РЕГУЛЯЦИЯ С2-МЕТАБОЛИЗМА В УСЛОВИЯХ МИКСОТРОФНОГО РОСТА ПРОДУЦЕНТА ПОЛИСАХАРИДА ЭТАПОЛАНА НА СМЕСИ С2-С6СУБСТРАТОВ Т.П.Пирог, Н.В.Лащук Национальный университет пищевых технологий, Киев, Украина, tapirog@usuft.kiev.ua Ранее нами была показана возможность увеличения синтеза микробного экзополисахаридного препарата (ЭПС) этаполана при выращивании Acinetobacter sp. УКМ В-7005 на смеси энергетически-неравноценных субстратов. На основе теоретических расчетов энергетических потребностей синтеза биомассы и ЭПС на энергетически-дефицитном субстрате (глюкоза) определена "дополняющая" концентрация энергетически-избыточного субстрата (этанол), позволяющая восполнить потери углерода глюкозы при окислении ее до СО2 с целью получения энергии для процессов конструктивного метаболизма. Введение этанола в среду с глюкозой в молярном соотношении 3,1:1 сопровождалось увеличением в 1,5-2 раза количества синтезированных ЭПС, а также их выхода от субстрата по сравнению с выращиванием продуцента на моносубстратах. Недостатком технологии получения этаполана на смеси этанола и глюкозы является необходимость поддержания нейтрального значения рН в процессе культивирования продуцента, что достигалось введением в среду высокой концентрации солей (11 г/л) для создания достаточно емкого фосфатного буфера (0,05 М). При выращивании Acinetobacter sp. УКМ В-7005 на незабуференной среде с этанолом и глюкозой наблюдалось снижения рН до 4-5, прекращение роста бактерий и синтеза ЭПС. Цель данной работи – выяснение причин лимитирования метаболизма при выращивании Acinetobacter sp. УКМ В-7005 на смеси С2-С6-субстратов, разработка подходов к их устранению и реализация биосинтеза этаполана в условиях миксотрофного роста продуцента на незабуференной среде. Энзимологические исследования Acinetobacter sp. УКМ В-7005 показали, что С2С6-метаболизм у данных бактерий лимитирован коэнзимом А. Так, при культивировании продуцента этаполана на среде с моносубстратами (глюкоза или этанол) без пантотената кальция (предшественника коэнзима А) наблюдали снижения рН культуральной жидкости, обусловленное накоплением пирувата (40-50 мМ) или ацетата (50-65 мМ) соответственно. Установлено, что снижения рН при культивировании бактерий на незабуференной среде с этанолом и глюкозой обусловлено накоплением ацетата. Пируват в культуральной жидкости не обнаружен. Лимитирование метаболизма ацетата при выращивании Acinetobacter sp. УКМ В-7005 на смеси этанола и глюкозы может быть связано с ингибированием активности ацетилКоА-синтетазы продуктами окисления этанола (НАДН и НАДФН) или с ингибированием синтеза этого фермента глюкозой, как установлено для Saccharomyces cerevisiae и Bacillus subtilis. Показано, что активатором ацетил-КоА-синтетазы у продуцента этаполана является пантотеновая кислота. Повышение концентрации этого витамина в среде до 0,0009% и снижение концентрации азотного источника питания до 0,3 г/л сопровождалось увеличением синтеза ЭПС на смеси С2-С6-субстратов в 1,5-1,7 раза. Однако при этом рН увеличивалось незначительно, а в культуральной жидкости был обнаружен ацетат. 191 Известно, что ацетил-КоА-синтетаза, функционирующая в клетках многих про- и эукариот, является индуцибельным ферментом (индуктор - ацетат). Мы предположили, что использование инокулята, выращенного на ацетате или этаноле в присутствии ацетата, даст возможность частично снять лимитирование С2-метаболизма в условиях миксотрофного роста Acinetobacter sp. УКМ В-7005 на смеси этанола и глюкозы. Установлено, что при использовании инокулята, выращенного на ацетате, показатели синтеза ЭПС увеличивались, при этом активность НАД+- зависимой алкогольдегидрогеназы снижалась в 3 раза, в то время как активность ацетил-КоАсинтетазы, ацетаткиназы, изоцитратлиазы и малатсинтазы повышалась в 1,8-2 раза по сравнению с использованием посевного материала, полученного на этаноле. Таким образом, энзимологические исследования свидетельствуют об устранении лимитирования метаболизма ацетата при культивировании Acinetobacter sp. В-7005 на незабуференной среде с этанолом и глюкозой. Кроме пантотеновой кислоты, активаторами ацетил-КоА-синтетази у Acinetobacter sp. В-7005 являются катионы калия и магния. Так, максимальная активность этого фермента в бесклеточном экстракте наблюдалась в присутствии 100 мМ К+ или 5-10 мМ Mg2+. Повышение в среде культивирования продуцента этаполана концентрации катионов калия и магния сопровождалось увеличением количества синтезированных ЭПС на 20-27% и выхода ЭПС от субстрата в 1,3 раза, то есть практически до уровня, получаемого в условиях миксотрофного роста на среде с високой емкостью буфера - 8,3-9,2 г/л. Еще одним подходом для интенсификации синтеза этаполана на смеси этанола и глюкозы может быть дробное внесение субстратов в среду. По нашему мнению, такой прием позволит, с одной стороны, снизить или устранить ингибирующее действие продуктов окисления этанола и ацетальдегида на активность ацетил-КоА-синтетазы, а с другой - частично снять возможное репрессирующее влияние глюкозы на синтез этого фермента. В пользу этого предположения свидетельствовали результаты определения скорости дыхания интактных клеток в присутствии С2-С6-субстратов. Так, скорость окисления ацетата клетками, выращенными на среде с повышенным содержанием глюкозы и этанола, была в 1,3-1,7 раза ниже, чем у клеток, культивируемых при более низкой концентрации субстратов. При этом скорость дыхания в присутствии этанола, ацетальдегида, глюкозы и пирувата была практически одинаковой независимо от концентрации этанола и глюкозы в среде культивирования. Установлено, что снижение начальной концентрации субстратов в среде до 0,5 и 0,25% (с последующим дробным внесением порциями по 0,25% в процессе культивирования бактерий) сопровождалось повышением показателей синтеза ЭПС в 1,2-1,4 раза. Таким образом, в результате проведенной работы показана возможность устранения лимитирования С2-метаболизма при выращивании продуцента этаполана на смеси этанола и глюкозы. Уменьшение содержания нитратно-аммонийного источника азота в среде до 0,3 г/л и замена его на нитратный, повышение концентрации пантотената кальция до 0,0009%, катионов калия и магния до 100 и 5-10 мМ соответственно, использование посевного материала, выращенного на ацетате, снижение начальной концентрации этанола и глюкозы до 0,25-0,5 % с последующим дробным их внесением дало возможность предупредить накопление ацетата в культуральной жидкости и реализовать без снижения показателей синтез этаполана в условиях миксотрофного роста продуцента на незабуференной среде. 192