Диссертация ()

Государственное бюджетное образовательное учреждение
высшего профессионального образования
«Красноярский государственный медицинский университет
имени профессора В.Ф.Войно-Ясенецкого
Министерства здравоохранения Российской Федерации»
На правах рукописи
Комина Анна Владимировна
ВЛИЯНИЕ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНА КАТАЛАЗЫ
НА ИНДУЦИРОВАННЫЙ ОКИСЛИТЕЛЬНЫМ СТРЕССОМ
АПОПТОЗ ЛЕЙКОЦИТОВ
И КЛЕТОК МЕЛАНОМЫ КОЖИ
03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология
Диссертация
на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Научные руководители:
доктор медицинских наук, доцент
Рукша Татьяна Геннадьевна
доктор биологических наук, доцент
Постникова Ольга Алексеевна
Красноярск – 2014
2
ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ..................................................................................... 4
ВВЕДЕНИЕ .............................................................................................................. 5
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ......................................................................... 10
1.1 Физиологические функции про- и антиоксидантых систем, роль
окислительного стресса в развитии патологии ...................................... 10
1.1.1 Дыхательная цепь митохондрий и образование активных форм
кислорода ............................................................................................ 10
1.1.2 Пероксид водорода и его физиологическая роль ........................... 12
1.1.3 Повышение уровня активных форм кислорода в клетке —
окислительный стресс, его роль в норме и патологии................... 14
1.1.4 Антиоксидантная система клетки. Каталаза как компонент
антиоксидантной защиты.................................................................. 16
1.2 Дефекты каталазы и жизнеспособность клеток в условиях
окислительного стресса. ........................................................................... 18
1.3 Апоптоз как вариант реакции на окислительный стресс ...................... 21
1.3.1 Сигнальные пути апоптоза. .............................................................. 22
1.3.2 Роль нарушений апоптоза в процессах опухолевого роста........... 25
1.4 Изучение механизмов апоптоза. Роль митохондриального белкатранслокатора TSPO в реализации апоптоза ......................................... 27
1.4.1 Периферический бензодиазепиновый рецептор (TSPO) как маркер
митохондриального пути передачи апоптотического сигнала ..... 27
Глава 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ .................................. 30
2.1 Культивирование клеток .......................................................................... 31
2.2 Индукция окислительного стресса .......................................................... 31
2.3 Методы морфологического исследования ............................................. 33
2.3.1 Оценка уровня апоптоза.................................................................... 33
2.4 Методы молекулярно-генетического исследования ............................. 33
3
2.4.1 Выделение ДНК ................................................................................. 33
2.4.2 ПДРФ анализ ...................................................................................... 35
2.4.3 Выделение мРНК ............................................................................... 37
2.4.4 ПЦР в реальном времени .................................................................. 37
2.5 Биохимические методы исследования .................................................... 38
2.5.1 Измерение активности антиоксидантных ферментов ................... 38
2.6 Статистическая обработка результатов .................................................. 40
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ ..................... 43
3.1 Формирование групп нормальных клеток с различной активностью
каталазы ..................................................................................................... 43
3.1.1 Распределение полиморфизма С-262Т гена CAT в
мононуклеарных лейкоцитах ........................................................... 43
3.1.2 Определение активности каталазы в эритроцитах людей с
различными вариантами полиморфизма С-262Т гена каталазы .. 45
3.2 Сравнение распределения полиморфизма С-262Т гена каталазы в
здоровых и опухолевых клетках.............................................................. 46
3.3 Определение активности каталазы в лейкоцитах периферической
крови в состоянии окислительного стресса ........................................... 50
3.4 Оценка выраженности апоптоза клеток при индукции окислительного
стресса ........................................................................................................ 51
3.5 Определение уровня экспрессии белка-транслокатора (TSPO) в
лейкоцитах при индукции окислительного стресса в клетках в
зависимости от полиморфизма С-262Т гена каталазы.......................... 60
Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ........................................................ 63
ВЫВОДЫ ............................................................................................................... 83
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ............................................................... 84
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..................................................................................... 85
4
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
CAT – ген, кодирующий фермент каталазу
TSPO – Translocator protein
кДНК – комплементарная ДНК, ДНК, созданная на основе матричной РНК
методом обратной транскрипции
мРНК – матричная рибонуклеиновая кислота
ПДРФ-анализ – анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов
5
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы. Разработка и внедрение технологий молекулярно-генетического скрининга как основы индивидуализированной медицины
обусловливают необходимость исследования механизмов развития патологических состояний в зависимости от мутационного статуса пациента. Оценка
только рисков развития патологий, опирающаяся на полиморфизм генов, является недостаточной для создания новых эффективных способов терапии и
профилактики заболеваний. Необходимо изучение молекулярно-клеточных
процессов, приводящих к патологии клетки в зависимости от генетического
статуса.
Одним из основных механизмов повреждения клетки является повышение содержания активных форм кислорода. Эти соединения составляют
неотъемлемую часть клеточного метаболизма, в норме они выполняют важные защитные, регуляторные и иные функции (Reth M., 2002; Ree S.G., 2003).
При этом уровень активных форм кислорода в клетке регулируется антиоксидантной системой, при нарушении функционирования которой развивается
состояние окислительного стресса. Роль последнего доказана в возникновении большого числа заболеваний, в том числе заболеваний кожи, а также
формировании нейродегенеративных процессов (Васенина Е.Е., Левин О.С.,
2013). Кроме того, окислительный стресс влечет за собой нарушение в клетке
процессов, регулируемых активными формами кислорода, – пролиферации,
дифференцировки, апоптоза, что может индуцировать развитие злокачественных новообразований (Klaunig J.E., et al., 2010; Grigorov B., 2012).
Каталаза является одним из наиболее значимых ферментов антиоксидантной системы. Ее основной функцией считают утилизацию пероксида водорода в условиях окислительного стресса. В многочисленных экспериментальных исследованиях неоднократно описывались различные изменения
функционирования каталазы, вызванные, в том числе, мутациями в гене, кодирующем данный фермент. Показано, что это может приводить к повышению рисков развития ряда заболеваний (Chistiakov D.A. et al., 2005; Ahn J. et
al., 2006; Hebert-Schuster M. et al., 2012). Так, однонуклеотидную замену С>Т
в промоторной части гена каталазы в положении -262 связывают как с изменением активности данного фермента в клетках, так и с уровнем его экспрес-
6
сии (Forsberg L. et al., 2001). Это вызывает изменение рисков развития таких
заболеваний, как атеросклероз, бронхиальная астма, асбестоз и др. (Franko A.
et al., 2008; Letonja M. et al., 2011; Babusikova E. et al., 2013). Однако механизмы нарушений, происходящих в клетке с изменением функциональной
активности каталазы, до конца не исследованы.
Клетки кожи в высокой степени подвержены воздействию активных
форм кислорода, что связано с развитием меланомы, базально-клеточного и
плоскоклеточного рака кожи из-за изменений процессов передачи сигнала,
появления нестабильности генома, нарушений динамики клеточного цикла
(Swalwell H., 2012; Taddei M.L., 2012). Возможности индукции апоптоза в
опухолевых клетках рассматривают в качестве перспективного направления
в терапии злокачественных новообразований (Zhang S. et al., 2014; Luo T.Y.
et al., 2014). Пероксид водорода, утилизируемый каталазой, играет важную
роль в регуляции апоптоза (Clémenta M.-V. et al., 1998; Cerella C. et al., 2009).
Нарушения апоптоза наблюдаются при развитии злокачественных новообразований, что обеспечивает жизнеспособность опухоли.
Реализация апоптоза происходит в различных типах клеток с помощью
разных молекулярных механизмов, что важно учитывать при разработке эффективных средств противоопухолевой терапии. В этом аспекте одной из
перспективных мишеней для индукции апоптоза опухолевых клеток может
быть белок-транслокатор TSPO, который может принимать участие в индукции апоптоза с помощью разных механизмов (Грачев Д. Е., 2009).
На основе вышесказанного исследование биологического поведения
клеток с различными антиоксидантными свойствами, а также их функционирования в условиях окислительного стресса как одного из факторов развития
патологических изменений, имеет существенное значение для понимания как
механизмов опухолевого роста, так и разработки новых подходов терапии
злокачественных новообразований.
Цель работы – изучить влияние полиморфизма гена каталазы на жизнеспособность и уровень апоптотической и некротической гибели лейкоцитов и опухолевых клеток кожи при индукции окислительного стресса.
Задачи исследования:
1. Выявить особенности активности каталазы в нормальных и опухолевых клетках в зависимости от варианта полиморфизма С262Т гена каталазы.
7
2. Оценить активность каталазы в мононуклеарных лейкоцитах с различным генотипом С262Т и клетках меланомы кожи в условиях окислительного стресса, индуцированного пероксидом водорода в диапазоне концентраций 400 – 1000 мкмоль/л.
3. Оценить выраженность апоптоза мононуклеарных лейкоцитов в зависимости от активности каталазы, а также клеток меланомы кожи в условиях окислительного стресса, индуцированного пероксидом водорода в диапазоне концентраций 400 – 1000 мкмоль/л.
4. Определить изменения экспрессии апоптоз-ассоциированного белка
TSPO под воздействием окислительного стресса, индуцированного пероксидом водорода в диапазоне концентраций 400 – 1000 мкмоль/л в зависимости
от активности каталазы.
5. Оценить связь между экспрессией TSPO и выраженностью апоптоза,
индуцированного пероксидом водорода, и определить функциональную роль
TSPO в реализации изменений, вызванных окислительным стрессом.
Научная новизна. Впервые произведено исследование активности каталазы в условиях окислительного стресса в клетках с различными физиологическими уровнями активности каталазы в зависимости от варианта полиморфизма гена каталазы. Впервые оценена жизнеспособность клеток, их
устойчивость к окислительному стрессу, индуцированному пероксидом водорода, в зависимости от уровня активности каталазы.
Впервые показано, что лица, обладающие «диким» вариантом генотипа
каталазы -262СС, имеют повышенный риск развития меланомы и плоскоклеточного рака кожи по сравнению с лицами, содержащими мутантный аллель
в данном положении гена каталазы (-262СТ и -262ТТ).
Впервые выявлено, что изменение уровня митохондриального апоптозассоциированного белка TSPO напрямую не связано с выраженностью окислительного стресса, индуцированного действием пероксида водорода, что
может свидетельствовать об отсутствии роли данного белка в развитии
апоптоза.
Теоретическая и практическая значимость. Произведена характеризация биологического поведения клеток мононуклеарных лейкоцитов и меланомы кожи в зависимости от эффективности работы каталазы, выявлены
различия их функциональной активности при индукции окислительного
8
стресса пероксидом водорода в концентрациях 400 мкмоль/л, 700 мкмоль/л и
1000 мкмоль/л, что может быть применено для разъяснения патогенеза заболеваний, сопряженных с развитием окислительного стресса.
Полученные экспериментальные данные о различии в распределении
полиморфизма С-262Т среди здоровых людей и больных меланомой кожи и
плоскоклеточным раком кожи указывают на значимость полиморфизма С262Т в прогнозировании развития меланомы кожи и плоскоклеточного рака.
Это позволяет расценивать полиморфизм С-262Т гена каталазы как один из
критериев при оценке риска развития меланомы кожи и плоскоклеточного
рака кожи, что необходимо учитывать при разработке способов профилактики данных заболеваний.
Выявлено, что снижение устойчивости мононуклеарных лейкоцитов к
окислительному стрессу связано с конститутивной активностью каталазы,
зависит от генотипа, что, соответственно, может обусловливать дифференцированную роль фермента в развитии патологических изменений, индуцированных окислительным стрессом.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Полиморфизм гена каталазы С262Т определяет различную активность фермента в клетках периферической крови, а также меланомы кожи.
2. При краткосрочной индукции окислительного стресса активность каталазы является стабильной и не зависит от мутационного статуса гена, при
этом мононуклеарные лейкоциты с генотипом ТТ и сниженной активностью
каталазы обладают меньшей устойчивостью к окислительному стрессу, что
выражается в индукции некроза и апоптоза в данном типе клеток.
3. Меланома клеточной линии Bro обладает чувствительностью к окислительному стрессу, индуцированному пероксидом водорода в концентрации
1000 мкмоль/л, демонстрируя при этом изменение доли живых, апоптотических и некротических клеток.
4. Экспрессия гена TSPO в мононуклеарных лейкоцитах в условиях
окислительного стресса, индуцированного пероксидом водорода, не коррелирует с концентрацией пероксида водорода и уровнем апоптоза в клетках,
что может являться свидетельством отсутствия роли данного белка в редоксзависимом апоптозе.
Внедрение результатов исследования. Результаты, полученные в хо-
9
де диссертационного исследования, внедрены в учебный процесс кафедры
патологической физиологии с курсом клинической патофизиологии имени
проф. В.В.Иванова ГБОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф.Войно-Ясенецкого Минздрава РФ».
Апробация работы. Основные положения диссертации изложены на
VII Сибирском физиологическом съезде с международным участием (Красноярск, 2012), заседании проблемной комиссии ГБОУ ВПО КрасГМУ Минздрава РФ (протокол № 1 от 25.04.2012) и заседании проблемной комиссии
ГБОУ ВПО КрасГМУ Минздрава РФ (протокол № 4 от 16.06.2014).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных
работ, в том числе 3 – в журналах, рекомендованных ВАК РФ для опубликования статей, содержащих результаты диссертационных исследований:
1. Комина А.В., Рукша Т.Г. Модуляция апоптоза в мононуклеарных
лейкоцитах с различными вариантами полиморфизма С-262Т гена каталазы //
Цитология. – 2014. – Т. 56, № 8. – С. 599-603.
2. Комина А.В., Гырылова С.Н. , Рукша Т.Г. Полиморфизм гена каталазы и развитие плоскоклеточного рака кожи // Онкология. Журнал им. П.А.
Герцена. – 2013. – № 3. – С. 45-47.
3. Комина А.В., Рукша Т.Г. Анализ распределения и влияние полиморфизма гена каталазы (-262С/Т) на функциональную активность клеток крови
// Материалы съезда физиологов с международным участием. – Красноярск,
2012. – С. 241-242.
4. Komina A.V., Korostileva K.A., Gyrylova S.N., Belonogov R.N., Ruksha
T.G. Interaction between single nucleotide polymorphism in catalase gene and catalase activity under the conditions of oxidative stress // Physiol. Res. – 2012. –
Vol. 61, № 6. – P. 655-658.
5. Комина А.В., Коростилева К.А., Рукша Т.Г. Роль полиморфизма С262Т в промоторной области гена каталазы в развитии плоскоклеточного рака кожи // Сб. статей межрегиональной НПК Актуальные вопросы онкологии. – Красноярск, 2011. – С. 78-81.
6. Комина А.В., Рукша Т.Г. Распределение полиморфных вариантов гена каталазы у больных злокачественными новообразованиями кожи в Красноярском крае // Актуальные проблемы патофизиологии. – Бишкек, 2011. –
С. 186-189.
10
Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1
Физиологические функции про- и антиоксидантых систем,
роль окислительного стресса в развитии патологии
Все живые организмы находятся в прочной и постоянной взаимосвязи с
окружающей средой и постоянно обмениваются с ней веществами и энергией, являясь открытыми термодинамическими системами. Одним из основных
компонентов потребления живыми организмами является кислород. Он принимает участие в важнейших метаболических процессах клетки – реакциях
окисления, в результате которых происходит преобразование веществ и энергии в организме.
1.1.1 Дыхательная цепь митохондрий и образование
активных форм кислорода
Процессы, связанные с восстановлением молекулярного кислорода в
клетке вызывают большой интерес исследователей в силу образования на
различных этапах этого процесса промежуточных соединений, обладающих
реакционной активностью и зачастую оказывающих влияние на жизнедеятельность клетки – активных форм кислорода.
Интерес к активным формам кислорода как к причине возникновения
различных биохимических нарушений в клетке и развития патологических
процессов возник еще в 50-х годах 20-го века (Gershman R. et al., 1954). За
этот период было опубликовано множество исследований, описывающих как
действие активных форм кислорода на клетку, так и источники их возникновения.
Несмотря на различия точек зрения, большинством исследователей все
же одним из основных источников активных форм кислорода признается митохондрия, а именно цепь переноса электронов на внутренней ее мембране,
сопряженная с окислительным фосфорилированием АДФ (Bae Y. S. et al.,
2011; Brown G.C., Borutaite V., 2012) (рис. 1).
11
Рис. 1. Схема цепи передачи электронов на внутренней мембране митохондрий.
В этой цепи восстанавливается 93 – 95% молекулярного кислорода, однако другие 5 – 7% могут оставаться не полностью восстановленными, формируя реакционно активные соединения, свободные радикалы. Другим путем
возникновения активных форм кислорода называют дополнительные реакции в цепи, протекающие как спонтанно, благодаря разности окислительновосстановительных потенциалов или возникновению побочных продуктов
реакций, так и за счет вспомогательных реакций, осуществляющих окисление субстратов помимо цепи переноса электронов. Так, при измерении окислительно-восстановительного потенциала реакции преобразования O2 в O2· в
нормальных условиях (pH 7,0) ученые показывают, что данное значение является промежуточным между потенциалами начального и конечного звена
электрон-транспортной цепи и составляет -0,160 В.
Дыхательная цепь включает окислительные центры с потенциалами от 0,320 В (NAD(P)H) до +0,39 В (цитохром а3). Следовательно, термодинамически дыхательные компоненты этих центров (железо-серные кластеры, семихинон, флавопротеины) вполне способны к переносу электронов с образо-
12
ванием супероксид аниона. Кроме того, многие этапы переноса электронов
содержат одноэлектронные переносчики, которые также способны осуществлять моновалентное восстановление кислорода (Turrens J.F., 2003). Согласно
другим данным помимо системы цитохромов источником активных форм
кислорода могут являться побочные реакции, такие как метаболизм ксантина, гипоксантина, L- и D-аминокислот: при этом происходит перенос протонов непосредственно на молекулярный кислород с образованием пероксида
водорода (Чеснокова Н.П. и др., 2006а).
Таким образом, промежуточные формы восстановленного кислорода
образуются на протяжении дыхательной цепи.
Под термином «активные формы кислорода» в различных источниках
объединяют: супероксидный анион-радикал O2·, пероксид водорода HOOH,
гидроксильный радикал HO·, синглетный кислород 1O2, озон O3, пероксильные радикалы ROO-, гипохлорит ClO-, оксид азота NO·, гидропероксил радикал НОО·, пероксинитрит ONOO- и ряд других свободных радикалов. Перечень этих соединений варьирует от одной публикации к другой (Strzelczyk J.
K., Wiczkowski A., 2012), однако все они оказывают влияние на клетку как в
физиологическом состоянии, так и при возникновении окислительного стресса (Владимиров Ю.А., 2009). При этом наиболее изученными и представляющими наибольший интерес свободными радикалами в клетке остаются супероксидный анион-радикал O2·, пероксид водорода HOOH и гидроксильный
радикал HO·. И поскольку известно, что образование этих соединений – процесс неизбежный для клетки, большее внимание было обращено к их роли в
клетке и процессам их утилизации.
1.1.2 Пероксид водорода и его физиологическая роль
Пероксид водорода представляет большой интерес исследователей, поскольку выделяется среди других активных форм кислорода не высокой
окислительной способностью, но большой продолжительностью жизни. Сам
пероксид водорода не обладает свойствами сильного окислителя, однако лег-
13
ко преобразуется в другие, более агрессивные молекулы, такие как гипохлорит или гидроксильный радикал. Кроме того, согласно одним исследованиям,
в отличие от супероксидного анион-радикала, пероксид водорода обладает
большей подвижностью и способностью проникать через мембраны. Однако
на сегодняшний день существуют данные, опровергающие это утверждение
(Grivennikova V.G., 2010).
Образование пероксида водорода в клетке происходит различными путями. Согласно исследованию Boveris и коллег, образование пероксида водорода в митохондриях клеток печени составляет лишь 15% от общего производства пероксида водорода в клетке (Boveris A. et al., 1972). Однако есть основания полагать, что в других типах клеток этот вклад может оказаться
больше (Гривенникова В.Г., Виноградов А.Д., 2013). При этом в целом в
клетке пероксид водорода может образовываться посредством преобразования супероксидного анион-радикала как спонтанно, так и при каталитическом участии супероксиддисмутазы, а также в процессе прямого синтеза в
реакциях с участием гликолатоксидаз или оксидаз D-аминокислот в пероксисомах. В митохондриях описаны источники образования пероксида водорода
– окисление сукцината и NADH (Комплексы I и II) (Jensen P.K., 1966).
Пероксид водорода в малых концентрациях выполняет ряд важных
функций в клетке. Так, он используется фагоцитами в реакции, катализируемой миелопероксидазой, для образования гипохлорита, который, в свою очередь, обладает свойством разрушать клеточную стенку бактерий, тем самым
защищая организм от чужеродной клетки (Владимиров Ю.А., 2000; Mayer G.,
2006).
Однако кроме защитной функции большое внимание уделяется важной
роли пероксида водорода в регуляции клеточной пролиферации и апоптоза.
Несмотря на слабые окислительные свойства, он способен окислять SHгруппы белков, вызывая тем самым модификацию рецепторных белков, имитируя функцию лиганда (Reth M., 2002). Таким образом, он принимает уча-
14
стие в возникновении и передаче клеточных сигналов.
Именно свойство пероксида водорода оказывать влияние на вступление
клетки в апоптоз вызывает повышенный интерес исследователей, особенно в
применении к клеткам злокачественных новообразований, имеющий нарушение в регуляции клеточного цикла и пролиферирующих без вступления в
апоптоз.
1.1.3 Повышение уровня активных форм кислорода в клетке –
окислительный стресс, его роль в норме и патологии
В физиологических условиях концентрация активных форм кислорода
в клетке составляет около 10-8 М (Кулинский В.И., Колесниченко Л.С., 1993).
Однако, в ряде случаев концентрация активных форм кислорода в клетке
может превысить безопасный порог, приводя к возникновению окислительного стресса. Причинами окислительного стресса называют как внутренние
факторы, такие как недостаточная активность антиоксидантных ферментов
по сравнению с прооксидантными, так и внешние – ионизирующее и ультрафиолетовое излучение, лекарственные препараты, ксенобиотики.
Повышенное содержание активных форм кислорода при окислительном стрессе способно приводить к различным повреждениям клеточных
структур за счет окисления липидных, белковых и ДНК-молекул. Таким образом, возникают нарушения клеточных мембран, структуры ДНК, а также
ошибки в РНК, приводящие к нарушению синтеза белка или дизрегуляции
экспрессии гена (Klaunig J.E. et al., 2010).
Нарушениям в хранении и реализации генетического материала уделяется особое внимание при изучении окислительного стресса. Именно эти изменения связывают с развитием ряда заболеваний, таких как хроническая дегенерация нейронов, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона (Васенина
Е.Е., Левин О.С., 2013), а также ряд онкологических заболеваний: колоректальный рак, рак молочной железы, простаты, печени и другие (McKenna T.,
2009; Klaunig J.E. et al., 2010). Кроме того, окислительный стресс связывают с
15
развитием сахарного диабета, атеросклероза и некоторых других заболеваний, а также с процессами старения.
Особое внимание повреждающему действию активных форм кислорода
уделяется в митохондриях. Поскольку источники образования активных
форм кислорода в митохондриях располагаются очень близко к митохондриальной ДНК, она оказывается главной мишенью их разрушающего воздействия. В связи с этим, большая часть заболеваний, обусловленных действием
окислительного стресса, связывается именно с повреждением молекул в митохондриях (Скулачев В. П., 1996).
По концентрации окислительных агентов и реакции на них клеток
окислительный стресс условно подразделяют на уровни (Valko M. et al., 2007;
McKenna T., 2009):
1. Низкий уровень – клетка обеспечивает себе достаточную защиту. При
этом изменения наблюдаются большей частью в синтезе белков. В норме
клетки могут длительное время пребывать в состоянии непрерывного
окислительного стресса низкого уровня без серьезных последствий.
2. Средний уровень – клетка осуществляет адаптацию к стрессу.
3. Высокий уровень – клетка переходит в состояние выживания, клеточный
рост и деление в этом случае практически останавливаются. Дальнейшее
повышение концентрации активных форм кислорода приводит к массовой
гибели клеток.
Очевидно, что опасность для жизни клетки возникает при достижении
высокого уровня окислительного стресса, однако отмечено повышение риска
становления и развития злокачественной опухоли под воздействием окислительного стресса низкого и среднего уровня (рис. 2) (Valko M. et al., 2007).
Кроме того, известно, что различные типы клеток и тканей реагируют
на окислительный стресс по-разному. Одними из наиболее чувствительных
клеток являются клетки головного мозга, находящиеся в состоянии постоянного потребления большого количества кислорода и потому не имеющие до-
16
статочно сильной системы защиты от него.
Рис. 2. Дозозависимый эффект взаимосвязи между уровнем окислительного стресса и
процессом прогрессирования опухоли, процессом мутагенеза и процессом апоптоза/некроза (Valko M. et al., 2007).
Повышенной же устойчивостью отличаются клетки кожи, вероятно в
силу их постоянного нахождения в прямом контакте с кислородом воздуха
(Баринов А.Н., 2012). В целом с окислительным стрессом связывают возникновение целого ряда заболеваний, таких как атеросклероз, астма, ревматоидный артрит, нейродегенеративные заболевания и другие (Aruoma O.I., 1998;
Babusikova E. et al., 2013).
1.1.4 Антиоксидантная система клетки. Каталаза как компонент
антиоксидантной защиты
Важнейшими ферментами антиоксидантной защиты считаются супероксиддисмутаза, каталаза и глутатион-пероксидаза. При этом общепризнано, что в состоянии окислительного стресса ключевым ферментом является
каталаза. Именно она способна утилизировать пероксид водорода с высокой
скоростью (около 6 миллионов молекул H2O2 в минуту (Rahman K., 2007)),
17
обеспечивая тем самым быструю реакцию клетки на опасность и препятствуя
преобразованию пероксида водорода в гидроксильный радикал – один из
сильнейших внутриклеточных окислителей.
Каталазы относятся к классу оксидоредуктаз и представляют собой целую группу протеинов, включающую различные по строению и действию
молекулы: типичные, или монофункциональные, каталазы, бифункциональные каталазы-пероксидазы и негемовые магранец-содержащие, или псевдокаталазы (Zamocky M., 2008; Goyal M. M., Basak A., 2010). Типичная каталаза
эритроцитов человека — хромопротеид, имеющий молекулярную массу 244
кДа и состоящий из 1997 аминокислот в 4 идентичных субъединицах (рис. 3).
Каждая субъединица каталазы содержит по одной группе гема.
Рис. 3. Структура тетрамера каталазы эритроцитов человека (Putnam C.D. et al., 2000).
Реакция преобразования пероксида водорода с помощью каталазы осуществляется в два этапа путем взаимодействия с гемовой группой фермента,
содержащей Fe(III). В результате происходит поляризация и разрыв -О-Освязи в пероксиде водорода и образование промежуточного комплекса I, содержащего группу Fe(IV)=O, и воды. На втором этапе протон из другой мо-
18
лекулы пероксида водорода выступает в роли воостановителя фермента, давая выход молекулам воды и кислорода и возвращая каталазу в первоначальное состояние. В общем виде реакцию действия каталазы можно представить
следующим образом:
1. H2O2 + Fe(III)-фермент → H2O + O=Fe(IV)-фермент
2. H2O2 + O=Fe(IV)-фермент → H2O + O2 + Fe(III)-фермент.
Таким образом, из двух молекул пероксида водорода образуется 2 молекулы воды и одна молекула кислорода.
Каталаза обладает меньшим сродством к субстрату, чем глутатионпероксидаза, поэтому в физиологических условиях утилизация пероксида водорода в клетках осуществляется главным образом за счет последней. А также пероксиредоксина. Однако в отличие от глутатион-пероксидазы она обеспечивает очень высокую скорость реакции окисления пероксида водорода и
потому является бесценной в условиях окислительного стресса. Каталаза достаточно легко выделяется из множества тканей и организмов, возможно поэтому она является одним из широко изученных ферментов. В настоящее
время существует множество исследований различных видов каталаз от распространенности, механизмов действия до расшифровки нуклеотидной последовательности гена и пространственной структуры белка (Мирошниченко
О.С., 1992; Безручко Н.В., 2012; Putnam C.D. et al., 2000; Zamocky M., 2008).
Согласно исследованиям, в клетках эукариот каталаза локализована
преимущественно в пероксисомах, в меньшей степени в микросомах, еще
меньше в цитозоле (Мирошниченко О.С., 1992; Чеснокова Н.П. и др., 2006б).
1.2
Дефекты каталазы и жизнеспособность клеток
в условиях окислительного стресса
Известно, что ген каталазы человека располагается в 13 положении на
коротком плече 11 хромосомы (11p13) (Quan F. et al. 1986). В общей нуклеотидной последовательности ДНК 11 хромосомы ген каталазы занимает позиции от 34438925 пары оснований до 34472060 пары оснований (NCBI, 2014)
19
и включает 13 экзонов. Как любой участок ДНК, ген каталазы подвержен
множественным ошибкам и мутациям в процессе репликации. Некоторые из
этих мутаций оказывают существенное влияние на синтез и работу каталазы.
На сегодняшний день изучается множество полиморфизмов каталазы и оценивается их роль в работе фермента и вклад в развитие различных патологических состояний.
Среди изучаемых полиморфизмов встречаются как мутации в кодирующей части гена, так и изменения в регуляторной области. Среди первых
большой интерес представляют мутации, приводящие к изменению структуры и даже укорочению белковых молекул субъединиц каталазы. Такие изменения как правило значительно снижают ее активность, приводя к гипо- или
акаталаземии (Goth L., Nagy T., 2012).
Мутации в интронах и регуляторных областях гена имеют более сложное воздействие на работу каталазы и требуют более детального изучения их
механизмов. Поэтому большинство исследований в первую очередь опирается на фенотипическое проявление данных мутаций, оценивая частоту их
встречаемости среди лиц с различными заболеваниями, связанными с окислительным стрессом, и оценивая риски развития этих заболеваний при наличии мутантного аллеля. Примерами таких мутаций являются однонуклеотидные замены в промоторной части гена каталазы А-21Т и С-262Т.
Одним из наиболее изучаемых полиморфизмов в промоторной части
гена каталазы является замена C>T в положении -262. Согласно данным исследований, этот полиморфизм оказывает существенное влияние на активность каталазы, способствуя ее достоверному снижению, и связан с повышенным риском развития таких заболеваний как язвенный колит (Khodayari
S. et al., 2013), бронхиальная астма у детей (Babusikova E. et al., 2013), индуцированный мышьяком гиперкератоз (Ahsan H. et al., 2003) и др. Среди пациентов с сахарным диабетом 1 типа наличие мутации -262С>Т связано с повышенным риском развития периферической нефропатии (Chistiakov D.A. et
20
al., 2006).
С другой стороны, наличие мутантного аллеля в промоторной части каталазы в положении -262 не оказывает влияния на риск развития псевдоксантомы эластической (Zarbock R. et al., 2007), рака легких в популяции жителей
Гонг Конга (Ho J.C. et al., 2006), системной красной волчанки среди жителей
Ирана (Jafari M. et al., 2012), а также болезни Альцгеймера (Goulas A. et al.,
2002; Capurso C. et al., 2008) и рецидивирующих депрессивных расстройств
(Galeski P. et al., 2009), то есть тех заболеваний, которые также связывают с
непосредственным участием окислительного стресса.
Среди исследований взаимосвязи между генотипами каталазы С-262Т и
риском развития злокачественных новообразований мы встречаем данные о
риске развития рака простаты и рака молочной железы. При этом различные
исследователи приходят к различным выводам в оценке риска развития рака
простаты у лиц с генотипом -262ТТ. Согласно Сhoi J.Y. et al. (2007), для
мужчин моложе 65 лет влияние полиморфизма каталазы С-262Т на риск заболеваемости раком простаты отсутствует, тогда как после 65 лет риск возрастает в 2 раза. Позднее Tefik T. et al. (2013) оспорили полученные данные,
показав достоверное повышение риска заболевания раком простаты среди
мужчин всех возрастов.
В отношении рака молочной железы, являющегося первым злокачественным заболеванием среди женщин по распространенности и смертности
в Российской Федерации (под ред. В.И. Чиссова и др., 2012), американскими
учеными Ahn J. et al. была показана взаимосвязь между наличием генотипа
каталазы -262ТТ и повышенным риском развития данного вида рака. Кроме
того, в подтверждение гипотезы о роли активных форм кислорода в развитии
рака молочной железы, этими исследователями была показана возможность
снижения риска развития данного заболевания при потреблении овощей и
фруктов, содержащих антиоксиданты (Ahn J. et al., 2005).
Таким образом, полиморфизм С-262Т в промоторной части гена катала-
21
зы представляет большой интерес для исследователей и подвергается множественному рассмотрению с позиции оценки риска развития заболеваний. Однако, внутренние механизмы работы фермента исследованы не так обширно,
а влияние данного полиморфизма на жизнедеятельность клетки в целом
практически не изучено. До настоящего времени не изучено влияние мутации на устойчивость клеток к окислительному стрессу, а именно на их способность вступать в апоптоз. Тем не менее, изучение данного аспекта позволит нам лучше понять механизмы, происходящие в здоровых и опухолевых
клетках в состоянии окислительного стресса с целью стимулирования клеточного апоптоза в злокачественных новообразованиях.
1.3
Апоптоз как вариант реакции на окислительный стресс
Одним из результатов повреждающего действия окислительного стресса является вступление клетки в апоптоз.
Апоптоз – программируемая клеточная гибель, целью которой является
избавление многоклеточного организма от поврежденных или ненужных
клеток без ущерба для окружающей их клеточной массы. Термин «апоптоз»
был предложен в 1971 году Kerr J., но морфологические черты апоптоза были
описаны еще в 1885 году Flemming W. (Sinha K. et al., 2013). В отличие от
другой формы гибели клеток – некроза – апоптоз не сопровождается разрушением цитоплазматической мембраны клетки и выходом продуктов распада
в межклеточное пространство, поэтому в месте гибели клетки не возникает
воспалительных процессов.
Апоптоз играет большую роль в поддержании гомеостаза тканей, а
также в эмбриональном развитии всех организмов (Hotchkiss R.S. et al., 2009).
Характерными признаками апоптоза считаются сжатие клетки с утерей межклеточных контактов, фрагментация ДНК, конденсация хроматина, разрушение цитоскелета, блеббинг (вспучивание цитоплазмы) и распад клетки на
мелкие апоптотические тельца, которые быстро поглощаются фагоцитами
(Варга О.Ю., Рябков В.А., 2006).
22
Апоптоз возник эволюционно очень давно и сохранил высокую степень
консервативности. Он представляет собой сложный многоэтапный процесс.
Выделяют три основных фазы протекания апоптоза:
I фаза – индукция апоптоза. Она начинается от возникновения сигнала
на мембранных рецепторах и протекает до передачи сигнала на каспазы.
II фаза – эффекторная. Происходит запуск каспазного каскада, а также
активация других соединений, приводящих к необратимым изменениям в
клетке.
III фаза – деградационная. Активированные эндонуклеазы осуществляют фрагментацию ДНК и конденсацию хроматина. Клетка распадается на
апоптотические тельца, имеющие на поверхности маркеры для узнавания фагоцитами (фосфатидилсерины, аннексин V, калретикулин), захватывается и
утилизируется макрофагами.
При исследовании механизмов апоптоза, связанного с окислительным
стрессом, наибольший интерес вызывает фаза индукции апоптоза, поскольку
именно в этой фазе осуществляется действие активных форм кислорода и регуляция процессов. Кроме того, с торможением инициации апоптоза связывают дефекты программированной клеточной смерти опухолевых клеток.
1.3.1 Сигнальные пути апоптоза
Выделяют два основных пути, по которым происходит индукция
апоптоза. Первый путь называют путем «рецепторов смерти» или рецепторным путем. Он начинается от рецепторов, расположенных на поверхности
плазматической мембраны клетки и главным образом воспринимает информацию извне клетки. Поэтому его также называют внешним путем запуска
апоптоза. Митохондриальный, или внутренний, сигнальный путь обычно
привязывают к реакции клетки на внутренние изменения или повреждения.
Он начинается на внутренней мембране митохондрии и завершается в цитоплазме. Упрощенно рецепторный и митохондриальный сигнальные пути
апоптоза изображены на рис. 4.
23
Рис. 4. Схема рецепторного и митохондриального каспазного пути апоптоза.
Источником возникновения рецепторного сигнала называют расположенные в цитоплазматической мембране рецепторы, такие как Fas (CD95 –
24
cluster differentiation 95, кластер дифференциации 95; APO-1 – apoptosis antigen 1, апоптотический антиген 1), TNFR (tumor necrosis factor receptor, рецептор фактора некроза опухоли) и т.д. Активация рецептора происходит за счет
присоединения к нему специфического лиганда – FasL (Fas-лиганд), TNF
(tumor necrosis factor, фактор некроза опухоли) соответственно и др.
Активированный рецептор присоединяет к себе домен клеточной смерти в клеточной цитоплазме. Для Fas это домен FADD (Fas-associated death
domain, домен смерти ассоциированный с рецептором Fas), для TNFR –
TRADD (TNF receptor associated death domain). Образовавшийся комплекс
присоединяет и активирует прокаспазу 8, превращая ее в каспазу 8. В свою
очередь, каспаза 8 способствует активации каспазы 3, запускающей механизм трансформации клетки, после чего процесс программируемой гибели
клетки становится необратимым (Широкова А.В., 2007).
При митохондриальном запуске апоптоза ключевым звеном является
внутренняя мембрана митохондрии и существующий на ней мембранный потенциал. Было показано, что снижение мембранного потенциала в митохондрии клетки приводит к существенным изменениям состояния самой митохондрии: наблюдается отекание митохондриального матрикса, поры внутренней мембраны широко раскрываются, приводя к окислительно-восстановительному коллапсу, внешняя мембрана митохондрии разрывается.
Через раскрытые поры происходит выход ряда белков в цитоплазму, в
том числе цитохрома с. При этом цитохром с взаимодействует с апоптотическим фактором активации протеаз Apaf1 и прокаспазой 9 с образованием
апоптосомного комплекса (апоптосомы), содержащего активированную каспазу 9. Каспаза 9 активирует каспазы 3 и 7. Так начинается каспазный каскад
при митохондриальном сигнальном пути.
Таким образом, рецепторный и митохондриальный сигнальные пути
апоптоза сходятся на этапе активации каспазы 3. Дальнейший путь апоптоза
у них протекает по одной схеме.
25
Кроме описанных путей индукции апоптоза описывают также ряд других путей, таких как сигнальный путь эндоплазматического ретикулума, связанный с активацией прокаспазы 12, и другие (Широкова А.В., 2007).
Особое внимание уделяют процессам регуляции апоптоза в клетке. В
настоящее время описывают ряд белков, осуществляющих регуляцию
апоптоза и способных как стимулировать, так и ингибировать данный процесс. Одним их основных стимуляторов апоптоза выступает белок p53, который называют онкосупрессором. Этот белок обеспечивает синтез генов,
участвующих в репарации ДНК, а также процессах вступления в апоптоз. Таким образом, белок p53 стимулирует вступление клетки в апоптоз, что препятствует возникновению опухоли. Из ингибиторов апоптоза наиболее широко изучен белок Bcl-2. Он действует на уровне возникновения митохондриального сигнального пути и способствует восстановлению ионного потенциала на внутренней мембране митохондрий и стабилизации цитохрома с.
Таким образом, не происходит повреждения мембран, высвобождения
цитохрома с и запуска каспазного каскада. Bcl-2 снижает эффект АФК на
клетку и потому рассматривается порой как антиоксидант, хотя прямой антиоксидантной активностью не обладает (Hildeman D.A. et al., 2003). Однако
в то же время гиперэкспрессия Bcl-2 и подавление апоптоза данным белком
при наличии повреждающих агентов окислительного стресса в клетке может
спровоцировать клеточную малигнизацию.
Поскольку, при нарушении баланса оксидантной и антиоксидантной
систем, источник образования активных форм кислорода располагается чаще
внутри клетки, существует мнение, что апоптоз как реакция на окислительный стресс будет иметь скорее митохондриальный путь инициации.
1.3.2 Роль нарушений апоптоза в процессах опухолевого роста
Необходимость стимулировать клеточный апоптоз возникает в науке
при борьбе со злокачественными новообразованиями. Сам процесс малигнизации клеток связывают с нарушением баланса регуляции процессов проли-
26
ферации, дифференцировки и апоптоза, причем процессы дифференцировки
и апоптоза подавляются, тогда как пролиферация и рост клеток происходят
интенсивно. Так, было показано, что при развитии рака яичников прогрессирование опухоли сопровождается повышенной экспрессией белка семейства
Bcl-2, ингибитора апоптоза, а также изменением в белке p53, осуществляющим репарацию ДНК и называемым онкосупрессором (Антонеева И.И., Петров С.Б., 2008).
Таким образом, при развитии злокачественного новообразования клетки его оказываются практически неспособными к самостоятельному вступлению в апоптоз, а поскольку одним из регуляторов этих процессов называют активные формы кислорода (в частности, пероксид водорода) (Фархутдинов Р. Р., 2001), то становится целесообразным использовать их и для восстановления клеточного баланса.
Индукция апоптоза опухолевых клеток рассматривается как один из
возможных подходов в терапии злокачественных новообразований (Matés
J.M., Sánchez-Jiménez F.M., 2000). Так, возможность индукции апоптоза путем модуляции окислительного стресса была показана для клеток рака молочной железы (Yin S.T. et al., 2014) и опухолевых клеток при лейкемии
(Zhang S. et al., 2014).
Меланома и плоскоклеточный рак кожи являются злокачественными
новообразованиями кожи, которым уделяется особое внимание. Причиной
этого является высокая смертность пациентов с меланомой (80% всех пациентов с раком кожи) (
ez I.L.et al., 2011), а также высокая скорость роста
клеток плоскоклеточного рака, его склонность к рецидивам. Согласно исследованиям, меланома занимает особое место среди злокачественных новообразований по механизмам формирования и роста и требует особого подхода в
терапии из-за плохо прогнозируемого течения, возможной быстрой диссеминации опухолевого процесса (Новик А.В., 2011; Fruehauf J.P., Trapp V., 2008).
Одной из особенностей меланомы является тот факт, что она развива-
27
ется из меланоцитов – клеток, характеризующихся повышенным содержанием активных форм кислорода (Fruehauf J.P., Trapp V., 2008;
ez I.L. et al.,
2011), и потому, взаимодействие меланомы с активными формами кислорода
может отличаться от данных для других опухолей. Кроме того, меланома характеризуется непредсказуемостью течения и ответа на терапию (Новик А.В.,
2011). Высокая степень мутагенеза клеток меланомы затрудняет ее терапию
посредством целенаправленного воздействия на определенную молекулярную мишень. В настоящее время интенсивно исследуются возможности применения активных форм кислорода для лечения меланомы, однако точный
ответ на возможность такого подхода до сих пор не получен (Davids. L.M.,
2013).
Одним из основных факторов развития плоскоклеточного рака кожи
является длительное воздействие на кожу ультрафиолетового излучения
(Ганцев Ш.Х., Юсупов А.С., 2012; Stern R.S., Lunder E.J., 1998). При этом
действие ультрафиолетового излучения рассматривается как напрямую, через
возникновение мутаций в ДНК, так и посредством увеличения количества
активных форм кислорода в клетке под его воздействием – окислительного
стресса (Rodust P.M. et al., 2009).
1.4
Изучение механизмов апоптоза. Роль митохондриального белкатранслокатора TSPO в реализации апоптоза
1.4.1 Периферический бензодиазепиновый рецептор (TSPO) как маркер
митохондриального пути передачи апоптотического сигнала
Одним из основных направлений в изучении механизмов клеточного
апоптоза является выявление роли различных компонентов (ферментов, белков, лигандов) в реализации апоптотического процесса. При этом в первую
очередь определяют наличие и концентрации этих компонентов в живой
клетке и собственно в процессе апоптоза. К таковым относится белоктранслокатор (18 kDa), которому отводят важную роль в регуляции апоптоза
по митохондриальному сигнальному пути (Xiaolong Q. et al., 2012).
28
TSPO, белок-транслокатор, translocator protein (18 kDa), периферический бензодиазепиновый рецептор (PBR), IBP – этот белок имел много различных названий, сменяющих друг друга в процессе его исследования с момента открытия в 70-х годах XX века (Papadopoulos V. et al., 2006; Corsi L. et
al., 2008; Surinkaew S. et al., 2011). Причиной этому является, во-первых, широкая распространенность данной молекулы как в клетке, так и в тканях и
даже среди многообразия живых организмов (Casellas P. et al., 2002; Fan J. et
al., 2012), а во-вторых – большой диапазон его функций в клетке (Xiaolong Q.
et al., 2012).
Можно полагать, что общая картина функций TSPO в клетке является
на сегодняшний день еще не полной. Среди функций TSPO в клетке описаны
регуляция биосинтеза стероидов, транспорт холестерола, порфирина и анионов через мембраны, участие в процессах роста и дифференцировки клетки,
регуляция клеточной пролиферации опухолей, регуляция клеточного апоптоза, управление митохондриальным мембранным потенциалом в электронтранспортной цепи и регуляция работы кальциевых каналов (Papadopoulos V.
et al., 2006; Xiaolong Q. et al., 2012). В дополнение существует ряд исследований, показывающих наличие изменений в работе TSPO при различных заболеваниях, в том числе при злокачественных новообразованиях (Han Z. et al.,
2003). Таким образом, TSPO представляет большой интерес как функционально разносторонняя молекула.
Основной локализацией TSPO в клетке считают митохондрии, однако
существуют также исследования, продемонстрировавшие локализацию TSPO
в ядерных фракциях и плазматической мембране (Veetman L., Gavish M.,
2006; Papadopoulos V. et al., 2006). Пространственная структура и основные
биохимические характеристики TSPO подробно описаны в работе Korkhov
V.M. et al. (2010).
Представления об участии TSPO в процессе клеточного апоптоза опираются на различные данные. Одним из наиболее распространенных под-
29
тверждений роли TSPO при апоптозе является возможность стимулировать
апоптоз в клетках лигандом TSPO PK11195 (Гырылова С.Н., 2011; Hirsch T.
et al., 1998; Tanimoto Y., 1999; Mendonça-Torres M.C., Roberts S.S., 2013). Хотя Kroemer G. et al. отмечено, что воздействие данного лиганда на процесс
апоптоза возможно и без взаимодействия с TSPO (Kroemer G., Reed J.C.,
2000), принято считать, что механизм действия TSPO на апоптоз заключается
в регуляции процесса открытия неспецифических митохондриальных пор
(PTP), что является начальным этапом вступления клетки в апоптоз. Одновременно описывают участие TSPO в начальных этапах каспаз-независимого
апоптоза, без выхода цитохрома с (Грачев Д.Е., 2009). Вместе с тем, механизмы действия TSPO остаются не до конца ясными и требуют дальнейшего
разъяснения.
Таким образом, на основе имеющихся данных об участии TSPO в индукции клеточного апоптоза, он рассматривается как перспективная мишень
воздействия на клетку с целью стимуляции апоптоза, в частности, как стратегия в противоопухолевой экспериментальной терапии (Kessel D., 2001; Corsi
L. et al., 2008).
30
Глава 2.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Исследование выполнено на кафедре патологической физиологии с
курсом клинической патофизиологии Государственного бюджетного учреждения высшего профессионального образования «Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф.Войно-Ясенецкого» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Утверждено локальным
этическим комитетом КрасГМУ (№ 36/2011 от 22.12.2011).
Биопсийный материал получен из КГБУЗ «Красноярское краевое патологоанатомическое бюро». Человеческая культура клеток меланомы кожи
BRO была получена в ФГБУ «НИИ клинической иммунологии» СО РАМН
(г. Новосибирск).
Для анализа активности каталазы и устойчивости нормальных клеток в
условиях окислительного стресса использовали мононуклеарные лейкоциты
периферической крови от здоровых добровольцев. Известно, что клетки с
высокой и сниженной активностью каталазы в нормальных условиях часто
не имеют фенотипических различий (Казимирко В.К., Мальцев В.И., 2004).
Однако существует ряд исследований, показавших, что активность каталазы
в клетках достоверно снижается при наличии мутации С-262Т в промоторной
части гена CAT (Forsberg L. et al., 2001; Nadif R. et al., 2005; Bastaki M. et al.,
2006; Ahn J. et al., 2006; Ghaly M.S. et al., 2012).
На основе этих данных на первом этапе отбора образцов для исследования определяли генотип каталазы в положении -262 гена с помощью
ПДРФ-анализа (описан ниже). Это позволило сформировать группы обследованных людей с вариантами полиморфизма CAT -262СС (дикий вариант), 262СТ (гетерозиготная мутация) и -262ТТ (гомозиготная мутация).
Впоследствии различная активность каталазы между группами была
подтверждена измерением активности в эритроцитах по методу М.А.Королюка (1988) (описан ниже). Из каждой группы были отобраны 3 человека для
31
дальнейшего исследования поведения мононуклеарных лейкоцитов в условиях окислительного стресса. Таким образом, в исследовании принимали
участие три группы людей с вариантами полиморфизма в промоторной части
гена каталазы С-262Т с подтвержденной различной активностью данного
фермента.
2.1
Культивирование клеток
Выделение мононуклеарных лейкоцитов периферической крови производилось от здоровых добровольцев после получения информированного согласия, осуществлялось посредством градиентного центрифугирования с раствором Диакол (Диа-М, Россия).
Клетки суспендировали в питательной среде RPMI-1640 с добавлением
бычьей фетальной сыворотки (10%) и доводили до концентрации 2 – 3·106
клеток/мл, затем рассевали в культуральную планшету и инкубировали при
37°C в CO2 инкубаторе (5% CO2).
Человеческая культура клеток меланомы кожи BRO сохранялась замороженной в жидком азоте. Размораживание клеток осуществляли путем
кратковременной инкубацией при температуре 37°C, после чего производили
отмывку клеток от криоконсерванта питательной средой RPMI 1640, содержащей 2 мМ L-глутамина и 10% фетальной бычьей сыворотки. Клетки центрифугировали в центрифуге ЦЛМН-Р10-01-Элекон (Элекон, Россия) на скорости 1000 об./мин в течение 1 мин и осторожно отбирали супернатант.
Клеточный осадок заливали свежей питательной средой. Культивирование осуществляли в питательной среде RPMI 1640, содержащей 2 мМ Lглютамина, 10% инактивированной бычьей фетальной сыворотки и антибиотики (100 ЕД/мл пенициллина и 0,25 мкг/мл амфотерицина В) в СО2инкубаторе (Sanyo, Япония) при содержании СО2 5% и температуре 37°C.
2.2
Индукция окислительного стресса
Клетки рассеивали в культуральные планшеты с плотностью 1 – 2,5·106
32
кл./мл и инкубировали в течение 24 ч. В каждом эксперименте плотность
клеточных культур всех исследуемых образцов приводилась к одному значению исходя из данных о том, что устойчивость клеток к окислительному
стрессу зависит не только от концентрации окислительного агента (H2O2), но
и от плотности клеточной культуры (Бурова Е.Б. и др., 2012).
Затем к культурам клеток добавляли по 50 мкл приготовленных растворов пероксида водорода в питательной среде RPMI 1640 с 2 мМ L-глютамина и 10% инактивированной бычьей фетальной сыворотки до конечных
концентраций 400 мкмоль/л, 700 мкмоль/л и 1000 мкмоль/л. Данные концентрации пероксида водорода были выбраны исходя из данных российских
ученых, описывающих влияние пероксида водорода в диапазоне концентраций 50 – 1000 мкмоль/л на мононуклеарные лейкоциты, а также фибробласты
и стволовые клетки эндометрия (Новицкий В.В. и др., 2008; Бурова Е.Б. и др.,
2012). В контрольные лунки с культурой приливали равный объем полной
питательной среды без пероксида водорода. После индукции окислительного
стресса инкубирование клеток продолжалось.
Для оценки уровня активности каталазы в условиях окислительного
стресса после индукции инкубирование продолжали 1 ч, после чего культуру
центрифугировали в течение 10 мин при 3000 об./мин на микроцентрифуге
MiniSpin (Eppendorf, США), клеточный осадок промывали физиологическим
раствором, ресуспендировали в 100 мкл стерильной дистиллированной воды.
После разрушения клеток посредством замораживания-оттаивания суспензии
использовали для биохимического исследования.
Для оценки выраженности клеточного апоптоза после индукции инкубирование продолжали в течение 24 ч. По окончании осуществляли центрифугирование клеток в течение 10 мин при 1500 об./мин на микроцентрифуге
MiniSpin (Eppendorf, США). Клеточный осадок промывали в холодном фосфатно-солевом буфере. Далее проводили морфологические исследования.
33
2.3
Методы морфологического исследования
2.3.1 Оценка уровня апоптоза
Выраженность апоптоза оценивалась визуально при помощи окраски
клеток акридиновым оранжевым/бромистым этидием (АО/ЕВ) (Gerbu Biothechnick GmbH, MP Biomedicals Inc.) согласно методу Ribble D., 2005 (Ribble
D. et al., 2005). Концентрация красителей составляла 8 мг/мл каждого. Визуализация проводилась с использованием флуоресцентного микроскопа Микромед 3 ЛЮМ (Микромед, Россия) при увеличении Х400, светофильтр 000.
Подсчитывали число апоптотических клеток на 100 визуализируемых клеток.
Живая клетка под микроскопом имела округлую форму, крупное ядро, имеющее относительно равномерную окраску и занимающее почти всю клетку,
четкий ровный контур.
Апоптотическая клетка распознавалась по конденсированному содержимому, образующему скопление неправильной формы с фрагментарным
или полным окрашиванием в зеленый, реже желтый, цвет. Цитоплазма
апоптотических клеток за счет образования выпячиваний придавала клетке
нечеткие очертания и имела более слабое зеленое или оранжевое окрашивание. В состоянии позднего апоптоза клетка представляла собой скопление
фрагментов оранжевого цвета. Некротические клетки приобретали яркое
красно-оранжевое окрашивание.
Живые клетки меланомы линии Bro при окраске акридиновым оранжевым/бромистым этидием отличались крупным размером и шероховатостью
поверхности. Цитоплазма и ядро их также равномерно окрашивались в зеленый цвет. В апоптотических клетках ядро было желто-оранжевого цвета.
Некротическая клетка имела красно-оранжевую окраску.
2.4
Методы молекулярно-генетического исследования
2.4.1 Выделение ДНК
Для определения полиморфизма гена CAT C-262T в клетках относи-
34
тельно здоровых людей в качестве материала использовались образцы венозной крови, взятые у 103 пациентов в возрасте от 18 до 60 лет, у которых на
момент исследования не было выявлено заболеваний, в том числе связанных
с нарушением окислительно-восстановительных процессов. Среди исследуемых было 82 женщины (средний возраст 24,35±6,80 лет) и 21 мужчина (средний возраст 22,14±3,60 лет).
Для определения полиморфизма в опухолевых клетках было исследовано 50 биоптатов меланомы кожи и 50 биоптатов плоскоклеточного рака,
полученных от онкологических больных. Среди пациентов с меланомой кожи было 63% женщин и 37% мужчин. Средний возраст женщин составил
50,28±14,34 лет (18 – 76 лет), возраст мужчин — 53,07±12,17 лет (29 – 75
лет). Локализация меланомы была различной, от области лица и шеи до голеней и стоп. Среди поставленных диагнозов преобладала поверхностно распространенная меланома (72%). Кроме того, присутствовали образцы лентиго меланомы (9%), веретеноклеточной меланомы (7%), узловой меланомы
(5%) и других видов (7%).
Одним из важных диагностических признаков при оценке меланомы
является классификация по уровню инвазии по Кларку. Согласно этой классификации, на первом уровне инвазии клетки меланомы распространяются в
верхнем слое кожи (эпидермисе). Второй уровень инвазии характеризуется
внедрением клеток во второй слой кожи, дерму, на третьем-четвертом уровне
клеток меланомы заполняют всю толщу дермы, не выходя при этом за ее
пределы. При пятом уровне инвазии распространение опухоли происходит за
пределы дермы, в подкожно-жировую клетчатку. В исследуемой выборке образцов меланомы присутствовали образцы с первого по пятый уровень инвазии по Кларку. При этом образцы с 1–2 уровнем инвазии составили 7,3%, 2
уровнем – 26,8%, 3 уровнем – 39%, 4 уровнем – 19,5%, 5 уровнем – 7,3%.
Среди пациентов с плоскоклеточным раком кожи преобладали мужчины (71,1 %). Средний возраст женщин составил 66,9±13,83 лет (48 – 82 года),
35
мужчин – 62,03±14,50 лет (24 – 81 год). Основным местом локализации плоскоклеточного рака была голова (включая расположение на нижней губе,
ушной раковине, нижней челюсти) – 76,0 %.
Нельзя не отметить, что в группах условно здоровых добровольцев и
пациентов с меланомой и плоскоклеточным раком кожи средний возраст существенно различался. Однако в исследовании российских ученых показано,
что распределение полиморфизма С-262Т гена каталазы значимо не изменяется в возрастных группах от 1 до 75 лет (Паук В.В. и др., 2008). Это сделало
возможным сравнение полученных в данном исследовании распределений.
Для получения ДНК из биоптатов кожи производилась предварительная депарафинизация ксилолом с последующей спиртовой промывкой по
стандартной методике. После этого образцы ткани инкубировались при температуре 55°С в течение ночи с лизирующим раствором (комплект реагентов
ДНК-сорб В, Amplisens, Россия). Для получения ДНК из лейкоцитов образцы
крови центрифугировались на скорости 2700 об./мин в течение 15 мин, затем
лейкоциты отбирались в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и
заливались лизирующим раствором (комплект реагентов ДНК-сорб В, Amplisens, Россия). Дальнейшее выделение ДНК осуществлялось при помощи
комплекта реагентов ДНК-сорб В (Amplisens, Россия). Выделенные образцы
ДНК хранились при температуре -20°С.
2.4.2 ПДРФ анализ
Для выявления мутации использовали метод анализа полиморфизма
длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ-анализ), описанный Nagasaka T.
et al. (2004).
Праймеры
5’-CTGATAACCGGGAGCCCCGCCCTGGGTTCGGATAT-
3’ и 5’-CTAGGCAGGCCAAGATTGGAAGCCCAATGG-3’ (ООО «Сибэнзим», Новосибирск) были созданы по последовательности, описанной Zarbock R. et al. (2007) для представления сайта рестрикции EcoR V (BioLabs,
36
New England) в диком аллеле (GATATC). Амплификация проводилась на амплификаторе BIS Termocycler в объеме 25 мкл, содержащем ПЦР буфер, 1,5
ммоль/л MgCl2 (ФГУН ЦНИИЭ Ростпотребнадзора), 0,2 мкмоль/л каждого
праймера, 0,1ммоль/л dNTPs (5х dNTPs mix, ФГУН ЦНИИЭ Ростпотребнадзора), 0,625 единиц TaqF полимеразы (ФГУН ЦНИИЭ Ростпотребнадзора) и
около 50 нг выделенной ДНК.
Условия ПЦР (Zarbock R. et al., 2007) были изменены в сторону увеличения количества циклов до 40: первоначальная денатурация при 95°С – 15
мин, и 40 циклов денатурации при 94°С – 1 мин, отжига праймеров при 68°С
– 1 мин, элонгация при 72°С – 1 мин; 15 мин при 72°С для конечной элонгации. Длина полученного ПЦР-продукта составляла 190 п.н.
Полученные ампликоны переосаждали по стандартной методике с 5М
хлоридом натрия и этанолом и подвергали рестрикции с помощью рестриктазы EcoR V. Рестрикция производилась в объеме 25 мкл с использованием
буферного раствора для рестриктазы SE W и бычьего сывороточного альбумина (БСА) в концентрации 100 мкг/мл (СибЭнзим, Россия) при температуре
37°С в течение 20 ч. В качестве положительного контроля на этапе рестрикции использовали геномную ДНК человека (Applied Biosystems, США).
Для определения длин полученных продуктов рестрикции осуществляли электрофоретическое разделение в 10% полиакриламидном геле (камера
для электрофореза Helicon, BioRad, США) при следующих параметрах: сила
тока – 50 мА, напряжение – 400 В, мощность – 15 Вт (источник тока Эльф-8,
ДНК-Технология, Россия). Для определения длин фрагментов на дополнительную дорожку геля наносили маркерную ДНК 100 bp Ladder (Медиген,
Россия) в объеме 1 мкл. После завершения электрофореза гель окрашивался
раствором бромистого этидия в течение 5 мин. Визуализация продуктов рестрикции в геле осуществлялась с использованием прибора ChemiDoc (BioRad, США).
В случае отсутствия в гене каталазы мутации в положении -262, ПЦР
37
продукты разрезались на фрагменты длиной 157 п.н. и 33 п.н. При наличии
же мутации (предположительно, замены С-262Т) сайт узнавания рестриктазой нарушался, и ампликон длиной 190 п.н. оставался неразрезанным.
2.4.3 Выделение мРНК
Для получения мРНК из культуры мононуклеарных лейкоцитов после
инкубирования с различными концентрациями пероксида водорода использовали по 1 мл культуры. Клетки центрифугировали в микроцентрифуге MiniSpin (Eppendorf, США) на скорости 3000 об./мин, промывали фосфатным
буферным раствором, после чего осуществляли выделение мРНК из клеток
методом гуанидин-фенол-хлороформной экстракции с использованием комплекта реагентов «Рибо-золь В» (AmpliSens, Россия) по прилагаемому протоколу. После выделения РНК осуществляли реакцию обратной транскрипции
с применением комплекта реагентов «Реверта» (AmpliSens, Россия) при температуре 37°C в течение 30 мин. Полученную кДНК использовали для дальнейшей постановки ПЦР в реальном времени.
2.4.4 ПЦР в реальном времени
Постановку ПЦР в реальном времени производили с использованием
специфичных праймеров к TSPO (Hs00559362_m1; Applied Biosystems,
США). В качестве эндогенного контроля использовали β-актин (Assay ID
Hs01060665_g1; AppliedBiosystems, США). Для постановки реакции использовали реакционную смесь Universal MasterMix II no UNG ×10 (Applied Biosystems, США). В объеме 25 мкл смешивали 2,5 мкл MasterMix-смеси, 1 мкл
раствора специфичных праймеров и зонда TaqMan®Assay, 2 мкл полученной
кДНК и 19,5 мкл деионизованной воды для ПЦР (БиоЛинк, Россия).
Образец эндогенного контроля β-актина содержал 2,5 мкл смеси MasterMix, по 0,9 мкл каждого праймера и зонда, 2 мкл кДНК и 17,8 мкл деионизованной воды для ПЦР. Программа термоциклирования выполнялась при
следующих условиях: 50°C – 2 мин, 95°C – 10 мин, 40 циклов: 95°C – 15 сек,
38
60°C – 1 мин. ПЦР в реальном времени осуществляли на приборе StepOne™
Real-Time PCR System (Applied Biosystems, США). Исходя из полученных
значений порогового цикла Ct для образца TSPO и внутреннего контроля βактина, рассчитывали их разность ΔCt. Далее определяли разность между ΔCt
опытного образца, после инкубации с пероксидом водорода, и контрольного
образца, инкубируемого без добавления пероксида водорода – значение
ΔΔCt. И наконец, рассчитывали относительное количество TSPO (RQ) опытных образцов по формуле:
RQ = 2(-ΔΔCt)
Полученное значение RQ отражает уровень экспрессии мРНК TSPO в
клетках с пероксидом водорода относительно уровня в контрольной культуре, без пероксида водорода. Таким образом, уровень экспрессии в клетках
контрольной группы приравнивается к 1.
2.5
Биохимические методы исследования
2.5.1 Измерение активности антиоксидантных ферментов
На первом этапе работы измерение активности каталазы производили в
эритроцитах 20 условно здоровых людей с определенными вариантами полиморфизма С-262Т в промоторной части гена каталазы. 13 человек из них
имели генотип С/С по полиморфизму CAT C-262T, и 7 человек были носителями мутантного аллеля Т в гомо- или гетерозиготном состоянии (3 человека
с вариантом С/Т и 4 человека с вариантом Т/Т). Измерение осуществляли фотометрическим методом на спектрофотометре СФ-46 (ЛОМО, Россия).
Для определения уровня активности использовалась методика, предложенная Королюком М.А. и др. (1988). К 2 мл 0,03% раствора пероксида водорода приливалось 10 мкл клеточного гемолизата лейкоцитов, разведенных
в 50 раз. После инкубации при комнатной температуре в течение 10 мин к
смеси приливали 1 мл 4% раствора молибдата аммония, после чего измеряли
цветность раствора при длине волны 400 нм. В качестве раствора сравнения
39
использовали раствор пероксида водорода с молибдатом аммония в той же
пропорции, но без добавления клеточного образца.
Расчет активности осуществляли по формуле:
A = (Σхп – Σоп)/k (мМ-1·см-1) · t (мин) · V (л) · Hb (г/л),
где A – активность каталазы, Σхп – экстинкция холостой пробы, Σоп –
экстинкция опытной пробы, k – коэффициент экстинкции пероксида водорода, равный 2,22 · 103 (мМ-1·см-1), t – время реакции в минутах, V – объем вносимой пробы в литрах, Hb – концентрация гемоглобина во вносимой пробе в
граммах на литр.
Полученное значение активности отражало число миллимолей пероксида водорода, разрушенных каталазой за 1 минуту в пересчете на 1 г гемоглобина.
На втором этапе работы производили определение уровня активности
ферментов окислительного стресса в культуре лейкоцитов после индукции
окислительного стресса пероксидом водорода. Использовалась та же методика (Королюк М.А. и др., 1988). При этом в качестве образца использовали
осадок мононуклеарных лейкоцитов, ресуспендированный в 100 мкл дистиллированной
воды,
после
разрушения
клеток
методом
заморажива-
ния/оттаивания. Объем вносимой пробы – гемолизата мононуклеарных лейкоцитов – составлял 0,1 мл. Для расчетов и статистической обработки использовали относительные значения активности каталазы по сравнению с активностью в культуре, не подвергшейся окислительному стрессу (0 мкмоль/л
H2O2, Аконтр) для каждого образца.
Aотн = Aэксп/Aконтр
= ((Σхп – Σоп)/k · t · V)эксп/((Σхп – Σоп)/k · t · V)контр
При анализе этого отношения мы получаем в числителе и знаменателе
равные значения k (2,22 · 103 мМ-1·см-1), t (10 мин) и V (10-4 л). В результате
сокращения равных значений расчетная формула приобрела вид:
40
Aотн = (Σхп – Σоп)эксп/ (Σхп – Σоп)контр,
где (Σхп – Σоп)эксп – разность экстинкций холостой и опытной пробы для
экспериментального образца, а (Σхп – Σоп)контр – то же самое для контрольного
образца.
2.6
Статистическая обработка результатов
Для статистического расчета соответствия распределения генотипов
каталазы по закону Харди-Вайнберга использовали программное обеспечение MS Excel 2007 (Microsoft). Достоверность p рассчитывали при помощи
программного обеспечения WolframAlpha. Относительные шансы развития
меланомы кожи и плоскоклеточного рака кожи рассчитывали как отношение
содержания мутантного (Т) и немутантного (С) аллелей в образцах новообразований кожи по сравнению с таковым в контрольной популяции:
OR = (q(опухолей) / p(опухолей)) / (q(здоровых) / p(здоровых)),
где q – частота мутантного аллеля Т, а p – частота дикого аллеля С.
Для оценки относительных шансов (Odds ratio, OR) и 95% доверительного интервала (Confidence Interval, CI) использовали программу GraphPad
InStat v3.10.
Результаты исследований активности каталазы, а также данные оценки
выраженности апоптоза и уровня мРНК белка-транслокатора оценивали по
непараметрическому критерию Крускала-Уоллиса с использованием программы Statistica 6.0. Результаты этих исследований представлены на рис. 5 –
16. Графики и гистограммы представлены в виде медианных значений с
верхними и нижними квартилями. Достоверность различий в доле живых
клеток в образцах мононуклеарных лейкоцитов с вариантом полиморфизма
-262СС в промоторной части гена каталазы и клетках меланомы линии Bro
при равных концентрациях пероксида водорода осуществляли по Uкритерию Манна-Уитни.
41
Схема дизайна эксперимента
42
Схема дизайна эксперимента (продолжение)
43
Глава 3.
РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1
Формирование групп нормальных клеток
с различной активностью каталазы
Выявление клеток с различным уровнем активности каталазы представляет некоторые затруднения в силу отсутствия явного фенотипического
проявления сниженной активности каталазы. Более того, существуют данные
о том, что даже почти полное отсутствие активности каталазы – акаталазия –
может не иметь у человека явных фенотипических проявлений в нормальных
условиях (Казимирко В.К., Мальцев В.И., 2004; Ogata M., 1991). По этой
причине для формирования групп с различным уровнем активности данного
фермента мы воспользовались данными исследований ученых, показавших,
что достоверное снижение активности каталазы в клетке возникает в результате присутствия в ДНК, в промоторной части кодирующего ее гена (CAT)
однонуклеотидной замены С-262Т.
Таким образом, первым этапом работы стало определение варианта полиморфизма С-262Т гена CAT в мононуклеарных лейкоцитах здоровых добровольных доноров, у которых на момент исследования не было выявлено
заболеваний, связанных с действием окислительного стресса (таких как сахарный диабет, атеросклероз). Данное условие было важным для минимизации дополнительных факторов, способных отразиться на реакции клетки на
окислительный стресс.
3.1.1 Распределение полиморфизма С-262Т гена CAT
в мононуклеарных лейкоцитах
Определяли вариант полиморфизма гена каталазы в ДНК, полученной
из лейкоцитов венозной крови условно здоровых людей, методом ПДРФанализа. Обследовано 103 человека, из них 82 женщины и 21 мужчина. Мутация была выявлена в 32 случаях из 103 (31%), причем 6 образцов (6%) показали наличие мутации в обоих аллелях гена, а 26 образцов (25%) подверг-
44
лись рестрикции наполовину, показав наличие трех полос в геле: 190 п.н.,
157 п.н. и 33 п.н., и тем самым выявляя гетерозиготность по данной мутации.
71 образец (69%) венозной крови не содержал мутацию и полностью разрезался рестриктазой (рис. 5).
Рис. 5. Электрофорез ДНК-фрагментов гена каталазы после рестрикции эндонуклеазой
EcoR V. 1, 8 – маркерная ДНК 100bp Ladder (Медиген, Россия); 2, 5, 6, 7 – фрагмент гена
с вариантом С/С; 3 – частично разрезанный фрагмент гетерозиготного мутанта С/Т; 4
– ампликон мутанта Т/Т (слева и справа указаны размеры фрагментов, п.н.).
Таким образом, частоты генотипов для полиморфизма С-262Т гена каталазы распределились следующим образом: СС – 0,69; СТ – 0,25; ТТ – 0,06.
Полученное распределение частот генотипов соответствует равновесию Харди-Вайнберга при χ2 = 2,67 и достоверности p = 0,10 (табл. 1).
Распределение частот аллелей в исследуемой группе составило 0,82
для аллеля С и 0,18 для мутантного аллеля Т.
Таблица 1. Частота генотипов и аллелей полиморфизма С-262Т гена каталазы в группе здоровых добровольцев.
генотип
число
частота
аллель
С/С
С/Т
Т/Т
С
Т
71
26
6
168
38
0,69
0,25
0,06
0,82
0,18
χ2
p
2,67
0,10
45
При разделении по гендерному признаку мы не наблюдали различий в
распределении частот аллелей среди женщин и мужчин. Для первых оно составило 0,81 для дикого аллеля С и 0,19 для аллеля Т. Среди мужчин аллель
С встречался с частотой 0,83, а аллель Т с частотой 0,17. В нашем исследовании все образцы с генотипом ТТ были выявлены среди лиц женского пола,
тогда как среди мужчин мутантных гомозигот обнаружено не было. Однако,
учитывая небольшую выборку мужчин, это было близко к ожидаемому числу
гомозигот – 1,26. При сравнении полученного распределения генотипов в
мужской группе с общим распределением мы не получили достоверных отличий: значение критерия Пирсона χ2 составило 1,86, p = 0,17.
3.1.2 Определение активности каталазы в эритроцитах людей
с различными вариантами полиморфизма С-262Т гена каталазы
Мембрана эритроцитов рассматривается как модельный индикатор
воздействия на организм неблагоприятных факторов, в том числе свободных
радикалов (Кашулина А.П., 2011). Высокое содержание в клетках кислорода
способствует образованию большого количества активных форм (Северин
Е.С., 2009). Для защиты от окислительного стресса эритроциты содержат
большой спектр антиоксидантных ферментов, одним из важнейших среди
которых является каталаза. Она обнаруживается в них как в свободном, так и
в мембранно-связанном состоянии и позволяет оценивать общее состояние
антиперекисной защиты организма (Кашулина А.П., 2011). Поэтому для
оценки взаимосвязи между вариантом полиморфизма С-262Т гена каталазы и
активностью данного фермента были выбраны эритроциты.
Для исследования активности ферментов утилизации пероксида водорода были использованы эритроциты 20 условно здоровых людей из числа
участвовавших в определении генотипа.
В результате измерения было отмечено достоверное снижение активности каталазы в образцах, содержащих замену -262С>Т, как в одном, так и в
двух аллелях гена по сравнению с диким вариантом -262СС. В образце с ге-
46
терозиготным вариантом СТ активность фермента снизилась на 13% и составила 0,58 ммоль/г белка·мин по сравнению с 0,66 ммоль/г·мин в образце СС
(p = 0,035). Аналогичное снижение было отмечено в образце с мутацией в
обоих аллелях гена -262ТТ – 0,58 ммоль/г·мин (p = 0,016) (рис. 5).
Рис. 5. Активность каталазы в эритроцитах людей с различными вариантами полиморфизма С-262Т гена каталазы. Данные представлены в виде медианных значений и верхних
и нижних квартилей. Звездочками отмечены достоверные различающиеся данные по критерию Крускала-Уоллиса при p < 0,05.
Таким образом, были сформированы группы с четким различием по активности каталазы. Согласно результатам исследований, фенотипически генотипы каталазы -262ТТ и -262СТ могут иметь различные проявления в виде
изменения рисков развития тех или иных заболеваний (Tefik T. et al., 2013;
Khodayari S. et al., 2013). Поэтому, несмотря на близость значений активности каталазы, для дальнейшего исследования были оставлены все три группы
клеток, разделенных по варианту полиморфизма.
3.2
Сравнение распределения полиморфизма С-262Т гена каталазы
в здоровых и опухолевых клетках
Развитие патологических процессов в опухолевых клетках зачастую
связано с большим количеством ошибок и мутаций в ДНК. На следующем
этапе работы была исследована возможность изменения распределения по-
47
лиморфизма С-262Т в промоторной части гена каталазы в клетках меланомы
кожи и плоскоклеточного рака кожи по сравнению со здоровой группой для
выявления возможных изменений в работе каталазы.
Для исследования были использованы 50 образцов меланомы кожи и
50 образцов плоскоклеточного рака кожи, а также контрольная группа, представленная лейкоцитами 103 здоровых добровольцев. Для исследования использовали ПДРФ-анализ.
Анализ ДНК образцов меланомы и плоскоклеточного рака показал постоянное присутствие полос ДНК, не подвергшихся рестрикции ферментом
EcoR V, почти во всех образцах (рис. 6), однако относительная концентрация
этих фрагментов не превышала 30% от суммарного количества ДНКфрагментов в образце, что исключало возможность гетерозиготности всего
образца. Присутствие данных полос можно объяснить гетерогенностью генома опухолевой ткани.
Рис. 6. Электрофорез ДНК-фрагментов гена каталазы, полученных из образцов плоскоклеточного рака, после рестрикции ферментом EcoR V. 1 – маркерная ДНК 100bp Ladder;
2-6 – образцы плоскоклеточного рака после рестрикции: на каждой из дорожек присутствуют полосы неразрезанной ДНК различной интенсивности; 7 – контрольный образец
ДНК полностью разрезался рестриктазой; 8 – контрольный образец, не подвергавшийся
рестрикции (амплификат).
При этом, поскольку особенностью рестриктазы было разрезание ДНК
именно по дикому варианту последовательности, можно заключить, что
48
большая часть опухолевых клеток обладала диким вариантом полиморфизма
– -262СС. Это может быть следствием как исходно дикого варианта полиморфизма пациента, так и показателем того, что в процессе развития опухоли
направленно или случайно возникли клетки с вариантом -262СС, которые в
дальнейшем показывали более интенсивный рост, чем клетки с мутацией в
одном или обоих аллелях гена.
Исходя из данных предположений, образцы, содержащие лишь малую
долю ДНК, не подвергшейся рестрикции, рассматривались как образцы дикого типа (САТ -262СС).
При исследовании полиморфизма в клетках меланомы кожи генотипы
-262СТ и ТТ не были выявлены ни в одном из образцов. Частота аллеля С составила 1,0.
При анализе полиморфизма гена каталазы в клетках меланомы клеточной линии BRO было обнаружено, что меланома BRO не содержит мутации
-262С>T в промоторной области каталазы, то есть является носителем дикого
варианта полиморфизма (вариант генотипа СС) (рис. 7).
Рис. 7. Электрофорез ДНК-фрагментов гена каталазы в клетках меланомы линии BRO после рестрикции эндонуклеазой EcoR V. 1 – маркерная ДНК 100bp Ladder (Медиген, Россия); 2 – образец с вариантом генотипа -262СТ; 3 – образец с вариантом генотипа 262СС; 4 – образец ДНК меланомы клеточной линии BRO.
49
Исследования ДНК образцов плоскоклеточного рака показали наличие
мутации в гетерозиготном состоянии (СТ) в 5 случаях из 50 (частота генотипа p = 0,10). Гомозиготный мутантный вариант ТТ выявлен не был. Остальные 47 образцов (p = 0,95) не содержали мутантного аллеля. Частота аллеля Т
в тканях плоскоклеточного рака составила 0,05.
Отношение шансов развития меланомы кожи OR в исследуемых группах составило 0,022 при 95% достоверном интервале 0,001 – 0,36 и достоверности p<1·10-4. Для плоскоклеточного рака данный показатель был равен 0,24
(95% достоверный интервал 0,09 – 0,67, p = 6,7·10-3) (см. табл. 1). Таким образом, у людей с генотипами -262СТ и -262ТТ шанс развития меланомы кожи
в 45,5 раз ниже, а шанс развития плоскоклеточного рака кожи в 4,2 раза ниже, чем у людей с диким вариантом -262СС (табл. 2).
Таблица 2. Распределение полиморфизма С-262Т гена каталазы в опухолевых клетках ткани меланомы кожи и плоскоклеточного рака кожи
Группа здоровых людей
OR,
генотип
частота
(95% ДИ)
аллель
С/С
С/Т
Т/Т
С
Т
0,69
0,25
0,06
0,82
0,18
p
Образцы меланомы кожи
генотип
аллель
0,022
С/С
С/Т
Т/Т
С
Т
(0,001 –
число
50
0
0
100
0
0,36)
частота
1
0
0
1
0
<1,000·10-4
Образцы плоскоклеточного рака кожи
генотип
число
частота
аллель
0,24
С/С
С/Т
Т/Т
С
Т
(0,09 –
45
5
0
95
5
0,67)
0,90
0,10
0
0,95
0,05
6,7·10-3
50
3.3
Определение активности каталазы в лейкоцитах периферической
крови в состоянии окислительного стресса
В состоянии окислительного стресса под действием пероксида водоро-
да каталаза играет ключевую защитную роль (Чеснокова Н.П. и др., 2006б;
Mueller S. et al., 1997).
Окислительный стресс был индуцирован в мононуклеарных лейкоцитах 9 лиц с различными уровнями активности каталазы добавлением пероксида водорода в культуру до конечных концентраций 400, 700 и 1000
мкмоль/л. Через 1 ч после индукции определяли активность каталазы в клеточной культуре. Выбранное время позволяло обнаружить быстрые изменения в активности каталазы в условиях окислительного стресса.
При этом мы опирались на данные исследований, показавших, что цитотоксический эффект пероксида водорода на клетки глиомы зависит от его
концентрации в культуре клеток и времени инкубации: увеличение концентрации приводит к снижению времени достижения равного цитотоксического эффекта (Gülden M. et al., 2010). На основе данных этого исследования выбранные нами концентрации были признаны достаточно высокими для проявления эффекта цитотоксичности пероксида водорода на клетки в течение 1
ч (рис. 8).
Несмотря на кажущуюся тенденцию, статистически значимой корреляции между концентрацией пероксида водорода в культуральной среде и изменением активности каталазы в мононуклеарных лейкоцитах ни для одной
из групп СС, СТ и ТТ обнаружено не было. Значение критерия КрускалаУоллиса составило: для группы СС – H = 7,15 (p = 0,067), для группы СТ – H
= 5,43 (p = 0,143) и для группы ТТ – H = 2,94 (p = 0,401).
При сравнении по критерию Крускала-Уоллиса образцов с различными
вариантами полиморфизма при равных концентрациях H2O2 в культуральной
среде достоверных различий в относительном значении активности каталазы
при p < 0,05 также выявлено не было.
51
Рис. 8. Зависимость активности каталазы в мононуклеарных лейкоцитах от концентрации
пероксида водорода в культуральной среде. Значение активности каталазы в культуре без
пероксида водорода принято за единицу.
При оценке активности каталазы в клетках меланомы клеточной линии
BRO достоверных изменений в активности каталазы при инкубации в присутствии пероксида водорода в различных концентрациях также не наблюдалось (рис. 9). Значение относительной активности фермента колебалось около контрольного (H = 1,17, p = 0,760).
Значение H-критерия для трех групп при 400 мкмоль/л H2O2 составило
3,82 (p = 0,15), при 700 мкмоль/л H2O2 – 5,42 (p = 0,07), при 1000 мкмоль/л
H2O2 – 5,60 (p = 0,06).
3.1 Оценка выраженности апоптоза клеток
при индукции окислительного стресса
Возможное изменение в работе антиоксидантных ферментов в состоянии длительного окислительного стресса предполагает изменения в поведении и судьбе клеток, подверженных стрессу.
52
Относительная активность
каталазы, отн. ед
1,30
1,20
1,10
1,00
0,90
0,80
0,70
0,60
0,50
0
200
400
600
[H2O2], мкмоль/л
800
1000
Рис. 9. Зависимость активности каталазы в клетках меланомы клеточной линиии BRO от
концентрации пероксида водорода в культуральной среде. Значение активности каталазы
в культуре без пероксида водорода принято за единицу.
Окраска клеток смесью акридинового оранжевого и бромистого этидия
позволила довольно четко разделить живые, апоптотические и некротические
клетки. При этом живые лейкоциты имели вид ровных клеток округлой формы, имеющих относительно равномерное окрашивание внутреннего содержимого в зеленый цвет (рис. 10, А). На стадии раннего апоптоза клеточное
ядро приобретало неправильную форму, внутреннее содержимое ядра и
клетки в целом конденсировалось, окрашиваясь более интенсивно, чем
остальная часть клетки. За счет выпячиваний цитоплазмы, контур клетки
становился неровным и размытым (рис. 10, Б).
На более поздних стадиях в клетках была заметна фрагментация ядра,
проявляющаяся в виде скопления нескольких ярко-зеленых округлых образований внутри цитоплазмы одной клетки (рис. 10, В). Сама цитоплазма при
этом имела гораздо более слабое окрашивание в зеленый либо оранжевый
цвет. Клетки, близкие к завершению апоптоза, имели вид скоплений мелких
53
округлых апоптотических телец (рис. 10, Г). Некротические клетки окрашивались в красно-оранжевый цвет, контрастируя с живыми и апоптотическими
клетками (рис. 10, Д).
Несмотря на возможность наблюдать различные стадии апоптоза, провести четкую границу между ними представлялось затруднительным. Значительная часть апоптотических клеток находилась в относительно более ранней стадии апоптоза (конденсированное, иногда частично фрагментированное ядро, «вздутия» цитоплазмы). В то же время клетки на этапе позднего
апоптоза с полной фрагментацией цитоплазмы встречались крайне редко либо не могли быть подсчитаны. Поэтому при статистической обработке учитывали общее число клеток в состоянии апоптоза, вне зависимости от стадии.
При анализе полученных данных была отмечена тенденция к постепенному снижению числа живых клеток в культуре мононуклеарных лейкоцитов с нормальной активностью каталазы – группа СС – с ростом концентрации пероксида водорода в культуре (p = 0,016). При 1000 мкмоль/л H2O2
процент живых клеток достоверно снизился с 95,9 до 62,33% (р = 0,013). Параллельно росло число апоптотических клеток, достигнув в образце с 1000
мкмоль/л H2O2 23,08% (p = 0,013), и некротических клеток – 13,55% в образце с 1000 мкмоль/л H2O2 (p = 0,039) (рис. 11, СС).
В культурах клеток группы СТ число живых клеток при концентрации
пероксида водорода 1000 мкмоль/л снизилось с 95,05 до 54,81% (p = 0,013), а
число апоптотических клеток выросло с 4,15 до 31,11% (p = 0,013). Число
некротических клеток также возросло и составило 15,19% в образцах с 1000
мкмоль/л H2O2 (p = 0,013).
В случае с гомозиготным вариантом ТТ доля живых клеток при 1000
мкмоль/л H2O2 составила 42,64% (p = 0,019), однако при этом было отмечено
достоверное увеличение числа не апоптотических, а некротических клеток
(18,85%; p = 0,013). Гистограммы медианных значений данных с верхними и
нижними квартилями представлены на рис. 11.
К
Н
54
НК
Рис. 10. Мононуклеарные лейкоциты при окраске акридиновым оранжевым/бромистым
этидием. А – живые клетки имеют четкий контур, округлую форму и равномерное окрашивание в зеленый цвет; Б – клетки в состоянии раннего апоптоза отличаются конденсированным содержимым и нечетким контуром; В – клетки на более поздних этапах
апоптоза: клеточное ядро претерпевает фрагментацию; Г – завершающий этап
апоптоза – клетка полностью фрагментируется, приобретая вид скопления мелких образований; Д – некротическая клетка (НК) окрашивается в красно-оранжевый цвет.
При сравнении групп с различными уровнями активности каталазы,
обусловленными полиморфизмом С-262Т, при равных концентрациях пероксида водорода по непараметрическому критерию Крускала-Уоллиса, было
55
выявлено отсутствие достоверных различий в жизнеспособности клеток при
отсутствии окислительного стресса (табл. 3). При добавлении в культуры пероксида водорода до конечной концентрации 400 мкмоль/л отмечали повышенное содержание некротических клеток в образце -262ТТ относительно
дикого варианта (p = 0,034). В то же время достоверных различий в долях
живых и апоптотических клеток отмечено не было.
При увеличении концентрации пероксида водорода до 700 мкмоль/л
наблюдали статистически значимые расхождения в долях живых и апоптотических клеток между вариантами полиморфизма -262СС и -262ТТ: процент
живых клеток в мутантном варианте составил 54,44%, что достоверно ниже,
чем в диком варианте (p = 0,022), где жизнеспособность сохранили 69,53%
клеток. Уменьшение доли живых клеток в культуре с вариантом полиморфизма ТТ происходило за счет повышения доли апоптотических клеток:
34,44% по сравнению с 17,19% в образцах СС (p = 0,022).
Подобное расхождение сохранилось и при максимальной из создаваемых концентраций пероксида водорода в культуральной среде – 1000
мкмоль/л. Доля живых клеток в образцах с вариантом -262ТТ при этой концентрации H2O2 составила 42,64%, что достоверно ниже, чем в образцах
-262СС – 62,33% (p = 0,022), а доля апоптотических клеток (36,43%) была
значимо выше таковой для дикого варианта (23,08%) (p = 0,034).
Следует отметить, что при анализе данных, характеризующих доли
живых, апоптотических и некротических клеток, в гетерозиготном образце
-262СТ статистически значимых расхождений в выраженности апоптоза мононуклеарных лейкоцитов по сравнению с образцами СС и ТТ выявлено не
было.
Клетки меланомы являются, по сути, меланоцитами, поэтому способны
обладать повышенной устойчивостью к окислительному стрессу.
Таким образом, ожидаемо, что меланома клеточной линии BRO будет
обладать хорошей выживаемостью в присутствии пероксида водорода.
56
Рис. 11. Сравнительное распределение долей живых, апоптотических и некротических
клеток в культурах мононуклеарных лейкоцитов с различными вариантами полиморфизма
С-262Т гена каталазы в зависимости от концентрации пероксида водорода в культуре.
Звездочкой обозначены достоверные различия при p < 0,05.
57
Таблица 3. Жизнеспособность мононуклеарных лейкоцитов с различными
вариантами полиморфизма С-262Т гена каталазы в присутствии в культуре
пероксида водорода в различных концентрациях
Вариант генотипа
СС
СТ
ТТ
p для достоверно различающихся значений
[H2O2] = 0 мкмоль/л
Доля живых клеток,
% (min-max)
95,90
(93,50 - 96,75)
95,05
(93,08 - 95,58)
94,59
(94,00 - 95,05)
-
Доля апоптотических клеток, % (minmax)
2,46
(2,44 - 4,72)
4,15
(3,96 – 4,62)
3,60
(2,86 - 5,00)
-
Доля некротических
клеток, % (min-max)
1,64
(0,81 – 1,78)
0,99
(0,27 – 2,31)
1,80
(1,00 - 2,09)
-
[H2O2] = 400 мкмоль/л
Доля живых клеток,
% (min-max)
86,39
(84,62 - 89,76)
79,33
(78,30 – 87,12)
59,09
(57,15 – 61,76)
Доля апоптотических клеток, % (minmax)
11,19
(7,09 - 11,96)
12,75
(9,20 - 16,98)
29,09
(23,53 - 30,30)
-
Доля некротических
клеток, % (min-max)
3,15
(1,65 – 4,20)1
4,72
(3,68 – 7,92)
13,76
(10,61 - 14,71)1
0,0341
-
[H2O2] = 700 мкмоль/л
Доля живых клеток,
% (min-max)
69,53
(68,35 –
75,85)2
65,71
(63,86 - 65,77)
54,44
(44,89 –
55,26)2
0,0222
Доля апоптотических клеток, % (minmax)
17,19
(15,56 - 17,72)3
25,41
(20,95 - 25,50)
34,44
(28,95 - 38,78)3
0,0223
Доля некротических
клеток, % (min-max)
13,28
(8,59 – 13,92)
10,73
(8,72 - 13,33)
15,79
(11,12 – 16,33)
-
42,64
(42,62 - 48,86)4
0,0224
[H2O2] = 1000 мкмоль/л
Доля живых клеток,
% (min-max)
Доля апоптотических клеток, % (minmax)
Доля некротичесикх
клеток, % (min-max)
62,33
(59,23 - 66,14)4
54,81
(50,59 - 56,82)
23,08
(20,47 - 24,12)5
31,11
(25,76 - 34,22)
13,55
(13,39 - 17,69)
15,19
(14,07 - 17,42)
36,43
(33,12 –
38,52)5
18,85
(18,01 – 20,93)
0,0345
-
Примечание. 1-5 - статистически значимые различия при множественном сравнении по
критерию Крускала-Уоллиса.
58
После инкубации клеток с 400, 700 и 1000 мкмоль/л пероксида водорода и окраски акридиновым оранжевым/бромистым этидием в культуре меланомы линии BRO был отмечен небольшой рост числа клеток с признаками
апоптотической гибели. При этом живая клетка меланомы BRO под флуоресцентным микроскопом имела вид крупной округлой клетки зеленого цвета с четким шероховатым краем и относительно равномерно окрашенной
зернистой цитоплазмой (рис. 12, А).
В апоптотической клетке ядро приобретало яркий желто-оранжевый
цвет, выделяющий его на фоне желтовато-зеленой цитоплазмы (рис. 12, Б),
иногда отмечалась его фрагментация. Некротические клетки встречались в
культуре очень редко и имели разные размеры, зачастую неправильную форму и красно-оранжевую окраску (рис. 12, В).
Рис. 12. Меланомные клетки линии Bro при окраске акридиновым оранжевым/бромистым
этидием. А — живая клетка; Б — клетка в состоянии апоптоза; В — некротическая
клетка.
59
При оценке доли живых, апоптотических и некротических клеток в
культурах с различной концентрацией пероксида водорода была выявлена
достаточно высокая жизнеспособность клеток меланомы под воздействием
пероксида водорода. Достоверное снижение числа живых клеток по сравнению с культурой без добавления H2O2 наблюдалось только при концентрации
последнего 1000 мкмоль/л, однако даже при этой концентрации выживаемость клеток меланомы составила 79,81 % (p = 0,019).
Число апоптотических клеток соответственно достоверно возросло и
составило 17,65 % (p = 0,019). Доля некротических клеток при этом значимо
не изменялась (рис. 13). Следует также отметить, что доля живых клеток меланомы Bro была достоверно выше таковой для мононуклеарных лейкоцитов
с аналогичным вариантом генотипа гена каталазы – -262СС (сравнение по
критерию Манна-Уитни, p = 0,049 для каждой пары показателей).
Рис. 13. Сравнительное распределение долей живых, апоптотических и некротических
клеток в культуре меланомы Bro в зависимости от концентрации пероксида водорода в
культуре.
Звездочкой обозначены достоверные различия при p < 0,05.
60
3.2 Определение уровня экспрессии белка-транслокатора (TSPO)
в лейкоцитах при индукции окислительного стресса в клетках
в зависимости от полиморфизма С-262Т гена каталазы
TSPO рассматривается как маркерный белок митохондриального сигнального пути апоптоза (Corsi L. et al., 2008, Xiaolong Q. et al., 2012). Поэтому определение уровня TSPO в лейкоцитах с различными вариантами полиморфизма в условиях окислительного стресса вызывает большой интерес.
В нашем исследовании наблюдалось отсутствие корреляции между вариантом полиморфизма C-262T в промоторной части гена каталазы и уровнем TSPO для всех исследуемых образцов. Более того, данные об изменении
уровня мРНК белка-транслокатора относительно такового β-актина были индивидуальными для каждого из 9 исследуемых лиц и не поддавались единому объяснению. Для многих образцов был отмечен значимый дозозависимый
эффект концентрации пероксида водорода на уровень экспрессии TSPO.
На рис. 14 в качестве примера приведены графики зависимости относительного количества мРНК TSPO (RQ) для трех исследуемых лиц с полиморфизмом -262СТ. Измерения проведены в 4 повторах, данные представлены в виде медианных значений и верхнего и нижнего квартилей. В образце
CT1 отмечалось достоверное повышение относительного количества TSPO
после инкубации с 700 мкмоль/л пероксидом водорода по сравнению с контролем (p = 0,018). При повышении концентрации пероксида водорода до
1000 мкмоль/л относительное количество TSPO снова резко снижалось (p =
0,018) (см. рис. 14, график CT1).
В образце CT2 также наблюдалось изменение относительного количества TSPO в присутствии 700 мкмоль/л пероксида водорода, однако, в этом
случае, мы отмечали не повышение, а снижение уровня экспрессии данного
белка (p = 0,023). При 1000 мкмоль/л H2O2 значимых различий с контролем
не отмечалось. В образце CT3 статистически значимое повышение относительного количества TSPO наблюдалось именно при максимальной из представленных концентраций пероксида водорода – 1000 мкмоль/л (p = 0,031).
61
Рис. 14. Относительное количество мРНК TSPO к β-актину (RQ) в трех образцах мононуклеарных лейкоцитов с вариантом -262СТ гена каталазы в зависимости от концентрации пероксида водорода в культуре.
Цифрами 1 – 5 отмечены значения, имеющие достоверные различия при p < 0,05.
Рис. 15. Относительное количество мРНК TSPO к β-актину (RQ) в культурах мононуклеарных лейкоцитов с различными вариантами полиморфизма С-262Т гена каталазы в зависимости от концентрации пероксида водорода в культуре.
62
При статистической обработке данных по группам с различными вариантами полиморфизма С-262Т получены медианные значения, не имеющие
достоверных различий ни при изменении концентрации пероксида водорода,
ни между вариантами полиморфизма для каждой концентрации (рис. 15).
63
Глава 4.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Влияние мутации С-262Т в промоторной части гена каталазы на изменение активности данного фермента неоднократно подтверждалось исследованиями ученых и подробно обсуждалось и их исследованиях (Forsberg L. et
al., 2001; Nadif R. et al., 2005; Bastaki M. et al., 2006; Ahn J. et al., 2006). С одной стороны, было показано, что данная мутация снижает активность каталазы, с другой – приводит к повышению уровня самой каталазы в эритроцитах,
предположительно за счет повышения транскрипционной активности мутантного гена каталазы (Forsberg L. et al., 2001).
Полученные нами данные активности каталазы в эритроцитах согласуются с результатами зарубежных исследователей: активность каталазы в
клетках с генотипами СС и СТ достоверно ниже таковой в клетках с диким
вариантом генотипа – СС. Таким образом, метод использования полиморфизма каталазы для разделения образцов на группы по активности оказался
успешным. В результате этого было получено три группы с двумя достоверно различными уровнями активности каталазы. Однако, опираясь на исследования, связанные с влиянием изменений в гене каталазы на риски развития
заболеваний, обнаружено, что, несмотря на снижение активности фермента в
случаях как с гомозиготной мутацией -262ТТ, так и с гетерозиготной мутацией -262СТ в гене CAT, достоверные изменения в рисках развития связанных с ней заболеваний отмечаются лишь для мутации в двух аллелях гена.
Гетерозиготная мутация -262СТ рассматривается скорее как промежуточный вариант между исходным диким и гомозиготным мутантным вариантами. В работе Forsberg L. et al. (2001), оценивших не только активность каталазы, но и изменение уровня транскрипционной активности гена при наличии мутации, было показано, что при наличии варианта -262СТ гена каталазы
уровень этого фермента в крови выше, чем при диком варианте -262СС, но
ниже гомозиготного мутантного варианта -262ТТ. Все эти данные позволили
64
нам предположить, что функционирование каталазы, определяемое гетерозиготной мутацией С-262Т в промоторной части гена CAT может быть отличным от такового каталазы гомозиготного мутанта -262ТТ. Поэтому в дальнейшем исследовании осуществлялся анализ всех трех групп образцов, которые были обозначены в соответствии с вариантом полиморфизма гена каталазы в положении -262: СС, СТ и ТТ.
Определение активности каталазы в клетках опухолей может вызвать
затруднения по причине трудной доступности этого биологического материала для лабораторных исследований. Сохранение опухолевых тканей производится с применением формалиновой фиксации и заключения в парафиновый блок. В этом случае нельзя говорить об изучении живых процессов в
клетке, в том числе измерении активности белка. В этом случае определение
генотипа позволяет предположить уровень конститутивной активности фермента. Сравнение частот полиморфизма С-262Т, оказывающего влияние на
активность каталазы, в группах раковых и здоровых клеток позволит сделать
вывод об особенностях протекания процессов, связанных с данной мутацией,
и их участии в развитии заболевания.
Исследования распределения данного полиморфизма проводились неоднократно для ряда заболеваний, связанных с действием окислительного
стресса на клетку. При этом результаты исследований распределения полиморфизма С-262Т в гене каталазы среди пациентов давали различные ответы
о влиянии данной мутации на риск развития заболеваний, связанных с окислительным стрессом. Так, с одной стороны, отмечен эффект повышения риска развития таких заболеваний, как гипертензия (Mansego M.L. et al., 2011;
Hebert-Schuster M. et al., 2012), атеросклероз (Letonja M. et al., 2011), язвенный колит (Khodayari S. et al., 2013) и пр. при наличии гомозиготной мутации
С-262Т в гене САТ, снижающей ее активность. С другой стороны, существует множество доказательств отсутствия корреляции между полиморфизмом
С-262Т и развитием других заболеваний, также связанных с окислительным
65
стрессом: болезнь Альцгеймера (Goulas A. et al., 2002), псевдоксантома эластическая (Zarbock R. et al., 2007), рецидивирующие депрессивные расстройства (Galecki P. et al., 2009) и др.
Показано, что в целом полиморфизм каталазы С-262Т, а значит и ее
сниженная активность, не приводит к снижению средней продолжительности
жизни носителей мутации в популяции (Christiansen L. et al., 2004). Немного
позднее к аналогичному выводу пришли российские исследователи Паук
В.В. и др. (2008). Более того, они показали, что среди населения старческого
возраста (75 – 89 лет) носители мутации -262СТ встречаются чаще, чем среди
более молодого населения (21 – 55 лет) (Паук В. В., 2008).
Особое внимание уделяется окислительному стрессу в развитии злокачественных новообразований. В исследованиях взаимосвязи между генотипом каталазы и риском развития злокачественных новообразований также
встречаются различные результаты. С одной стороны, Ahn J. et al. (2005) было показано, что наличие генотипа -262ТТ в промоторной части гена каталазы повышает риск развития рака молочной железы. С другой стороны, гипотеза влияния полиморфизма каталазы на риск развития злокачественных образований не была подтверждена для рака простаты, что было описано в исследованиях Choi J.Y. et al. (2007): достоверного увеличения доли мутантных
аллелей среди пациентов с данным заболеванием по сравнению с контрольной группой выявлено не было.
Все эти выводы основаны на исследованиях распределения частот полиморфизма С-262Т среди пациентов с заболеваниями по сравнению с группой здоровых людей. И они предполагают влияние на развитие заболевание
изменений в работе каталазы, в том числе ее активности.
На основе этих исследований, была высказана гипотеза, что данные о
распределении полиморфизма С-262Т среди образцов меланомы кожи и плоскоклеточного рака кожи позволят предположить особенности работы каталазы в опухолевых клетках по сравнению со здоровыми.
66
Предполагалось, что кожа может обладать большей чувствительностью
к наличию мутации, чем молочная железа. Это основывалось на большей
подверженности кожи окислительному стрессу за счет воздействия на нее таких факторов как ультрафиолетовое облучение. Однако, вопреки предположению, мы получили полное отсутствие мутантного аллеля Т в клетках меланомы, незначительную его долю (0,05) в клетках плоскоклеточного рака.
Полученные отношения шансов развития меланомы кожи 0,022 и плоскоклеточного рака 0,24 дают основания заключить, что работа каталазы, обусловленная наличием мутантного аллеля в промоторной части гена CAT в положении -262, приводит к достоверному снижению эффективности развития
злокачественных новообразований кожи.
Если предположить, что меланома изначально возникла из клеток, обладающих диким вариантом полиморфизма -262СС, то, вероятно, в ходе ее
развития в клетках могли появляться спонтанные мутации, в том числе в положении -262 гена CAT, однако эти мутации не повышали, а возможно даже
снижали эффективность роста опухолевой ткани. О наличии таких мутаций в
части клеток говорит присутствие полос неразрезанной ДНК на электрофореграмме после рестрикции эндонуклеазой EcoR V.
Явление гетерогенности опухолевой ткани является общепризнанным
на сегодняшний день (Чехун В.Ф. и др., 2012; Геращенко Т.С. и др., 2013;
Marte В., 2013). В то же время нельзя исключить возможность возникновения
меланомы или плоскоклеточного рака из клеток, обладающих мутацией С262Т как в гомо-, так и в гетерозиготном состоянии. В этом случае, вероятно,
в процессе репликации ДНК могла возникнуть обратная мутация, приведшая
к возникновению варианта -262СС. В этом случае вновь возникшие клетки
обладали большей жизнеспособностью и развивались более интенсивно,
формируя большую часть опухолевой ткани.
Тогда исходные клетки, содержащие мутацию, остаются в ткани в относительно небольшом количестве, проявляясь при ПДРФ-анализе в виде той
67
же неразрезанной рестриктазой ДНК. Таким образом, следует предположить,
что развитие опухоли из клеток кожи у людей с генотипом СС в положении
-262 в промоторной части гена CAT будет протекать более эффективно, поскольку не требует дополнительного случайного события – обратной мутации. А наименьшая эффективность развития меланомы кожи и плоскоклеточного рака кожи возможна у людей с генотипом -262ТТ.
Статистический расчет относительных шансов развития меланомы кожи и плоскоклеточного рака кожи позволяет нам заключить, что у людей с
генотипом -262СС гена каталазы риск развития меланомы кожи превышает
таковой для лиц с генотипами -262СТ и -262ТТ в 45,5 раз, а риск развития
плоскоклеточного рака кожи – в 4,2 раза.
В поисках объяснения данному явлению следует обратить внимание на
работу Valko M. et al. (2007), в которой описано дозозависимое влияние интенсивности окислительного стресса на процессы мутагенеза, канцерогенеза
и апоптоза/некроза. Авторами показано, что для прогрессирования опухоли
достаточно небольшого окислительного стресса, тогда как слишком высокое
содержание активных форм кислорода приводит к ее некрозу или вступлению клеток в апоптоз (Valko M. et al., 2007).
Таким образом, для повышения жизнеспособности клеток опухоли
необходимо, чтобы концентрация активных форм кислорода в них поддерживалась на уровне, соответствующем небольшому смещению оксидантного
статуса в сторону окислительных реакций, и не допускалось его превышение.
Для клеток кожи и, соответственно, злокачественных новообразований кожи,
в частности, меланомы и плоскоклеточного рака кожи, это становится особенно актуальным. Индукция окислительного стресса невысокими концентрациями свободных радикалов в коже не представляет сложности из-за постоянной подверженности органа факторам окислительного стресса, таким
как ультрафиолетовое облучение.
В то же время эффективная работа системы антиоксидантной защиты
68
и, в частности, каталазы, становится более востребованной в условиях постоянного наличия активных форм кислорода. Таким образом, клетки с мутантным генотипом Т/Т в промоторной части гена каталазы в положении -262,
обладая меньшей активностью данного фермента, являются наименее устойчивыми к действию окислительного стресса. Можно предположить, что антиоксидантная защита в этом случае будет работать менее эффективно в
условиях окислительного стресса. В этом случае высокий уровень активных
форм кислорода спровоцирует переход клетки в состояние апоптоза.
В нашем последующем исследовании косвенным подтверждением
данной гипотезы стал тот факт, что клеточная линия меланомы Bro также не
является носителем мутации С-262Т ни в одном из аллелей гена каталазы.
Таким образом, преобладание дикого аллеля С в клетках меланомы
кожи и плоскоклеточного рака кожи возможно объяснить тем, что данные
виды новообразований кожи могут более эффективно развиваться из клеток,
обладающих более высокой активностью каталазы и способных более эффективно выживать в условиях окислительного стресса и поддерживать уровень активных форм кислорода выше физиологического.
Согласно многочисленным исследованиям, риск развития меланомы
кожи связан с фототипом кожи. Доказано, что люди с I и II фототипами кожи
по классификации Д.Фитцпатрика (люди с белой или светлой кожей, способной образовывать лишь незначительное количество пигмента под действием
солнечных лучей) (Фитцпатрик Д.Е., Элинг Д.Л., 1999) обладают повышенным риском развития меланомы кожи (Кудрявцев Д.В. и др., 2006).
Таким образом, опираясь на полученные результаты, можно предположить, что сниженная активность каталазы, обусловленная наличием мутантного аллеля Т в промоторной части гена CAT в положении -262, снижает
риск развития таких злокачественных новообразований кожи как меланома
кожи и плоскоклеточный рак кожи. Людям же, обладающим генотипом
-262СС, особенно со светлым типом кожи, с быстрым развитием ожогов по-
69
сле пребывания на солнце, следует избегать длительного воздействия на кожу факторов, индуцирующих окислительный стресс (в том числе ультрафиолетового облучения), поскольку данный фактор влияет на степень риска развития онкологических заболеваний кожи.
В завершение обсуждения распределений частот полиморфизма С262Т в нормальных и опухолевых клетках, следует проанализировать контрольную группу исследуемых лиц. Несмотря на то, что наличие мутации С262Т в промоторной части гена каталазы приводит к значимому изменению
активности и уровня экспрессии данного фермента, данная однонуклеотидная замена встречается в генотипах людей на различных территориях земного шара не так редко. Об этом свидетельствуют исследования, проводимые
учеными из различных регионов: Германии, Китая, Ирана, США, Египта и
других (Ahn J. et al., 2006; Zarbock R. et al., 2007; Mak J.C.W. et al., 2007; Jafari
M. et al., 2012; Ghaly M. S. et al., 2012; Tefik, T. et al., 2013).
В исследованной нами группе жителей Красноярского края частота генотипа -262ТТ совпала с таковой для популяции жителей Германии (размер
выборки – 117 человек), а частоты аллелей С и Т оказались равными частотам для популяции жителей Египта (размер выборки не указан). В популяции
жителей Китая отмечается отсутствие мутантного варианта генотипа -262ТТ,
что было отмечено и обсуждалось французскими учеными (Nadif R. et al.,
2005). Это позволило нам предположить, что в распределении частот полиморфизма С-262Т определенную роль могут играть скорее расовые особенности популяции, чем территориальные.
В целом, распределение полиморфизма гена каталазы в группе жителей
города Красноярска согласуется с распределением Харди-Вайнберга при χ2 =
2,67 и достоверности p = 0,10.
Несмотря на множество исследований взаимосвязи полиморфизма С262Т с риском развития заболеваний, это дает не так много информации для
понимания каждого конкретного случая и каждого человека в отдельности.
70
Статистические расчеты не дают ответ на вопрос конкретного человека: «Что
конкретно для меня означает наличие мутантного аллеля?». Именно такие
вопросы возникали почти у каждого из обследованных добровольцев. И для
ответа на эти вопросы более важным является понимание процессов в клетке,
измененных вследствие мутации и приведших к повышению риска развития
заболевания. Повышенный риск еще не означает обязательное возникновение патологии. В этой связи, изучение особенностей работы ферментов в
клетке, возможно, позволит предотвратить заболевание путем направленной
профилактики с учетом молекулярно-генетических особенностей организма.
При рассмотрении исследуемой нами группы условно здоровых людей,
отмечалось, что носители гомозиготной мутации фенотипически не обнаруживают особенностей, связанных со снижением активности каталазы. Объяснением этому может служить тот факт, что в физиологическом состоянии
организма основным ферментом, метаболизирующим пероксид водорода, является не каталаза, а глутатионпероксидаза, обладающая большим сродством
к субстрату (H2O2), чем каталаза (Чеснокова Н.П. и др., 2006б).
Таким образом, при отсутствии внешних источников пероксида водорода, его утилизация осуществляется большей частью не каталазой, а глутатионпероксидазой (Turrens J.F., 2003), а также другими путями, например, с
помощью пероксиредоксинов (Ree S.G. et al., 2003; Miwa S. et al., 2008). Вероятно, именно по этой причине наличие изменений в генотипе каталазы не
имеет фенотипических проявлений в нормальных условиях.
Подтверждением этого также могут являться исследования акаталазии,
показавшие, что у лиц с данным заболеванием в половине случаев не проявляются признаки патологии (Казимирко В.К., Мальцев В.И., 2004; Ogata M.,
1991). Другим объяснением отсутствия фенотипических проявлений являются результаты исследований шведских ученых Forsberg L. et al. (2001), показавших, что полиморфизм С-262Т в промоторном регионе гена каталазы оказывает влияние на фактор связывания транскрипции. При этом Т-аллель свя-
71
зан с повышением уровня каталазы в крови (Forsberg L. et al., 2001). И таким
образом в физиологических условиях сниженная активность каталазы в организме компенсируется ее повышенным синтезом.
Несмотря на отсутствие явных проявлений в физиологическом состоянии, в ряде работ отмечено повышение риска развития ряда заболеваний,
связанных с действием активных форм кислорода для людей со сниженной
активностью каталазы. Это позволяет предположить, что существенные изменения в работе антиоксидантной системы в этом случае возникают именно
в ответ на окислительный стресс. Потому как именно в условиях окислительного стресса, вызванного пероксидом водорода, роль каталазы становится ключевой (Чеснокова Н.П. и др., 2006б). Поэтому задачей следующего
этапа данной работы было разъяснение характера изменений, которые происходят в антиперекисной защите у лиц со снижающей активность мутацией
и без нее под действием окислительного стресса, индуцированного пероксидом водорода.
Полученные данные, не содержащие достоверного изменения активности каталазы, позволяют предположить, что в нормальном состоянии мононуклеарные лейкоциты обладают хорошим резервом в отношении антиперекисной защиты. Потому в первые часы возникновения окислительного стресса, вызванного заданными концентрациями пероксида водорода, имеющихся
ресурсов фермента оказывается вполне достаточно для того, чтобы противостоять действию активной формы кислорода. В то же время, если вспомнить
данные активности каталазы в физиологическом состоянии в эритроцитах, то
можно утверждать, что абсолютное значение активности каталазы в клетках
с вариантами генотипа -262СТ и -262ТТ по каталазе все же остается пониженным в сравнении с диким вариантом СС. Поэтому для обеспечения равноценного ответа на окислительный стресс клеткам в группах СТ и ТТ необходимо было бы достоверное повышение активности каталазы.
Таким образом, следует заключить, что активность каталазы в клетках,
72
содержащих мутацию С-262Т в гене CAT, не повышается в состоянии окислительного стресса, оставаясь на уровне ниже дикого варианта.
Измерение активности каталазы в состоянии окислительного стресса в
лейкоцитах с различными вариантами полиморфизма гена каталазы С-262Т
ранее не производилось, хотя изменение активности каталазы под действием
окислительного стресса вызывает интерес ученых, изучающих как животные,
так и растительные и бактериальные клетки (Shim Ie-S. et al., 2003; Nakamura
K. et al., 2012).
Среди исследований модуляции окислительного стресса и оценки активности каталазы в клетках крови чаще описываются эксперименты с эритроцитами. При этом в силу сложностей культивирования эритроцитов эксперимент и оценка изменения активности осуществляется в короткие сроки.
Поскольку данная работа преследовала цель сравнить уровень активности
каталазы с последующей устойчивостью клетки к окислительному стрессу,
объектом не могли стать только эритроциты. Было произведено сравнение
полученных нами результатов с некоторыми данными для эритроцитов, позволяющими объяснить полученные результаты.
В ряде работ выявлено увеличение активности каталазы в условиях
окислительного стресса в эритроцитах людей больных раком почки (Герасименко М.Н. и др., 2012). Однако в этом исследовании время воздействия на
клетки факторов окислительного стресса составляет сутки и более. Можно
предположить, что и в нашем случае можно было бы наблюдать достоверное
изменение активности каталазы после более длительной инкубации клеток в
присутствии пероксида водорода. Одним из косвенных подтверждений этому
становятся результаты исследования клеток на выраженность апоптоза через
24 ч после добавления пероксида водорода в культуру.
При модуляции относительно кратковременного окислительного
стресса в эритроцитах в исследовании Гидуляновой К.В. (2008) было показано достоверное увеличение активности каталазы в этих клетках через 1 ч ин-
73
кубации для исследуемых лиц в возрасте от 8 до 14 лет, тогда как для людей
30 – 40 лет такого увеличения не наблюдалось. Miranda-Vilela A.L. et al.
(2010) сделали сходное заключение для лейкоцитов в связи с наличием другого полиморфизма в промоторной части гена каталазы – А-21Т: эффект от
окислительного стресса, индуцированного пероксидом водорода, зависит от
возраста исследуемого человека.
В нашем случае возраст исследуемых носителей полиморфизмов составил 20 – 31 год. Следовательно, можно предположить, что отсутствие
быстрого ответа на окислительный стресс в лейкоцитах может объясняться
возрастными особенностями исследуемых лиц. В то же время, нельзя не отметить, что уровень значимости p при оценке изменения относительной активности каталазы в клетках с вариантом полиморфизма СС был близок к
пороговому (p = 0,067). Возможно, при увеличении выборки и использовании
более чувствительного метода измерения активности каталазы можно было
наблюдать достоверное увеличение активности каталазы для мононуклеарных лейкоцитов в группе СС (с высокой активностью каталазы) уже через
час.
Таким образом, полученные данные требуют уточнения, но все же дают возможность предположить, что в условиях окислительного стресса, индуцированного пероксидом водорода, работа системы антиперекисной защиты мононуклеарных лейкоцитов с различными уровнями активности каталазы, обусловленными полиморфизмом С-262Т в промоторной части гена CAT,
достоверно не меняется, оставаясь на своем физиологическом уровне.
Изменения не в активности фермента, а в поведении клеточных культур стали заметны после 24 ч инкубации мононуклеарных лейкоцитов с пероксидом водорода. Об этом свидетельствуют полученные нами достоверные
различия в реакции клеток на окислительный стресс посредством вступления
в апоптоз.
Снижение доли живых клеток во всех образцах указывает на критич-
74
ность концентрации пероксида водорода в 1000 мкмоль/л для данного типа
клеток: независимо от уровня активности каталазы. Эта концентрация способствует значимому снижению количества живых клеток в культуре мононуклеарных лейкоцитов. Для клеток с генотипами -262СС и -262СТ это достигается, в первую очередь, за счет вступления значимой доли клеток в
апоптоз. Сходные результаты при оценке выраженности апоптоза мононуклеарных лейкоцитов получены в исследовании В.В.Новицкого и соавт.
(2008), показавших отсутствие достоверного изменения в количестве аннексин-V-положительных клеток в культуре, индуцированной пероксидом водорода в концентрациях 50, 100 и 500 мкмоль/л, и значимый рост числа этих
клеток при концентрации 1000 мкмоль/л.
Таким образом, можно предположить, что клетки с вариантами полиморфизма -262СС и -262СТ гена каталазы обладают активностью системы
антиперекисной защиты достаточной для того, чтобы обеспечить адекватный
ответ на окислительный стресс, вызванный пероксидом водорода. Но в то же
время рост числа апоптотических клеток дополняется ростом числа некротических клеток, сигнализирующим о разрушительной силе активного кислорода, которой могут противостоять далеко не все клетки культуры. Это еще
раз подтверждает повреждающее действие пероксида водорода в концентрации 1000 мкмоль/л.
Для клеток с вариантом полиморфизма -262ТТ гена каталазы снижение
доли живых клеток происходит главным образом за счет роста некротических клеток. Более того, доля некротических клеток в этих культурах оказалась достоверно выше таковой для группы СС даже при небольшой концентрации пероксида водорода (400 мкмоль/л). Это свидетельствует о сниженной устойчивости клеток с гомозиготным мутантным вариантом -262ТТ к
окислительному стрессу: клетка погибает не в состоянии обеспечить адекватную реакцию на окислительный агент. Даже в том случае, когда клетка
может обеспечить адекватный ответ в виде вступления в апоптоз, доля апто-
75
тических клеток для мутантного варианта ТТ оказывается выше, чем для дикого варианта СС при аналогичных условиях.
Возможно, объяснение этому обнаруживается в совокупности двух
предыдущих исследований: значимо более низкая активность каталазы в физиологическом состоянии, которая не увеличивается при возникновении
окислительного стресса, приводит к быстрому истощению клетки, что влечет
за собой спонтанную или программируемую ее гибель. Возможно, что присутствие мутации в обоих аллелях гена каталазы все же влечет за собой заметное ослабление клеток в условиях окислительного стресса по сравнению
не только с диким вариантом полиморфизма -262СС, но даже с гетерозиготным вариантом -262СТ.
В результате полученных нами данных выявляется то самое расхождение, наблюдаемое в исследованиях взаимосвязи полиморфизма С-262Т каталазы с активностью фермента и рисками развития заболеваний. В группе
клеток, обладающих гетерозиготным вариантом СТ в положении -262 гена
CAT отмечается сниженная активность каталазы, но, вероятно, это снижение
недостаточно велико, чтобы приводить к значимому снижению устойчивости
клеток к окислительному стрессу по сравнению с диким вариантом клеток.
Таким образом, вариант генотипа -262СТ оказывается своего рода
промежуточной формой при изменении работы каталазы за счет мутации. Он
снижает активность фермента, но в этом случае, возможно, компенсаторных
механизмов клетки оказывается достаточно для того, чтобы поддерживать
антиоксидантный баланс даже в состоянии окислительного стресса. При
наличии же мутации в обоих аллелях гена изменения в каталазе оказываются
еще более ярко выраженными и уже не могут полностью компенсироваться.
Жизнеспособность клеток в условиях окислительного стресса, индуцированного пероксидом водорода, в зависимости от варианта активности каталазы, ранее не исследовалась. Однако в исследовании Новицкого В.В. и др.
(2008) выявлено, что доля аннексин-V-положительных клеток при концен-
76
трации пероксида водорода 1 ммоль/л составила 11,08%. В нашем случае доля апоптотических клеток при окраске акридиновым оранжевым/бромистым
этидием составила 23,08% для самой устойчивой группы -262СС.
Возможно, такое расхождение данных связано с различием методов
оценки выраженности апоптоза, а также с различиями в составе питательной
среды: в данном исследовании питательная среда не содержала HEPES. Кроме того, в публикации В.В.Новицкого и др. (2008) не указано время инкубации мононуклеарных лейкоцитов в присутствии пероксида водорода, но,
возможно, расхождения могут быть связаны с различным временем инкубации – в настоящем исследовании оно продолжалось 24 ч.
В исследованиях зарубежных ученых существуют данные о клетках с
меньшей устойчивостью к окислительному стрессу, индуцированному пероксидом водорода. Так, было показано достоверное снижение доли живых
клеток в культурах клеток надпочечников человека, а также в ткани нейробластомы человека через 24 ч при концентрации пероксида водорода 50
мкмоль/л (Chen S.-J. et al., 2013), а в клетках сетчатки глаза значимое снижение доли живых клеток наблюдалось при 300 мкмоль/л пероксида водорода
(Hanus J. et al., 2013).
Таким образом, мононуклеарные лейкоциты обладают относительно
высокой устойчивостью к окислительному стрессу, индуцированному пероксидом водорода, по сравнению с рядом других типов клеток человека. Но
при этом изменение работы каталазы за счет гомозиготной мутации -262ТТ в
промоторной части гена каталазы снижает устойчивость этих клеток к пероксиду водорода по сравнению с диким вариантом, способствуя их гибели уже
при 700 мкмоль/л.
Выше было описано поведение здоровых клеток человека в условиях
окислительного стресса, однако после трансформации клетки могут проявлять совершенно иные свойства, в том числе в отношении активных форм
кислорода. С целью изучения данного вопроса было выполнено исследова-
77
ние в клетках меланомы кожи клеточной линии Bro. При этом в клетках меланомы линии Bro не было зарегистрировано повышения активности каталазы в ответ на окислительный стресс. Независимо от концентрации пероксида
водорода в окружающей среде (культуральной среде) активность каталазы в
клетках меланомы Bro сохраняется на уровне контрольного значения.
Можно предположить, что абсолютное значение активности каталазы в
клетках меланомы может оказаться выше, чем в лейкоцитах, ведь известно,
что нормальные меланоциты обладают высокой степенью защиты от окислительного стресса благодаря пигменту меланину (Jenkins N.C., Grossman D.,
2013; Denat L. et al., 2014). Это предположение подтвердилось при оценке
выраженности апоптоза: доля живых клеток в культуре меланомы Bro оказалась достоверно выше таковой при всех исследуемых концентрациях пероксида водорода (400 мкмоль/л, 700 мкмоль/л и 1000 мкмоль/л) в культуре лейкоцитов c аналогичным генотипом -262СС гена каталазы. Следовательно, несмотря на отсутствие роста активности каталазы в условиях окислительного
стресса, данный фермент все же обеспечивает достаточную защиту клетки от
повреждения.
Несмотря на более высокую устойчивость к окислительному стрессу по
сравнению с лейкоцитами, в культуре меланомы Bro наблюдается достоверное снижение доли живых клеток при воздействии 1 ммоль/л пероксида водорода. Таким образом, клетки меланомы обладают чувствительностью к той
же концентрации пероксида водорода, что и мононуклеарные лейкоциты.
Описание данного свойства присутствует в некоторых работах и является основанием для поиска путей лечения меланомы путем стимуляции окислительного стресса (Newman R.A. et al., 2006).
Американские исследователи Fruehauf J.P. и Trapp V. (2008) даже
назвали активные формы кислорода «ахиллесовой пятой» меланомы. Однако
другими исследователями показано, что появление большого количества активных форм кислорода, влекущее за собой гибель клеток в зоне воздей-
78
ствия, может способствовать активации процессов пролиферации и метастазирования в окружающих меланому тканях (Sander C.S. et al., 2003). Если
вновь обратиться к полученным нами результатам, гибель примерно 20%
опухолевых клеток, вероятно, может стимулировать пролиферацию остальных 80% и даже спровоцировать появление метастазов.
В исследованиях зарубежных ученых существуют данные о различной
устойчивости опухолевых клеток к окислительному стрессу. Так, Klingelhoeffer C. et al. (2012) при оценке устойчивости одиннадцати раковых клеточных линий (не включающих рак кожи) показали, что лишь 55% исследуемых клеточных линий устойчивы к воздействию пероксида водорода. При
этом повышенная устойчивость была связана с более высоким уровнем активности каталазы. Исследователи показали, что каталаза является очень
важным ферментом антиоксидантной защиты опухоли (Klingelhoeffer C. et
al., 2012).
Другими учеными была описана устойчивость клеток меланомы линий
20842P и 20842M2 к апоптозу, индуцированному окислительным стрессом за
счет повышенной экспрессии гена DHCR24. При этом более высокий уровень экспрессии данного гена наблюдается в метастазирующей меланоме по
сравнению с первичной (Stasi D. Di et al., 2005). Следовательно, устойчивость
клеток меланомы к апоптозу, индуцированному окислительным стрессом,
может также зависеть от клеточной линии меланомы и стадии ее развития. В
таком случае, несмотря на наличие чувствительности клеток меланомы отдельных клеточных линий, включая линию Bro, к окислительному стрессу,
индуцированному пероксидом водорода, для борьбы с данным злокачественным новообразованием метод индукции апоптоза в клетках активными формами кислорода может оказаться неприемлемым. Возможность использования такого метода требует уточнения.
Поскольку исследования устойчивости меланомы к окислительному
стрессу проводились неоднократно, полученный нами результат не имеет
79
научной новизны. Однако важным в данном исследовании является не это, а
именно сопоставление данных о работе каталазы и выживаемости клеток в
условиях окислительного стресса в различных клетках. В данном случае поведение клеток меланомы в условиях окислительного стресса соответствует
ожиданиям для клеток с диким вариантом генотипа -262СС в промоторной
части гена каталазы, где предположительно активность каталазы высока.
Однако, помимо факта вступления клетки в апоптоз под действием
окислительного стресса, важным является понимание механизмов протекания данного процесса с целью дальнейшего вмешательства в этот процесс.
Это позволит найти пути воздействия на клетки злокачественных новообразований в терапевтических целях. В различных исследованиях неоднократно
было показано, что апоптоз, индуцированный активными формами кислорода, зачастую протекает по митохондриальному сигнальному пути, сопровождаемый изменением электрохимического потенциала на внутренней митохондриальной мембране.
Следовательно, для направленной индукции активными формами кислорода необходимо иметь четкое представление об особенностях протекания
именно этого пути апоптоза. Одним из маркеров митохондриального сигнального пути апоптоза является белок-транслокатор (TSPO), ранее обозначаемый как периферический бензодиазепиновый рецептор (PBR) (Papadopoulos V. et al., 2006). Именно TSPO связывают с реакцией клетки на присутствие активных форм кислорода. Это подтверждается также данными, указывающими на наличие у Rhodobacter sphaeroides гомологичного TSPO белка,
регулирующего экспрессию гена в ответ на присутствие активных форм кислорода (Yeliseev A.A., Kaplan S., 1995).
Известно также, что активные формы кислорода вызывают структурные изменения в TSPO, а именно индуцируют его полимеризацию (Delavoie
F., 2003). В свою очередь, изменение структуры белка может быть сопряжено
с изменением его функциональной активности. TSPO может являться важ-
80
ным компонентом в цепи событий, начинающихся с индукции окислительного стресса в клетке и заканчивающихся ее апоптотической гибелью. Логично
предположить, что рост числа апоптотических клеток в культуре мононуклеарных лейкоцитов, индуцированный пероксидом водорода, может находиться в прямой корреляции с уровнем TSPO в культуре.
В этой связи следующей задачей данного исследования было определение уровня экспрессии гена TSPO в группах клеток с различными уровнями активности каталазы при различных концентрациях пероксида водорода.
Это позволяет оценить вклад митохондриального сигнального пути при
вступлении клеток в апоптоз.
Полученные нами данные опровергают выдвинутую выше гипотезу о
взаимосвязи между количеством апоптотических клеток и уровнем TSPO в
культуре. С одной стороны, определялся дозозависимый эффект уровня
TSPO от концентрации активной формы кислорода. Данное явление также
было описано ранее при воздействии на различные типы клеток таких факторов окислительного стресса, как ультрафиолетовое излучение (Савченко И.А.
и др., 2010) и хлорид аммония (Caballero B. et al., 2013). Однако эта зависимость относительного количества TSPO от концентрации пероксида водорода оказалась различной, индивидуальной для каждого из исследуемых образцов, и, таким образом, относительное количество TSPO в клетках не имеет
корреляции ни с вариантом генотипа каталазы С-262Т, ни, следовательно, с
активностью каталазы, и ни с концентрацией пероксида водорода.
Среди исследований TSPO не было обнаружено ни одной работы, позволяющей объяснить полученный нами результат. Взаимосвязь между TSPO
и активными формами кислорода прослеживается даже при сравнении его
уровня в клетках различных типов тканей. Так, клетки головного мозга человека, где содержание активных форм кислорода минимально, содержат низкий уровень TSPO (Gavish M. et al., 1999). При оценке патологических состояний также показана корреляция между уровнем TSPO и развитием ряда
81
опухолей, связанных с действием активных форм кислорода (KluboGwiezdzinska J. et al., 2012).
Возможно, полученные нами данные указывают на то, что воздействие
пероксида водорода на клетку извне имеет иной механизм индукции апоптоза нежели при его эндогенном возникновении. В большинстве исследований
указывается, что пероксид водорода обладает высокой проницаемостью через мембраны клеток, однако в работе Grivennikova V.G. (2010) сделана попытка опровергнуть это утверждение. Это также может объяснить полученные нами результаты: недостаточная проницаемость через мембраны не позволяет пероксиду водорода быстро проникнуть в клетку и достичь митохондриальной мембраны, тогда как рецепторы апоптоза на поверхности клетки
обладают хорошей доступностью для молекулы, поступившей извне.
В этом случае молекулы пероксида водорода в первую очередь будут
активировать рецепторы клеточных мембран, стимулируя рецепторный сигнальный путь апоптоза. Проникновение пероксида водорода в клетку и изменение мембранного потенциала митохондрий может быть обусловлено рядом
факторов, оставшихся за пределами исследования. Высказано предположение, что активные формы кислорода в небольших концентрациях не оказывают существенного эффекта на процесс вступления клетки в апоптоз, поскольку их действие подавляется работой белка Bcl-2 (Jacobson M. D., Raff
M.C., 1994). Возможно, и в данном случае пероксид водорода, проникающий
в клетку, не оказывает воздействия на митохондриальный сигнальный путь
апоптоза, а инактивируется каталазой, в то время как запуск апоптоза в митохондриях подавляется белком Bcl-2.
Наконец, полученные результаты позволяют предположить, что пероксид водорода не оказывает влияния на уровень TSPO в клетке, либо оказывает на него влияние в совокупности с рядом дополнительных факторов,
оставшихся неизвестными в данном исследовании.
Таким образом, корреляция между концентрацией активных форм кис-
82
лорода и уровнем TSPO в мононуклеарных лейкоцитах с различными уровнями активности каталазы в клетках требует дальнейших исследований.
Резюмируя вышесказанное, можно заключить: активность фермента
оказывает значимое влияние на устойчивость клеток к окислительному
стрессу, достоверно снижая ее при достижении некоторого порогового уровня, как при наличии гомозиготной мутации С-262Т в гене CAT; уровень активности каталазы в мононуклеарных лейкоцитах, существующий за счет
данной мутации, остается неизменным в первые часы воздействия окислительного стресса, индуцированного пероксидом водорода. Распределение полиморфизма С-262Т в гене CAT, влияющего на активность каталазы, среди
больных меланомой кожи и плоскоклеточным раком кожи позволяет заключить, что для успешного прогрессирования данных видов новообразований
клеткам необходима достаточно высокая активность каталазы, позволяющая
поддерживать концентрацию активных форм кислорода на уровне выше физиологического, но не позволяющая при этом нанести им ущерб.
Полученные результаты могут стать основанием к более подробному
изучению взаимосвязи полиморфизма С-262Т гена CAT с особенностями
функционирования клеток в условиях окислительного стресса. Так, например, одним из дальнейших направлений может стать изучение последствий
респираторного взрыва в фагоцитах с различным конститутивным уровнем
активности каталазы при иммунном ответе, а также выявление особенностей
работы каталазы в этих условиях. Возможно, это поможет выявить причины
повышенного риска развития ряда заболеваний, связанных с наличием мутации в промоторной части гена каталазы С-262Т, а также обеспечить прогнозирование развития патологических изменений у пациентов в зависимости от
функционирования каталазы.
83
ВЫВОДЫ
1. Полиморфизм гена каталазы С-262Т обусловливает изменение активности каталазы в нормальных (мононуклеарные лейкоциты) и опухолевых
клетках (клетки меланомы кожи и плоскоклеточного рака кожи).
2. В мононуклеарных лейкоцитах и клетках меланомы в условиях
окислительного стресса, вызванного пероксидом водорода в диапазоне концентраций 400 – 1000 мкмоль/л, сохраняется стабильная активность каталазы
вне зависимости от полиморфизма гена CAT.
3. Мононуклеарные лейкоциты с генотипом ТТ и сниженной активностью каталазы характеризуются сниженной устойчивостью к окислительному стрессу и повышенной апоптотической и/или некротической гибелью.
4. Клетки меланомы линии Bro резистентны к индукции окислительного стресса пероксидом водорода в концентрациях 400, 700 мкмоль/л, но обладают чувствительностью к его воздействию в концентрации 1000
мкмоль/л, что выражается в увеличении доли апоптотических клеток.
5. Экспрессия TSPO – митохондриального, апоптоз-ассоциированного
белка – в клетках меланомы кожи и мононуклеарных лейкоцитах характеризуется разнонаправленностью вне зависимости от варианта полиморфизма
гена каталазы С-262Т.
6. Изменение уровня экспрессии TSPO не зависит от активности каталазы и не коррелирует с выраженностью апоптоза в культурах мононуклеарных лейкоцитов при индукции окислительного стресса, что указывает на отсутствие функциональной роли данного белка в реализации апоптоза, сопряженного с повышенной концентрацией активных форм кислорода.
84
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
1. Выявление уровня активности каталазы посредством определения
варианта полиморфизма С-262Т гена CAT может быть использовано для
формирования новых подходов к профилактике злокачественных новообразований кожи, а также других заболеваний, связанных с развитием окислительного стресса.
2. Лицам, обладающим диким вариантом полиморфизма гена каталазы
-262СС, необходимо воздерживаться от повреждающего действия ультрафиолетового излучения.
85
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Антонеева И.И., Петров С.Б. Маркеры апоптоза и пролиферации опухолевых клеток в динамике прогрессирования рака яичника // Онкология. –
2008. – Т. 10, № 2. – C. 234–237.
2. Баринов А.Н. Роль окислительного стресса в заболеваниях нервной
системы — пути коррекции // Трудный пациент. – 2012. – № 1.
3. Безручко Н.В., Рубцов Г.К., Ганяева Н.Б., Козлова Г.А., Садовникова
Д.Г. Каталаза биологических сред организма человека и ее клиникобиохимическое значение в оценке эндотоксикоза // Вестник ТГПУ. - 2012. Том 7, №122. – С. 94 – 98.
4. Биохимия: учебник / под ред. чл.-корр. РАН, проф. Е.С. Северина. – 5е изд. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2009. – ил. – 768 с.
5. Бурова Е.Б., Люблинская О.Г., Шатрова А.Н., Бородкина А.В., Никольский Н.Н. Сравнительный анализ устойчивости к окислительному стрессу стволовых клеток эндометрия и фибробластов человека // Цитология. –
2012. – Т. 4, № 6. – P. 478–483.
6. Варга О.Ю., Рябков В.А. Апоптоз: понятие, механизмы реализации,
значение // Экология человека. – 2006. - №7. – С. 28–32.
7. Васенина Е.Е., Левин О.С. Окислительный стресс в патогенезе нейродегенеративных заболеваний: возможности терапии // СТПН. – 2013. – №3–
4. – С. 39–46.
8. Владимиров Ю.А. Свободные радикалы в биологических системах //
Соросовский Образовательный Журнал. – 2000. – Т. 6, № 12. – С. 13–19.
9. Владимиров Ю.А., Проскурнина Е.А. Свободные радикалы и клеточная хемилюминесценция // Успехи биол. химии. – 2009. – Т. 49. – С. 341–388.
10. Ганцев Ш.Х., Юсупов А.С. Плоскоклеточный рак // Практ. онкол. –
2012. – Т. 13, № 2. – С. 80–91.
11. Герасименко М.Н., Зуков Р.А., Титова Н.М., Дыхно Ю.А., Модестов
86
А.А., Попов Д.В. Антиоксидантная система и маркеры окислительного
стресса при раке почки // Сиб. онкол. журн. – 2012. – Т. 5, № 53. – С. 39-43.
12. Геращенко Т.С., Денисов Н.В., Литвяков Н.В., Завьялова М.В., Вторушин С.В., Цыганов М.М., Перельмутер В.М., Чердынцева Н.В. Внутриопухолевая гетерогенность: природа и биологическое значение // Биохимия. –
2013. – Т. 78, вып. 11. – С. 1531 – 1549.
13. Гидулянова К.В. Возрастные особенности модуляции активности антиоксидантных ферментов при индуцированном окислительном стрессе //
Вісник Харківського національного університету імені В. Н. Каразіна. Серія:
біологія. – 2008. – Вип. 7, № 814.
14. Грачев Д.Е. Роль периферического бензодиазепинового рецептора в
начальных стадиях апоптоза и индукции неспецифической поры митохондрий: Автореф. дис. … канд. биол. наук : 03.00.02 / Ин-т теорет. и эксперим.
биофизики РАН. – Пущино, 2009. – 24 с.
15. Гривенникова В.Г., Виноградов А.Д. Генерация активных форм кислорода митохондриями // Успехи биол. химии. – 2013. – Т. 53. – С. 245–296.
16. Гырылова С.Н., Рукша Т.Г., Комина А.В. Индукция апоптоза клеток
меланомы лигандом TsPO PK11195 // Сиб. онкол. журн. – 2011. – №1. – С.
40–43.
17. Злокачественные новообразования в России в 2010 году (заболеваемость и смертность) / Под ред. В.И. Чиссова, В.В. Старинского, Г.В. Петровой. – М.: ФГБУ «МНИОИ им. П.А. Герцена» Минздравсоцразвития России,
2012. – ил. – 260 с.
18. Казимирко В.К., Мальцев В.И. Антиоксидантная система и ее функционирование в организме человека // Здоровье Украины. – 2004. – № 192. –
C. 98.
19. Кашулина А.П. Эритроциты периферической крови как источник
информации о состоянии организма в норме и при патологии // Медицина и
качество жизни. – 2011. – № 2. – С. 11–14.
87
20. Королюк М.А., Иванова Л.И., Майоров И.Г. Метод определения активности каталазы // Лаб. дело. – 1988. – №1. – С. 16–18.
21. Кудрявцев Д.В., Кудрявцева Г.Т., Мардынский Ю.С., Золотков А.Г.,
Вальков М.Ю., Левит М.Л. Ультрафиолетовое излучение, фототип и меланома кожи // Экология человека. – 2006. – № 11. – С. 9–13.
22. Кулинский В.И., Колесниченко Л.С. Структура, свойства, биологическая роль и регуляция глутатионпероксидазы // Успехи соврем. биол. –
1993. – T. 113, № 1. – C. 107–122.
23. Мирошниченко О.С. Биогенез, физиологическая роль и свойства каталазы // Биополимеры и клетка. – 1992. Т. 8, № 6. – С. 3–25.
24. Новик А.В. Меланома кожи: новые подходы // Практическая онкология. – 2001. – Т. 12, № 1. – С. 36-42.
25. Новицкий В.В., Рязанцева Н.В., Часовских Н.Ю., Старикова Е.Г.,
Кайгородова Е.В., Стариков Ю.В., Жукова О.Б. Модуляция апоптоза мононуклеаров в условиях окислительного стресса // Бюл. экспер. биол. мед. –
2008. – Т. 145, № 3. – С. 251 – 254.
26. Паук В.В., Насибуллин Т.Р., Туктарова И.А., Зуева Л.П., Мустафина
О.Е. Полиморфизм генов ферментов антиоксидантной защиты в связи с продолжительностью жизни // Успехи геронтологии. – 2008. – Т. 21, № 4. – С.
593–595.
27. Савченко И.А., Рукша Т.Г., Салмин В.В., Зыкова Л.Д. Результаты
экспериментального изучения воздействия УФ-облучения на фоточувствительный белок кожи // Вестн. дерматол. и венерол. – 2010. – № 3. – С. 33–36.
28. Скулачев В.П. Кислород в живой клетке: добро и зло // Соросовский
образовательный журн. – 1996. – № 3. – C. 4–10.
29. Фархутдинов Р.Р., Мусин Ш.И., Кзыргалин Ш.Р. Свободные радикалы, пролиферация и канцерогенез // Креативная хирургия и онкология. –
2001. – № 3. – C. 109–112.
30. Фитцпатрик Д.Е., Элинг Д.Л. Секреты дерматологии. – СПб:
88
Невский диалект. – 1999.
31. Чеснокова Н.П., Понукалина Е.В., Бизенкова М.Н. Источники образования свободных радикалов и их значение в биологических системах в
условиях нормы // Соврем. наукоемкие технологии. – 2006а. – № 6. – С. 28–
34.
32. Чеснокова Н.П., Понукалина Е.В., Бизенкова М.Н. Молекулярноклеточные механизмы инактивации свободных радикалов в биологических
системах // Успехи соврем. естествознания. – 2006б. – № 7. – С. 28–36.
33. Чехун В.Ф., Шербан С.Д., Савцова З.Д. Гетерогенность опухоли –
динамичное состояние // Онкология. – 2012. – Т. 14, № 1. – С. 4 – 12.
34. Широкова А.В. Апоптоз. Сигнальные пути и изменение ионного и
водного баланса клетки // Цитология. – 2007. – Т. 49, № 5. – C. 385–394.
35. Ahn, J., Gammon M.D., Santella R.M. Associations between breast cancer risk and the catalase genotype, fruit and vegetable consumption, and supplement use // Am. J. Epidemiol. – 2005. – Vol. 162, № 10. – P. 943–952.
36. Ahn J., Gammon M.D., Santella R.M., Gaudet M.M., Britton J.A., Teitelbaum S.L., Terry M.B., Nowell S., Davis W., Garza C., Neugut A.I., Ambrosone
C.B. Associations between catalase phenotype and genotype: modification by epidemiologic factors // Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. – 2006. – Vol. 15, № 6.
– P. 1217–1222.
37. Ahsan H., Chen Y., Kibriya M.G., Islam M.N., Slavkovich V.N., Graziano J.H., Santella R.M.. Susceptibility to arsenic-induced hyperkeratosis and oxidative stress genes myeloperoxidase and catalase // Cancer Lett. – 2003. – Vol.
201. – P. 57–65.
38. Aruoma O.I. Free radicals, oxidative stress, and antioxidants in human
health and disease // J. Am. Oil Chemists' Society. – 1998. – V. 75, № 2. – P. 199212.
39. Babusikova E., Jesenak M., Evinova A., Banovcin P., Dobrota D. Frequency of Polymorphism -262 C/T in Catalase Gene and Oxidative Damage in
89
Slovak Children With Bronchial Asthma // Arch. Bronconeumol. – 2013. – Vol. 4.
– P. 507–512.
40. Bae Y.S., Oh H., Rhee S.G., Yoo Y.D. Regulation of Reactive Oxygen
Species Generation in Cell Signaling // Mol. Cells. – 2011. – Vol. 32, № 6. – P.
491–509.
41. Bastaki M., Huen K., Manzanillo P., Chande N., Chen C., Balmes J.R.,
Tager I.B., Holland N. Genotype-activity relationship for Mn-superoxide dismutase, glutathione peroxidase 1 and catalase in humans // Pharmacogenet. Genomics. – 2006. – Vol. 16. – P. 279–286.
42. Boveris A., Oshino N., Chance B. The cellular production of hydrogen
peroxide // Biochem. J. – 1972. – Vol. 128. – P. 617–630.
43. Caballero B., Veenman L., Bode J., Leschiner S., Gavish M. Concentration-Dependent Bimodal Effect of Specific 18 kDa Translocator Protein (TSPO)
Ligands on Cell Death Processes Induced by Ammonium Chloride. Potential Implications for Neuropathological Effects due to Hyperammonemia // CNS Neurol.
Disord. Drug Targets. – 2013. – Vol. 13, № 4. – P.574-592.
44. Capurso C., Solfrizzi V., D'Introno A., Colacicco A.M., Capurso S.A., Bifaro L., Menga R., Santamato A., Seripa D., Pilotto A., Capurso A., Panza F. Short
arm of chromosome 11 and sporadic Alzheimer's disease: catalase and cathepsin D
gene polymorphisms // Neurosci. Lett. – 2008. – Vol. 432, № 3. – P. 237–242.
45. Casellas P., Galiegue S., Basile A.S. Peripheral benzodiazepine receptors
and mitochondrial function // Neurochem. Intern. – 2002. – Vol. 40, № 6. – P.
475–486.
46. CAT catalase [Homo sapiens (human)] // NCBI [Electronic database]. –
2014. – Access mode: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/847. – last accessed
06.06.2014.
47. Cerella C., Coppola S., Maresca V., De Nicola M., Radogna F., Ghibelli
L. Multiple mechanisms for hydrogen peroxide-induced apoptosis // Ann. N. Y.
Acad. Sci. – 2009. – V. 1171. – P. 559–563.
90
48. Chen Shu-J., Zhang W., Tong Qin, Conrad K., Hirschler-Laszkiewicz I.,
Bayerl M., Kim J.K., Cheung J.Y., Miller B.A. Role of TRPM2 in cell proliferation and susceptibility to oxidative stress // Am. J. Physiol. Cell Physiol. – 2013. –
Vol. 304. – P. C548–C560.
49. Chistiakov D.A., Zotova E.V., Savost’anov K.V., Bursa T.R., Galeev
I.V., Strokov I.A., Nosikov V.V. The 262T>C promoter polymorphism of the catalase gene is associated with diabetic neuropathy in type 1 diabetic Russian patients
// Diabetes & Metabolism. – 2006. – Vol. 32. – P. 63–68.
50. Choi J.Y.,
Neuhouser M.L., Barnett M., Hudson M., Kristal A.R.,
Thornquist M., King I.B., Goodman G.E., Ambrosone C.B. Polymorphisms in oxidative stress-related genes are not associated with prostate cancer risk in heavy
smokers // Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. – 2007. – Vol. 16, № 6. – P. 1115–
1120.
51. Christiansen L., Petersen H.Ch., Bathum L., Frederiksen H., McGue M.,
Christensen K. The Catalase -262C/T Promoter Polymorphism and Aging Phenotypes // J. Gerontol.: Biol. Sci. – 2004. – Vol. 59A, № 9. – P. 886–889.
52. Clémenta M.-V., Pontonb A., Pervaizc Sh. Apoptosis induced by hydrogen peroxide is mediated by decreased superoxide anion concentration and reduction of intracellular milieu // FEBS Letters. – 1998. – V. 440. – P. 13–18.
53. Corsi L., Geminiani E., Baraldi M. Peripheral Benzodiazepine Receptor
(PBR) New Insight in Cell Proliferation and Cell Differentiation // Curr. Clin.
Pharmacol. – 2008. – Vol. 3. – P. 38–45.
54. Delavoie F., Li H., Hardwick M., Robert J.C., Giatzakis C., Péranzi G.,
Yao Z.X., Maccario J., Lacapère J.J., Papadopoulos V. In vivo and in vitro peripheral-type benzodiazepine receptor polymerization: functional significance in drug
ligand and cholesterol binding // Biochem. – 2003. – Vol. 42. – P. 4506–4519.
55. Denat L., Kadekaro A. L., Marrot L., Leachman S.A., Abdel-Malek Z.A.
Melanocytes as Instigators and Victims of Oxidative Stress // J. Invest. Dermatol. –
2014. – Vol. 134, № 6. – P. 1512–1518.
91
56. Di Stasi D., Vallacchi V., Campi V., Ranzani T., Daniotti M., Chiodini
E., Fiorentini S., Greeve I., Prinetti A., Rivoltini L., Pierotti M.A., Rodolfo M.
DHCR24 gene expression is upregulated in melanoma metastases and associated to
resistance to oxidative stress-induced apoptosis // Inter. J. Cancer. – 2005. – Vol.
115. – P. 224–230.
57. Fan J., Lindemann P., Feuilloley M.G., Papadopoulos V. Structural and
functional evolution of the translocator protein (18 kDa) // Curr. Mol. Med. –
2012. – Vol. 12, № 4. – P. 369 – 386.
58. Forsberg L., Lyrenӓ s L., deFaire U., Morgenstern R.A. A common functional C-T substitution polymorphism in the promoter region of the human catalase
gene influences transcription factor binding, reporter gene transcription and is correlated to blood catalase levels // Free Radical Biol. Med. – 2001. – Vol. 30. – P.
500–505.
59. Franko A., Dolzan V., Arnerić N., Dodic-Fikfak M. Asbestosis and catalase genetic polymorphism // Arh. Hig. Rada Toksikol. – 2008. – Vol. 59, № 4. –
P. 233 – 240.
60. Fruehauf J.P., Trapp V. Reactive oxygen species: an Achilles' heel of
melanoma // Expert Rev. Anticancer Ther. – 2008. – Vol. 8, № 11. – P. 1751–
1757.
61. Galecki P., Szemraj J., Zboralski K., Florkowski A., Lewinski A. Relation
between functional polymorphism of catalase gene (-262C>T) and recurrent depressive disorder // Neuro Endocrinol. Lett. – 2009. – Vol. 30, № 3. – P. 357–362.
62. Gavish M., Bachman I., Shoukrun R., Katz Y., Veenman L., Weisinger
G., Weizman A. Enigma of the Peripheral Benzodiazepine // Pharmacol. Rev. –
1999. – Vol. 51, № 4. – P. 629–650.
63. Ghaly M.S., Ghattas M.H., Labib S.M. Association of catalase gene polymorphisms with catalase activity and susceptibility to systemic lupus erythematosus in the Suez Canal area, Egypt // Lupus. – 2012. – Vol. 21, №11. – P. 1244–
1249.
92
64. Goth L., Nagy T. Acatalasemia and diabetes mellitus // Arch. Biochem.
Biophys. – 2012. – Vol. 525. – P. 195–200.
65. Goulas A., Fidani L., Kotsis A., Mirtsou V., Petersen R.C., Tangalos E.,
Hardy J. An association study of a functional catalase gene polymorphism, -262C->T, and patients with Alzheimer's disease // Neurosci. Lett. – 2002. – Vol. 330, №
2. – P. 210–213.
66. Goyal M.M., Basak A. Human catalase: looking for complete identity //
Protein Cell. – 2010. – Vol. 1, № 10. – P. 888–897.
67. Grigorov B. Reactive oxygen species and their relation to // Trakia J. of
Sciences. – 2012. – Vol. 10, No 3. – P. 83-92.
68. Grivennikova V.G., Kareyeva A.V., Vinogradov A.D. What are the
sources of hydrogen peroxide production by heart mitochondria? // Biochim. Biophys. Acta. – 2010. – Vol. 1797. – P. 939–944.
69. Gülden M., Jess A., Kammann J., Maser E., Seibert H. Cytotoxic potency
of H2O2 in cell cultures: Impact of cell concentration and exposure time // Free
Rad. Biol. Med. – 2010. – Vol. 49. – P. 1298–1305.
70. Han Z., Slack R.S., Li W., Papadopoulos V. Expression of peripheral benzodiazepine receptor (PBR) in human tumors: relationship to breast, colorectal,
and prostate tumor progression // J. Recept. Signal Transduct. Res. – 2003. – Vol.
23. – P. 225–238.
71. Hanus J., Zhang H., Wang Z., Liu Q., Zhou Q., Wang S. Induction of necrotic cell death by oxidative stress in retinal pigment epithelial // Cell Death and
Disease. – 2013. – Vol. 4, № 12. – P. e965.
72. Hebert-Schuster M., Fabre E.E., Nivet-Antoine V. Catalase polymorphisms and metabolic diseases // Curr. Opin. Clin. Nutr. Metab. Care. – 2012. –
Vol. 15, № 4. – P. 397–402.
73. Hildeman D. A., Mitchell Th., Aronow B., Wojciechowski S., Kappler J.,
Marrack Ph. Control of Bcl-2 expression by reactive oxygen species // PNAS. –
2003. – Vol. 100, № 25. – P. 15035–15040.
93
74. Hirsch T., Decaudin D., Susin S. A., Marchetti P., Larochette N., RescheRigon M., Kroemer G. PK11195, a ligand of the mitochondrial benzodiazepine receptor, facilitates the induction of apoptosis and reverses Bcl-2-mediated cytoprotection / T. Hirsch [et al.] // Exp. Cell Res. – 1998. – Vol. 241. – P. 426–434.
75. Ho J.C., Mak J.C., Ho S.P., Ip M.S., Tsang K.W., Lam W.K., ChanYeung M. Manganese superoxide dismutase and catalase genetic polymorphisms,
activity levels, and lung cancer risk in Chinese in Hong Kong // J. Thorac. Oncol. –
2006. – Vol. 1, № 7. – P. 648–653.
76. Hotchkiss R.S., Strasser A., McDunn J.E., Swanson P.E. Cell death // N.
Engl. J. Med. – 2009. – Vol. 361, № 16. – P. 1570–1583.
77. Human Erytrocyte Catalase: Protein Data Bank in Europe [Electronic database] // EMBL-EBI. – Access mode: http://www.ebi.ac.uk/pdbe-srv/view/ entry/1dgf/summary.html. – last accessed 06.06.2014.
78.
ygen
Species in the Biology of Melanoma [Electronic Resource] // Breakthroughs in
Melanoma Research. – InTech, 2011. – Access mode: http://www.intechopen.com/
books/breakthroughs-in-melanoma-research/reactive-oxygen-species-in-the-biology-of-melanoma. – last accessed 06.06.2014.
79. Jacobson M.D., Raff M.C. Programmed cell death and Bcl-2 protection in
very low oxygen // Nature. – 1995. – Vol. 374, № 6525. – P. 814–816.
80. Jafari M., Salimi S., Nakhaee A., Zakeri Z., Sandooghi M., Saravani M.
Lack of Association between Catalase Gene C-262T Polymorphism and Systemic
Lupus Erythematosus // Zahedan J. Res. Med. Sci. – 2012. – Vol. 14, № 7. – P.
49–52.
81. Jenkins N. C., Grossman D. Role of Melanin in Melanocyte Dysregulation
of Reactive Oxygen Species [Electronic resource] // BioMed Res. Intern. – 2013. –
Vol. 2013, ID 908797. – 3 p. – Access mode: http://dx.doi.org/10.1155/2013/
908797. – last accessed 06.06.2014.
82. Jensen P.K. Antimycin-insensitive oxidation of succinate and reduced
94
nicotinamide-adenine dinucleotide in electron-transport particles. I. pH dependency and hydrogen peroxide formation // Biochim. Biophys. Acta. – 1966. – Vol.
122. – P. 157–166.
83. Kessel D. The role of the peripheral benzodiazepine receptor in the apoptotic response to photodynamic therapy // Photochem. Photobiol. – 2001. – Vol.
74. – P. 346–349.
84. Khodayari S., Salehi Z., Fakhrieh As.S., Aminian K., Mirzaei Gisomi N.,
Torabi Dalivandan S. Catalase gene C-262T polymorphism: importance in ulcerative colitis // J. Gastroenterol. Hepatol. – 2013. – Vol. 28, № 5. – P. 819–822.
85. Klaunig J.E., Kmendulis L.M., Hocevar B.A. Oxidative stress and oxidative damage in cancerogenesis // Toxicol. Pathol. – 2010. – Vol. 38. – P. 96–109.
86. Klingelhoeffer C., Kämmerer U., Koospal M., Mühling B., Schneider M.,
Kapp M., Kübler A., Germer C. T., Otto C. Natural resistance to ascorbic acid induced oxidative stress is mainly mediated by catalase activity in human cancer
cells and catalase-silencing sensitizes to oxidative stress [Electronic resource] //
BMC Complement. Altern. Med. – 2012. – 12: 61. – Access mode: http://www.biomedcentral.com/1472-6882/12/61. – last accessed 06.06.2014.
87. Klubo-Gwiezdzinska J.. Jensen K., Bauer A., Patel A., Costello Jr J.,
Burman K.D., Wartofsky L., Hardwick M.J., Vasko V.V. The expression of translocator protein in human thyroid cancer and its role in the response of thyroid cancer cells to oxidative stress // J. Endocrinol. – 2012. – Vol. 214. – P. 207–216.
88. Korkhov V.M., Sachse C., Short J.M., Tate Ch.G. Three-Dimensional
Structure of TspO by Electron Cryomicroscopy of Helical Crystals // Structure. –
2010. – Vol. 18. – P. 677–687.
89. Kroemer G., Reed J.C. Mitochondrial control of cell death // Nature Med.
– 2000. – Vol. 6. – P. 513–519.
90. Kutikhin A.G., Yuzhalin A.E., Volkov A.N., Zhivotovskiy A.S., Brusina
E.B. Correlation between genetic polymorphisms within IL-1B and TLR4 genes
and cancer risk in a Russian population: a case-control // Tumour Biol. – 2014. –
95
Vol. 35, № 5. – P. 4821 – 4830.
91. Letonja M., Nikolajević-Starčević J., Batista D. C., Osredkar J., Petrovič
D. Association of the -262C/T polymorphism in the catalase gene promoter with
carotid atherosclerosis in Slovenian patients with type 2 diabetes // Centr. Eur. J.
Med. – 2011. – Vol. 6, № 4. – P. 463.
92. Liu Y., Zha L., Li B., Zhang L., Yu T., Li L. Correlation between superoxide dismutase 1 and 2 polymorphisms and susceptibility to oral squamous cell
carcinoma // Exp. Ther. Med. – 2014. – Vol. 7, № 1. – P. 171-178.
93. Luo T.Y., Cheng P.C., Chiang P.F., Chuang T.W., Yeh C.H., Lin W.J.
188Re-HYNIC-trastuzumab enhances the effect of apoptosis induced by
trastuzumab in HER2-overexpressing breast cancer cells // Ann. Nucl. Med. –
2014.
94. Mak J.C. W., Ho S.P., Yu W.C., Choo K.L., Chu C.M., Yew W.W., Lam
W.K., Chan-Yeung M. Polymorphisms and functional activity in superoxide dismutase and catalase genes in smokers with COPD // Eur. Respir. J. – 2007. – Vol.
30. – P. 684–690.
95. Mansego M.L., Solar Gde M., Alonso M.P., Martínez F., Sáez G.T., Escudero J. C., Redón J., Chaves F.J. Polymorphisms of antioxidant enzymes, blood
pressure and risk of hypertension // J. Hypertens. – 2011. – Vol. 29, № 3. – P. 492–
500.
96. Marte B. Tumour heterogeneity // Nature. – 2013. – Vol. 501, № 7467. –
327 p.
97. Matés J.M., Sánchez-Jiménez F.M. Role of reactive oxygen species in
apoptosis: implications for cancer therapy // Int. J. Biochem. Cell Biol. – 2000. –
Vol. 32, №2. – P. 157 – 170.
98. Mayer G. Immunology: Innate (non-specific) Immunity [Electronic resource] // Microbiol. Immunol. On-Line . – USC School of Medicine, 2006. – Access mode: http://pathmicro.med.sc.edu/book/immunol-sta.htm. – last accessed
06.06.2014.
96
99. McKenna T. Oxidative stress on mammalian cell cultures during recombinant protein expression // Linköping Univercity, Institute of Technology, 2009. –
74 p.
100. Mendonça-Torres M.C., Roberts S.S. The translocator protein (TSPO)
ligand PK11195 induces apoptosis and cell cycle arrest and sensitizes to chemotherapy treatment in pre- and post-relapse neuroblastoma cell lines // Cancer Biol.
Therapy. – 2013. – Vol. 14, № 4. – P. 319–326.
101. Miranda-Vilela A.L., Alves P.C.Z., Akimoto A.K., Pereira L.C.S., De
Nazaré Klautau-Guimarães M., Grisolia C.K. The effect of hydrogen peroxideinduced oxidative stress on leukocytes depends on age and physical training in
healthy human subjects carrying the same genotypes of antioxidant enzymes' gene
polymorphisms // Am. J. Human Biol. – 2010. – Vol. 22, № 6. – P. 807–812.
102. Miwa S., Bruce K., Beckman B. Oxidative Stress in Aging: From Model
Systems to Human Diseases // New York: Humana Press. – 2008. – P. 11–36.
103. Mueller S., Riedel H.-D., Stremmel W. Direct evidence for catalase as
the predominant H2O2 -removing enzyme in human erythrocytes // Blood. – 1997.
– V. 90, № 12. – P. 4973-4978.
104. Nadif R., Mintz M., Jedlicka A., Bertrand J.P., Kleeberger S.R., Kauffmann F. Association of CAT polymorphisms with catalase activity and exposure to
environmental oxidative stimuli // Free Radical Res. – 2005. – Vol. 39, № 12. – P.
1345–1350.
105. Nadif R., Kleeberger S.R., Kauffmann F. Polymorphisms in manganese
superoxide dismutase and catalase genes: functional study in Hong Kong Chinese
asthma patients // Clin. Exp. Allergy. – 2006. – Vol. 36, № 8. – P. 1104–1105.
106. Nagasaka T., Sasamoto H., Notohara K., Cullings H. M., Takeda M.,
Kimura K., Kambara T., MacPhee D. G., Young J., Leggett B.A., Jass J.R., Tanaka
N., Matsubara N. Colorectal Cancer With Mutation in BRAF, KRAS, and WildType With Respect to Both Oncogenes Showing Different Patterns of DNA Methylation // J. Clin. Oncol. – 2004. – Vol. 22. – P. 4584 - 4594.
97
107. Nakamura K., Kanno T., Mokudai T., Iwasawa A., Niwano Y., Kohno
M. Microbial resistance in relation to catalase activity to oxidative stress induced
by photolysis of hydrogen peroxide // Microbiol. Immunol. – 2012. – Vol. 56, № 1.
– P. 48–55.
108. Newman R.A., Yang P., Hittelman W.N., Lu T., Ho D.H., Ni D., Chan
D., Vijjeswarapu M., Cartwright C., Dixon S., Felix E., Addington C. Oleandrinmediated oxidative stress in human melanoma cells // J. Exp. Therapeut. Oncol. –
2006. – Vol. 5. – P. 167–181.
109. Ogata M. Acatalasemia // Hum. Genet. – 1991. – Vol. 86, № 4. – P.
331–340.
110. Papadopoulos V., Baraldi M., Guilarte T.R. Translocator protein (18
kDa): New nomenclature for the peripheral-type benzodiazepine receptor based on
its structure and molecular function // Trends in Pharmacol. Sci. – 2006. – Vol. 27,
№ 8. – P. 402–409.
111. Putnam C.D., Arvai A.S., Bourne Y., Tainer J.A. Active and inhibited
human catalase structures: ligand and NADPH binding and catalytic mechanism //
J. Mol. Biol. – 2000. – Vol. 296. – P. 295–309.
112. Quan F., Korneluk R. G., Tropak M.B., Gravel R.A. Isolation and characterization of the human catalase gene // Nucleic Acids Res. – 1986. – Vol. 14, №
13. – P. 5321–5335.
113. Rahman K. Studies on free radicals, antioxidants, and co-factors // Clin.
Interventions in Aging. – 2007. – Vol. 2, № 2. – P. 219–236.
114. Recent Advances in the Biology, Therapy and Management of Melanoma [Electronic Resource] / Ed. by L. M. Davids. – InTech, 2013. – Access mode:
http://www.intechopen.com/books/recent-advances-in-the-biology-therapy-andmanagement-of-melanoma. – last accessed 06.06.2014.
115. Ree S.G., Chang T.-Sh., Bae Y.S., Lee S.-R., Kang W.K. Cellular Regulation by Hydrogen Peroxide // J. Am. Soc. Nephrol. – 2003. – Vol. 14. – P. 211–
215.
98
116. Reth M. Hydrogen peroxide as second messenger in lymphocyte activation // Nature Immunol. – 2002. – Vol. 3, № 12. – P. 1129–1134.
117. Ribble D., Goldstein N.B., Norris D.A., Shellman Y.G. Simple technique for quantifying apoptosis in 96-well plates // BMC Biotechnol. – 2005. –
Vol. 5. – P. 12.
118. Rodust P.M., Stockfleth E, Ulrich C, Leverkus M, Eberle J. UV-induced
squamous cell carcinoma--a role for antiapoptotic signalling pathways // Br. J.
Dermatol. – 2009. – Vol. 161, № 3. – P. 107-115.
119. Sander C.S., Hamm F., Elsner P., Thiele J.J. Oxidative stress in malignant melanoma and non-melanoma skin cancer // Br. J. Dermatol. – 2003. – Vol.
148, № 5. – P. 913–922.
120. Shim Ie-S., Momose Yu., Yamamoto A., Kim D.-W., Usui K. Inhibition
of catalase activity by oxidative stress and its relationship to salicylic acid accumulation in plants // Plant Growth Regulation. – 2003. – Vol. 39, № 3. – P. 285–292.
121. Sinha K., Das J., Pal P.B., Sil P.C. Oxidative stress: the mitochondriadependent and mitochondria independent pathways of apoptosis // Arch. Toxicol. –
2013. – Vol. 87. – P. 1157–1180.
122. Stern R.S., Lunder E.J. Risk of squamous cell carcinoma and methoxsalen (psoralen) and UV-A radiation (PUVA). A meta-analysis // Arch. Dermatol.
– 1998. – Vol. 134. – P. 1582–1585.
123. Strzelczyk J.K., Wiczkowski A. Oxidative damage and carcinogenesis //
Contemp Oncol (Pozn). – 2012. – Vol. 16, № 3. – P. 230–233.
124. Surinkaew S., Chattipakorn S., Chattipakorn N. Roles of mitochondrial
benzodiazepine receptor in the heart // Canadian J. Cardiol. – 2012. – Vol. 27, №
4. – P. 262e3 – 262e13.
125. Swalwell H., Latimer J., Haywood R.M., Birch-Machin M.A. Investigating the role of melanin in UVA/UVB- and hydrogen peroxide-induced cellular and
mitochondrial ROS production and mitochondrial DNA damage in human melanoma cells // Free Radic. Biol. Med. – 2012. – Vol. 52, № 3. – P. 626–634.
99
126. Taddei M.L., Giannoni E., Raugei G., Scacco S., Sardanelli A.M., Papa
S., Chiarugi P. Mitochondrial Oxidative Stress due to Complex I Dysfunction
Promotes Fibroblast Activation and Melanoma Cell // J. Signal Transduct. – 2012.
– Vol. 2012. – 10 p.
127. Tanimoto Y., Onishi Y., Sato Y., Kizaki H. Benzodiazepine receptor agonists modulate thymocyte apoptosis through reduction of the mitochondrial
transmembrane potential // Jpn. J. Pharmacol. – 1999. – Vol. 79. – P. 177–183.
128. Tefik T., Kucukgergin, C., Sanli, O., Oktar, T., Seckin, S., Ozsoy, C.
Manganese superoxide dismutase Ile58Thr, catalase C-262T and myeloperoxidase
G-463A gene polymorphisms in patients with prostate cancer: relation to advanced
and metastatic disease // BJU Intern. – 2013. – Vol. 112. – P. E406–E414.
129. Turrens J.F. Mitochondrial formation of reactive oxygen species // J.
Physiol. – 2003. – Vol. 522, № 2. – P. 335–344.
130. Valko M., Leibfritz D., Moncol J., Cronin M.T.D., Mazura M., Telser J.
Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease // Intern. J. Biochem. Cell Biol. – 2007. – Vol. 39. – P. 44–84.
131. Veetman L., Gavish M. The peripheral-type benzodiazepine receptor and
the cardiovascular system. Implications for drug development // Pharmocol. Therapeut. – 2006. – Vol. 110, № 3. – P. 503–524.
132. Xiaolong Qi, Jiahong Xu, Fei Wang, Junjie Xiao. Translocator Protein
(18 kDa): A Promising Therapeutic Target and Diagnostic Tool for Cardiovascular Diseases // Oxidative Med. Cell. Longevity. – 2012. – 9 p.
133. Yeliseev A.A., Kaplan S. A sensory transduser homologous to the
mammalian peripheral type benzodiazepine receptor regulates photosynthetic
membrane complex in Rhodobacter sphaeroides 2.4.1 // J. Biol. Chem. – 1995. –
Vol. 270. – P. 21167–21175.
134. Yin S.T., Latifah S.Y., Jhi B.F., Nurdin A., Yoke K.C., Rasedee A.,
Mustapha U.I., Norsharina I., Maznah I. Induction of apoptosis through oxidative
stress-related pathways in MCF-7, human breast cancer cells, by ethyl acetate ex-
100
tract of Dillenia suffruticosa [Electronic resource] // BMC Complement. Altern.
Med.. – 2014. – Vol. 14, № 55. – Access mode: http://www.biomedcentral.com/
1472-6882/14/55. – last accessed 06.06.2014.
135. Zamocky M., Furtmüller P.G., Obinger Ch. Evolution of Catalases from
Bacteria to Humans // Antioxid. Redox. Signal. – 2008. – Vol. 10, № 9. – P. 1527–
1548.
136. Zarbock R., Hendig D, Szliska C, Kleesiek K, Götting C. Pseudoxanthoma elasticum: genetic variations in antioxidant genes are risk factors for early
disease onset // Clin. Chem. – 2007. – Vol. 53, № 10. – P. 1734–1740.
137. Zhang S., Zhang S., Yin J., Li X., Zhang J., Yue R., Diao Y., Li H.,
Wang H., Shan L., Zhang W. Jacarelhyperol A induced apoptosis in leukaemia
cancer cell through inhibition the activity of Bcl-2 proteins // BMC Cancer. –
2014. – Vol. 14, № 1. – P. 689.