию белка (нейтральные значения рН, стабилизирующие добавки в виде белков, солей и специальных соединений). Для освобождения белков от нуклеиновых кислот полученный гомогенат обрабатывают сульфатом марганца до конечной концентрации этой соли в смеси, равной 0,05 М. Осадок нуклеиновых кислот отделяется с помощью ротационной вакуум-фильтрации, а в образовавшийся фильтрат добавляют сульфат аммония до 45% от его насыщения. Возникший осадок белков, содержащий галактозидазу, собирают с помощью центрифугирования или вакуум-фильтрации. Вся процедура очистки энзима от момента подачи бактерий в систему до момента получения осадка галактозидазы занимает всего один час. В зависимости от свойств выделяемого фермента и сопутствующих ему балластных веществ при получении очищенных препаратов ферментов комбинируют различные приемы и методы, такие, как термическое фракционирование, осаждение органическими растворителями, солями и тяжелыми металлами, фильтрация на молекулярных 151 ситах, ионообменная хроматография, электрофорез, изоэлектрофокусирование. На заключительных этапах очистки часто используют аффинную хроматографию, которая основана на способности ферментов избирательно связывать те или иные лиганды – субстраты, коферменты, конкурентные ингибиторы, аллостерические эффекторы и т.п. Такое связывание весьма специфично, что позволяет выделить тот или иной энзим из множества других белков. В процессе выделения повышается доля фермента в массе тотальных белков, т.е увеличивается его удельная активность. В производственных условиях активность получаемого ферментного препарата оценивается количеством субстрата, преобразованного 1мг (1кг) препарата при оптимальных условиях за 1 мин, и измеряется в Е / мг, моль / мг или каталах / кг белка. Очистка продукта. Задача стадии очистки – убрать примеси, сделать продукт максимально чистым. Эта задача решается с помощью разнообразных процессов, в числе которых многие из тех, что уже были рассмотрены ранее. Кроме этих процессов используют и следующие. Диализ – процесс, в котором через полупроницаемую перегородку могут проходить низкомолекулярные вещества, а высокомолекулярные остаются. Путем диализа осуществляют очистку вакцин и ферментов от солей и низкомолекулярных растворимых примесей. Кристаллизация. Этот процесс базируется на различной растворимости веществ при разных температурах. Медленное охлаждение позволяет формировать кристаллы из растворов целевых продуктов, причем чистота их обычно очень высока. Можно даже получить еще более чистый продукт, если кристаллы растворить в воде или растворителе, а потом снова кристаллизовать (т.е. провести процесс перекристаллизации). Концентрирование продукта. После очистки продукта он часто находится все-таки в растворе с небольшими концентрациями примесей. Дальнейшая задача – обеспечить его концентрирование. На выходе из биотехнологической стадии суспензия обычно содержит целевого продукта примерно 0,1–1%, после стадии отделения биомассы – 0,1–2%, после стадии выделения – 1–10%, после очистки – 50–80%, и, наконец, после концентрирования – 90–100%. На стадии концентрирования применяют такие процессы, как выпаривание, сушка, осаждение, кристаллизация с фильтрацией получившихся кристаллов, ультрафильтрация и гиперфильтрация или 152 нанофильтрация, обеспечивающие как бы «отжим» растворителя из раствора. Очищенные ферментые препараты хранят при низкой температуре (до -80°С). Для стабилизации ферментов в их препараты добавляют коферменты и субстраты. Ферментные препараты для промышленного применения стабилизируют, добавляя глицерин, моносахариды, дисахариды, HS-соединения (цистеин, глутатион, меркаптоэтанол, дитиотреитол и др.), отдельные аминокислоты, желатину и другие белки – наполнители. На завершающей стадии производства продукт приобретает товарную форму за счет проведения процессов гранулирования (формирование гранул из порошка или прямо из раствора), дражирование, таблетирование (формирование драже, таблеток), розлив или фасовка, ампулирование (затаривание в ампулы). 153 ГЛАВА 9 ПРОИЗВОДСТВО ПИЩЕВЫХ КИСЛОТ НА ОСНОВЕ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ 9.1 Получение уксусной кислоты Уксусная кислота широко используется в пищевой, химической, микробиологической промышленности, медицине. Получение уксусной кислоты из спиртосодержащих жидкостей было известно более 10 тысяч лет назад. В те времена древние греки и римляне использовали уксус в качестве освежающего напитка и получали, главным образом, оставляя вино открытым. В больших масштабах уксус долго получали в плоских открытых бочках, в которых пленка бактерий плавала на поверхности. В середине XX века появились глубинные процессы ферментации. Уксуснокислое брожение основано на способности уксуснокислых бактерий окислять спирт кислородом воздуха с участием алкогольдегидрогеназы в уксусную кислоту: СН3СН2ОН + О2 СН3СООН + Н2О, при этом из 1 моля этанола образуется 1 моль уксусной кислоты, а из 1 л 12 об. % спирта получается 12,4 весовых % уксусной кислоты. Данный процесс окисления спирта могут реализовывать многие бактерии, но в промышленных технологиях для получения уксуса используют уксуснокислые бактерии рода Acetobacter, интерес представляют также бактерии Gluconobacter. Большую часть уксуса получают, используя разведенный спирт. В настоящее время процесс реализуют как поверхностным, так и глубинным способом. Поверхностный режим протекает в струйных генераторах, наполненных древесной стружкой, объемом до 60 м3. Исходный питательный раствор с бактериями распыляют по поверхности стружек, он стекает, собираясь в нижней части аппарата. После этого жидкость собирают и вновь закачивают в верхнюю часть аппарата. Процедуру повторяют 3–4 раза, в результате в течение 3 дней до 90 % спирта трансформируется в ацетат. Этот старый способ протекает более эффективно и равномерно при автоматическом поддерживании температуры и принудительной подаче воздуха. Современные промышленные процессы получения уксуса реализуют в глубинной культуре в специальных аэрационных аппаратах 154 с термостабилизацией и механической системой пеногашения. Исходная инокулируемая смесь содержит этанол и уксусную кислоту (соответственно около 5 и 7 %); конечная концентрация уксуса через 1,5 суток составляет 12–13 %. Процесс – полупроточный, отливнодоливной. Каждые 30–35 ч до 60 % культуры заменяют на свежее сусло. При глубинной ферментации выход продукта на 1 м3 в 10 раз выше по сравнению с поверхностной ферментацией. Разработан и реализован эффективный непрерывный способ получения уксусной кислоты в батарее последовательно работающих ферментеров (обычно 5 аппаратов). Температура культивирования составляет 28 0С для Acetobacter и 35 0С при использовании в качестве продуцента культуры Bact. schutzenbachii. Наилучшим сырьем для процесса является этиловый спирт, полученный из зерно-картофельного сырья, при его концентрации около 10 %. Оптимум рН для развития бактерий – около 3. При увеличении содержания уксусной кислоты в культуры свыше 8 % рост бактерий замедляется, при 12–14 % прекращается. Поэтому процесс проводят в батарее последовательно соединенных аппаратов. Первый выполняет роль инокулятора, поэтому в него непрерывно подают свежую среду и поддерживают условия, оптимальные для быстрого образования биомассы бактерий. Культура из первого аппарата поступает во второй аппарат и далее – в последующие, при этом транспортировка культуральной жидкости осуществляется воздухом. В каждом аппарате условия ферментации стабилизируются в соответствии с требованиями течения хода ферментации, при постепенном понижении температуры среды от 28 С0 в первом аппарате до 25 С0 – в последнем. Режим аэрации также изменяется, от 0,4 до 0,15 м3 -мин. Концентрация спирта со второго по четвертый аппарат стабилизируется на требуемом уровне подачей в них среды с 40 % этанолом. Из последнего аппарата выводится культуральная жидкость с содержанием ацетата не ниже 9,0 и не выше 9,3 %. Выход кислоты составляет до 90 кг из 100 л безводного спирта. На постферментационной стадии после отделения бактериальной биомассы раствор уксуса фильтруют, освобождая от окрашенных и взвешенных частиц, и далее подвергают пастеризации. Для повышения концентрации исходные растворы вымораживают до 20–30 %. Дальнейшее концентрирование до получения ледяной уксусной кислоты (98,0–99,8 %), проводят методом перегонки. 155 9.2 Получение натурального уксуса Получение уксуса осуществляется биохимическим путем, где в качестве исходного сырья применяют легкие виноградные или фруктово-ягодные вина, или разбавленный винный спирт. При этом во всех случаях конечным продуктом является винный или натуральный уксус, содержащий не более 10 % уксусной кислоты. Производство винного уксуса осуществляется различными способами. Одним из старейших способов получения винного уксуса является орлеанский. Материалом для приготовления уксуса по этому способу служит легкое виноградное вино, содержащее все вещества, необходимые для питания и размножения бактерий. Уксусное брожение производят в дубовых бочках особой формы. В помещение постоянно поддерживают необходимую температуру и регулируют ее циркуляцией воздуха для того, чтобы ускорить или задержать процесс брожения (по надобности). Бочки, в которых происходит процесс окисления, имеются отверстия для доступа воздуха, через которые заливают уксус, необходимый для начала окисления, и вино. Кроме этих бочек (уксусообразователей) устанавливают деревянные чаны для фильтрования вина и готового уксуса. В качестве фильтрующего материала используют буковые стружки, предварительно вымоченные в воде (для удаления из них дубильных веществ, вредных для брожения). Для начала окисления в бочку, приблизительно на 1/5 ее высоты, наливают готовый уксус, в котором содержаться уксусные бактерии. Вино приливают периодически, небольшими порциями, до тех пор, пока бочки не наполнятся. После окисления всего спирта уксус перекачивают в фильтры и операцию начинают снова. После работ Пастера, исследовавшего уксуснокислое брожение, в орлеанский способ вносились изменения и дополнения. В результате был построен аппарат, позволяющий проводить окисление непрерывно. Этот аппарат состоит из ряда четырехугольных ящиков, расположенных один над другим, с отверстиями для воздуха и переточными трубами. Вино с необходимым количеством уксуса (до 25 % по объему) поступает в верхний ящик, откуда непрерывно стекает через все нижележащие ящики, окисляясь по пути. Наряду с описанным способом стал применяться другой, ускоренный способ, который из-за большой поверхности соприкоснове- 156 ния спиртовой жидкости с воздухом дает повышенную производительность. Сущность его заключается в том, что спиртовой жидкости дают медленно стекать по колонне, наполненной пористым веществом, противотоком к движению воздуха. Таким образом, при ускоренном (или скором) способе уксусообразователь не заполняют спиртовой жидкостью (или суслом), а лишь орошают ею стружку. Количество подаваемой жидкости рассчитывают так, чтобы процесс окисления заканчивался полностью в нижней части колонны. Исходным материалом для получения уксуса в этом случае служит разбавленный винный спирт. В аппаратах более поздних конструкций поверхность соприкосновения воздуха со спиртовой жидкостью очень велика, так как вместо стружек используют древесные опилки, через которые энергично с помощью вакуума просасывают воздух. Пары спирта и уксусной кислоты улавливают из воздуха в специальных поглотителях. Уксусообразователи в промышленности стали применяться не только деревянные, но и керамиковые и железобетонные, а также из кислотостойкой стали, а процесс стал автоматизированным и непрерывным. Биологические особенности процесса. Кроме усовершенствования аппаратуры, улучшалась также биологическая сторона процесса. Так, например, стали пользоваться специально приготовленными чистыми культурами уксусных бактерий. При этом не только ускорился процесс окисления, но и улучшилось качество уксуса. Обычно заводы работают по ускоренному способу на смешанных (случайных) культурах бактерий. При этом, наряду с полезными бактериями, в культурах встречаются виды, мало пригодные для уксусного производства. Культуры уксусных бактерий должны удовлетворять следующим требованиям: хорошо окислять спирт и в минимальной степени окислять образующуюся уксусную кислоту; давать уксус хорошего качества; первоначальные свойства культуры должны сохраняться как можно дольше. Для получения уксуса по орлеанскому способу часто применяют культуры с прочными и упругими пленками, а в то время как для ускоренного способа лучше подходят уксусные бактерии, образующие тонкую и рыхлую пленку. Наиболее ценными бактериями, которые использую современные уксусные заводы, работающие по ускоренному способу являются В. Curvum и В. Schuzenbachi. Эти бактерии, очищенные с посторонних бактериальных примесей, дают наиболее 157 высокую кислотность уксуса. На уксусных заводах, работающих по ускоренному способу, культуру вводят в уксусообразователь при его пуске, и она работает в нем несколько лет (до 20–40), поэтому очень важно с самого начала внести в образователь проверенную, работоспособную, устойчивую и дающую хороший продукт культуру. Состав сусла при непрерывном способе производства не может быть произвольным. Как правило, кислотность сусла должна быть больше процентного содержания в нем спирта. Практически установлено, что для достижения наибольшей производительности кислотность сусла должна быть 6–7 %, а содержание спирта соответственно 4–3 %, т. е. чтобы сумма процентного содержания кислоты и спирта равнялась приблизительно 10 %. При низких концентрациях уксус, выпускаемый из уксусообразователя, должен еще содержать некоторое количество спирта (0,51)%, так как при полном отсутствии спирта появляются вредные бактерии, которые производят дальнейшее окисление уксусной кислоты. Начинается так называемое переокисление, разложение уксусной кислоты до углекислого газа и воды, т.е. происходит процесс, который может привести к исчезновению из среды как спирта, так и уксусной кислоты. При кислотности уксуса выше 7 % опасность переокисления отпадает, так как при такой кислотности уксусная кислота сама является сильным антисептиком, убивающим вредные бактерии. Нежелательными спутниками уксусного производства являются так называемые уксусные угри (Anguillula aceti), которые иногда развиваются в уксусообразователях в больших количествах, особенно при слабокислом уксусе. Эти мелкие (длиной 1–2 мм) организмы при плохой фильтрации могут попадать в готовый продукт. Они безвредны для человека, но вызывают у потребителя естественное отвращение к продукту. Чтобы избежать образование посторонних микроорганизмов и уксусных угрей, производят стерилизацию аппарата, предварительную пастеризацию уксуса, которым пропитывают стружку. Для этого аппарат промывают горячей водой, загружают в него сухую стружку и затем вместе со стружкой пропаривают острым паром. Пастеризацию уксуса производят нагреванием до 70°С в течение 30 мин. Пастеризованный уксус заливают в аппарат до тех пор, пока содержание уксусной кислоты в уксусесырце (в сливе) не достигнет 7–7,8 %. После этого в уксусообразователи вносят чистую культуру бактерий. 158 Часто для уничтожения угрей добавляют к полученному уксусу 1–2 % поваренной соли. Такая концентрация соли уже по истечении 1–2 суток оказывается смертельной для угрей. После этого уксус отфильтровывают для задержания мертвых угрей. Технологическому процессу уксусные угри большого вреда не приносят и не оказывают заметного влияния на баланс веществ, несмотря на то, что они питаются уксусными бактериями, ассимилируют спирт и уксусную кислоту. Внесение в затор питательных веществ для бактерий повышает производительность уксусообразователя, так как эти вещества усиливают жизнедеятельность бактерий и их размножение. Выбор минеральных солей для питания бактерий зависит от содержания примесей в воде, применяемой в производстве уксуса. Обычно в затор добавляют азотистые вещества и калийные соли, которых недостает в воде, идущей в производство. Такими добавками являются фосфаты аммония (NHA)2HPOA или NH4H2PO4, сульфат аммония (NH4)2SO4 и фосфаты калия (К2НРО4 или КН2РО4). Для облегчения усвоения бактериями минеральных солей в затор вносят также углеводы, обычно в виде глюкозы. Для нормального промышленного уксусного брожения и максимального выхода продукта на 1 л безводного спирта добавляют 7 г глюкозы, 1,25 г дифосфата аммония, 0,5 г дифосфата калия и 0,2 г сульфата магния. Главными недостатками производства уксусной кислоты являются: медленность процесса, затраты ценного пищевого сырья, невозможность получения концентрированного продукта. Натуральный уксус имеет приятный запах благодаря наличию в нем естественных примесей. Особенно высоко ценится уксус, приготовленный на основе виноградных или фруктово-ягодных вин. 159 ГЛАВА 10 ПРОИЗВОДСТВО ОРГАНИЧЕСКИХ КИСЛОТ НА ОСНОВЕ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ 10.1 Получение лимонной кислоты Лимонная кислота – трехосновная оксикислота, широко распространена в природе, относительно много ее содержится в некоторых ягодах, фруктах, особенно в цитрусовых (в лимоне 5–8%), в листьях и стеблях некоторых растений. Лимонную кислоту выделяют в виде лимоннокислого кальция из продуктов переработки листьев хлопчатника, стеблей махорки, хвои ели, плодов лимонав. Лимонная кислота широко применяется в ряде отраслей пищевой промышленности: кондитерской (конфеты, желе), винодельческой, безалкогольных напитков, консервной, пищеконцентратов. Она используется в фармацевтической промышленности, в том числе при переливании крови, а также при приготовлении косметических средств. Лимонная кислота – прекрасный хелатирующий (комплексообразующий) агент, что позволяет широко использовать ее в процессах электрогальванизации, дубления кож, окраски тканей, приготовления чернил, очистки паровых котлов, изготовления синтетических моющих средств. Используется лимонная кислота в химической промышленности, в том числе при производстве алкидных смол, а ее эфиры служат пластификаторами при производстве лаков. Способность образовывать лимонную кислоту при росте на средах с углеводами – свойство, широко распространенное среди мицелиальных грибов. Для получения лимонной кислоты в лабораторном и промышленном масштабе используют грибы рода Aspergillus (в том числе виды A. awamori;A. clavatus, A. fumaricas, A. japonicus, A. niger, A. wentii), рода Penicillium (в том числе P. chrysogenum, P. citrinum, P. citrogenum, P. luteum), а также Botrytis cinerea, Paecilomyces divaricatum, Mucor piriformis, Polyporus anceps. В настоящее время в качестве продуцента лимонной кислоты применяются различные штаммы A. niger. Используемые в производстве штаммы отличаются большой скоростью роста, легкостью культивирования и высоким выходом лимонной кислоты. 160 Способность различных грибов, в том числе A. niger, продуцировать лимонную кислоту проявляется в строго определенных условиях культивирования. Как правило, культуры грибов при избытке питательных веществ не накапливают лимонной кислоты, а образуют значительную биомассу и окисляют сахар до СО2 и Н2О. Синтез лимонной кислоты грибом продуцентом осуществляется обычно на средах с высокой концентрацией углевода (5–20%). Наилучшим субстратом для A. niger является сахароза. Накопление кислоты имеет место при ограничении роста гриба одним из минеральных компонентов среды (Fe, Mn, P, N) или несколькими компонентами одновременно. Преимущественное образование лимонной кислоты происходит при культивировании продуцента при низком значении рН среды. В таких условиях синтез других органических кислот подавляется. Процесс кислотообразования осуществляется в условиях достаточного обеспечения культуры молекулярным кислородом. В процессе ферментации можно выделить две фазы: активного роста гриба; интенсивного кислотообразования, рост мицелия в этот период становится незначительным. При производстве лимонной кислоты применяются три способа ферментации: 1. Культивирование продуцента на поверхности твердой питательной среды (твердофазная ферментация). 2. Поверхностное культивирование на жидкой среде. 3. Погруженное глубинное культивирование. Культивирование на поверхности твердой среды. Грибпродуцент выращивают в неглубоких лотках на поверхности влажных отрубей риса или пшеницы. После окончания процесса лимонная кислота вместе с небольшим количеством одновременно образовавшихся глюконовой и щавелевой кислот экстрагируется водой, а затем осаждается в виде соли кальция. В связи с тем, что отруби богаты железом и другими микроэлементами, используют штаммы A. niger, не чувствительные к высоким концентрациям металлов. Поверхностное культивирование на жидкой среде. Поверхность жидкой среды, разлитой в неглубокие кюветы, засевают конидиями гриба продуцента. Кюветы размещают на стеллажах в термостатированных «бродильных камерах». Гриб развивается в виде плотной пленки на поверхности питательной среды, содержащей высокие концентрации сахара. 161 Образующаяся лимонная кислота переходит из клеток мицелия в раствор, из которого после окончания процесса ее осаждают в виде кальциевой соли, а затем переводят в форму свободной кислоты и кристаллизуют. Ферментацию можно продлить, доливая в среду раствор сахара или подводя под пленку свежую среду. Различают три основных способа ведения процесса: бессменный, сменный и доливной. При бессменном способе рост и кислотообразование гриба происходят на одной и той же питательной среде, содержащей минеральные соли и источник углерода. Источник углерода (кристаллический сахар или меласса) вносится в питательную среду в количестве, необходимом для обеспечения нормального роста и активного кислотообразования гриба. Сменный способ культивирования часто называют методом готовых пленок. Пленку гриба выращивают на питательной среде, содержащей минеральные соли и углевод. По окончании роста гриба питательный раствор из-под пленки сливают, пленку промывают стерильной водой и под нее подводят новую среду для кислотообразования, обычно содержащую углевод, но лишенную минеральных соединений. Доливаемый раствор имеет повышенную концентрацию сахара и находится под пленкой сравнительно длительное время (4–6 сут). При многосменном методе переработанные растворы несколько раз в течение цикла сливают из-под пленки и заменяют новыми. Частота смены зависит от активности грибной пленки. Способ долива основан на том, что через 6–7 суток от начала цикла, когда содержание остаточного сахара в растворе снизится до 3–4%, подливают свежий раствор мелассы (без питательных солей) в количестве 30–35% начального объема. В результате продолжительность цикла ферментации увеличивается с 8–9 до 12 суток. При получении лимонной кислоты поверхностным способом одним из важнейших факторов являются аэрация, температура и влажность. Количество воздуха увеличивают по мере развития мицелия. Лимонная кислота составляет 96–99% от общей суммы кислот, а выход ее равен 85– 91% от внесенного сахара. После окончания ферментации культуральную жидкость из под мицелия сливают и отводят для выделения лимонной кислоты. Пленки гриба собирают и используют для выделения содержащегося в них фермента – пектиназы, либо высушивают и используют в качестве добавок в корм скоту и птицы. Штаммы A. niger, используемые в качестве продуцентов лимонной кислоты при поверхностном методе, не пригодны для использо- 162 вания в условиях глубинного культивирования. При этом методе применяют специально реакционированные природные штаммы или мутанты. Штамм сохраняется в виде конидий, отделенных от мицелия («споровый консерв»). В качестве посевного материала для ферментации используются конидии гриба, смешанные с активированным углем или тальком. Процесс ферментации включает два этапа: выращивание мицелия в посевном аппарате и рост мицелия и кислотообразование в основном ферментаторе. В качестве источника углерода при существующем методе глубинной ферментации лимонной кислоты используют мелассу, освобожденную от ионов Fe, Mn и других металлов путем обработки ферроцианидом калия. Лимонную кислоту выделяют в виде труднорастворимой при высокой температуре соли кальция. Для получения цитрата кальция к отфильтрованному культуральному раствору добавляют хлористый кальций (2,5–3% от количества кислоты), раствор нагревают до 100 С° и нейтрализуют известковым или меловым молоком до рН 6,8–7,0. Выпавший в осадок трехкальциевый цитрат отфильтровывают, промывают горячей водой и разлагают серной кислотой. Лимонная кислота полностью освобождается и переходит в раствор, а остающиеся в осадке гипс и оксалат кальция удаляют фильтрацией. Раствор после ряда дополнительных стадий очистки упаривают под вакуумом и проводят кристаллизацию лимонной кислоты. В продажу поступает кристаллическая лимонная кислота. Лимонную кислоту также получают с помощью дрожжей из н-парафинов. Способность продуцировать эту кислоту широко распространена у различных видов дрожжей рода Candida (С. lipolytica, С. guilliermondii, С.oleophila, С. parapsilosis, С. tropicalis, С. zeylanoides). Все без исключения природные штаммы дрожжей при росте на средах с алканами продуцируют две кислоты – лимонную и изолимонную, которые являются изомерами и различаются положением гидроксильной группы. 10.2 Получение итаконовой кислоты Итаконовая (метиленянтарная) кислота – ненасыщенная двухосновная кислота: она может быть получена химическим путем из лимонной или аконитовой кислоты. Кроме того, итаконовая кислота является продуктом метаболизма углеводов грибами рода Aspergillus, а 163 именно A. itaconicus, выделенного в 1929 году японским исследователем Киношита, и A. terreus, обнаруженным несколько позднее английским ученым Кэлэмом (1939). Способность итаконовой кислоты и ее производных легко полимеризоваться дает возможность образовывать многочисленные синтетические материалы, обладающие ценными свойствами и находящие широкое применение. Итаконовая кислота применяется в производстве высококачественных синтетических смол, синтетических волокон (в том числе нитрилакрилового волокна «нитрон»), ПАВ, моющих средств, фармацевтических препаратов, инсектицидов, красителей и других сложных органических соединений. Продуцентом кислоты являются специально селекционированные штаммы А. terreus. Процесс синтеза итаконовой кислоты очень похож на соответствующий процесс получения лимонной кислоты. Как одна, так и другая кислоты могут быть получены методами поверхностного и глубинного культивирования. Чаще используется глубинный метод. Процесс включает культивирование продуцента на средах с высокой концентрацией сахара (чаще мелассой) в условиях ограничения роста гриба минеральными компонентами среды (обычно железом и фосфором) при низком рН среды и достаточном обеспечении кислородом. Итаконовая кислота в отличие от лимонной является токсичным продуктом. Избежать токсичного действия накапливающейся кислоты можно нейтрализацией ее NH4OH. Периодическое введение NH4OH и поддержание значения рН среды на уровне 3,8 обеспечивает накопление до 150–200 г итаконовой кислоты в одном литре раствора. Другая особенность процесса синтеза итаконовой кислоты с помощью А. terreus – необходимость внесения в среду высоких концентраций ионов таких металлов, как Zn2+, Mg2+ и Cu2+. В результате многоступенчатой обработки природного штамма мутагенами и последующего отбора селекционирован ряд высокоактивных мутантов А. terreus. В качестве посевного материала при поверхностном и глубинном методах ферментации в промышленности используют сухие конидии гриба, отделенные от мицелия и смешанные с активированным углем. При поверхностном способе процесс ферментации осуществляется в кюветах по бессменному варианту без долива или с доливом. В качестве источника углерода используют свекловичную мелассу или продукт переработки отходов древесины – двойное соединение глюкозы с NaCl. 164 Рациональная концентрация сахара 8%, рН среды 5,0, кроме того, среда содержит NH4NO3, MgS04·7H20, ZnS04·7H2O, KFe(CN)6 и кукурузный экстракт. Важным фактором является воздушный режим в «бродильной камере». При глубинном способе процесс осуществляется последовательно в двух ферментаторах. Среда в посевном ферментаторе засевается спорами гриба. В конце экспоненциальной фазы роста мицелий передается из посевного в основной аппарат. Ферментационная среда содержит 6–7% сахара мелассы (состав солей тот же, что и при поверхностном методе), рН среды поддерживается на уровне 2,1–2,3, оптимальном для синтеза итаконовой кислоты. В течение ферментации осуществляется интенсивное перемешивание и аэрация среды. Биосинтез итаконовой кислоты в глубинных условиях происходит намного интенсивнее, чем в поверхностных. После окончания процесса ферментации культуральную среду освобождают от мицелия, осветляют активированным углем и упаривают под вакуумом. Итаконовая кислота кристаллизуется из упаренного раствора. Перекристаллизованная итаконовая кислота используется для химических синтезов. Биосинтез итаконовой кислоты связан с превращением глюкозы по фруктозобисфосфатному пути и реакций ЦТК. Непосредственным предшественником итаконовой кислоты служит цисаконитовая кислота, – продукт превращения цитрата под действием аконитатгидратазы. 10.3 Получение фумаровой кислоты Фумаровая кислота – транс-изомер этилендикарбоновой кислоты. Большое значение имеет способность фумаровой кислоты превращаться в малеиновую кислоту (цис-изомер), которая, как и малеиновый ангидрид, используется для изготовления синтетических смол, красок и лаков. Фумаровая кислота дает смолы типа глицериновых, которые при использовании в лаках обладают большой крепостью и устойчивостью. Кроме того, фумаровая кислота в виде магниевых и натриевых солей используется в медицине. В последнее время фумаровую кислоту все шире используют в пищевой промышленности как заменитель лимонной кислоты при изготовлении безалкогольных напитков. Фумаровая кислота может быть получена методом микробиологического синтеза с помощью грибов из углеводов. Фумаровая кислота – метаболит ЦТК, присутствует во всех живых клетках, но ред- 165 ко выделяется в среду. Продуцентами фумаровой кислоты могут быть различные виды грибов: P. griseofulvum, A. glaucus, A. flavus, A.oniki, A. wentii, Caldariomyces fumago. Наиболее активно продуцируют фумаровую кислоту мукоровые грибы, особенно относящиеся к роду Rhizopus (некоторые штаммы R. Nigricans, R. delemar и R. arrhizus). В качестве источника углерода для синтеза фумаровой кислоты грибами используют глюкозу в концентрации 5–10% или крахмалсодержащие материалы. Важным фактором является ограничение роста гриба-продуцента источником азота и цинка. Ферментация осуществляется в условиях интенсивной аэрации с нейтрализацией среды СаСОз или NaOH. Процесс может проводиться как методом поверхностного, так и методом глубинного культивирования. Наибольший выход фумаровой кислоты (58% от потребленной глюкозы) получен при использовании в качестве продуцента R. delemar. Для выделения фумаровой кислоты культуральную жидкость освобождают от мицелия гриба, фильтрат подкисляют минеральной кислотой и свободную фумаровую кислоту, обладающую низкой растворимостью в воде, выкристаллизовывают из раствора. Фумаровая кислота образуется в результате реакций ЦТК. 10.4 Получение α-кетоглутаровой кислоты Кетоглутаровая кислота (2-оксоглутаровая) кислота (НООС– СН2–СН2–СО–СООН) – ценный биохимический препарат. Она легко аминируется химическим или ферментативным способом и может служить сырьем для производства глутаминовой кислоты. Кроме того, α-кето-глутаровая кислота – прекрасный источник углерода для различных микроорганизмов. Сверхсинтез α-кетоглутаровой кислоты дрожжами происходит при культивировании Сandida lipolytica на средах с низкой концентрацией тиамина, так как обязательным условием образования ее в значительном количестве является лимитирование роста продуцента дефицитом этого витамина. Дрожжи не способны самостоятельно синтезировать пиримидиновую часть молекулы тиамина и нуждаются во внесении витамина в среду. Метод состоит в культивировании специально селекционированного штамма С. lipolytica на синтетической среде с очищенным парафином в качестве источника углерода. Рост продуцента ограничивается дефицитом тиамина в среде. Ферментация осуществляется в 166 ферментаторе, снабженном мешалкой, в условиях интенсивной аэрации. α-кетоглутаровая кислота, образующаяся дрожжами, нейтрализуется периодическим добавлением стерильного раствора NaOH. В конце процесса культивирования выход α-Кетоглутаровой кислоты достигает 70% от внесенного в среду парафина. Синтез α-кетоглутаровой кислоты дрожжами начинается не сразу, а после потребления тиамина из среды и при концентрации его в дрожжах ниже определенного уровня. Процесс ферментации может быть условно разделен на две фазы: - фазу активного роста продуцента (сопровождающуюся полным потреблением тиамина из среды); - фазу замедления роста и интенсивного синтеза α-кетоглутарата. Процесс кислотообразования продолжается неразмножающимися клетками до полного потребления субстрата. α-Кетоглутаровая кислота – метаболит цикла Кребса, образуется в результате декарбоксилирования изоцитрата. Клетки дрожжей, продуцирующие кислоту, имеют высокую активность цитратсинтазы и изоцитратдегидрогеназы. Однако дальнейшее превращение α-кетоглутарата в цикле оказывается невозможным при дефиците тиамина и в результате низкой активности циаминсодержащего фермента – кетоглутаратдегидрогеназы. Блокирование ЦТК на этом уровне приводит к накоплению α-кетоглутарата в клетках и выделению его в среду. 167 ГЛАВА 11 ПРОИЗВОДСТВО ЭТИЛОВОГО СПИРТА НА ОСНОВЕ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ Ограниченность запасов ископаемого топлива, зависимость многих стран от импорта энергетических запасов активизируют поиск новых более доступных видов топливно-энергетического сырья. Неисчерпаемым источником такого сырья является растительная биомасса, две трети которой составляет целлюлоза. В последнее десятилетие значительно возрос интерес к получению биотоплива (этанола) из растительной биомассы с помощью микроорганизмов, когда этиловый спирт рассматривается как горючее будущего, он может внести существенный вклад в восполнение энергетических ресурсов. Перспективы использования низших спиртов (метанола, этанола), а также ацетона и других растворителей в качестве горючего для двигателей внутреннего сгорания вызвали в последние годы большой интерес к возможности их крупномасштабного получения в микробиологических процессах с использованием различного растительного сырья. Этиловый спирт является прекрасным экологическим чистым горючим для двигателей внутреннего сгорания. Замена дефицитного бензина иными видами топлива – актуальная проблема современности. Использование чистого этанола или в смеси с бензином (газохол) существенно снижает загрязнение окружающей среды выхлопными газами, так как при сгорании этанола образуются только углекислота и вода. Поэтому в странах с большими запасами природного растительного материала и соответствующими почвенноклиматическими условиями, обеспечивающими большие ежегодные урожаи, становится целесообразным ориентировать производство моторных топлив на процессы микробиологического брожения. Около 40 лет назад проведены успешные испытания автомашин с двигателем, работающим на 95 %-этаноле: 1 л этого горючего достаточно для 5 км пробега, а 1 л бензина – для 7,5 км. Однако в выхлопных газах автомобилей, работающих на этаноле, содержится в 60 раз меньше окиси углерода, чем при использовании бензина. Этиловый спирт – перспективное сырье и для микробиологической промышленности. В отличие от метанола он не токсичен, менее летуч и более эффективно потребляется микроорганизмами. Способ получения дрожжей, утилизирующих этиловый спирт, запатентован в 168 ряде стран. Выход биомассы колеблется от 55 до 80 % от внесенного этанола. Этанол усваивают и многие бактерии. Наиболее перспективные продуценты белка – бактерии рода Acinetobacter. Они хорошо растут на среде с этанолом без добавления витаминов и накапливают до 10г/л биомассы, а в некоторых случаях – до 24 г/л. Этанол – сравнительно дешевое сырье для микробиологического получения аминокислот. Он является хорошим источником углерода для производства лизина и глутаминовой кислоты с использованием Brevibac-terium и Corynebacterium. На среде с этанолом выход глутаминовой кислоты повышается на 50 % . Таким образом, этиловый спирт можно рассматривать не только как жидкое топливо, но и как перспективное сырье для различных отраслей микробиологической промышленности, развитие которой увеличит потребность в этиловом спирте. Для получения этанола используется недефицитное сырье, в том числе целлюлозосодержащие отходы. Кроме того, биоконверсия растительной биомассы в этанол энергетически более выгодна, чем ее конверсия в микробную (белок) биомассу. Энергетический выход аэробной конверсии составляет около 0,60. При анаэробном процессе в конечные продукты – этанол и микробную биомассу – переходит около 0,95 энергии субстрата. Сырьем для процессов спиртового брожения могут быть разнообразные биомассы, включая крахмалсодержащие (зерно, картофель), сахаросодержащие материалы (меласса, отходы деревоперерабатывающей промышленности), а также биомасса специально выращенных пресноводных и морских растений и водорослей. 11.1 Способы получения этилового спирта 1. Этиловый спирт обычно получают из гексоз в процессах брожения, вызываемых бактериями (Zymomonas mobilis, Z. anaerobica, Sarcina ventriculi), клостридиями (Clostridium thermocellum) и дрожжами (Saccharomyces cerevisiae). Издавна сырьем для производства этилового спирта микробиологическим способом служили различные сельскохозяйственные и дикорастущие растения, содержащие сахар или крахмал: зерно, картофель, сахарная свекла, сахарный тростник, фрукты. 1. Главная задача, которую приходится решать при получении спиртов технического назначения, это замена дорогостоящих крахмалсодержащих субстратов дешевым сырьем непищевого назначения. 169 2. Синтетический этанол получают путем каталитической гидратации этилена, который составляет основную часть крекинговых и попутных газов, образующихся при переработке нефти. Однако предполагают, что в течение 20 лет производство синтетического этанола полностью прекратится и его будут получать исключительно путем ферментации. 3. Производство спирта на основе гидролиза целлюлозосодержащих материалов минеральными кислотами разрабатывалось в Германии, США, СССР в конце XIX – начале XX века. В нашей стране большой размах гидролизная промышленность получила благодаря работам Шаркова (1977). Производство спирта из гидролизатов целлюлозосодержащего сырья более энергоемко, чем из глюкозо- и крахмалсодержащего, так как для получения сбраживаемого сахара необходимы более высокие температура и затраты на выделение и очистку спирта, содержание которого в бражке из целлюлозосодержащего сырья на порядок ниже (1,0–1,5 об.%), чем в бражке, перерабатываемой на заводах спиртовой промышленности из крахмалсодержащего сырья (6–12 об.% спирта). Гидролизное производство основано на свойстве полисахаридов, составляющих около 70 % массы растений, подвергаться гидролитическому расщеплению до моносахаридов под действием воды в присутствии минеральных кислот. Гидролизное производство, являющееся одной из отраслей микробиологической промышленности, позволяет перерабатывать низкокачественную древесину и миллионы тонн разнообразных древесных и сельскохозяйственных отходов в важнейшие продукты: кормовые белковые дрожжи, этиловый спирт, фурфурол, ксилит, глюкоза, диоксид углерода. Ценность гидролизного производства усматривается еще и в том, что в качестве сырья оно использует низкокачественную древесину, разнообразные древесные и сельскохозяйственные отходы. В качестве гидролизного сырья широко используются различные виды отходов лесопиления и деревообработки, дрова, отходы переработки сельскохозяйственных культур и некоторые дикорастущие растения. Критерием для использования тех или иных отходов является их стоимость, размеры их концентрации в районе расположения гидролизного завода и технологические свойства. Наиболее дешевым видом сырья являются древесные опилки и подсолнечная лузга. Процесс складывается из нескольких стадий, включающих подготовку сырья, процесс брожения, отгонку и очистку спирта, денатурацию, переработку кубовых остатков. 170 Наличие в растительных тканях двух типов полисахаридовпентозанов и гексозанов и, следовательно, возможности получения преимущественно пентозных или гексозных моносахаридов, определило организацию гидролизной промышленности предприятий следующих профилей: дрожжевого, основанного на переработке всех сахаров в кормовые дрожжи; спиртодрожжевого, в котором из гексозных вырабатывается этиловый спирт, а из пентозных – дрожжи; ксилозно-дрожжевого, где вначале гидролизуют пентозы для получения ксилозы, а затем гексозы для производства дрожжей. Источником промышленного получения моносахаридов являются растительные ткани, основу которых образуют полимерные цепи различных полисахаридов – пентозанов и гексозанов. Наиболее ценным растительным сырьем является древесина, которая на 65-70 % состоит из полисахаридов. Превращение полисахаридов растительного сырья в моносахариды (простые сахара) основано на гидролитическом расщеплении (гидролизе) полисахаридов. Одновременно с гидролизом полисахаридов идет процесс распада моносахаридов с образованием различных продуктов: оксиметилфурфурола, фурфурола, муравьиной кислоты и других продуктов. Скорость распада моносахаридов определяется теми же факторами, что и скорость их образования. Поэтому режим гидролиза растительного сырья с целью получения моносахаридов подбирают так, чтобы процесс разрушения моносахаридов был наименьшим. Гидролиз древесины может осуществляться с использованием концентрированных или разбавленных минеральных кислот. Гидролизат содержит 3–3,5 % РВ (редуцирующие вещества), из них до 90 % приходится на моносахариды, свыше 5 % составляют декстрины, остальное – различные примеси, затрудняющие биохимическую переработку гидролизата. Поэтому гидролизат сначала выдерживают в течение 3 ч при 0 100 С в инверторах с целью инверсии декстринов, а также для разрушения части примесей. Затем его нейтрализуют известковым молоком и аммиаком до рН 3,2–4,2, одновременно добавляют минеральные питательные соли. Нейтрализованный гидролизат (нейтрализат) подвергают отстаиванию для отделения взвешенных частиц и охлаждают до 30–35 0С. Полученный сустрат аэрируют и затем освобождают от образовавшихся хлопьев путем отстаивания. Отстоявшийся осветленный субстрат, так называемое сусло направляют на биохими- 171 ческую переработку для получения спирта или белковых кормовых дрожжей. Для производства этилового спирта используют гидролизат только от варки хвойной древесины, где в составе моносахаридов преобладают гексозы. В сусло вводят спиртообразующие дрожжи, которые с помощью выделяемого ими фермента зимазы расщепляют гексозные (сбраживаемые) сахара до этилового спирта и двуокиси углерода. С6Н12О6 → 2С2Н6ОН + 2СО2. Спиртовое брожение осуществляют в бродильной батарее. На ряде заводов такая батарея состоит из трех аппаратов вместимостью по 300 м3. В двух головных аппаратах, работающих параллельно, при 32–35 0С происходит брожение. В них непрерывно поступают (раздельно или в смеси) сусло и дрожжевая суспензия, а бродящая жидкость из них непрерывно перетекает в третий, хвостовой аппарат для дображивания. От сброженной жидкости действием центробежной силы отделяют на сепараторах дрожжевую суспензию, которую возвращают в головные аппараты. Остающуюся жидкость называют спиртовой бражкой. Она содержит 1,0–1,5 % этилового спирта и в качестве примесей небольшое количество метилового спирта, эфиров, альдегидов. Бражку направляют на бражную колонну, где из нее отгоняют острым паром спиртовую фракцию. Конденсат, содержащий около 20 % этилового спирта, ректифицируют в колонне для отделения основного количества примесей. Полученный продукт повторно ректифицируют в спиртовой колонне для доведения массовой доли этилового спирта до 95–96 %. Получение спирта ферментацией целлюлозы. В 1976 г. появилось сообщение о новой комплексной технологии получения спирта, обеспечивающей наиболее полную утилизацию газетной бумаги. Технология заключается в получении ферментативным путем из целлюлозы глюкозы с последующим ее сбраживанием дрожжами до этанола. Схема предусматривает поэтапное осахаривание бумаги целлюлазой Trichoderma viridae QM 9414, затем спиртовое брожение и выращивание кормовых дрожжей на отходах. Процесс, предложенный Wilke et al. (1976), состоит в том, что целлюлозосодержащее сырье – древесину, хлопчатобумажные ткани, рисовую и пшеничную солому, бумагу – измельчают, а затем осахаривают целлюлазой или культуральной жидкостью микроорганизмов 172 Trichoderma viride или Т. reesei. Полученный раствор глюкозы сбраживают до спирта, используя дрожжи Saccharomyces cerevisiae, Pichia или микроскопические грибы Rhizopus javanikus. Этот способ значительно увеличивает выход целевого продукта по сравнению с известным двухступенчатым методом получения этилового спирта. Изучение ферментативного осахаривания целлюлозы фильтратом культуральной жидкости Trichoderma viride QM 9414 показало, что процесс ферментативного гидролиза наиболее активно протекает при 45–50 0С, следовательно, целесообразно использование термофильных штаммов дрожжей. Было установлено, что выход этанола зависит от концентрации ферментов, активности отдельных компонентов целлюлазного комплекса и концентрации глюкозы. Присутствие целлюлаз не подавляет накопление этанола в ферментативной среде, а увеличение концентрации ферментов повышает его выход. Подобный процесс ферментации возможен при применении различных целлюлозосодержащих субстратов. Процесс получения этанола по способу фирмы «Галф Ойл» основан на обработке предварительно подготовленной суспензии с содержанием целлюлозы 7,5–15,0 % ферментами Trichoderma reesei целлобиогидролазой и 3-глюкозидазой. Образовавшуюся при этом глюкозу сбраживают в этанол дрожжи Saccharomyces cerevisiae, S. bergensis и Candida brassicae. В качестве сырья испытаны древесные опилки, кора деревьев и стоки целлюлозно-бумажного производства. Изучен процесс получения этанола из размельченной рисовой соломы путем одновременного гидролиза целлюлозосодержащих компонентов соломы и сбраживания образующихся при этом сахаров в спирт. Процесс предусматривает использование целлюлаз грибов рода Trichoderma и культивирование термофильных дрожжей Saccharomyces cerevisiae. В течение этого процесса в среде не накапливается целлобиоза и тем самым устраняется ингибирование образования целлюлолитических ферментов. Разработан способ ферментативного гидролиза пшеничной или ячменной соломы и последующего сбраживания, который позволяет получать этанол с выходом, равным 75 % от теоретического. Выход этанола зависит от способа обработки соломы и способа экстракции целлюлозы, а также от концентрации ферментного препарата целлюлаз. При использовании комплекса целлюлолитических ферментов гриба Trichoderma harrianum выход этанола выше, чем при гидролизе целлюлозы ферментами гриба Trichoderma reesei. Это объясняется 173 более высоким содержанием 3-глюкозидазы в культуральной жидкости Trichoderma harrianum. Процесс утилизации твердых бытовых отходов в этанол включает систему разделения органических и неорганических отходов, гидролиз целлюлозы до глюкозы, сбраживание глюкозы и отгонку этанола. Предлагается два способа гидролиза целллюлозы: кислотный и ферментативный с одновременным сбраживанием сахара. Оба позволяют получать этанол с выходом, превышающим 80 % от теоретического. Городские домашние отходы также могут служить сырьем для получения этанола. В этом случае гидролиз осуществляют в колонном реакторе целлюлазами Trichoderma reesei. Даже при низких концентрациях субстрата за 48 ч гидролиза выход сахаров составляет 45–50 %. В гидролизатах преобладает глюкоза (60 %), присутствуют также ксилоза (8,5 %) и целлобиоза (7 %). Образование этанола дрожжами – это анаэробный процесс, однако для размножения дрожжей в незначительных количествах нужен и кислород. Процессы, происходящие при конверсии сахаросодержащего субстрата в спирт, включают также процессы метаболизма и роста клеток продуцента, поэтому в целом биологический процесс получения спиртов зависит от ряда параметров (концентрации субстрата, кислорода, а также конечного продукта). При накоплении спирта в культуре до определенных концентраций начинается процесс ингибирования клеток. Поэтому большое значение приобретает получение особых штаммов, резистентных к спирту. Промышленный процесс брожения может осуществляться по разным схемам: непрерывно, периодически и периодически с возвратом биомассы. При периодическом процессе субстрат сбраживается после внесения свежевыращенного инокулята, который обычно получают в аэробных условиях. После завершения сбраживания субстрата клетки продуцента отделяют, и для нового цикла получают свежую порцию посевного материала. Это достаточно дорогостоящий процесс, так как в аэробном процессе размножения дрожжей расходуется много субстрата. Экономический выход в процессе составляет около 48 % от субстрата по массе (часть субстрата тратится на процессы роста и метаболизма клеток, а также образование других продуктов – уксусной кислоты, глицерола, высших спиртов). Если в качестве продуцента в процессах брожения используют дрожжи, продуктивность составляет 1–2 г этанола/грамм клеток в час. 174 В промышленных процессах продуктивность аппаратов зависит от физиологических особенностей продуцента, плотности биомассы, типа аппарата и режима ферментации; варьирует очень широко (от 1 до 10 г/л ч). Длительность цикла составляет около 36 ч, конечная концентрация спирта – 5 % (вес/объем). Недостатки процесса (главным образом, длительность и неполное использование субстрата) можно частично устранить, применяя процесс с повторным использованием биомассы. По завершении процесса брожения концентрация спирта в бражке может составлять от 6 до 12 %. Побочными продуктами спиртового брожения являются углекислота, сивушные масла, кубовые остатки, дрожжи. Каждый из этих продуктов имеет определенную стоимость и самостоятельную сферу применения. 175 ГЛАВА 12 ПРОИЗВОДСТВО БЕЛКА НА ОСНОВЕ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ Белки, или протеины, – важнейший класс биологически активных веществ. Они играют ключевую роль в клетке, присутствуют в виде главных компонентов в любых формах живой материи. В организме животных белков содержится до 40–50 % и более на сухую массу, меньше у растений (2–35 %). Нетрадиционным и принципиально новым способом получения белковых веществ является микробиологический синтез. По скорости роста микроорганизмы превосходят сельскохозяйственные культуры в сотни, а животных – в тысячи раз. Поэтому микробиологический синтез с большей эффективностью использует материальные и энергетические ресурсы, не требует больших земельных площадей, не зависит от погодных и климатических условий и не загрязняет окружающую среду ядохимикатами, так как не использует пестициды. Качество микробных белков близко белкам животного происхождения. Применение микробных белков в кормопроизводстве улучшает качество и усвояемость традиционных растительных кормов. Например, 1 т кормовых дрожжей обеспечивает экономию 5 т зерна и увеличивает продуктивность в животноводстве на 15–30 %. Современный средний завод по производству микробного белка мощностью 50т/год и занимающий 0,2 га может обеспечить потребность в белке до 10 млн человек. Сельскохозяйственные технологии для таких масштабов производства требуют до 16 тыс. га, засеянных пшеницей, либо содержание фермы с производительностью 400 поросят/день. Белок одноклеточных должен удовлетворять ряду специальных требований. Главными являются: питательность, переваримость, экономическая эффективность. Питательность микробного белка, определяемая по химическому составу, близка традиционным белковым продуктам. Микробная биомасса питательна, если ее компоненты перевариваются ферментами пищеварительного тракта высших животных или человека. Препятствием этому могут быть клеточные стенки отдельных продуцентов, которые предварительно приходится разрушать, а также высокий уровень нуклеиновых кислот. Последние метаболизи- 176 руются в организме животных и выводятся из организма с уриной, следовательно, не представляют для высших животных опасности. Для человека такой уровень нуклеиновых кислот неприемлем, так как в ходе их усвоения возможно нарушение обмена веществ и возникновение патологических состояний. Поэтому для пищевых целей микробную биомассу предварительно обрабатывают, используя различные методы разрушения и денуклеотизации. 12.1 Получение кормовых дрожжей Получение кормовых дрожжей организовано на основе переработки углеводного и углеводородного сырья. В качестве углеводного сырья используются: гидролизаты древесины и растительных отходов (подсолнечной и рисовой лузги, кукурузных кочерыжек, стеблей хлопчатника и др.); сульфитные щелока и предгидролизаты сульфатно-целлюлозного производства; обесспиртованная барда. Сырье ежегодно возобновляется и, как правило, является отходами. Промышленное производство товарной микробной биомассы осуществляется путем непрерывного аэробного культивирования аспорогенных дрожжей в нестерильных условиях. Максимальные скорости синтеза белковых веществ микробными клетками реализуются при оптимальных условиях среды, когда удельная скорость роста близка к максимальной. Поэтому для получения белка одноклеточных биотехнологические процессы организуют в проточном режиме, который позволяет стабилизировать практически все параметры стадии ферментации на уровнях, оптимальных для размножения клеток со скоростями роста, близкими к max, то есть в режиме белковой направленности биосинтеза. При производстве биомассы в качестве кормового белкового продукта, как правило, осуществляется режим незащищенной ферментации, то есть без соблюдения правил стерильности. В настоящее время в микробиологических производствах белка применяется различное сахаросодержащее сырье. Это отходы пищевой, молочной, спиртовой, сахарной и целлюлозной промышленности и продукты переработки растительного сырья (древесины, соломы, торфа, несъедобных частей растений – стебли, лузга, кочерыжки). Питательные среды, приготовленные на основе перечисленных субстратов, содержат наборы моно- и дисахаров, органические кислоты, спирты и другие органические соединения, а также минеральные элементы, то есть являются сложными многокомпонентыми субстра- 177 тами. Поэтому при их применении используют штаммы-продуценты, способные, во-первых, усваивать как пентозы, так и гексозы, и, вовторых, устойчивые к присутствию спиртов, фурфурола и других продуктов гидролиза растительных биомасс. Наибольшее распространение получили виды дрожжей рода Candida: C. utilis, C. scottii, C. tropicalis, способные утилизировать наряду с гексозами пентозы и обладающие толерантностью к фурфуролу. На большинстве гидролизно-дрожжевых заводов основу ассоциаций составляют дрожжи Candida scottii (60 % и более). Эти дрожжи обладают высокой продуктивностью и качеством, они полностью флотируются и хорошо сепарируются. В ассоциацию микроорганизмов могут входить также C. tropicalis, C. utilis. Для переработки сульфитных щелоков используют C.utilis. Их доля в дрожжевой массе 80–100 %. Основные регулируемые параметры непрерывного культивирования дрожжей. Температура ферментации – наиболее важный физический параметр, зависящий от применяемой культуры дрожжей и степени ее адаптации к температуре. Аспорогенные дрожжи, относящиеся к роду Candida, способны развиваться при 30–45 0С. При более низкой температуре процессы обмена веществ замедляются, падает активность клеток, а следовательно, скорость размножения микроорганизмов. При повышении температуры скорость процесса биосинтеза растет, но до определенного предела, который наступает при 39–40 0С. Далее будет происходить инактивация белковых ферментов, что приведет к падению выхода биомассы, отмиранию дрожжевых клеток. По физиологическим признакам оптимальная температура культивирования дрожжей 32–34 0С. С технологической точки зрения температурный режим ферментации должен поддерживаться вблизи верхнего предела, но не превышать его. Наиболее высокая скорость роста и продуктивность производственных штаммов дрожжей достигается при 36–38 0С. Активная кислотность среды. Аспорогенные дрожжи способны развиваться в слабокислой среде рН 3-6, но оптимальное значение параметра 4,6–4,8. При рН меньше 3,0–3,4 падает интенсивность дыхания дрожжевых клеток, скорость их размножения, клетки отмирают и вымываются из аппаратов. При высоких рН наблюдается повышенное пенообразование субстрата и возможность инфицирования среды бактериальной микрофлорой. 178 В промышленности обычно ферментацию ведут при рН 4,2– 4,4, то есть на производстве культивирование проводится не в оптимальных условиях по кислотности, это приводит к некоторому снижению выхода дрожжей. Состав и концентрация питательных веществ. Основными органическими питательными компонентами субстратов являются моносахариды. Дрожжи Candida в условиях аэробной ферментации ассимилируют как пентозные, так и гексозные моносахариды гидролизата, причем скорость усвоения гексоз выше. Вместе с тем дрожжи способны ассимилировать органические кислоты (уксусную, яблочную, янтарную, лимонную); спирты (этанол), сорбит и др. соединения. На производстве в качестве источников углеродного питания дрожжи рода Candida усваивают моносахариды на 95–99 %, неуглеводные компоненты на 50–75 %. Оптимальная концентрация РВ в сусле 1,2–1,6 %. Дрожжи утилизируют углеродсодержащие компоненты гидролизатов, сульфитного щелока последовательно: глюкоза, уксусная кислота, манноза, ксилоза, галактоза, арабиноза. Из неорганических веществ для биосинтеза компонентов дрожжевых клеток требуются соединения фосфора, азота, калия, магния, железа, кальция и др. макро- и микроэлементов. Ингибиторы процесса. К ингибиторам биохимического процесса относятся биологические яды, отрицательно влияющие на жизнедеятельность микроорганизмов при малых концентрациях (менее 0,01 %). Наиболее токсичными компонентами гидролизатов являются фурановые соединения, терпены, фенолы и танниды. Затрудняют процесс жизнедеятельности дрожжей некоторые кислоты (муравьиная, левулиновая и др.), а также высокомолекулярные соединения лигногуминового типа. На производстве в составе питательной среды систематически контролируют содержание фурфурола – наиболее токсичного компонента гидролизата, который подавляет процесс дыхания клеток, влияя тем самым на энергетический обмен дрожжей. Допустимая концентрация фурфурола – 0,03 %. Отрицательное влияние на культивирование дрожжей оказывает такой продукт метаболизма, как СО2. Его ингибирующее действие проявляется при концентрации не более 0,02 %. При повышении концентрации СО2 в газовой фазе на 1 % выход дрожжей от РВ снижается в среднем на 0,75 %. Следовательно, конструкция ферментеров должна обеспечивать интенсивный отвод СО2 из культуральной жидкости. 179 Активными ингибиторами являются также вторичные метаболиты: антибиотики, токсины, алкалоиды, некоторые ферменты. Стимуляторы. По типу действия различают стимуляторы и дополнительные источники питания дрожжей. Стимуляторы активируют ферментационные процессы при малых концентрациях (0,01– 0,1%), ими могут быть ферменты, аминокислоты, витамины и другии соединения. Как промышленный процесс, микробиологическое производство белка не требует посевных площадей, не зависит от климатических и погодных условий, поддается точному планированию и высокому уровню автоматизации, позволяет получать продукцию стандартного качества. Продукты микробного синтеза можно назвать новыми видами кормов и пищи, но неверно считать их синтетическими или искусственными. Разнообразность микроорганизмов и типов их питания позволяет микробиологической промышленности маневрировать в использовании различных видов сырья для биосинтеза. Технологический процесс получения дрожжевого белка складывается из следующих операций: приготовление питательной среды, выращивание дрожжей, сгущение, упаривание и высушивание биомассы. Процесс аэробного глубинного культивирования микроорганизмов осуществляется в ферментаторах непрерывного действия. Культура подвергается перемешиванию, аэрированию и охлаждению. Скорость выделения тепла в процессе роста аэробных микроорганизмов прямо пропорциональна скорости потребления ими молекулярного кислорода. На каждый грамм потребленного микроорганизмами кислорода выделяется 142,5кДж (3,4 ккал). Количество потребляемого кислорода достигает 80 % от получаемого сухого вещества дрожжей. Так как дрожжи усваивают только мелкодиспергированный, растворенный в жидкой среде кислород, количество его должно быть достаточным для нормального размножения и роста дрожжей. В промышленности расход воздуха составляет от 20 до 40 м3 на 1 кг абсолютно сухих дрожжей. Для диспергирования воздуха в питательной среде, повышения скорости его растворения и увеличения времени соприкосновения пузырьков с жидкостью, содержащей дрожжи, применяют различные воздухораспределительные системы: барботажную, с механическими средствами распыления или турбоаэрационную, эрлифтную и вибрационную. Воздух, подаваемый в аппарат, должен быть чистым и не зараженным посторонними микроорганизмами. Освобождение от меха- 180 нических примесей осуществляется с помощью специальных фильтров. При выращивании дрожжей образуется пена, которую можно гасить различными методами: химическими, механическими и гидравлическими. Химические пеногасители (олеиновая кислота, рыбий жир) повышают поверхностное натяжение жидкости на границе жидкость-воздух и быстро гасят пену. Механические пеногасители – различные устройства, приводимые во вращение от электродвигателя. Гидравлический метод основан на разбивании пены сильными струями жидкости, падающими сверху вниз. Выращенные клетки дрожжей отделяют от водной среды сепарированием. Дрожжевая суспензия через промежуточные сборники проходит последовательно через первую и вторую ступень сепарации с соответствующим повышением концентрации 7,5–10 и 12,5–15 % по сухим веществам (или 300–400 и 500–600 г/л по прессованным дрожжам). Сгущение дрожжевой суспензии в центробежном поле основано на разделении твердой фазы – дрожжевых клеток с плотностью около 1,1 г/см3 – и жидкой фазы с плотностью 1,01 г/см3. Потери дрожжей на стадии сепарации состовляют 5–7%. Отсепарированные дрожжи подвергают термической обработке при 80–90 0С, приводящей к отмиранию клеток. Полученную в результате такой обработки сметанообразную массу высушивают до остаточной влажности 6-10 %, используя распылительные или барабанные сушилки. Температура в зоне сушки распылительных сушилок 90–95 0С, барабанных – 150–1600С. После высушивания получают порошкообразный или хлопьевидный продукт, который можно подвергнуть гранулированию. Продукт упаковывают и направляют на комбикормовые заводы и другим потребителям. По показателям качества кормовые дрожжи делятся на 4 группы: высшая (содержание истинного белка 44 %), первая (41%), вторая (36 %) и третья (32 %). До 1987 г. кормовых дрожжах регламентировалось содержание сырого протеина (56%, 51, 46 и 43 % соответственно) от абсолютно сухого вещества. Товарные дрожжи кроме белка содержат углеводные компоненты (до 30 %), липиды 3–5 %, неорганические вещества до 10 %, также нуклеиновые кислоты, лигногуминовые вещества и др. Технология получения микробного белка является в настоящее время самой крупнотоннажной отраслью биотехнологии, производящей важнейшие кормовые препараты и белковые добавки для животноводства, звероводства, птицеводства, рыбоводства, а также белок 181 пищевого назначения с использованием разнообразного сырья и субстратов. 12.2 Получение дрожжей на основе углеводородного сырья Возможность утилизировать компоненты нефти наиболее часто проявляется среди микроорганизмов, развивающихся в природе в местах, содержащих улеводороды. В связи с этим илы сточных вод нефтеперерабатывающих предприятий и различные почвы, в которые попадают нефтепродукты, могут быть использованы для изолирования штаммов, активно растущих на средах с углеводородами. В качестве углеводородного сырья используют эмульсию нпарафинов, природный газ, дизельное топливо. Наиболее перспективными видами сырья являются окисленные углеводороды, в первую очередь метиловый и этиловый спирты. Способность к утилизации углеводородов встречается у представителей мицелиальных грибов (Aspergillus и Fuzarium), у многих видов грибов семейства Mucoroceae и разных бактерий (Pseudomonas methanica). Лучшими видами дрожжеподобных грибов рода Candida являются C.tropicalis, C.lipolytica, C.intermedia, C.guillermondii. Наряду с монокультурами целесообразно использовать смесь культур углеводородокисляющих микроорганизмов. Из микроорганизмов, усваивающих жидкие углеводороды, для биосинтеза белка наиболее целесообразно использовать дрожжеподобные грибы рода Candida, усваивающие преимущественно парафины С10–С30. Они активно окисляют углеводороды, синтезируя повышенное количество белка и витамины. Наиболее интенсивно процесс роста происходит на среде, содержащей н-алканы с различной длиной цепи. Дрожжами с наибольшей скоростью обычно потребляются налканы С11–С14, среднее положение занимают алканы С15–С18 и медленнее других усваиваются н-алканы С23–С24. Алканы С6–С9 не только плохо усваиваются дрожжами, но часто токсичны для них. Микроорганизмы могут окислять и углеводороды с длинными прямоцепочечными радикалами, но не до конца. Процесс окисления останавливается на промежуточной стадии, и образовавшиеся продукты далее в процессе роста не используются. Углеводороды проникают в дрожжевые клетки через клеточные стенки по порам, а также за счет растворения в липидах клеток. Окисление углеводородов идет в три этапа: 182 а) первичное окисление алкана с последовательным образованием спирта, альдегида и монокарбоновых кислот жирного ряда. Окисление идет за счет фермента оксидазы, катализирующей присоединение атома кислорода к концевой метильной группе алкана. Получающийся спирт с помощью алкогольдегидрогеназы или оксидазы окисляется до альдегида, который за счет альдегиддегидрогеназы окисляется в кислоту; б) окисление кислот по механизму β-окисления с отщеплением двух атомов углерода с образованием в качестве основного промежуточного продукта ацетил-КоА. Состав жирных кислот не повторяет состава н-алканов, которые были взяты в качестве субстратов. Он смещен в сторону С16, С17 и С18 за счет С2 – удлиннения или укорочения жирных кислот, получающихся в результате окисления алканов, что приводит к появлению в дрожжах кислот (до 50 %), имеющих нечетное количество углеродных атомов. Это не типично для биологических объектов; в) далее ацетат окисляется в цикле трикарбоновых кислот. Микроорганизмы способны окислять и полициклические ароматические углеводороды, в том числе сильный канцероген – 3,3бензапирен. Образующиеся соединения в результате окисления неканцерогенны или значительно менее канцерогенны, чем исходные углеводороды. Лучше использовать сырье, не содержащее ароматических соединений, так как они накапливаются в липопротеиновых структурах и полностью не перерабатываются. Дрожжи, вырабатываемые на основе углеводородов, представляют собой сухую биомассу микроорганизмов. Они содержат 48– 59 % белка, 5–9 % нуклеиновых кислот, 15–18 %, 0,5% клетчатки, 2– 5 % жира, 8–12 % минеральных веществ. Белок дрожжей является полноценным, так как содержит комплекс незаменимых аминокислот. По питательной ценности белковые дрожжи приближаются к кормам животных и усваиваются организмом животных на 90 %. В состав минеральных веществ входит 2–2,5 % фосфора, 1–3 % калия, 0,5– 1,5 % кальция, 0,04–0,4 % натрия. Особую ценность придает повышенное содержание витаминов группы В (1 %) и эргостерина (0,2–0,5 %). Поэтому дрожжи, полученные на углеводородных средах, носят название белкововитаминных концентратов (БВК). Оценка пригодности конкретной микробной биомассы дается на основании химических, санитарногигиенических, ветеринарно-зоотехнических и медикобиологических исследований. 183 ГЛАВА 13 КУЛЬТИВИРОВАНИЕ КЛЕТОК, ОРГАНОВ И ТКАНЕЙ РАСТЕНИЙ В настоящее время достаточно широко разрабатываются методы, обещающие значительный прогресс в решении вопросов рационального использования природных ресурсов. Один из них – культура клеток и тканей in vitro. Метод культуры высших растений лежит в основе изучения биологии клетки, существующей вне организма. Культивируемые клетки высших растений способны синтезировать традиционно используемые продукты растительного происхождения, создавать принципиально новые вещества, биотрансформировать предшественники в ценный продукт. Роль культуры изолированных клеток и тканей в биотехнологии можно рассматривать в трех направлениях. Первое направление связано со способностью изолированных растительных клеток продуцировать ценные для медицины, парфюмерии, косметики и других отраслей промышленности вещества вторичного синтеза: алкалоиды, стероиды, гликозиды, гормоны, эфирные масла и др. Как правило, вторичные вещества получают из каллусной ткани, выращенной на твердой (агаризованной) или жидкой (суспензионная культура) питательной среде. Продуктивность культивируемых клеток в результате клеточной селекции может значительно превышать продуктивность целых растений. Преимуществом такого способа получения веществ вторичного синтеза является также возможность использовать для этой цели растения, не произрастающие в наших природных условиях, и получать продукцию в течение всего года. Второе направление – это использование культуры изолированных тканей для размножения и оздоровления посадочного материала. Этот метод, названный клональным микроразмножением растений, позволяет получать от одной меристемы сотни тысяч растений в год. Третье направление – использование изолированных клеток в селекции растений, дающее возможность получать быстрорастущие растения, устойчивые к различным неблагоприятным факторам среды: засуха, засоление, низкие и высокие температуры, фитопатогены, тяжелые металлы и другие. Вместе с тем это направление предусматривает создание новых растений путем слияния изолированных протопластов и получения неполовых (соматических) гибридов. 184 Таким образом, культура клеток и тканей растений является не только одним из альтернативных источников практически значимых БАВ, но и нетрадиционным методом охраны растений. Термин «культура клеток, органов, тканей» применяется к асептически выращиваемым частям растений: каллусным тканям на агаризованной среде; суспензионной культуре клеток, культуре протопластов; изолированным зародышам и органам (кончиков корней, меристемам побегов). Методы культивирования изолированных фрагментов растений основаны на исследовании важного свойства растительной клетки – тотипотентности. Тотипотентность (лат. totus – весь, potentia – сила) – это свойство клетки реализовать генетическую информацию, обеспечивающую ее дифференцировку и развитие до целого организма. Тотипотентность у растений реализуется при заживлении ран; на раневой поверхности растений в результате неорганизованной пролиферации клеток происходит развитие каллуса. Каллус способствует заживлению раневого повреждения. 13.1 Культура каллусных тканей Для производства биологически активных веществ используют каллусную ткань, которую получают твердофазной ферментацией и глубинным суспензионным культивированием. Каллусная культура – это неорганизованная пролиферирующая ткань, состоящая из дедифференцированных клеток. В дальнейшем они специализируются как каллусные, т.е. становятся, таким образом, дифференцированными. Дифференцировка – возникновение различий между однородными клетками и тканями, изменение в ходе развития, приводящее к образованию специализированных клеток, органов, тканей. Дифференцировка клеток растений in vitro может происходить различными путями и с различной степенью – от дифференцировки отдельных клеток до развития целого растения. Наиболее простой вид дифференцировки – появление в каллусной ткани дифференцированных клеток, имеющих специфичное морфологическое строение и несущих особые функции. Гистологическая дифференцировка каллусных клеток (гистогенез) – образование в каллусе различных тканей. 185 Органогенез (монополярные структуры) – это дифференциация каллусных клеток в целые органы: превращение их в апексы стеблей или корней. Соматический эмбриогенез (биполярные структуры) – образование в каллусной или суспензионной культуре эмбриоидов, т.е. зачатков интактного растения, способных развиваться во взрослое растение. Дифференциация тотипотентных клеток популяции in vitro зависит от следующих факторов: вида растения и генотипа растения-донора; органа растения и характеристик клеток экспланта этого органа; условий культивирования: различных питательных сред, экзогенных гормональных факторов, стимуляторов; физических факторов культивирования: фотопериода, качества и интенсивности освещения, температурного режима, рН, аэрации. Каллус может образовываться как на изолированных кусочках ткани (эксплантах), так и на растении при поражении. Каллусную ткань можно получить практически из любой живой ткани растения. Она в основном бывает белого или желтоватого, реже светлозеленого цвета. Темно-коричневая окраска возникает чаще при старении каллусных клеток. Каллусная ткань в зависимости от происхождения и условий выращивания может быть разной консистенции – рыхлой, средней плотности, плотной. Основным условием превращения растений клетки в каллусную является присутствие в питательной среде фитогормонов. Ауксины вызывают процесс дедифференцировки клетки, приготавливающие ее к делению, а цитокинины – пролиферацию (деление) дедифференцированных клеток. Если в питательную среду без гормонов поместить кусочек стебля, листа, корня или другой эксплант, состоящий из специализированных (дифференцированных) клеток, то деление клеток не произойдет, и каллусная ткань не образуется. Это связано с неспособностью дифференцированных клеток к делению. Каждая клетка имеет 3 фазы роста: первая – деление, вторая – растяжение, третья – дифференцировка. Для того чтобы не произошло старения, утраты способности к делению и отмирания каллусных клеток, первичный каллус, возникающий на эксплантах, через 4– 6 недель переносят на свежую питательную среду. Эту операцию на- 186 зывают пассированием. При регулярном пассировании способность к делению может поддерживаться в течение десятков лет. Характерной чертой заключительной фазы роста является утолщение вторичной клеточной оболочки и потеря клеткой способности к делению. Для того чтобы дифференцированные клетки вновь обрели способность к делению, необходимо, чтобы произошла их дедифференцировка, т.е. клетки должны быть в меристематическом состоянии. Размножение дифференцированных клеток приводит к анархическому, неорганизованному росту, в результате чего образуется каллусная ткань. Таким образом, превращение специализированной ткани в каллусную связано с индукцией клеточного деления, способность к которому она потеряла в процессе дифференцировки. Процесс перехода к каллусному росту в базальной части апекса начинается с остановки клеточных делений. Лагфаза продолжается 24–48 ч, в течение которых клетки увеличиваются в размерах, ткань разрыхляется. После лагфазы клетки начинают быстро делиться, образуя каллусную ткань. Таким образом, если дедифференцировка специализированной клетки связана с индукцией деления под влиянием фитогормонов, то дедифференцировка делящейся меристематической клетки связана с остановкой деления, деспециализацией клетки и только после этого – с индукцией деления, приводящей к каллусообразованию. Переход клетки in vitro из дифференцированного состояния к дедифференцировке и активным клеточным делениям обусловлен изменением активности генов. Активирование одних генов и репрессирование других приводит к изменению в белковом составе клеток. В каллусных клетках появляются специфические белки и одновременно исчезают белки, характерные для фотосинтезирующих клеток листа. Каллусная клетка имеет свой цикл развития и повторяет развитие любой клетки, включая деление, растяжение и дифференцировку, после чего наступает старение и отмирание клетки. Кривая роста каллусных клеток имеет S-образную форму. Такой характер роста легко обнаружить у суспензионных культур каллусных клеток. 187 Рост клеточной популяции при культивировании в накопительном режиме: 1 – латентная фаза; 2 – экспоненциальная фаза; 3 – линейная фаза роста; 4 – фаза замедления роста; 5 – стационарная фаза. Различают следующие фазы ростового цикла: Латентная фаза (лагфаза). В этот период клетки не размножаются, отсутствует их видимый рост, но происходит активный процесс поглощения воды и питательных веществ. Экспоненциальная (логарифмическая) фаза роста. Это ограниченный период в ростовом цикле периодической (накопительной) культуры, в ходе которого происходит экспоненциальное (логарифмическое) увеличение количества клеток за счет их интенсивного деления, и как следствие – увеличение сухого вещества. Линейная фаза по продолжительности является очень короткой. Удельная скорость роста культуры в этой фазе практически постоянная. Фаза замедления роста (ранняя стационарная фаза). В этот период средний размер клеток продолжает возрастать, отмечаются гетерогенность клеточной популяции и начало синтеза вторичных веществ. Стационарная фаза. К этому периоду ростового цикла суспензионная культура достигает максимума сухого веса. В культуральной среде накапливаются продукты жизнедеятельности клеток, угнетающие рост культуры. Культуральная среда истощается по наличию основных компонентов, обеспечивающих азотное, фосфорное, углеводное питание. Чтобы не наступила гибель клеток, необходимо субкультивирование суспензионной культуры на свежую среду. 188 В среднем от начала культивирования до стационарной фазы роста проходит 21–28 дней. Продолжительность ростового цикла зависит от условий культивирования, исходной плотности, возраста ипокулюма, состава и объема питательной среды, видоспецифичности исходной культуры. Каллусные клетки in vitro сохраняют многие физиологобиохимические свойства нормальных клеток и способность к синтезу вторичных метаболитов. Клеточный цикл у каллусных клеток более длителен, чем у растений, произрастающих в открытом грунте. Особенностью каллусных клеток является гетерогенность по возрасту: одновременно присутствуют в каллусной ткани клетки молодые и старые. Значительные отличия наблюдаются в энергетическом обмене каллусных клеток. Они потребляют меньше кислорода по сравнению с нормальными. Это свидетельствует о сдвиге соотношения между дыханием и брожением в сторону усиления брожения, т.е. снижении эффекта Пастера. 13.2 Стерилизация Необходимым условием работы с культурой изолированных тканей является соблюдение строгой стерильности. Экспланты, которые помещают на питательную среду, легко поражаются микроорганизмами, поэтому необходимо стерилизовать как эксплант, так и питательную среду. Все манипуляции с изолированными тканями (введение в культуру, пересадка на свежую питательную среду) проводят в асептическом помещении (ламинар-боксе) стерильными инструментами. Стерильность надо соблюдать и во время культивирования изолированных тканей. Чистую посуду, предварительно завернутую в бумагу или в фольгу, инструменты, бумагу, вату стерилизуют сухим жаром в сушильном шкафу при температуре 1600С в течение 1,5–2 ч. Питательные среды стерилизуют в автоклаве при температуре 120°С и давлении 0,75–1 атм в течение 20 мин. Если в состав питательных сред входят вещества, разрушающиеся при автоклавировании, их следует стерилизовать путем фильтрации через бактериальный фильтр. Затем стерильные профильтрованные компоненты добавляют в проавтоклавированную среду, охлажденную до температуры 400С. 189 Растительные ткани сами по себе могут служить серьезным источником заражения, так как на их поверхности всегда находится эпифитная микрофлора. Поэтому необходимо проводить поверхностную стерилизацию. Предварительно часть растения, из которой будет извлечен эксплант, промывают водой с мылом и споласкивают чистой водой. Затем растительный материал стерилизуют в растворах дезинфицирующих веществ. После выдерживания эксплантов в дезинфицирующем растворе несколько раз промывают в дистиллированной воде и скальпелем удаляют наружные слои клеток на срезах эксплантов, так как он может быть поврежден при стерилизации. Микроорганизмы могут находиться и внутри растительной ткани. Для предотвращения инфицирования внутри тканей кроме поверхностной стерилизации иногда приходится применять антибиотики. Однако подобная обработка не всегда приводит к стерилизации внутренних тканей, так как трудно выбрать направленно действующий антибиотик. 13.3 Питательные среды Изолированные клетки и ткани культивируют на многокомпонентных питательных средах. Они могут существенно различаться по своему составу, однако, в состав всех сред обязательно входят необходимые растениям макро- и микроэлементы, углеводы, витамины, фитогормоны и их синтетические аналоги. Углеводы (сахароза или глюкоза) входят в состав любой питательной среды. Они необходимы в качестве питательного компонента, так как большинство каллусных тканей лишено хлорофилла и не способно к автотрофному питанию. Поэтому их выращивают в условиях рассеянного освещения или в темноте. В качестве дополнительного источника азота в состав сред добавляют аминокислоты или гидролизат казеина – источник аминокислот. В состав сред включают водорастворимые витамины: тиамин, рибофлавин, биотин, пантотеновую кислоту, пиридоксин. аскорбиновую кислоту. Обязательными компонентами питательных сред должны быть фитогормоны. К ним относятся ауксины, вызывающие дифференцировку клеток экспланта и цитокинины, индуцирующие клеточные деления. При изменении соотношения между этими фитогормонами 190 или при добавлении других фитогормонов могут быть вызваны разные типы морфогенеза. Природный ауксин в растениях представлен в основном в виде индолил-3-уксусной кислоты (гетероауксин) – ИУК. Наиболее выраженный эффект ауксина проявляется в стимуляции роста. Ауксин играет важную роль в процессах регенерации при размножении каллусных клеток: в процессе образования придаточных и боковых корней, луковиц, при заложении вегетативных почек. Для практических целей в сельском хозяйстве часто применяют не ИУК, а синтетические ауксины, так как они в растениях не разрушаются ИУК-оксидазой. Это индолил-3-масляная кислота (ИМК); αнафтил-1-уксусная кислота (НУК): 2,4 дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д); фенилуксусная кислота (ФУК); фенилмасляная кислота (ФМК). ИУК необходима для индуцирования каллусогенеза. В качестве источников цитокининов в искусственных питательных средах используют кинетин, 6-бензиламинопурин, зеатин, которые представляют собой N-замещенные производные аденина. Действие цитокининов проявляется прежде всего в ускорении клеточных делений, что опосредуется усилением синтеза ДНК и РНК и белков. Благодаря этому замедляется старение клеток и повышается их устойчивость к неблагоприятным факторам среды. Цитокинины в состав сред включают для стимуляции клеточного деления в каллусных и суспензионных культурах, и культурах протопластов, при регенерации проростков из соматических эмбриоидов или стеблевых почек. При культивировании протопластов в составе культурных сред используют и абсцизовую кислоту. Абсцизовая кислота оказывает противодействие ауксинам, гиббереллинам и цитокининам. Гиббереллины стимулируют рост в фазе растяжения и деления клеток, вызывают рост плодов. Важным свойством гиббереллинов является способность вызывать вытягивание стебля у розеточных растений или у растений с укороченным стеблем, т.е. устранять физиологическую и генетическую карликовость. Гиббереллины относят к условно половым гормонам: например, у тыквенных они способствуют образованию мужских цветков. Для гиббереллинов доказано их непосредственное действие на биосинтез ферментов, например, α-амилазы и других гидролаз и про- 191 растающих семенах злаков: эти ферменты расщепляют крахмал до простых сахаров, которые усваиваются развивающимся зародышем. Гиббереллины – это дитерпеноиды с тетрациклическим гиббереллановым скелетом из 19–20 С-атомов. Для практических целей наиболее часто используют гибберелловую кислоту, которая производится в промышленности. В настоящее время известно большое число различных по составу питательных сред. Минеральная среда Мурассиге и Скуга является самой универсальной. Она пригодна для образования и роста каллусов, индукции морфогенеза у большинства двудольных растений. Так, изменение соотношения ауксина и кинетина приводит к образованию либо корней (преобладание ауксина), либо стеблевых культур (преобладание кинетина). Среда Ганборга и Эвелега более подходяща для культивирования клеток и тканей бобовых растений и злаков. Среда Уайта обеспечивает укоренение побегов и нормальный рост стебля после регенерации, а среда Нича и Нич пригодна для индукции андрогенеза в культуре пыльников. В состав некоторых сред входит ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) или ее натриевая соль, которые улучшают доступность железа для клеток. 13.4 Влияние физических факторов на рост и развитие растительных тканей На рост и развитие растительных тканей in vitro большое влияние оказывают физические факторы: свет, температура, аэрация, влажность. Свет. Большинство каллусных тканей могут расти в условиях сильного освещения или в темноте, так как они не способны фотосинтезировать. Вместе с тем свет может выступать как фактор, обеспечивающий морфогенез и активирующий процесс вторичного синтеза. В качестве источника света используют люминесцентные лампы. Для большинства растений оптимум освещенности составляет примерно 1000 люкс. Температура. Для большинства каллусных культур оптимальной является температура 260С. В отличие от роста культур клеток и тканей индукция их морфогенеза требует более низких температур (18–200С). Аэрация. Для выращивания суспензионных культур большое значение имеет аэрация. Особенно важно снабжение воздухом культивируемых клеток в больших объемах ферментеров. 192 При выращивании клеток в малых объемах (в колбах) нормальная аэрация достигается при постоянном перемешивании суспензии. Влажность. Оптимальная влажность в помещении, где растут культуры, должны составлять 60–70%. 13.5 Способы культивирования изолированных клеток и тканей для получения БАВ В качестве источника БАВ используют каллусную ткань, которую получают твердофазным способом культивирования и глубинным суспензионным культивированием, осуществленным в периодическом и непрерывном (проточном) режимах. Твердофазный способ культивирования. Каллусные клетки получают из фрагментов тканей разных органов высших растений, помещая кусочки такой ткани в питательную среду (пробирки, колбы, чашки Петри), соблюдая строгую стерильность. Через 4–6 недели культивирования экспланта возникает первичный каллус, который необходимо перенести па свежую питательную среду. При культивировании на агаризованных средах кусочек каллуса должен иметь массу 60–100 мг на 30–40 мл свежей среды. Каллусная ткань, вырастая на поверхности твердой питательной среды, имеет аморфную структуру, представляющую собой массу тонкостенных паренхимных клеток. Химический состав каллусной ткани обычно незначительно отличается от соответствующего органа растения. Каллусные клетки после ряда делений переходят на обычный для данного растения цикл развития, т.е. начинается дифференциация. Этот процесс регулируют гормоны. Глубинное суспензионное культивирование. Для глубинного культивирования и получения суспензионных культур более пригодна каллусная ткань рыхлого типа, которая легко фрагментируется на отдельные клетки и небольшие агрегаты при перенесении ее в жидкую среду. Перед пересевом первичную культуру фильтруют через два слоя марли или через сита (нейлоновые, металлические), чтобы отделить крупные агрегаты каллусной ткани и остатки трансплантата. На образование клеточных агрегатов также оказывает влияние интенсивность перемешивания среды, так как клетки чрезвычайно чувствительны и быстро лизируются. 193 Суспензионные культуры, как правило, состоят из отдельных клеток, варьирующих по форме и размеру, и неоднородных многоклеточных агрегатов. Соотношение отдельных клеток и таких агрегатов в суспензии зависит от видовой принадлежности растения и условий культивирования. Глубинное культивирование можно осуществлять в колбах на качалках при частоте вращения 100–120 об/мин. На 60–100 мл среды используют 2–3 г свежей каллусной ткани, чтобы начальная плотность клеточной популяции составила 0,5-10–2,5-10 клеток/мл среды. Сосуды с суспензией устанавливают на качалки ротационного типа. В этих условиях обеспечивается аэрация и, кроме того, нарастающая масса клеточных агрегатов распадается на отдельные фрагменты. Необходимо отметить, что растительные клетки растут и размножаются значительно медленнее, чем клетки микроорганизмов. Время их удвоения 1–3 суток. Процесс культивирования растительных клеток занимает 2–3 недели, что повышает требования к обеспечению асептических условий. Непрерывное культивирование. Другой метод выращивания клеточных культур – непрерывное культивирование – основан на поддержании баланса между разбавлением питательной среды и удалением части суспензии. Установлено, что если при периодическом культивировании клеточных суспензий в экспоненциальной фазе роста в культуральную систему добавлять свежую среду, то деление клеток может поддерживаться неограниченно долго. Это послужило основой создания систем, позволяющих осуществлять, непрерывное культивирование. Культуральные системы, функционирующие непрерывно, разделяют на полупроточные и проточные. При полупроточном режиме выращивания через определенные интервалы времени производится отбор части суспензии и разбавление оставшейся суспензии свежей средой. Через суспензию пропускают стерильный воздух. Культуру перемешивают с помощью магнитной мешалки. Культивирование может продолжаться в течение нескольких месяцев. Проточный режим культивирования позволяет осуществлять непрерывное снабжение культуральной системы свежей средой с удалением равного объема клеточной суспензии. В таком режиме автоматизированные ферментеры (культуральные сосуды) могут функционировать в течение нескольких лет. Ферментеры, используемые для производства больших клеточных биомасс, могут достигать объ- 194 ема до 1500 л. Для осуществления многостадийных процессов при промышленном культивировании клеток-продуцентов веществ вторичного обмена используют конструкции, состоящие из системы нескольких ферментеров. 13.6 Растения и их культура изолированных клеток и тканей как промышленные источники БАВ Растения являются продуцентами многих биологически активных соединений, способных оказывать влияние на биологические процессы в организме. К таким соединениям принадлежат сердечные гликозиды, сапонины, стерины, каротиноиды, полифенолы, алкалоиды, витамины, хиноны, а также вещества, обладающие специфическим ароматом, вкусом и окраской. Биологически активные вещества принадлежат к продуктам вторичного обмена, которые называют вторичными метаболитами или вторичными продуктами биосинтеза. В настоящее время известно более 100000 вторичных метаболитов, продуцируемых растениями. Многие из них являются экономически важными продуктами и используются в фармакологической, косметической, пищевой промышленности. Культуры клеток и тканей, полученные in vitro, как и клетки интактного растения, могут синтезировать вторичные метаболиты, которые могут иметь большое практическое значение. Причем по качественному составу и количественному составу они могут быть схожи. В основе промышленного производства биологически активных веществ (лекарственных субстанций и других) из культуры клеток растений лежит ряд последовательных стадий и операций: получение высокопродуктивных продуцентов, разработка оптимальных условий культивирования продуцента БАВ с максимальным биосинтезом целевого продукта, разработка и внедрение в практику соответствующих методов и условий выделения и очистки БАВ, создание готовых препаратов и контроль качества. Работа на каждом из этих этапов должны проводится соответствующими специалистами: биотехнологами, генетиками, химиками-технологами. 13.7 Перспективы развития клеточной инженерии Культивируемые клетки и ткани могут служить адекватной моделью при изучении метаболизма и его регуляции в клетках и тканях 195 целого растения. На основе культивируемых клеток и тканей растений созданы технологии для промышленности и сельского хозяйства. Углубление знаний биологии культивируемых растительных клеток обязательно для дальнейшего прогресса в разработках принципиально новых, перспективных для практики технологий. Возникший немногим более 50 лет назад метод культуры клеток и тканей растений продолжает развиваться очень интенсивно. Совершенствуются и возникают новые методические приемы, углубляются знания биологии самих объектов и понимание механизмов их поведения, множатся технологии, созданные для практического применения. Однако новые технологии, применяемые к высшим растениям и животным, пока не столь используемы, как хотелось бы. Попытки применения приемов генетической инженерии к высшим растениям и животным сталкиваются с огромными трудностями, обусловленными как несовершенством знаний, так и сложностью организации организмов. Использование научных достижений тесно связано с фундаментальными исследованиями и реализуется на самом высоком уровне современной науки. Фундаментальные исследования жизненных явлений на клеточном уровне привели к появлению принципиально новых технологий и получению новых продуктов. Важнейшими задачами, стоящими перед клеточной инженерией, являются повышение продуктивности сельскохозяйственных растительных культур, создание новых видов в сельском и лесном хозяйстве, получение практически значимых вторичных метаболитов. Постановка новых биотехнологических процессов связана с большими капиталовложениями и высоким риском. Внедрение новейших методов особенно перспективно, когда целевой продукт не может быть получен иными способами или масштабы его производства малы, а цены очень высоки. Особенно это касается фармакологических препаратов и диагностических средств. Дальнейшее развитие биологических технологий во многом связано с прогрессом в области технических наук. Повышение эффективности биотехнологических процессов невозможно без автоматизации и совершенствования аппаратурного и технологического оформления процессов. Это позволит повысить эффективность традиционных биотехнологических процессов и расширит сферы применения получаемых продуктов. 196 Решение проблемы обеспечения населения пищевыми продуктами связано с получением высокопродуктивных и устойчивых к болезням и вредителям культурных растений. Трансгенные растения, устойчивые к гербицидам, насекомым, вирусам быстро вытесняют старые сорта сельскохозяйственных культур. Перенос в изолированные протопласты чужеродных генов методами генной инженерии является перспективным методом получения трансгенных растений. Преимуществами данного метода является возможность получения продукта независимо от внешних климатических, почвенных условий, круглогодично, сохраняя при этом естественные ареалы ценных лекарственных растений. Особую значимость этот вопрос приобретает в связи с возрастающей остротой экологических проблем. Только в медицине 30 % применяемых лекарств содержат соединения растительного происхождения. Если учесть потребности пищевой промышленности, парфюмерии, сельского хозяйства, то становится очевидной необходимость замены плантационного, а тем более дикорастущего сырья на гарантированно получаемую промышленным способом биомассу культивируемых клеток, содержащую необходимые соединения в достаточном количестве. 197 ГЛАВА 14 БИОТЕХНОЛОГИЯ УТИЛИЗАЦИИ ОТХОДОВ СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА И ОБОГАЩЕНИЕ КОРМОВ Существует широкий круг микроорганизмов, способных потреблять вторичные продукты сельского хозяйства и перерабатывающей промышленности с образованием микробной биомассы. Самыми перспективными являются быстрорастущие микроорганизмы, способные усваивать негидролизованные сельскохозяйственные отходы. В наибольшей степени этим требованиям соответствуют мицелиальные грибы и дрожжи. Жидкие и плотные отходы могут быть трансформированы в кормовые препараты, обогащенные микробным белком. Известно, что концентрированные стоки являются, по существу, готовой питательной средой для этих микроорганизмов, так как содержат все необходимые компоненты, включая витамины и микроэлементы. Снижение количества загрязнений при внедрении новых технологических приемов и процессов должно достигаться за счет использования отработанных продуктов, автоматизированного управления процессами, использования быстрорастущих суперактивных штаммов микроорганизмов, адаптированных к деградации определенных субстратов или полученных методом генной инженерии новых микроорганизмов или их сообществ. В любом случае по теории стабильного развития органические отходы должны рассматриваться как источник питательных веществ, как носитель энергии. Существующие отходы должны утилизироваться, когда это технически возможно и когда стоимость этого является разумной. Главное достоинство перспективных биотехнологий переработки отходов – экономичность и экологичность. Старые технологии утилизации отходов стали убыточными. Возросла стоимость энергоносителей, а для хранения навоза или помета приходится выводить из оборота тысячи гектаров сельскохозяйственных угодий. Кроме того, размещение вблизи больших городов крупных животноводческих комплексов и птицефабрик приводит к загрязнению водных бассейнов и в целом окружающей среды. Использование навоза в качестве только удобрения (традиционный способ) уже не может считаться универсальным и эффективным. Необходимы современные энергосберегающие эффективные технологии. 198 Технологии переработки помета, навоза путем обезвоживания и дальнейшей стерилизации весьма энергоемки. Термическая обработка жидкой или твердой фракции высокими температурами приводит не только к потерям элементов питания для растений, но и образованию канцерогенов. К тому же основными требованиями к технологиям переработки отходов животноводства и получения из них органических удобрений являются сохранение их биологической активности и максимальное содержание соединений азота, фосфора и других элементов. Одним из возможных способов утилизации отходов животноводства является биологическая переработка с использованием микро- и макроорганизмов, позволяющая быстро и эффективно перерабатывать значительное количество навоза и помета. Перспективным способом биологической утилизации отходов животноводства является культивирование на них микроорганизмов. Для ферментации навоза используют главным образом мицелиальные грибы (твердофазное культивирование), а на навозных стоках осуществляют глубинное культивирование бактерий, дрожжей и грибов. Выращивание бактериальных культур на отходах животноводческих комплексов не получило широкого распространения из-за ограниченного применения бактерий на кормовые нужды. Выращивание дрожжей позволяет произвести «облагораживание» стоков (свиноферм и ферм крупного рогатого скота) и получить дешевые кормовые добавки и бактериальные препараты. Биотехнология способна вовлечь в производство кормовых препаратов и добавок огромные массы жидких и плотных отходов агропромышленного комплекса растительного и животного происхождения. Компостирование органических отходов с добавлением микроорганизмов, биоферментация помета и навоза при 70–850С позволяют получать ценное органическое удобрение, необходимое для повышения плодородия почвы и получения экологически чистой сельскохозяйственной продукции. Разработаны технологии утилизации отходов сельского хозяйства в специальных установках – биореакторах, биоферментерах (биоферментаторах), модулях, метантенках и т.д. В них, как правило, микробиологическая трансформация отходов осуществляется за счет аэробно-анаэробных процессов. Биотехнологии имеют существенные преимущества перед компостированием за счет снижения потерь питательных веществ в перерабатываемом исходном сырье, значитель- 199 ного повышения экологической чистоты конечных (вторичных) продуктов и сокращения времени переработки сырья. Управление процессом биоферментации отходов позволяет интенсифицировать минерализацию исходного субстрата, активизировать биосинтез новых соединений и улучшить питательные свойства конечных целевых продуктов. «Сгорание» органической массы можно регулировать физическими, химическими и биологическими воздействиями. В последнем случае активизируются микроорганизмы исходного субстрата или внесенные смешанные микробоценозы, а их ферментные системы преобразуют субстрат в необходимом направлении, ускоряя процессы распада органического материала и микробного синтеза. Получаются продукты заданного качества, будь то органические удобрения или кормовые добавки, субстраты для микробиологической промышленности или почвогрунты для теплиц. 14.1 Получение водорода и биогаза Получение водорода и биогаза микробиологическим путем – биотехнологическое решение XXI века. Водород является идеальным химическим носителем энергии. Сжигание его при высоких температурах дает большое количество полезной энергии с высоким КПД. Микробиологическое получение водорода в настоящее время развивается, хотя прямое биотехнологическое получение водорода на основе процесса, аналогичного фотосинтезу, или анаэробного сбраживания дискутируется. Для получения водорода из органических отходов путем анаэробной ферментации селекционируются новые виды, микроорганизмов, способные производить водород вместо метана. В Японии исследован процесс образования водорода из метана при сбраживании рисовой соломы, кухонных отходов, лошадиного навоза и метанового ила. Исследователи Великобритании изучили процесс образования водорода с помощью использующих метан бактерий Methylomonas alvus, Methylosinus trichosporium. Производство биогаза в процессе метанового брожения широко распространено в мире. За счет конверсии отходов системой метаногенеза может быть получено условное топливо, измеряемое миллиардами тонн. Оставшуюся в результате метановой ферментации биомассу можно использовать как удобрение. Биометаногенез, или метановое «брожение» – давно известный процесс превращения биомассы в энергию. Открыт данный процесс в 1776 году Вольтой, который установил наличие метана в болотном 200 газе. Биогаз, получаемый из органического сырья в ходе биометаногенеза в результате разложения сложных органических субстратов различной природы при участии смешанной из разных видов микробной ассоциации, представляет собой смесь из 65–75 % метана и 20–35 % углекислоты, а также незначительных количеств сероводорода, азота, водорода. Теплотворная способность биогаза зависит от соотношения метана и углекислоты и составляет 5–7 ккал/м3; 1 м3 биогаза эквивалентен 4 квт/ч электроэнергии, 0,6 л керосина, 1,5 кг угля и 3,5 кг дров. Неочищенный биогаз используют в быту для обогрева жилищ и приготовления пищи, а также применяют в качестве топлива в стационарных установках, вырабатывающих электроэнергию. Компремированный газ можно транспортировать и использовать (после предварительной очистки) в качестве горючего для двигателей внутреннего сгорания. Очищенный биогаз аналогичен природному газу. В процессах биометаногенеза решается не только проблема воспроизводства энергии, эти процессы чрезвычайно важны в экологическим плане, так как позволяют решать проблему утилизации и переработки отходов различных производств и технологий, сельскохозяйственных и промышленных, а также бытовых, включая сточные воды и твердый мусор городских свалок. В сложных процессах деструкции органических субстратов и образования метана участвует микробная ассоциация различных микроорганизмов. В ассоциации присутствуют микроорганизмыдеструкторы, вызывающие гидролиз сложной органической массы с образованием органических кислот (масляной, пропионовой, молочной), а также низших спиртов, аммиака, водорода; ацетогены, превращающие эти кислоты в уксусную кислоту, водород и окислы углерода и, наконец, собственно – метаногены – микроорганизмы, восстанавливающие водородом кислоты, спирты и окислы углерода в метан. С биохимической точки зрения метановое «брожение» – это процесс анаэробного дыхания, в ходе которого электроны с органического вещества переносятся на углекислоту; последняя затем восстанавливается до метана (при истинном брожении конечным акцептором электронов служит молекула органического вещества (конечные продукты брожения). Донором электронов для метаногенов служит водород, а также уксусная кислота. Деструкцию органической массы и образование кислот вызывает ассоциация облигатных и факультативных анаэробных организмов, среди которых гидролитики, кислотогены, ацетогены и др.; это 201 представители родов Enterobacteriaceae, Lactobacilaceae, Sterptococcaceae, Clostridium, Butyrivibrio. Активную роль в деструкции органической массы играют целлюлозоразрушающие микроорганизмы, так как растительные биомассы, вовлекаемые в процессы биометаногенеза, характеризуются высоким содержанием целлюлозы (лигнинцеллюлозы). В превращении органических кислот в уксусную существенную роль играют ацетогены – специализированная группа анаэробных бактерий. Собственно метаногенные или метанообразующие бактерии (архебактерии) катализируют восстановительные реакции, приводящие к синтезу метана. Субстраты для реализации этих реакций – водород и углекислота, а также окись углерода и вода, муравьиная кислота, метанол и др. Переработка отходов за счет метанового брожения – наиболее экономичный и эффективный метод очистки территорий, прилегающих к животноводческому комплексу. Конверсия биомассы животноводческих комплексов в газообразное топливо служит дополнительным энергоносителем в сельском хозяйстве. Переработка отходов метановым брожением – наиболее экономичный и эффективный метод очистки сточных вод, утилизации твердых отходов промышленности, сельского хозяйства, коммунально-бытовых отходов. Большой производительностью по метану обладают разработанные в США биореакторы, использующие магнитотаксисные бактерии. В конструкцию биореактора включают устройство для создания внутреннего локального магнитного поля, привлекающего магнитотаксисные бактерии. Бактериальные продуценты биогаза мигрируют в область магнитного поля, концентрируются в окружающей зоне биореактора и не вымываются из него при вводе свежих порций органических отходов и удалении остатков. 14.2 Получение кормовых добавок В настоящее время для создания биологически активных добавок и продуктов используется ограниченный спектр микроорганизмов – в основном бифидо- и лактобактерий. Однако многие авторы отмечают перспективы использования микроорганизмов других таксономических групп, положительно влияющих на нормальную микрофлору животных и человека. Дрожжи достаточно давно и широко применяются в сельском хозяйстве именно как пробиотические добавки к корму. В развитых 202 странах такие добавки вызывают повышенный интерес из-за законодательных ограничений использования кормовых антибиотиков. Животным скармливается растительный силос, содержащий значительные количества живых дрожжей, живые дрожжевые культуры вводят в рационы как эффективный стимулятор продуктивности. В нашей стране дрожжеванные корма готовят на различном сырье: это фуражная мука, патока, виноградная, яблочная мука, опилки, солома, шелуха зерновых и другое сырье, которым располагают хозяйства. Из этих продуктов готовят жидкие питательные среды, засевают пекарские или кормовые дрожжи в чистом виде или в смеси с молочнокислыми бактериями, культивируют 6–9 ч, затем культуру убивают или скармливают в нативном виде. При такой ферментации применяются малоинтенсивные режимы перемешивания и аэрации, следствием чего является довольно низкое содержание дрожжей в культурах((1,0–1,5) · 106 кл/см3). Тем не менее даже в таких концентрациях дрожжи дают положительный эффект в животноводстве и птицеводстве. Кормовые добавки, содержащие культуру Saccharomyces serevisiae, выращенную на среде из побочных продуктов зернопереработки, улучшают перевариваемость гемицеллюлозы и белков, стабильность рубцовой ферментации у молочных коров, постстрессовое потребление пищи у телят, а также производительность свиней в стадии финального откорма на рационе с низким содержанием фосфора. Лечебно-профилактические дрожжевые добавки на основе ржаных отрубей способны обеспечить профилактический эффект до 90%, отмечается также высокий лечебный эффект (выздоровление до 75% заболевших животных и сокращение продолжительности болезни) при диарее телят. Установлена нейтрализация токсичности белковых токсинов ботулинического типа А, шигеллезного и термолабильного энтеротоксина кишечной палочки с помощью высушенных культур винных дрожжей. Существует несколько механизмов, посредством которых осуществляются парафармацевтические свойства дрожжей. Дрожжи и продукты дрожжевой ферментации зернового сырья представляют собой уникальную субстанцию, обладающую способностью связывать токсигенные микроорганизмы и их метаболиты и нормализовать биоценозы ЖКТ высших животных. Токсиннейтрализующие свойства дрожжевых клеточных стенок используются при изготовлении биосорбента на основе винных дрожжей. Наряду с традиционными природными и синтетическими сорбентами дрожжевой 203 биосорбент эффективно применяется для детоксикации пестицидов, содержащихся в виноградных соках и винах. Дрожжевые экстракты являются достаточно эффективными радиопротекторами, т.е. они уменьшают повреждающее действие радиации на живые организмы и снимают радионуклидное заражение растительных субстратов. Имеются сообщения о противоопухолевой активности дрожжей Saccharomyces cerevisiae, Candida tropicalis, Cryptococcus albidus, Candida guilliermondii, Candida pseudotropicalis, Candida parakrusaee. В Московском государственном университете пищевых производств разработана технология универсального биологически активного полуфабриката пищи и кормов на базе сельскохозяйственного сырья и дрожжей. Предложено выделять дрожжевые культуры, перспективные для биоконверсии растительного сырья, из природных микробиоценозов растительного и животного происхождения. Наиболее перспективными продуцентами биомассы признаны термотолерантные дрожжевые и дрожжеподобные грибы родов Pichia, Rhodotorula, Candida и др., интенсивно растущие на твердофазных растительных субстратах. Реальными субстратами биоконверсии являются вторичные продукты агропромышленных предприятий (послеспиртовая барда, отходы хранения и переработки плодоовощного сырья, навозные стоки животноводческих и птицеводческих хозяйств и т.п.). В качестве углеводистого сырья для дрожжевой биоконверсии предложены растительные субстраты с реакцией среды, близкой к нейтральной: зерно и продукты его переработки, клубни и корнеплоды. В их состав наряду с легкоусвояемыми продуктами входят целлюлозосодержащие формообразующие компоненты: отруби, соломенная или травяная мука, солодовые ростки и т.п. При твердофазной ферментации установлена более высокая удельная продуктивность биомассы дрожжей на единицу массы углеводистого субстрата, чем при глубинной ферментации. Культивирование дрожжей на твердофазных субстратах рекомендовано вести при перемешивании не чаще 1 раза за 2 ч, температуре 28–300С в течение 24–48 ч. Установлена возможность сухого и жидкого фракционирования твердофазной дрожжевой биомассы, которая может быть рекомендована в качестве компонента пищевых продуктов, кормов или удобрений. Организация линий, перерабатывающих агропромышленное сырье по предлагаемой технологии, весьма реальна на базе функ- 204 ционирующих предприятий агропромышленного комплекса с использованием сырья и отходов этих предприятий. 14.3 Биотрансформация растительного сырья Биотрансформация растительного сырья и отходов сельского хозяйства и перерабатывающей промышленности с помощью микроорганизмов создает возможность получения в специальных цехах значительных (возможно, намного больших, чем в микробиологической промышленности) количеств кормовых продуктов, обогащенных микробным белком. Основное отличие таких продуктов – большая вариабельность их химического состава, зависящая от характера перерабатываемого сырья, вида используемого микробапродуцента, способа его культивирования. Препараты, полученные путем глубинного культивирования мицелиальных грибов и дрожжей, содержат больше белка, чем препараты, полученные поверхностным методом. Например, на сточных водах пищевых предприятий при культивировании дрожжей получены препараты, содержащие 30–45%, на безбелковом коричневом соке зеленых растений – около 30% сырого протеина от сухой массы. Крахмалсодержащие жидкие среды даже с нерастворимыми включениями обеспечивают значительно большее содержание сырого протеина в конечном продукте (30–40%), чем среда с измельченным целлюлозосодержащим субстратом (10– 15 % сырого протеина). Примером зависимости эффекта протеинизации от способа культивирования (при прочих равных условиях) является выращивание термофильных грибов на свекловичном жоме в глубинной и твердофазной культурах. Максимальный прирост белка в первом случае – 402%, во втором – 264%. И тем не менее у твердофазной ферментации имеются большие перспективы для широкого внедрения в самых различных хозяйствах, занятых производством и переработкой сельскохозяйственной продукции, ввиду ее преимуществ, ввиду низкой себестоимости получаемых с ее помощью протеинизированных продуктов. Грубые растительные корма могут быть обогащены грибным белком до 20–25%, иногда получают и более высокие результаты – 25–30%. Эффектность протеинизации у мицелиальных грибов может быть заметно выше (3–10 раз), чем у дрожжей (2–3,5 раза), но, как 205 правило, это сопровождается заметным удлинением процесса ферментации, значительно более эффективными (а значит, и дорогостоящими) должны быть меры по поддержанию стерильности процесса. В ходе этого процесса происходит не только количественное нарастание белка в продукте, но и повышение его качества (соотношения незаменимых и заменимых аминокислот), что зависит прежде всего от используемой микробной культуры. По содержанию некоторых незаменимых аминокислот микробные белковые препараты превосходят соевый шрот и рыбную муку, например, по лизину, метионину, гистидину, треонину и триптофану. В любом случае полученный конечный продукт будет комплексным, т.е. он будет содержать наряду с наросшей микробной биомассой остатки трансформируемой плотной питательной среды. В процессе твердофазной ферментации потребляется лишь часть содержащихся в исходном сырье крахмала, пектина, гемицеллюлозы, целлюлозы, т.е. получаемый комплексный препарат весьма богат углеводами, состав которых зависит как от вида микроорганизма, так и от химического состава перерабатываемого сырья. Наряду с накоплением белка в процессе трансформации может быть в несколько раз повышено содержание липидов. Известно, что корма для животных должны быть сбалансированы не только по аминокислотам, но и по липидам, так как известно их значение как источников незаменимых полиненасыщенных жирных кислот, играющих определенную роль в процесах регуляции обмена веществ. Эти кислоты играют большую роль в синтезе простагландинов, представляющих собой гормоноподобные вещества, принимающие участие в регуляции многих процессов, в том числе и стимуляции роста животных. Производимые на сельскохозяйственном сырье продукты микробного синтеза в ходе роста микроорганизмов обогащаются целым комплексом ростовых веществ – каротином, витаминами группы В, аскорбиновой кислотой, витамином Е и т.д. При 5%- добавке дрожжей в корм степень покрытия потребности свиней в витаминах составляет в процентах: B1 – 10–50, В2 – 100, В6 – 40, РР – 100. Помимо этого в таких препаратах могут содержаться комплексы гидролитических ферментов, оказывающих немаловажное влияние на перевариваемость кормов. Использование микробных препаратов в животноводстве. Микробные препараты весьма перспективны при использовании их в качестве компонентов кормов. Известно, что 10–20% белка в рационах сельскохозяйственных животных может быть заменено белком одно- 206 клеточных. Конечно, этот процент может варьировать в зависимости от штамма-продуцента, сырья, на котором он культивируется, способа культивирования. Например, скармливание животным препаратов, полученных с помощью дрожжей, дает заметный разброс по величине добавок, оптимальных для рациона: Candida tropicalis А–11 при глубинном культивировании на виноградных выжимках – 7% по протеину; Endomycopsisflbuliger С – 4 при твердофазной ферментаци виноградных выжимок и отрубей (1:1) – 10–15% по протеину; Endomycopsis fibuliger C-4 при глубинной ферментации на комплексных плодоовощных отходах – 21,5% по протеину. Превышение этих оптимальных доз нежелательно, так как, с одной стороны, иногда оно может приводить к снижению продуктивности животных, а с другой стороны, просто невыгодно экономически. Введение микробных кормовых препаратов в рационы сельскохозяйственных животных и птицы повышает их продуктивность, создает возможность обеспечивать длительное оптимальное течение обменных процессов в организме животного, полную и правильную реализацию его генетического потенциала (так называемые жизнеподдерживающие свойства). Естественно, что использование таких кормовых добавок может заметно улучшить экономические показатели, повысить прибыль предприятий, применяющих эту технологию. При этом качество животноводческой продукции, получаемой с применением микробных препаратов, не уступает таковому на обычных кормах. При производстве молочных продуктов (сыра, творога) в процессе получения белкового сгустка из молока выделяется молочная сыворотка, которая содержит 50% сухих веществ молока. Молочная сыворотка – нестойкое сырье, которое необходимо либо немедленно использовать, либо законсервировать. Используют ее для добавления в корма, получения напитков и лактозы, обогащения пищевых продуктов и полуфабрикатов, а также в качестве питательной среды для микроорганизмов при получении молочной кислоты, спирта, кормовых дрожжей и др. По статистическим данным 48– 88% получаемой во всем мире сыворотки идет на корм скоту, 0,5– 4,0% – на технические и 7–52% – на пищевые цели. Состав молочной сыворотки заметно варьирует в зависимости от качества исходного сырья, характера готового продукта, способа отделения белка (сквашивание, ферментный способ). Наличие в сыворотке легкоусвояемых источников углерода (лактоза – молочный сахар, в меньших количе- 207 ствах – глюкоза, галактоза и др.) и ростовых веществ позволяет считать ее перспективным сырьем в биотехнологических процессах. На молочной сыворотке можно выращивать поверхностным и глубинным способами микроскопические грибы (Репicilluт rogueforti, Rhizopus oligosporus, Morchella и др.). Известны способы получения кормовых биомасс на основе смешанной культуры микроскопических грибов и бактерий (Lactobacterium, Pseudomonas, E. coli, Candida utilis, Brettanomyces anomalis и др.). При культивировании дрожжевых микроорганизмов на сыворотке необходимо внесение дополнительных источников азота в виде мочевины, сернокислого аммония и аммиака в количестве до 1%, что способствует повышению содержания белка в дрожжах в 2–4 раза. Ограничивает широкое использование биомассы одноклеточных в рационах животных, а тем более в пище человека, высокое содержание в ней нуклеиновых кислот. Предлагаемые химические методы денуклеинизации микробных препаратов приводят в то же время и к потерям белка, что весьма нежелательно. Препараты, получаемые на растительном сельскохозяйственном сырье с помощью мицелиальных грибов, содержат около 2% нуклеиновых кислот. Несколько больше содержание нуклеиновых кислот в дрожжевых препаратах, полученных на растительном сырье, – (3–4%). В целом же наилучшим способом удаления отходов по экономическим и экологическим соображениям является их использование в качестве вторичного сырья. Приведенные способы биоконверсии отходов могут дать, иногда неожиданно, весьма существенный результат с благоприятными последствиями для развития отрасли. К сожалению, большинство из них реализуется в нашей стране очень плохо. 208 Библиографический список 1. Андреев, А.А. Производство кормовых дрожжей / А.А. Андреев, Л.И. Брызгалов. – М.: Лесн. пром-сть, 1986. –248 с. 2. Артамонов, В.И. Биотехнология – агропромышленному комплексу / В.И. Артамонов – М.: Наука, 1989. –160 с. 3. Асонов, Н.Р. Микробиология / Н.Р. Асонов.– М.: Колос, 2001. – 352 с. 4. Атапасов, А. Биотехнология в растениеводстве: пер. с болг. Е.B. Дененко; отв. ред. В.К.Шумный – Новосибирск, 1993. –241 с. 5. Беккер, М.Е. Микробиология микробиологического синтеза / М.Е. Беккер. – Рига: Зинатне, 1980.–240 с. 6. Биотехнология растения: культура клеток: пер. с анг/ Г.П. Болвел [и др.]; под ред. Р.Г. Бутенко. – М.: Aгропромпиздат, 1989. – 280с. 7. Негрука, В.И.. Биотехнология сельскохозяйственных растений/:пер. с англ. – М.: Aгропромииздат, 1987. – 301с. 8. Биотехнология: в 8 кн. Кн 3. Клеточная инженерия/ Р.Г. Бутенко, [и др.] – М.: Bысш. шк. 1987. – 127 с. 9. Биотехнология: учеб. пособие для вузов: в 8 кн. / под ред. Н.С. Егорова, В.Д. Самуилова. Кн.1: Проблемы и перспективы/ Н.С. Егоров, А.В. Олескин, В.Д. Самуилов. – М.: Высш. шк., 1987. – 159 с. 10. Бирюков, В.В. Основы промышленной биотехнологии: Учеб и учеб пособие для студентов высш. учеб. заведений В.В. Бирюков.: – М.: КолосС, 2004. – 296 с. 11. Бутенко, Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе Р.Г.Бутенко.: – М.:ФБК-ПРЕСС, 1999. – 160 с. 12. Волова, Т.Г. Экологическая биотехнология: учеб. пособие для университетов / Т.Г. Волова. – Новосибирск: Сиб. хронограф, 1997. – 144 с. 13. Воробьева, Л.И. Промышленная микробиология учеб. пособие для вузов / Л.И. Воробьева. – М.: Изд-во МГУ, 1987 – 168с. 14. Гриневич, А.Г. Техническая микробиология / А.Г. Гриневич. – М.: Высш. шк., 1986. –168с. 15. Гусев, М. В. Микробиология/ М. В. Гусев, Л. А. Минеева. М.: Изд. центр Академия, 2003 16. Егоров, Н.К. Основы учения об антибиотиках / Н.К. Егоров. – М.: Высш. шк., 1986. 209 17. Егорова, Т.А. Основы биотехнологии: учеб. пособие для высш. пед. учеб. заведений / Т.А. Егорова, СМ. Клунова, Е.А. Живухина.- М.: Академия, 2003. – 208 с. 18. Елинов, Н.П. Химическая микробиология / Н.П. Елинов. – М.: Высш. шк. 1989. 19. Емцев, В. Т. Микробиология / В. Т. Емцев, В. К Шильникова. – М.: Агропромиздат, 1990. – 191с 20. Емцев, В.Т. Микробиология: учеб. для вузов / В.Т. Емцев, Е.Н. Мишустин. – 5-е изд., перераб.и доп. – М.: Дрофа, 2005. – 445с. 21. Есипов, Е.П. Основы биотехнологии / Е.П. Есипов. – М.: Наука, 1995. 22. Левенко, Б.А. Биотехнология растений: сегодня и завтра. Б.А.Левенко / Физиология и биохимия культурных растений, – 1999. Т.31. – №3. – С. 163–171. 23. Лиепиньш, Г.К. Сырье и питательные субстраты для промышленной биотехнологии / Г.К.Лиепиньш, М.Э. Дунце – Рига: Зинате, 1986. – 158с. 24. Метаболизм микроорганизмов : учеб. пособие для вузов / Н.С.Егоров [и др.] – М.: Из-во Моск. ун-та, 1986. – 256с. 25. Технология биоконверсии растительного сырья. Ч.2: Перспективные технологии микробиологической конверсии растительной биомассы: учеб. пособие для студентов / П.В.Миронов [и др.] – Красноярск: Изд - во СибГТУ, 2002. –150 с. 26. Мосичев, М.С. Общая технология микробиологических производств / М.С. Мосичев, А.А. Складнев, В.Б. Котов. – М.: Легкая и пищевая пром-сть, 1982. – 264 с. 27. Носов, A.M. Физиологическая регуляция роста и синтеза вторичных соединений. Биология культивируемых клеток и биотехнология растении. – М.: Наука, 1991. – С.5–19. 28. Оборудование технологических линий для получения продуктов микробиологического синтеза: сб. науч. тр НИИхиммаш. – М., 1984. – 112 с. 29. Основы биохимии: учеб. для студ. биол. спец. ун-тов/под ред. А.А. Анисимова. – М.: Высш.шк., 1986. – 133–140. 30. Основы сельскохозяйственной биотехнологии / Г.С. Муромцев, [ и др.] – М.: Aгропромиздат, 1990. –384 с. 31. Першина, Л.А. Методы культивирования in vitro в биотехнологии растений. Л.А. Першина – Новосибирск: Изд-во НГУ, 2000. – 68 с. 210 32. Промышленная микробиология: учеб. пособие для вузов/ под общ. ред. Н.С. Егорова. – М.: Высш. шк., 1989. – 688с 33. Роуз, Э. Химическая микробиология / Э. Роуз, под ред. проф. Н.С. Егорова – М.: Мир, 1971. – 294с. 34. Сельскохояйственная биотехнология: учеб. / B.C. Шевелуха [и др.] – М.: Высш. шк, 2003. –496 с. 35. Сидоренко, О.Д. Микробиология: учеб. для агротехнологов / О.Д. Сидоренко, Е.Г.Борисенко, А.А. Ванькова, Л.И. Войно – М.:ИНФРА-М, 2005. – 287с. 36. Сидоров, В.А. Биотехнология растений: клеточная селекция. В.А. Сидоров – Киев: Наук. думка, 1990. – 280 с. 37. Техническая микробиология пищевых продуктов / под ред. А.Я. Панкратова. – М.: Пищевая пром-сть,1968. – 744с. 38. Чуетов В.И. Промышленная технология лекарств: учеб. Т 2. – Харьков: Изд-во НФАУ 2002. – 716 с. 39. Чурбанова, И.Н Микробиология / И.Н Чурбанова. – М.: Высш. шк.,1987. – 239с. 40. Шлегель, Г. Общая микробиология / Г. Шлегель. – М.: Мир, 1987. 211 Тесты для проверки знаний 1. Способностью использовать солнечный свет для получения органического вещества из неорганического обладают микробные клетки, имеющие специальные: - пигменты + - органеллы - ферментативные системы + - ионные комплексы 2. Процесс поступления веществ в клетку по градиенту концентрации называется: - облегченная диффузия - пассивная диффузия + - обменная адсорбция - фагоцитоз 3. При повышенной концентрации солей в среде с микробными клетками происходит : - деплазмолиз - плазмолиз + - лизис - тургор 4. Микроорганизмы, оптимум для развития которых находится в диапазоне температур от плюс 15 до минус 80С, называются: - мезофилы - психрофилы + - термофилы - базофилы 5. Микроорганизмы, оптимум для развития которых находится в диапазоне температур от плюс 20 до плюс 40 0С, называются: - мезофилы + - психрофилы - термофилы - базофилы 212 6. Микроорганизмы, оптимум для развития которых находится в диапазоне температур от +40 до + 800С, называются: - мезофилы - психрофилы - термофилы + - базофилы 7. Состояние клетки с ослабленной энергией протекания процессов называется: - симбиоз - анабиоз + - онтогенез - гомеостаз 8. Вещества, вызывающие положительный микробный таксис, называются: - реппеленты - аттрактанты + - консерванты - антиоксиданты 9. Неустойчивость к определЕнным факторам среды называется: - лабильность + - резистентность - толерантность - тактильность 10. Свойства, которыми обладают вещества, вызывающие приостановку роста и размножения микробных клеток: - бактериостатические + - бактерицидные - элективные - конформационные 11. Свойства, которыми обладают вещества, вызавающие гибель микробной клетки: - элективные - конформационные - бактериостатические - бактерицидные + 213 12. Прокариоты, способные к фотосинтезу и фиксации молекулярного азота: - микоплазмы - клостридии - нокардии - цианобактерии + 13. Использовать энергию света для обеспечения клетки энергией способны: - гетеротрофы - хемотрофы - фототрофы + - метатрофы 14. Хемолитотрофы используют в энергетическом метаболизме: - распад углеводов. - гидролиз белков - окислительно-восстановительные превращения минеральных веществ + - окисление жирных кислот 15. Процесс брожения проходит в: - аэробных условиях - анаэробных условиях + - при наличии органических субстратов + - при наличии возбудителей + 16. Конечным акцептором водорода при брожении является: - кислород - органические вещества промежуточного распада субстрата + - компоненты исходного субстрата - вода 17. Основная характеристика способности вещества к сбраживанию: - наличие неполностью окисленных или восстановленных атомов углерода + - наличие двойных связей. - наличие функциональных групп - химический состав 214 18. Для микроорганизмов доступным видом энергии может быть: - механическая - ядерная - химических связей + - электромагнитная (световое излучение) + 19. Восстановительными свойствами обладает среда, окислительно-восстановительный потенциал (ОВП) которой: - менее 28 + - более 28 - равен 28 - любая 20. Окислительными свойствами обладает среда, окислительновосстановительный потенциал (ОВП) которой: - менее 28 - более 28 + - равен 28 - любая 21. В процессах дыхания и фотосинтеза при переносе электронов через мембраны энергия первоначально запасается в форме: - запасных веществ - трансмембранного электрохимического потенциала + - энергии АТФ - энергии АДФ 22. Фосфорилирование, связанное с мембранами, может быть: - субстратным - фотосинтетическим + - окислительным + - гидролитическим 23. Потребление энергии в растущей клетке связано с: - биосинтезом новых веществ + - активным транспортом через мембраны + - подготовкой к делению и спорообразованию - образованием запасных веществ 215 24. Состояние покоя в живой клетке является процессом: - изолированным - статическим - динамическим + - равновесным + 25. В случае, когда энергии в целом клетка получает больше, чем требуется для поддержания жизни: - она рассеивается в виде тепла + - запасается в виде высокополимерных молекул полисахаров, липидов + - хранится в виде АТФ - преобразуется в световую 26. АТФ и ферменты, связанные с ней, локализованы: - в цитоплазме - в рибосомах - в митохондриях эукариот + - на внутренних цитоплазматических мембранах прокариот + 27. Совокупность процессов превращения материи и энергии в живом организме, сопровождающехся постоянным ее обновлением, называется - метаболизмом + - катаболизмом - анаболизмом - плеоморфизм 28. Совокупность биохимических процессов поглощения, усвоения питательных веществ и создание структурных элементов клетки называется: - диссимиляцией - конструктивным обменом + - анаболизмом + - катаболизмом 29. Нормальные энергетические уровни связей: - 8–10 кДж + - 25–40 кДж - 4-6–кДж - 12–20 кДж 216 30. Макроэргические связи, содержащие с своем составе атомы фосфора и серы, содержат: - 8–10 кДж - 25–40 кДж + - 4–6 кДж - 12–20 кДж 31. Микроорганизмы, которые используют в метаболизме вещества растительных и животных остатков, называются: - метатрофы - паразиты - сапрофиты + - психрофиты 32. Автоаминотрофы – микроорганизмы, способные усваивать азот: - аммонийный, нитратный, молекулярный + мочевинный + аминокислоты белки 33. Простая диффузия веществ в клетку происходит и основана на: - работе переносчиков законах осмоса + работе натрий-кальциевого насоса градиенте концентраций+ 34. Активный перенос веществ через мембрану происходит : - с участием специальных белков - переносчиков + - с затратой энергии + - по градиенту концентрации - по законам осмоса 35. Дыхание называется аэробным, если конечным акцептором электронов является: - молекулярный кислород + - продукты промежуточного распада - элементы субстрата - связанный кислород 217 36. Энергия органических соединений при аэробном дыхании освобождается - полностью + - частично - поэтапно + - только в виде тепла 37. При брожении энергия освобождается в виде : - АТФ - сохраняется в промежуточных продуктах + - не освобождается - тепла + 38. Конечные продукты брожения зависят от: - наличия факторов роста - возбудителя и качества субстрата + - параметров процесса + - отбора продуктов на промежуточных этапах 39. Автотрофные микроорганизмы получают энергию используя: - световую энергию солнца + безазотистые органические вещества липопротеиды минеральные соединения + 40. Источником азота для дрожжей служат: - аминокислоты + - аммонийные соли + - нитраты и нитриты - атмосферный азот 41. Фототрофы используют для получения энергии: - свет видимой длины 400–700 нм и ближние инфракрасные волны+ - ультрафиолетовые волны - дальний инфракрасный свет (более 1100 нм ) - только видимый свет 218 42. Для осуществления конструктивного метаболизма необходимо наличие: - донора электронов + - ферментов + - тепловой энергии - кислорода 43. Экзогенным донором электронов для фотосинтетического процесса служит: - вода (с выделением кислорода) + - органические вещества - минеральные соли - продукты брожения 44. Фоторедукция – это процесс, характерный для фотолитоавтотрофов, при котором: - используется готовое органическое вещество - донором водорода служит не вода, а другие вещества + - не происходит выделения кислорода - донором служит вода 45. При создании органического вещества из неорганического происходит: - окисление атомарного углерода - восстановление диоксида углерода + - превращения минеральных солей - восстановление карбамидов 46. Средняя степень окисления углерода в продуктах брожения относительно исходного субстрата: - повышается - остается неизменной+ - снижается - варьируется 219 47. При брожении происходит внутри- и межмолекулярная перестройка субстрата в окислительно-восстановительных процессах за счет: - кислорода и воды - не полностью окисленного углерода + - не полностью восстановленного углерода + - органических радикалов 48. Факультативные анаэробы способны приспосабливаться к условиям среды, потому что: - изменяют способ образования АТФ + - продуцируют другие ферменты - имеют сразу две ферментные системы - имеют несколько ферментных систем одновременно 49. Характеристика процессов биологического окисления: - связаны с переносами электронов+ - ферментативные + - многостадийные+ - происходят с поглощением энергии 50. При окислении запасных веществ клетка использует: - гетерогенный лизис - ферментативный гидролиз эндогенными ферментами + - перенос функциональных групп - окисление 51. На первом этапе окисления молекулы глюкозы происхо- дит: - активация с затратой 2 молекул АТФ+ отщепление кислорода образование промежуточного соединения потеря группы ОН- 52. Конечный выход энергии при получении пировиноградной кислоты из глюкозы составляет: - 4 молекулы АТФ - 2 молекулы АТФ+ - 6 молекул АТФ - не освобождается энергия 220 53. Ключевым метаболитом во всех процессах окисления является: - яблочная кислота - пировиноградная кислота + - уксусный альдегид - фумаровая кислота 54. Всегда в итоге первого этапа превращения глюкозы происходит: - только поглощение энергии АТФ образование пировиноградной кислоты + восстановление первичной дегидрогеназы НАД*Н2 образование фосфатных связей 55. Молочнокислые бактерии в молоке развиваются при: рН=3,5–4 рН= 4,7–5 рН = 5,5–5 рН = 7,5–8,5 56. Маслянокислые бактерии в молоке развиваются при: рН=3,5–4 рН= 4,7–5 рН = 5,5–5 рН = 7,5–8,5 57. Гнилостные бактерии в молоке развиваются при: рН=3,5–4 рН= 4,7–5 рН = 5,5–5 рН = 7,5–8,5 58. Если в результате брожения из глюкозы образуются молочная, уксусная кислота, этиловый спирт и диоксид углерода, происходит: - гомоферментативное брожение гетероферментативное брожение+ ферментативное окисление анаэробное разложение 59. Возбудители маслянокислого брожения: - микроаэрофилы - строгие аэробы - облигатные анаэробы + - факультативные аэробы 60. Возбудители маслянокислого брожения: - неподвижные неспорообразующие бактерии - подвижные палочки бациллярного типа - клостридии + - грамм–кокки 221 61. По конечным продуктам брожение, осуществляемое клостридиями, подразделяют на: - истинно маслянокислое+ - ацетонобутиловое + - пропионовое - пектиновых веществ + 62. Во всех случаях брожения с участием бактерий рода Clostridium ключевым метаболитом является: - молочная кислота - ацетил-коэнзим-А + - щавелевая кислота - ацетон 63. Процесс…. наиболее энергетически выгодный: - брожения (субстратное фосфорилирование) - дыхания (окислительное фосфорилирование) + - фотосинтеза (фотосинтетическое фосфорилирование) - анаэробного дыхания 64. В конечном итоге процесса дыхания образуются: - окислительные ферменты - вода, углекислый газ и АТФ + - продукты промежуточного окисления - органические кислоты 65. Тип дыхания, в котором конечным акцептором служат окисленные соединения азота, серы, хлора, хрома, СО2, является: - облигатно аэробным - анаэробным + - хемотрофным - факультативно анаэробным 66. При наличии в среде двух типов акцепторов факультативные анаэробы используют тот, который - позволит получить больше энергии - имеет более высокую концентрацию + - использует оба пути получения энергии - имеет больше окисленных соединений 222 67. Нитратное дыхание, или денитрификация, – это: - процесс восстановления нитратов до молекулярного азота или закиси азота за счет окисления органических субстратов в анаэробных условиях + - процесс окисления нитритов до нитратов в анаэробных условиях - образование аммиака из нитратных солей в аэробных условиях 68. Процесс усвоения бактериями молекулярного атмос-ферного азота из воздуха называется: - нитратредукция - азотфиксация + - аммонификация - денитрификация 69. В анаэробных условиях конечным акцептором водорода для денитрификации являются: - углекислые соли - нитраты + - нитриты - молекулярный азот 70. В спиртовом брожении конечным акцептором водорода является: - уксусный альдегид + - глицерил фосфат - пировиноградная кислота - уксусная кислота 71. По химической природе ферменты: - белки + - гликолипиды - витамины - липопротеиды 72. В биологических реакциях ферменты являются: - переносчиками электронов - снижают энергию активации в превращениях молекул + - инициируют реакции - участниками 223 73. Суммарный энергетический эффект в ферментативной реакции: - снижается повышается не изменяется + варьируется 74. Равновесие биологической ферментативной реакции - сдвигается в сторону первичных продуктов - сдвигается в сторону образования конечных продуктов - не изменяется + - варьируется 75. В случае прохождения ферментативного катализа в неоднородной среде, он будет: - раздельный - гомогенный - гетерогенный + - полиморфный 76. В реакциях с веществами, имеющими общие структурные признаки, ферменты проявляют: - абсолютную специфичность - относительную специфичность - групповую специфичность + - идентичность 77. Ферменты, действующие на определенную химическую связь, являются: - относительно специфичными + - стереохимически специфичными - абсолютно специфичными - неспецифичными 78. В мультиферментных системах: - продукт первой реакции является субстратом для второй + - конечный продукт возвращается в реакцию - промежуточный продукт расщепляется - конечный продукт образуется сразу 224 79. В состав однокомпонентных ферментов входят: - органо-минеральный комплекс - фосфопротеины - только белок + - гликопротеины 80. Катализируемая реакция протекает: - на концах молекулы фермента - на функциональных группах апофермента - активном центре фермента + - на связях кофермента 81. Двукомпонентный фермент построен из: - иона металла и протеина - сложного эфира и белка - апофермента и кофермента + - на молекулы белка 82. Кофактор в зависимости от вида связи с белковой частью называется: - коферментом + - активным центром - простетической группой - апоферментом 83. Роль апофермента в молекуле: - определяет избирательную специфичность всей молекулы + - реагирует с субстратом - усиливает каталитическую активность фермента + - снижает энергию активации 84. Ферментативная реакция проходит: - через многостадийные превращения - через образование субстрат-ферментного комплекса + - одностадийно - без промежуточных соединений 85. Фермент по окончании реакции: 225 - частично входит в продукты остается неизменным + окисляется теряет активность 86. Лабильность фермента – это: - активность в любых условиях - неустойчивость в зависимости от кислотности и температуры + - сохранение постоянства конфигурации - нечуствительность к факторам среды 87. С повышением температуры активность ферментов увеличивается: - прямо пропорционально - в узких пределах + - максимально - не изменяется 88. Полная инактивация ферментов с разрушением происходит: - 800 С + - 650 С - 900 С + - 600 С 89. При изменениях кислотности среды происходит: - изменение структуры апофермента - ионизация функциональных групп субстрата и фермента + - преобразование субстрата - изменение конфигурации промежуточного комплекса 90 Вещества, снижающие активность фермента в среде, называются: - ингибиторы + - инактиваторы - стабилизаторы - реагенты 91. В случае разрушения или модификации функциональных групп происходит: - возвратное ингибирование 226 - переходное ингибирование - необратимое ингибирование + - ингибирование средой 92. Обратимое игибирование может быть: - конкурентным + - неконкурентным + - специфичным - неопределенным 93. Действие ингибитора может быть снижено: - разбавлением раствора - повышением концентрации субстрата + - понижением температуры - повышением температуры 94. Конкурентное ингибирование – это: - блокировка активного центра ингибитором, сходным по структуре с субстратом + - химическая реакция ингибитора и субстрата - инактивация апофермента 95. Неконкурентное ингибирование вызывается: - блокировкой процесса реакции с субстратом - ингибитор реагирует с функциональными группами, не входящими в активный центр + - повышением энергии активации субстрата 96. По месту действия ферменты классифицируются как: - экзо-ферменты + - эндо-ферменты + - изомеразы и синтетазы - ферментные комплексы и мультисистемы 97. Оксиредуктазы: - ускоряют окислительно-восстановительный процесс + - переносят водород к акцептору + - осуществляют реакцию между донором и акцептором - образуют новые связи 227 98. Биологическое окисление органических веществ в клетке происходит путем: - присоединения кислорода - дегидрирования (отнятия водорода) + - отнятия группы ОН- расщепления цепи 99. Коферментом для всех первичных дегидрогеназ служит: - никотин амид аденин динуклеотид (НАД) + - флавоноиды - никотин амид аденин динуклеотид фосфат (НАДФ) + - фитонциды 100. Коферментом вторичных дегидрогеназ является: - пиридоксин - флавин аденин динуклеотид (ФАД) + - флавин аденин мононуклеотид (ФМН) + - витамины 101. Первичные дегидрогеназы: - аэробные - анаэробные + - индифферентные к кислороду - микроаэрофильные 102. Для первичных дегидрогеназ конечным акцептором служат: - окисленные органические вещества + вторичные дегидрогеназы + кислород минеральные ионы 103. Вторичные дегидрогеназы передают водород на: - кислород + - цитохромы + - промежуточные продукты - минеральные ионы 104. Оксиредуктазы эукариот локализованы: - в цитоплазме 228 - на клеточной стенке - на внутренних мембранах митохондрий + - на мезосомах 105. Оксиредуктазы прокариот находятся: - на цитоплазматической мембране - во внутренних мембранах цитоплазмы + - в нуклеотидном пространстве - на мезосомах 106. Трансферазы катализируют: - разрыв углеродной цепи - перенос функциональных групп + - транспорт веществ через мембрану - образование новых связей 107. Гидролазы прокариот относятся к группе: - эндоферментов - токсинов - экзоферментов + - гликозидов 108. Ферменты, расщепляющие сложные эфиры, называются: - каталазы - эстеразы + - лиазы - оксиредуктазы 109. Пептидазы расщепляют: - сложные эфиры - высшие жирные кислоты - белки + - витамины 110. Лиазы осуществляют превращения: - липидов - гликозидные связи углеводов с окислением функциональных групп - отщепление атомных группировок с образованием двойных связей и присоединений по их месту + - отщепление атомов углерода 229 111. Преобразование исходного сырья в продукт с использованием биохимической деятельности микроорганизмов называется: - лиофилизация - трансформация - сублимация - ферментация + 112. Процессы … – это ферментации, в которых целевым продуктом являются внеклеточные или внутриклеточные продукты метаболизма: - биодеградации - биосинтеза + - культивирования - утилизации 113. ... – это микробиологическая компонентов исходной среды: - биокомпостирование + - культивирование - биосинтез - биодеградация + утилизация определенных 114 В ... режиме культивирования загрузка сырья и инокулята в аппарат производится единовременно и остается до окончания ферментации: - многоциклическом - периодическом + - непрерывном - полунепрерывным 115. В ... процессе загрузка среды и выгрузка ферментационной жидкости протекают постоянно и одновременно с одной скоростью: - многоциклическом - периодическом - непрерывном + - полунепрерывном 116. В ... процессах между разгрузкой и загрузкой аппарата ферментация протекает как периодическая, но по достижению опре- 230 деленной фазы небольшая часть ферментационной среды выгружается и добавляется свежая: - периодических - непрерывных - отъемно-доливных + - многоциклических 117. Состояние ферментационного процесса для единицы объема характеризуется: - концентрацией биомассы + - вязкостью микробной суспензии - концентрацией целевого продукта - концентрация микробной взвеси 231 Ключевые слова АНТИБИОТИЧЕСКИЕ ВЕЩЕСТВА АВТОТРОФЫ АВТОЛИЗ АНАБИОЗ АНАБОЛИЗМ АНАЭРОБЫ АНТАГОНИЗМ МИКРОБНЫЙ АЦИДОФИЛЫ АЭРОБЫ АССИМИЛЯЦИЯ АЦЕТИЛКОЭНЗИМ АЦИДОФИЛЫ БИОМАССА БИОПОЛИМЕРЫ БИОСИНТЕЗ БИОТЕХНОЛОГИЯ БИОТРАНСФОРМАЦИЯ БИОКАТАЛИЗ БИОДЕГРАДАЦИЯ БРОЖЕНИЯ – ВИДЫ БАЦИЛЛЫ БАКТЕРИОЦИДНО БАКТЕРИОСТАТИЧЕСКИ ГОМЕОСТАЗ ГЕТЕРОТРОФЫ ГЛИКОЛИЗ ДИССИМИЛЯЦИЯ ДИАЛИЗ ДЕПЛАЗМОЛИЗ ДЫХАНИЯ ВИДЫ ИНГИБИРОВАНИЕ ИНОКУЛЯТ КАТАБОЛИЗМ КАТАЛАЗА КОФЕРМЕНТ КОД ГЕНЕТИЧЕСКИЙ, КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ВИДЫ КУЛЬТУРА МИКРОБОВ ЛИТОТРОФЫ ЛИЗИС МИКРОБНЫЙ ЛИОФИЛИЗАЦИЯ МЕТАБОЛИТЫ МУТАГЕНЕЗ МЕТАТРОФЫ МИКРОФЛОРА НИТРАТРЕДУКЦИЯ ПСИХРОФИЛЫ ПЛАЗМОЛИЗ ПЕРМЕАЗЫ ПАТОГЕННОСТЬ ПЕРЕКРИСТАЛЛИЗАЦИЯ РЕЗИСТЕНТНОСТЬ САПРОФИТЫ СЕЛЕКТИВНОСТЬ СРЕДЫ ВИДЫ СТЕРИЛИЗАЦИЯ – ВИДЫ СУСПЕНЗИЯ БАКТЕРИАЛЬНАЯ СУБЛИМИРОВАНИЕ ТЕРМОФИЛЫ ТОЛЕРАНТНОСТЬ ТОКСИНЫ ТУРГОР ФАКТОР РОСТА ФОСФОЛИРИРОВАНИЕ ФОТОЛИТОТРОФЫ ФОТОСИНТЕЗ ФЕРМЕНТЫ ФЕРМЕНТАЦИЯ ФОТОЛИЗ ФАЗЫ РОСТА ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКТОР ХЕМОТРОФЫ ЦИКЛ ЖИЗНЕННЫЙ ЦИТОХРОМЫ ЦИКЛ КРЕБСА ШТАММ-РОДУЦЕНТ ЭКЗОФЕРМЕНТЫ 232 Приложения Приложение 1 Классификация машин и аппаратов 232 233 Приложение 2 Таблица Основные органические кислоты, продуцируемые микроорганизмами Кислота Микроорганизм-продуцент Источник углерода Молочная Lactobacillus delbrueckii Rhizopus oryzae Глюкоза (крахмал) Глюкоза Выход от источника углерода, % 90 Масляная Clostridium butyricum Крахмал, глюкоза 60-70 50 Пропионовая Койевая Глюконовая 2-Кетоглюконовая Глюкоза » » » 60 60 до 95 90 5-Кетоглюконовая Винная Propionibacterium shermanii Aspergillus oryzae Aspergillus niger Pseudomonas Fluoreseens Gluconobacter suboxydans Gluconobacter suboxydans Пировиноградная Pseudomonas aeruginosa » » 90 30 » 50 Уксусная Acetobacter aceti Этанол Лимонная Aspergillus niger Candida lipolytica Aspergillus terreus Candida brumptil Сахароза (меласса) Парафин Глюкоза » 90-98 85 140 60 28 Алканы, 60-70 Итаконовая Tpeo-Dsизолимонная Аллоизолимонная а-Кетоглутаровая Янтарная Фумаровая Яблочная Тетрадекандикарбоновая Candida lipolytica этанол Penicillium purpurogenum Глюкоза Pseudomonas fluorescens » Candida lipolytica Парафин Bacterium succinicum Яблочная кислота Rhizopus delemar Глюкоза Candida hydrocarbofumaПарафин rica Schizophyllum commune Глюкоза Сhydracar fumarica Pichia membra C. naefaciens Парафин Candida cloacea Гексадекан 40 40 70 57 58-65 84 70-100 72 60 234 БИОХИМИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ С ОСНОВАМИ БИОТЕХНОЛОГИИ Машанов А.И. Величко Н.А. Федорова О.С. Машанов А.А. Редактор В.А. Сорокина Санитарно-эпидемиологическое заключение № 24.49.04.953.П. 000381.09.03 от 25.09.2003 г. Подписано в печать 24.06.09. Формат 60х84/16. Бумага тип. № 1. Печать – ризограф. Усл. печ. л. Тираж 110 экз. Заказ № Издательство Красноярского государственного аграрного университета 660017, Красноярск, ул. Ленина, 117
