Áåëêè – îäíè èç ñàìûõ ðàñïðîñòðàíåííûõ êîìïîíåíòîâ æèâîé ìàòåðèè
реклама
ЗАДАЧА № 4 Принципы структурной организации и стабильность белков. Белки – одни из самых распространенных компонентов живой материи. Вещества данного класса выполняют в организмах разнообразуные функции – структурную, транспортную, каталитическую, защитную и т.п. Соответственно, белки исключительно разнообразны по составу, размерам, форме, устойчивости в ненативных (неприродных) условиях. Однако у всех белков есть и много общего: все они построены из мономерных звеньев одного и того же типа, пространственная структура белков поддерживается системой невалентных взаимодействий. При сдаче коллоквиума будут рассмотрены общие закономерности, полученные при изучении разнообразных глобулярных (сферических и близких к сферическим) белков: принципы структурной организации, пути сворачивания, вопросы стабильности и стабилизации. В заключении мы познокомимся с основными характеристиками белков фибриллярных (вытянутых, палочкообразных). 1. Принципы структурной организации белков. Белки характеризуются чрезвычайно сложной организацией составляющих их атомов в пространстве. Для систематизации знаний о белках были выделены различные уровни их структурной организации. Наиболее часто выделяют следующие структуры белков: первичную вторичную третичную четвертичную Большинство читателей знакомо с таким делением еще из школьного курса биологии. Однако в последние годы исследователи, занимающиеся вопросами структуры белков предпочитают оперировать шестиуровневой классификацией, а именно: первичная структура вторичная структура сверхвторичные структура домен глобулярный белкок ассоциат (агрегат) белковых глобул Ниже мы последовательно рассмотрим перечисленные уровни (от простого к сложному) и выявим общие закономерности, присущие тому или иному уровню. 1.1. Первичная структура белков Все белки представляют собой полимерные молекулы, построеные из остатков α-амонокарбоновых кислот. Первичная структура белка – это последовательность аминокислотных остатков, которая однозначно задает более высокие (пространственные) структуры белка. Многообразием свойств белки в основном обязаны тому, что составляющие их аминокислоты, наряду с аминогруппой, содержат в αположении разнообразные радикалы. Для изображения аминокислот используют разнообразные способы. Поскольку во всех аминокислотах (за исключением глицина) присутствует как минимум один асимметрический центр, весьма удобна и информативна проекция Фишера (рис. 1а). В качестве «эталонного» соединения при построении проекции Фишера используют глицериновый альдегид (рис. 1б). При этом наиболее окисленную группу располагают сверху, аминокислотный радикал – снизу, а атом водорода и гидрооксильную группу (амминогруппу в случае белков) – справа и слева. Соответственно, если гидрооксильная (амино-) группа располагаются справа, то говорят, что это соединение относится к Dряду, а если слева – то к L-ряду. СOO+ H3N СHO H R а H OH СH2OH б Рис. 1. Формулы L-α-амминокислоты (а) и D-глицеринового альдегида (б) в проекции Фишера. Отметим, что подавляющие большинсто аминокислотных остатков в составе белков относятся к L-ряду. В то же время в природных олигопептидах часто встремаются остаткти и D-аминокислот. Студенты при сдаче коллоквиума по данной теме должны уметь изображать α-аминокислоты в проекции Фишера, а также переходить к абсолютной (R-,S-) конфигурации (данную информацию можно почерпнуть в большинстве учебников по органической химии). V В организмах встречаются сотни разнообразных аминокислот. Тем не менее большинство из них относится к крайне редким (ряд таких нетривиальных аминокислотных остатков присутствует в фибриллярных белках), а наиболее распространены в природе 20 так называемых канонических аминокислот. Для целей дальнейшего рассмотрения удобнее всего классифицировать их по природе бокового радикала. Канонические аминокислоты можно разделить на две большие группы: полярные и неполярные. К неполярным относятся аланин, валин, лейцин, изолейцин, фенилаланин, тирозин и триптофан. Последние две аминокислоты занимают проммежуточное положение, поскольку содержат в своем составе ОН- и NHгруппы, сооответственно. Полярные аминоислоты, исходя из их состояния при нейтральных значениях рН, можно разделить на три подгруппы: заряженные положительно (лизин, аргинин, гистидин), заряженные отрицательно (аспарагиновая и глутаминовая кислоты) и незаряженные (серин, треонин, аспарагин, глутамин, цистеин, метионин). Несколько особняком в данной классификации стоят глицин (боковой радикал – атом водорода) и пролин, который является не амино-, а имнокислотой. V Студенты при сдаче коллоквиума должны знать формулы боковых радикалов канонических аминокислот и соответствующие им трехбуквенные обозначения. Для аминокислот, в состав которых входят ионогенные группы, необходимо знать значения рКа этих групп (данную информацию можно почерпнуть в Справочнике биохимика). Также следует представлять физический смысл параметра рКа и уметь определять состояние ионизации функциональной группы при любом значении рН, исходя из известного значения рКа данной группы. Приведенное выше разделение аминокислот на группы удобно в силу того, что свойства бокового радикала во многом определяют локализацию того или иного аминокислотного остатка в белке, а также взаимодействия, в которые он может быть вовлечен. Так, остатки большинства неполярных аминокислот преимущественно локализованы внутри белка. Исключение составляет аланин, который с приблизительно равной вероятностью может быть обнаружен и внутри, и на поверхности белка. Подавляющее большинство заряженных аминокислотных остатков расположены на поверхности благодаря термодинамически выгодной гидратации зарядов молекулами растворителя. Присутствие же таких остатков внутри белка почти однозначно указывает на их участие в образовании солевых мостиков с противоположно заряженым аминокислотным остатком. Полярные незаряженные остатки присутствуют как на поверхности, так и во внутренних областях, где они участвуют в образовании внутрибелковых водородных связей. Количество остатков Gly и Pro в белках строго определено: и те, и другие располагаются на изгибах цепи. При этом чрезмерное содержание остатков глицина привело бы к излишне гибкой, а пролина – к излишне жесткой полипептидной цепочке, что крайне невыгодно с энергетической точки зрения. Также следует иметь в виду, что наряду с химическими свойствами исключительно важной характеристикой бокового радикала является его размер. В результате реакции между карбонильной группой одной аминокислоты (или ее ацильным производным с хорошей уходящей группой) и аминогруппой другой образуется пептидная связь, которая является разновидностью амидной связи. Пептидная связь отличается как от одинарной, так и двойной и является как бы «полуторной». Это предопределяет особые свойства данной связи и, в первую очередь, затормоенность вращения вокруг нее. Другими словами, пептидная связь – плоская. Это, в свою очередь, приводит к цис-транс изомерии при пептидной связи. В белках практически все остатки в существует в трансформе. Если бы значительная часть остатков существовала в цис-форме, полипептидная цепь оказалась бы «слишком скрученной», что осложняло бы сворачивание белка в правильную конформацию. Разница в уровнях стандартной свободной энергии между цис- и трансформами невелика (порядка 2 ккал/моль). Однако перехода аминокислот из одной изомерной формы в другую не наблюдается из-за высокого активационного барьера реакции (20 ккал/моль). Единственное исключение составляет пролин, который существует как в цис-, так и в транс-форме и для которого активационный берьер составляет 13 ккал/моль. Стандартная свободная энергия образования пептидной связи составляет –5 ккал/моль. Это немного, если сравнить с соответствующими данными для СС и С-N связей. Студенты при сдаче коллоквиума должны объяснять, почему природа выбрала такое невысокое значение свободной энергии образования пептидной связи. V Все структуры белка выше первичной характеризуют пространственную организацию. Они поддерживаются комплексом тех или иных невалентных взаимодействий. Поэтому сначала необходимо рассмотреть типы невалентных взаимодействий, реализующиеся в белках. 1.2. Невалентных взаимодейстий в белках Наиболее важными типами невалентных взаимодействий в белках являются: • Дисперсионные силы притяжения и отталкивание электронных оболочек • Электростатические взаимодействия • Водородные связи • Гидрофобные взаимодействия Дисперсионные силы притяжения и отталкивание электронных оболочек. Эти два типа взаимодействий обычно объединяют. Данные взаимодействия реализуются между любыми двумя атомами. Каждый атом можно представить в виде осциллирующего диполя. Если два диполя осциллируют на некотором расстоянии друг от друга, то они начинают друг друга наводить таким образом, что положительный заряд одного обращен к отрицательному заряду другого. В результате между ними возникает электростатическое притяжение. По мере сближения атомов между ними сокращается расстояние, соответственно сближаются их внешние электронные оболочки. Поскольку они заряжены одноименно, с притяжением наведенных диполей начинает «конкурировать» отталкивание оболочек. При некотором оптимальном расстоянии силы притяжения и отталкивания равны, соответственно при этом расстоянии наблюдается минимум потенциальной энергии. Для описания данного типа невалентных взаимодействий используются разнообразные потенциалы, например, так называемый «6-12». Студенты при сдаче коллоквиума должны уметь изображать кривую зависимости потенциальной энергии от расстояния между атомами и объяснять вид кривой в различных областях. V Свободная энергия взаимодействий данного типа невелика и составляет порядка –30 кал/моль. Однако в состав белков входит огромное количество близкорасположенных атомов, в результате чего вклад дисперсионных сил притяжения в общую стабильность белка велик. Электростатические взаимодействия реализуются в белках как между разно-, так и одноименно заряженными группами. Наиболее важны так называемые солевые мостики, которые возникают между положительно и отрицательно заряженными группами белка. V Студенты при сдаче коллоквиума должны знать, какие потенциальные участники солевых мостиков имеются в белках. Данные взаимодействия подчиняются закону Кулона. Свободная энергия образования солевых мостиков зависит от среды, в которой они локализованы. Во внутренней неполярной области белка данная величина составляет порядка – 5 ккал/моль (сравните со значением для ковалентной пептидной связи), а в приповерхностных слоях белка – в 10-20 раз меньше. V Студенты при сдаче коллоквиума должны знать закон Кулона, а также объяснять, исходя из данного закона, чувствительность энергии образования солевых мостиков к свойствам среды. Водородные связи образуются между атомом водорода, несущим частичный положительный заряд и электроотрицательными атомами (в белках это атомы О и N), несущими частичный отрицательный заряд. По своей природе это невалентные электростатические взаимодействия (вклад перекрывания электронных оболочек – не более 5%). Водородные связи выделяют в отдельную группу благодаря уникальным свойствам атома водорода, который имеет всего один электрон. Данный электрон в значительной степени смещен к электроотрицательному атому, с которым водород образует ковалентную связь. Как следствие, ничто не отталкивает электронную оболочку атома кислорода или азота, которые участвуют в образовании водородной связи. В результате атом водорода как бы «утапливается» в этом азота или кислорода, а водородная связь оказывается короче суммы Ван-дер-Ваальсовых радиусов ее участников; причем чем сильнее укорачивается водородная связь, тем она прочнее. Свободная энергия водородной связи в белках достигает –3 ккал/моль, при этом она максимальна при линейном расположение всех четырех вовлеченных атомов, например: О-Н…N-Н. Гидрофобные взаимодействия. При рассмотрении взаимодействий данного типа сначала необходимо уделить внимание состоянию растворителя. Вода характеризуется пространственной системой водородных связей. Каждая молекула воды может максимально образовывать водородные связи с 4 другими молекулами воды, что реализуется в твердом состоянии – во льду. В жидком состоянии в каждый момент времени это значение в среднем составляет 3,6 молекулы. Дробное значение объясняется динамическим характером системы водородных связей, которые постоянно и с высокой скоростью рвутся и образуются вновь. Такое большое количество водородных связей исключительно выгодно с энергетической точки зрения. Далее рассмотрим модельную систему: каплю масла или неполярного органического растворителя в воде. Молекулы неполярного соединения, попавшие в систему, не могут образовывать водородные связи с водой. В принципе возможны две ситуации. В первом варианте часть молекул воды, располагающихся в непосредственной близости к неполярным частицам, будет заморожена и образует льдоподобные структуры. В данном случае энтропия системы уменьшится, а энтальпия практически не изменится, поскольку практически все водородные связи будут сохранены. Во втором варианте вода останется полностью жидкой, однако часть водородных связей будет утеряна. При этом энтропия системы практически не изменится, а энтальпия уменьшится. Следует подчеркнуть, что оба рассмотренных варианта приводят к энергетическому проигрышу. В действительности реализуется тот вариант, в котором проигрыш будет меньше. Экспериментальными физико–химическими методами было установлено существование льдоподобных (клатратных) структур вокруг неполярных соединений. Таким образом, часть молекул воды в непосредственной близости Если же в системе присутствуют две или более неполярные частицы, каждая из которых окружена льдоподобной «шубой», они будут слипаться и образовывать одну общую «шубу». Это и есть гидрофобное взаимодействия. При этом часть молекул воды будет размораживаться и высвобождаться в объем растворителя. Энтропия растворителя и системы в целом при этом увеличиться. Такой рост энтропии и является движущей силой гидрофобных взаимодействий. Таким образом, гидрофобные взаимодействия ненаправлены, в связи с чем неправильно использовать термин «гидрофобная связь». В силу указанной выше причины, определить энергию единичного гидрофобного контакта невозможно, однако в расчете на весь белок вклад гидрофобных взаимодействий составляет сотни, а иногда и тысячи ккал/моль. • • • • • • • • 1.3. Вторичная структура Студенты при сдаче коллоквиума должны рассмотреть: общее определение вторичных структур типы вторичных структур: спирали и складчатые листы параметры спиралей причины наивысшей устойчивости альфа-спирали причины правозакрученности спиралей строение листов параллельность и анти-параллельность листов типичные размеры листов • 1.4. Сверхвторичная структура Студенты при сдаче коллоквиума должны рассмотреть: примеры сверхвторичных структур • • • 1.5. Домены Студенты при сдаче коллоквиума должны рассмотреть: типы доменов соотношения между структурными и функциональными доменами преимущества доменной организации белков • • • 1.6. Глобулярный белок Студенты при сдаче коллоквиума должны рассмотреть: общее определение глобулярных белков примеры глобулярных белков примеры проферментов V V V V • • 1.7. Ассоциаты (агрегаты) глобулярных белков Студенты при сдаче коллоквиума должны рассмотреть: примеры ассоциатов преимущества олигомерной организации белков • • • • • • 2. Сворачивание белков Студенты при сдаче коллоквиума должны рассмотреть: Термодинамическую характеристику процесса сворачивания Общую кинетическую схему сворачивания Промежуточные продукты при сворачивании белка Примера скорость-лимитирующих стадий Роль ферментов в сворачивании белков Функции белков-шаперонов V V 3. Пост-трансляционная модификация Наряду со сворачиванием, белки могут подвергаться посттрансляционной модификации, которая затрагивает систему ковалентных связей. К наиболее распространенным типам пост-трансляционной модификации относят: • Образование дисульфидных мостиков • Гидролиз пептидных связей под действием специфических протеаз • Гликозилирование • Фосфорилирование • Гидроксилирование • Ацилирование концевой аминогруппы • Превращение концевой карбоксильной группы в амидную Студенты при сдаче коллоквиума должны знать примеры перечисленных выше типов пост-трансляционной модификации, а также ее причины и результаты. V 4. Стабильность белков Исследователи выделяют различные типы стабильности белков. Мы рассмотрим следующие из них: • Стабильность белков in vivo • Термодинамическую стабильность • Устойчивость к необратимой инактивации 4.1. Стабильность белков in vivo Данный тип стабильности характеризует устойчивость белков к деградации в составе живых клеток. Глобулярные белки существенно различаются по времени жизни в организмах (обычно от 2 до 200 часов). Основными механизмами биодаградации белков являются: • Протеолиз в лизосомах под действием кислых протеаз • Протеолиз в цитозоле под действием кальций- и АТФ-зависимых протеаз • Комплексообразование с полипептидом убиквитином с последующим гидролизом под действием специфических протеаз К настоящему времени не выявлено корреляции между стабильностью белков in vivo и их молекулярными параметрами (молекулярной массой, изоэлектрической точкой, содержанием вторичных структур, гидрофобностью поверхности и т.п.). Более важным с данной точки зрения является наличие или отсутствие в составе белка сигнальных последовательностей. Также исключительно важным является локализация белка в клетке. Студенты при сдаче коллоквиума должны знать примеры сигнальных последовательностей и уметь объяснять влияние локализации белка в клетке на его стабильность in vivo. V 4.2. Термодинамическая стабильность Данный тип стабильности определяется разностью величин свободной энергии (∆Gстаб) нативной и обратимо денатурированной (частично развернутой) конформаций белка. Белки являются исключительно точно сбалансированными структурами. Несмотря на то, что стабилизирующие и дестабилизирующие вклады различных невалентных взаимодействий составляют сотни, а иногда и тысячи ккал/моль, значение ∆Gстаб обычно лежит в пределах 5-15 ккал/моль. Такое невысокое значение предопределяет относительную лабильность белковых молекул, их высокую чувствительность к параметрам (температура, давление) и составу (наличие денатурантов, детергентов, органических растворителей, солей) системы. К основным причинам высокой или низкой термодинамической стабильности относят: 1. наличие солевых мостиков 2. наличие внутрибелковых водородных связей 3. наличие дисульфидных мостиков 4. плотность упаковки белка 5. наличие лигандов и простетических групп 6. комплексообразование с другими белками и прочими компонентами клетки Студенты при сдаче коллоквиума должны объяснять влияние перечисленных выше параметров на термодинамическую стабильность белка и подкреплять свои рассуждения примерами. V 4.3. Устойчивость к необратимой инактивации Процессы, приводящие к необратимой денатурации, принято классифицировать по механизмам. К наиболее распространенным относят: • Агрегацию • Изменение системы ковалентных связей • Диссоциации олигомерных белков • Диссоциации кофактора • Сорбцию на стенках реакционного сосуда • «Необратимые» конформационные изменения V Студенты при сдаче коллоквиума должны приводить примеры инактивационных процессов, протекающих по перечисленным выше механизмам, а также указывать условия, в которых эти процессы протекают наиболее эффективно. V • • • • V 5. Стабилизация белков Студенты при сдаче коллоквиума должны рассмотреть: Обратимые и необратимые инактивационные процессы Схему Эйринга Общие подходы к стабилизации: подавление обратимых и необратимых стадий Представления о стабилизационных подходах (иммобилизация и модификация белков, комплексообразование с другими молеккулами, генно-инженерные методы). 6. Фибриллярные белки Студенты при сдаче коллоквиума должны рассмотреть: Для кератина, фиброина, коллагена, элластина, актина и миозина: особенности аминокислотного состава, макросвойства, распространение в природе, структуру белка Рекомендуемая литература 1. Шульц, Ширмер. Принципы структурной организации белков. 2. А. Ленинджер. Биохимия. 3. Страйер. Основы биохими. 4. Серия Биотехнология, книга 7. Иммобилизованные ферменты. 5. Собственные конспекты лекций по введению в специальность (3 курс).
