Учебная программа подготовки аспиранта

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ГОУ ВПО РОССИЙСКО-АРМЯНСКИЙ (СЛАВЯНСКИЙ)
УНИВЕРСИТЕТ
Составлена в соответствии с федеральными государственными
требованиями к структуре основной профессиональной
образовательной программы послевузовского
УТВЕРЖДАЮ:
профессионального образования (аспирантура)
Проректор по науке
_____________ П.С. Аветисян
«____» __________ 2014г.
Институт математики и высоких технологий
Кафедра - Медицинской биохимии и биотехнологии
Учебная программа подготовки аспиранта
ДИСЦИПЛИНА: ОД.А .04
Избранные главы биохимии
наименование дисциплины по учебному плану подготовки аспиранта
03.01.04
Биохимия
Шифр
Программа одобрена на заседании
Кафедры протокол
Утверждена Ученым Советом РАУ
Протокол
наименование научной специальности
№ __9___ от __14.04.________2014г.
№ ___12___ от ___17.04________2014г.
Г.Р. Вардапетян , док. биол. наук,
Заведующий кафедрой
проф.
Подпись
Ереван 2014
И.О.Ф, ученая степень, звание
1. Аннотация
Пути синтеза большинства вторичных метаболитов установлены достаточно
хорошо. В настоящее время интенсивно изучается энзимология вторичного метаболизма.
На
основании
имеющейся
информации
можно
сформулировать
некоторые
закономерности биосинтеза этих соединений. Предшественниками синтеза служит
относительно небольшое количество первичных метаболитов. Многие группы вторичных
метаболитов могут синтезироваться несколькими путями. Часто этапы синтеза
дублированы в разных компартментах клетки (например, пластиды — цитозоль). Синтез
четко спланирован и обслуживается набором специальных ферментов, в большинстве
случаев весьма специфичных.
2. Требования к исходным уровням знаний и умений студентов:
Для освоения курса студентам необходимо иметь исходный университетский уровень
подготовки по биологии, молекулярной биологии, биохимии, кинетике ферметативного
катализа, физ-химии белков и нуклеиновых кислот. Он должен уметь
пользоватся
стандартными математическими программаи при решении задач.
3. Учебная программа
3.1 Цель и задачи дисциплины
 Цель дисциплины:
Целью курса "И
Избранные главы биохимии" является формирование у студентов
представлений об основных процессах, законах и методах биохимии вторичного
метаболизма, а также навыков практических расчетов при исследовании некоторых
современных проблем биохимии.
1. Задачи дисциплины:
1. изложить
некоторые основные
проблемы современной биохимии вторичного
метаболизма.
2. на конкретных примерах продемонстрировать решение этих проблем.
3.проводить практические занятия для студентов с целью углубленного изучения курса.
3.2 Требования к уровню освоения содержания дисциплины
После прохождения дисциплины студент должен:
знать:
2
-
основные закономерности лежащие в основе биохимии вторичного метаболизма.
-
основные закономерности биосинтеза основных классов вторичных метаболитов.
-
Методические подходы исследования вторичных метаболитов.
уметь:
-
применять полученные знания для решения аналогичных проблем в смежных
областях биохимии.
владеть:
-
навыками по обобщению полученных знаний и анализу сложных биохимических
систем
3.3 Трудоемкость дисциплины и виды учебной работы (в академических часах
и кредитах)
Виды учебной работы
1
1. Общая трудоемкость изучения
дисциплины по семестрам , в т. ч.:
1.1. Аудиторные занятия, в т. ч.:
1.1.1.Лекции
1.1.2. Практические занятия
тренингового типа, в т. ч.
1.1.2.1. Обсуждение
прикладных проектов
(с защитой тезисов)
1.1.2.2. Кейсы (анализ
практич.ситуаций)
1.1.2.3. Деловые игры,
тренинги (а также
ролевые игры,
имитация ситуаций)
1.1.3.Семинары (а также
групповые обсуждения)
1.1.4.Лабораторные работы
(практическ.эксперименты,
демонстрац.опыты)
1.2. Самостоятельная работа
2. Консультации
3. Письменные домашние задания
4. Контрольные работы
5. Курсовые работы
6. Эссе и рефераты
7. Расчетно-графические работы
8. Другие методы и формы занятий **
9. Форма текущего контроля:
Устный опрос на семинаре и
тестирование умений
Всего
часов
2
126
__
сем.
3
126
72
36
72
36
36
36
54
54
2
2
3
Количество часов по семестрам
___
___
___
___ ___ ___
сем
сем.
сем. сем. сем. сем.
4
5
6
7
8
9
___
сем.
10
10.Форма промежуточного контроля: 2
письменных контрольных по темам
11.Форма итогового контроля: Зачет
по суммарным результатам (баллы)
Конт. Конт.
р-та
р-та
3.4. Содержание дисциплины:
3.4.1. Разделы дисциплины с указанием видов занятий (лекции, семинарские и
практические занятий, лабораторные работы) и их трудоѐмкость в академических
часах и кредитах:
Практ.
заняти
я,
часов
Семинары,
часов
Разделы и темы дисциплины
Всего
часов
Лекции,
часов
1
38
36
36
1. Биосинтез алкалоидов.
12
6
6
2. Биосинтез изопреноидов.
Первый промежуточный контроль
12
6
6
3. Биосинтез фенольных соединений.
8
8
8
8
8
8
8
8
8
128
36
36
2
4. Синтез минорных классов вторичных
соединений.
5. Энзимология
метаболизма
ИТОГО
вторичного
Другие
Лабор., виды
часов занятий
, часов
3.4.2. Содержание разделов и тем дисциплины:
Биосинтез алкалоидов. Образование этих веществ тесно связано с общим обменом азота
клетки. Для большинства алкалоидов показано, что схемы их синтеза унифицированы, т.
е. имеют сходную последовательность реакций. В процессе биосинтеза молекула аминокислоты практически полностью включается в структуру алкалоида. Синтез алкалоидов
разных групп включает одинаковые типы реакций: декарбоксилирование, окислительное
дезаминирование, альдольная конденсация, но для каждой группы алкалоидов эти
реакции осуществляют «собственные» ферменты. На первом этапе синтеза происходит
декарбоксилирование аминокислоты при участии соответствующей декарбоксилазы.
Образовавшиеся биогенные амины подвергаются окислительному дезаминированию с
участием аминооксидаз. Полученные в результате аминоальдегиды или аминокетоны в
результате серии последовательных реакций образуют ключевые гетероциклические
соединения. Затем происходит модификация базовой структуры с участием разнообразных реакций — гидроксилирования, метилирования и др. В формировании окончательной
структуры алкалоида могут принимать участие дополнительные углеродные единицы,
например ацетат (в виде ацетил-СоА) или монотерпеновая единица (для сложных
4
54
индольных алкалоидов). В зависимости от сложности алкалоида его биосинтез включает
от трех-четырех до десяти—пятнадцати реакций.
Рис.1
Для целого ряда алкалоидов не только установлена схема синтеза, но охарактеризованы и
выделены ферменты. Оказалось, что некоторые ферменты синтеза не очень специфичны
(в качестве субстратов могут использовать различные соединения), однако в цепочке синтеза обязательно присутствуют высокоспецифичные ферменты, которые используют только один субстрат (или ряд очень близких субстратов) и выполняют очень специфичную
реакцию. Например, при синтезе изохинолинов гидроксилирование базовой структуры по
каждому положению выполняют разные ферменты.
5
Рис. 2. Схема биосинтеза изохинолиновых алкалоидов
По мере продвижения к заключительным этапам синтеза сродство ферментов к субстрату
обычно повышается: например, для ряда ферментов синтеза бербериновых алкалоидов Кт
составляет менее 1 мкМ. В качестве примера на рис. 1 представлена схема синтеза
изохинолиновых алкалоидов.
Биосинтез изопреноидов. Если при синтезе алкалоидов сходная цепочка превращений
используется для различных исходных соединений (аминокислот), то синтез колоссального числа изопреноидов происходит из единственного предшественника — изопентенилдифосфата (ИПДФ). Под действием фермента изопентенилдифосфатизомеразы, которая
сдвигает двойную связь, ИПДФ превращается в диметилаллилдифосфат (ДМАДФ). Далее
ИПДФ присоединяется к ДМАДФ по двойной связи и образуется С10-соединение —
геранилдифосфат. Он служит источником всех монотерпеноидов. Затем к геранилдифосфату присоединяется еще один ИПДФ и образуется С15-соединение фарнезилдифосфат —
исходное вещество для синтеза сесквитерпеноидов. Далее фарнезилдифосфат может либо
присоединить еще одну молекулу ИПДФ с образованием геранилгеранилдифосфата (С20соединение — источник дитерпеноидов), либо димеризоваться с образованием сквалена
(С30-соединение — исходное соединение для всех тритерпеноидов). Наконец, геранилгеранилдифосфат может димеризоваться с образованием фитоина — С40-соединения, источник тетратерпеноидов. Кроме того, к геранилгеранилдифосфату может последовательно
присоединиться большое количество ИПДФ, формируя в конечном итоге полиизопреноиды — каучук и гуттаперчу. В результате описанных реакций образуется полный гомологический ряд С5-соединений разной длины. Далее эти алифатические молекулы могут
«свернуться» в циклические структуры, причем количество циклов, их размер и типы
6
сочленения могут быть самыми разными. На рис. 3 представлена общая схема синтеза
изопреноидов.
Синтез базовых изопреноидных структур осуществляют всего два типа ферментов —
пренилтрансферазы, которые «наращивают» длину изопреноидов, и циклазы, которые
формируют соответствующий циклический скелет молекулы. При этом каждый тип
структуры формирует специфическая циклаза. Так как типов циклических структур
изопреноидов довольно много, то и количество циклаз должно быть внушительным. К
настоящему времени их известно более ста. После формирования базовой структуры (или
одновременно с этим), происходит ее модификация и «оснащение» функциональными
группами.
Рис.
3.
Общая
схема
биосинтеза
изопреноидов
(Л)
и
два
пути
синтеза
изопентенилдифосфата (Б) в растениях.
Точками показаны меченые атомы в исходных соединениях и в образовавшихся ИПДФ
Таким образом, биосинтез изопреноидов можно представить себе как своеобразный
7
биохимический
«моделист-конструктор».
Вначале из
унфицированых
С5-модулей
изготовляются гибкие линейные конструкции разной длины. Они представляют собой
практически
формирования
идеальный
материал
множества
для
«биохимического
вариантов
конструирования»
циклических
и
структур.
Долгое время считалось, что во всех организмах исходное соединение для образования
изопреноидов — ИПДФ — формируется единственным способом, а именно из
мевалоновой кислоты, которая в свою очередь синтезируется из трех молекул ацетилСоА. Недавно было установлено, что разные организмы используют различные способы
синтеза ИПДФ. В клетках животных и грибов все изопреноиды синтезируются по
«классическому» мевалонатному пути. Целый ряд микроорганизмов, в том числе многие
цианобактерии и зеленые водоросли, используют другой вариант образования ИПДФ. В
этом случае его предшественником является 1-дезоксиксилулозо-5-фосфат, который синтезируется из пирувата и глицеральдегид-3-фосфата. Такой путь синтеза был назван
«альтернативным», или «немевалонатным». Оказалось, что растения используют оба
варианта образования изопреноидов: в цитозоле синтез идет по классическому пути, а в
пластидах — по альтернативному (рис. 3). При этом возможно не только дублирование
синтеза изопреноидов в разных ком-партментах клетки, но и разделение по типу
синтезируемых структур. Тритерпеноиды (включая стероиды) синтезируются в цитозоле
из мевалоната, тогда как дитерпеноиды (включая фитол хлорофилла) и тетратерпеноиды
(прежде всего каротиноиды) — в пластидах по альтернативному пути. Моно- и
сесквитерпены, вероятно, могут образовываться разными вариантами в зависимости от
структуры молекулы и вида растения.
Биосинтез фенольных соединений. К настоящему времени известно два пути
образования фенольных соединений — шикиматный (через шикимовую кислоту) и
ацетатно-малонатный. Основной путь шикиматный, это практически единственный
способ формирования ароматического кольца. В качестве исходных соединений для
синтеза выступают фосфоенолпируват (ФЕП) и эритрозо-4-фосфат. При их конденсации
возникает семиуглеродная кислота (2-кето-3-дезокси-7-фосфоарабогептановая), которая
затем циклизуется в 5-дегидрохин-ную кислоту. Из дегидрохинной кислоты образуется
шикимовая кислота, которая имеет шестичленное кольцо, одну двойную связь, и ее легко
перевести в соединения ароматического ряда. Из шикимовой кислоты возможно образование оксибензойных кислот — n-оксибензойной, протокатеховой, галловой. Однако
основной путь использования шикимовой кислоты — образование через префеновую
кислоту ароматических аминокислот фенилаланина и тирозина. Фенилаланин (возможно,
в ряде случаев и тирозин) — основной предшественник синтеза фенольных соединений.
8
Дезаминирование фенилаланина осуществляет фермент фенилаланинаммиаклиаза (ФАЛ).
В результате образуется коричная кислота, гидроксилирование которой приводит к
образованию
пара-кумаровой
(оксикоричной)
кислоты.
После
дополнительного
гидроксилирования и последующего метилирования из нее образуются остальные
оксикоричные кислоты.
Оксикоричные кислоты представляют центральное звено синтеза всех фенольных
соединений клетки. Opтo-кумаровая кислота является предшественником кумаринов.
После ряда реакций укорочения алифатической части молекулы образуются С6-С2- и С6С1 – соединения — это второй путь образования оксибензойных кислот (первый —
непосредственно из шикимовой кислоты). Оксикоричные кислоты могут образовывать
различные конъюгаты, прежде всего с сахарами, однако основная масса оксикоричных
кислот
активируется
путем
взаимодействия
с
СоА.
Два
магистральных
пути
использования СоА-эфиров оксикоричных кислот — синтез лигнинов и синтез
флавоноидов. Для синтеза лигнинов СоА-эфиры оксикоричных кислот восстанавливаются
до спиртов, которые выступают в качестве мономеров синтеза. При синтезе флавоноидов
СоА-производное оксикоричной кислоты взаимодействует с тремя молекулами малонилСоА
с
образованием
халкона.
Реакцию
катализирует
фермент
халконсинтаза.
Образовавшийся халкон легко преобразуется в флаванон. Из флаванонов за счет реакций
гидроксилирования,
окисления
—
восстановления
образуются
другие
группы
флавоноидов. Затем может происходить модификация молекулы — гликозилирование,
метоксилирование
и
др.
Ацетатно-малонатный путь синтеза фенольных соединений широко распространен у
грибов, лишайников и микроорганизмов. У растений он является минорным. При синтезе
соединений по этому пути ацетил-СоА карбоксилируется с образованием малонилацетилСоА. Затем происходит каскад аналогичных реакций, в результате наращивается
углеродная цепь и возникает поли-β-кетометиленовая цепочка. Циклизация поликетидной
цепи приводит к образованию различных фенольных соединений. Таким способом
синтезируются флороглюцин и его производные, некоторые антрахиноны. В структуре
флавоноидов кольцо В формируется по шикиматному пути (из оксикоричной кислоты),
тогда как кольцо А — по ацетатно-малонатному. В клетке работают два шикиматных пути
синтеза флавоноидов — один в пластидах, другой в цитозоле. В этих компартментах
находится полный набор изоферментов шикиматного пути, а также ферментов
фенольного метаболизма, в том числе ФАЛ и халконсинтазы. Таким образом, в
растительной клетке существует две параллельные цепочки синтеза фенольных
соединений (аналогично изопреноидам).
9
Синтез минорных классов вторичных соединений. Образование этих веществ также
изучено достаточно полно. Для многих азотсодержащих соединений исходными
веществами являются аминокислоты. Например, синтез цианогенных гликозидов
начинается
с
декарбоксилирования
соответствующей
аминокислоты,
затем
последовательно формируются альдоксим, нитрил и α-гидроксинитрил. На последнем
этапе синтеза образуется цианогенный гликозид за счет гликозилирования αгидроксинитрила при помощи УДФ-глюкозы. Синтез обычно осуществляет комплекс
ферментов: например, для дуррина этот комплекс состоит из четырех ферментов. Гены
ферментов клонированы. Трансгенное по двум генам растение арабидопсиса приобрело
способность к синтезу цианогенных гликозидов. Синтез беталаинов начинается от
тирозина, который гидроксилируется и образуется диоксифенилаланин (ДОФА). ДОФА
служит источником для двух фрагментов молекулы бетацианинов — беталамовой кислоты и цикло-ДОФА. Объединение этих двух соединений приводит к формированию
бетацианинов. При синтезе бетаксантинов беталамовая кислота конденсируется с
пролином.
Серосодержащие
вторичные
метаболиты
обычно
синтезируются
из
серосодержащих аминокислот.
ЭНЗИМОЛОГИЯ ВТОРИЧНОГО МЕТАБОЛИЗМА
Изучение этимологии вторичного метаболизма привело к открытию удивительно
большого
количества
различных
ферментов,
участвующих
в
этом
процессе.
Модификация вторичных метаболитов — источник их поразительного разнообразия.
Модификация происходит прежде всего в реакциях замещения (их осуществляют
ацилтрансферазы),
метилирования,
гликозилирования.
В
геноме
арабидопсиса
обнаружены гены 43 различных ацилтрансфераз. Несколько структурно близких
ацилтрансфераз используют в качестве субстратов ацил-СоА, в их активном центре
содержится консервативный гистидин. Гены ацилтрансфераз в геноме собраны в
кластеры. Метилтрансферазы представляют собой суперсемейство ферментов, в которое
входят О-, С-, N-, S-метилтрансферазы. Они используют в качестве метилирующего
субстрата
S-аденозинметионин
(SAM)
и
осуществляют
метилирование
фенилпропаноидов, флавоноидов, алкалоидов, поликетидов, сахаров. С-, N-, Sметилтрансферазы структурно (и, видимо, эволюционно) не связаны, тогда как Ометилтрансферазы имеют сходную первичную структуру и консервативный SAMсвязывающий мотив. Гликозилирование осуществляют гликозилтрансферазы, причем
существуют три типа ферментов: О-, С-, S-гликозилтрансферазы. Гликозилирование существенно изменяет свойства молекулы, прежде всего увеличивает ее растворимость и
снижает
токсичность.
Окислительно-восстановительные
10
превращения
кардинально
изменяют
свойства
молекулы.
Эти
реакции
катализируют
окислительно-
восстановительные (редокс) ферменты вторичного метаболизма — «метаболические
волшебные палочки». У растений обнаружили более 300 цитохром-Р450-оксигеназ и более
100 диоксигеназ; при этом следует учесть, что диоксигеназы обычно мультисубстратны и
образуют несколько продуктов.
3.4.3.
Краткое
содержание
семинарских/практических
занятий
и
лабораторного практикума**
3.5. Материально-техническое обеспечение дисциплины
Слайдоскоп.
Компьютер.
Компьютерный проектор.
3.6. Модульная структура дисциплины с распределением весов по формам
контролей
Вид учебной
работы/контроля
Контрольная работа
Тест
Курсовая работа
Лабораторные работы
Письменные домашние
задания
Эссе (реферативного типа)
Устный опрос (семинарс.)
Реферат
Вес формы
текущего контроля
в результирующей
оценке текущего
контроля
Вес формы
промежуточного
контроля в итоговой
оценке
промежуточного
контроля
М11
М1
М2
0,5
М3
М2
М3
0.5
0.5
0,5
0,5
Вес итоговых
оценок
промежуточных
контролей в
результирующей
оценке
промежуточного
контроля
0,5
Вес результирующей
оценки текущего контроля
в итоговых оценках
промежут. контролей
Вес итоговой оценки 1-го
промежуточного контроля
в результирующей оценке
промежут. контролей
Вес итоговой оценки 2-го
промежуточного контроля
0,5
11
Вес оценки
посещаемост
и,
результирую
щей оценки
промежут.
контролей и
оценки итог.
контроля в
результирую
щей оценке
итогового
контроля
в результирующей оценке
промежут. контролей
Вес итоговой оценки 3-го
промежуточного контроля
в результирующей оценке
промежут. контролей т.д.
Вес результирующей
оценки промежуточных
контролей в результир.
оценке итогов. контроля
Экзамен/зачет (оценка
итогового контроля)
0.5
1.0
0
∑=
1
∑=1 ∑=1
∑=1
∑=1
∑=1
∑=1
∑=1
3.7. Формы и содержание текущего, промежуточного и итогового контролей
Будут проведены текущий (опрос), промежуточный, а также итоговый контрль.
Вопросы к кандидатскому минимуму по специальности 030104-Биохимия
«БИОХИМИЯ ВТОРИЧНОГО МЕТАБОЛИЗМА»
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
Пути синтеза большинства вторичных метаболитов.
Биосинтез алкалоидов.
Ключевые гетероциклические соединения.
Изохинолиновых алкалоидов.
Биосинтез изопреноидов.
Терпеноиды (включая стероиды) и сесквитерпены.
Биосинтез фенольных соединений.
Синтез минорных классов вторичных соединений.
Энзимология вторичного метаболизма
Модификация вторичных метаболитов
Окислительно-восстановительные превращения
Вторичные метаболиты белковой природы (гормоны, яды)
Природные антиоксиданты
Выделение вторичных метаболитов.
Методы определения медико-биологической активности вторичных метаболитов
А. Ленинджер. Основы биохимии. В 3-х томах. "Мир", М., 1985.
Л. Cтрайер. Биохимия. В 3-х томах. "Мир", М., 1984.
Р. Марри, Д. Греннер, П. Мейес, В. Родуэлл. Биохимия человека. В 2-х томах.
"Мир", М., 1993
Г. Малер, Ю. Кордес. Основы биологической химии. "Мир", М., 1970.
Биохимия: Учебник / Под ред. Е. С. Северина.М.: ГЭОТАР-МЕД, 2004.-784 с.
Лим В. И., Аглямова Г. В. Принципы формирования пространственной структуры белков и нуклеиновых
кислот. Стереохимическое моделирование// Молекулярная биология. 1999. т. 33, N 6, с. 1027-1034.
Наградова Н. К. Внутриклеточная регуляция формирования нативной пространственной структуры белков
// Соросовский образовательный журнал. Биология. 1996. N 7.
Спирин А. С. Молекулярная биология: Структура рибосомы и биосинтез белка. М.: Высш.шк., 1986.-303 с.
Степанов В. М. Молекулярная биология. Структура и функции белков. М.:Высш.шк., 1996.-335 с.
Финкельштейн А. В., Птицын О. Б. Физика белка: Курс лекций с цветными и стереоскопическими
иллюстрациями. - М.: Книжный дом 'Университет', 2002.-376
дополнительная:
А. Уайт, Ф. Хендлер, Э. Смит, Р. Хилл, И. Леман. Основы биохимии. В 3-х
томах. "Мир", М., 1981.
М. Диксон, Э. Уэбб. Ферменты. В 3-х томах. "Мир", М., 1982.
Э. Корниш-Боуден. Основы ферментативной кинетики. "Мир", М., 1979.
Ч. Кантор, П. Шиммел. Биофизическая химия. В 3-х томах. "Мир", М., 1985.
12
В. Дженкс. Катализ в химии и энзимологии. "Мир", М., 1972.
В. П. Скулачев. Биоэнергетика. Мембранные преобразователи энергии. "Высш.
шк.", М., 1989.
П. Хочачка, Дж. Сомеро. Биохимическая адаптация. "Мир", М., 1988.
13