РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ (19) RU (11) 2 486 248 (13) C2 (51) МПК C12P 13/08 (2006.01) C12N 1/20 (2006.01) C12R 1/15 (2006.01) ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ (12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ (21)(22) Заявка: 2011126521/10, 29.06.2011 (24) Дата начала отсчета срока действия патента: 29.06.2011 (43) Дата публикации заявки: 10.01.2013 Бюл. № 1 (45) Опубликовано: 27.06.2013 Бюл. № 18 C 2 2 4 8 6 2 4 8 R U (54) СПОСОБ БИОСИНТЕЗА L-ЛИЗИНА (57) Реферат: Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ биосинтеза L-лизина на ферментационных средах. Готовят основную ферментационную среду на основе ферментолизата крахмала в количестве 8-15% по глюкозе и дополнительную ферментационную среду, содержащую компоненты основной ферментационной среды, концентрированные в 2-3,5 раза. Стерилизуют их. Биосинтез Lлизина осуществляют с использованием штамма-продуцента Corynebacterium glutamicum BKM Ac-2577D (BIGOR 55). Загружают в ферментер основную питательную среду в количестве 1/3 от ее объема. Затем производят засев основной ферментационной питательной среды 10-20% посевного материала, выращенного в две стадии. Процесс биосинтеза ведут с непрерывной подачей подпитки, начиная с 8-16 час культивирования. При этом поддерживают ингибирующую концентрацию редуцирующих веществ в культуральной жидкости 4-8%. После заполнения аппарата до максимального объема через 60-66 часов культивирования и далее каждые 6-12 часов в течение всего остального процесса биосинтеза часть культуральной жидкости в количестве 1015% от максимального объема перекачивают в аппарат для дображивания. В этом аппарате продолжают процесс биосинтеза в течение 6-12 часов при тех же условиях, что и в основном аппарате, но без подачи дополнительной питательной среды. Затем выделяют L-лизин. Ñòð.: 1 ru C 2 Адрес для переписки: 105066, Москва, ул. Старая Басманная, 21/4, МГУИЭ (Московский государственный университет инженерной экологии), ректору МГУИЭ Д.А. Баранову 2 4 8 6 2 4 8 (56) Список документов, цитированных в отчете о поиске: RU 2107097 С1, 20.03.1998. US 20080160585 A1, 03.07.2008. RU 2099424 С1, 20.12.1997. RU 2125608 С1, 27.01.1999. ФЕДОТОВА Н.А. Разработка технологии получения из зернового сырья азотсодержащих компонентов для процессов ферментации. Автореферат дисс. - М.: 2009. SU 298132 А3, 11.03.1971. (73) Патентообладатель(и): Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный университет инженерной экологии" (ФГБОУ ВПО "МГУИЭ") (RU) R U Приоритет(ы): (22) Дата подачи заявки: 29.06.2011 (72) Автор(ы): Герман Людмила Сергеевна (RU), Сенаторова Валентина Николаевна (RU), Бирюков Валентин Васильевич (RU), Щеблыкин Игорь Николаевич (RU), Петрищева Ольга Аркадьевна (RU) Изобретение позволяет вести процесс биосинтеза в течение длительного времени без снижения скорости синтеза L-лизина и обеспечивает получение культуральной жидкости с концентрацией L-лизина перед выделением не ниже 100 г/л. 4 пр. R U R U 2 4 8 6 2 4 8 C 2 C 2 2 4 8 6 2 4 8 Ñòð.: 2 RUSSIAN FEDERATION (19) RU (11) 2 486 248 (13) C2 (51) Int. Cl. C12P 13/08 (2006.01) C12N 1/20 (2006.01) C12R 1/15 (2006.01) FEDERAL SERVICE FOR INTELLECTUAL PROPERTY (12) ABSTRACT OF INVENTION (72) Inventor(s): German Ljudmila Sergeevna (RU), Senatorova Valentina Nikolaevna (RU), Birjukov Valentin Vasil'evich (RU), Shcheblykin Igor' Nikolaevich (RU), Petrishcheva Ol'ga Arkad'evna (RU) (21)(22) Application: 2011126521/10, 29.06.2011 (24) Effective date for property rights: 29.06.2011 (43) Application published: 10.01.2013 Bull. 1 (45) Date of publication: 27.06.2013 Bull. 18 2 4 8 6 2 4 8 R U (57) Abstract: FIELD: biotechnology. SUBSTANCE: basic fermentation medium is prepared on the basis of fermentative lysate of starch in an amount of 8-15% for glucose, and additional fermentation medium containing the components of basic fermentation medium, 2-3.5 times concentrated. They are sterilised. Biosynthesis of L-lysine is carried out using strain-producer Corynebacterium glutamicum of All-Russia classification of microorganisms Ac-2577D (BIGOR 55). The fermentor is loaded with the basic nutrient medium in amount of 1/3 of its volume. Then inoculation of the basic fermentation nutrient medium is carried out with 10-20% inoculum grown in two stages. Biosynthesis process is carried out with continuous feeding starting from 8-16 hours of cultivation. At that the inhibitory concentration of reducing substances in the culture fluid of 4-8% is maintained. After filling the device to the maximum volume after 60-66 hours of cultivation and then every 6-12 hours for the rest part of biosynthesis process a part of the culture fluid in amount of 1015% of the maximum volume is pumped into the device for final fermentation. In this device, the biosynthesis process is continued for 6-12 hours under the same conditions as in the main device but without feeding the additional nutrient medium. Then L-lysine is isolated. EFFECT: invention enables to carry out the biosynthesis process for a long time without reducing the rate of synthesis of L-lysine, and provides obtaining of the culture fluid with high concentration of L-lysine prior to the isolation. 4 ex Ñòð.: 3 en C 2 C 2 (54) METHOD L-LYSINE BIOSYNTHESIS 2 4 8 6 2 4 8 Mail address: 105066, Moskva, ul. Staraja Basmannaja, 21/4, MGUIEh (Moskovskij gosudarstvennyj universitet inzhenernoj ehkologii), rektoru MGUIEh D.A. Baranovu (73) Proprietor(s): Federal'noe gosudarstvennoe bjudzhetnoe obrazovatel'noe uchrezhdenie vysshego professional'nogo obrazovanija "Moskovskij gosudarstvennyj universitet inzhenernoj ehkologii" (FGBOU VPO "MGUIEh") (RU) R U Priority: (22) Date of filing: 29.06.2011 RU 2 486 248 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для получения L-лизина, применяемого для балансировки кормов животных, в пищевой промышленности для балансировки состава пищевых продуктов и в медицинской промышленности для приготовления аминокислотных смесей парентерального питания. Известны способы получения L-лизина на основе микробиологического синтеза, предусматривающие культивирование с использованием различных штаммовпродуцентов Corynebacterium и Brevibacterium. Источником углерода в питательных средах служит меласса, технический сахар, техническая глюкоза. В качестве ростового фактора (источника аминного азота) используются кукурузный экстракт, кислотные гидролизаты белково-витаминного концентрата (БВК) и биомассы продуцента. Известные в России способы получения L-лизина, реализованные в промышленных масштабах, ориентированы на использование мелассы и гидролизатов БВК, а конечным продуктом являлся жидкий концентрат лизина (ЖКЛ) или высушенный на отрубях концентрат кормового лизина (ККЛ). Однако на территории России в настоящее время практически все углеводсодержащее сырье непищевого назначения для микробиологической промышленности труднодоступно или дорого. В связи с этим целесообразно использование технологий, работающих на нетрадиционном сырье. Известен способ получения L-лизина, описанный в патенте США №4,411,991 (1983 г.), в котором предлагается использовать гидролизат концентрированной молочной сыворотки в качестве источника редуцирующих веществ (РВ). Недостатком данного способа является низкое содержание РВ в полученном гидролизате, и как следствие, низкая концентрация лизина. Известен способ получения L-лизина, описанный в Journal of Fermentation and Bioengineering. Vol.86, №2, 180-184. 1998. Регулирование метаболической активности осуществляется внесением в культуральную жидкость лейцина так, чтобы текущая концентрация лейцина поддерживалась на уровне 0,1 г/л. Недостатком данного способа является использование генно-инженерных штаммов-продуцентов лизина, биомасса которых запрещена в ЕЭС для использования в комбикормах с/х животных. Наиболее близким к предлагаемому способу по регулированию биосинтеза лизина в процессе культивирования является патент США №2107097, в котором описан способ биосинтеза лизина на ферментационных средах, предусматривающий приготовление ферментационной среды с углеводной, белковой и солевой частями, культивирование в ферментере на основной ферментационной среде штаммапродуцента с внесением дополнительной ферментационной среды (подпитки) в ходе процесса культивирования, при поддержании величины рН, температуры культивирования, аэрации и перемешивания на питательных средах с глюкозой в качестве источника углеводов с использованием лейцин-ауксотрофного штамма Corynebacterium, где регулирование метаболической активности происходит путем внесения подпитки, содержащей источник углеводов и белка, по концентрации лейцина в культуральной жидкости. Весь процесс биосинтеза проводят при лимитирующей концентрации углеводов в питательной среде 5-35 г/л. К недостаткам данного способа относятся использование кристаллической глюкозы и низкая концентрация L-лизина в культуральной жидкости, что является следствием периодического способа ведения процесса культивирования. Задачей настоящего изобретения является биосинтез L-лизина на основе питательных сред, содержащих ферментолизат крахмала как источник углеводов, Ñòð.: 4 DE RU 2 486 248 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 позволяющий получать высокую концентрацию L-лизина в культуральной жидкости. Поставленная задача достигается тем, что - биосинтез лизина осуществляют на ферментационных средах с углеводной, белковой и солевой частями; культивирование штамма-продуцента проводят в ферментере на основной ферментационной среде с внесением дополнительной питательной среды (подпитки) в ходе процесса биосинтеза, при поддержании величины рН, температуры культивирования, аэрации и перемешивания; а в качестве сырья для приготовления основной ферментационной среды и подпитки используют ферментолизат крахмала, который получают из крахмалсодержащего растительного сырья или крахмалсодержащих отходов пищевой промышленности; ферментолизат крахмала вносят в ферментацонную среду в количестве 8-15% по глюкозе, и проводят культивирование с использованием штамма-продуцента Corynebacterium glutamicum BKM Ac-2577 D (BIGOR 55); в ферментер загружают 1/3 от его рабочего объема основную питательную среду, содержащую 2,5-7,5% источника органического азота (ростовой фактор), аммоний сернокислый 3,5-6,5%, соли магния и фосфора 0,05-0,4%, тиамин и биотин 0,05-0,6 мг/л и 10-20% посевного материала из посевного аппарата, выращенного в две стадии, проводят культивирование при рН 6,5-7,5, температуре 2832°C, и условиях аэрации и перемешивания, обеспечивающих скорость массопередачи кислорода не менее 5 г O2/л*час; через 8-16 часов от начала культивирования начинают подачу подпитки, в которой концентрация всех компонентов в 2-3,5 раза больше, чем в основной питательной среде, поддерживая концентрацию РВ в среде на уровне 4-8%; после достижения максимального (рабочего) объема жидкости в ферментере через 60-66 часов культивирования производят отбор культуральной жидкости (КЖ) в количестве 10-15% от максимального объема и передают ее в отдельный аппарат, где в процессе биосинтеза в течение 6-12 часов происходит дображивание РВ; процесс отбора культуральной жидкости проводят многократно каждые 6-12 часов в течение 350-500 часов роста; дображивание (процесс биосинтеза) проводят при тех же параметрах процесса, что и в основной ферментации (кроме подачи подпитки, она отсутствует) в течение 6-12 часов. Сущность предлагаемого способа получения L-лизина заключается в следующем: - на основе ферментолизата крахмала готовят основную ферментационную среду: ферментолизат крахмала вносят в количестве 8-15% по глюкозе, 2,5-7,5% источника органического азота (ростового фактора), аммоний сернокислый 3,5-6,5%, соли магния и фосфора 0,05-0,4%, тиамин и биотин 0,05-0,6 мг/л и подпитку (дополнительную ферментационную среду), содержащую компоненты ферментационной среды, концентрированные в 2-3,5 раза, и стерилизуют их; - биосинтез L-лизина осуществляется с использованием штамма-продуцента лизина Corynebacterium glutamicum BKM Ac-2577 D (BIGOR 55). Штамм получен мутагенезом из родительского штамма В5200 (ВКПМ ГосНИИгенетика) в компании ООО ПКФ «БИГОР». Культура Corynebacterium glutamicum BKM Ac-2577 D BIGOR 55 имеет генетические маркеры: leu и horn ауксотрофность и амилоэтилцистеинрезистентность, облигатный аэроб, грамположительна, спор не образует. Клетки в виде палочек неправильной формы, размером 0,3-1,0×1,5-4,7 мкм, неподвижные. Располагаются одиночно или в парах, часто V-образно; - засев основной ферментационной питательной среды производят 10-20% посевного материала со второй стадии выращивания посевного материала; - полунепрерывный процесс биосинтеза ведут с непрерывной подачей подпитки, начиная с 8-16 час культивирования, при этом метаболическая активность штаммаÑòð.: 5 RU 2 486 248 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 продуцента, ауксотрофного по лейцину, регулируется за счет поддержания ингибирующей концентрации РВ в культуральной жидкости 4-8% по глюкозе, а содержание лейцина поддерживается в культуральной жидкости 0,1-0,2 г/л за счет ростового фактора, входящего в состав подпитки; - по заполнении аппарата до максимального объема через 60-66 часов культивирования, и далее каждые 6-12 час, многократно - в течение 350-500 часов, часть культуральной жидкости в количестве 10-15% от максимального объема КЖ перекачивают в стерильный аппарат, где поддерживается оптимальная для биосинтеза величина рН 6,7-7,4 подачей аммиачной воды. В этом аппарате происходит процесс биосинтеза в течение 6-12 часов, обеспечивающий дображивание РВ, из КЖ после дображивания затем выделяют лизин. Сущность предлагаемой технологии раскрывается, но не исчерпывается в приведенных примерах. Пример 1 Ферментацию проводят в ферментере емкостью 10 л, снабженном системами регулирования температуры, аэрации, перемешивания, рН, парциального давления растворенного кислорода, автоматической подачей дополнительных питательных сред. Начальные условия перемешивания и аэрации обеспечивают скорость массопередачи кислорода 5 г O2/л*час. Процесс биосинтеза, обеспечивающий дображивание (потребление остаточных редуцирующих веществ до концентрации не выше 0,8%), проводят в аппарате Биофло, емкостью 1 л, снабженном системами рН-статирования, термостатирования, аэрации, перемешивания. Штамм-продуцент L-лизина Corynebacterium glutamicum BIGOR 55, выращенный на агаризованной среде Хоттингера при 30°C в течение суток, переносят в посевные колбы со стерильной питательной средой следующего состава (г/л): Ферментолизат крахмала (по глюкозе) - 25,0 Кукурузный экстракт - 40,0 Аммоний сернокислый - 4,0 Натрий хлористый - 10,0 Тиамин - 0,05 мг/л Биотин - 0,6 мг/л Засев колб производят при начальном значении рН 7,0-7,3. При температуре 30°C выращивают на качалке в колбах в течение 18 часов. Посевной материал из колб в количестве 10% переносят в аппарат, емкостью 1 л, предварительно заполненный 450 мл стерильной питательной среды следующего состава (г/л): Ферментолизат крахмала (по глюкозе) - 50,0 Кукурузный экстракт - 45,0 Аммоний сернокислый - 20,0 Калий фосфорнокислый - 1,5 Магний сернокислый - 0,7 Пеногаситель Пропинол Б-400 - 1,0 Тиамин - 0,05 мг/л Биотин - 0,6 мг/л Засев аппарата производят при начальном значении рН 7,0-7,3. Культивирование ведут при 30°C в течение 8 часов. Ñòð.: 6 RU 2 486 248 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Готовый посевной материал со второй стадии в количестве 10% от начального объема питательной среды в рабочем ферментере стерильно перекачивают перистальтическим насосом в рабочий ферментер. Объем рабочего ферментера - 10 л. Аппарат стерилизуют с 3 л стерильной питательной среды следующего состава (г/л): Ферментолизат крахмала (по глюкозе) - 80,0 Кукурузный экстракт - 25,0 Аммоний сернокислый - 35,0 Магний сернокислый - 0,5 Калий фосфорнокислый - 4,0 Пеногаситель Пропинол Б-400 - 1,0 Тиамин - 0,05 мг/л Биотин - 0,6 мг/л Через 8 часов культивирования включают подачу подпитки следующего состава (г/л): Ферментолизат крахмала (по глюкозе) - 280,0 Кукурузный экстракт - 87,5 Аммоний сернокислый - 122,5 Магний сернокислый - 1,75 Калий фосфорнокислый - 14,0 Пеногаситель Пропинол Б-400 - 3,5 витамины: Тиамин - 0,175 мг/л Биотин - 2,1 мг/л Подпитку подают в ферментер со скоростью, величина которой меняется по специально составленному алгоритму, выходя к 60 часам на постоянное значение, которое поддерживается в течение всего процесса ферментации. Через 60 часов 0,85 л культуральной жидкости (КЖ), что составляет 10% от объема КЖ в ферментере, перекачивают в стерильный аппарат емкостью 1 л, снабженный системами рН-статирования, термостатирования, перемешивания, аэрации, для проведения процесса биосинтеза, обеспечивающего дображивание редуцирующих веществ. Каждые 6 часов из аппарата емкостью 1 л сливают 0,85 л культуральной жидкости и вносят следующую порцию из основного аппарата (периодический слив) и передают на стадию выделения лизина. Культивирование в основном аппарате ведется в течение 350 часов. Общий слив за 350 часов - 50,6 л с концентрацией лизина 100 г/л (по лизину монохлоргидрату). Пример 2 Ферментацию проводят в ферментере емкостью 10 л, снабженном системами регулирования температуры, аэрации, перемешивания, рН, парциального давления растворенного кислорода, автоматической подачей дополнительных питательных сред. Начальные условия перемешивания и аэрации обеспечивают скорость массопередачи кислорода 5-6 г/O2/л*час. Процесс биосинтеза, обеспечивающий дображивание РВ, проводят в аппарате Биофло, емкостью 2 л, снабженном системами рН-статирования, термостатирования, аэрации, перемешивания. Штамм-продуцент L-лизина Corynebacterium glutamicum BIGOR 55, выращенный на агаризованной среде Хоттингера при 30°C в течение суток, переносят в посевные Ñòð.: 7 RU 2 486 248 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 колбы со стерильной питательной средой следующего состава (г/л): Ферментолизат крахмала (по глюкозе) - 25,0 Кукурузный экстракт - 40,0 Аммоний сернокислый - 4,0 Натрий хлористый - 10,0 Тиамин - 0,05 мг/л Биотин - 0,6 мг/л Засев колб производят при начальном значении рН 7,0-7,3. При температуре 30°C выращивают на качалке в колбах в течение 20 часов. Посевной материал из колб в количестве 10% переносят в аппарат, емкостью 1 л, предварительно заполненный 600 мл стерильной питательной среды следующего состава (г/л): Ферментолизат крахмала (по глюкозе) - 50,0 Кукурузный экстракт - 45,0 Аммоний сернокислый - 20,0 Калий фосфорнокислый - 1,5 Магний сернокислый - 0,7 Пеногаситель Пропинол Б-400 - 1,0 Тиамин - 0,05 мг/л Биотин - 0,6 мг/л. Засев аппарата производят при начальном значении рН 7,0-7,3. Культивирование ведут при 30°C в течение 12 часов. Готовый посевной материал со второй стадии в количестве 20% от начального объема питательной среды в рабочем ферментере стерильно перекачивают перистальтическим насосом в рабочий ферментер. Объем рабочего ферментера - 10 л. Аппарат стерилизуют с 3 л стерильной питательной среды следующего состава (г/л): Ферментолизат крахмала по глюкозе - 150,0 Кукурузный экстракт - 75,0 Аммоний сернокислый - 65,0 Калий фосфорнокислый - 4,0 Магний сернокислый - 0,5 Пеногаситель Пропинол Б-400 - 1,0 Тиамин - 0,05 мг/л Биотин - 0,6 мг/л Через 16 часов культивирования включают подачу подпитки, следующего состава (г/л): Ферментолизат крахмала - 300,0 Кукурузный экстракт - 150,0 Аммоний сернокислый - 130,0 Калий фосфорнокислый - 8,0 Магний сернокислый - 2,0 витамины: Тиамин - 0,1 мг/л Биотин - 1,2 мг/л Подпитку подают в ферментер со скоростью, величина которой меняется по специально составленному алгоритму, выходя к 66 часам на постоянное значение, которое поддерживается в течение всего процесса ферментации. Ñòð.: 8 RU 2 486 248 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Через 66 часов 1,275 л культуральной жидкости, что составляет 15% от объема КЖ в ферментере, перекачивают в стерильный аппарат емкостью 2 л, снабженный системами рН-статирования, термостатирования, перемешивания, аэрации, для дображивания РВ. Каждые 12 часов из аппарата емкостью 2 л сливают 1,275 л культуральной жидкости и вносят следующую порцию КЖ из основного аппарата (периодический слив). Культивирование в основном аппарате ведется в течение 500 часов. Общий слив за 500 часов - 55,6 л с концентрацией лизина 115 г/л (по лизину монохлоргидрату). Пример 3 Ферментацию проводят в ферментере емкостью 10 л, снабженном системами регулирования температуры, аэрации, перемешивания, рН, парциального давления растворенного кислорода, автоматической подачей дополнительных питательных сред. Начальные условия перемешивания и аэрации обеспечивают скорость массопередачи кислорода 5 г O2/л*час. Дображивание проводят в аппарате Биофло, емкостью 1 л, снабженном системами рН-статирования, термостатирования, аэрации, перемешивания. Штамм-продуцент L-лизина Corynebacterium glutamicum BIGOR 55, выращенный на агаризованной среде Хоттингера при 30°C в течение суток, переносят в посевные колбы со стерильной питательной средой следующего состава (г/л): Ферментолизат крахмала по глюкозе - 25,0 Пептон - 28,0 Дрожжевой экстракт - 12,0 Аммоний сернокислый - 4,0 Натрий хлористый - 10,0 Тиамин - 0,05 мг/л Биотин - 0,6 мг/л Засев колб производят при начальном значении рН 7,0-7,3. При температуре 30°C выращивают на качалке в колбах в течение 18 часов. Посевной материал из колб в количестве 10% переносят в аппарат, емкостью 1 л, предварительно заполненный 300 мл стерильной питательной среды следующего состава (г/л): Ферментолизат крахмала по глюкозе - 50,0 Пептон - 31,5 Дрожжевой экстракт - 13,5 Аммоний сернокислый - 20,0 Калий фосфорнокислый - 1,5 Магний сернокислый - 0,7 Пеногаситель Пропинол Б-400 - 1,0 Тиамин - 0,05 мг/л Биотин - 0,6 мг/л Засев аппарата производят при начальном значении рН 7,0-7,3. Культивирование ведут при 30°C в течение 8 часов. Готовый посевной материал со второй стадии в количестве 10% от начального объема питательной среды в рабочем ферментере стерильно перекачивают перистальтическим насосом в рабочий ферментер. Объем рабочего ферментера - 10 л. Аппарат стерилизуют с 3 л стерильной питательной среды следующего состава (г/л): Ñòð.: 9 RU 2 486 248 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Ферментолизат крахмала по глюкозе - 80 Пептон - 17,5 Дрожжевой экстракт - 7,5 Аммоний сернокислый - 35,0 Калий фосфорнокислый - 1,5 Магний сернокислый - 0,7 Пеногаситель Пропинол Б-400 - 1,0 Тиамин - 0,05 мг/л Биотин -0,6 мг/л Через 8 часов культивирования включают подачу подпитки следующего состава (г/л): Ферментолизат крахмала - 280,0 Пептон - 61,25 Дрожжевой экстракт - 26,25 Аммоний сернокислый - 122,5 Калий фосфорнокислый - 14,0 Магний сернокислый - 3,5 витамины: Тиамин - 0,175 мг/л Биотин - 2,1 мг/л Подпитку подают в ферментер со скоростью, величина которой меняется по специально составленному алгоритму, выходя к 60 часам на постоянное значение, которое поддерживается в течение всего процесса ферментации. Через 60 часов 0,85 л культуральной жидкости, что составляет 10% от объема КЖ в ферментере, перекачивают в стерильный аппарат емкостью 1 л, снабженный системами рН-статирования, термостатирования, перемешивания, аэрации, для дображивания редуцирующих веществ. Каждые 6 часов из аппарата емкостью 1 л сливают 0,85 л культуральной жидкости и вносят следующую порцию из основного аппарата (периодический слив) и передают на стадию выделения лизина. Культивирование в основном аппарате ведется в течение 350 часов. Общий слив за 350 часов - 51,4 л с концентрацией лизина 100 г/л (по лизину монохлоргидрату). Пример 4 Ферментацию проводят в ферментере емкостью 10 л, снабженном системами регулирования температуры, аэрации, перемешивания, рН, парциального давления растворенного кислорода, автоматической подачей дополнительных питательных сред. Начальные условия перемешивания и аэрации обеспечивают скорость массопередачи кислорода 5-6 г/O2/л*час. Дображивание проводят в аппарате Биофло, емкостью 2 л, снабженном системами рН-статирования, термостатирования, аэрации, перемешивания. Штамм-продуцент L-лизина Corynebacterium glutamicum BIGOR 55, выращенный на агаризованной среде Хоттингера при 30°C в течение суток, переносят в посевные колбы со стерильной питательной средой следующего состава (г/л): Ферментолизат крахмала (по глюкозе) - 25,0 Ферментолизат глютена - 20,0 Растительный экстракт - 20,0 Аммоний сернокислый - 4,0 Натрий хлористый - 10,0 Ñòð.: 10 RU 2 486 248 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Тиамин - 0,05 мг/л Биотин - 0,6 мг/л Засев колб производят при начальном значении рН 7,0-7,3. При температуре 30°C выращивают на качалке в колбах в течение 20 часов. Посевной материал из колб в количестве 10% переносят в аппарат, емкостью 1 л, предварительно заполненный 600 мл стерильной питательной среды следующего состава (г/л): Ферментолизат крахмала по глюкозе - 50,0 Ферментолизат глютена - 22,5 Растительный экстракт - 22,5 Аммоний сернокислый - 20,0 Калий фосфорнокислый - 1,5 Магний сернокислый - 0,7 Пеногаситель Пропинол Б-400 - 1,0 Тиамин - 0,05 мг/л Биотин - 0,6 мг/л Засев аппарата производят при начальном значении рН 7,0-7,3. Культивирование ведут при 30°C в течение 12 часов. Готовый посевной материал со второй стадии в количестве 20% от начального объема питательной среды в рабочем ферментере стерильно перекачивают перистальтическим насосом в рабочий ферментер. Объем рабочего ферментера - 10 л. Аппарат стерилизуют с 3 л стерильной питательной среды следующего состава (г/л): Ферментолизат крахмала по глюкозе - 150,0 Ферментолизат глютена - 37,5 Растительный экстракт - 37,5 Аммоний сернокислый - 45,0 Аммоний фосфорнокислый - 0,4 Магний сернокислый - 0,3 Пеногаситель Пропинол Б-400 - 1,0 Тиамин - 0,05 мг/л Биотин - 0,6 мг/л Через 16 часов культивирования включают подачу подпитки, следующего состава (г/л): Ферментолизат крахмала (по глюкозе) - 300,0 Ферментолизат глютена - 75,0 Растительный экстракт - 75,0 Аммоний сернокислый - 130,0 Калий фосфорнокислый - 8,0 Магний сернокислый - 2,0 витамины: Тиамин - 0,1 мг/л Биотин - 1,2 мг/л Подпитку подают в ферментер со скоростью, величина которой меняется по специально составленному алгоритму, выходя к 66 часам на постоянное значение, которое поддерживается в течение всего процесса ферментации. Через 66 часов 1,275 л культуральной жидкости, что составляет 15% от объема КЖ в ферментере, перекачивают в стерильный аппарат емкостью 2 л, снабженный Ñòð.: 11 RU 2 486 248 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 системами рН-статирования, термостатирования, перемешивания, аэрации, для дображивания РВ. Каждые 12 часов из аппарата емкостью 2 л сливают 1,275 л культуральной жидкости и вносят следующую порцию КЖ из основного аппарата (периодический слив). Культивирование в основном аппарате ведется в течение 500 часов. Общий слив за 500 часов - 56,2 л с концентрацией лизина 115 г/л (по лизину монохлоргидрату). Осуществлен способ культивирования L-лизина, обеспечивающий получение КЖ с концентрацией лизина перед выделением не ниже 100 г/л (по лизину-монохлоргидрату). Этот результат достигнут благодаря использованию в качестве источника углеводов для приготовления питательных сред (основной и подпитки) ферментолизата крахмала, полученного из возобновляемого растительного крахмалсодержащего сырья. Регуляция биосинтеза лизина ингибирующими концентрациями компонентов питательной среды и подача подпитки с постоянной скоростью по концентрации РВ в культуральной жидкости позволяет вести процесс биосинтеза в течение длительного времени без снижения скорости синтеза лизина. Использование нового штамма-продуцента, полученного без применения рекомбинантных технологий, допускает применение биомассы продуцента в составе белково-витаминных кормовых добавок. Формула изобретения 1. Способ биосинтеза L-лизина на ферментационных средах, предусматривающий приготовление ферментационной среды с углеводной, белковой и солевой частями, культивирование в ферментере на основной ферментационной среде штаммапродуцента с внесением дополнительной ферментационной среды в ходе процесса культивирования, при поддержании величины рН, температуры культивирования, аэрации и перемешивания, отличающийся тем, что в качестве штамма-продуцента используют Corynebacterium glutamicum ВКМ Ac-2577D (BIGOR 55); основная питательная среда содержит ферментолизат крахмалсодержащего сырья в количестве 8,0-15,0% по глюкозе; среду загружают в ферментер в количестве 1/3 от его рабочего объема; вносят 10-20% посевного материала, выращенного в две стадии; через 8-16 ч культивирования начинают подачу дополнительной ферментационной среды, в которой концентрация всех компонентов в 2-3,5 раза больше, чем в основной, поддерживая концентрацию редуцирующих веществ в культуральной жидкости в пределах 4-8%, причем после достижения максимального объема жидкости в аппарате через 60-66 ч культивирования и далее каждые 6-12 ч в течение всего остального процесса биосинтеза производят отбор ферментационной жидкости из ферментера в количестве 10-15% от максимального объема и передают ее в аппарат для дображивания, в котором продолжают процесс биосинтеза в течение 6-12 ч при тех же условиях, что и в основном аппарате, но без подачи дополнительной питательной среды. 50 Ñòð.: 12 CL