Исследование методом ЯМР связывания сывороточного
реклама
Электронный журнал «Структура и динамика молекулярных систем». №6,А, 2009 г УДК 538.955, 577.322.23 ИССЛЕДОВАНИЕ МЕТОДОМ ЯМР СВЯЗЫВАНИЯ СЫВОРОТОЧНОГО АЛЬБУМИНА С ЖИРНЫМИ КИСЛОТАМИ 1 Гумерова А.В., Рудакова М.А., Филиппов А.В., Скирда В.Д. Казанский государственный университет им. В.И. Ульянова-Ленина 420008, Казань, ул. Кремлевская, 18, кафедра физики молекулярных систем E-mail: alisa.gumerova@mail.ru, тел: ( 843 ) 2315189 Альбумин, являющийся основным компонентом белковой составляющей плазмы крови, выполняет важную функцию транспорта и депонирования жирных кислот, гормонов, лекарств и т.д. Существует предположение об изменении конформации молекул альбумина и, соответственно, изменения его способности к связыванию жирных кислот, при его взаимодействии с опухолевыми метаболитами, появляющимися в крови при развитии онкологических заболеваний. Интересным подходом, позволяющим получать детальную информацию о сайтах связывания альбумина и его конформации, является исследование 13С-метилзамещенных жирных кислот, взаимодействующих с альбумином, при помощи метода ЯМР, а именно методики [1H,13C] HSQC NMR. В работе обсуждается результат применения данной методики с целью получения информации об особенностях конформации альбумина в присутствии эндогенных жирных кислот в контексте поиска основы для разработки диагностики онкологических заболеваний по компонентам крови. Альбумин – белок, составляющий 40-60% от общего количества белка плазмы крови. Основная роль альбумина – участие в поддержании онкотического давления плазмы и объема циркулирующей крови, а также транспорт и депонирование различных веществ. Период полураспада альбумина в крови составляет 18-20 дней. Он связывает неполярные вещества, в первую очередь жирные кислоты, билирубин и холестерин, является переносчиком ряда гормонов. Около 40% кальция плазмы крови обратимо связывается с альбумином, находясь в подвижном равновесии с физиологически активным ионизированным кальцием плазмы крови [1]. Также альбумин в организме выполняет функцию транспорта и депонирования целого ряда разнообразных по своей химической структуре лекарственных веществ. Таким образом, эффективность действия лекарств во многом определяется особенностями их взаимодействия с альбумином. При этом в организме одни лекарства могут оказывать влияния на эффективность других лекарств за счет их конкурентного связывания с молекулами альбумина [2]. На сегодняшний день альбумин активно исследуется не только как белок с уникальными свойствами и функциями, осуществляемыми в организме, но и как биомаркер патологических процессов. В частности, при онкологических заболеваниях с молекулами альбумина способны связываться опухолевые метаболиты, распространяемые с током крови, вызывая определенную конформационную перестройку [3]. Таким образом, посредством исследование конфор1 Работа выполнена при поддержке тематического плана НИР КГУ по заданию Федерального агентства по образованию РФ в 2009 г. ЕЗН № 1.3.09 26 Электронный журнал «Структура и динамика молекулярных систем». №6,А, 2009 г мационных особенностей альбумина представляется возможным получение информации о развитии онкологических заболеваний. В связи с чем актуальным представляется вопрос о конформации молекулы альбумина в присутствии опухолевых метаболитов. Поскольку одной из основных функций альбумина является перенос жирных кислот, то именно для них молекула альбумина обладает значительным числом сайтов связывания (семь), при этом особенности связывания определяются конформацией молекулы альбумина [2]. Соответственно, характеристики связывания альбумина с жирными кислотами могут служить критериями для оценки конформационного состояния самой молекулы альбумина. Известно, что при связывании различных метаболитов, в том числе опухолевых, происходит изменение конформации альбумина, что приводит к изменению как числа возможных сайтов связывания жирных кислот, так и вероятности такого связывания [1, 2]. Таким образом, становится возможным исследовать особенности структуры альбумина посредством исследования комплекса альбумин – жирные кислоты. Один из наиболее эффективных подходов в исследовании свойств белковых молекул, в частности, конформации и особенностей связывания с различными веществами, заключается в ЯМР-исследовании меченых молекул, например, меченых стабильными радикалами или определенными изотопами. При этом могут применяться как меченые молекулы белков или их фрагменты, так и молекулы, участвующие во взаимодействии с белковой молекулой. Одним из примеров вышеизложенного подхода является изучение 13С-метилзамещенной-олеиновой кислоты при помощи методики [1H,13C] HSQC NMR, которая позволяет оценить количество сайтов связывания альбумина, доступных для связывания жирных кислот. Преимуществом использования 13С-метилзамещенной-олеиновой кислоты для изучения конформации альбумина является то, что она содержит единственный изотоп 13С, дающий ЯМР-сигнал, а, следовательно, одной молекуле, связанной в определенном сайте связывания альбумина, соответствует один кросс-пик в двумерном ЯМР-спектре [4]. Таким образом, анализ ЯМР-спектра молекул 13С-метил-замещенной-олеиновой кислоты позволяет получить непосредственную информацию о способности альбумина к связыванию жирных кислот, соответственно, данная кислота может использоваться в качестве «зонда» для изучения конформации альбумина. С другой стороны, в приведенном примере в качестве объекта исследования был выбран альбумин, очищенный от жирных кислот. В нативных условиях, а точнее, в условиях функционирования в организме, большинство сайтов связывания жирных кислот альбумина оказываются занятыми. В связи с чем актуальной представляется задача определения способности молекул 13Сметил-замещенной-олеиновой кислоты замещать в сайтах связывания альбумина природные жирные кислоты, что может оказаться ключевым в разработке методов диагностики онкологических заболеваний. Основная идея построения такой методики диагностики состоит в отслеживании наличия опухолевых метаболитов в крови по характерному изменению конформации альбумина. Необ27 Электронный журнал «Структура и динамика молекулярных систем». №6,А, 2009 г ходимо уметь получать такую информацию в присутствии эндогенных жирных кислот. Таким образом, целью данной работы являлось исследование связывания молекул 13С-метил-замещенной-олеиновой кислоты с молекулами альбумина, не очищенного от эндогенных жирных кислот, при помощи методики [1H,13C] HSQC NMR. Материалы и методы Для приготовления образцов использовался человеческий сывороточный альбумин не очищенный от жирных кислот (фирма Fluka 05420), а также 13Сметил-замещенная олеиновая кислота (фирма Cambridge Isotope Laboratories, CLM-2492-0). Олеиновая кислота (рисунок 1) предварительно растворялась в дейтерированном диметилсульфоксиде в концентрации 100 мМ. Для растворения альбумина использовался фосфатный буферный раствор 50 мМконцентрации на основе дейтерированной воды, pH=7.0. Альбумин растворялся в буферном растворе в концентрации 0.5 мМ. Раствор олеиновой кислоты добавляли к раствору альбумина в объемном соотношении 1:5, обеспечивающем соотношение – 40 молекул олеиновой кислоты на одну молекулу альбумина. Далее образец тщательно перемешивался и выдерживался в течение 2 часов при комнатной температуре для установления равновесия. Рис. 1. 13С- метил-замещенная олеиновая кислота в соотношении 1:40 Следует отметить, что образцы готовились аналогично образцам, описанным в работе [4]. Главное отличие заключается в том, что целью нашей работы являлось исследование альбумина не очищенного от жирных кислот, по этой причине для увеличения вероятности связывания альбумина с молекулами олеиновой кислоты, концентрация олеиновой кислоты была увеличена в 10 раз по сравнению с концентрацией олеиновой кислоты в образцах, описанных в работе [4]. Двумерные спектры [1H,13C] HSQC NMR регистрировались на ЯМРспектрометре “AVANCE IITM-500”( Bruker BioSpin GmbH) с рабочей частотой на протонах 500 МГц при температуре 30°С. Результаты и обсуждение На рисунке 2 представлен фрагмент двумерного [1H,13C] HSQC спектра комплекса альбумин /13С-метил-замещенная олеиновая кислота в соотношении 1:40. Как можно видеть (рисунок 2) в спектре присутствуют 7 кросс-пиков, отражающих спин-спиновое взаимодействие ядер 1H и 13C метильных групп мо28 Электронный журнал «Структура и динамика молекулярных систем». №6,А, 2009 г лекул олеиновой кислоты. Положение кросс-пиков объясняется тем, что метильная группа молекулы олеиновой кислоты, связавшиеся в одном из возможных сайтов связывания с альбумином, находится в локальном окружении, отличном от окружения метильных групп меченых олеиновых кислот в остальных сайтах связывания, что обусловливает различие в химических сдвигах ЯМР-сигналов ядер 1H и 13C метильных групп молекул меченой олеиновой кислоты. Рис. 2. Фрагмент спектра 2D [1H,13C] HSQC NMR комплекса альбумин / 13С- метилзамещенная олеиновая кислота в соотношении 1:40 Сравнивая полученные результаты с данными работы [4], в первую очередь следует отметить совпадение положения шести кросс-пиков (на рисунке 2 они обозначены красным 1 – 6). Это означает, что молекулы олеиновой кислоты способны заместить эндогенные жирные кислоты в шести из семи сайтов связывания жирных кислот молекулы альбумина. Таким образом, в целом молекулы 13С-метил-замещенной олеиновой кислоты пригодны для использования в качестве «зонда» для исследования структуры молекул альбумина не очищенных от жирных кислот. При этом кросс-пик 7 на полученном нами спектре отсутствует. Это означает, что данный сайт оказался недоступен для связывания с олеиновой кислотой при данных условиях. Среди возможных причин следует отметить в первую очередь высокую аффинность связывания эндогенных жирных кислот с молекулой альбумина в данном сайте [2]. 29 Электронный журнал «Структура и динамика молекулярных систем». №6,А, 2009 г Вместе с тем в полученном нами двумерном спектре присутствует дополнительный кросс-пик, обозначенный на спектре X, который отсутствует на спектре, представленном в работе [4]. Данный кросс-пик X приписывается нами к молекулам олеиновой кислоты, не связанным с альбумином. Возможность присутствия в системе несвязанной 13С-метил-замещенной олеиновой кислоты объясняется тем, что на одну молекулу альбумина в данном случае приходится 40 молекул жирной кислоты. В ходе проделанной работы удалось установить, что применение 13Сметил-замещенной олеиновой кислоты в качестве зонда, позволяющего методом ЯМР получать информацию о структуре молекулы альбумина, оказывается весьма эффективным даже в состоянии, когда большинство сайтов связывания альбумина заняты эндогенными жирным кислотами, что делает этот метод перспективным в контексте поиска методики диагностики онкологических заболеваний. Получение более детальной информации о конформации альбумина предполагает решение задачи соотнесения кросс-пиков двумерных HSQC-спектров данной системы конкретным сайтам связывания жирных кислот молекулы альбумина, что и является предметом дальнейших исследований. Литература 1. Kragh-Hansen, U. Practical Aspects of the Ligand-Binding and Enzymatic Properties of Human Serum Albumin / U. Kragh-Hansen, V. T. G. Chuang, M. Otageri // Biological & Pharmaceutical Bulletin.- 2002.- V.25.- P. 695 – 704 2. Simard, J. R. Location of high and low affinity fatty acid binding sites on human serum albumin revealed by NMR drug-competition analysis / J. R. Simard, P. A. Zunszain, J. A. Hamilton, S. Curry // Analytical Biochemistry. -2006. – V. 347. - P. - 297–302 3. Lowenthal, M. S. Analysis of albumin-associated peptides and proteins from ovarian cancer patients / M. S. Lowenthal, A. I. Mehta, K. Frogale [et al.] // Clinical Chemistry. – 2005. - V. 51(10). – P. 1933–1945 4. Sarver, R.W. Determining molecular binding sites on human serum albuminby displacement of oleic acid /R. W. Sarver, H. Gao, F. Tian // Analytical Biochemistry. - 2005. – V. 347. - P. 297 –302 5. Kazmierczak, C. Electron Spin Resonance Spectroscopy Albumin: A Novel New Test for Cancer and Monitoring Steven / C. Kazmierczak, A. Gurachevsky, G. Matthes, V. Muravsky // Clinical Chemistry – 2006 – V.52 – P. 2129–2134 6. Matthes, G. Albumin transport analysis of different collected and processed plasma products by electron spin resonance spectroscopy / G. Matthes , G. Seibt, V. Muravsky, G. Hersmann, G. Dornheim // Transfusion and Apheresis Science. - 2002 –V. 27 - P. 129–135 30 Электронный журнал «Структура и динамика молекулярных систем». №6,А, 2009 г NMR STUDIES OF FATTY ACID / ALBUMIN BINDING Gumerova A.V., Rudakova M.A., Filippov A.V., Skirda V.D. Kazan State University, 420008, Kremlevskaya 18, Kazan, Russia Human albumin is one of main components of blood plasma. There is a suggestion about a specific modification of albumin by binding with fatty acids and about the changing of its conformation in the result of its interaction with oncogenic metabolites. One of most informative methods of studying of this binding is NMR [1H,13C] HSQC NMR technique. In this work we are discussing some results obtained after application of this NMR technique to study albumin – fatty acids binding with the aim to develop a method of diagnostics of oncological diseases which can be based on an analysis of dynamic behavior of the blood components. Keywords: albumin, HSQC NMR, binding sites, oleic acid Сведения об авторах № Ф.И.О. № 1 Гумерова Алиса Вагизовна 2 Рудакова Майя Анатольевна 3 Андрей Васильевич Филиппов 4 Скирда Владимир Дмириевич Должность и место работы Аспирант, КГУ им. В.И. Ульянова-Ленина Ассистент, КГУ им. В.И. Ульянова-Ленина д.ф.-м.н., доцент, КГУ им. В.И. Ульянова-Ленина д.ф.-м.н., проф., КГУ им. В.И. Ульянова-Ленина Телефон рабочий E-mail 2-315-189, Alisa.gumerova@mail.ru 2-315-189, Maya.Rudakova@ksu.ru 2-315-189, Andrey.Filippov@ksu.ru 2-315-189, Vladimir.Skirda@ksu.ru 31
