Диссертация Линник А.И - Наука и инновации КемТИПП

Министерство образования и науки Российской Федерации
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение
высшего профессионального образования
«Кемеровский технологический институт пищевой промышленности»
(ФГБОУ ВПО «КемТИПП»)
На правах рукописи
Линник Анна Игоревна
РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ БИОПРЕПАРАТА
ДЛЯ ПЕРЕРАБОТКИ КЕРАТИНСОДЕРЖАЩИХ ОТХОДОВ
Специальность 05.18.04 – Технология мясных, молочных и рыбных продуктов и
холодильных производств
ДИССЕРТАЦИЯ
на соискание ученой степени
кандидата технических наук
Научный руководитель:
доктор технических наук, профессор
А.Ю. Просеков
Кемерово 2015
2
СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ……………………………………………………………………... 3
1. АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР ……………………………………………… 10
1.1.Состав и свойства кератинов………………………………………………
10
1.2.Анализ штаммов микроорганизмов, содержащих ген кератиназы…….
23
1.3 Способы технологической переработки кератинсодержащего сырья…....
29
1.4. Заключение по обзору литературы и задачи исследования…………….
35
2. МЕТОДИКА ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ………………………………...
38
2.1. Организация выполнения работы………………………………………….
38
2.2. Объекты исследования…………………………………………………….
40
2.3. Методы исследований…………………………………………………….
41
3.РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ…………..
49
3.1. Идентификация штамма, полученного из природного источника, и изучение его свойств……………………………………………………………….
49
3.2. Изучение влияния технологических параметров культивирования на
кератинолитическаую активность Bacillus pumilus …………………………..
58
3.3. Подбор оптимального состава питательной среды для культивирования
штамма Bacillus pumilus ………………………………………………………..
64
4. ПРАКТИЧЕСКАЯ РЕАЛИЗАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ…………………………………………………………………………….
85
4.1.Технологическая схема по производству биопрепарата для переработки
отходов птицеперерабатывающей промышленности в кормовую добавку…. 85
4.2.Состав, свойства и продолжительность хранения биопрепарата………
90
4.3. Экономическая эффективность выработки биопрепарата……………….. 95
ВЫВОДЫ И РЕЗУЛЬТАТЫ…………………………………………………
103
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ………………………
104
ПРИЛОЖЕНИЯ………………………………………………………………... 120
3
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность работы. Рост численности населения планеты и урбанизация являются причинами увеличения количества и разнообразия отходов, образуемых промышленными и сельскохозяйственными предприятиями. На 2002 год
количество отходов оценивалось в 12 млрд. тонн, из которых 11млрд. тонн составляли промышленные отходы и 1,6 млрд. тонн – твердые бытовые отходы. К
2025 году аналитики предполагают увеличение количества отходов до 90 млрд.
тонн [67,145].
Аграрно-животноводческий комплекс в современных условиях продолжает
быть важным загрязнителем почвы и других элементов окружающей среды: отходы сточных вод животноводческих комплексов, ферм и птицефабрик, использование ядохимикатов и пестицидов. Существуют трудности осуществления контроля сельскохозяйственных объектов, разбросанных на обширных территориях.
Состояние почвы и всей окружающей среды в сельской местности, согласно
государственным докладам об охране окружающей среды, остается тревожным, ряд регионов обладает признаками зон чрезвычайной экологической ситуации или экологического бедствия [16, 156].
В тоже время отходы агропромышленного комплекса являются ценным
сырьем при рациональном использовании и вторичной переработке могут служить источниками для получения жирных кислот, биодизеля, аминокислот, белка,
новых высокопитательных продуктов. Животноводство, несомненно, является основным источником биологически полноценного белка в питании населения высокоразвитых стран. Не умаляя роли и значения производства говядины, свинины,
баранины, молока, рыбы, особое внимание во всем мире уделяется роли птицеводства в решении проблем обеспечения населения белком животного происхождения [111, 161].
4
Вклад птицеводческой отрасли в производство мяса в России составляет 1,2
млн. т в год. При этом образуется 0,4 млн. тонн отходов потрошения птицы, что
создает значительную проблему для перерабатывающей отрасли и требует решения следующих задач: обеспечение биологической безопасности; обеспечение
экологической безопасности; производство полезных для человека продуктов
(белков, жира, биологически активных веществ и т.д.);производство энергии [6].
Среди всех отходов потрошения птицы наибольший интерес представляет
перопуховое сырье, в котором содержится около 65% кормового белка. Решение
проблемы перевода основного белка пера в усвояемую форму имеет первоочередное значение как с позиции мобилизации резервов животного белка, так и с точки
зрения охраны окружающей среды [42].
Для успешного развития птицеводства и животноводства одним из определяющих факторов является создание кормовой базы. Основой кормовой базы
служит растениеводство. Вместе с тем, кормам животного происхождения отводится важная роль в обеспечении потребности незаменимыми аминокислотами,
прежде всего потребности растущих организмов и поддержании высокой продуктивности животных и птицы. При этом решающая роль в развитии и укреплении
кормовой базы отводится созданию новых кормовых смесей и добавок, улучшению качества кормов. Рост производства мяса в стране требует дополнительных
объемов комбикорма для откорма сельскохозяйственных животных и птицы.
Уменьшить потребность в комбикормах можно за счет повышения его питательной ценности при использовании кормов животного происхождения[61].
Таким образом, важным направлением современной биотехнологии являются исследования, направленные на расширение возможностей переработки кератинсодержащего сырья с целью обеспечения экологичности производств за счет
создания безотходных и малоотходных технологий при максимальном вовлечении побочных продуктов переработки в основное производство. В связи с этим
актуальны исследования, направленные на использование ферментативных процессов переработки кератинсодержащего сырья, в том числе с применением рекомбинантных штаммов микроорганизмов [33].
5
На данном этапе технологического прогресса наибольший интерес представляет процесс микробного ферментативного гидролиза сырья. При ферментативном гидролизе максимально сохраняется питательная ценность получаемых
продуктов,
значительно
повышаются
их
растворимость
и
усвояемость
[127].Ферментативный гидролиз позволяет сохранить полный набор аминокислот,
находящихся в составе белков.
Многие широко распространённые микроорганизмы секретируют значительное количество протеолитических биокатализаторов в окружающую среду,
что значительно облегчает задачу их выделения и очистки. Возможность управления образованием ферментов за счёт подбора соответствующей питательной
среды и условий культивирования позволяет не только увеличить выход протеолитических ферментов, но и получать ферментные препараты с определёнными
свойствами. Методы селекции и генной инженерии значительно увеличивают
возможности целенаправленного биосинтеза ферментов. Существенна способность микроорганизмов вырабатывать ферменты, уникальные по своей субстратной специфичности (кератиназы, коллагеназы, эластазы) [35].
Более глубокое знание биологических процессов, основанных на законах
микробиологии и их применение в технологии утилизации птицеводческих отходов, позволит полнее и с большим эффектом использовать закономерности протекания процессов биоферментации [45].
Ферментативный гидролиз кератинов приобретает большое значение в связи с возможностью создания на его основе различных белковых добавок и гидролизатов не только кормового, но и пищевого значения. В связи с этим открытие
высокоэффективных продуцентов и производство на их основе ферментных препаратов приобретает чрезвычайно актуальную задачу [51].
Степень разработанности. Вопросам переработки вторичных сырьевых ресурсов мясной промышленности на пищевые и кормовые цели посвящены работы
Л.В.Антиповой, В.Г. Волика, И.А. Глотовой, Г.В. Гуринович, А.И. Жаринова,
Г.П. Казюлина, Г.И. Касьянова, Л.С. Кудряшова, А.Б. Лисицына, О.С. Осминина,
6
В.М. Позняковского, Н.Н. Потипаевой, И.А. Рогова, В.А. Тутельяна, Ч.Ю. Шамханова, и др.
Цели и задачи
исследований.
Целью работы является
изучение
микроорганизмов, выделенных из естественной среды обитания и разработка
технологии получения
биопрепарата
на их основе для переработки
кератинсодержащих отходов птицеперерабатывающей промышленности.
Для достижения поставленной цели сформулированы основные задачи исследований:
- исследовать генетические, фенотипические особенности и биохимические
свойства штамма Bacillus pumilus;
- изучить влияние технологических параметров культивирования на ферментные системы штамма Bacillus pumilus;
- подобрать оптимальный состав питательной среды для культивирования
штамма Bacillus pumilus;
- разработать рецептуру и технологическую схему получения биопрепарата
и кормовой добавки с его применением;
- изучить состав и свойства кормовой добавки;
- разработать техническую документацию на биопрепарат и кормовую добавку;
- рассчитать ожидаемую экономическую эффективность, провести
про-
мышленную апробацию технологии.
Научная новизна работы заключается в следующем:
- изучены физиолого-биохимические, фенотипические
и генетические
свойства штамма Bacillus pumilus, штамм депонирован в ВКПМ ФГУП «ГосНИИгенетика» с целью пополнения коллекции и правовой защиты штамма, обладающего кератиназной активностью;
- установлено, что штамм относится к роду Bacillus,а генетический анализ
позволил определить на 99 % вид микроорганизма; учитывая проведенные иссле-
7
дования и особенности
штамма, его можно идентифицировать как Bacillus
pumilus;
- на основании полученных результатов выбраны технологические параметры культивирования штамма Bacillus pumilus. Температура составляет 50 °С, рН
среды 7,0-8,0, объем аэрации 1,150 дм3/мин, скорость перемешивания от 50 до 100
об/ мин;
- оптимизирован состав питательной среды, обеспечивающий максимальную продуктивность штамма Bacillu spumilus при культивировании: триптон12%,
панкреатический гидролизат 12%, хлорид натрия 0,2%, хлорид кальция 0,6 %,
фруктоза 0,5%;
- установлено, что культивирование на подобранной питательной среде в
течение 12 ч при 37°С приводит к повышению протеолитической активности
ферментов, которая составляет 24,13 Е/мг
Практическая значимость работы. На основании полученных результатов
описаны основные параметры получения кератиназы из штамма Bacillus
pumilus.Разработан способ получения биопрепарата с использованием распылительной сушки при следующих параметрах: температура сушки 60°С; продолжительность сушки 6 ч. Разработана техническая документация (ТУ 9225-09602054145-2014), регламент и рецептура биопрепарата. Проведена промышленная
апробация технологии в компании ООО «Кера-Тех».
Методология и методы исследований. При проведении исследований использовали общепринятые, стандартные и оригинальные методы биохимического,
физико-химического, микробиологического и генетического анализа, в том числе
спектрофотометрия, электрофорез в полиакриламидном геле по Лэммли, хроматография, метод Дюма.
Положения, выносимые на защиту:
– генетические, фенотипические особенности и биохимические свойства
штамма Bacillus pumilus;
– влияние технологических параметров культивирования на активность
штамма Bacillus pumilus;
8
– состав питательной среды и условия культивирования штамма Bacillus
pumilus с кератиназной активностью;
– рецептура и технологическая схема получения биопрепарата и кормовой
добавки с применением штамма Bacillus pumilus.
Степень достоверности и апробация работы. Основные положения и результаты работы были предметом докладов и обсуждений на международных и
межрегиональных научно-практических конференциях, семинарах, конгрессах: I
Международной научно-практической конференции молодых ученых (Таганрог,2011).Всероссийской научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых с международным участием «Технологии и оборудование
химической, биотехнологической и пищевой промышленности» (Бийск,2011);IV
Всероссийской конференции с международным участием студентов, аспирантов и
молодых ученых «Пищевые продукты и здоровье человека» (Кемерово,
2011);Школе-конференции молодых ученых «Фундаментальная наука для биотехнологии и медецины-2011», Институт биохимиии им. А.Н. Баха РАН (Москва,2011); Всероссийской научно-практической конференции «Биомедицинская
инженерия
и
практической
биотехнология»,
конференции
(Курск,2012);
«Проблемы
I
Международной
современной
биологии»,
научно(Моск-
ва,2012); 16-ой Международной Пущиновской школы – конференции молодых
ученых «БИОЛОГИЯ – НАУКА XXI ВЕКА» ( Пущино,2012); Конкурсе «Евразия
– технология будущего» в номинации «Лучший экологический инновационный
проект. Green progect 2012» (Екатеренбург,2012);Международном конкурсе «Молодой ученый Alltech»в области сельского хозяйства (Кентукки, 2012);VII Международного симпозиума «ЕС-Россия: сотрудничество в области биотехнологии,
сельского, лесного, рыбного хозяйства и пищи в Седьмой Рамочной Программе»
(Москва, 2012); Российской агропромышленной выставке «Золотая осень -2012»,(
Москва, 2012); 6-ой Международной биотехнологической выставки — ярмарка
«РосБиоТех — 2012» ( Москва,2012);V международной школе молодых ученых
по молекулярной генетике «Непостоянство генома» (Звенигород,2012);VII Московского международного конгресса "Биотехнология: состояние и перспективы
9
развития", (Москва, 2013); Всероссийской молодежной научной конференции с
международным участием «Современные проблемы фундаментальных и прикладных наук», (Кемерово,2013); 3rd International scientific conference "European
Applied Sciences: modern approaches in scientific researches (Штутгарт, 2013).
10
ГЛАВА 1.АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР
В аналитическом обзоре рассмотрены состав и свойства кератинов, представлен анализ штаммов микроорганизмов, содержащих ген кератиназы. На основании анализа литературных данных сформулирована цель и направления собственных исследований.
1.1 Состав и свойства кератинов
Наибольший интерес из всех отходов потрошения птицы представляет перопуховое сырье, так как оно составляет 30 % от массы всех отходов. Для его переработки необходимо подробное изучение строения и происхождения данного
сырья, а также поиск альтернативного источника его деградации [131].
В статье О.Ф.Черновой, сотрудницы Института проблем экологии и эволюции им. Северцова РАН, дан широкий и содержательный обзор гипотез происхождения кератинсожержащего сырья, такого как перья и волосы, приведен перечень сходства и различия в их строении, разобраны некоторые конвергентные
признаки [136,137].
В данной работе особый интерес представляет структура перьев для подбора оптимальных условий тотального гидролиза.
Перья и волосы развиваются из фолликула с участием эктодермы и мезодермы, сложены многослойными кератиновыми структурами, способными к регенерации. Регенерация обеспечивается стволовыми клетками, расположенными
внутри фолликула[136,138].
Оказалось, что развитие перьев и волос регулируется сходным набором
белков, работающих в единообразных сигнальных каскадах. Белок SNN – это сигнальный центр, Noggin – отвечает за деление клеток пера и волоса, WNTβ-
11
катенин – определяет дифференцировку стволовых клеток в зачатках. Облик
кожных структур определяется градиентами сигнальных белков. Экспериментально показано, что все кожные придатки возникают как результат взаимодействия экто- и мезодермы; степень участия экто- и мезодермы при этом может различаться, то есть развитие, и дифференцировка кожных придатков представляют собой «вариации на общую тему»[136, 139].
Сходство функций и гипотетическая общность происхождения перьев и волос предполагают множество общих черт в их строении. Под общностью происхождения понимается участие одних и тех же тканевых структур в производстве
перьев и волоса; это означает какие-то общие гистологические свойства и сходную биохимическую регуляцию. Перья и волосы эволюционировали по отдельности. Об этом говорит, в частности, различный состав кератинов перьев и волос
(рисунок 1.1.1). Перья и чешуя современных пресмыкающихся сложены двумя
видами кератинов: α- и β-кератинами, включая и специфичную форму β-кератина
- φ-кератин (анализировали соответствующие ткани аллигатора). У современных
видов млекопитающих волосы сложены только α-кератином [92].
Кератины (от греч. keras, род. падеж keratos - рог) - это структурные фибриллярные белки, состоящие из параллельных полипептидных цепей, имеющих
конформацию α-спирали или β-структуры (структуры складчатого листа). αКератины (часто их называют просто кератины) - основной тип белков, из которых образуются наружные защитные покровы позвоночных. Кератин является
типичным представителем класса волокнистых белков. Он содержится в тканях
эпидермального происхождения, к которым относятся шерсть, волос, а также рога, когти, перья, копыта, китовый ус и др.[40, 62]. Все перечисленные выше ткани
представляют собой сложные многокомпонентные биологические образования,
состоящие из отдельных клеток, формирующих их различные гистоструктурные
элементы [144].
Сходство задач при раздельной эволюции неизбежно приводит к конвергентному сходству конструктивных признаков. Чтобы проиллюстрировать конвергентные признаки перьев и волос, О.Ф.Чернова рассмотрела тонкую конструк-
12
цию их слоев. Остевые волосы и иглы (видоизменение волос) млекопитающих,
как и бородки опахала перьев птиц, представляют собой трехслойные кератиновые цилиндры. Первый слой – это кутикула, второй слой – корковый, а третий –
сердцевина. Все эти слои хорошо различимы на срезах перьев и волос [32, 66].
Рисунок 1.1.1 –Сравнение тонкого строения перьев и волос: мозаичная кутикула (а) бородки пера у серого журавля - в центре каждой чешуйки видны вмятины от ядра, и (б) иглы американского дикобраза; раструбная кутикула (в) бородки второго порядка пуха покровного пера полевого жаворонка и (г) нижней
части остевого волоса мышевидного опоссума, ячеистая сердцевина стержня (д)
покровного пера кедровки и (е) иглы американского дикобраза.
13
Кутикула построена из чешуек, которые состоят из ороговевших клеток.
Конструкция чешуек перьев и волоса может быть очень похожей. Например, мозаичная кутикула: клетки ее не перекрываются, а располагаются встык, имеют вид
пяти- или шестиугольников. У млекопитающих мозаичная кутикула находится в
наиболее тонкой, прикорневой части волоса, а также покрывает, например, иглы
дикобраза. У птиц она часто встречается на бородках опахала пера[96]. Считается,
что такая структура придает волосу или перу особую прочность. Но у птиц чешуйка-мозаика составлена только одной клеткой, и даже виден след от круглого
ядра в центре, а чешуйка-мозаика волоса млекопитающих состоит из нескольких
клеток, и ядер в ней не видно[11, 27].
Покровные перья и пуховые волосы должны быть тонкими и гибкими. Эти
свойства обеспечиваются сходным конструктивным решением. Кутикула этого
типа перьев и волос представляет собой кольцевые сегменты, вставленные друг в
друга: в расширенную часть нижнего сегмента вставлена зауженная часть верхнего. Получается членистая структура наподобие раздвижного телескопа.Только у
перьев междоузлие длиннее, чем у волоса[26, 133].
Корковый слой состоит из плотно соединенных веретеновидных клеток.
Кора и волос, и перьев может содержать воздушные полости. Воздушные полости
улучшают теплозоляционные свойства покровов. Та же теплозащитная функция
предопределила и сходное строение третьего слоя – сердцевины. Сердцевинный
слой устроен по принципу сетки или ячеек, ограниченных клеточными стенками. Воздух внутри ячеек обеспечивает снижение теплопроводности, а ячеистая
структура повышает механическую прочность[14, 130].
Отдельные морфологические компоненты пера образованы белковыми веществами, относящимися к группе твердых или мягких кератинов. Содержание
этих протеинов составляет более 85% по массе. Твердые кератины отличаются
повышенной химической устойчивостью, высоким содержанием серы, значительной термоустойчивостью и тенденцией к образованию ориентированных упорядоченных структур. Мягкие кератины характеризуются пониженной устойчиво-
14
стью к химическим и термическим воздействиям, крайне низким содержанием серы, слабой структурированностью[37,125].
Аминокислотный состав различных кератинов не постоянен и значительно
варьируется в зависимости от происхождения сырья (таблица 1.1.1).
При исследовании аминокислотного состава кератина установлено, что в
нем содержатся все незаменимые аминокислоты, причем в незначительных количествах [19, 45,69].
Таблица 1.1.1–Количественный состав аминокислот различного видакератинсодержащего сырья.
Человеческий
Волос
Овечья
Куриное
волос
лошади
шерсть
перо
6,88
1,50
4,40
5,21
-
0,90
2,80
6,02
12,12
7,10
11,50
10,83
Аспарагиновая кислота
-
0,30
2,30
7,04
Глутаминовая кислота
8,00
3,70
12,90
14,03
-
3,40
4,40
-
Фенилаланин
0,62
-
-
4,74
Тирозин
3,30
3,20
2,90
5,06
Серин
-
0,60
0,90
5,28
Цистин
11,55
-
7,30
5,28
Аминокислоты
Аланин
Валин
Лейцин
Пролин
Аминокислотный состав кератина представлен из 19 аминокислотами. Среди них нет оксипролина и оксилизина, которые являются основными аминокислотами коллагена, а вместо них присутствуют серосодержащие аминокислоты цистин и цистеин [5, 22, 74].
Различия в аминокислотном составе кератина различных животных обуславливаются особенностями процесса ороговения эпителиальных тканей. В ряде
15
случаев это связано с образованием различных по своему морфологическому характеру типов волоса. Так, например, волос кролика отличается от тонкорунной
овечьей шерсти пониженным количеством серосодержащих аминокислот и повышенным содержанием аминокислот основного характера [98,43].
Это все указывает на то, что кератины представляют собой не индивидуальное химическое вещество, а целую группу белковых веществ.
Существенным отличием кератинов пигментированных волос и перьев животных от непигментированной тонкорунной овечьей шерсти, куриного пера, является повышенное содержание в первых тирозина. Так, в волосе ондатры находится приблизительно 10-14% тирозина, а в волосе белки 6-12%.Интересно отметить, что аминокислотный состав кератинов волоса пушных животных изменяется в соответствии с сезонной изменчивостью (линькой) волосяного покрова[54,58,114].
Известно, что остатки аминокислот в белках соединяются друг с другом посредством пептидной связи, образуя так называемые полипептидные цепочки, агрегация которых приводит к формированию макромолекулы белка. Таким образом, следующим шагом в понимании структуры белка после расшифровки его
аминокислотного состава являются вопросы о порядке чередования аминокислотных остатков в полипептидных цепочках, размерах полипептидных цепочек и
природе остатков, находящихся в концевых участках цепочек.
Сведения, позволяющие судить о молекулярном весе макромолекул белка,
минимальном числе образующих их полипептидов и об их характере, могут быть
получены посредством определения аминокислот, образующих конечные участки
полипептидных цепочек[80,101,138].
Аминокислотный состав кератина дает представление о строении его основных структурных единиц – молекулярных цепей, а также об активных группах, участвующих в образовании межмолекулярных связей и в значительной степени определяющих свойства кератина и их изменения под влиянием различных
реагентов (рисунок 1.1.2)[108,113].
16
Рисунок 1.1.2- Структурная организация кератинов
β-Кератины отличаются от α-кератинов отсутствием поперечных дисульфидных связей между соседними полипептидными цепями. Последние
обычно имеют антипараллельную ориентацию, которая стабилизируется водородными связями и гидрофобными взаимодействиями. Группы R аминокислотных остатков имеют сравнительно небольшие размеры. β-Кератины не растворяются в воде, устойчивы к действию органических растворителей, разбавленных кислот и щелочей; их волокна более гибки, чем у a-кератинов, но
не эластичны. Полипептидные цепи содержат большое количество остатков
глицина, аланина и серина (около 87% от всех аминокислотных остатков; каждый второй аминокислотный остаток глицин); остатки цистеина и метионина
отсутствуют. В полипептидной цепи преобладает повторяющаяся последовательность –Gly–Ser–Gly–Ala–Gly–Ala– [54,108,124].
Наличие в составе кератинов значительного количества остатков дикарбоновых аминокислот (аспарагиновой и глутаминовой) и аминокислот основного
характера (лизина, аргинина и гистидина) определяет их амфотерный характер,
17
обусловливающий возможность активного взаимодействия с реагентами основного и кислотного характера, а также ионного взаимодействия между отдельными
фрагментами структуры кератинов (как внутримолекулярного, так и межмолекулярного). Присутствие в кератинах гидроксилсодержащих аминокислот (серина,
треонина, тирозина) позволяет им взаимодействовать с веществами, вступающими в
реакцию по месту расположения гидроксильных групп, а также способствует образованию в структуре кератинов интенсивно развитой системы водородных связей,
оказывающей существенное влияние на физико-механические, физико-химические и
другие свойства кератинсодержащего сырья[7,56,86,112].
Огромное влияние на особенности структуры кератинов и проявление ими
определенных физико-химических особенностей оказывает содержащей в них
аминокислоты цистина. Важная роль в формировании структуры кератина принадлежит также аминокислотным остаткам с углеводородной боковой цепью –
глицину и пролину [57, 163].
Известно, что остатки аминокислот в белках соединяются друг с другом посредством пептидной связи, образуя так называемое полипептидные цепочки, агрегация которых приводит к формированию макромолекулы белка. Эти полипептиды можно разделить на две группы:
1) обладающие более высоким содержанием цистина и имеющие молекулярную массу около 10000 Да;
2) обладающие низким содержанием цистина и имеющие молекулярную
массу от 50000 до 80000 Да.
Взаимосвязь полипептидных цепочек в кератинах, обусловливающая их ассоциацию в гигантскую макромолекулу, осуществляется за счет взаимодействия
между главными цепями, а также между боковыми цепями посредством разнообразных типов химических связей [71,136].
Существенное значение в образовании макромолекулярной структуры кератинов имеет интенсивно развитая система водородных связей, которые могут возникать между карбонильными и имидными группами, карбонильными и гидроксильными группами, фенольными гидроксильными и аминогруппами; свобод-
18
ными карбоксильными группами, амидными группами соседних полипептидных
цепочек [12,72].
Между полипептидными цепочками возникают также гетерополярные ионные связи, осуществляющие взаимодействие боковых цепочек аминокислот основного (лизина, аргинина) и кислотного характера (аспарагиновой и глутаминовой). Ионныесвязи, как и водородные, играют существенную роль в образовании
макромолекулярной структуры кератинов. А также во взаимодействии друг с другом отдельных макромолекул и даже различных морфологических компонентов
кератинсодержащего сырья[116,143].
Основным типом ковалентной связи между полипептидными цепочками в
макромолекуле кератинов считается дисульфидная связь, образуемая остатками
цистина, входящим своими двумя половинками в две различные полипептидные
цепочки. Цистин является диамино-дикарбоновой кислотой и может участвовать
в образовании четырех различных пептидных связей, образуя две различные полипептидные цепочки, соединенные дисульфидной связью[118].
Помимо этого обе аминные и обе карбоксильные группы цистина могут образовать пептидные связи, входящие в одну полипептидную цепочку. При этом
цистин будет входить в состав одной цепочки, и дисульфидная группа не будет
образовывать поперечную связь между двумя цепочками, а будет представлять
собой дополнительную связь в одной цепочке, располагаясь параллельно ее оси.
Дисульфидная связь кератинов очень реакционно способна. В частности, она легко подвергается гидролизу и восстановлению [18,19].
Уровень содержания серы в кератинах, богатых серой, зависит от питания
животных (таблица 1.1.2). Содержание серы в кератиносодержащих отходах изменяется в связи с тем, что разные виды кератинов имеют различное соотношение
богатых и бедных серой фракций[50, 117].
19
Таблица 1.1.2- Содержание серы в кератинах, г/100 г протеина
Кератинсодержащее
Кератины, богатые серой
Кератины, бедные серой
Свиная щетина
7,2
2,1
Волос кролика
7,2
2,3
Волос КРС
5,9
1,7
Рога КРС
5,8
2,4
Шерсть овец
5,0
2,1
сырье
Помимо дисульфидной связи между боковыми цепочками в макромолекуле
кератинов могут существовать такие типы ковалентных связей, как простые
эфирные, сложноэфирные, имидные, амидопептидные, а также связи типа уреидных. Все они могут присутствовать в кератинах, связывая полипептидные цепочки в макромолекуле белка, а также осуществлять связь как между отдельными макромолекулами, а так и между отдельными гистоструктурными компонентами пера[47,49].
Макромолекулы кератинов образуются большим количеством разнообразных и громоздких полипептидных цепочек. Основной их особенностью являются
ничтожные размеры в поперечном сечении по сравнению с размерами в продольном направлении. Конформация таких длинных цепочек определяется результатом взаимодействия двух конкурирующих сил: с одной стороны, стремящихся
придать им неупорядоченную скрученную форму, при которой концевые участки
цепочки будут максимально сближены, что будет сопровождаться возрастанием
энтропии системы, и с другой стороны, стремящихся стабилизировать форму цепочки за счет взаимодействия между химически активными группами соседних
цепочек [110]. В кератинах силы, стабилизирующие структуру, достаточно велики,
так как для этих белков характерно наличие аминокислотных остатков, имеющих
атомные группировки, между которыми осуществляется активное химическое взаимодействие[135,136].
20
Существование различных форм кератина свидетельствует о том, что в
структуре его макромолекул имеются прочно фиксированные, упорядоченные
фрагменты, обладающие регулярной конформацией полипептидных цепочек, так
называемые кристаллические зоны, и неспиральные дезориентированные неупорядоченные участки – аморфные зоны [100].
Установлено, что компактная a-спиральная укладка полипептидных цепочек, характерная для кристаллических зон, присуща фрагментам, обладающим
небольшим содержанием серы. Система из трех α-спиральных цепей, закрученных в общую суперспираль, называется для кератина протофибриллой. Одиннадцать протофибрилл, из которых две находятся в центре, а девять окружают их
внешним кольцом, образуют микрофибриллу [70].
Компонент с большим содержанием цистина существует в виде аморфного цементирующего вещества – матрикса, который связывает вместе микрофибриллы. Микрофибриллы расположены пучками, идут параллельно оси
(длине) волоса или пера, а цепи с большим содержанием цистина заполняют
пространства между микрофибриллами и связывают всю систему. Микрофибриллы и цементирующее вещество группируются вместе, образуя макрофибриллу[44,48].
Следует особо остановиться на работах, посвященных исследованию химических особенностей кератинов, образующих отдельные морфологические компоненты пера [90,109].
Как известно, корковый слой волоса (кортекс) сформирован из ороговевших
веретенообразных эпителиальных клеток, ориентированных параллельно длине
волокна, покрытых клеточными мембранами и соединенных между собой межклеточными веществом. Изнутри клетки заполнены плотно упакованными пучками микрофибрилл, погруженных в матрикс, характеризующийся высоким содержанием цистина [18,67].
Кератин микрофибрилл обладает меньшей химической активностью, чем
кератин цементирующего вещества. Это объясняется более интенсивным развитием в них поперечных связей [21, 139].
21
Химическое взаимодействие в кератинах коркового слоя, в первую очередь,
осуществляется в межфибриллярном веществе. В частности, в нем сравнительно
легко могут протекать реакции дисульфидно-сульфгидрильного обмена, в результате которых меняется характер дисульфидных связей и образуются новые сульфгидрильные группы. Изменение характера спирали в полипептидных цепочках
межфибриллярного кератина, ее некоторое ослабление обусловлено присутствием
остатка пролина. Таким образом, межфибриллярное вещество может играть роль
пластификатора, обладая способностью ослаблять напряжение[114,121,134].
Отмеченные выше различия в химическом составе и структуре кератинов
фибрилл и межклеточного вещества обуславливают также их различное отношение к влаге. Так, кератины межфибриллярного вещества энергично сорбируют
влагу, кератины фибрилл более инертны. В соответствии с этим свойства межфибриллярного вещества, в частности, физико-механические, в значительной степени зависят от его влагосодержания. Свойства фибрилл такой выраженной зависимости не проявляют [20].
Данные аминокислотного анализа не указывают на принципиальное отличие кератинов клеточных мембран от межфибриллярных и фибриллярных кератинов. В отношении содержания дикарбоновых и гидроксилсодержащих аминокислот кератин клеточных мембран занимает промежуточное положение между
кератинами фибриллярного и цементирующего вещества. Что касается цистина и
пролина, то содержание их невелико. И хотя это заставляет ожидать наличия в
кератинах клеточных мембран спиральной конформации полипептидных цепочек, установлено, что для этих кератинов типична дезориентированная
структура α-типа [103].
По своим свойствам кератины клеточных мембран резко отличаются от
фибриллярных и межфибриллярных кератинов. Их высокая химическая устойчивость не может быть обусловлена наличием дисульфидных или водородных межцепочечных связей, т.к. воздействие реагентов, разрушающих эти связи, не вызывает растворения клеточных мембран. В связи с этим ряд исследователей предполагает, что в кератинах клеточных мембран присутствуют поперечные ковалентные
22
связи, это могут быть, например, сложноэфирные или простые эфирные связи, образованные остатками тирозина[105,140].
Образуя внешнюю оболочку кортикальных клеток, клеточные мембраны
играют существенную роль в структурном соединении их в единое целое. Совокупность межклеточного вещества и внешней оболочки клеток называют комплексом клеточных мембран (ККМ). Взаимосвязь веретенообразных клеток усиливается за счет того, что концевые участки клеток, имеющие пальцеобразные
отростки, как бы внедряются в тело соседней клетки, в результате чего интенсифицируется механическая и химическая связь между клетками. При этом внутри
клеток, у их границ наблюдается обильное скопление межфибриллярного аморфного вещества. При подобном представлении о тонкой структуре фибриллярный
кератин не может рассматриваться как главный морфологический компонент, определяющий прочное соединение клеток в единое целое и обуславливающий основные свойства[84,154,156].
Вопрос о химической природе межклеточного вещества недостаточно ясен.
Оно отличается от кератинов, образующих клеточные структуры, пониженным
содержанием серы и азота, а также аминокислот основного характера (аргинина,
гистидина и лизина) и повышенным содержанием моноаминокислот. Многие
данные свидетельствуют о том, что значительная часть межклеточного вещества
кератиновых структур образована мукополисахаридами и полисахаридами, которые за счет способности к полимеризации взаимодействуют с химически активным межфибриллярным кератином, присутствующим в больших количествах в
области комплекса клеточных мембран. Прочные кератинуглеводные комплексы
образуются с помощью простых и сложных эфирных связей. По всей вероятности, этим можно объяснить их высокую химическую устойчивость, выражающуюся в нерастворимости в реагентах, разрушающих дисульфидные и водородные связи, а также свойственную им особенность разрушаться протеолитическими ферментами, что ведет к резкому снижению прочности волоса или пера, а иногда – к разрушению его на отдельные клетки[24,106,150].
23
1.2 Анализ штаммов микроорганизмов, содержащих ген кератиназы
Белок пера в естественном виде практически не расщепляется протеолитическими ферментами пищеварительного тракта животных из-за наличия большого числа дисульфидных связей цистеина. Для перевода кератинового белка в усвояемую форму его необходимо подвергнуть гидролизу и разрушить дисульфидные связи.
При ферментативном гидролизе максимально сохраняется питательная
ценность получаемых продуктов, значительно повышается их растворимость и
усвояемость [21].
До недавнего времени считалось, что только патогенные грибы (дерматофиты) [99,104,114,123] и отдельные виды бактерий [9,13,137,153] и актиномицетов
[8,52,71, 159] обладают способностью вырабатывать внеклеточные ферменты, разрушающие белки кератинов[63,87,95,129].
Впервые на это обратили внимание специалисты медицинской микробиологии. Они отмечали разрушение волос и ороговевших частиц тела человека (ногтей,
покрова кожи и других) и выделяли культуры актиномицетного строения. Одна из
них была названа Actinomyceskeratolyticus[17,106,107,120].
Позже кератинрасщепляющие актиномицеты выделялись многими исследователями из природных субстратов (почвы, водоемов) и из тела животных. Такие
организмы были найдены среди разных штаммов Streptomycesrimosus, S. griseus,
S. roseochromogenes, S. praecox, S. parvus, S. scabies, S. griseoluteus, Nocardiarubra,
S. microvlavus, S. globisporusvulgaris [106,107,160,162].
Кератинолитическая активность обнаружена среди почвенных грибов
[28,31,85]. Наибольшее распространение в почве имеют кератинофильные грибы
Penicilliumrubrum, Penicilliumlilacium, Fusariumnivale. Дерматофитные грибы,
относящиеся к родам Keratinomyces, Microsporum, Trichophyton, Epidermophiton,
интенсивно
разлагают
кератиновые
материалы.
Так,
например,
Keratinomycesajelloi разрушает до 58,5 % нативного кератина в течение 10 суток.
24
Одновременно с разрушением кератина механическим врастанием гифов дерматофитов между клетками внешнего слоя идет выделение протеолитических ферментов[12,29,59,161].
Культуры
Fusiformisnodosus,
Trichophytonschoenleini,
Trichophytonrubrum, Trichophytonmentagrophytes и Candidaalbicans образуют
ферменты, расцепляющие кератин [68]. Отмечено использование кератинового
материала фенотипами Trichophytonterrestre. В Филадельфии были проведены исследования по выделению чистой кератиназы Trichophyton mentagrophytes [38,77,82].
Существенно нарушают структуру волокна шерсти грибы родов
Aspergillusflavipes,
Scopulariopsis,
Chaetomium,
бактерии
родов
Epicoccum,
Bacillussubtilis
Verticilliumlateritum,
и
Pseudomonascaviae,
Bacilluscoagulans, Stearothermophilus[36,78,97].
Российскими ученными Бандояном В.К.и Дороховым В.В. был выделен в ходе
селекции штамм Streptomyces ornatus S 1220, который проявлял хорошую кератиназную активность (7,3 ед/см3). Штамм Str.ornatusS 1220 хорошо рос и полностью разложил перья в среде после 72 ч [99].
Штамм Str. оrnatus S 1220 был выделен из горных районов Армении. За 78 ч
культивирования проявляет кератиназную активность 7,3 ед/см3.
В таблице 1.2.1 представлен ряд микроорганизмов, обладающих кератиназной
активностью [149].
Таблица 1.2.1 - Микроорганизмы, обладающие кератиназной активностью
Наименования
Номера
культуры
штаммов
Конечное
значение
pH
Протеолитическая
Кератиназ-
Активность,
ная Актив-
10-3,
ность,
ед/см3
мкг/см3
S. purpurascens
561
8,2
0
0
S. roseus
1088
8,5
0
0
S. spororaveus
A-318
8,6
0
0
S. fradiae
400
6,3
2
15
S. variabilis
1095
7,7
6
89
25
Продолжение таблицы 1.2.1
Наименования
Номера
культуры
штаммов
Конечное
значение
pH
Протеолитическая
Кератиназ-
Активность,
ная Актив-
10-3,
ность,
ед/см3
мкг/см3
S. griseolus
402
7,9
8
104
S. inkanus
A-204
8,9
8
109
S. fradiorectus
A-154
8,0
8
118
S. umbrinus
1283
8,5
8
121
S. lanatus
1055
8,2
12
161
S. ruberscens
696
8,3
12
164
S. aurantiacus
1209
8,1
13
177
S. glomeroaurantiacus
1341
8,4
15
208
S. fanguliticus
A-164
8,2
16
234
S. chromogenes
1335
7,7
19
275
S. capocosis
1216
8,0
27
382
S. roseolilacinus
1085
8,5
200
3018
S. microflavus
420
8,5
247
606
S. fradiae
1040
8,6
264
3941
S.griseolus
1044
8,7
293
4464
S. roselus
1086
8,9
317
4697
S. reseofulvus
1084
8,1
339
5029
S. fradiae
A-150
8,7
350
5201
S. daghestanicus
1028
8,8
419
6315
S.pseudofrediae
A-270
8,7
509
7834
S. fradiospiralis
A-157
8,6
520
7956
26
Кератинолитическая активность обнаружена в ряде микроорганизмов, в
частности стрептомицетах (Streptomyces Sp.A11, Streptomyces pactum DSM
40530, Streptomyces fradiae, Streptomyces sp. S. K1-02, Streptomyces ornatus,
Streptomyces chromogenes s. graecus ЛИА 0832, Streptomyces lavendulae ВКПМ
s-910) [148]игрибах (Microsporum canis, Microsporum gypseum, Microsporum
fulvum, Dermatophilus congolensis, Aspergillus fumigatus fresenius, Trichophyton
mentagrophytes, Trichophyton simii, Trichophyton schoenleinii, Chrysosporum
georgiae, Scopulariopsis brevicaulis)[147,152,153,157].
Известен штамм Bacillus speciesАН-101, продуцирующий щелочную кератиназу с оптимальным рН действия 12–13, которая специфично гидролизует кератин человеческого волоса. Данный микроорганизм выращивают при 37oС в течение 56 ч на достаточно сложной среде, содержащей растворимый крахмал, желатин, дрожжевой экстракт и набор неорганических солей, рН среды доводят до 9,5
добавлением NaHCO3. Активность кератиназы Bacillus species No АН-101 высока,
но недостаточна для промышленного внедрения фермента[16,126].
Штаммы Bacillus licheniformis OWU 138В и Bacillus licheniformis OWU 88B,
выделенные из перьев диких птиц, продуцируют, главным образом, β-кератиназу,
избирательно расщепляющую кератин перьев и практически не действующую на
кератин шерсти животных[2].
Штамм Bacillus licheniformis–99депонирован во Всероссийской коллекции
микроорганизмов при Институте биохимии и физиологии микроорганизмов РАН
под номером ВКМ В-2220 Д. Штамм был получен с помощью многоступенчатой генетической селекции с применением методов эффективного мутагенеза
- ультрафиолетового облучения с одновременным воздействием химических
мутагенов из штамма Bacillus licheniformis–78 ВКМ В-2184Д[119].
Недостатками вышеперечисленных продуцентов являются низкая продуктивность и сложность способа культивирования. Кроме того, микроорганизмы рода Microsporum, Dermatophilus и Trichophyton являются патогенными
и не могут использоваться для промышленного получения ферментных препаратов [10, 30, 41, 91].
27
Бациллы продуцируют различные внеклеточные ферменты в период постэкспоненциальной и стационарной фаз роста. Секреция субтилизиноподобных протеиназ сильно зависит от компонентов питательной среды, а именно
от соотношения в среде источников азота и углерода, присутствия легко метаболизируемых сахаров (например, глюкозы), ионов металлов и т.д. [131].
Использование сред, содержащих сложные органические соединения
(пептон, триптон, дрожжевой экстракт) приводит к более интенсивному росту
и продукции внеклеточных протеиназ бактерий [145,156].
Обогащенность сред физиологически активными соединениями, микроэлементами и другими факторами роста благоприятно сказывается на жизнедеятельности и биосинтетической активности микроорганизмов[93, 151].
Бактериальные секреторные белки, как известно, выполняют несколько
очень важных функций дистанционного управления, таких как предоставление питательных веществ, детоксикация окружающей среды и гибель потенциальных
конкурентов.В частности, внеклеточные белки патогенных бактерий играют решающую роль в вирулентности[89,146].
Тот факт, что переносимые белки В. subtilis не сохраняются на внешней
мембране, встречающийся в грамотрицательных бактериях, делает грамположительные бактерии предпочтительней для протеомных анализов белков секреции.
Кроме того, наличие полной последовательности генома [79] и около 3000Yмутантов сенной палочки делает В. Subtilis идеальной моделью для исследования
грамположительных бактерий.
Считается что имеется, по крайней мере, четыре различных путей для экспорта белков из цитоплазмы и около 300 белков, способных экспортироваться, которые можно было бы различить. До сих пор наибольшее количество экспортируемых белков было предсказано по основному пути белков секреции. Можно предположить, отталкиваясь от литературных данных, что кератиназа, продуцируемая, B.
subtilis относится к белкам экспортируемых путем секреции белков[83, 142].
28
Чтобы понять механизм деградации кератина пера, необходимо рассмотреть
структурную организацию и механизм действия фермента кератиназы [84], так
как кератиназа является специфическим ферментом[123,141,149].
На рисунке 1.2.1 представлена не зрелая форма с пропептидной связью (PDсвязь). Структурная модель показывает, что протеаза состоит из 4-х доменов: каталитический, два β-сэндвича и пропептидный домен [72,155]. Структурное выравнивание показывает далекое отношение между субструктурой пропептидного и
каталитического доменов.
Рисунок 1.2.1– Структурная организация фермента кератиназы
Пропептидный домен сильно связан с частью оставшейся протеазы опосредованными водородными связями вдоль доменных поверхностей вокруг активной
щели к β-сэндвичу 1 и β-сэндвичу 2 зажимами [117]. Структурная организация
29
мультидоменного белка кератиназы микроорганизмов дает представление об активации профермента и его роли в некаталитических доменах [128,132,145].
С применением методов генной инженерии стало возможно получение
штаммов по совокупности существенных признаков схожих со штаммами, выделенными из природных источников.
Однако необходимый ген модифицирован для достижения необходимых результатов. В нашем случае таким штаммом является штамм Bacillus licheniformis
PWD-1, ATCC53757. При культивировании на среде, содержащей 1% перьевой
пудры, при 45oС в течение 96 ч синтезирует кератиназу в количестве 25 ед/см3.
Очищенная кератиназа гидролизует широкий спектр субстратов: казеин, порошок из перьев, эластин, коллаген. Фермент стабилен при рН от 5 до 12 с оптимумом действия на порошок из перьев и казеин – 8,5 и от 10,5 до 11,5 соответственно; оптимальная температура действия – 50–55oС[15, 81].
1.3 Способы технологической переработки
кератинсодержащего сырья
Коэффициенты переваримости питательных веществ у птиц несколько ниже, чем у других животных. Протеин животных кормов переваривается на 80–
90%, растительных кормов – на 80–85% и очень хорошо переваривается жир – на
85–95%. В целом энергия корма, трансформируемая из переваренных питательных веществ, используется на 70–80% [39].
У птицы резервы белка в организме ограничены, поэтому недостаток протеина в рационе очень быстро сказывается на ее сохранности и продуктивности.
Избыток протеина приводит к повышению обмена веществ и нежелательному использованию его в энергетических целях, а также сопровождается задержкой роста молодняка, снижением использования азота и накоплением витаминов А и В в
печени. Важным показателем сбалансированности рациона является энерго-
30
протеиновое (ЭПО) отношение, которое указывает, сколько обменной энергии
должно приходиться на 1% сырого протеина в 1 кг полнорационного комбикорма.
Белок пера в естественном виде практически не расщепляется протеолитическими ферментами пищеварительного тракта животных из-за наличия большого
числа дисульфидных связей цистеина. Для перевода кератинового белка в усвояемую форму его необходимо подвергнуть гидролизу и разрушить дисульфидные связи.
Это достигается различными способами: нагреванием в воде, путем окисления, восстановления или гидролиза [73, 74]. В настоящее время известно несколько способов получения гидролизатов из кератинсодержащего сырья: гидротермический, щелочной, кислотный и ферментативный. Целью гидролиза является разрушение компактной структуры кератиновой молекулы до получения
полипептидов, пептидов и отдельных аминокислот.
Наиболее простым является высокотемпературный водный гидролиз кератинсодержащего сырья. Процесс термической обработки предусматривает гидролиз при температуре 138–143 оС и сушку. Полученную гидротермическим методом муку используют и на кормовые цели, в этом случае ее добавляют к мясокостной в количестве до 7%.
При производстве муки из малоценного пера и отходов фабрик перопуховых изделий в котел наряду с пером добавляют 2–3,5 части воды. В процессе гидролиза и сушки перопуховое сырье превращается в мягкую кашеобразную массу
серого или светло-коричневого цвета, легко растираемую пальцами. Высушенную
массу, содержащую 9–10 % влаги, выгружают в отцеживатель для отделения жира и выдерживают в течение 6–8 ч до температуры 18–20 оС, после чего дробят,
просеивают, удаляют металломагнитные примеси.
Гидротермический способ имеет преимущества: непродолжительность процесса, исключено использование химических веществ, аппаратов для очистки гидролизата от соли, не требует сложного оборудования. Но жесткие условия гидролиза разрушают некоторые незаменимые и серосодержащие аминокислоты, способствуют образованию циклопептидов, в результате чего они становятся ус-
31
тойчивыми к воздействию пищеварительных протеолитических ферментов. Поэтому продукт имеет низкую усвояемость (42–48%) животными [95]. Это обусловливает применение продуктов водного гидролиза только в качестве компонента кормовой муки [124].
Кислотный гидролиз применяют для получения аминокислот. Аминокислоты необходимы для повышения биологической ценности белковых кормов. Гидролиз проводят при температуре 115–120 оС в присутствии 28% соляной кислоты
в течение 4–6 часов. Полученный гидролизат очищают, упаривают и выделяют из
него аминокислоты.
Щелочной гидролиз осуществляют щелочами для изготовления кератинового клея, связующего материала для литейных форм, органоминеральных удобрений, пеногасителя. Гидролиз кератинсодержащего сырья в присутствии мочевины
позволяет получить кормовой белковый концентрат [75].
Существует способ получения молекулярно-растворимого кератина. Реализацию способа осуществляют с использованием воды, содержащей не более 500 мг солей в 1 дм3, для приготовления растворов, а также на всех этапах в процессе получения молекулярно-растворимого кератина, который применяют с размером частиц не
более 1 мм.
Кератинсодержащее сырье двукратно обрабатывают щелочным раствором на
основе пероксида натрия, пероксида водорода и хлорида натрия, промывают водой с
указанными параметрами и осуществляют промежуточную обработку кислотным
раствором на основе ортофосфорной и азотной кислот с последующей нейтрализацией, стабилизацией pH, гомогенизацией, фракционной очисткой, сушкой, измельчением и стерилизацией готового продукта [76].
К недостаткам щелочного гидролиза относят разрушение аминокислот цистина, метионина и цистеина, частичную их рацемизацию. При нейтрализации щелочного гидролизата образуется до 22% поваренной соли. Соли, образующиеся
при использовании ортофосфорной кислоты, придают гидролизату горький вкус
[82, 117].
32
При хранении эти соли выпадают в осадок, что затрудняет быстрое приготовление эмульсий. К другим недостаткам данного способа гидролиза кератинового сырья относятся длительность процесса, применение аппаратов для отгонки
аммиака из гидролизата и для центрифугирования, использование кислот для
нейтрализации щелочного гидролизата.
Кислотный гидролиз имеет некоторые преимущества перед щелочным: предотвращается распад аминокислоты аргинина на орнитин и аммиак, исключается
дезаминирование таких аминокислот, как серии, треонин, цистин, цистеин и метионин; интенсифицируется гидролиз сырья [127, 140].
Однако при кислотном способе разрушаются аминокислоты триптофан и
тирозин, а также некоторые из них превращаются из L-формы в D-форму, неусвояемую организмом животных [100]. Большой помехой является наличие жира в
сырье, который придает готовому продукту неприятный вкус и запах [128].
После гидролиза при нейтрализации образуется до 22% поваренной соли, которая обусловливает гигроскопичность продукта [100]. Кроме того, наличие избытка поваренной соли в кормах угнетает рост животных.
Адсорбционный метод обессоливания на ионообменных колонкахдорогостоящий и продолжительный. Для осуществления указанного способа необходимо
строительство отдельных цехов (линий), оснащенных специальным оборудованием,
что требует расширения производственных помещений и дополнительных капитальных затрат. Поэтому данный способ не нашел пока широкого применения в
мясной промышленности [100, 129].
К современным методам получения аминокислот из кератинсодержащего
сырья относится гидролиз сырья в герметичных сосудах под давлением газообразного диоксида углерода (2,5–3,0 МПа) при пониженной температуре 105°С в
течение 60–80 мин [105]. Другой способ устраняет подгорание белковых продуктов с помощью турбулизаторов [64].
Полученные гидролизаты предлагается использовать в качестве белковых
добавок в пищевой промышленности [130].
33
К числу химических способов переработки кератинсодержащего сырья относится поверхностный гидролиз под давлением в горизонтальном вакуумном
котле с использованием мочевины или сульфата натрия [76]. Сырье и воду берут
при гидромодуле 1:1–1:2,5 и вносят кристаллические мочевину или сульфат натрия из расчета 1–3 или 5% к массе сырья. Гидролиз проводят при давлении 0,2
МПа в течение 5–6 ч, затем обработанную массу сушат. В процессе гидролиза
кератинсодержащего сырья образуются высокомолекулярные пептиды, которые
хорошо связывают воду. Благодаря этому слив бульона исключается, что предотвращает потери сухих веществ. Гидролиз кератина можно проводить и 0,5–3%
раствором карбоната натрия при 10–70°С [131]. Однако гидролиз с применением
химических веществ нежелателен, так как всегда связан с очисткой продукта гидролиза от химических веществ и с использованием оборудования, специфического
для работы с такими реагентами [100].
В последнее время в связи с внедрением безотходных технологий и необходимостью обеспечения безвредности производств популярны способы деструкции непищевых отходов мясных предприятий с помощью специфических ферментов [90]. Они позволяют получить обессоленные белковые гидролизаты, не требуют жестких условий обработки, максимально сохраняют
полный набор аминокислот.
При ферментативном гидролизе максимально сохраняется питательная ценность получаемых продуктов, значительно повышаются их растворимость и усвояемость [91].Ферментативный гидролиз позволяет сохранить полный набор аминокислот, находящихся в составе белков [100].
Гидролиз ведут ферментами при температуре и рН, обеспечивающих максимальную активность используемых протеаз. Затем температуру поднимают до
уровня, необходимого для инактивации энзимов. Водный раствор отделяют от
непереработанного
твердого
остатка,
концентрируют
и,при
необходимо-
сти,высушивают.
Проведены исследования, направленные на сочетание воздействия химических компонентов, действующих на дисульфидные связи с последующим воздей-
34
ствием на кератин протеолитическим ферментом. Установлено, что комбинированный метод с применением ферментативного гидролиза позволяет получить
кормовую добавку с высоким содержанием цистина (5,18±0,14 мг/см3), метионина (0,54±0,01 мг/см3) и массовой долей белка 81,9 мг/см3 [32].
В Воронежской технологической академии разработана малоотходная
технология
получения
кормового
метионинобогащенного
препарата
из
малоценного пера птицы с применением фермента протеолитического действия –
савиназы [27].
Изначально проводят очистку пера, промывку, измельчение, затем
обработку проводят в автоклаве под давлением с использованием восстановителя
сульфита натрия. Гидролиз проводят при оптимальных условиях действия
фермента. Полученный осадок отделяют сепарированием, а затем сушат методом
распыления до влажности 5–8%. Выход препарата - до 72%. Анализ химического
состава полученного сухого гидролизата подтверждает высокую массовую долю
белка в нем – 78,03%. Порошок, получаемый в результате гидролиза, усваивается
животными на 98%.
Применение ферментных препаратов способствует созданию малоотходных
технологий, позволяет интенсифицировать технологические процессы, улучшить
качество полуфабрикатов и готовой продукции, уменьшить расход сырья на единицу выпускаемой продукции, повысить культуру производства, улучшить условия труда, уменьшить загрязненность и количество сточных вод. Очевидно, успешное решение этих производственных задач тесно связано с физикохимической и биохимической характеристикой специфических энзимов и соответствующих препаратов.
Ферментативный гидролиз кератинов приобретает большое значение в связи
с возможностью создания на его основе различных белковых добавок и гидролизатов не только кормового, но и пищевого значения. В связи с этим открытие высокоэффективных продуцентов и производство на их основе ферментных препаратов
представляет чрезвычайно актуальную задачу [110].
35
1.4 Заключение по обзору литературы и задачи исследования
В целом следует отметить, что, несмотря на распространение протеолитических ферментов в природе и высокие объемы их производства в промышленности, протеолитические ферменты с кератиназным действием требуют более детального изучения [34].
Широкие возможности для увеличения выхода ферментов и повышения их
протеолитической активности открывает генная инженерия. Генетическая инженерия является одним из важнейших направлений биотехнологии микроорганизмов. По сути, генетическая инженерия (молекулярное клонирование или технология рекомбинантных ДНК) представляет собой совокупность экспериментальных
процедур, позволяющих осуществить перенос генетического материала из одного
организма в другой. В основе этого переноса лежит встраивание нужного фрагмента ДНК (вставки) в другую молекулу ДНК (вектор), которая способна реплицироваться в соответствующей клетке – хозяине [69].
Для клонирования нужных генов в генетической инженерии используют
плазмиды – кольцевые молекулы ДНК, которые стабильно передаются потомству
бактериальных клеток независимо от хромосомной ДНК. В настоящее время появляется все больше данных о том, что наличие в бактериальных клетках плазмиды может негативно сказываться на жизнеспособности клеток, а именно, значительно замедлять клеточный метаболизм, замедлять рост бактерий, что во многих
случаях нежелательно при создании промышленных штаммов–продуцентов [88].
Несомненно, интерес к созданию нового поколения бесплазмидных штаммов-продуцентов обусловлен определенными запретами на использование плазмиды в крупных микробиологических производствах посоображениям их возможного нежелательного распространения среди микроорганизмов окружающей
среды. Кроме того, как правило, продуценты конструируются с помощью последовательных хромосомных модификаций, при которых требуется проведение
36
многократных интеграций генетического материала в бактериальную хромосому,
что вызывает ряд проблем, связанных с ограниченным набором селективных маркеров и законодательным ограничением на их применение. Поэтому усовершенствование генно-инженерного инструментария, предназначенного для конструирования бесплазмидных штаммов-продуцентов, является актуальным и практически значимым [99].
Исходя из наметившихся тенденций в современной биотехнологии, создаются бесплазмидные безмаркерные штаммы- продуценты биологически активных
веществ, образование которых является результатом скоординированной деятельности нескольких ферментов. Как правило, конструирование таких штаммовпродуцентов требует решения специфических проблем, таких как манипулирование множеством генов, поддержание индивидуального уровня экспрессии или регулируемого контроля экспрессии каждого из этих генов.
Такие штаммы конструируют с помощью последовательных хромосомных
модификаций, включающих делеции или замены небольших участков генома, а
также встраивания протяженных фрагментов ДНК с генами/ оперонами. В связи
со всем выше сказанным настоящая работа направлена на анализ полученного
нами ранее бесплазмидного природного штамма сверхпродуцента кератиназы,
используемого при переработке кераинодержащего сырья птицеперерабатывающей промышленности.
В связи с этим, целю диссертационной работы, являлось получение штамма
– суперпродуцента кератиназы для переработки кератинсодержащего сырья.
Для достижения поставленной цели сформулированы основные задачи исследований:
- исследовать генетические, фенотипические особенности и биохимические
свойства штамма Bacillus pumilus;
- изучить влияние технологических параметров культивирования на ферментные системы штамма Bacillus pumilus;
- подобрать оптимальный состав питательной среды для культивирования
штамма Bacillus pumilus;
37
- разработать рецептуру и технологическую схему получения биопрепарата
и кормовой добавки с его применением;
- изучить состав и свойства кормовой добавки;
- разработать техническую документацию на биопрепарат и кормовую добавку;
- рассчитать ожидаемую экономическую эффективность, провести
мышленную апробацию технологии.
про-
38
Глава 2. МЕТОДИКА ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ
В настоящей главе приведена схема экспериментальных работ и дана характеристика объектам и основным методам исследований.
2.1 Организация выполнения работы
Теоретические и экспериментальные исследования выполнены на кафедре
«Бионанотехнология» Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Кемеровский
технологический институт пищевой промышленности». Работа состояла из нескольких последовательных этапов, представленных на рисунке 2.1.1.
На первом этапе для формулировки цели и задач собственных исследований
проводили анализ доступной отечественной и зарубежной информации по теме
диссертационного исследования.
Второй этап исследований был связан с получением штамма микроорганизма из природного источника и идентифиция по морфологическим, культуральным
и физиолого–биохимическим свойствам, молекулярно-генетическим характеристикам.
Третий этап посвящен изучению влияния технологических параметров
культивирования на активность штамма. Изучали влияние рН среды, температуры, продолжительности процесса культивирования на концентрацию биомассы,
массовую долю белка и кератиназную активность штамма.
На четвертом этапе определяли оптимальный состав питательной среды для
культивирования штамма, с целью повышения активности продуцируемого фермента и увеличения степени гидролиза кератинсодержащего сырья.
39
Разработка технологии получения биопрепарата для переработки
керотинсодержащих отходов мясной промышленности
Анализ отечественных и зарубежных литературных данных,
формулировка цели и задач собственных исследований
Идентификация
штамма, полученного
из природного источника и изучение его
свойств
- характеристика
бактерий
- устойчивость к
антибиотикам
- сродство нуклеотидной
последовательности
- морфологические, культуральные и физиологобиохимические свойства
изучаемого микроорганизма
- молекулярногенетическая характеристика микроорганизма
Определение влияния
технологических параметров культивирования микроорганизмов на активность
фермента
- рН среды,
- температуры,
- продолжительность
процесса
культивирования
-концентрация
биомассы
- массовая доля белка
- активность кератиназы
Изучение оптимального состава питательной
среды для культивирования штамма
- активность фермента
- степень гидролиза
- концентрация
биомассы
- массовая доля белка
Разработка технологии
биопрепарата
- физико-химические
свойства
- органолептические
свойства
- усвояемость
- показатели
безопасности
- состав питательной
среды
- регламент выработок
- техническая
документация
Практическая реализация результатов исследований
Рисунок 2.1.1 – Общая схема проведения исследований
40
В дальнейшем разрабатывали технологию получения биопрепарата для переработки кератинсодержащего сырья. Для этого разрабатывали рецептуры и технологическую схему биопрепарата, изучали состав и свойства кормовой добавки.
На заключительном этапе проводили расчет экономической эффективности
технологии по получению биопрепарата для переработки перьевых отходов, и
промышленную апробацию технологии на предприятии отрасли.
2.2Объекты исследований
На разных этапах работы объектами исследований являлись:
- перопуховое сырье, полученное при переработке птицы в условиях птицефабрики ООО «Крестьянское хозяйство» Кемеровской области;
- штамм микроорганизма, полученного из природного источника (тухлого
мяса) используемый в экспериментальных исследованиях, получен в Научно образовательном центре ФГБОУ ВПО «Кемеровский технологический институт
пищевой промышленности».
В экспериментальной работе использовали следующие химические реактивы: бакто–триптон (Difco, Великобритания), дрожжевой экстракт (Difco, Великобритания);хлорид
натрия
(х.ч.),
калий-натрий
виннокислый
4-
водный(Химлабприб, Россия); питательный агар, мясопептонный агар (МПА),
мясопептонный бульон (МПБ),среда Чапека, крахмальный агар(ГНУ ВНИИМС,
Россия). Tag- полимераза, десятикратный буфер с Mg2 + (ТЕ), минеральное масло
(ЗАО Силекс, Россия);деионизованная вода MilliQ (MilliporeS.A.S, Франция);
BigDyecTerminatorv3/1 CycleSequencingKit для секвенирования (AppliedBiosystem,
CША); агароза (Helicon, Россия), тогда как бромистый этидий и бычий сывороточный альбумина (БСА) (Sigma, США);трихлоруксусная кислота (ТХУ), хлороформ, фенол, этанол, Трис-HCl буфера получены от фирмы РеаХим (Россия);праймеры (Синтол, Россия). Додецилсульфат натрия (SDS) (Serva, Герма-
41
ния), нингидрин(Вектон, Россия),ДНК-маркеры производства Сибэнзим (Россия);
набор реагентов для окраски по Граму(ЭКОлаб, Россия); исследовательский
стрип для определения метаболизма сахаровAPI 50 СН( bioMerieux, Франция).
2.3 Методы исследований
При выполнении работы использовали общепринятые, стандартные и
оригинальные методы исследования.
Отбор проб и подготовку их к анализу проводили по ГОСТ 26929.
Активную кислотность измеряли на потенциометрическом анализаторе
по ГОСТ 26781-85.
Чистую культуру бактерий Bacillus pamilus, обладающую кератиназной активностью, получали из тухлого мяса говядины. Для этого говяжье мясо, нарезанное пластинками толщиной 3–5мм,помещали в чашках Петри в термостат при
температуре 37–38Св течении суток для ускорения процесса загнивания.
Для
изучения
физиолого-биохимических
свойств
микроорганизмов
использовали:
– питательный агар, г/дм3: панкреатический гидролизат рыбной муки – 12;
пептон ферментативный – 12; натрия хлорид – 6; агар микробиологический – 10;
рН – 7,1-7,5.
–крахмальный агар, г/дм3: крахмал растворимый – 10; калия гидрофосфат –
1; магния сульфат – 1; натрия хлорид – 1; аммония сульфат – 2; кальция карбонат
–2; железа сульфат – 0,001; марганца хлорид – 0,001; цинка сульфат – 0,001; агарагар – 20.
– среду Чапека, г/дм3: сахароза – 20; калия дигидрофосфат – 1; магния
сульфат – 0,5; калия хлорид – 0,5; натрия нитрит – 2; агар-агар – 20.
Компоненты питательных сред растворяюли в 1 дм3 дистиллированной
воды, нагревали до полного расплавления агара, разливали в пробирки или колбы
42
и стерилизовали 15 мин при температуре 121ºС (питательный агар и крахмальный
агар) и 20 мин при 112 ºС (среда Чапека).
Питательные среды для культивирования микроорганизмов были приготовлены в соответствии с ГОСТ Р 51758-2001.
Перед проведением исследований штаммы микроорганизма активировали.
Для активации Bacilluspamilus использовалипитательный агар. Культивирование
микроорганизмов проводили при температуре 38С и рН среды 7,1–7,5 в течение
суток.
Культивированиемикроорганизма проводили в течение 72 ч в термостате
при температуре 30–40 ºС. Полученный посевной материал засевали на плотные
питательные среды (питательный агар, крахмальный агар, среда Чапека) методом
глубинного и поверхностного посева.
При поверхностном посеве агаризованные питательные среды разливали в
стерильные чашки Петри и после охлаждения подсушивали в термостате при
40±2ºС в течение 40–60 мин. После этого на поверхность агаровой пластины
стерильной градуированной пипеткой вносили 0,05 см3 микробной суспензии.
Для глубинного посева 1 см3 микробной суспензии вносили в стерильную
чашку
Петри,
заливалипитательным
раствором,
45±2
ºС
последующим
перемешиванием.
Дифференцировку бактерии по биохимическим свойствам их клеточной
стенки проводилис помощью метода Грама. Суть метода заключается в том, что
клеточная стенка грамположительных бактерий прочно фиксирует генцианвиолет, не обесцвечивается этанолом и потому не воспринимает дополнительный
краситель (фуксин). У грамотрицательных микробов генцианвиолет легко вымывается из клетки этанолом, и они окрашиваются дополнительным красителем.
Для получения чистых культур палочковидных бактерий использовали метод Дригальского, основанный на механическом разделении микробных клеток на
поверхности плотной питательной среды в чашках Петри.
Для определения метаболизма сахаров у исследуемого штамма использовали тест-системуAPI 50CH. Принцип работы тест-системы заключается в измене-
43
нии цвета субстрата в лунках тест-полос при смещении рН в ходе обмена веществ
микроорганизмов.
Результаты обработки секвенсов при помощи компьютерной программы,
находящейся на сайте RDBII (RibosomalDatabaseProjectII), предназначенной для
определения родства микроорганизмов и построения филогенетических деревьев,
представляются в графическом виде.
Культивирование микроорганизмов осуществляли на питательном бульоне
с добавлением различных солей: NaCI – 0,25%; КН2РО4 – 0,1%; СаСО3 – 0,3%.
Массовая доля солей была выбрана согласно имеющимся литературным данным.
По окончании культивирования культуральную жидкость отделяли от мицелия центрифугированием (3500-4000 об/мин), надосадочную жидкость - фильтрованием через фильтр «Красная лента».» В фильтрате определяли кератиназную
активность.
Для определения кератиназной активности брали 200 мг измельченных перьев (предварительно промытых хлороформом и водой, высушенных на воздухе), добавляли 10 см3 0,05 М боратного буфера рН 9,0, содержащего количество фермента, эквивалентное 0,02 единицы общей протеолитической активности (ПС). Энергично встряхивали и оставляли на 3±0,06ч при 37±2 °С для гидролиза кератина.
Параллельно проводили контрольную реакцию на растворение перьев в буфере и
содержание растворимого белка в культуральной жидкости. Количество расщепленного белка (мкг/см3) в культуральной жидкости за 1 ч гидролиза определяли по
калибровочной кривой, построенной по растворам сывороточного альбумина.По
окончании гидролиза оставшийся нерасщепленный белок осаждали раствором трихлоруксусная кислоты и фильтровали. В фильтрате измеряли оптическую плотность
при 340 нм.
Общее содержание белка определяли спектрофотометрическим методом
по стандартной биуретовой реакции согласно ГОСТ 23327-78.
Общую бактериальную обсемененность ферментного препарата рассчитывали как среднее арифметическое число колоний микроорганизмов на 1 г препарата для всех разведений.
44
Определение общего азота проводили с помощью
анализатора белка
RAPID N ELEMENTAR, в соответствии с европейскими стандартами. Принцип
метода заключается в определении азота за счет сжигания анализируемого вещества известной массы в условиях высокой температуры (900±2 °C) камеры в присутствии кислорода, что приводит к высвобождению углекислого газа, воды и
азота, массовая доля которого детектируется прибором.
Содержание общего белка рассчитывали умножением общего азота на пересчетный коэффициент для микробного белка, составляющий 6,25.
Содержание влаги определяли по ГОСТ Р 52838-2007.
Содержание сырого протеина определяли по ГОСТ 13496.4-93.
Определение аминного азота проводили спектрофотометрическим методом
с использованием 2,4,6-тринитробензолсульфоновой кислоты (ТНБС). Метод основан на спектрофотометрическом определении хромофоров, образующихся при
реакции первичных аминов с ТНБС. Количество аминного азота в исследуемых
гидролизатах определяли по калибровочному графику, построенному для стандартных разведений известного вещества. Степень гидролиза определяли как отношение аминного азота к общему азоту.
Определение аминокислот проводили с помощью автоматического анализатора аминокислот AracusPMAGmbH, утвержденного директивами 98/64/ЕС и
2000/45/ЕС. Принцип метода состоит в катионообменном разделении аминокислот с шаговым градиентом pH и послеколоночной дериватизацией нингидрином.
Для этого образцы предварительно подвергали кислотному (6 н. соляная кислота,
температура 110°С, в течение 24–72 ч) или ферментативному гидролизу.
Для математической обработки результатов исследований использованы
методы регрессионного анализа с применением многофакторного планирования,
градиентного метода и метода наименьших квадратов, линейного программирования. Графические зависимости на рисунках представлены после обработки экспериментальных данных по методу наименьших квадратов, реализованные в
MicrosoftExcel и MatLAB 6.5.
45
Для определения активности микроорганизмов в центрифужную пробирку отмеряли 1 см3 сыворотки и 1 см3трихлоруксусную кислоту (ТХУ) 10%, перемешивали, закрывали пробкой и кипятили 20 мин на водяной бане. Далеецентрифугировали в течении 20 ±2 мин при скорости 1500 об/мин. 0,4 см3 центрифугата помещали в мерные пробирки и прибавляли 4 см3 фосфатного буфера (рН=6,8) и 0,5 см3 1% водного раствора нингидрина. Содержимое пробирки
перемешивали и ставили в кипящую водяную баню. После появления лилового
и фиолетовому цвета раствора пробирки охлаждали и доводили объем дистиллированной водой до 7 см3. Колориметрировали при зеленом светофильтре в
кювете шириной слоя 5 см3. Норма составляет 2,96 ± 0,1 мг%.
Определение активности ферментных препаратов. Анализ проводили с
ферментными препаратами после инактивации клеток ультразвуком и фосфатным буфером 0,01 мг ферментного препарата разводили в 1 см3 воды, приливали 1 см3 субстрата. Проводили определение с добавлением ТХУ и без добавления.
С добавлениемТХУ, брали 400 мм3 смеси фермента с субстратом, приливали 400 мм3 ТХУ. Далее из этой смеси брали 100 мм3 и добавляли 400 мм3
фосфатного буфера.
Для проведения реакции без добавления ТХУ к 100 мм3 смеси фермента с
субстратом добавляли 400 мм3 фосфатного буфера, приливали 200 мм3 1% водного раствора нингидрина. Содержимое пробирки перемешивали и ставили в
кипящую водяную баню. После изменения окраски от буровато-грязного цвета
до лилового и фиолетового, пробирки охлаждали, колориметрировали при зеленом светофильтре в кювете шириной слоя 5 см3.
Выделение хромосомальной ДНКпроводили экспресс методом в холодной
комнате. Для этого отбирали 200мм3ночной культуры, центрифугировали 5 минсо
скоростью 5 000об/мин, отделяли супернатант. С последующими промыванием
осадока растворомPBS 200мм3 и центрифугированиемсо скоростью 12000об/мин
в течение 2 мин. Удаляли супернатант, к осадку добавляли деанизированную водуи размешивали на вортексе в течение 20 сек. Далее добавляли 40 мм3 смеси фе-
46
нола и хлороформа и 4 мм3SDS 10%, тщательно перемешивали на вортексе в течении 20 сек . Осаждали центрифугированием. Отбирали верхнюю водную фазу и
переносилив чистый эпендорфф. Хранили выделенную ДНК в холодильной камере на -20.
Полимеразную
цепную
реакцию
проводили
на
приборе
GeneAmpPCRSystem 2400. Температурный режим подбирали с учетом длины
амплифицированного фрагмента, вида используемых праймеров. Выделение и
очистку ПЦР продуктов проводили с использованием
набора Geneclean и
GFXTMPCRDNAandGelBandPurificationKit (Fisher Scientific, США). Присутствие
соответствующих мутаций проверяли секвенированием по методу Сэнгера.
Электрофорез в агарозном геле проводили следующим образом: навеску
агарозы массой 1,5г помещали в термостойкую колбу, заливали 150 мл трисборатного буфера (трис-(оксиметил)-аминометан 4,5 мМ, борная кислота 4,5 мМ,
ЭДТА 1 мМ, этидия бромид 15 мм3), доводили до кипения, охлаждали до 65-70°С
и заливали в форму, так чтобы толщина геля была 0,5 см, формировали лунки.
Застывший гель помещали в камеру для горизонтального электрофореза. Камеру заливали трис-боратным буфером. На дно лунок вносили по 10мм3 продуктов реакции амплификации и 3 мм3 краски-лидера, подключали камеру к источнику тока, соблюдая полярность. Проводили электрофорез при напряжении
равном 10 В/см не менее 60 мин. Результаты электрофореза визуализировали облучением геля ультрафиолетовым светом на трансиллюминаторе.
Молекулярно-массовое распределение белков и пептидов оценивали с помощью электрофоретическим методом Лэмли. Для разделения белка использовали денатурирующий полиакриламидный гель (12% разделяющий и 4% фокусирующий) с 0,1% SDS-Na (додецилсульфат натрия).
Визуализацию гелей проводили на УФ-трансиллюминаторе TCP-20M при
длине волны излучения 312 нм. Сохранение и обработку данных осуществляли с
помощью гель-документирующей системы BioRad.
Метод определения общей кислотности состоит в рН-метрическом титровании водной вытяжки пробы комбикорма или комбикормового сырья раствором
47
калия гидроксида до pH 8,20 и последующим расчетом общей кислотности, исходя из объема израсходованной на титрование щелочи, и определения градуса
Неймана.
Реактивы: калия гидроксид (х. ч.) по ГОСТ 24363 или стандарт-титр (использование
натрия
гидроксида
недопустимо); вода
дистиллированная;
бумага фильтровальная. Оборудование: ионометр ЭВ-74; электрод стеклянный
лабораторный ЭСЛ-63-07 для измерения лри температуре от 25 до 100 °С; электрод сравнения хлорсеребряный насыщенный образцовый 2-го разряда; термокомпенсатор ТКА-7; термометр 1-63 ТЛ-2; мешалка магнитная ММ-3; мельница
лабораторная МРП или другие аналогичных марок; сито с отверстиями диаметром 1 мм; ступка фарфоровая с пестиком; ножницы; весы лабораторные 2-го
класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г; набор гирь; колбы
мерные вместимостью 25 и 1000 см исполнений 1-го, 2-го класса точности; колба
мерная вместимостью 500 см ; стакан химический вместимостью 50 см3 или 100
см3; цилиндр мерный вместимостью 250 см 2-го класса точности; пипетки градуированные вместимостью 1 и 10 см 2-го класса точности; воронки стеклянные
диаметром
36—56
мм;
палочка
стеклянная
длиной
15—20
см.
Подготовка к анализу. Из средней пробы отбирают около 100 г комбикорма или
комбикормового сырья, тщательно измельчают на мельнице и просеивают через
сито с отверстиями диаметром 1 мм.
Электроды стеклянный лабораторный и сравнения хлорсереб- ряного насыщения готовят к работе в соответствии с паспортами на них. После каждого
измерения электроды промывают дистиллированной водой и осушают фильтровальной бумагой. Хранят их в дистиллированной воде.
Ионометр ЭВ-74 к работе в режиме рН-метра готовят в соответствии с паспортом.
Для приготовления раствора калия гидроксида концентрации с(КОН) = 0,1
моль/дм3 навеску реактива массой 5,611 г переносят в мерную колбу вместимостью 1000 см , растворяют в дистиллированной воде, старательно перемешивают
и доводят до метки. Допускается приготовление раствора из фиксанала.
48
Для определения коэффициента поправки раствора калия гидроксида около 80 см
этого раствора переносят в стакан вместимостью 100 см , куда опускают электродную пару, и при постоянном перемешивании на магнитной мешалке измеряют pH.
Навеску исследуемого продукта массой 26 г помещают в оухую коническую
колбу вместимостью 500 см3, приливают 250 см7 дистиллированной воды и, закрыв колбу пробкой, взбалтывают непрерывно в течение 10 мин. 25 см3 полученной таким образом суспензии через воронку отливают по стеклянной палочке в
мерную колбу на 25 см3. Содержимое колбы количественно переносят в стакан
вместимостью 50 или 100 см3, куда опускают электродную пару. При постоянном
перемешивании на магнитной мешалке к суспензии пипеткой по каплям добавляют раствор калия гидроксида концентрации с(КОН) = 0,1 моль/дм3 до тех пор,
пока pH не достигнет значения 8,2. Используют пипетку вместимостью 10 см3,
если pH суспензии меньше 6,0, или 1 см3, если pH суспензии больше 6,0.
Расчет проводили по формуле 3.3.1:
Х=4*V*K
(1)
Где 4 – коэффициент пересчета на 100 г продукта;
V- объём раствора гидроксида калия, израсходованного для достижения рН 8,20
см; V= 0,29
К- коэффициент поправки раствора гидроксида калия; К=0,31
Х = 4* 0,29*0,31=0,36
(2)
49
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Исследования данной главы направлены на идентификацию штамма микроорганизма, полученного из природного источника, и изучение его свойств; изучение влияния технологических параметров на кератинолитическую активность
микроорганизмов; оптимизацию состава питательной среды для культивирования
штамма.
3.1. Идентификация штамма, полученного из природного источника,
и изучение его свойств
С целью идентификации микроорганизмов использовали основные фено-и
генотипические характеристики. Данные характеристики направлены на установление таксономического положения и, прежде всего, видовой принадлежности
микроорганизма, наиболее важного аспекта микробиологической диагностики.
Для изучения фенотипических свойств использовали визуальный метод и
метод микроскопирования. Анализировали форму, размер клеток, характер контура края, рельеф, поверхность, цвет структуру, консистенцию колоний.
При посеве штамма на плотную питательную среду при оптимальной температуре культивирования 37С и рН среды 7,3 бактерии образовали плоские,
круглые, неправильной формы колонии с волнистыми краями, рельефные, шероховатые телесного цвета. Консистенция колоний сухая, плотная с белым зернистым налетом, легко снимается с агара. Палочкообразные бактерииразмером 1,7–
3×4,0–0,6 мкм при выращивании на обогащенной среде имеют вид толстых,
больших палочек, иногда расположенных в цепочках. Палочки подвижны за счет
перетрихиальных жгутиков, грамположительные. Культура образует эллипсоид-
50
ные или цилиндрические споры размером 1,0–1,5×0,6–0,9 мкм.Полученные результаты представлены в таблице 3.1.1.
Таблица 3.1.1- Характеристика фенотипических свойств микроорганизмов выделенных из мяса
Фенотипические свойства
Показатели
Размер, мкм
Форма
1,7–3×4,0–0,6
Палочкообразная,форма спорэллипсоидные или цилиндрические
Характер контура края
Волнистые, неправильной формы
Рельеф
Рельефные
Поверхность
Шероховатые
Цвет
Поверхность телесного цвета
Структура
Узорчатая, зернистая
Консистенция
Колония сухая, плотная с белым зернистым налетом, легко снимается с агара
Данные, представленные в таблице 3.1.1, свидетельствуют о том что, микроорганизмы, полученные из мяса, близки по фенотипическим показателям с
бактериям рода Вacillus.
С целью анализа изученного штамма по биохимическим свойствам использовали стандартизированные тест-системы API 50 CHB с программным
обеспечением идентификации Аpiweb производства ВioMerieux (Франция).
Данная тест-система включает 50 биохимических тестов по изучению углеводного обмена микроорганизмов и предназначена для идентификации бацилл, энтеробактерий и вибрионов. Полученные результаты представлены в
таблице 3.1.2.
51
Таблица 3.1.2 - Результаты биохимического тестирования микроорганизмов рода
Bacillus
№п/п
Название
Результаты
теста штамма
№
Название
Результаты
теста штамма
1
Глицерол
+
26
Салицин
+
2
Эритрит
-
27
Целлобиоза
+
3
D-арабиноза
-
28
Мальтоза
+
4
L-арабиноза
+
29
Лактоза
-
5
Рибоза
+
30
Мелибиоза
-
6
D-ксилоза
+
31
Сахароза
+
7
L-ксилоза
-
32
Трегалоза
+
8
Рибит
-
33
Инулин
-
9
β-метил -
-
34
Мелицитоза
-
ксилозид
10
Галактоза
-
35
D-рафиноза
-
11
D-глюкоза
+
36
Крахмал
+
12
D-фруктоза
+
37
Гликоген
+
13
D-маноза
+
38
Ксилит
-
14
L-сорбоза
-
39
β-генцибиоза
-
15
Рамноза
-
40
D-тураноза
-
16
Галактит
-
41
D-ликсоза
-
17
Инозитол
+
42
D-тагатоза
+
18
Манитол
+
43
D-фукоза
-
19
Сорбитл
+
44
L-фукоза
-
20
α-метил -D-
-
45
D-арабит
-
манозид
52
Продолжение таблицы 3.2.1
№п/п
21
Название
Результаты
теста штамма
α-метил -D-
№
Название
Результаты
теста штамма
+
46 L-арабит
-
-
47 Глюконат
-
+
48 2-кето-
-
глюкозид
22
N-ацетил глюкозоамин
23
Амигдалин
глюконат
24
Арбутин
+
49 5-кето-
-
глюконат
25
Эскулин
+
50 Контроль
-
Данные, представленные в таблице 3.1.2, свидетельствуют о том, что грамположительные
палочки ферментировали глицерол, L- арабинозу, рибозу, D-
ксилозу, D-глюкозу, D-фруктозу, D-маннозу, инозитол (циклогексан-1,2,3,4,5,6гексол),маннитол,сорбитол(глюцит),α- метил-D – маннозид, амигдалин,арбутин
(бета-D-глюкопиранозид),эскулин, салицин. Бактерии обладали способностью
вырабатывать
целлобиозу
(4-(β-глюкозидо)-глюкоза),мальтозу,
сахаро-
зу,трегалозу, крахмал, глюкоген,туранозу. Данные биохимические характеристики соответствуют виду Bacillus licheniformis на 98%, а тест на вид Bacillus subtilis
показал принадлежность у таксона данного микроорганизма на 1,1%.
Таким образом, стандартизированные тест-системы API 50 CH и API 20 позволили провести комплекс биохимических исследований и определить видовую
принадлежность грамположительных палочек рода Bacillus, выделенных из говяжьего мяса.
Дальнейшие исследования направлены на изучение резистентности исследованного штамма к антибиотикам.Истинная природная устойчивость характеризуется отсутствием у микроорганизмов мишени действия антибиотика или недос-
53
тупности мишени вследствие первично низкой проницаемости либо ферментативной инактивации. Природная резистентность является постоянным видовым
признаком микроорганизмов и легко прогнозируется. В связи с этим установление резистентности микроорганизмов является актуальным, так как даст возможность упростить работы со штаммом в производственных маштабах.
Провели анализ устойчивости к антибиотикам. Для анализа на устойчивость
изучаемого штамма к антибиотикам использовали антибиотики следующего наименования: хлорамфеникол, стрептомицин, тетрациклин, канамицин, пеницилин.
Результаты исследования представлены в таблице 3.1.3.
Таблица 3.1.3 - Показатели антибиотической устойчивости Bacillus
Наименование антибиоти-
Концентрация
Зона ингибирования
ка
антибиотика, %
роста бактерий, R,см
1
Хлорамфеникол
0,4
1,5
2
Стрептомицин
0,4
1,3
3
Тетрациклин
0,4
2,5
4
Канамицин
0,4
2,2
5
Пенициллин
0,4
1,7
6
Лизоцим
0,4
0,3
7
Контроль
0
-
№п/п
Как видно из таблицы 3.1.3, микроорганизмы не обладают природной устойчивостью к пяти представленным антибиотикам, так как радиус зоны ингибирования составляет от 1,3 до 2,5 см. Однако микроорганизмы проявляют переменную устойчивость к антибиотику лизоцим, на третьи сутки зона ингибирования составляет 0,3 см, а на 7-е сутки полностью исчезает и культура свободно
54
растет на плашке с антибиотиком лизоцим. По результатам исследований можно
сделать вывод о том, что культура обладает устойчивостью к антибиотику лизоцим, который на ранних стадиях развития культуры снижает скорость развития,
но не ингибирует данный штамм.
Далее провели генетическую идентификацию штамма Bacillus до вида с
помощью анализа генов, кодирующих 16S РНК.
При секвенировании вариабельных участков генов, кодирующих 16S
рРНК, получена следующая нуклеотидная последовательность для исследуемого штамма:
AATGACCCTACCCCTGTTGAGCCGGGGGCTCTTCAGCATCAGACTTAAGAA
ATCCGCCTGCGAGCCCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCT
ACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGT
ACCGTCAAGGTGCGAGCAGTTACTCTCGCACTTGTTCTTCCCTAACAACAGA
GCTTTACGATCCGAAAACCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACT
TTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCC
GTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGT
CGCCTTGGTGAGCCATTACCCCACCAACTAGCTAATGCGCCGCGGGTCCATC
TGTAAGTGACAGCCGAAACCGTCTTTCATCCTTGAACCATGCGGTTCAAGGA
ACTATCCGGTATTAGCTCCGGTTTCCCAGAGTTATCCAGTCTTACAGGCAGG
TTACCACGTGTTACTCACCCGT
Молекулярный вес нуклеотидной последовательности рассчитывали в программе Mongo-Oligo (http://mods.rna.albany.edu/masspec/Mongo-Oligo):
Средняя масса
5'OH - RNA[541mer] - 3'OH
C:172T:136 A:108 G:125
Молекулярная масса
M =174682.036 Да
55
Рисунок 3.3.1–Филогенетическое дерево первичного скрининга
56
Дальнейшие исследования направлены на анализ результатов секвенирования и построение дерева родства.
Первичный скрининг по базе данных GenBank и RDP-II показал, что исследуемый штамм принадлежит к следующим систематическим группам Bacteria;
Firmicutes; Bacilli; Bacillales;Bacillaceae; Bacillus. Филогенетическое дерево представлено на рисунке 3.3.1.
Для идентификации поиск гомологичных последовательностей осуществляли с помощью программы BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
Аминокислотные последовательности сравнивали с помощью функции
ClustalWMultiplealignment в программе BioEdit Seguence Aligment Editor 7.0.9.1
(США).
Последовательности выравнивали с соответствующими последовательностями ближайших видов бактерий, доступными из базы данных GenBank, результаты представлены в таблице 3.1.4.
Таблица 3.1.4. - Последовательности ближайших видов бактерий
Скор
№ Последовательности
в
Скорв
NSB RDBII
I
S000012241
0,973 0,779
Дли-
Последо-
на
ватель-
Род,вид
участка
1440
ность в
NSBI
Bacillus
Последовательность в
RDBII
AB021198
DSM11031
AJ831842
type
vallismortis (T)
S000417318
0,985 0,873
1415
Bacillus
altitudinis (T)
S000428475
S000458519
0,973 0,771
0,990 0,917
1337
1354
Bacillus
strain:41KF2b
AF074970
NRRL
subtilis (T)
B-23049
Bacillus safensis AF234854
FO-036b
(T)
57
Продолжение таблицы 3.1.4
Дли-
Последователь-
№ Последо- Скорв
Скорв
на
вательности
RDBII
уча-
NSBI
Род,вид
стка
S000481068
S000644546
0,990
0,975
0,917
0,832
1352
1372
ность в
NSBI
Последовательность в
RDBII
Bacillus
ATCC
pumilus (T)
7061
Bacillus
AY904033
SMC 4352-2
AB255669
NBRC 15535
AJ831841
type
AY876289
idriensis (T)
S000734915
0,973
0,775
1389
Bacillus
amyloliquefac
iens (T)
S001014161
0,985
0,875
1443
Bacillus
stratosphericu
strain:41KF2a
s (T)
S001014162
0,985
0,875
1443
Bacillus
AJ831844
aerophilus (T)
S001239910
0,975
0,775
1355
Bacillus
type
strain:28K
EU194897
CBMB205
methylotrophi
cus (T)
В таблице 3.1.4. представлены последовательности ближайших видов бактерий, наибольшее совпадение длины участка наблюдается у Bacillusvallismortis,
однако если рассматривать показания поскорув NSBI то наиболее близкими
BacillussafensisиBacilluspumilus.Дальнейший анализ по RDPII 16S рРНК базе данных показал гомологию с теми же видами бактерий.
По данным анализа было построено филогенетическое дерево с гомологичными штаммами (рисунок 3.1.2).
58
Рисунок 3.1.2–Филогенетическое дерево гомологичных штаммов
Критерием отнесения микроорганизма к тому или иному виду считается гомология не менее 97%. По этому критерию исследуемый штамм можно отнести к
нескольким видам рода Bacillus.
Анализ филогенетического родства, построенный с использованием типовых штаммов близкородственных бактерий, показал, что наиболее близкими к исследуемому штамму являются виды Bacillus pumilus и Bacillus safensis.
По результатам проведенного анализа секвенсов вариабельных участков генов, кодирующих 16S рРНК, тестируемый штамм наиболее близок к видам Bacillu
spumilus и Bacillus safensis (99%).
С учетом культурально-морфологических и биохимических свойств штамм
полученный из природного источника, относится к родуBacillus, а генетический
анализ позволил определить на 99 % вид микроорганизма, учитывая проведенные
исследования и особенности штаммф, его можно идентифицировать как Bacillus
pumilus.
3.2. Изучение влияния технологических параметров культивирования
на кератинолитическую активность Bacillus pumilus
До недавнего времени процесс культивирования микроорганизмов считался
довольно простым, проходящим через ряд принципиально общих стадий и приводящим к получению из малого количества посевного материала необходимого
59
количества биомассы или продуктов метаболизма. Однако с развитием и распространением биотехнологических методов процесс культивирования стал индивидуальным для каждого вида микроорганизмов. Правильно подобранные технологические параметры - залог успеха при культивировании микроорганизмов. К
числу технологический факторов, оказывающих воздействие на микроорганизмы,
относятся температура, состав питательной среды, рН. В зависимости от варьирования технологических параметров можно достичь высокой скорости роста микроорганизмов и наработку метаболитов.
С целью ориентирования оптимальных условий проводили
анализ при
стандартных параметрах с отсутствием регулирования pH (при избытке субстрата,
температуре 37±2 º С), результаты представлены в таблице 3.2.1.
Таблица 3.2.1- Показатели ферментативной активности штамма Bacillus pumilus
при стандартных условиях
Продолжительность
культивирования
2
4
6
22
24
26
28
30
31
32
Bacillus pumilus
Концентрация
аминокислот мг/мл
0,457
2,367
2,136
4,325
3,265
3,563
4,686
4,429
5,81
4,981
Оптическая
плотность
0,012
0,064
0,057
0,116
0,088
0,096
0,126
0,119
0,156
0,134
Степень гидролиза,
%
0,26
1,38
1,24
2,52
1,90
2,08
2,73
2,58
3,38
2,91
Полученные данные могут использоваться для контроля подбора оптимальных условий, так как изменение параметров может, как усилить ферментативную
реакцию, так и уменьшить ее активность.
Поскольку реакция гидролиза эндотермическая, то повышение температуры
смещает равновесие в системе вправо, степень гидролиза возрастает, в связи с
60
этим изменение температуры будет влиять на скорость реакции. Температура является одним из важнейших факторов культивирования микроорганизмов. Она
может, как ускорить рост микроорганизмов, прирост биомассы, продуцирование
белка, так и снизить. Выбор оптимума температуры позволяет с высокой эффективностью проводить накопление необходимого продукта.
Обработка клеток ультразвуком широко применяется, особенно для разрушения бактериальных клеток. Однако в данном случае необходимо подобрать режим ультразвуковой обработки, не вызывающий инактивации фермента. Разрушение клеток ультразвуком происходит в результате микроколебаний суспензии,
помещенной в стеклянный стакан с излучателем ультразвуковых волн.
Ультразвук создает высокую степень вибрации суспензии, вследствие чего
происходит механический разрыв клеток. Следует контролировать уровень пенообразования и перемешивать при обработке, поскольку интенсивное пенообразование вызывает денатурацию белков в образующихся тонких пленках на разделе
фаз жидкость/газ.
Для разрушения бактерий чаще всего используют излучатель на 22 кГц. При
выбранном значении облучают суспензию клеток (1 г сырой биомассы и 5 мл
среды разрушения) последовательно 6–10 раз с интервалами в 30 с при промежуточном охлаждении излучателя и суспензии в воде со льдом. Полученные клетки
затем осаждают на скоростной центрифуге (примерно 20 тыс. об/мин в течение
10–15 мин при 4 оС).
Для определения оптимальных температурных параметров и их влияния на
активность микроорганизмов проводили спектрофотометрическое исследование
при разных температурах. Выбранные для исследования температурные параметры составили диапазон от 30 до 50°С. Культивирование проводили в течение 12 ч.
После завершения культивирования определяли активность до и после разрушения клеточной стенки на ультразвуковой установке. Полученные результаты
представлены в таблице 3.2.2.
61
Таблица 3.2.2 – Кератинолитическая активность штамма Bacillus pumilus в зависимости от температурного режима
Температура, °С
30
37
40
45
50
разрушения
11,76
14,43
17,46
14,05
28,47
Активность после разрушения
12,91
15,19
18,22
15,19
28,85
Активность
до
ультразвуком, Е/мг
ультразвуком, Е/мг
В результате анализа данных, представленных в таблице 3.2.2, можно сделать
вывод о том, что при температуре 50°С накопленный микроорганизмами фермент
кератиназа наиболее активен (28,47 Е/мг), а при 45°С его активность падает
до14,05Е/мг. Сравнение показателей активности с воздействием ультразвуком и
без него показало, что наибольшее значение активности наблюдается при температуре 50°С. Данный факт, очевидно, связан с тем, что фермент продуцируется
микроорганизмами в культуральную жидкость и не накапливается в больших количествах внутри клетки.
Оптимальная концентрация водородных ионов способствует развитию микроорганизмов, так как только при оптимальной реакции среды, влияющей на проницаемость оболочки, микроорганизмы могут усваивать питательные вещества.
Культивирование проводили 12 ч при 37°С. В ходе исследований параметры
рН варьировали от 5,0 до 12,0 с шагом 1,0. Активность определяли до и после
разрушения клеточной стенки ультразвуковой установкой. Полученные результаты представлены в таблице 3.2.3.
В результате анализа данных, представленных в таблице 3.2.3,можно сделать
вывод о том, что оптимальным диапазоном рН среды для культивирования является 7,0–8,0.
62
Таблица 3.2.3–Кератинолитическая активность штамма Bacillus pumilusв зависимости от рН питательной среды
pH питательной среды
Наименование
Активность
до
5,0
6,0
7,0
8,0
9,0
10,0
11,0
12,0
9,50
10,25
12,15
12,53
11,77
10,63
8,73
7,21
10,63
10,63
12,91
13,29
13,67
12,53
10,25
8,73
разру-
шения
ультразвуком, Е/мг
Активность
после
раз-
рушения
ультразвуком, Е/мг
В данном диапазоне происходит максимальная активация фермента и его накопление в культуральной жидкости. Как видно из таблицы 3.2.3 значение рН 10–
12 блокирует проницаемость стенки, и развитие микроорганизмов затормаживается, вследствие чего, соответственно продуцирование фермента усложняется.
Одним из важных факторов процесса глубинного культивирования микроорганизмов является перемешивание культуральной жидкости, способствующее
равномерному распределению растворенных компонентов питающего субстрата,
кислорода и продуктов метаболизма по всему объему аппарата. В результате оптимизации этого параметра может быть значительно повышена производительность процесса и снижены энергетические затраты.
Скорость оптимального перемешивания культуральной жидкости с микроорганизмами в процессе их роста выбирали в зависимости от активности фермента,
прироста биомассы и степени пенообразования.
63
Для изучения выбрали три скорости перемешивания 50, 100, 150 об/мин.
Культивирование проводили при температуре 37± 2° С, изучали скорость прироста биомассы, белка и активность фермента. Полученные данные представлены на
рисунке 3.2.1.
а
б
в
Рисунок 3.2.1–Изменение показателей при варьировании скорости
перемешивания
64
Данные, представленные на рисунке 3.2.1, свидетельствуют о том, что культура Bacillus pumilus адекватно реагирует на различные условия перемешивания
питательной среды. В результате анализа данных можно сделать вывод о том, что
при скорости перемешивания 100 об/мин накопленный микроорганизмами фермент кератиназы наиболее активен и прирост биомассы идет равномерно во всем
объеме питательной среды. При 150 об/мин его активность падает до 12,89Е/мг,
помимо этого происходит стойкое интенсивное пенообразование. Данный факт,
очевидно, связан с необратимыми механическими повреждениями клеток культуры. При 50 об/мин происходит адекватное накопление биомассы и активность
фермента составляет 14,12Е/мг. Однако в процессе культивирования происходит
плотное налипание биомассы на стенки сосуда и микроорганизмы развиваются
неравномерно. Можно сделать вывод о том, что оптимальный диапазон скорости
перемешивания для микроорганизма составляет от 50 до 100 об/ мин.
3.3. Подбор оптимального состава питательной среды для культивирования штамма Bacillus pumilus
Варьируя состав питательной среды, можно влиять на скорость роста микроорганизмов, а также на активность фермента и скорость его продуцирования в
процессе роста микроорганизмов.
В начале эксперимента были выбраны наиболее доступные источники углерода и азота, которые входят в состав питательных сред: мясо-петонный бульон,
среда Чапека, среда LB.
В ходе исследований варьировали источники азота (пептон, сульфат аммония, дрожжевой экстракт) и углерода (глюкоза, лактоза, фруктоза, сахароза, сорбит). Варьировали как состав питательных сред, так и процентное соотношение
вносимых компонентов. Состав питательных сред представлен в таблице 3.3.1.
65
Таблица 3.3.1 - Состав ферментационных питательных сред
Компонент
Массовая доля, г/ дм3
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Пептон
12
12
12
12
-
-
-
-
-
-
-
-
Триптон
-
-
-
-
12
12
12
12
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
12
12
12
12
12
12
12
12
-
-
-
-
12
12
12
12
NaCl
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
CaCl2,
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Сахароза
12
-
-
12
-
-
-
12
-
-
-
D-глюкоза
-
10
-
-
-
10
-
-
-
10
-
-
D-фруктоза
-
10
-
-
-
10
-
-
-
10
-
Сорбит
-
-
10
-
-
-
10
-
-
-
10
Дрожжевой
экстракт
Панкреатический гидролизат
-
Выбор питательной среды проводили по активности кератиназы при культивировании микроорганизма в условиях 37±2°С в течение 4, 8 и 12 ч. Результаты
исследований представлены в таблице 3.3.2.
В результате анализа данных, представленных в таблице 3.3.2,можно сделать
вывод о том, что оптимальным составом питательной среды для культивирования
Bacillus pumilus является среда под №7, в состав которой входит фруктоза, хлорид
кальция, хлорид натрия и триптон.
При культивировании на данной среде достигается максимальная активность
фермента и его накопление в культуральной жидкости. Как видно из таблицы
3.3.2 использование триптона как источника азота способствует повышению активности фермента.
66
Таблица 3.3.2 – Кератинолитическая активность штамма Bacillus pumilus в зависимости от состава ферментационных сред
Показатели активности, Е /мг белка
Номер состава
питательной среды
при продолжительности культивирования, ч
4
8
12
1
1,330
4,820
8,692
2
4,593
10,970
12,185
3
6,339
12,564
14,690
4
3,378
4,555
8,882
5
3,378
5,200
11,425
6
5,048
11,274
12,792
7
6,263
13,020
17,841
8
3,871
7,933
12,109
9
1,214
4,099
8,085
10
6,111
9,641
13,589
11
5,086
10,552
14,310
12
1,290
3,720
7,326
Использование сорбита, наоборот, снижает эффективность накопления
фермента и его наработку. Данный факт, очевидно, связан с тем, что при добавлении сорбита происходит изменение метаболических процессов в клетке и продуцирования фермента кератиназы.
67
Дальнейшие исследования направлены на подбор оптимальной концентрации фруктозы в питательной среде, для этого ее содержание изменяли от 5 до 20
г/дм3 с шагом 5 г/дм3. Контроль и выбор оптимальной концентрации фруктозы
определяли по показателям прироста биомассы, белка и активности. Полученные
данные представлены в таблицах 3.3.3 –3.3.5.
Таблица 3.3.3 - Накопление белка микроорганизмов Bacillus pumilum в зависимости от концентрации фруктозы в питательной среде
Содержание белка, мг/дм3
Массовая доля
фруктозы, г/ дм3
при продолжительности культивирования, ч
4
8
12
5
321,886
344,607
375,779
10
189,607
217,041
222,865
15
144,738
190,287
171,905
20
102,937
127,452
148,033
Из таблицы 3.3.3 видно, что наибольшее содержание белка наблюдается при
массовой доле фруктозы 5 г/дм3 в течение четырех часов культивирования. Также
анализ результатов показал, что с увеличением продолжительности времени
культивирования наблюдается увеличение содержания белка при концентрации
фруктозы 5 г/дм3 .
При увеличении массовой доли фруктозы в питательной среде происходит
снижение содержания белка среднем в два раза при концентрации 10 и 15 г/ дм3 и
в три раза при использовании 20 г/ дм3 фруктозы.
Следовательно, целесообразно внесение наименьшей концентрации фруктозы в состав питательной среды.
68
Таблица 3.3.4 - Накопление биомассы микроорганизмов Bacillus pumilus в зависимости от концентрации фруктозы в питательной среде
Содержание биомассы, г/дм3
Массовая доля
фруктозы, г/дм
при продолжительности культивирования, ч
3
4
8
12
5
1,655
1,716
1,837
10
1,213
1,196
1,183
15
0,491
0,876
1,228
20
0,456
0,950
1,118
При анализе данных таблицы 3.3.4 можно сделать вывод, о том что интенсивный прирос биомассы наблюдается при концентрациях фруктозы 5 и 10 г/дм3,
это в 2 раза больше, чем при концентрации 15 и 20 г/дм3.Полученные данные свидетельствуют о том, что при сравнении показателей прироста биомассы наибольшее значение имеет микроорганизм, развивающийся при концентрации фруктозы
5 г/дм3. Однако целесообразно проанализировать показатель активности фермента
при тех же концентрациях (таблица 3.3.5).
В результате анализа данных, представленных в таблице 3.3.5, можно сделать вывод о том, что при концентрации фруктозы 5 г/дм3 микроорганизмы продуцируют наиболее активный фермент, активность которого составляет 24,13
Е/мг через 12 часов культивирования.
При концентрации фруктозы 10 г/дм3 активность кератиназы снижается через 12 часов до 19,013 Е/ мг. Также наблюдается снижение кератинолитической
активности при концентрации фруктозы 15 и 20 г/дм3. Таким образом, можно
сделать вывод о том, что оптимальная концентрация фруктозы в ферментационной среде должна составлять 5 г/дм3.
69
Таблица 3.3.5 – Кератинолитическая активность штамма Bacillus pumilus в зависимости от концентрации фруктозы в питательной среде
Активность кератиназы, Е /мг
Концентрация
фруктозы г/ дм3
при продолжительности культивирования, ч
4
8
12
5
9,387
18,512
24,134
10
8,206
17,972
19,013
15
7, 519
14,018
18,398
20
6,284
12,978
17,913
Аэрация является неестественным фактором, который определяет рост и
развитие микроорганизмов в процессе культивирования. Параметры аэрации для
каждого вида микроорганизмов определяются в соответствии с особенностями
развития, состава питательной среды, продолжительности культивирования и т.д.
Аэрация – это процесс поступления воздуха в питательную среду, который
позволяет ускорить процесс окисления органических веществ в питательной среде, повышая их усвояемость для микроорганизмов, так как кислород является основным лимитирующим фактором при культивировании.
Принцип аэрации состоит в том, что атмосферный воздух проходит несколько степеней очистки под давлением, далее поступает в виде мелких пузырьков в питательную среду. Такой метод применяют при глубинном культивировании, для стимуляции роста аэробов скорость поступления кислорода должна быть
не меньше скорости его потребления.
Культуру микроорганизмов высеивали в жидкую питательную среду объемом 5 дм3 в биореактор, подключали датчики насыщения кислородом, создавали
оптимальные условия и задавали среднюю фиксированную скорость перемеши-
70
вания 80 об/мин, варьируя только скорость подачи воздуха. В процессе культивирования наблюдали за ростом микроорганизмов и потреблением кислорода, в
соответствии с этим изменяли насыщенность кислородом питательной среды,
данные представлены на рисунке 3.3.1.
Рисунок 3.3.1– График насыщенности кислородом питательной среды для
интенсификации роста и развития микроорганизмов
Из графика (рис. 3.3.1) видно, что насыщенность питательной среды кислородом составляет 46,5% в первый час культивирования микроорганизмов, при
этом происходит адаптация микроорганизмов и распределение по всему объему,
при дальнейшем культивировании наблюдается снижение объема потребляемого
кислорода до минимального значения 26,3 %, что соответствует активации роста
микроорганизмов.
В процессе дальнейшего культивирования для стимуляции роста микроорганизмов начали подачу кислорода до выхода на плато. Зависимость аэрации от насыщенности кислородом питательной среды представлена в таблице 3.3.6.
71
Таблица 3.3.6– Зависимость аэрации от насыщенности кислородом питательной
среды
Продолжительность
роста
1
4
8
12
18
24
Насыщенность кислородом, %
46,5
26,3
86,5
110,2
114,8
114,8
Аэрация, дм3/мин
0,465
0,263
0,865
1,102
1,150
1,150
микроорганизмов, ч
Из таблицы 3.3.6 видно, что оптимальный для роста и развития штамма Bacillus pumilum объем подачи кислорода, должен составлять 1,150 дм3/мин, так как
данного объема хватает на развитие микроорганизмов без кислородного голодания. Далее проводили адаптацию микроорганизмов при подаче постоянного потока кислорода для оптимизации параметров ферментации. Анализ проводили по
трем параметрам аэрации 0,465; 0,865;1,150 дм3/мин, наблюдали изменение прироста биомассы, активности белка от потребления кислорода.
На рисунке 3.3.2 представлена зависимость прироста биомассы, активности
ферментов, массовой доли белка от потребления кислорода в процессе культивирования.
Из рисунка 3.3.2 видно, что для стабильного прироста биомассы без резких
переломов, которые могут образовываться из-за кислородного голодания или
чрезмерной аэрации, необходимое количество кислорода составляет 1,150
дм3/мин. Также из графика на рисунке 3.3.2 следует, что целевой белок начинает
накапливаться при продолжительности культивирования 6 ч.
Наблюдается высокая кератинолитическая активность при аэрации 1,150
дм3/мин, что свидетельствует об интенсивном продуцировании фермента в культуральную жидкость без окисления. При объемах 0,465 и 0,865 дм3/мин через 4
ч активность начинает снижаться, что связано с недостатком кислорода в культуральной жидкости.
72
Рисунок 3.3.2 –Зависимость прироста биомассы, активности, белка от
потребления кислорода в процессе культивирования.
Учитывая полученные результаты, были определены оптимальные интервалы варьирования основных параметров процесса культивирования. Оптимальным
вариантом культивирования в ферментере объёмом 5 дм3 является продолжительность 21 ч, при перемешивании 80 об\мин. Варианты с увеличением скорости
перемешивания до 150 об/мин снижали скорость накопления целевого продукта,
однако аэрация при 1,150 дм3/мин позволяет ускорить процесс накопления белка.
73
В таблице 3.3.7 представлены параметры процесса культивирования продуцентов кератиназы Bacillus pumilum в биореакторе.
Таблица 3.3.7 – Параметры культивирования продуцентов кератиназы Bacillus
pumilus
Параметры
Значения
Продолжительность, ч
21,0
Температура, °С
37,0
рН
7,0
Число оборотов мешалки, об/мин
80,0
Аэрация, дм3/мин
1,150
Представленные оптимальные условия культивирования продуцента кератиназы Bacillus pumilum в дальнейшем применили для наработки фермента и определения оптимальной концентрации его внесения при проведении гидролиза
перопухового сырья (таблица 3.3.8)
Таблица 3.3.8 - Содержание свободных аминокислот в кератинсодержащем
сырье
Содержание свободных аминокислот
СодержаКонцентра-
Концентра-
Концентра-
Концентра-
ция фермента
ция фермента
ция фермента
ция фермента
0,01 г/ см3
0,03 г/ см3
0,04 г/ см3
0,05 г/ см3
10
4,57
6,02
3,84
3,25
15
4,82
5,23
4,58
4,35
20
4,84
5,46
3,98
3,61
25
4,50
4,31
4,37
4,70
ние пера,
г/ дм3
74
Из таблицы 3.3.8 можно сделать вывод, что массовая доля фермента 0,03 г/
см3 является оптимальной. Дальнейшие исследования были направлены на определение возможности очистки получаемого фермента и анализа кератинолитической активности в сравнении к протеазой К.
Очистку фермента проводили с применением сульфата аммония. Полученные очищенные образцы кератиназы полученные как с применением ультразвука
для разрушения клеточных стенок микроорганизмов, так и без разрушения. За
контроль принимали раствор протеиназы К в 50мМ фосфатном буфере, наиболее
близкий по действию фермент щелочной протеазы.
Провели качественный анализ-сравнение на жидкостном хроматографе LC20 Prominence на спектрофотометрическом детекторе с заданной длиной волны
280нм; скорость потока элюента – 1мл/мин; элюент – 100мм натрий-фосфатный
буфер с 0,3 м NaCl; объем инжекции – 20мкл; время анализа составило 30 минут.
Хроматограмма образцов представлена на рисунке 3.3.3.
Рисунок 3.3.3 – Хроматограмма сравнения кератиназы: розовый– кератиназа полученная с применением ультразвука, коричневый – кератиназа полученная без
применения ультразвука, синий – протеиназа К.
75
В ходе анализа была выявлена схожесть результатов образцов кератиназы
полученной из штаммов с применением ультразвука и кривые практически совпали, образцы обработанные ультразвуком, никак не отличались от основных образцов. Таким образом, можно сделать вывод о том, что применение ультразвука
не влияет на количество выделенного фермента кератиназы и может применяться
для инактивации деятельности микроорганизмов при наработке биопрепарата, как
более безопасный метод.
Зная время выхода очищенной кератиназы, можно проводить ее очистку с
применением хроматографичесокого метода, однако затраты на элюент экономически не выгодны, наиболее перспективным является метода диализа.
Для определения оптимальных параметров для активации биопрепарата
были изучены температурные режимы и количество катализатора. Большинство
протеаз синтезируется как предшественники, которые если вообще обладают, то
очень слабой каталитической активностью.
Эти предшественники обычно превращаются в активные энзимы в процессе
протеолитической обработки. Она выполняется при посредстве или другой протеазы, или за счет автокатализа, запускаемого присоединением кофакторов или за
счет удаления ингибиторов. Следовательно, заранее может быть накоплено большое количество предшественников, и они могут быть активированы при поступлении какого-то сигнала.
Протеазы могут регулировать собственную активацию. Это достигается за
счет осуществления положительных и отрицательных обратных связей, примером
которых является каскад усиления. В этом случае, активная протеаза может прямо
или опосредованно активировать собственного предшественника, что приводит к
экспоненциальной скорости активации и обеспечивает быстрое выполнение протеазой своей цели.
Известно, что ферментативной активности кератиназы требует присутствие
ионов Ca2+ (1–5 mM). Кератиназа содержит два сайта связывания ионов Ca2+, которые расположены вблизи активного центра, но не принимают непосредственного участия в каталитической реакции.
76
Фермент расщепляет белки преимущественно по гидрофобным аминокислотам (алифатические, ароматические и другие гидрофобные аминокислоты).
Белки полностью расщепляются, при длительной инкубации или при высокой
концентрации кератиназы.
После удаления ионов кальция, стабильность фермента снижается, но протеолитическая активность остается. Удаление ионов Ca2+ снижает каталитическую активность кератиназы на 80%, поэтому добавляем ионы кальция в составе
мела в кератинсодержащее сырье.
Повышение температуры реакции от 37°C до 60°C увеличивает активность
кератиназы в несколько раз, так же добавление 0,8–1% SDS или гуанидина хлорида (3 M) или гуанидина тиоционата (1 M) или мочевины (4 M). Так как повышается доступность пептидных связей белков для кератиназы, ускоряя их гидролиз.
Кератиназа работает в широком диапазоне pH (4–12), её оптимум pH 7,8.
Активность
ингибирует
температура
выше
65°C
или
присутст-
вие трихлоруксусной кислоты. Так как добавление трихлоруксусной кислоты не
допустимо, в составе кормовой добавке мы выбрали распылительную сушку для
инактивации биопрепарата и обработки гидролизованного субстрата
Сушку растворов вели на экспериментальной установке, с возможностью
регулировки скорости рабочего раствора и распыляющего потока газа. Установка
позволяет получать готовый продукт с размером частиц 1–25 мкм.
Материалы, вступающие в контакт с продуктом: кислотоустойчивая нержавеющая сталь, боросиликатное стекло, силикон.
Технические характеристики
сушилки представлены в таблице 3.3.9.
На рисунке 3.3.4 приведена схема установки распылительной сушки. Нагрев
подаваемого газа и двухпоточной форсунки (1) осуществляет микропроцессорная
автоматика Fuzzy-logic (2) с цифровым дисплеем и датчиком температуры PT 100,
который обеспечивает высокую точность регулирования температуры.
77
Таблица 3.3.9– Технические характеристики экспериментальной установки распылительной сушки
Показатели
Характеристика
Напряжение
200/230 В, 50–60 Гц
Максимальная скорость потока воздуха
35 м3/ч
Максимальная температура на входе
220 °C
Мощность нагрева
2300 Вт
Газ для распыления
сжатый воздух, 200–1000
дм3/ч, 5–8 бар
Диаметр отверстия форсунки
7 мм
Распылительный колпачок
диаметр 1,4 мм и 1,5 мм
Среднее время нахождения
1,0–1,5 с
Размеры ШxГxВ
60x50x110 см
Вес
48 кг
Раствор проходит через форсунку, распыляющую его на мельчайшие капли
и попадает в камеру (3), в которой протекает процесс сушки. Частицы, захваченные потоком газа, перемещаются в циклон (4), где происходит их разделение под
действием собственной силы тяжести. Установка оснащена фильтром (5) удерживающим мелкие частицы и аспиратором (6) для создания потока воздуха.
В стандартном режиме работы распылительной сушилки направления распыляемого образца и осушающего воздуха совпадают. Давление в системе поддерживается на уровне ниже атмосферного, что предотвращает любую возможность загрязнения продукта в случае утечек.
В установке используется осушитель воздуха Dehumidifier B-296 и устройство для распылительного отверждения Spray Chilling, с помощью которого возможно получение порошков с минимальной остаточной влажностью. Внешний
вид установки распылительной сушки и параметры сушки белкового гидролизата представлен на рисунке 3.3.5.
78
Рисунок 3.3.4 – Схема установки распылительной сушки
(1 –форсунка; 2 – нагреватель; 3 – распылительная камера (цилиндр);
4 – циклон; 5 – фильтр; 6 – аспиратор)
79
Рисунок 3.3.5 – Установка распылительной сушки и параметры сушки
Технология получения кормовой добавки методом распылительной сушки
предполагает следующие отличия от классической:
– контроль температуры на выходе, что позволяет избежать нежелательного процесса термического горения с образованием токсинов .
– использование циклонной технологии.
– применение фильтра, улавливающего мельчайшие частицы высушенного
продукта
– отсутствие катализаторов и стабилизаторов, что позволяет повысить непосредственное содержание белковой кормовой добавки на выходе.
– проводить инактивацию кератиназы в мягких условиях без добавления
химических примесей.
К числу преимуществ сухой кормовой добавки с использованием распылительной сушки относятся: точность дозирования, компактность, удобство упаков-
80
ки и транспортировки, длительность хранения и возможность целевого применения в растворенном виде.
Одним их основных путей повышения продуктивности сельскохозяйственных животных и птицы является организация полноценного кормления их за счет
скармливания разнообразных кормов в соответствии с существующими нормами.
При этом полноценность рациона должна обуславливаться не только определенным количеством в нем сухого вещества и энергии, но уровнем и составом протеина, достаточным количеством незаменимых аминокислот и других питательных веществ. Протеин кормов необходим животным как источник аминокислот,
которые являются строительным материалом для всех белков тела животного и
производимой ими продукции, а также для участия во всех процессах нормального функционирования организма.
Незаменимые аминокислоты жизненно необходимы для животных всех видов и возрастов, за исключением аргинина и гистидина, которые не являются
строго незаменимыми, а также глицина, незаменимого только для цыплят. Аргинин – условно незаменимая аминокислота, так как она хотя и в малых количествах, но синтезируется в организме животного.
Анализ аминокислотного состава кормовой добавки после применения распылительной сушки проводили методом капиллярного электрофореза.
Для определения аминокислотного состава методом капиллярного электрофореза необходимо было провести кислотный гидролиз образцов. Сначала брали
2-3 навески, каждая массой 100 мг и помещали в виалу для гидролиза, добавляли
10 см3 соляной кислоты 6 М, герметично закрыли и поместили в сушильный шкаф
на 72 час при температуре 120 С.
По окончанию гидролиза виалы вынули из шкафа и охладили до комнатной
температуры. Содержимое виалы после охлаждения фильтровали через фильтр,
отбросив первые порции и собирая основные фильтраты.
Из фильтрата далее получили ФТК – производные, для этого в стеклянные
бюксы вместимостью 10-15 см3 отбирали по 0,05 см 3 гидролизатов из навесок .
Растворы выпаривали досуха в струе теплого воздух. В каждую бюксу с сухими
81
остатками добавляли 0,15 см3 карбоната натрия 0,1 моль /дм3 и 0,3 см3 раствора
ФИТЦ (фенилизотиоцианат 0,40 см 3 и изопропиловый спирт которым доводят до
метки 25 см3). Тщательно перемешивали до растворения осадка, закрывали
крышкой и оставляли на 35 минут при комнатной температур. Затем растворы
выпаривали досуха в теплой струе теплого воздуха.
Сухой остаток досуха растворили в 0,5 см3 дистиллированной воды и использовали для анализа с получением электрофореграмм (рисунок 3.3.6 ). Анализ
с помощью системы капиллярного электрофореза «Капель 105» с положительной полярностью источника высокого напряжения.
82
Рисунок 3.3.10 – Электрофореграммы аминокислотного состава кормовой
белковой добавки
Полученные результаты пересчитывают в соответствии с методическими
указаниями М 04-38-2009 «Определение содержания аминокислот (лизина, метионина, треонина, цистина и триптофана) методом капиллярного электрофореза»
для определения массовой концентрации аминокислот приведена в таблице
3.3.10.
83
Таблица 3.3.10. Определение массовой доли аминокислот в кормовой добавке
Определяемый
Массовая концентрация
параметр
в пробе, мг/дм3
Массовая доля аминокислоты в образце,
X ± Δ мг/ г продукта
Аргинин
7,565
663,60±265,44
Лизин
1,690
148,25±50,40
Тирозин
0,486
42,63±12,79
Фенилаланин
0,707
62,02±18,61
Гистидин
0,419
36,75±18,38
Лейцин + Изолейцин
1,696
148,77±38,68
Метионин
0,494
43,33±14,73
Валин
0,837
73,42±29,37
Пролин
1,049
92,02±23,92
Треонин
0,644
56,49±22,60
Серин
1,049
92,02±23,92
Аланин
1,294
113,51±29,51
Глицин
1,252
109,82±37,34
12,629
289,66±115,86
Аспарагиновая кислота
4,842
111,06±44,42
Цистин
17,004
390,00±195,00
Глутаминовая
кислота
84
Из таблицы 3.3.10 видно, что не происходит потери аминокислот перопухового сырья, соответственно данная кормовая добавка так же представляет интерес
по составу незаменимых аминокислот и может применяться для расчета рецептуры комбикормов с применение ее в их составе.
Далее проводили анализ кормовой добавки для определения общей кислотности.
Таблица 3.3.11. – Показатели активной и общей кислотности кормовой добавки
Название комбикорма или
Активная
Общая
комбикормового сырья
кислотность, рН
кислотность,
X,°Н
Кормовая добавка
7,3
0,36
Из таблицы 3.3.11 видно что рН кормовой добавки нейтрально 7,3.
При расчете общей кислотности (число Неймана) составляет 0,36 °Н, что в свою
очередь соответствует ГОСТ и может применяться в составе комбикормов для
сельскохозяйственных животных.
85
ГЛАВА 4. ПРАКТИЧЕСКАЯ РЕАЛИЗАЦИЯ
РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ
На основании анализа отечественной, зарубежной литературы и патентов, а
также результатов собственных исследований, теоретически обоснована и экспериментально доказана целесообразность разработки технологии производства
биопрепарата на основе микроорганизмов Bacillus pumilus для получения белковой кормовой добавки из кератинсодержащих отходов. Биопрепарат позволит повысить белковую питательность комбикормов для сельскохозяйственных животных, а также рационально использовать перьевые отходы птицефабрик.
4.1 Технологическая схема по производству биопрепарата для переработки
отходов птицеперерабатывающей промышленности в кормовую добавку
Изучение оптимального состава среды для культивирования штамма и
влияния технологических параметров культивирования на кератинолитическую
активность микроорганизмов Bacillus pumilus позволило определить оптимальные
параметры процесса получения биопрепарата для переработки отходов птицефабрик в кормовую добавку.
На основании проведенных экспериментов и полученных данных разработана и апробирована технология в условиях испытательной лаборатории Научно–
образовательного центра и Научно–Исследовательского Института Биотехнологии ФГБОУ ВПО «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности», которая представлена на рисунке 4.1.1. Полученные экспериментальные данные позволили разработать пакет технической документации на полученный биопрепарат и кормовую добавку.
86
Активация микроорганизмов в
жидкой питательной среде
Подготовка пера
Биопрепарат
Ферментативный
гидролиз
о
(t = 37±1 С, τ = 28,0±0,5 ч)
Инактивация
(t = 0±1оС, τ = 10-15 мин)
Фильтрация ферментативного
гидролизата
Распылительная сушка гидролизата
пера(tвх. =120 ºС ,
tвых.= 73 ºС, подача воздуха 100%,
насос 12%, прочистка форсунки = 2
Контроль безопасности кормовой добавки
Фасовка белковой добавки
Рисунок 4.1.1 - Технологическая схема получения кормовой добавки
Технологический процесс получения белковой добавки на основе гидролизованного пера осуществляют согласно схеме, которая состоит из последовательных и взаимосвязанных этапов: подготовка перьевого сырья, активизация культуры Bacillus pumilus - продуцента фермента кератиназы, ферментативный гидролиз
перопухового сырья, инактивация продуцента и фермента, фильтрация гидроли-
87
зата, распылительная сушка, контроль показателей безопасности готовой белковой добавки и ее фасовка. На первом этапе технологического процесса осуществляют подготовку перопухового сырья.
Перо, полученное на птицефабрике, очищают промывкой от животноводческих загрязнений и продуктов убоя птицы, далее обрабатывают слабым щелочным раствором, который не оказывает отрицательного действия на перо. После
промывки перо сушат, проверяют на наличие посторонних примесей и измельчают с добавлением карбоната кальция для простоты измельчения.
Параллельно проводят посев микроорганизмов на питательную жидкую
среду с целью активации для получения работоспособных культур микроорганизмов Bacillus pumilus и наработки кератолитических ферментов.
Для активации и наработки
микроорганизмов используют питательную
среду LB следующего состава:NaCl -10г/дм3, дрожжевой экстракт–4г/дм3, пептон
-10г/дм3, фруктоза - 0,5 г/дм3.
Посев производится в стерильных условиях. Далее культура культивируется
при температуре 37± 2ºС, рН среды 6,8-7,0, в течение12 - 32 часов с постоянным
перемешиванием, частота движения 80-120 об/мин.
После культивирования культуру микроорганизмов обрабатывают ультразвуком, ультразвук можно заменить охлаждением культуры до 5ºС для инактивации клеток, далее отделяют клетки от культуральной жидкости
с помощью
фильтрования под вакуумом.
Полученную культуральную жидкость при необходимости сушат на распылительной сушилке для получения однородной консистенции, мелкодисперсного
порошка. Полученный биопрепарат получается с активностью 8,9Е/ мг, степенью
очистки Гх3, так как микроорганизмы продуцируют фермент кератиназу во
внешнюю среду, не задерживая и не накапливая его в клеточной мембране.
Технология получения биопрепарата для биотрансформации перопухового
сырья представлена на рисунке 4.1.2.
88
Приемка и оценка качества сырья
Подготовка питательной среды для микроорганизмов
Подогрев питательной среды до 37+2оС и внесение микроорганизмов
Культивированием микроорганизмов для накопления фермента
12-32ч при t = 37 +2оС, рН 7,0+0,2оС, 80 об/мин, аэрация1,150 дм3/мин
Инактивация микроорганизмов
Ультразвук или охлаждение до 5+1оС
Фильтрация под вакуумом
Распылительная сушка
Рисунок 4.1.2 -Технология получения биопрепарата для биотрансформации перьевого сырья
В обезжиренное измельченное перо вносят полученный активный биопрепарат вместе с питательной средой и воду, в соотношении 25 г пера на 1дм3 воды
и 3 гбиопрепарата.
Далее проводят процесс ферментативного гидролиза в течение 28±0,5 чпри
температуре37±2оС.Температурный режим выбран таким образом, что нагрев сырья с внесенными в биопрепаратомпозволяет активизировать ферменты для перевода кератина пера в усвояемую форму. Соответственно, процесс биотрансформации начинается сразу после внесения биопрепарата.
По окончании ферментативного гидролиза гидролизат подвергается инактивации. Параметры инактивации выбраны таким образом, чтобы ферменты пре-
89
кращали свое действие на гидролизат. Так как фермент кератиназа работает в широком температурном диапазоне от 24до 65±2оС, в связи с этим для инактивации
выбрана низкая температура 0±1оС в течение 10-15 мин. Данные параметры оптимальны для инактивации в производственных масштабах.
Фильтрация - это неотъемлемая стадия технологического процесса, так как
в гидролизате могут оставаться взвести жестких частей пера, которые гидролизуются дольше, помимо этого в сырье могут присутствовать различные посторонние примеси. Во избежание засорения форсунки и поломки аппарата в процессе
сушки сырье подвергают фильтрации, отделяя твердые фазы.
Следующей стадией в производстве белковой кормовой добавки является
процесс сушки.Процесс сушки протекает чрезвычайно быстро (обычно 15-30 сек)
и частицы в зоне повышенных температур имеют насыщенную поверхность, температура которой близка к температуре адиабатного испарения чистой жидкости.
Благодаря мгновенной сушке и невысокой температуре распыленных частиц материала высушенный продукт получается хорошего качества: например, не
происходит денатурации белков, окисления, потерь витаминов и т. д.
Выбор распылительной сушки можно объяснить тем, что получаемый гидролизат имеет однородную консистенцию, а распылительная сушка позволяет
исключить процесс измельчения сухого гидролизата, также гидролизат имеет повышенную растворимость. После распылительной сушки лишняя влага удаляется
из продукта ферментативного гидролиза, и белковая добавка приобретает порошкообразную форму. Удаление влаги позволяет повысить срок хранения готовой
продукции.
Контроль безопасности кормовой добавки необходим для проверки безопасности продукции для животных и, соответственно, человека. Кормовые добавки и кормовые смеси по показателям качества и безопасности должны соответствовать требованиям технических нормативных правовых актов, действующих на
территории Российской Федерации.По санитарно-микробиологическим показателям высокобелковые кормовые добавки должны соответствовать нормам СанПиН
2.3.2.1078-01 (индекс 1.9.9.4).
90
Следующая стадия подразумевает фасовку кормовой добавки для включения в комбикорма и при необходимости ее маркировку.
Последняя стадия связана с внесением кормовой добавки в комбикорма для
сельскохозяйственных животных по предварительно разработанной рецептуре,
для сбалансированности рациона.
Технологический регламент выработки белковой кормовой добавки и рецептуры (таблица 4.1.1) использован при разработке технической документации,
включающей технические условия и технологическую инструкцию.
Таблица 4.1.1 - Рецептура компонентов для получения белкового гидролизата
Компоненты
Рецептура,
г (дм3)
Биопрепарат
3,0
Перо
20,0
Вода
1000,0
Итого
1000,0
В таблице 4.1.1 представлена рецептура для выработки 1дм3 белкового гидролизата, который в дальнейшем, как указано в схеме на рисунке 4.1.1, будет подвержен распылительной сушке для получения готовой продукции.
4.2. Состав, свойства и продолжительность хранения биопрепарата и
белковой кормовой добавки
Для государственных предприятий комбикормовой промышленности используют биопрепараты первой группы. По физико-химическим и биологическим показателям биопрепарат Г3х должен соответствовать требованиям, указанным в
таблице 4.2.1.
91
Таблица 4.2.1 - Физико-химические и биологические показатели биопрепарата
Наименование показателя
Норма для групп
Метод анализа
I
Внешний вид и цвет
II
Порошок
от
светло- По ГОСТ 20264.1
бежевого
до
светло-
коричневого
Массовая доля остатка после
По ГОСТ 20264.1
просеивания для препарата:
с поваренной солью на сите из
-
5,0
20,0
-
5,0
5,0
проволочной сетки № 0,5, %, не
более
с поваренной солью и мелом на
сите из проволочной сетки №
0,25, %, не более
с кукурузной мукой на сите из
проволочной сетки № 0,67, %,
не более
Массовая доля влаги для препа-
По ГОСТ 20264.1
рата с наполнителями:
мелом и солью поваренной, %,
8,0
не более
мукой кукурузной, %, не более
Протеолитическая
активность
15,0
70±7
7,0±0,7
По ГОСТ 20264.2
(ПС), ед/г
Безвредность в тест-дозе
Массовая доля поваренной соли,
%, не более
Безвреден
6,0
По п.3.2
-
По п.3.1
92
Биопрепарат хорошо растворим в воде, но допускается выпадение в осадок нерастворимого наполнителя. Определение растворимости в воде проводят 5 г исследуемого препарата (из общей пробы) взвешивают на технических весах в стаканчике вместимостью 100 см3 и тщательно растирают стеклянной палочкой с небольшим количеством дистиллированной воды. Навеску переводят в цилиндр
вместимостью 500 см3, доводят дистиллированной водой до метки и оставляют на
10—15 мин при периодическом перемешивании. После этого визуально определяют растворимость биопрепарата.
Данный биопрепарат соответствует нормам и может использоваться как добавка к корму птицы, так и для получения кормовой добавки из кератинсодержащего сырья.
Органолептическое соответствие партии биопрепарата
является первым
контрольным показателем продукции для оценки качества. Органолептические
показатели, которым соответствует биопрепарат, приведены в таблице 4.2.2.
Таблица 4.2.2 - Органолептические показатели биопрепарата
Наименование показателя
Показатель
Внешний вид и консистен-
Мелкодисперсный порошок. Не допускается нали-
ция
чие посторонних примесей
Цвет
от светло-бежевого до светло-коричневого
Запах
Специфический
Вкус
Специфический
Размер гранул
0,1-0,5 мм
Анализ результатов, представленных в таблице 4.2.2. свидетельствует о том,
что биопрепарат обладает хорошими органолептическими свойствами, размер
гранул 0,1-0,5 мм, без плотных не рассыпающихся при надавливании комков, цвет
светло-желтый, запах специфический без постороннего гнилостного или затхлого,
по потребительским свойствам биопрепарат не уступает аналогам, а по показателю гранулирования лучше имеющихся на рынке.
93
По физико-химическим показателям сухой биопрепарат соответствует требованиям, приведенным в таблице 4.2.3.
Таблица 4.2.3 -Физико-химические показатели сухого биопрепарата
Наименование показателя
Значение показателя
Удельная активность, Е/мг, не менее
5,0
Массовая доля влаги %, не более
10,0
По физико-химическим показателям жидкий биопрепарат соответствует
требованиям, приведенным в таблице 4.2.4.
Таблица 4.2.4 -Физико-химические показатели жидкого биопрепарата
Физико-химические показатели
Значения показателей
Растворимость в воде
растворим
Свободные ферменты
кератиназа
Удельная активность, Е/мг, не менее
3,0
Важными показателем, характеризующим безопасность биопрепарата, являются микробиологические показатели.
По микробиологическим показателям биопрепарат должен соответствовать
требованиям СанПиН 2.3.2.1293-03, Единым санитарно-эпидемиологическим и
гигиеническим
требованиям
к
товарам,
подлежащим
санитарно-
эпидемиологическому надзору (контролю), приведенным в таблице 4.2.5.
Анализ полученных результатов, представленных в таблице 4.2.5, показал,
что по содержанию санитарно-показательных и патогенных микроорганизмов исследуемые образцы биопрепарата отличаются высокой надежностью, поскольку
искомые микроорганизмы (бактерии группы кишечной палочки, золотой стафилококк, сальмонеллы) в нормируемых массах продукта отсутствуют.
94
Таблица 4.2.5 - Микробиологические показатели белковой кормовой добавки
Наименование показателя
КМАФАнМ, КОЕ/г
Нормы
Фактические
5·104
(БГКП, коли-формы), в 1г
не допускается Не обнаружено
Наличие сальмонелл, КОЕ/ 25 г
не допускается Не обнаружено
Наличие бактерий, КОЕ/1 г
Не более 30
Не обнаружено
Плесени, КОЕ/г
50
Не обнаружено
Дрожжи, КОЕ/г
50
Не обнаружено
Высев бактерий
Споры в целом генерируют Bacillus
Так же процесс распылительной сушки увеличивает срок хранения и предотвращает образование плесени на ранних стадиях хранения.
Показано, что миграции токсичных элементов в продукте не отмечается,
контролируемые потенциально опасные химические вещества содержаться
в
продукте в концентрациях, не превышающих установленные нормативы СанПиН
2.3.2.1293-03 (индекс 2.25.13), Единым санитарно-эпидемиологическим и гигиеническим требованиям к товарам, подлежащим санитарно-эпидемиологическому
надзору (контролю) (ТС ЕврАзЭС), приведенным в таблице 4.2.6.
Таблица 4.2.6 -Содержание токсичных элементов в биопрепарате
Наименование вещества (эле-
Допустимый уровень его содержания, мг/кг
мента)
не более
Свинец
10,0
Мышьяк
3,0
Кадмий
40,0
Ртуть
0,5
95
Помимо перечисленных веществ содержание радионуклеотидов цезия -137
(норматив не более 50 Бк/ кг) и стронция – 90 (нормативы не более 25 Бк/ кг) в
продукте не установлено.
4.3. Экономическая эффективность выработки биопрепарата
Заключительным этапом исследований является оценка эффективности выработки продукта.
Расчет экономической эффективности производства биопрепарата на основе
культуры Bacillus pumilus для гидролиза кератина, проводили по нормативным
расценкам на 20.04.2013г.
Смета затрат на сырье и основные материалы, необходимые для производства биопрепарата, для переработки отходов птицеперерабатывающей промышленности в кормовую белковую добавку включили в себя две основные стадии
расчета.
Были произведены расчеты суммарных затрат сырья и основных материалов на 100 дм3 культуральной жидкости с активированными микроорганизмами
(таблица 4.3.1).
Далее проводим обработку культуральной жидкости и получение биопрепарата. Для этого необходимо рассчитать затраты на сушку и выход готового биопрепарата. На данной стадии не обходимо учесть затраты на оборудование и
энергию, а так же принять во внимание объем полученного биопрепарата.
Таким образом, необходимо рассчитать конечную стоимость 1 кг биопрепарата. Полная себестоимость биопрепарата формируется с учетом затрат по статьям калькуляции на производство продукции. Структура себестоимости разработанного биопрепарата представлена в таблице 4.3.2.
96
Таблица 4.3.1 - Расчет суммарных затрат сырья и основных материалов на 100 дм3
культуральной жидкости с активированными микроорганизмами для получения
биопрепарата
№
Наименование элемен- Потребность в
тов сырья или материа- элементе сып/п лов
рья или материалов,
кг
3
(дм )
Текущая цена
за
единицу
элемента сырья и материалов, руб.
Стоимость
элемента сырья
и материалов,
руб.
1.
D - фруктоза
0,6
150,0
90,0
2.
Хлорид кальция
0,2
40,0
8,0
3.
Панкреатический
ролизат
1,2
1500,0
1800,0
4.
Хлорид натрия
0,6
36,0
21,6
5.
Триптон
1,2
3960,0
4752,0
6.
Вода
100,0
3,5
350,0
гид-
Итого:
7021,6
Таблица 4.3.2 - Структура себестоимости биопрепарата
Статьи затрат
Удельный вес,
%
Производственная себестоимость, руб.
Материальные затраты в том числе:
87,6
9098,92
Сырье
67,6
7021,60
Транспортные расходы
2,2
228,51
Упаковка
13,5
1402,23
Топливно –энергетические расходы
4,3
446,64
Затраты с отчислениями
1,7
176,58
Условно – постоянные расходы
8,9
924,43
Амортизация
1,8
186,96
Итого:
10386,95
97
Как видно из таблицы 4.3.2, наибольший удельный вес занимает сырье. Себестоимость готового продукта в наибольшей степени зависит от стоимости сырья. Прибыль от реализации продукции определяется по формуле 4.3.1.:
(4.3.1.)
Где П – прибыль от реализации, руб.;
Сп– полная себестоимость изделия, руб.;
Р - рентабельность ( по пищевой промышленности 20 %)
Отсюда прибыль от реализации биопрепарата равна:
Расчет товарной продукции проводят по формуле 4.3.2.:
(4.3.2)
Отсюда товарная продукция ТП равна
Расчет затрат на 1 рубль товарной продукции проводят по следующей формуле 4.3.3:
(4.3.3)
98
Следовательно затраты на рубль товарной продукции кормовой добавки
равны:
Расчет оптовой цены за кг готовой продукции проводят по следующей формуле 4.3.4:
( 4.3.4)
руб.
Отпускная цена кормовой добавки формируется из оптовой цены с учетом
НДС (18%). Данная надбавка позволяет возместить издержки производства и
реализации и получить прибыль, которая позволяет продолжить и развивать производство.
Таким образом, отпускная цена за 1 дм3 готовой продукции биопрепарата
составляет 124,5 руб. На основании проведенных расчетов основные показатели
экономической эффективности представлены в таблице 4.3.3.
Таблица 4.3.3 - Основные показатели экономической эффективности на 1т готовой продукции
Себестоимость,
тыс. руб.
Оптовая цена,
тыс. руб.
Отпускная цена,
тыс. руб.
Ожидаемая прибыль,
тыс. руб.
103,70
124,50
146,92
43,22
Для производства и реализации 1 т биопрепарата предприятию необходимо
затратить 103,70 тыс. руб. Выручка от данной продукции после вычета из нее затрат за работу и услуги, связанные с производством и реализацией, составить
99
43,22 тыс. руб. Следовательно, полученная прибыль позволит предприятию – изготовителю продолжить выпуск данного вида биопрепарата. Так же предприятие
может поднять отпускную цену до 500 -1500 руб. так как существующие аналоги
намного дороже их стоимость составляет от 1750 до 10780 руб.
Себестоимость готового продукта в наибольшей степени зависит от стоимости сырья. Из 100л культуральной жидкости получается 2,61 кг биопрепарата, отсюда мы рассчитали себестоимость одного кг биопрепарата, который составляет
1799,96 руб.
Таблица 4.3.4 - Рассечет суммарных затрат сырья и основные материалы на 100л
готовой продукции
№
п/п
Наименование
элемен-
Потребность
Текущая цена
Стоимость эле-
тов сырья или материа-
в элементе
за единицу
мента сырья и
лов
сырья или
элемента сы-
материалов, руб.
материалов,
рья и мате-
кг (л )
риалов, руб
1.
Биопрепарат
0,3
1799,96
599,98
2.
Карбонат кальция
3,0
0,3
0,9
3.
Вода
100,0
3,5
350
Итого:
950,89
Прибыль от реализации продукции определяется по формуле 4.3.5:
(4.3.5.)
Где П – прибыль от реализации, руб.;
Сп– полная себестоимость изделия, руб.;
100
Р - рентабельность ( по пищевой промышленности 20 %)
Полная себестоимость продукции формируется с учетом затрат по статьям
калькуляции на производство продукции. Структура себестоимости разработанной белковой добавки представлена в табл. 4.3.5.
Таблица 4.3.5 - Структура себестоимости белковой добавки из отходов птицеперерабатывающей промышленности
Статьи затрат
Удельный вес, %
Производственная себестоимость, руб.
Материальные затраты в
87,6
1232,22
Сырье
67,6
950,89
Транспортные расходы
2,2
30,95
Упаковка
13,5
189,90
4,3
60,49
Затраты с отчислениями
1,7
23,91
Условно – постоянные
8,9
125,19
1,8
25,32
том числе:
Топливно
–
энергетические расходы
расходы
Амортизация
Итого:
1406,64
Как видно из табл. 4.3.5, наибольший удельный вес занимает сырье. Себестоимость готового продукта в наибольшей степени зависит от стоимости сырья.
101
Прибыль от реализации продукции определяем по формуле 4.3.2. Отсюда прибыль от реализации белковой добавки равна
Расчет товарной продукции проводят по формуле 4.3.6.:
(4.3.6)
Отсюда товарная продукция ТП равна
Расчет затрат на 1 рубль товарной продукции проводят по следующей формуле 4.3.7:
(4.3.7)
Следовательно затраты на рубль товарной продукции кормовой добавки
равны:
Расчет оптовой цены за кг готовой продукции проводят по следующей формуле 4.3.8:
( 4.3.8)
102
руб.
Отпускная цена кормовой добавки формируется из оптовой цены с учетом
НДС (18%). Данная надбавка позволяет возместить издержки производства и
реализации и получить прибыль, которая позволяет продолжить и развивать производство.
Таким образом, опускная цена за 1 кг готовой продукции белковой добавки
составляет 16,88 руб. На основании проведенных расчетов основные показатели
экономической эффективности представлены в табл. 4.3.6.
Таблица 4.3.6 - Основные показатели экономической эффективности на 1т готовой продукции
Себестоимость,
Оптовая цена,
Отпускная цена,
Ожидаемая прибыль,
тыс. руб.
тыс. руб.
тыс. руб.
тыс. руб.
14,06
16,88
19,92
3,04
Для производства и реализации 1 т белковой кормовой добавки предприятию необходимо затратить 14,06 тыс. руб. Выручка от данной продукции после
вычета из нее затрат за работу и услуги, связанные с производством и реализацией, составить 3,04 тыс. руб. Следовательно, полученная прибыль позволит предприятию – изготовителю продолжить выпуск данного вида белковой добавки. Так
же предприятие может поднять отпускную цену до 30 – 50 руб. так как существующие аналоги намного дороже их стоимость составляет от 65 до 1750 руб.
103
ВЫВОДЫ И РЕЗУЛЬТАТЫ
1.Установлено что микроорганизмы полученные из гниющего мяса по фенотипическим и биохимическим признакам относятся к бактериям рода Вacillus
и устойчивы у антибиотику лизоцим. Филогенетический анализ подтвердил родовую принадлежность, а так же позволил определить вид pumilus.
2. Изучено влияние технологических параметров культивирования на активность штамма Вacillus pumilus. Установлено, что при температуре 50 °С накопленный микроорганизмами фермент наиболее активен (28,47 Е/мг), оптимальным диапазоном рН среды для культивирования является 7,0-8,0, при скорости
перемешивания от 50 до 100 об/мин.
3. Подобран оптимальный состав ферментационной среды для культивирования штамма Вacillus pumilus, который включает фруктозу - 5 г/дм3, триптон - 12
г/дм3, хлорид натрия - 6 г/дм3, хлорид кальция – 2 г/дм3.
4. Разработаны рецептура и технологическая схема получения кормовой
белковой добавки из кератинсодержащего сырья. Кормовая добавка соответствует
санитарно-гигиеническим требованиям, обладает высокой биологической ценностью
5.Рассчитали ожидаемую экономическую эффективность. Для производства
и реализации 1 т белковой кормовой добавки предприятию необходимо затратить
14,06 тыс. руб. Выручка от данной продукции после вычета из нее затрат за работу и услуги, связанные с производством и реализацией, составить 3,04 тыс. руб.
Следовательно, полученная прибыль позволит предприятию – изготовителю продолжить выпуск данного вида белковой добавки. Так же предприятие может поднять отпускную цену до 30 – 50 руб. так как существующие аналоги намного дороже их стоимость составляет от 65 до 1750 руб.
104
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ
1.
Андреева, Е.В. Биогазовые технологии и высокоэффективные органические
удобрения / Е.В. Андреева // Инженерно-техническое обеспечение АПК. - 2005. № 1. - С. 23.
2.
Андреева, Е.В. Возможности и источники использования возобновляемых и
нетрационных источников энергии в АПК Республики Беларусь (газогенераторы
для твердого топлива и бытовых отходов) / Е.В. Андреева // Инженернотехническое обеспечение АПК. – 2010. - №3. – С. 654.
3.
Андреева, Е.В. Перспективы применения биогазовых установок в республи-
ке Беларусь / Е.В. Андреева // Экологическая безопасность в АПК. - 2007. - №4. С. 884-884.
4.
Андреева, Е.В. Перспективы применения энергосберегающей кавитацион-
ной обработки материалов в технологических процессах АПК / Е.В. Андреева //
Инженерно-техническое обеспечение АПК. – 2011. - №2. – С. 368.
5.
Архипченко И.А. Производство и применение микробного гранулированно-
го удобрения бамил / И.А. Архипченко // Докл. РАСХН, 1996. - №2. - С. 32-34.
6.
Архипченко И.А. Использование отходов животноводства для производства
удобрений / И.А. Архипченко, И.И. Баболина, П.Л. Дерикс // Докл. РАСХН, 1998. №6. - С. 18-19.
7.
Архипченко И.А. Полифункциональные микробные удобрения / И.А. Ар-
хипченко // Наука в России. - 1999. - №6. - С. 62-64.
8.
Архипченко И.А. Оптимизация процессов компостирования и влияние био-
компостов на урожай / И.А. Архипченко, О.В. Орлова // Агрохимический вестник.
- 2001. - №5. - С. 22-24.
9.
Ассонов, A.M. Проблемы очистки животноводческих стоков на фермах и
комплексах и пути их решения. / A.M. Ассонов, Г.Е. Мерзлая, В.В. Бондаренко. Минск, 1990. - С. 7-8.
105
10.
Багаев Г.В. Мировой продовольственный кризис и аграрная стратегия Рос-
сии / Г.В. Багаев // На пути к теории аграрного производства: инт.-конф. - ВЭГУ. 2008 г.- С. 49-54.
11.
Бакулов И.А. Обеззараживание навозных стоков в условиях промышленно-
го животноводства / И.А. Бакулов, В.А. Кокурин, В.М. Котляров. - М.: Росагропромиздат, 1998. - 126 с.
12.
Балашова, Т.Д. Краткий курс химической технологии волокнистых мате-
риалов / Т.Д. Балашова и др. – М.: Легкая и пищевая промышленность, 1986. –
200 с.
13.
Барболина И.И. Влияние биоудобрения бамил на почвенную микрофлору и
урожай сельскохозяйственных культур: автореф. дис. … канд. биол. наук :
06.01.04 / Барболина Ирина Ивановна – СПб., 1997.- 20 с.
14.
Бацанов, И.Н. Уборка и утилизация навоза на свиноводческих комплексах /
И.Н. Бацанов, И.И. Лукьянов.- Россельхозиздат, 1977. - С. 31-33.
15.
Берлин, А.Х. Оценка топоферментативной активности целлюлаз и ксиланаз
/ А.Х. Берлин, Д.Ф. Тихомиров, Б.Р. Гутьеррес и др. // Прикладная биохимия и
микробиология. - 1998. - Т .34. - №3. - С. 382-387.
16.
Биркин, С.М. Переработка отходов животноводства на фермерских хозяйст-
вах / С.М. Биркин // Сельский механизатор. - 2009. - № 4. - С. 26.
17.
Биркин, С.М. Совершенствование системы анаэробной переработки отходов
животноводства / С.М. Биркин, Н.М. Антонов // Вестник Красноярского государственного аграрного университета. - 2009. - № 4. - С. 197-202.
18.
Биологический энциклопедический словарь / Гл. ред. М. С. Гиляров; Ред-
кол.: А. А. Баев, Г. Г. Винберг, Г. А. Заварзин и др. - 2-е изд., исправл. - М.: Сов.
Энциклопедия, 1986. - 864 с.
19.
Биохимия: Учеб. для вузов / Под ред. Е.С. Северина. - М.: ГЭОТАР-Медиа,
2003. - 779 с.
20.
Буклагина, Г.В. Биологическая утилизация навоза на свинокомплексах / Г.В.
Буклагина // Инженерно-техническое обеспечение АПК. - 2001. - № 2. - С. 541.
106
21.
Веротченко, М.А. Биопереработка свиного навоза - основа получения хити-
на и хитозана / М.А. Веротченко, А.П. Терещенко, Ф.И. Злочевский // Аграрная
Россия. - 2000. - № 5. - С.57-59.
22.
Власова, Е.Я. Экологические проблемы агропромышленного комплекса в
условиях урбанизации / Е.Я. Власова, Я.Я. Яндыганов // Успехи современного естествознания. - 2008. - № 2. - С. 28-29.
23.
Волчатова, И.В. Применение углеродсодержащих твердых отходов в каче-
стве нетрадиционных удобрений / И.В. Волчатова, С.А. Медведева // Химия в интересах устойчивого развития. - 2001. - №9. - С. 533–540.
24.
Волчатова, И.В. Продуктивность агроценозов при использовании продуктов
биоконверсии гидролизного лигнина / И.В. Волчатова, С.А. Медведева, М.В. Бутырин // Агрохимия. - 2005. - №5. - С. 55–58.
25.
Ворошилов, Ю.И. Животноводческие комплексы и охрана окружающей среды /
Ю.И. Ворошилов, С.Д. Дурдыбаев и др. - М.: Агропромиздат, 1991. - С. 68-95.
26.
Габбасова, И.М. Использование биогенных добавок совместно с биопрепа-
ратом «Деворойл» для рекультивации нефтезагрязненных почв / И.М. Габбасова,
P.P. Сулейманов, Т.Ф. Бойко и др. // Биотехнология. - 2002. - №2. - С 57-65.
27.
Гайдашева, И.И. Перспективы использования новых биопрепаратов для за-
щиты злаков в Средней Сибири / И.И. Гайдашева, В.С. Садыкова, П.Н. Бондарь //
Вестник КрасГАУ. – 2008 .– №1(22). – С. 74-78.
28.
Ганжара, Н.Ф. Современные способы биоконверсии органических отходов и
получения высококачественных органических удобрений / Н.Ф. Ганжара, Р.Ф.
Байбеков, Д.Ю. Колтыхов и др. // Известия Тимирязевской сельскохозяйственной
академии. - 2007. - № 1. - С. 133-141.
29.
Григорьев, М.А. Создание безотходной технологии в свете ответственности
производителей за переработкой сырьевых на примере пивоваренного производства / М.А. Григорьев, Л.В. Римарева // Экология промышленных производств. 2009. - №1. - С. 43-46.
107
30.
Дабаева, М. Д. Эколого-безопасная утилизация отходов : монография / М.
Д. Дабаева, И. И. Федоров, А. И. Куликов; Бурят. гос. с.-х. академия. – Улан-Удэ :
Изд-во БГСХА, 2001. – 94 с.
31.
Дирина, Е.Н. Биодизель и биоконверсия отходов его производства // Е.Н.
Дирина, А.Ю. Винаров, Л.В. Драчева // Масложировая промышленность. - 2008. № 5. - С. 36-39.
32.
Доля, А.М. Утилизация навоза молочных ферм / А.М. Доля, Д.И. Згиров-
ский // Техника и оборудование для села. - 2009. - № 4. - С. 39-42.
33.
Егорова, Д.О. Грамположительные бактерии-деструкторыхлорированных
бифенилов, перспективные для использования при биоремедиациизагрязненных
почв / Д.О. Егорова, Е.Г. Плотникова // Биотехнология. - 2009. - №3. - С. 72-79.
34.
Егорова, Т.А. Основы биотехнологии: учебное пособие / Т.А. Егорова. – М.:
Высшая школа. 2003. - 268 с.
35.
Заика, Н.А Твердофазная ферментация сибирских штаммов грибов рода
Trichoderma / Н.А. Заика, Т.И. Громовых // Сибирский экологический журнал. 2007. - Т.- 14.- № 3. - С. 471-475.
36.
Зариня, Д.Я. Подбор микробных ассоциаций и разработка способов компости-
рования мелкодисперсных древесных отходов / Д.Я. Зариня, Л.Я. Дубова, Т.Н. Дижбите и др. // Дождевые черви и плодородие почв: мат. II Междунар. науч.-практ.
конф. – Владимир, 2004. - С. 116.
37.
Ильин, С.Н. Ресурсосберегающая технология переработки свиного навоза с
получением биогаза: автореф. дис. … канд. техн. наук: 05.20.01 / Ильин Сергей
Николаевич. - Улан-Удэ, 2005. - 23 с.
38.
Инкижинова, С. Птицеводы страхуются от конкуренции / С. Инкижинова //
Эксперт. – 2011. - №3.
39.
Керженцев, А.С. Функциональная экология / А.С. Керженцев. - М.: Нау-
ка, 2006. – 262 с.
40.
Климова, Е.В. Новые технологии биоконверсии отходов животноводства /
Е.В. Климова // Экологическая безопасность в АПК. - 2006.- № 3.- С. 737.
108
41.
Климова, Е.В. Мощный источник энергии (технология переработки навоза) /
Е.В. Климова // Инженерно-техническое обеспечение АПК. - 2002. - № 3. - С. 847.
42.
Клуге, Р. Биогаз: исследование химического состава отходов брожения / Р.
Клуге // Новое сельское хозяйство. - 2010. - №2. - С. 80 - 83.
43.
Ковалев, Н.Г. Биоконверсия отходов животноводства / Н.Г. Ковалев // Вест-
ник Российской академии сельскохозяйственных наук. - 2003. - №2. - С.28-30.
44.
Ковалев, Н.Г. Утилизация органического сырья биоконверсией в удобрения /
Н.Г. Ковалев, В.Г. Полозова, И.Н. Барановский // Техника и оборудование для села. 2009. - №1. - С. 25-27.
45.
Кореньков, Д.А. Удобрения, их свойства и способы их использования // Д.А.
Кореньков. - М., 1982. – 415 с.
46.
Константинов, В.Н. Мезофильная анаэробная ко-обработка городских
твердых отходов со свиным навозом в пилотной биогазовой установке объемом 20 л / В.Н. Константинов // Инженерно-техническое обеспечение АПК. 2009. - № 2. - С. 571-571.
47.
Константинов, В.Н. Лабораторные опыты по производству биогаза из ко-
субстратов: отходы пищевой промышленности и коровий навоз в разных пропорциях / В.Н. Константинов // Инженерно-техническое обеспечение АПК. - 2009. № 3. - С. 873-873.
48.
Корзникова, М.В. Оценка степени конверсии органического вещества отхо-
дов животноводства и птицеводства в биогаз (на примере РФ) / М.В. Корзникова,
А.Ю. Блохин, Ю.П. Козлов // Вестник Воронежского государственного университета. Серия: Химия. Биология. Фармация. – 2008. - №2– С.108-111.
49.
Корзникова, М.В. Получение и использование биогаза в Российской Феде-
рации при переработке отходов сельскохозяйственного производства / М.В. Корзникова, А.Ю. Блохин, Ю.П. Козлов // Вестник Росс. у-та дружбы народов: экология и безопасность жизнедеятельности. - 2008. - № 3. - С. 17-22.
50.
Королько, А.А. Получение биогаза на молочной ферме путем утилизации
навоза и использование его для выработки электроэнергии с помощью микротур-
109
бинного генератора / А.А. Королько // Инженерно-техническое обеспечение АПК.
- 2006. - № 2. - С. 581.
51.
Костромин, Д.В. Анаэробная переработка органических отходов животно-
водства в биореакторе с барботажным перемешиванием : дис. … канд. техн. наук :
05.20.01 / Костромин Денис Владимирович. - Йошкар-Ола, 2010. - 183 с.
52.
Кошкин, М.В. Перспективы использования биогаза / М.В. Кошкин, И.В.
Решетникова, А.В. Савушкин // Механизация и электрификация сельского хозяйства. - 2009. - №6. - С.33-34.
53.
Кривых, Л.И. Утилизация отходов с животноводческих комплексов и ферм:
практ. руководство / Л.И. Кривых. - Барнаул: РИО АИПКРС АПК, 2005. - 40 с.
54.
Кутьева, Т.Ю. Биоудобрения из отходов животноводства (бамил, омуг, экуд,
пудрет): влияние на продуктивность растений и свойства почв : дисс. … канд.
биол. наук : 06.01.04 / Кутьева Татьяна Юрьевна. - М., 2002 .- 187 с.
55.
Кухаренко, А.А. Возможные пути интенсификации процесса брожения /
А.А. Кухаренко, М.Н. Дадашев, В.М. Короткий и др. // Производство спирта и ликероводочных изделий. - 2008. - № 2. - С. 16-18.
56.
Лазарчик В.М. Вермикомпосты на основе разных субстратов / В.М. Лазарчик,
A.M. Головков, В.Е. Лазарчик и др. // Агрохимический вестник. - 2005. - №3. - С. 14-17.
57.
Ленинджер, А. Основы биохимии / А. Ленинджер. – М: Мир, 1985. - 367 с.
58.
Лозановская, И.Н. Теория и практика использования органических удобре-
ний / И.Н. Лозановская, Д.С. Орлов, П.Д. Попов. - М.: Агропромиздат, 1987. - 95 с.
59.
Лысенко. В.П. Подготовка, переработка помета на птицефабриках и использо-
вание его в земледелии / В.П. Лысенко. - ВНИТИП : Сергиев Посад. - 2001. - 108 с.
60.
Лысенко В. Утилизация органических отходов / В. Лысенко // Животновод-
ство России. – 2007. – № 3. – С. 8-9.
61.
Мартынов, А.Ю. Переработка органических отходов мясокомбинатов мето-
дом анаэробного сбраживания / А.Ю. Мартынов, Л.Л. Никифоров, Г.С. Руденко //
Мясная индустрия. - 2003. - №28. - С. 14-17.
110
62.
Мерзлая Г.Е. Методика и результаты исследований эффективности компо-
стов и вермикомпостов / Г.Е. Мерзлая // Дождевые черви и плодородие почв: мат.
II Междунар. науч.-практ. конф. – Владимир, 2004. - С. 150-152.
63.
Мерзлая, Г.Е. Птичий помет - ценное сырье / Г.Е. Мерзлая // Птицеводство.
- 2009. - №6. - С. 13-14.
64.
Мерзлая, Г.Е. Технологии утилизации помета / Г. Мерзлая, Н. Корнева, В.
Тюрин и др. // Птицеводство. - 2009. - №1. - С. 48-50.
65.
Милевская, И.А. Приемы воспроизводства плодородия мелиорированных
почв с использованием нетрадиционных удобрений / И.А. Милевская // Экологическая безопасность в АПК. - 2005. - № 4. - С. 898.
66.
Мокрушина, Н.С. Биоконверсия древесных отходов методом компостирования
с получением органического удобрения / Н.С. Мокрушина, Т.С. Тарасова, И.В. Дармов // Известия Самарского научного центра РАН. - 2009. - Т.11. - № 1. - С. 228-231.
67.
Монастырский, O.A. Влияние биопрепаратов натразвитие и токсинообразова-
ние полевых штаммов Fusarium qraminearum / O.A. Монастырский, В.А. Ярошенко //
Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук. - 2002. - №3. - С.22-23.
68.
Морозова А.И. Переработка вторичного кератинсодержащего сырья и полу-
чение белковых гидролизатов на пищевые и кормовые цели / А.И. Морозова, О.О.
Бабич, И.С. Разумникова, и др. // Техника и технология пищевых производств. Кемерово, 2011. - №2 (21). – С. 7- 11.
69.
Морозов Н.М. Экологические требования к средствам механизации уборки
и переработки навоза / Н.М. Морозов, В.А. Денисов // Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. - 2003. - №1. - С.21-24.
70.
Мякиньков, А.Г. Получение коллагеновых субстанций на основе фермента-
тивной обработки вторичного сырья мясной промышленности / А.Г. Мякиньков //
Пищевая и перерабатывающая промышленность. - 2003. - № 2. - С. 786.
71.
Никольская, С.А. Химическое строение и свойства текстильных волокон
/А.С. Никольская, О.Г. Цирнкина . – Иваноская государственная текстильная академия, Иваново, 2003. – 24 с.
111
72.
Новородовская, Т.С. Краткий курс химической технологии волокнистых
материалов / Т.С. Новородовская, С.Ф. Садов. – М.: Легпромбытиздат, 1986. – 200
с.
73.
О реализации федеральной целевой программы "Социальное развитие села
до 2013 года: Приказ Минсельхоз РФ от 26.12.2012 г. №27481 // Собрание законодательства РФ. – 2012. - № 12. - С 1420.
74.
Олива, Т.В. Опыт применения нетрадиционных кормовых добавок / Т.В. Олива,
И.В. Николаева // Успехи современного естествознания. - 2007. - № 12. - С. 228-228.
75.
Осипова, Н.И. Ветеринарно-санитарные и гигиенические меры по сбору и
утилизации органических отходов / Н.И. Осипова // Экологическая безопасность в
АПК. - 2007. - № 1. - С. 177.
76.
Осипова, Н.И. Новые технологии в утилизации органических отходов и
реабилитации почвы / Н.И. Осипова // Ветеринария. - 2009. - № 2. - С. 281-281.
77.
Осипова, Н.И. Санитарно-бактериологическая оценка органических отходов
животноводческих предприятий / Н.И. Осипова // Ветеринария. - 2008. - № 1. - С. 4.
78.
Пат. №2347808 РФ, МПК7 C12N1/20. Биопрепарат из эффективных микро-
организмов для деградации органических отходов / Афанасьев, Е.Н.
-
№2007129820/13; заявл.06.08.2007; опубл. 27.02.2009.
79.
Пат. РФ № 2167829 МПК 7 C02 F3/00 2F11/04. Установка комплексной пе-
реработки навоза сельхозотходов / Тумченок В.И. - 99107619/13; заявл.
12.04.1999; опубл. 27.05.2001.
80.
Пат. РФ № 2136615 МПК6 C02 F11/12. Способ переработки жидких отхо-
дов в биотопливо / Торккели Э. - 98101196/25; заявл. 26.06.1996; опубл.
10.09.1999.
81.
Пат. №2286982 РФ, МПК7,C05F11/08. Способ приготовления бактериаль-
ного удобрения на основе биогумуса / Кощаев, А.Г. - №2004135696/13; заявл.06.12.2004; опубл. 20.05.2006.
82.
Пат. РФ №2314693 МПК7 A01 C12 N001/20. Ассоциация бактерий для по-
лучения биопрепарата, биопрепарат, повышающий плодородие почвы и оздоравливающий ее, обладающий противогрибковыми и стимулирующими рост расте-
112
ний свойствами, и способ его получения / Буяновский Э. К., Кудряшова Е. Б.,
Санцевич Н. И. - 2005124138/13; опубл. 20.01.2008.
83.
Пат. РФ №95106326 МПК6 C12M1/10. Биоконверсионная установка / Соко-
лов Д.П. Винаров А.Ю. Смирнов В.Н. - 95106326/13; опубл. 27.01.1997.
84.
Пат. РФ №2294319 МПК7 C05F9/00. Способ переработки твердых бытовых
отходов / Лихачев Ю. М., Гарабаджиу А. В., Козлов Г. В. - 2005124209/12; опубл.
27.02.2007.
85.
Пат. РФ №1477694 МПК7 Установка для сбраживания отходов животного и
растительного происхождения с образованием биогаза / Семененко И. В. 4299995; опубл. 07.05.1989.
86.
Патент №2286980 РФ, МПК7, C05F11/08. Способ получения микробиоло-
гического удобрения / Кощаев, А.Г. - №2004135694/13; заявл. 06.12.2004; опубл.
20.05.2006.
87.
Пат. №2409537 РФ, МПК7, C05F3/00. Способ переработки птичьего помета
и свиного навоза в органическое удобрение / Подгорнов, П.А. - №2009126086/05;
заявл. 07.07.2009; опубл. 20.01.2011.
88.
Пат. РФ №2441720 МПК7 B09 B300 C1 . Способ комплексной переработки
органических отходов / Смирнов Ю.Д., Ковшов С.В., Никулин А.Н. и др. –
2010132505/13; заявл. 02.08.2010; опубл. 02.08.2010.
89.
Пат. РФ №116011 МПК7
A01G.
Биокомплекс / Яруткин А.В., Разин Д.В. –
Заявл. 09.12.2011; опубл. 20.05.2012.
90.
Пат. РФ № 69698 МПК7
A01G.
Биокомплекс / Кабилов З.А. – Заявл.
31.07.2007; опубл. 10.01.2008.
91.
Пат. РФ № 2249580 МПК7 C05 F3/00. Способ переработки и утилизации ор-
ганосодержащих отходов / Чертес К.Л., Быков Д.Е., Тупицына О.В и др. –
2003101872/12; заявл. 23.01.2003; опубл 27.09.2004.
92.
Пат. РФ № 2151133 МПК7 C05F3 00, A23K1 00. Способ биоконверсии орга-
нических отходов в кормовую добавку / Ковалев Н.Г., Рабинович Г.Ю., Степанок
В.В. и др. - 98121120/13; заявл. 17.11.1998; опубл. 20.06.2000.
113
93.
Пат. №2186753 РФ, МПК7, C05F11/08. Способ биоконверсии органических
отходов для получения модифицированного удобрения и питательного субстрата /
Чекасина, Е.В. - №2000115249/13; заявл. 15.06.2000; опубл. 10.08.2002.
94.
Пат. №93030782 РФ, МПК6, C05F11/08. Способ биологической переработки
птичьего помета / Чекасина, Е.В. - №93030782/13; заявл. 17.06.1993; опубл.
20.04.1997.
95.
Пат. РФ № 2150198 МПК 7 A01 K67033 C05 F3/06. Установка для перера-
ботки навоза на белковый корм и удобрение / Коноводов А.А. - 99121544/13; заявл. 18.10.1999; опубл. 10.06.2000.
96.
Патент РФ №2192403 МПК7 C05 F11/08. Способ получения органо-
минерального удобрения / И.В. Волчатова, С.А. Медведева, Э.И. Коломиец и др. 2000116745/13; заявл. 23.06.2000; опубл: 10.11.2002.
97.
Пат. №2153262 РФ, МПК7, A23K1/00. Способ получения кормовой добавки
биоконверсией органических отходов / Ковалев Н.Г. - №99100876/13; заявл.
14.01.1999; опубл. 27.07.2000.
98.
Пат. №2003138195 РФ, МПК7, C12P1/00. Способ получения биологически
активного средства биоконверсией органического сырья / Рабинович Г.Ю. №2003138195/13; заявл. 31.12.2003; опубл. 10.06.2005.
99.
Пат. №2034924 РФ, МПК7, C 12 N 9/50. Штамм Streptomyces ornatus проду-
цент кератиназы / Бандоян А.К. - № 93011685/13; заявл. 03.03.93; опубл. 10.05.95.
100. Пискурева, В.А. Использование отходов сельскохозяйственного производства для получения белково-углеводных кормовых добавок с разными функциональными свойствами / В.А. Пискурева, И.А. Гнеушева, Н.Е. Павловская // Вестник
ОрелГАУ. - 2010. - №6. - С. 109-111.
101. Покровская, С.Ф. Использование дождевых червей для переработки органических отходов и повышения плодородия почв: автореф. дис. … канд. биол. наук.Москва, 1991.- 22 с.
102. Попова, Е.Б. Технология ускоренного производства биокомпостов / Е.Б. Попова // Инженерно-техническое обеспечение АПК. - 2004. - № 1. - С. 194.
103. Просеков, А.Ю. Опыт кафедры «Бионанотехнология» Кемеровского техно-
114
логического института пищевой промышленности в области биотехнологии получения рекомбинантных ферментных препаратов / А.Ю. Просеков, О.О. Бабич,
Л.С. Солдатова // Техника и технология пищевых производств.- 2012.- Т. 3.- №
26.- С. 102-111.
104. Прудова, Л.Ю. К вопросу характеристики пленкообразных структур, получаемых в процессе биоконверсии отходов птицепепрерабатывающей отрасли / Л.Ю.
Прудова, Т.Е. Данилова, В.Ж. Цыренов и др. // Вестник Восточно -Сибирского государственного технологического университета. - 2010. - № 4. - С. 89-95.
105. Рабинович, Г.Ю. Роль биодобавок в интенсификации процесса биоферментации / Г.Ю. Рабинович, Н. Г. Ковалев, Э.М. Сульман // Докл. РАСХН, 1999. №4. - С. 57-60.
106. Репин, П.С. Биоконверсия отходов масложировой промышленности липазой
дрожжей Yarrowialipolytica / П.С. Репин, О.С. Корнеева, О.В. Карманова // Фундаментальные исследования. - 2010. - № 12. - С. 147-152.
107. Решетникова, И.В. Отходы – на службу сельской энергетике / И.В. Решетникова, М.А. Валиулин, С.П. Игнатьев // Механизация и электрификация сельского хозяйства. - 2008. - №12. - С.56-57.
108. Савушкин, А.В. Альтернативное топливо в сельском хозяйств / А.В. Савушкин, В.С. Вохмин, И.В. Решетникова // Механизация и электрификация сельского
хозяйства. - 2009. - №4.- С.37-38.
109. Садыкова, В.С. Антагонистическая и ростстимулирующая активность
штаммов родов Trichoderma и перспективы их использования в биоконтроле /
В.С. Садыкова, И.Н. Третьякова, Н.Е. Носкова и др. // Иммунопатология, аллергология, инфектология. – 2009. – №2. – С. 71-72.
110. Санжаровская, М.И. Биоконверсия органических отходов как способ повышения экологической чистоты производства и окружающей среды / М.И. Санжаровская // Инженерно-техническое обеспечение АПК. - 2008.- № 3. - С. 710-710.
111. Санжаровская, М.И. Технологии и оборудование для переработки навоза / М.И.
Санжаровская // Инженерно-техническое обеспечение АПК. - 2009. - № 1. - С. 275-275.
115
112. Сенько, О.В. Переработка отходов сельского хозяйства в коммерчески значимые продукты / О.В. Сенько, Н.А. Степанов, Д.А. Гудков. // Образование и наука XXI
века: 8-я междунар. научн.-практ. конф. – Болгария, 2012. – Т. 42. – С. 55–57.
113. Серегина, Е.В. Переработка дождевыми червями некоторых с/х отходов в
биогумус / Е.В. Серегина, Д.Г. Звягинцев и др. // Микроорганизмы в с/х: тезисы
докл. конф.- Пущино, 1992. - 183 с.
114. Сидоренко, О.Д. Биологические технологии утилизации отходов животноводства: учеб. пособие / О.Д. Сидоренко, Е.В. Черданцев. - М.: Изд - во МСХА,
2001. - 74 с.
115. Сидоренко, О.Д. Технология биоконверсии отходов сельскохозяйственного
производства: учебное пособие. - М.: ФГОУ ВПО МСХА им. Тимирязева, 2006. - 83 с.
116. Сидоренко, О.Д. Проблемы эффективного использования отходов сельского
хозяйства / О.Д. Сидоренко // Агрохимия. - 2009. - №2. - С. 87-92.
117. Смирнова, В.Д. Интенсификация процесса биоконверсии отходов пищевой
промышленности в дрожжевую массу кормового назначения / В.Д. Смирнова,
И.В. Балакирев, Е.В. Башашкина и др. // Химическая промышленность сегодня. 2010. - № 8. - С. 10-15.
118. Сорокин, О.А. Переработка отходов сельскохозяйственных производств биококнверсией / О.А. Сорокин // Промышленная энергетика. - 2005. - № 8. - С. 39-44.
119. Соуфер, С. Биомасса как источник энергии / С. Соуфер, О. Замойски. - М.:
Мир, 1985. - 368 с.
120. Стабникова, Е.В. Скрининг носителя для бактерий, очищающих почву от
нефтяных загрязнений / Е.В. Стабникова // Микробиологический журнал. - 1998. 60. - № 2. - С. 85-90.
121. Стадник, Б.Г. Новое направление в биологизации земледелия / Б.Г. Стадник
// Химия в сельском хозяйстве. - 1994. - №3. - С. 23-24.
122. Степень, Р.А. Альтернативные пути рациональной переработки древесных
отходов / Р.А. Степень, С.М. Репях // Инвестиционный потенциал лесопромышленного комплекса Красноярского края: мат. науч.-практ. конф. - Красноярск,
2001. - С. 14–19.
116
123. Тарханов О.В. На пути к теории аграрного производства / О.В. Тарханов. Уфа: Изд-во ВЭГУ, 2008. – С. 189.
124. Тарханов, О.В. Основы теории аграрного производства / О.В. Тарханов. Уфа: Изд-во Системы и технологии, 2008. – С. 33.
125. Тарханов, О.В. Органо-минеральные удобрения на основе свежезаконсервированной органики / О.В. Тарханов, Л.С. Тарханова, В.М. Валеев // Почвы, жизнь,
благосостояние. - 2000. – С. 424.
126. Тарханов, О.В. Плодородие без гумуса и удобрений / О.В. Тарханов // Химия и жизнь. - 2008. - № 3. - С. 24.
127. Тарханов, О.В. Технологическая реформа сельского хозяйства как средство
против войны / О.В. Тарханов. - М. : Книга и Бизнес, 2006. - 218 с.
128. Тарханов, О.В. Экология и агроценоз / О.В. Тарханов // Экология и жизнь. –
2011. - № 2.- С. 12-19.
129. Тен, Х.М. Влияние компостной закваски на ускорение компостирования органических веществ / Х.М. Тен, В.Ф. Чень, Е.Л. Имранова // Агрохимия. - 2004. №2. - С. 63–66.
130. Тимофеевская С.А. Биоконверсия твердой фазы сточных вод мясокомбинатов / С.А. Тимофеевская // Пищевая и перерабатывающая промышленность. 2006. - № 4. - С. 1245-1245.
131. Фадеева, И.В. Отработка условий биоконверсии отходов спиртовой промышленности с помощью молочнокислых бактерий и базидиальных грибов / И.В.
Фадеева, Н.А. Атыкян, В.В. Ревин // Вестник Нижегородского университета им.
Н.И. Лобачевского. - 2009. - №6. - С. 113-119.
132. Филиппова, А.В. Влияние птичьего помета, используемого в качествекормовой базы, на численность красного калифорнийского гибрида дождевых червей
/ А.В. Филиппова // Ветеринария и кормление. – 2009. – № 5. – С. 26–27.
133. Филиппова, А.В. Использование отходов для улучшения почв орошаемых участков / А.В. Филиппова, Н.М. Глунцов // Плодородие. – 2003. – № 4 (13). – С. 271–273.
117
134. Фисин, В.И. Использование птичьего помета для получения микробных
удобрений с полифункциональными свойствами / В.И. Фисин, И.А. Архипченко,
Э.В. Попова, И.Э // Докл. РАСХН, 1998. - №4. - С. 32-34.
135. Химическая энциклопедия: В 5 т.: т.1: А-Дарзана /Редкол.: Кнунянц И. Л.
(гл. ред. ) и др. – М.: Сов. энцикл., 1988. – 623 с
136. Чернова, О.Ф. Атлас волос млекопитающих. (Тонкая структура остевых волос и игл в сканирующем электронном микроскопе) / О.Ф. Чернова, Т.Н. Целикова. - М.: Товарищество научных изданий КМК, 2004. - 428 с.
137. Чернова, О.Ф. Новый пример морфологической конвергенции: сходство архитектоники волоса и пера / О.Ф. Чернова // Докл. АН. - 2005. - Т. 405. - № 3.- С.
425-429.
138. Чернова, О.Ф. Полиморфизм архитектоники дефинитивных покровных
перьев / О.Ф. Чернова // Докл. АН. - 2005. - Т. 405. - № 3. - С. 1-7.
139. Чернова, О.Ф. Эволюционные аспекты полиморфизма волос / О.Ф. Чернова
// Изв. РАН. Сер. биол. - 2006. - № 1. - С. 52-63.
140. Юданова, А.В. Повышение эффективности производства удобрений путем
оптимизации параметров двухстадийной биоферментации навоза и помета / А.В.
Юданова // Инженерно-техническое обеспечение АПК. - 2001. - № 1. - С. 255.
141. Agunwamba, J.C. Solid waste management in Onitsha, Nigeria / J.C. Agunwamba,
O.K. Ukpai, I.C. Onyebuenyi // Waste Management and Research. - 1998. - 16 (1). - Р. 23-31.
142. Ander, P. Selective degradation of wood components by whiterot fungi / P. Ander, K.E. Eriksson // Physio. Plant. - 1977. - 41. - Р. 239-248.
143. Angelidaki, I.A Mathematical Model for Dynamic Simulationof Anaerobic Digestion of Complex Substrates: Focusing on Ammonia Inhibition / I. Angelidaki, L.
Ellegaard, B.K. Ahring // Biotechnology and Bioengineering. - 1993. - 42. - Р. 159-166.
144. Angelidaki, I.A Comprehensive Model of AnaerobicBioconversion of Complex
Substrates to Biogas / I.A. Angelidaki, L. Ellegaard, B.K. Ahring // Biotechnology and
Bioengineering. - 1999. - 63 (3). - Р. 363–372.
118
145. Angelidaki, I. Thermophilic anaerobic digestion of source-sorted organic fraction of
household municipal solid waste: Startup procedure for continuously stirred tank reactor / I.
Angelidaki, X. Chen, J. Cui, et al // Water Research. - 2006. -40. - P. 2621-2628.
146. Bajpai, P. Application of xylanases in prebleaching bambookraft pulp / P. Bajpai,
P.K. Bajpai // Tappi J. - 1996. - 79. - Р. 225–230.
147. Bahukhandi, D. Cultivation of Pleurotus sp. on different agricultural residues / D.
Bahukhandi, R.L.Munjal // Indian Phytopath. - 1989. - 42(4). - Р. 492-495.
148. Bhandari, T.P.S. Cultivationof oyster mushroom on different substrates / T.P.S.
Bhandari, R.N. Singh, B.L.Verma // Indian Phytopath. - 44(4). - Р. 555-557.
149. Bisaria, V.S. Bioprocessing of Agro-residues to glucose and chemicals / V.S.
Bisaria // Elsevier. - 1991. - Р. 210-213.
150. Burns, R.T. Moody. Development of a standard method for testing mechanical
manure solids separators / R.T. Burns, L.B. Moody. - ASAE St. Joseph: MI., 2003
151. Burton, C.H. Manure Management / C.H. Burton, C. Turner // Treatment Strategies for Sustainable Agriculture. – 2003. - №2. – P. 451
152. Das, N. Cultivation of Pleurotusostreatus on weed plants / N. Das, M. Mukherjee
// Biores. Technol. - 98(14) .- Р. 2723-2726.
153.
Edelmann, W.
Environmental aspects of the anaerobic digestion of the organic frac-
tion of municipal solid wastes and of solidagricultural wastes / W. Edelmann, U. Baier,
H. Engeli // Modern Technol. of Agro Processing and Agricultural Waste Products. –
2001. – Vol.52 – P.203.
154. Eduljee, G.H. The effect of changing waste management practices on
PCDD/PCDT releases from household waste recycling and disposal processes / G.H.
Eduljee, P. Dyke, P.W. Cains // Chemosphere. - 1997. - 34 (5-7). - Р. 1615-1622.
155. Kabak, B. Binding of aflatoxin Mi by Lactobacillus and Bifidobacterium / B.
Kabak, I. Var //Milchwissenschaft. - 2004. - №5. - P.301-303.
156. Kakeya, H. Biotransformation of the mycotoxin, zearalenone, to a non-estrogenic
compound by a ftmgal strain of clonostachys sp. / H. Kakeya, N. Takahashi-Ando, M.
Kimura // Biosci. Biotechnol. and Biochem. 2002. - №12. -P.2723-2726.
119
157. Kadota, J.Modified lignophenols to polyuretans glues / J. Kadota, K. Hasegawa,
M. Funaoka // Nippon setchaku gakkaishi J. Adhes. Soc. Jap. - 2004. - Vol. 40. - №9. P. 380–384.
158. Labrie, C. Effect of waste-based composts produced by two-phase composting on
two oomycete plant pathogens / C. Labrie, P. Leclers, C. Beaulieu // Plant and soil. 2001. - Vol. 235. - P. 27–34.
159. Leschine, S.B. Cellulose degradation in anaerobic environments / S.B. Leschine //
Annu. Rev.Microbiol. - 1995. - 49. - Р. 399–426.
160. Linnik, A.I. Optimization of cultivation parameters Bacillus subtilis / A.I. Linnik,
O.O. Babich, A.J. Prosekov, P.V. Mitrohin // 3rd International scientific conference
"European Applied Sciences: modern approaches in scientific researches". – Germany:
Stuttgart, 2013. – Vol. 2. - P. 35-37.
161. Mansfield, S.D. Characterization ofendoglucanases from the brown rot fungi
Gloeophyllum sepiarium and Gloeophyllum trabeum / S.D. Mansfield, J.N. Saddler,
G.M. Gübitz // Enzyme Microb Technol. - 1998. –Vol. 23. - Р. 133–140.
162. Schink, B. Energetics of syntrophic cooperation in methanogenic degradation / B.
Schink // Microbiologyand Molecular Biology Reviews. - 1997. - 61 (2). - Р. 262-280.
163. Schweizer, J. New consensus nomenclature for mammalian keratins / J.
Schweizer, P.E. Bowden, P.A. Coulombe, L. Langbein, E.B. Lane, T.M. Magin, L.
Maltais, M.B. Omary, D.A. Parry, M.A. Rogers, M.W. Wright // J Cell Biol. – 2006. 174 (2): Р. 169-174. DOI:10.1083/jcb.200603161
164. Shi, C. Action nitrogen-fixed microorganisms on the contents of nitrogen in
сompost / C. Shi, J. Pu, Z. Zheng // Chin. J. Appl. and Environ. Biol. - 2002. - Vol. 8,
№4. P. 419–421.
165. Stiller, H.A. Co-processing of agricultural and biomass waste with coal / A.H.
Stiller, D.B. Dadyburjor, J-P. Wann // Fuel Processing Technology. – 1996. – Vol. 49. –
P. 167–175.
166. Svensson, K. The fertilizing effect of compost and biogas residues fromsource
separated household waste / K. Svensson, M. Odlare, M.J. Pell // Agric. Sci. - 2004. 142. - Р. 461-467.
120
ПРИЛОЖЕНИЯ
121
ПРИЛОЖЕНИЕ А
122
ПРИЛОЖЕНИЕ Б
123
ПРИЛОЖЕНИЕ В
124
ПРИЛОЖЕНИЕ Г
125
126
127
ПРИЛОЖЕНИЕ Д
128
129