Оптимизация состава питательной среды для промышленного

УДК 579.841.11:519.242.7
С. П. Четвериков, Е. А. Асабина, О. Н. Логинов
Оптимизация состава питательной среды
для промышленного производства биопрепарата «Елена»
Институт биологии УНЦ РАН
450054, г. Уфа, пр. Октября, 69; тел. (3472) 355783
ГУП «Опытный завод Академии Наук Республики Башкортостан
450079, г. Уфа, ул. Ульяновых, 65; тел. (3472) 429252
С помощью метода полного факторного экспе
римента ПФЭ 2 4 разработана питательная сре
да для промышленного производства биопрепа
рата – фунгицида «Елена» с высоким титром
клеток и наибольшей антигрибной активностью.
Ключевые слова: биопрепарат, питательная
среда, математическое моделирование, анти
грибная активность.
Основой биопрепарата сельскохозяй
ственного назначения «Елена» является выде
ленный в Институте биологии УНЦ РАН
штамм бактерий Pseudomonas aureofaciens
(= P. chlororaphis) ИБ 51 1, 2, обладающий
антигрибной активностью.
При промышленном производстве био
препаратов на основе бактерий рода
Pseudomonas, предназначенных для использо
вания в растениеводстве, высокая стоимость
питательной среды неизбежно приведет к удо
рожанию целевого продукта.
С одной стороны, все известные среды
для культивирования псевдомонад, такие
как среда LB 3, среда Кинга 4, содержат в сво
ем составе пептон – ингредиент, высокая
стоимость которого отрицательно сказывается
для использования этих сред при промышлен
ном производстве биопрепаратов.
С другой стороны, для получения культур
Pseudomonas с высоким титром клеток и наи
большей антигрибной активностью, как нами
ранее было показано 5, нужно учитывать фак
тор наличия в питательной среде источника
органического азота.
Выходом из сложившейся ситуации явля
ется использование питательной среды,
где в качестве источника азота используется
автолизат отработанных пивных дрожжей, ко
торый содержит все незаменимые аминокисло
ты, а также в значительном количестве вита
мины группы В, РР и Е, но в настоящее время
не находит квалифицированного применения.
Микробные культуры при их культивиро
вании высоко чувствительны к составу пита
тельной среды. При удачном подборе всех
компонентов по качественному и количествен
ному составу, среда обеспечивает достаточно
быстрый рост и развитие популяции микроор
ганизмов и считается сбалансированной.
При подборе питательных сред с целью
повышения выхода биомассы или накопления
определенных продуктов обмена веществ
микроорганизмов, таких как антибиотики
или ростстимулирующие вещества, широкое
применение нашли методы математического
планирования эксперимента, которые позволя
ют не только одновременно изучить действие
нескольких факторов на интересующий нас
процесс, но и количественно оценить степень
этого влияния.
Цель настоящей работы – оптимизация
состава питательной среды для промышленного
производства биопрепарата – фунгицида «Еле
на» с высоким титром клеток и наибольшей ан
тигрибной активностью с помощью методов ма
тематического планирования эксперимента.
Условия эксперимента
В настоящей работе использовали односу
точную культуру Pseudomonas aureofasiens
(=P. chlororaphis) ИБ 51, выращенную
при 28 оС и n = 180 мин –1 на качалке
УВМТ12250 в жидкой питательной среде
Кинг В 4, которую затем пересевали (1 мл)
в колбы емкостью 250 мл со 100 мл среды,
состоящей из следующих компонентов: глице
рин, дрожжевой автолизат, Na2HPO4⋅12H2O,
KH2PO4⋅2H2O, MgSO4⋅7H2O, FeCl3, в количе
стве, необходимом согласно плану экспери
мента, и культивировали в течение трех суток
при температуре 28 оС.
Для получения автолизата отработанные
пивные дрожжи подвергали термической обра
ботке при 100 оС в течение часа.
Дата поступления 24.01.06
10
Башкирский химический журнал. 2006. Том 13. № 2
Оптимизацию состава ферментационной
питательной среды проводили с применением
метода математического планирования экспе
римента 6 в два этапа: построение адекватной
математической модели процесса; нахождение
собственно оптимального состава среды одним
из известных способов.
Для получения простейшей адекватной
модели требовалось связать выходной пара
метр системы (антигрибная активность, титр
клеток) с входными – концентрациями компо
нентов ферментационной среды. В экспери
менте единовременно проверяли серию ва
риантов ферментационных сред, в которых все
компоненты
(факторы)
варьировались
на двух количественных уровнях («верхнем +»
и «нижнем –»). Таким образом, число вариан
тов так называемого «полного факторного экс
перимента» (ПФЭ) соответствовало числу
всех возможных сочетаний варьируемых ком
понентов среды. Для n факторов, каждый
из которых был взят на 2х уровнях концен
трации, число вариантов состава сред – 2n.
Такой факторный эксперимент обозначается
как ПФЭ2n.
В качестве четырех факторов варьирова
ния были взяты глицерин (Х1), дрожжевой
автолизат
(Х 2),
Na 2HPO 4 ⋅12H 2 O(Х 3 ),
KH 2 PO 4⋅2H 2 O (Х 4 ), уровни варьирования
представлены в табл. 1, содержание остальных
компонентов ферментационной среды было
зафиксировано на следующем уровне:
MgSO4⋅7H2O – 1.5 г/л, FeCl3 – 0.01 г/л.
После соответствующей математической
обработки экспериментальных данных, зави
симость антигрибной активности (титра кле
ток) Y1 (Y2) штамма от концентрации в среде
всех варьируемых компонентов представляется
в виде многофакторного уравнения регрессии,
являющегося, по сути, искомой математичес
кой моделью процесса:
Y = b0 + b1 x1 + b2 x2 + ... + bn xn ,
где
xn – содержание соответствующего компонента
в среде в условных единицах («+1» – верхний
уровень, «–1» – нижний уровень);
Y – активность штамма (ед/мл среды),
титр клеток (КОЕ/мл среды);
bn – коэффициенты регрессии, отражающие
степень влияния концентрации в среде nго
фактора на антигрибную активность (титр
клеток) Y.
Для расчета bn использовалась формула
Йейтса:
bn =
где
( ∑ X nYn )
N
Xn = 1 – значение фактора в соответствующем
варианте факторного эксперимента;
Yn – величина активности штамма
в соответствующем варианте;
N – общее число вариантов в ПФЭ.
Следующий этап – определение опти
мального состава ферментационной среды
в эксперименте по схеме «крутого восхожде
ния», в вариантах которого последовательно,
с определенным шагом λ*, изменяли концент
рации компонентов в среде. Основой для рас
чета λ* являются величины bn. В серии вари
антов одновременно увеличивали или умень
шали дозы тех факторов, коэффициенты рег
рессии при которых имели соответсвенно
знаки «+» или «–».
Титр жизнеспособных клеток устанавли
вали методом предельных разведений на ага
ризованной среде Кинг B 4.
Таблица 1
Компоненты питательной среды и их уровни варьирования в ПФЭ 2 4
Êîìïîíåíò ñðåäû
Ôàêòîð
Ñðåäíèé
Íèæíèé
Âåðõíèé
Åäèíèöà
óðîâåíü «0»óðîâåíü «–» óðîâåíü «+» âàðüèðîâàíèÿ
11.00
2.00
20.00
9.00
Ãëèöåðèí, ã/ë
X1
Äðîææåâîé àâòîëèçàò, ã/ë
X2
0.13
0.01
0.25
0.12
Na2HPO4 ⋅ 12H2O, ã/ë
X3
5.50
1.00
10.00
4.50
KH2PO4 ⋅ 2H2O, ã/ë
X4
1.50
0.50
2.50
1.00
MgSO4 ⋅ 7H2O, ã/ë
FeCl3, ã/ë
Ïîñòîÿííûé óðîâåíü – 1.50
Ïîñòîÿííûé óðîâåíü – 0.01
Башкирский химический журнал. 2006. Том 13. № 2
11
Таблица 2
Схема ПФЭ2 4 по оптимизации ферментационной среды
Вариант
X1
X2
X3
X4
Y1
Антигрибная актив
ность, ед/мл КЖ
Y2
Титр клеток, млрд
КОЕ/мл КЖ
1
–
–
–
–
2.0
0.79
2
+
–
–
–
2.0
0.95
3
–
+
–
–
2.0
1.42
4
+
–
+
–
–
–
2.0
0.55
+
–
5.0
1.00
5
6
+
–
+
–
9.0
0.95
7
–
+
+
–
4.8
24.70
8
+
–
+
–
+
–
–
7.0
17.57
+
5.8
0.97
10
+
–
–
+
7.0
1.27
11
–
+
–
+
2.0
2.80
12
+
–
+
–
–
+
2.3
4.72
13
+
+
8.0
0.94
14
+
–
+
+
3.7
0.84
15
–
+
+
+
6.0
23.33
16
+
+
+
+
5.0
20.67
17
0
0
0
0
7.0
16.40
9
Антигрибную активность проверяли из
вестным методом 7, в качестве тестобъекта
использовали фитопатогенный гриб Bipolaris
sorokiniana (= Helminthosporium sativum).
Результаты и обсуждение
Согласно существующей матрице плани
рования, проведено 16 экспериментов с раз
личным варьированием изучаемых факторов
(табл. 2).
В результате эксперимента удалось вычис
лить коэффициенты уравнений регрессии –
математических моделей зависимости функций
Y1 (антигрибная активность) и Y2 (титр кле
ток) от концентрации в ферментационной сре
де компонентов Х1, Х2, Х3, Х4:
для антигрибной активности
b0 = 4.60, b1 = +0.15, b2 = –0.71,
b3 = +1.46, b4 = +0.38;
для титра клеток
b0 = 6.47, b1 = –0.53, b2 = +5.50,
b3 = +4.78, b4 = +0.47;
12
Соответственно, уравнения регрессии
выглядят следующим образом:
Y 1 = 4.6 + 0.15X 1 – 0.71X 2 +
+ 1.46X 3 + 0.38X 4 ,
Y 2 = 6.47 – 0.53X 1 +
+ 5.5X 2 + 4.78X 3 + 0.47X 4 .
Из уравнений следует, что зависимости
для антигрибной активности и титра клеток
различны. В обоих случаях увеличение отно
сительно среднего уровня (вариант 17) содер
жания в среде факторов Х3 и Х4 (т. е. мине
ральной составляющей питательной среды)
должно дать положительный эффект, и, соот
ветственно, снижение содержания фактора Х2
и увеличение фактора Х1 должно дать значи
мый положительный эффект для увеличения
антигрибной активности, в противоположном
случае идет увеличение титра с пониженинм
антигрибной активности.
Проведенный в дальнейшем эксперимент,
в котором в серии вариантов ферментационной
среды одновременно и с определенным шагом,
снижались концентрации «отрицательных»
компонентов и увеличивались концентрации
Башкирский химический журнал. 2006. Том 13. № 2
«положительных», привел к решению постав
ленной задачи – получению оптимальной по со
ставу среды для наибольшей антигрибной актив
ности. Величина шага λ* движения по градиенту
концентраций факторов в среде рассчитывалась
по стандартной методике, исходя из значений
коэффициентов регрессии 6 (табл. 3).
Таким образом, при помощи метода мате
матического планирования эксперимента
разработана питательная среда для про
мышленного производства биопрепарата –
фунгицида «Елена» с высоким титром клеток и
наибольшей антигрибной активностью.
Литература
Таблица 3
Расчет λ * для «крутого восхождения»
для антигрибной активности
Показатель
Х1
Х2
Х3
Х4
bn
0.15
– 0.71
1.46
0.38
λn
9.00
0.12
4.50
1.00
bnxλn
1.35
– 0.09
6.57
0.38
11.00
0.13
5.50
1.50
K
15.00 – 1.00 73.00
4.22
λ*
0.15
0.04
Основной уровень
– 0.01
0.73
В результате эксперимента по плану
«крутого восхождения» была разработана
ферментационная среда следующего состава (в
г/л): глицерин – 11.30; дрожжевой автолизат
– 0.11; Na 2HPO 4 – 6.96; KH2PO 4 – 1.58;
MgSO4 Ч 7H2O – 1.5; FeCl3 – 0.01; pH 7.4.
На данной среде антигрибная активность
штамма Pseudomonas aureofaciens ИБ 51
составила 12 ед/мл КЖ, что более чем в 1.5
раза выше, чем в среднем варианте, в то же
время титр клеток на данной среде составил
22 млрд КОЕ/мл КЖ, что вполне удовлетво
ряет условиям промышленного культивирова
ния микроорганизмов.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Пат.
2203945
РФ
Штамм
бактерий
Pseudomonas aureofaciens для получения пре
парата против заболеваний пшеницы, вызывае
мых грибными фитопатогенами / Логинов О. Н.,
Свешникова Е. В., Силищев Н. Н.,
Мелентьев А. И., Галимзянова Н. Ф.,
Бойко Т. Ф. // Б. И.– 2003.– №13.
Логинов О. Н., Свешникова Е. В.,
Четвериков С. П., Пугачева Е. Г.,
Васильева Н. С., Силищев Н. Н. Новые био
препараты для сельского хозяйства и восстанов
ления окружающей среды // Тез. докл. семи
нарапрезентации инновационных научно
технических проектов «Биотехнология2003»
(2425 ноября 2003 г., г.Пущино, ИБФМ).–
Пущино, 2003.– С. 74.
Sambrook J., Fritsch E. F., Maniatis T.
Molecular cloning. New York: Cold Spring
Harbor Press; 1989.– Р. A1.
King E. O., Ward M. K., Raney D. E. // J. Lab.
Clin. Med.– 1954.– V.44.– P. 301.
Логинов О. Н., Четвериков С. П. // Биотехно
логия.– 2003.– №5.– С. 22.
Максимов В. Н., Федоров В. Д. Применение ме
тодов математического планирования эксперимен
та при отыскании оптимальных условий культи
вирования микроорганизмов.– М., 1969.– 126 с.
Широков А. В., Логинов О. Н., Мелентьев А. И.,
Актуганов Г. Э. // Прикладная биохимия и
микробиология.– 2002.– Т.38, № 2.– С. 161.
Башкирский химический журнал. 2006. Том 13. № 2
13