Пирог, Т.П. Образование экзополисахаридов на углеводных субстратах штаммом Acinetobacter sp. и особенности его С6-метаболизма / Т. П. Пирог, М. А. Коваленко, Ю. В. Кузьминская // Микробиология. – 2002. – Т.71. № 2. – С. 215–221. УДК 579.841: 577.15 ОБРАЗОВАНИЕ ЭКЗОПОЛИСАХАРИДОВ НА УГЛЕВОДНЫХ СУБСТРАТАХ ШТАММОМ Acinetobacter sp. И ОСОБЕННОСТИ ЕГО С6-МЕТАБОЛИЗМА Т.П.Пирог, М.А.Коваленко, Ю.В.Кузьминская Институт микробиологии и вирусологии Национальной академии наук Украины, Киев Показана возможность синтеза выращивании штамма Acinetobacter sp. экзополисахаридов (ЭПС) при на углеводных субстратах (моно- и дисахариды, меласса, крахмал). Установлено, что катаболизм глюкозы у данных бактерий осуществляется по пути Эмбдена-Мейергофа-Парнаса и ЭнтнераДудорова. Пируват вовлекается в цикл трикарбоновых кислот при участии пируватдегидрогеназы (КФ 1.2.2.2). Анаплеротической реакцией, обеспечивающей синтез интермедиатов для конструктивного метаболизма при росте Acinetobacter sp. на С6-субстратах, является карбоксилирование пирувата (фермент пируваткарбоксилаза, КФ 6.4.1.1). C6-метаболизм Acinetobacter sp. лимитирован коэнзимом А. Независимо от источника углеродного питания (глюкоза, этанол) в клетках Acinetobacter sp. обнаружена высокая активность ключевых ферментов С2- и С6метаболизма. Исключением являлась выращивании бактерий на глюкозе. активность изоцитратлиазы при Индукторами изоцитратлиазы у Acinetobacter sp. являются С2-соединения (этанол или ацетат). Внесение С2соединений в среду с глюкозой сопровождалось одновременным потреблением обоих субстратов, увеличением количества синтезированных ЭПС и повышением их выхода по отношению к биомассе. Обсуждаются возможные механизмы интенсификации синтеза ЭПС при культивировании Acinetobacter sp. на смеси С2- 2 С6- субстратов. Штамм Acinetobacter sp. 12S является продуцентом комплексного полисахаридного препарата (ЭПС) этаполана [1]. Ранее была разработана технология получения этаполана при использовании этанола в качестве источника углерода, разработаны подходы к интенсификации синтеза управлению его составом и физико-химическими свойствами этаполана, [1, 2]. Однако штамм Acinetobacter sp. 12S может расти и синтезировать ЭПС не только на С2-, но и на C3-, С4- и С6-субстратах [1]. Это свойство выгодно отличает этот штамм от других микробных продуцентов, которые синтезируют полисахариды при выращивании только на углеводах (Xanthomonas campestris, Azotobacter vinelandii, Scleroticum glucanicum) [1]. Способность Acinetobacter sp. 12S синтезировать ЭПС на С2-С6-соединениях позволяет создать универсальную гибкую технологию получения полисахаридов на основе широкого набора углеродных субстратов, либо комплекс различных технологий, каждая из которых может быть реализована в зависимости от экономической целесообразности, наличия и доступности того или иного субстрата, необходимости получения ЭПС с определенными физико-химическими свойствами. В связи с изложенным выше целью данной работы являлось изучение закономерностей роста и синтеза ЭПС штаммом Acinetobacter sp. 12S на углеводных субстратах, изучение основных этапов метаболизма С6-соединений у данных бактерий и разработка на основе полученных результатов подходов к интенсификации синтеза ЭПС. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Объекты исследований. образующий штамм Объектами исследований являлись Acinetobacter sp. 12S, описанный нами ранее ЭПС[1] и мутантный штамм Acinetobacter sp.1НГ, не образующий экзополисахариды [3]. Культивирование Acinetobacter sp. Бактерии выращивали на жидкой минеральной среде следующего состава (г/л): KH2PO4 - 6,8; KOH - 1,8; KCl - 1,4; NH4NO3 - 0,6; MgSO4x7H2O - 0,4; CaCl2x2H2O - 0,1; FeSO4x7H2O - 0,001. В среду дополнительно вносили 0,5% (по объему) дрожжевого автолизата и 0,0006% 3 пантотената кальция. В качестве источника углерода и энергии использовали глюкозу в концентрации 10 г/л (1 масс.%), а также этанол в концентрации 1% (по объему). При изучении способности штамма Acinetobacter sp. 12S синтезировать ЭПС на углеводных субстратах в среду вносили маннозу, фруктозу, арабинозу, галактозу, рамнозу, сахарозу, мальтозу, лактозу, гидролизованные мелассу и крахмал ДЭ-60 в количествах, эквимолярных по углероду концентрации этанола. Гидролиз мелассы осуществляли следующим образом: к 100 г мелассы добавляли дистиллированную воду до конечного объема 200 мл, в полученный раствор вносили 20 мл 1 н Н2SO4, после чего стерилизовали при 1120С в течение 30 мин. Гидролиз крахмала ДЭ-60 осуществляли путем ферментативной обработки с помощью амилазы и глюкоамилазы, как описано в работе [1]. Культивирование бактерий осуществляли также на среде, содержащей 1% глюкозы, в которую дополнительно вносили этанол в концентрации 0,01 - 1% (по объему) или ацетат в концентрации 0,02%. Ацетат вносили в среду в виде 20% раствора ацетата натрия. Бактерии Acinetobacter sp. выращивали в колбах на качалке (220 об/мин) при 30оС, рН 6,8-7,0 в течение 16 - 96 ч. В качестве посевного материала использовали суточную культуру, выращенную на смешанной агаризованной среде: мясо-пептонный агар (МПА) и сусло-агар (СА) в соотношении 1:1. Концентрацию биомассы определяли по оптической плотности клеточной суспензии с последующим пересчетом на абсолютно сухой вес клеток по калибровочному графику. Количество синтезированных ЭПС устанавливали весовым методом [4]. Концентрацию пирувата в культуральной жидкости определяли по методу, описанному в работе [5]. Концентрацию хроматографии на этанола хроматографе определяли «Цвет-4» методом с пламенно газо-жидкостной ионизационным детектором (колонка 2 м, твердый носитель целит-545, неподвижная жидкая фаза полиэтиленгликоль ПЭГ-400 (20%), газ-носитель - гелий, температура 1500С). Концентрацию глюкозы в жидкости 4 определяли Бактериальную суспензию, культуральной глюкозооксидазным методом [6] . Получение бесклеточных экстрактов. полученную после культивирования Acinetobacter sp. 1НГ в жидкой минеральной среде, центрифугировали (4000 g, 15 мин., 4оС). Полученный осадок клеток дважды отмывали от остатков среды 0,05 М трис-НСl буфером (рН 7,0), центрифугируя (4000 g, 15 мин., 4оС). Отмытые клетки ресуспендировали в 0,05 М трис-НСl буфере (рН 7,0) и разрушали ультразвуком (22 кГц) 3 раза по 30 с при 4оС на аппарате УЗДН-1. Полученный дезинтеграт центрифугировали (12000 g, 30 мин., 4оС), осадок отбрасывали, надосадочную жидкость использовали в качестве бесклеточного экстракта. Для получения бесклеточных экстрактов использовали клетки, находящиеся в середине экспоненциальной фазы роста (16-18 ч культивирования на среде, содержащей глюкозу и/или этанол в качестве источника углеродного питания). Энзиматические 2.7.1.11) [7], анализы. Активность 6-фосфофруктокиназы 6-фосфоглюконатдегидратазы (КФ 4.2.1.12) (КФ [7], фосфоенолпируваткарбоксилазы (КФ 4.1.1.31) [8] и пируваткарбоксилазы (КФ 6.4.1.1) [9] определяли по окислению НАДН+ при 340 нм. Активность глюкозодегидрогеназы (КФ 1.1.1.118 и КФ 1.1.1.119) определяли по восстановлению НАД+ или НАДФ+ при 340 нм [7]. Активность глюкозодегидрогеназы (КФ 1.1.99.10) определяли по восстановлению дихлорфенолиндофенола в присутствии феназинметосульфата при 600 нм [10]. Активность пируватдегидрогеназы кетоглутаратдегидрогеназы (КФ 1.2.4.2) (КФ [12], 1.2.2.2) [11], - малатдегидрогеназы (декарбоксилирующей) (КФ 1.1.1.38) [13] определяли по восстановлению НАД+ при 340 нм. Активность алкогольдегидрогеназы (КФ 1.1.1.1.), альдегиддегидрогеназы (КФ 1.2.1.3 и КФ 1.2.1.4) и изоцитратлиазы (КФ 4.1.3.1) определяли как описано в работе [14]. Активность ферментов определяли при температуре 28-30оС, оптимальной 5 для роста Acinetobacter sp., и выражали в нмоль/мин мг белка. Содержание белка в бесклеточных экстрактах определяли по Bradford [15]. Определение скорости окисления субстратов интактными клетками Acinetobacter sp. Скорость окисления этанола, ацетальдегида, ацетата калия и глюкозы интактными клетками Acinetobacter sp. 1 НГ (скорость дыхания интактных клеток в присутствии субстратов) потребления определяли по скорости кислорода в реакционной смеси полярографически при помощи электрода закрытого типа на полярографе ППТ-1 при температуре 28-30оС, оптимальной для роста Acinetobacter sp. Удельную скорость потребления кислорода выражали в нмоль О2/мин мг клеток. Концентрация субстратов составляла 10 мМ. Клетки Acinetobacter sp. 1НГ, полученные после культивирования в жидкой минеральной среде с глюкозой (1%) или этанолом (1%) (16-18 ч, экспоненциальная фаза роста), центрифугировали (4000 g, 15 мин., 4оС). Полученный осадок клеток дважды отмывали от остатков среды 0,05 М К+- фосфатным буфером (рН 7,0) центрифугируя (4000 g, 15 мин., 4оС). Отмытые клетки ресуспендировали в 0,05 М К+-фосфатном буфере (рН 7,0). Для инкубации клеток при определении скорости окисления субстратов использовали трис-HCl буфер (0,05 M, pH 7,0). РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Из представленных в табл. 1 данных видно, что Acinetobacter sp.12S растет и синтезирует ЭПС на многих углеводных субстратах, включая моно-, дисахариды, а также мелассу и крахмал. В данных экспериментах бактерии выращивали на углеводных средах, не содержащих пантотеновую кислоту (витамин В3), которая необходима при росте Acinetobacter sp. на С2-субстратах. Следует отметить, что Acinetobacter sp. является ауксотрофом по этому витамину [1]. Наиболее низкий уровень биомассы и ЭПС наблюдался при выращивании бактерий на рамнозе и галактозе. При культивировании Acinetobacter sp. 12S на средах, содержащих сахарозу, лактозу и мальтозу количество синтезированных ЭПС было ниже, чем на некоторых моносахаридах (глюкозе, фруктозе, маннозе, 6 арабинозе). По-видимому, это обусловлено низкой активностью у Acinetobacter sp. ферментных систем, осуществляющих гидролиз дисахаридов. В связи с этим при использовании крахмала или мелассы в качестве источника углерода для Acinetobacter sp. 12S эти субстраты были предварительно прогидролизованы. ЭПС-синтезирующая способность исследуемого штамма при выращивании на углеводных субстратах сравнима с таковой при росте на этаноле, однако при культивировании на С6-соединениях наблюдали снижение рН культуральной жидкости до 5,5-5,7 (табл.1). Для выяснения возможных причин, обусловливающих снижение рН культуральной жидкости при выращивании бактерий на углеводах, исследовали основные этапы метаболизма С6-соединений у Acinetobacter sp. Для проведения энзимологических исследований использовали мутантный штамм Acinetobacter sp. 1 НГ, не образующий ЭПС. Клетки исходного ЭПС-синтезирующего штамма оказались непригодными для таких исследований ввиду невозможности их отделения от высоковязкого ЭПС с высокой молекулярной массой. Ранее такой подход был применен нами при изучении особенностей С2-метаболизма у данных бактерий [14], что позволило усовершенствовать технологию получения этаполана на основе этанола. Эксперименты показали, что основным путем расщепления глюкозы у Acinetobacter sp. является путь Эмбдена-Мейергофа-Парнаса (гликолиз, 1,6- фруктозобифосфатный путь), часть глюкозы может ассимилироваться через путь Энтнера-Дудорова (КДФГ-путь) (табл. 2). Об этом свидетельствовала высокая активность 6-фосфофруктокиназы – одного из ключевых ферментов гликолиза и 6-фосфоглюконатдегидратазы – одного из ключевых ферментов КДФГ-пути. В данной работе не исследовали активности ферментов пентозофосфатного цикла, поскольку он не является основным путем катаболизма гексоз у бактерий, а служит поставщиком НАДФН для реакций конструктивного метаболизма и рибозы – для синтеза нуклеотидов [16, 17]. Известно, что у некоторых бактерий глюкоза расщепляется через глюконат при участии НАД(Ф)+- или пирролохинолинхинон-зависимых 7 глюкозодегидрогеназ [16, 18]. В бесклеточном экстракте Acinetobacter sp. 1НГ не обнаружена НАД(Ф)+-зависимая глюкозодегидрогеназная активность, а активность пирролохинолинхинон-зависимой глюкозодегидрогеназы была крайне низкой и не превышала 0,2 нмоль/мин мг белка (табл. 2). Штаммы Acinetobacter sp. 12S и 1 НГ являются В3-зависимыми [1, 3]. В бесклеточном экстракте Acinetobacter sp. 1 НГ обнаружена пируватдегидрогеназная активность (табл. 2), причем при культивировании бактерий на углеводных средах, не содержащих В3, активность данного фермента была в два раза ниже, чем в присутствии В3 (табл. 3). Известно, что реакция, катализируемая пируватдегидрогеназой, требует наличия коэнзима А, предшественником которого является витамин В3 [16]. Таким образом, снижение рН культуральной жидкости при выращивании Acinetobacter sp. на углеводсодержащих средах без В3 (табл. 1) могло быть обусловлено накоплением пирувата. Действительно, в этом случае в культуральной жидкости был обнаружен пируват в концентрации 40-50 мМ (табл. 3). Внесение в глюкозосодержащую среду экзогенного витамина В3 позволило предотвратить накопление пирувата и снижение рН культуральной жидкости. Скорость дыхания в присутствии пирувата интактных клеток, выращенных на среде, содержащей В3, была существенно выше, чем клеток, культивируемых в отсутствие этого витамина (табл. 3). Таким образом, С6метаболизм бактерий, как и С2-метаболизм, лимитирован коэнзимом А. Наличие в бесклеточном экстракте Acinetobacter sp. 1 НГ активности кетоглутаратдегидрогеназы (табл. 2) может свидетельствовать о том, что данных бактерий, вероятно, у функционирует полный цикл трикарбоновых кислот. В бесклеточном экстракте Acinetobacter sp.1НГ обнаружена высокая активность пируваткарбоксилазы - одного из трех известных ферментов, которые восполняют пул интермедиатов для реакций конструктивного метаболизма при росте на С6-субстратах [16, 17] (табл. 2). Не выявлена активность фосфоенолпируваткарбоксилазы и малатдегидрогеназы (декарбоксилирующей). Наличие у Acinetobacter sp. пируваткарбоксилазы объясняет тот факт, что 8 бактерии способны расти на среде, содержащей пируват в качестве единственного источника углерода и энергии [1]. Кроме того, при выращивании на пирувате штамм Acinetobacter sp. 12S синтезирует ЭПС [1]. В этом плане интересны исследования, проведенные с бактериями Xanthomonas campestris. Из литературы известно, что эти бактерии хорошо растут на глюкозе и синтезируют при этом большое количество полисахарида ксантана [19]. В тоже время использование пирувата в качестве единственного источника углерода обеспечивает лишь слабый рост X. campestris при полном отсутствии синтеза ксантана [20]. Это, однако, не означает, что бактерии не способны поглощать и утилизировать экзогенный пируват, так как в присутствии глюкозы он вовлекается в метаболизм [21]. Слабый рост на пирувате бактерий X. campestris и неспособность синтезировать при этом ЭПС, вероятнее всего, связаны с отсутствием или низкой активностью глюконеогенетической ветви обмена веществ. Способность Acinetobacter sp. расти и ситезировать ЭПС на С2-С3- субстратах [1] свидетельствует о высокой активности у данных бактерий процесса глюконеогенеза. Суть глюконеогенеза заключается в том, что из двух молекул С 3соединения образуется одна молекула фосфорилированной гексозы - глюкозо-6фосфата или фруктозо-6-фосфата [17]. При росте Acinetobacter sp. на С2соединениях синтез С4-дикарбоновых кислот (предшественников глюконеогенеза) происходит в глиоксилатном цикле [14], одним из ключевых ферментов которого является изоцитратлиаза. Дальнейшие эксперименты показали, что интактные клетки Acinetobacter sp. 1НГ, выращенные на этаноле, окисляли глюкозу, а клетки, выращенные на глюкозе, были способны окислять также этанол, ацетальдегид и ацетат (табл. 4). Активность ключевых ферментов метаболизма глюкозы при культивировании Acinetobacter sp. 1 НГ на этаноле и ключевых ферментов трансформации этанола при выращивании бактерий на глюкозе оказались достаточно высокими, за исключением активности изоцитратлиазы (табл. 2), что, возможно, связано с тем, что индукторами изоцитратлиазы являются С2-соединения [16, 22]. Чтобы проверить это, были проведены эксперименты с внесением различных 9 концентраций этанола в среду, содержащую 1% глюкозы. Установлено, что активность изоцитратлиазы увеличивалась в 2 - 15 раз, причем наиболее высокая изоцитратлиазная активность отмечалась при низких концентрациях этанола (табл. 5). Увеличение активности изоцитратлиазы до 50-60 нмоль/мин мг белка наблюдалось также при внесении в среду с глюкозой ацетата (0,02%). При внесении С2-соединений активность пируваткарбоксилазы практически не изменялась (табл. 5). Следует отметить, что при выращивании бактерий на смеси этанола и глюкозы не наблюдалось катаболитной репрессии: оба субстрата потреблялись одновременно (рисунок). Полученные данные послужили предпосылкой для исследования возможности интенсификации синтеза ЭПС штаммом Acinetobacter sp. 12S. В результате было установлено, что при культивирования штамма Acinetobacter sp. 12S на среде с глюкозой (1%) внесение этанола привело к увеличению количества синтезированных ЭПС и их выхода по отношению к биомасе (табл. 6). Причем по мере повышения в среде содержания С2-субстрата концентрация ЭПС повышалась. Интересным оказался тот факт, что увеличение синтеза ЭПС наблюдали при внесении в среду с глюкозой низких (0,02%) концентраций ацетата. Как и в случае мутантного штамма 1 НГ, при культивировании ЭПСобразующего штамма на смешанном субстрате не отмечалось катаболитной репрессии. Мы предполагаем, что при выращивании Acinetobacter sp. 12S на смеси С2и С6-субстратов интенсификация синтеза ЭПС может быть обусловлена следующими причинами. 1. При внесении С2-соединений в глюкозосодержащую среду повышается активность ферментов глиоксилатного цикла - дополнительной анаплеротической последовательности реакций, приводящей к синтезу С4дикарбоновых кислот (см. табл. 5). Вполне вероятно, что образовавшиеся в глиоксилатном цикле С4-дикарбоновые кислоты могут вовлекаться в процесс глюконеогенеза, т.е. присутствие С2-соединений в среде с глюкозой может 10 индуцировать глюконеогенез. Такой механизм интенсификации синтеза ЭПС представляется особо привлекательным при низких (0,01-0,02%) концентрациях С2-соединений (этанола или ацетата) в среде с глюкозой, поскольку в этих случаях активность изоцитратлиазы повышалась почти в 15 раз (по сравнению с активностью данного фермента при выращивании на глюкозе). 2. При достаточно высоких концентрациях этанола (более 0,5%) в глюкозосодержащей среде этанол может использоваться бактериями в качестве дополнительного источника энергии. Известно, что при росте на глюкозе около 40% углерода субстрата расходуется на окисление до СО2 с целью получения энергии, необходимой для реакций конструктивного метаболизма [16]. Вполне вероятно, что в присутствии этанола, который является «энергетически избыточным» субстратом [14], существенно снижается расход углерода глюкозы на энергетическое обеспечение процессов конструктивного метаболизма и наблюдается более эффективная трансформация этого субстрата в ЭПС. Проверка этих предположений будет являться целью наших дальнейших исследований. Таким образом, в результате проведенной работы: - показана возможность роста и синтеза ЭПС бактериями Acinetobacter sp. 12S на С6-соединениях; - с использованием мутантного штамма Acinetobacter sp. 1 НГ, не образующего ЭПС, определены основные пути катаболизма глюкозы в клетках бактерий – гликолиз и КДФГ-путь. «Узким местом» метаболизма глюкозы у Acinetobacter sp. является реакция, катализируемая пируватдегидрогеназой. С6метаболизм у исследованных бактерий, подобно С2-метаболизму, лимитирован коэнзимом А. Анаплеротической реакцией, обеспечивающей синтез интермедиатов для конструктивного метаболизма при росте данного штамма. на С6-соединениях, является карбоксилирование пирувата; - в клетках Acinetobacter sp.1 НГ, выращенных на этаноле, обнаружена высокая активность ключевых ферментов метаболизма глюкозы, а у бактерий, выращенных на глюкозе – высокая активность ключевых ферментов метаболизма этанола, за исключением изоцитратлиазы. Индукторами изоцитратлиазы у 11 Acinetobacter sp. являются С2-соединения; - внесение С2-соединений в глюкозосодержащую среду увеличивало количество синтезированных ЭПС и повышало их выход по отношению к биомассе Acinetobacter sp. 12S. При культивировании бактерий на смеси С2-С6субстратов не наблюдалось катаболитной репрессии; - полученные результаты являются основой для разработки технологии получения этаполана на углеводах, а также на смеси С2- и С6-субстратов. ЛИТЕРАТУРА 1. Гринберг Т.А., Пирог Т.П., Малашенко Ю.Р., Пинчук Г.Э. Микробный синтез экзополисахаридов на С1-С2-соединениях. Киев: Наук. думка, 1992. 212 с. 2. Пирог Т.П. Принципы регуляции состава и физико-химических свойств экзополисахаридов, синтезируемых Acinetobacter sp. Дисс… д-ра биол. наук. Киев, Институт микробиологии и вирусологии НАН Украины, 1999. 450 с. 3. Пирог Т.П., Столяр С.М., Малашенко Ю.Р. Получение и исследование мутантных штаммов Acinetobacter sp., не образующих экзополисахариды // Микробиология. 2000. 69, N 5. С. 674-680. 4. Williams A.G., Wimpenny W.T. Exopolysaccharide production by Pseudomonas NCIB 11264 grown in continuous culture // J. Gen. Microbiol. 1978. 104. P. 47 – 57. 5. Sloneker J.N., Orentas D.G. Pyruvic acid a unique component of an exocellular bacterial polysaccharide // Nature. 1962. 194, N 4827. P.478-479. 6. Лукомская И.С., Городецкий В.К. Применение микроцида (глюкозооксидазы) для определения глюкозы крови в норме и при диабете // Биохимия. 1961. 26, № 3. С. 477-482. 7. Wheller P.R. Catabolic pathways for glucoce, glycerol and 6-phosphogluconate in Mycobacterium leprae grown in Armadillo tissues // J. Gen. Microbiol. 1983. 129, N 5. P.1481-1495. 8. Utter M.F., Kurahashi K. Mechanism of action of oxalacetic carboxylase // J. Biol. Chem. 1954. 207, N 2. P. 821-841. 9. Utter M.F., Keech D.B. Pyruvate Carboxylase. I. Nature of the reaction // J. Biol. Chem. 1963. 238, N 8. P. 2603-2608. 10. Hauge J.G. Glucose dehydrogenation in bacteria: a comparative study // J. Bacteriol. 1961. 82, N 4. P. 609-614. 11. Reed L. J., Willms C. R. Purification and resolution of the pyruvate dehydrogenase complex (Escherichia coli) // In: Methods in enzymology (Ed.Wood W.A.). New York and London: Acad. Press, 1966. Vol. 9. P. 247-265. 12. Mukherjee B. B., Matthews J., Horney D. L., Reed L.J. Resolution and reconstitution of the Escherichia coli -ketoglutarate dehydrogenase complex // J. Biol. Chem. 1965. 240, N 5. P. 2268-2269. 12 13. Ochoa S. “Malic enzyme” // In: Methods in enzymology (Ed. Colowick S.P. and Kaplan N.O.). New York: Acad. Press, 1955. Vol. 1. P. 739-753. 14. Пирог Т.П., Соколов И.Г., Кузьминская Ю.В., Малашенко Ю.Р. Некоторые особенности метаболизма этанола у мутантного штамма Acinetobacter sp., не образующего экзополисахариды // Микробиология. 2001. (В печати). 15. Bradford M. М. A rapid sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. 1976. 72. P. 248-254. 16. Готтшалк Г. Метаболизм бактерий. Москва: Мир, 1982. 312 с. 17. Малашенко Ю.Р., Соколов И.Г., Романовская В.А. Микробный метаболизм неростовых субстратов. Киев: Наук. думка, 1987. 192 с. 18. Neijssel O.M., Hommes R.W.J., Postma P.W., Tempest D.W. Physiological significanse and bioenergetic aspects of glucose dehydrogenase // Antonie van Leeuwenhoek. 1989. 56, N 1. P. 51-61. 19. Jeans A., Pittsley J.E., Senti F.R. Polysaccharide B-1459; a new hydrocolloid polyelectrolyte produced from glucose by bacterial fermentation // J. Appl. Polym.Sci. 1961. 5. P.519-526. 20. Pat. 4245046 USA, 103 C 09 J 3/02. Process for the fermentative production of xanthan gum with organic acids / A.Z.Demain, P.Souw. – Publ.13.01.81. 21. Souw P. The effect of citrate and other organic acids in xanthan production // Adv. Biotechnol. Proc. 6th Int. Ferment.Symp., London (Canada), July 20-25, 1980. Toronto etc., 1981. Vol.3. P. 447-453. 22. Honer Zu Bentrup K., Miczak A., Swenson D. L., Russell D. G. Characterization of activity and expression of isocitrate lyase in Mycobacterium avium and Mycobacterium tuberculosis // J. Bacteriol. 1999. 181, N 23. P.7161-7167.