Лекция 11. Инициация полипептидных цепей Исследования механизмов проявления генов, участвующих в синтезе ферментов обмена лактозы, привело Жакоба и Моно в 1961 г. к постулату о координированной транскрипции генов лактозного оперона. Эти работы оказали огромное влияние на развитие молекулярной биологии. В интересующей нас области они поставили проблему уровня на котором находятся “знаки препинания”, обеспечивающие фенотипическую реализацию каждого из смежных генов в виде отдельной полипептидной цепи. Вскоре последовало открытие информационных (матричных) РНК, а затем генетические и биохимические исследования показали, что в большинстве случаев каждая мРНК определяет несколько полипептидных цепей, соответствующих структурным генам одного оперона. В 1964 г. появились сообщения о двух очень важных фактах, которые и привели к открытию роли одной из тРНК как инициатора полипептидных цепей. Первый из этих фактов, установленный Маркером и Сенгером, состоял в том, что у E.coli, наряду с обычной тРНКМет существует еще особая тРНК – тРНКф. Метионин, этерифицированный этой тРНКф, становился в присутствии специфического фермента акцептором формиль-ной группы, переносимой с формилтетрагидрофолата (фТГФ). Второй факт, открытый Валлером, выяснился при анализе N -концевых участков белков E. coli. Оказалось, что препарат суммарных белков содержит в этих участках 45% метионина, 30% аланина, 15% серина и только 10% других амино-кислот. Зная эти результаты, Адамс и Копеки исследовали роль формилметионил – тРНКф как инициатора. Они использовали рибосомную систему E.coli, и РНК бактериофага R17; в соответствующих условиях на этой РНК синтезировался капсидный белок фага - белок, о котором уже имелось много сведений. В частности, было известно, что это белок с небольшим молекулярным весом, что он не содержит гистидина и имеет N-концевую последовательность аминокислот Ала-Сер-Асп-Фен-Тре. Когда систему инкубировали с 3Н-фТГФ – донором формильных групп, образующийся белковый материал содержал формильную группу. При центрифугировании инкубационной смеси в градиенте сахарозы были получены результаты, где было показано, что часть радиоактивности, происходящей из формильной группы, оказалась связанной с функционирующими 70S -рибосомами, а другая значительная часть находилась в легкой фракции (4S и менее), содержавшей вещества. 3 Н-фМет-тРНК, Третья фракция 3 Н-фТГФ и другие радиоактивного низкомолекулярные материала обладала коэффициентом седиментации 30S и плечом в зоне 20S. Этот 30S материал, хотя он и совпадает по своему распределению с 30S -субчастицами рибосом, на самом деле соответствует РНК фага R17, имеющей тот же коэффициент седиментации. Было показано, что радиоактивность, находящаяся в области 30S, принадлежит белку фаговой оболочки, который ассоциирован с РНК. Плечо 20S соответствовало материалу, содержавшему другой белок, кодируемый фаговой РНК. Эти результаты, а также наблюдения Валлера позволяли предполагать, что синтез всех белков E.coli начинается с формилметионина, за которым всегда следует аланин, а затем серин, и только с четвертой аминокислоты белки начинают отличаться друг от друга. Тот факт, что обычно в N -концевом положении находят 45% метионина, 30% аланина и 15% серина, мог бы указывать на то, что после синтеза полипептидных цепей специфические ферменты отщепляют с N -конца либо одну формильную группу, либо ее и метионин. В опытах in vitro было показано, что белковый синтез на РНК фага f 2 зависит от присутствия фМет-тРНК. В этих опытах, клетки E.coli лишили фМет-тРНК и донора формильных групп фТГФ, блокировав синтез предшественника- тетрагидрофолата – путем добавления триметоприма, ингибитора дигидрофолатредуктазы. В экстрактах из таких клеток включение аминокислот в полипептиды в присутствии РНК фага f 2 происходило только при добавлении фМет-тРНК или же фТГФ (который делает возможным синтез фМет-тРНК). Другие эксперименты показали, что in vivo ингибирование биосинтеза белков E.coli триметопримом тоже обусловлено тем, что это вещество препятствует инициации полипептидных цепей. Гидроксиламин в концентрациях 10-4 - 10-5 М, также ингибирует синтез белков in vivo. В опытах in vitro было показано, что его тормозящее действие локализуется на уровне фТГФ. Реагируя с активированными формильными группами, гидроксиламин создает нехватку донора этих групп и подавляет таким образом формилирование Мет-тРНКф. Присутствие в клетке двух типов РНК, способных этерифицировать метионин, ставит проблему узнавания каждой из этих тРНК специфическими кодонами. С помощью фильтрации на нитроцеллюлозных дисках было доказано, что фМет-тРНКф в присутствии рибосом реагирует с двумя кодонами АУГ и ГУГ, а Мет-тРНКм –только с одним кодоном АУГ. В опытах с синтетическими матрицами, начинавшимися с 5/-конца триплетом АУГ, за которым следовало более или менее длинное повторение одного и того же нуклеотида, было показано, что в присутствии смеси фМет-тРНКф и МеттРНКм в N -концевом положении образующихся полипептидных цепей находится только можно формилметионин. Из совокупности этих результатов заключить, что кодон АУГ, расположенный на 5/-конце, соответствующем N -концу полипептидной цепи, всегда взаимодействует с фМет-тРНК, а тот же кодон, локализованный в другом участке мРНК всегда реагирует с Мет-тРНКм –донором метионина для внутренних и С-концевых аминокислот полипептидных цепей. Мы не знаем, что означает взаимодействие триплета ГУГ с фМет-тРНКф наблюдаемое in vitro. Этот триплет соответствует одной из изоакцепторных тРНКВал и, видимо, не служит сигналом инициации in vivo. В бесклеточных экстрактах, где при отсутствии экзогенной матрицы полипептидный синтез происходит на эндогенных матрицах, формилметионина на 150 аминокислот. включался один остаток Только фМет-тРНКф, но не Мет-тРНКм узнает два синтетических тринуклеотида АУГ и ГУГ, хотя обе эти тРНК имеют в антикодоне один и тот же нуклеотид (У), соответствующий первому основанию А и Г в кодонах. Это показывает, что вторичная структура двух тРНК в районе антикодона не идентична. Вероятно, на нее влияют модифицированные основания, которые находятся в антикодоновых петлях этих тРНК в разных положениях. Примечательно также, что в случае инициирующего кодона существует неоднозначность спаривания (“люфт”) в первой позиции кодона, тогда как в случае всех других транслируемых кодонов этот люфт возможен только в третьей позиции.