Федеральное государственное бюджетное учреждение науки
реклама
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г. Б. Елякова Дальневосточного отделения Российской академии наук На правах рукописи Чистюлин Дмитрий Константинович Выделение и характеристика порообразующих белков из Yersinia ruckeri 02.00.10 – биоорганическая химия диссертация на соискание учёной степени кандидата химических наук Владивосток – 2014 г. 1. ВВЕДЕНИЕ……………………………………………………………………………... 5 2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР Структура и свойства порообразующих белков наружной мембраны грамотрицательных бактерий и методы их исследования……………………................. 2.1. Строение наружной мембраны 8 грамотрицательных бактерий………………………………………………………………………….…. 8 2.2. Общая характеристика порообразующих белков грамотрицательных бактерий…………………………………………………………………………….... 9 2.2.1. Физико-химические свойства неспецифических поринов……………..… 9 2.2.2. Функциональная активность порообразующих белков наружной мембраны грамотрицательных бактерий……………………………..………. 10 2.3. Пространственная структура поринов грамотрицательных бактерий……...….... 11 2.3.1. Методы изучения пространственной структуры белков……………...…... 11 2.3.2. Пространственная организация молекул поринов…………………..…..… 15 2.3.3. Построение теоретических моделей пространственной структуры βбаррельных белков…………………………………………………………..…. 19 2.4. Способы получения изолированных поринов…………………………………..… 22 2.5. Конформационные переходы изолированных поринов………………………..… 24 2.6. Антигенная структура порообразующих белков наружной мембраны граморицательных бактерий……………………………………………………..… 28 2.6.1. Исследование антигенной структуры поринов иммунохимическими методами……………………………………………………………………..…. 28 2.6.2. Предсказание локализации антигенных детерминант………………......… 30 2.7. Регуляция экспрессии OmpF и OmpC поринов грамотрицательных Бактерий………………………………………………………………………………. 32 2.8. Характеристика и свойства антигенов Yersinia ruckeri........................................... 34 3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ…………………………………………………..….... 39 3.1. Получение неспецифических (OmpF- и OmpC- подобных) поринов наружной мембраны Y. ruckeri……………………………………………………………….… 40 3.1.1. Первичная структура OmpC– и OmpF поринов из Y. ruckeri....................... 40 3.1.2. Анализ состава фракций пориновых белков наружной мембраны Y. ruckeri, извлекаемых детергентами различной природы……………………….. 40 3.1.2.1.Экстракция поринов неионным детергентом октилполиоксиэтиленом………………………………………………….. 3.1.2.2.Экстракция ионным детергентом SDS и очистка фракции 41 пориновых белков……………………………………………………………..… 42 3.1.3. Изучение влияния условий культивирования (осмолярности и температуры) на экспрессию OmpF и OmpC-подобных поринов и их идентификация……………………………………………………………….…. 44 3.1.4. Выделение индивидуальных OmpF и OmpC поринов Y. ruckeri…..……… 47 3.1.5. Технологичный способ получения и очистки OmpF порина Y. ruckeri….. 47 3.2. Исследование функциональных свойств OmpF и OmpC поринов……………..... 49 3.2.1. Характеристика проводимости одиночных каналов OmpF и OmpC поринов из НМ Y. ruckeri.................................................................................... 49 3.2.2. Порообразующие свойства OmpF порина из НМ Y. ruckeri…………….... 50 3.3. Молекулярная структура и пространственная организация OmpF и OmpC поринов Y. ruckeri………………………………………………………………..…. 52 3.3.1. Характеристика топологических моделей OmpF и OmpC поринов Y. ruckeri. Анализ их первичной и антигенной структуры………………….… 52 3.3.2. Сравнительный анализ пространственной структуры OmpF и OmpC поринов Y. ruckeri……………………………………………………………… 56 3.3.3. 3D структура мономеров и тримеров OmpF и OmpC поринов Y. ruckeri…………………………………………………………………………… 59 3.4. Изменения в пространственной структуре OmpF и OmpC поринов Y. ruckeri под действием температуры…………………………………………..… 66 3.4.1. Сравнительный анализ изменений в молекулярной структуре и микроокружении ароматических флуорофоров в молекулах OmpF и OmpC поринов в процессе термоденатурации………………………..…………….. 66 3.4.2. Мониторинг изменений в пространственной структуре OmpF порина под действием температуры…………………………………………………..…… 69 3.5. Иммунологическая и иммунохимическая характеристика OmpF порина Y. ruckeri…………………………………………………………...…. 76 3.5.1. Иммуногенные и иммунохимические свойства OmpF порина Y. ruckeri………………………………………………………………………...… 76 3.5.2. Определение элементов антигенной структуры OmpF порина Y. ruckeri…………………………………………………………………..……..… 78 3.5.2.1.Характеристика рекомбинантных мутантных белков OmpF порина из НМ Y. pseudotuberculosis………………………………………………..... 78 3.5.2.2.Элементы антигенной структуры OmpF порина Y. ruckeri………..…. 80 3.6. Взаимодействие OmpF порина Y. ruckeri с клетками эукариот………………..… 84 4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ……………………………………………………. 87 4.1. Материалы………………………………………………………………………….. 87 4.2. Приборы и оборудование………………………………………………………….. 87 4.3. Общие и аналитические методы исследования физико-химических характеристик поринов……………………………………………………………. 87 4.4. ПЦР амплификация и секвенирование ompC и ompF генов……………………. 88 4.5. Получение изолированных поринов иерсиний………………………………….. 88 4.6. Спектроскопические методы исследования пространственной структуры поринов…………………………………………………………………………….. 89 4.7. Изучение порообразующей активности белка с помощью техники БЛМ……………………………………………………………………..… 90 4.8. Построение теоретических моделей поринов…………………………………… 91 4.9. Иммунохимические методы………………………………………………………. 91 4.10. Исследование взаимодействия поринов с клетками эукариот…………… 92 5. ВЫВОДЫ………………………………………………………………………………… 94 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ……………………………………………………………… 95 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ………………………………………………………………. 96 1. ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы исследования. Yersinia ruckeri – грамотрицательная бактерия, вызывающая иерсиниоз у рыб, известный также как «энтерит, сопровождающийся покраснением рта». Ежегодно этот микроорганизм является причиной больших экономических потерь в индустрии аквакультур. Однако, несмотря на значимость проблемы, пока мало известно как о механизмах патогенеза этого заболевания, так и о функционировании данного микроорганизма в целом, что препятствует разработке мер для эффективной борьбы с ним. Известно, что порообразующие белки наружной мембраны (порины) играют важную роль в таких аспектах функционирования бактериальных клеток как адаптация к условиям окружающей среды и межклеточные взаимодействия. Бактериальные порины - интегральные βструктурированные белки, предназначенные для пассивной диффузии гидрофильных молекул через наружную мембрану (НМ). Особенности структуры и поверхностная локализация в клетке обуславливают наличие у поринов и других функций, отличных от транспортной. Экспонированные на поверхности бактериальной клетки участки полипептидной цепи поринов, так называемые петли, формируют потенциальные сайты взаимодействия с клетками организма-хозяина, в том числе с клетками иммунной системы. Показано, что порины являются высокоиммуногенными компонентами НМ грамотрицательных бактерий. Антитела к ним обнаруживаются в сыворотке крови как после вакцинации, так и при естественном развитии инфекции. В связи с этим, выявление структурных особенностей поверхностных участков молекул поринов и установление их роли в формировании антигенных эпитопов, имеет важное значение для конструирования диагностических и вакцинных препаратов. Представляет интерес также способность поринов взаимодействовать с клетками эукариот. Так, известно, что порины проявляют свойства индукторов и ингибиторов апоптоза, способны связываться с Toll-подобными рецепторами, зачастую обладают высокой цитотоксичностью и способностью влиять на клеточный цикл. Однако биологические свойства порообразующих белков НМ бактерий до сих пор остаются мало изученными. Кроме вышеназванных задач, имеющих прикладное значение, структурно- функциональные исследования поринов НМ бактерий важны для химии мембранных βструктурированных белков в целом, для выяснения особенностей их пространственной организации, для установления участков структуры, ключевых для поддержания стабильности молекулы этих белков, а также особенностей их сборки и денатурации под действием температуры и химических агентов. Цели и задачи исследования. Настоящая работа является частью систематического исследования структуры и функции неспецифических поринов бактерий рода Yersinia, проводимого в лаборатории молекулярных основ антибактериального иммунитета ТИБОХ ДВО РАН им. Г.Б. Елякова. Она посвящена выделению и сравнительной характеристике пространственной структуры и функциональной активности OmpC и OmpF поринов Y. ruckeri, исследованию процесса денатурации OmpF порина под действием температуры и изучению его иммунобиологических свойств. Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи: • выделить и идентифицировать неспецифические OmpF и OmpC порины НМ Yersinia ruckeri; • изучить влияние условий культивирования на экспрессию этих белков; • сравнить физико-химические свойства, особенности пространственной организации молекул и функциональную активность OmpF и OmpC поринов; • исследовать процесс термоденатурации OmpF порина методами оптической спектроскопии, микрокалориметрии и компьютерного моделирования; • изучить иммуногенные свойства OmpF порина, выявить общие с поринами иерсиний элементы антигенной структуры; • исследовать характер взаимодействия OmpF белка с клетками эукариот. Научная новизна исследования. Впервые выделены индивидуальные OmpF и OmpC порины из наружной мембраны Y. ruckeri и проведена сравнительная характеристика их пространственной структуры и функциональной активности. Впервые показано, что термоденатурация OmpF порина проходит в несколько стадий. Впервые показана зависимость экспрессии исследуемых поринов и транскрипции соответствующих генов от условий окружающей среды. Впервые охарактеризованы иммунохимические свойства OmpF порина Y. rucke, выявлены общие антигенные эпитопы OmpF поринов иерсиний. Впервые исследовано влияние поринов Y. ruckeri на клеточный цикл злокачественных клеток человека и нормальных клеток тканей рыб. Практическая значимость работы. Полученные в работе данные о высокой иммуногенности OmpF и OmpC поринов Y. ruckeri при относительно низкой их цитотоксичности, а также обнаружение в структуре белков общих с другими поринами иммунодоминантных эпитопов позволяют рассматривать исследуемые порины как перспективные протективные антигены для борьбы с инфекцией вызываемой Y. ruckeri. Разработан технологичный способ получения очищенной фракции поринов, исключающий стадию гель-хроматографии. Это стало возможным при использовании ДНКазы из гепатопанкреаса крабов, содержащей примеси протеаз. Основные положения, выносимые на защиту: • OmpF и OmpC порины Y. ruckeri подобно неспецифическим поринам наружной мембраны иерсиний имеют различные физико-химические характеристики, отличительные особенности первичной и пространственной структуры и образуют в искусственном бислое разные по размеру каналы. • Транскрипция соответствующих генов и экспрессия исследуемых поринов зависят от условий культивирования бактерий. При пониженной и комнатной температуре в бессолевой среде преимущественно экспрессируется OmpF порин, введение в среду NaCl и увеличение температуры приводит к появлению заметного количества OmpC порина. • Структура OmpF порина обладает аномально высокой для неспецифических поринов термостабильностью и способностью восстанавливать функционально активное состояние в присутствии липидного бислоя даже после инкубации при 85 о С, температуре необратимого конформационного перехода. • Процесс термоденатурации тримера OmpF порина имеет несколько стадий, сопровождающихся на начальных этапах обратимыми изменениями в структуре наружных петель, а в дальнейшем перестройками на уровне третичной и четвертичной структуры белка, приводящими к образованию термостабильных мономеров порина. Различия в спектрах триптофановой флуоресценции исследуемых поринов обусловлены особенностями положений Trp212 в OmpF и Trp184 в OmpC порине. • В петлях L1 и L4 молекулы OmpF порина локализованы иммунодоминантные Вэпитопы, перекрёстно реагирующие с АГ детерминантами OmpF порина Y. pseudotuberculosis. • OmpF порин Y. ruckeri имеет низкую цитотоксичность и оказывает влияние на клеточный цикл как злокачественных, так и нормальных клеток. В низких концентрациях белок ингибируют S-стадию клеточного цикла для обоих типов клеток, а высокие концентрации вызывают апоптоз злокачественных клеток. 2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР Структура и свойства порообразующих белков наружной мембраны грамотрицательных бактерий и методы их исследования 2.1. Строение наружной мембраны грамотрицательных бактерий Основным структурным компонентом живой клетки являются биологические мембраны, которые поддерживают её структурную целостность и регулируют обменные процессы (поступление питательных веществ и выброс метаболитов). Кроме того, они служат для передачи сигналов между различными функционально важными участками клеточной поверхности. Цитоплазма клеток грамотрицательных бактерий защищена от окружающей среды 2-мя мембранами - внутренней (цитоплазматической) и наружной. Средний слой, неплотно прилегающий к внутренней мембране, представляет собой специфический биополимер, называемый пептидогликаном (ПГ), который обеспечивает жесткость клеточной стенки микроорганизма [1] (рис. 1). Он является гликопептидом, состоящим из остатков Nацетилглюкозамина и N-ацетилмурамовой кислоты, и может быть разрушен под действием лизоцима. Помимо этого, мембраны связаны между собой видимыми в электронный микроскоп зонами адгезии, или зонами контакта (всего в клетке существует 200-400 таких зон) [2]. Столь сложное строение клеточной стенки вызвано условиями обитания грамотрицательных бактерий. Чаще всего это гипотоническое окружение, способное вызвать лизис цитоплазматической мембраны. Например, бактерии сем. Enterobacteriaceae, обитающие в кишечнике человека, должны обладать каким-либо механизмом защиты цитоплазматической мембраны от детергентного действия желчных солей, жирных кислот и глицеридов. Кроме того, кишечная полость богата протеолитическими и липолитическими ферментами, а также гликозидами [1]. В состав НМ грамотрицательных бактерий входят белки, фосфолипиды и липополисахарид (ЛПС). Содержание этих основных элементов мембраны может весьма различаться, что зависит от вида исследуемых микроорганизмов, условий их культивирования и методов количественной оценки данных компонентов [3, 4, 5]. Фосфолипиды представлены фосфатидилэтаноламином, фосфатидилглицерином и дифосфатидилглицерином, или кардиолипином. ЛПС является специфическим компонентом НМ бактерий, занимая около 45% ее поверхности[6]. По своей химической природе ЛПС представляет собой амфифильную молекулу, содержащую гидрофобный липидный компонент и гидрофильную полисахаридную часть. В НМ бактерий ЛПС прочно, но не ковалентно связан с некоторыми белками (в частности, с поринами) [7]. Рис. 1 – Клеточная стенка грамотрицательных бактерий. 1 — внутренняя, или цитоплазматическая мембрана; 2 — пептидогликановый слой; 3 — периплазматическое пространство; 4 — молекулы белков; 5 — фосфолипид; 6- липополисахарид; 7 — интегральный белок, 8 – наружная мембрана. В НМ было обнаружено несколько основных типов белков, общее содержание которых достаточно велико. Прежде всего, это интегральные каналообразующие белки, которые обеспечивают поступление в клетку питательных веществ, а, возможно, и выброс продуктов жизнедеятельности, поскольку НМ, в соответствии с химической природой составляющих ее липидов, малопроницаема для гидрофильных веществ. Порообразующие белки, представляют собой своеобразную транспортную систему бактериальной клетки. Они были открыты в 1976 году [8], и с тех пор термин «порины» стал использоваться для обозначения целого класса белков, образующих в НМ диффузионные каналы для осуществления транспорта небольших гидрофильных молекул, участвующих в метаболизме бактерий. Впоследствии порины были обнаружены во всех исследованных видах грамотрицательных бактерий и даже в отдельной группе грамположительных, у которых есть богатая липидами клеточная стенка, подобная бислою. К этой группе относятся коринебактерии, микобактерии и нокардии (Corinebacterium, Micobacterium, Nocardia). 2.2. Общая характеристика порообразующих белков грамотрицательных бактерий 2.2.1. Физико-химические свойства неспецифических поринов Классической моделью изучения порообразующих белков является E. coli. Показано, что в клетках этой грамотрицательной бактерии синтезируются несколько типов поринов, три из которых (OmpF, OmpC, и PhoE) являются основными в количественном отношении [9]. Эти белки относятся к неспецифическим поринам, но проявляют некоторую селективность в отношении диффундирующих веществ: катионов (OmpC и OmpF) и анионов (PhoE). Четвёртый порин, LamB (мальтопорин), значительно отличается от трёх предыдущих, т.к. является специфическим порином, который служит для переноса мальтозы [10]. Дальнейшие исследования более чем сорока различных поринов позволили выявить их общие структурные и функциональные свойства. Молекулярная масса этих белков варьирует от 28 000 до 48 000 Да. Порины являются интегральными β-структурированными белками: содержание этого типа структуры белка достигает 60%. В нативной мембране они присутствуют, как правило, в виде тримеров. По своим физико-химическим свойствам порины представляют собой слабокислые белки, имеющие необычайно большое для интегральных белков количество полярных аминокислотных (АК) остатков. Водородные и ионные связи, вместе с гидрофобными взаимодействиями, играют существенную роль в стабилизации пространственной структуры поринов как в НМ, так и в изолированном состоянии. Именно этим обусловлена необычайная устойчивость этих белков к протеазам, повышенной температуре и другим денатурирующим факторам [11]. 2.2.2. Функциональная активность порообразующих белков наружной мембраны грамотрицательных бактерий Наиболее полно к настоящему времени охарактеризованы свойства каналов, образуемых поринами из E. coli. Эти каналы различаются как по размерам (размеры OmpC, OmpF и PhoE белков составляют 1.3; 1.4 и 1.2 нм соответственно), так и по селективности. Порины в мембране прочно связаны с липополисахаридом (ЛПС), и многие исследователи считают, что это взаимодействие очень важно для проявления функциональной активности белков. Пориновые каналы характеризуются способностью существовать в 2-х функционально различных состояниях: ион-проводящем открытом и ион-непроводящем закрытом состояниях. Неспецифические порины, такие как OmpF, способны к спонтанным флуктуациям между этими состояниями, хотя при нейтральных значениях pH и низких значениях мембранных потенциалов открытое состояние является доминирующим [12]. Функциональная значимость этих флуктуаций остаётся до конца невыясненной. Помимо рН среды и потенциала на мембране на «поведение» пориновых каналов существенное влияние оказывает изменение ионного состава среды [13]. Для исследования функциональных свойств поринов наиболее часто используется электрофизиологический метод. Плоские липидные бислои (известные также как черные, или бислойные липидные мембраны, сокращенно БЛМ) с реконструированными в них поринами были первым электрофизиологическим инструментом, примененным для этих целей. Они продолжают широко использоваться как для первоначального обнаружения порообразующей активности вновь тестируемых пориноподобных белков, так и для характеристики функциональных свойств исследуемых поринов. С помощью техники БЛМ Benz с соавторами [14] исследовали 12 различных поринов из грамотрицательных бактерий E.coli, Salmonella typhimurium, Pseudomonas aeruginosa. Большинство поринов образовывало большие водонаполненные ион-проводящие каналы с проводимостью одиночной поры между 1.5 и 6 нСм в 1М KCl. Ионы, используемые для тестирования структуры канала, при движении через пору имели такую же подвижность, что и при свободном движении в растворе. На основании этого проводимость одиночной поры использовали для определения эффективного размера канала исследуемых поринов, разброс полученных значений составил 1.0 – 2.0 нм. На основании результатов, полученных в ранних работах по изучению функциональных свойств поринов с помощью техники БЛМ [15], было сделано два очень важных вывода. Вопервых, по кривой записи тока невозможно определить изменения в проводимости искусственной мембраны, связанные с закрытием поры, и, во-вторых, зависимость проводимости БЛМ от приложенного напряжения в достаточно широком диапазоне является омической, то есть линейной. Однако при напряжении выше 150 мВ, как показали Schindler и Rosenbusch [16], линейная зависимость тока от потенциала, приложенного к БЛМ, нарушается. Детальное описание кинетических свойств канала обычно проводят с помощью так называемой техники patch-clamp [17]. Этот метод позволяет исследовать одиночную пору при более низком уровне шума и с большим временным разрешением, нежели техника БЛМ. Стеклянная пипетка диаметром 1-2 мкм помещается на поверхность клетки или липидной везикулы. Участок мембраны («patch» в дословном переводе означает «многослойный(ая) пакет/структура»), содержащий один или несколько каналов, входит внутрь пипетки и при подключении (clamp) мембранного потенциала поток ионов фиксируется с течением времени. Эта техника с успехом используется в экспериментах на живых клетках и сферопластах [18, 19], а также на липосомах, содержащих фрагменты цитоплазматической и НМ бактерий [20, 21]. В patch-clamp экспериментах порины «ведут себя» иначе, нежели в БЛМ. Так, величина проводимости одиночной поры значительно меньше (< 100 пСм в 100-150 мМ растворе KCl), а каналы остаются открытыми в течение значительно более короткого промежутка времени (20-30 с). Закрытие пор наблюдается при отрицательном потенциале, значительно меньшем по величине, чем в искусственном бислое 2.3. Пространственная структура поринов грамотрицательных бактерий 2.3.1. Методы изучения пространственной структуры белков Хромофоры белковых молекул (то есть химические группы в молекуле белка, ответственные за поглощение света на определенных длинах волн) можно разделить на три класса: пептидные группы, боковые группы аминокислотных остатков и простетические группы. Спектроскопические методы исследования вторичной структуры белка основаны на изучении спектров именно пептидных хромофоров, поскольку конформация пептидных групп и определяет тот или иной тип вторичной структуры белка: α-спираль, β -структуру и др. Изучение поглощения света пептидными группами белка обычно проводится в ультрафиолетовом и инфракрасном диапазонах. Как показывают эксперименты, простая адсорбционная спектроскопия белков в неполяризованном ультрафиолетовом свете мало пригодна для анализа вторичной структуры белка. Более ценную информацию можно извлечь из спектров кругового дихроизма белка. Третичная же структура обычно исследуется методом собственной белковой флоуресценции [22]. Спектры кругового дихроизма белков. Белки, как практически все биологические молекулы, вследствие своей пространственной асимметрии обладают оптической активностью. С помощью КД спектроскопии можно получить информацию о целом ряде особенностей пространственной структуры белковой молекулы, и в комбинации с другими методами КД играет значительную роль при изучении процессов сборки-разворачивания белков. Этим вопросам посвящено достаточно много обзоров [23 - 25] В случае белков главной целью измерения спектров КД является определение содержания в них вторичных структур разных типов. Если доля ароматических аминокислот в белке не очень велика, его оптическая активность в области от 180 до 240 нм определяется главным образом полипептидным остовом. Многочисленные эксперименты показали, что алифатические боковые группы аминокислотных остатков белка также не дают заметного вклада в спектр КД в этой области. Следовательно, в первом приближении белковую молекулу можно рассматривать просто как комбинацию участков полипептидного остова, находящихся в конформациях α-спирали, β-листов, изгибов и неупорядоченной структуры. Спектры различных типов вторичной структуры белка можно оценить по результатам измерения КД гомополипептидов известной конформации (например, поли-L-лизина), после чего определить вклад каждой из структур в спектр КД исследуемого белка. Однако такой подход имеет ряд больших недостатков. Во-первых, участки упорядоченной вторичной структуры модельных гомополипептидов имеют значительно большую длину, чем длина типичных участков в глобулярных белках. Во-вторых, их конформация может сильно отличаться от конформации, наблюдаемой у элементов вторичной структуры реальных белков. Кроме этого, среди гомополипептидов нельзя найти "стандартов" для β-изгибов. И, наконец, хотя вклад в КД от взаимодействий между хромофорами уменьшается как квадрат расстояния между ними, должен существовать определенный вклад от взаимодействия между участками с различной вторичной структурой. Эти взаимодействия нельзя адекватно смоделировать, рассматривая протяженные гомополимеры, поэтому на практике в качестве базисных берут спектры КД белков, структура которых известна из данных рентгеноструктурного анализа [2629]. Наиболее часто для расчета элементов вторичной структуры белков исследователи используют метод Провенчера [30] и программный пакет CdPro [31]. Собственная белковая флуоресценция. Флоуресцентная спектроскопия является одним из самых высокочувствительных методов, позволяющих детектировать очень низкие концентрации веществ и отличать одно вещество от другого. Основные преимущества флуоресцентных методов, например, при исследовании разворачивания белков заключаются в чувствительности сигнала к микроокружению флуорофора, возможность использования различных характеристик флуоресцентных сигналов, возможность работать широком диапазоне концентраций, в котором отношение сигнал : шум является достаточно высоким, в быстром ответе и возможности приспособления этого метода к различным типам проб и кювет [32]. В связи с этим, флоуресцентная спектроскопия является чрезвычайно информативным методом, позволяющим получать данные о структурных свойствах, конформационной подвижности, положениях флоуресцирующих остатков в анализируемой биомолекуле, а также другие сведения о межмолекулярных взаимодействиях. В белках флоуресцирующими аминокислотами являются триптофан, тирозин и фенилаланин. При поглощении фотона хромофорной молекулой в ней происходит перераспределение электронной плотности и возрастает дипольный момент. В возбуждённом состоянии молекула может взаимодействовать с растворителем или другими близко расположенными в пространстве АК остатками. Эти взаимодействия специфически изменяют спектр излучаемой энергии, фиксируемый спектрофлуориметром. Полученные таким образом в ходе экспериментов спектры несут информацию о положениях остатков флоурофоров по отношению к другим группам боковых цепей аминокислот. Используя эти спектры можно судить об изменениях третичной и четвертичной структуры белка в процессах его взаимодействия с другими молекулами или под действием денатурирующих агентов, включая температуру [33]. При исследовании денатурации белков наиболее широко используемым флуорофором являются остатки триптофана. Несмотря на то, что индольная группа триптофана характеризуется относительно невысокими значениями коэффициента поглощения и квантового выхода флуоресценции, тем не менее, ее флуоресцентные свойства достаточно чувствительны к микроокружению. И эти преимущества с избытком перекрывают недостатки этого флуорофора при изучении разворачивания белков. В случае нативных белков квантовый выход флуоресценции индивидуальных остатков триптофана в белке, содержащем один остаток триптофана на одну молекулу, колеблется в широком диапазоне 0.01 – 0.40 [34]. Максимум эмиссии таких белков колеблется от 308 нм в случае азурина до приблизительно 350 нм в случае полностью доступного растворителю остатка триптофана [34 - 36]. Флуоресцентные свойства развернутых белков различаются в значительно меньшей степени. Все авторы, которые определяли его получали величину около 0.1, максимум эмиссии триптофановых остатков развернутых белков близок к 350 нм. Таким образом, при разворачивании эмиссия белка обычно сдвигается в сторону больших значений длин волн, а квантовый выход может как снижаться, так и повышаться. Широкий триптофановых диапазон остатков квантовых в белках выходов обусловлен и положений различными максимума типами эмиссии взаимодействий возбужденных индольных групп с микроокружением в разных белках. Значительное внимание уделялось разработке подходов к интерпретации флуоресцентных характеристик триптофановых остатков в белках, а также связи получаемых данных со структурными особенностями [37 - 40]. Наиболее широко распространенной точкой зрения является предположение о том, что эмиссия триптофановых остатков сдвинута сильнее в область более коротких волн, если индольную группу окружают другие неполярные боковые цепи аминокислот, а батохромный сдвиг объясняется взаимодействием возбужденного состояния с полярными молекулами растворителя или другими полярными функциональными группами. Крайне низкий квантовый выход триптофановых остатков в нативном белке указывает на наличие каких-либо внутримолекулярных реакций тушения. В работах ряда авторов [41 - 43] было показано, что пептидная связь и боковые цепи ряда аминокислот выступают в роли тушителей при непосредственном контакте. Что касается положения максимума флуоресценции, предполагается, что оно может быть связано со степенью электростатической стабилизации и дестабилизации возбужденной индольной группы (в возбужденном состоянии разделение зарядов выше, чем в невозбужденном), а также с наличием заряженных групп в микроокружении флуорофора. Анализ многочисленных спектров триптофановой флоуресценции белков и данных по тушению флоуресценции внешними факторами позволило Бурштейну с соавторами [44, 45] сформулировать модель дискретных состояний остатков триптофана в белках. Эта модель выделяет пять наиболее вероятных спектральных форм остатков триптофана. Спектральная форма А соответствует излучению невозмущённого индольного хромофора в нейтральном гидрофобном окружении внутри белковой глобулы. Это очень редко встречающаяся в белках форма, обнаруженная пока лишь у двух белков – азурина и бактериородопсина. Она наблюдается, когда непосредственно около индольного кольца нет ни одной полярной группы боковых цепей АК. Спектральная форма S соответствует излучению индольного хромофора, локализованного внутри белковой глобулы и образующего эксиплекс 1:1 с какой-то ближней полярной белковой группой. В чистом виде такая форма не встречается, сопровождаясь вкладом спектра класса I (см. ниже). Спектр класса S характеризуется максимумом при 316 нм, и довольно редко встречается на практике. Спектральная форма I соответствует излучению индольного хромофора, локализованного внутри белковой молекулы, образующего эксиплекс 2:1 с ближайшими полярными группами белка [45]. Максимум такого спектра находится на 330 нм. Спектральная форма II соответствует излучению хромофора на поверхности белка в контакте с молекулами связанной воды, подвижность которых ниже чем подвижность свободных молекул. Соответствующий спектр имеет максимум при 340 нм, и очень часто встречается в белках. Спектральная форма III соответствует излучению индольного хромофора, локализованного на поверхности белка в контакте с молекулами свободно релаксирующей воды. Спектр триптофановых остатков класса III почти совпадает со спектром излучения свободного триптофана в воде и имеет максимум при 350 нм. Такие остатки наиболее часто встречаются в развёрнутых белках и лишь иногда в нативных. Модель дискретных состояний триптофановых остатков является статистической, т. е. нахождение остатков триптофана в окружении, приводящем к реализации выше перечисленных спектральных форм, является более вероятным, чем нахождение в другом окружении. Тем не менее, анализ формы спектров флуоресценции белков на основе этой модели часто даёт полезную информацию о локализации триптофановых остатков. Такой анализ проводится с помощью компьютерной программы, которая аппроксимирует суммарный спектр спектрами триптофанилов классов S, I, II, III путём вариации их относительных вкладов [46]. Основным принципиальным вопросом, который необходимо решить исследователю, изучающему разворачивание белка, является ли этот процесс одно- или многостадийным. Одностадийная модель является самой простой для описания конформационных переходов в белках. Однако для двух- или многостадийных переходов необходимо сравнение двух или более различных типов данных, регистрируемых в процессе разворачивания белка. Это является классическим способом разграничения одно- или многостадийного процесса. Например, описан такой подход, который включает совместное использование КД и флуорометрии, эти параметры регистрируются одновременно на одном приборе [47]. 2.3.2. Пространственная организация молекул поринов Первый кристалл OmpF порина, достаточный по размерам для проведения рентгеноструктурного анализа, был получен почти 30 лет назад, в 1980 г. [48]. Однако наиболее значимым достижением в истории исследования поринов грамотрицательных бактерий, несомненно, стала расшифровка данных, полученных с помощью электронной дифракции и рентгеноструктурного анализа для тримера из Rhodobacter capsulatus [49, 50]. Она была осуществлена только спустя 10 лет и стала основой современных представлений о пространственной структуре порообразующих белков [51 - 54]. Рентгеноструктурный анализ интегрального мембранного белка из R. capsulatus показал, что основным структурным элементом поринов является так называемый β-баррель, сформированный 16-тью β-тяжами [55]. Эта часть структуры поринов представляет собой наполненный водой трансмембранный канал и характеризуется значительной степенью гомологии аминокислотной последовательности. Schulz [51] сформулировал основные принципы построения молекулы барреля: • Все β-стрэнды антипараллельны и локально взаимодействуют с соседними β- тяжами. • N- и С- концы полипептидной цепи порина смыкаются в пределах β-стрэнда, ближе к периплазматическому пространству, разграничивая первый и последний четный стрэнд. • Образование четвертичной структуры порина (тримеризация) происходит таким образом, что неполярный кор имеет тримерную ось, а центральная часть тримера белка представляет собой водорастворимый белок. • Внешние участки полипептидной цепи белка, связывающие β-стрэнды, представляют собой длинные петли, имеющие название L1, L2 и т.д., а со стороны периплазматического пространства тяжи соединены короткими изгибами, называемыми Т1, Т2 и т.п. • Если развернуть баррель в плоскости и расположить так, чтобы периплазматическая часть была внизу, то полипептидная цепь порина будет укладываться справа налево. • Во всех поринах сужение барреля в центральной части происходит из-за расположения внутри его самой длинной петли L3. • Для контакта с неполярной внутренней частью мембраны на поверхности молекулы порина существуют гирлянды из алифатических боковых цепей АК остатков, что характерно для всех β-баррельных белков. • Вариабельность последовательности аминокислот в трансмембранных участках β- барреля порина более высока, нежели в водорастворимых белках, особенно во внешних петлях. • Значительно более длинные петли, расположенные с внешней стороны мембраны, свернутые, как правило в α-спираль или имеющие неупорядоченную структуру (см. рис. 2), имеют небольшую степень гомологии и различаются по функциональным свойствам. На рис. 2 представлена структура тримера OmpF порина E coli. Мономер белка представляет собой эллипсообразный в сечении β-складчатый цилиндр (баррель), состоящий из антипараллельных β-тяжей (или стрэндов), соединенных так называемыми петлями, участками полипептидной цепи белка с неупорядоченной и/или α-спиральной структурой. Рис. 2 – Пространственная структура OmpF порина E.coli.А – вид поринового тримера сверху (в направлении, перпендикулярном плоскости мембраны); В – вид поринового мономера сбоку (по направлению стрелки на рис.2А); С – вид поринового мономера сверху. В интактной мембране бактерий обнаружены гексамеры и наномеры поринов [56]. Однако тример рассматривают как основную функциональную единицу (гидрофильную пору) поринов в структуре НМ микроорганизмов [57 - 59]. В качестве отдельных субструктурных элементов, в совокупности моделирующих структуру поринового канала можно выделить: экстрацеллюлярные (внешние) устье и вестибюль, зону констрикции (сужения) канала и периплазматические (внутренние) вестибюль и устье. (рис. 3) Эти элементы у различных поринов могут отличаться по основным и специализированным функциям. В первом случае, изменение строения того или иного элемента может определять геометрию канала в целом и, соответственно, предел эксклюзии конкретной поры, во втором - может иметь место увеличение потока специфических молекул, проходящих через канал, за счет, например, наличия соответствующих сайтов связывания. Как правило, внешний вестибюль представляет собой конусообразную структуру с широким входом (устьем). Длина вестибюля до зоны констрикции поры может быть различной: от 10 Ả у порина из R. capsulate до 20 Ả у поринов E. coli и R. baltica. Такое уменьшение длины вестибюля в случае порина из R. capsulate происходит за счет формирования «объединенного» устья, образованного всеми тремя мономерами. Рис. 3. Схематическое изображение поринового канала. Петли, ограничивающие вход во внешний вестибюль, содержат большое количество заряженных аминокислотных остатков. Распределены они таким образом, что вместе с зарядами внутри поры формируют градиент потенциала поринового канала. Мономеры поринов образуют множество контактов между собой с помощью именно этих участков полипептидных цепей, выступающих за пределы домена, погруженного в мембрану. Эти контакты между мономерами стабилизированы гидрофобными и полярными взаимодействиями. Значительная доля подобных взаимодействий существует вдоль петли L2, которая направлена в сторону от «своего» мономера, частично закрывая вход в пору соседнего мономера. Например, остаток глутаминовой кислоты (Е71), расположенный в средней части L2, называемой иначе «запирающей» петлей, образует солевые мостики с R100 и R132, локализованными в основании петли L3 соседнего мономера. Эти взаимодействия обеспечивают необычайно высокую стабильность тримерной структуры порина, особенно важны они для термоустойчивости белка [60]. Другая, самая длинная петля L3, в отличие от остальных, выходящих за пределы барреля, погружена в полость поры до середины, ограничивая, тем самым, ее размер и образуя сужение, так называемую «зону констрикции», или «глазок поры». Именно этот очень небольшой (10 Ả длиной и 5-10 Ả шириной, в зависимости от степени гидратации) сегмент канала ответственен за ограничения по размеру/мол. массе диффундирующих веществ. Заряженные остатки, локализованные в области «глазка», значительно влияют на ионоселективность и проницаемость канала, например, образование водородных связей между полярными группами боковых цепей полипептидной цепи порина препятствует продвижению солютов. Большое значение имеет также химическая природа диффундирующих веществ. Примечательно, что петля L3 содержит пептид PEFGG, имеющий высокую степень косервативности в АК последовательности бактериальных поринов [61]. Пересекает зону констрикции достаточно сильное поле, образованное электростатическим взаимодействием, с одной стороны, кислыми АК остатками, входящими в состав L3, а с другой, кластером основных АК остатков, локализованных внутри барреля на противоположной стороне. Кроме того, по мнению ряда исследователей, изменение конформации петель L3, L5, L7, L8 в значительной степени влияет на эффективность диффузии через пору [62]. Таким образом, главной структурной особенностью поринов оказалось то, что в их полипептидной цепи отсутствует достаточно протяженная последовательность гидрофобных АК остатков, подобная той, что «прошивает» мембранный бислой в случае α-спирализованных мембранных белков [63]. Внешняя поверхность барреля поринов, как и следовало ожидать, исходя из принципов построения интегральных мембранных белков, «занята» липофильными боковыми цепями аминокислотных остатков. Одной из наиболее впечатляющих особенностей пространственной организации тримера порина из R. capsulatus является присутствие большого числа ароматических аминокислотных остатков на обеих сторонах (внешней и внутренней) границы липида с водной средой [52]. Предполагается, что эти структуры защищают конформацию полипептидной цепи белка от возмущающих флуктуаций мембраны. Субструктурные элементы, определяющие геометрию поры поринов из различных бактерий, имеют как общие структурные черты, так и отличия. Именно они, а также взаимодействие зарядов, сосредоточенных во внешнем вестибюле, и поперечного поля, ориентированного вдоль оси поры, определяют селективные свойства поринового канала. 2.3.3. Построение теоретических моделей пространственной структуры β- баррельных белков Среди белковых структур, представленных в банках данных, структуры мембранных белков составляют лишь малую толику, менее 1% [64]. Одним из серьезных препятствий для прогресса в этой области является недостаток знаний о способах укладки полипептидной цепи и образования четвертичной структуры этих белков in vitro. Это связано со значительными трудностями при получении кристаллов мембранных белков и при исследовании их структуры с помощью спектроскопии ЯМР. В силу этих причин развитие компьютерных методов для предсказания пространственной структуры мембранных белков весьма востребовано, а использование теоретических моделей для детализации молекулярной организации отдельных функционально значимых участков этой структуры получает все большее распространение. Порины до сих пор остаются одними из немногих белков НМ бактерий, для которых известна кристаллическая структура. Поскольку трансмембранный кор, образованный β- стрэндами барреля, является наиболее консервативной частью молекулы белка, авторы, как правило, используют эти участки для идентификации поринов [65]. Однако сравнение АК последовательности поринов достаточно сложная задача из-за наличия внешних петель, соединяющих β-тяжи, которые претерпевают очень быстрые мутационные изменения в результате контактов с элементами окружающей среды, такими как антитела, компоненты врожденной системы иммунитета, бактериоцины и фаги. Как отмечает Ferenci [66], не существует простого алгоритма, с помощью которого можно было бы удовлетворительно справиться с определением местоположения β-стрэндов. Сведения об общих принципах строения поринов применяются при поиске генов, кодирующих порообразующие β-структурированные белки в исследуемых организмах. Существует, например, подход, основанный на определении наиболее типичных черт первичной структуры первую очередь близкородственных поринов разных групп. Так, порины энтеробактерий содержат характеристичную последовательность PEFGGD в петле L3. По вышеуказанному принципу построена одна из современных программ, позволяющих сделать отнесение искомого белка к β-баррельным белкам НМ грамотрицательных бактерий [67]. Эта программа BOMP (beta-barrel outer membrane protein predictor) и основана на анализе двух характерных структурных признаков, используемых для распознавания вышеуказанного типа белков. Первым является С-концевой фрагмент полипептидной цепи белков, типичный (консервативный) для большинства β-структурированных интегральных протеинов. В качестве второго отличительного признака используется определенная АК последовательность, содержащая остатки, типичные для трансмембранных участков (β-стрэндов) белка. Обнаружено, что точность предсказания составляет до 80%, если при тестировании используется сравнение с аннотированными в SwissProt базе данных внутриклеточными белками E. coli (788 АК последовательностей) и S. typhimurium (366 АК последовательностей). Среди 4346 полипептидов, составляющих общее количество белков E. coli, с помощью BOMP идентифицировано 103 белка с типичными признаками β-баррельных белков. У 36 из них с помощью программы BLAST не было обнаружено подобия с внутриклеточными белками, аннотированными в SwissProt базе данных. Количество интегральных β-баррельных белков в протеомах 10 различных бактерий составляло от 1,8 до 3%. Программа BOMP доступна на сервере http://www.imtech.res.in/raghava/tbbpred. На протяжении последнего десятилетия усилия исследователей в области биоинформатики были направлены на усовершенствование подходов при анализе первичной структуры мембранных белков, собранных в базах данных, и разработку новых предсказательных программ. В случае трансмембранных белков это, прежде всего, коснулось так называемого метода множественного выравнивания АК последовательностей, основанного на детальном анализе первичной структуры белков. Он явился основой для достаточно точного предсказания вторичной структуры белков [68]. Однако для уточнения более тонких деталей пространственной организации трансмембранных белков требовалась информация о первичной структуре как можно большего их числа. Применение метода множественного выравнивания АК последовательностей привело к прорыву в области компьютерного моделирования и сделало возможным успешное построение 3D-структур мембранных белков. Корректно проведенное выравнивание последовательности исследуемого белка с белками с известной пространственной структурой является ключевой стадией при сравнительном моделировании. Достаточно эффективным в этом случае является так называемый итеративный (основанный на повторении) подход, учитывающий как локальные, так и общие характерные черты сравниваемых белков. В работе [69] авторы применили его, используя следующие базы данных: HOMSTRAD, содержащую АК последовательности гомологичных белков, и COMPASS, в которой собрана информация о суперсемействах белков. Выявление консервативных структурных фрагментов анализируемого белка существенно облегчило отнесение его к определенному семейству (суперсемейству) и оптимальный выбор гомологичного белка, пригодного в качестве матрицы для моделирования. Итеративный подход предполагает построение теоретической модели исследуемого белка на основе выполненного множественного выравнивания его последовательности, а затем реконструкции полученной структуры. Повторение реконструкции (отсюда и название метода) осуществляется до достижения оптимальной структуры в формате программы JOY. Очень мало известно о преференциях во взаимодействии АК остатков, входящих в состав соседних стрэндов β-барреля. Jackups и Liang разработали вероятностную модель для количественной оценки взаимодействия АК остатков, находящихся в различных частях пространственной структуры и участвующих в интерстрэндовых контактах между парами АК остатков [70]. Во внимание были приняты сильные и слабые водородные связи и другие взаимодействия между боковыми цепями АК остатков. Оказалось, что если укладка αспирализованных белков, подчиняется правилу, «положительно зараженные АК внутри», то в случае β-баррельных белков в расположении таких остатков как Arg и Lys наблюдается иная картина: они предпочтительно локализуются в экстрацеллюлярных частях β-тяжей и не встречаются вблизи периплазматического пространства. В структуре белка существуют пары АК, связанные сильными водородными связями (например, Gly - ароматическая АК) и пары, не связанные Н-связями (ароматическая АК - ароматическая АК). Обнаружено, что Phe и Tyr участвуют в образовании ароматического пояса, заслоняющего Gly от полярного окружения. Авторы утверждают, что эти взаимодействия необходимо учитывать при определении участков полипептидной цепи β-баррельных белков, приходящихся на β-стрэнды. Разработанная ими шкала предпочтительных взаимодействий весьма полезна для предсказания пространственной структуры с помощью компьютерных программ, исследования механизма и моделирования процесса фолдинга мембранных β-баррельных белков. С помощью Веб-сервера transFold, использующего статистический потенциал, который характеризует взаимодействие (ориентацию) боковых цепей АК между соседними β-тяжами барреля, можно предсказывать супервторичную структуру трансмембранных белков [71]. В настоящее время этот подход является уникальным, так как он позволяет предсказать все возможные конформации исследуемого белка, а затем, применяя динамическое моделирование, определить минимизированную по энергетическим параметрам супервторичную структуру. Несмотря на значительные успехи методов биоинформатики топологический анализ белков НМ бактерий оказался значительно более трудоемким, чем предполагалось. В связи с этим применение предсказательных методов для построения пространственной структуры белков может быть успешным только при комплексном использовании экспериментальных и теоретических подходов. Иными словами, теоретическая модель, полученная в результате предсказания различных уровней структуры белка по данным его АК последовательности, должна быть скорректирована с учетом экспериментальных данных иммунохимического анализа и/или функциональной активности. Например, для того, чтобы определить, какой конкретно структурный домен влияет на каналообразующие свойства, стабильность тримерной структуры белка, связывание моноклональных антител или бактериофагов, необходимо получение мутантных и/или гибридных белков и изучение их свойств. 2.4 Способы получения изолированных поринов Для осуществления физико-химической характеристики с помощью оптических методов и изучения иммунохимических свойств белков, а также их успешной кристаллизации, необходимо получение достаточного количества препарата, содержащего макромолекулы, гомогенные как по химической, так и по пространственной структуре. В случае мембранных белков выполнение этих условий представляют собой непростую задачу, поскольку объем мембраны ограничен, а ее белковый состав чрезвычайно чувствителен к изменению внешних условий. Выделение поринов из бактериальной НМ представляет собой двустадийный процесс: солюбилизацию и очистку [72]. На первой стадии получения изолированных поринов используется классический способ, применяемый для переведения интегральных мембранных белков из анизотропной среды в изотропную. Способ этот заключается в переводе поринов в мицеллы детергентов, представляющие собой амфифильные соединения и образующие в водных растворах изотропные мицеллы. Порины переходят в солюбилизированное состояние, взаимодействуя с гидрофобной частью молекул детергентов. Если подходить строго к терминологии, растворы мембранных белков не могут считаться монодисперсными, такими как гомогенные растворы водорастворимых белков. Кроме того, мицеллы детергентов являются далеко не идеальной системой для поддержания мембранных белков в термодинамически стабильном и функционально активном состоянии. Одной из причин этого является тот факт, что извлечение мембранных белков из НМ бактерий с помощью детергентов представляет собой достаточно жесткую процедуру, часто приводящую к значительным аберрациям в конформации белка. В современной литературе упоминаются новые подходы к решению проблемы стабилизации мембранных белков в растворе, они связаны с использованием поверхностно-активных веществ недетергентной природы, например амфипатических полимеров. По сравнению с детергентами последние имеют ряд преимуществ и в плане переведения мембранных белков в раствор, и в сохранении их функциональной активности [73]. Для поддержания относительно стабильного состояния порина в комплексе с детергентом присутствие последнего в растворах необходимо и на стадии очистки. Как правило, для очистки поринов используют традиционные методы белковой химии: гельпроникающую концентрирования и ионообменную белка хроматографию, используют осаждение хроматофокусирование. 50 - 66% этанолом Для и ультрацентрифугирование. Гомогенность полученного препарата белка контролируют с помощью SDS, ПААГ-электрофореза и N-концевого анализа. Следует отметить, что при получении раствора очищенного порина конечная концентрация детергента в нем, как правило, остается неизвестной [74]. Во-первых, не все детергенты могут быть легко определены количественно. Во-вторых, несмотря на то, что конечной стадией очистки порина является диализ, в отношении многих детергентов трудно достичь равновесия их концентрации по обе стороны мембраны. Это происходит от «неспособности» мицелл детергентов легко проникать через мембрану, обычно используемую для диализа мембранных белков, и, вследствие этого, имеющую определенные ограничения в проницаемости. Кроме того, молекулы детергента, которые прочно связываются с белком при образовании смешанных мицелл, очень медленно приходят в равновесие со свободными молекулами детергента, находящимися в исходном растворе. Все эти обстоятельства делают весьма неопределенной информацию о содержании детергента и, соответственно, соотношении детергент/белок в полученном препарате, что может кардинальным образом повлиять на результаты структурных исследований мембранных белков. Что касается конкретно неспецифических поринов НМ бактерий, методы их извлечения и очистки интенсивно развивались с середины 70-х до середины 80-х годов прошлого столетия, особенно углубленно над этой проблемой работали R.M. Garavito и J.P. Rosenbusch. Они подобрали условия для экстракции порина из E. coli и осуществили кристаллизацию белка [75]. Тримеры порина были получены в функционально активном соcтоянии с помощью неионного детергента октилполиоксиэтилена (РОЕ). По свидетельству авторов необычная устойчивость белка по отношению к действию детергентов, повышенной температуры, а также способность к сохранению стабильности в широком диапазоне значений рН позволили опробовать разнообразные условия для кристаллизации белка. За последние годы список ионных и особенно неионных детергентов, используемых для получения солюбилизированных поринов, значительно расширился. Однако, несмотря на разнообразие экстрагирующих агентов, существует, по сути дела, только два принципиально различных подхода для извлечения этих белков из мембраны. Автором первого является Rosenbusch [76]. Метод включает в себя получение фракции клеточных стенок и последующую дифференциальную экстракцию: сначала цитоплазматических белков (с помощью тритона Х-100), а затем экстракцию комплекса ПГпорин с последующим разрушением комплекса растворами SDS при повышенной температуре и получением изолированных поринов. В основе второго метода, разработанного Нюрминен [77], лежит расщепление ПГ слоя лизоцимом с последующим осаждением порина при рН 6.0. Предполагается, что в этом случае конформация изолированного порина максимально приближена к состоянию белка в нативной мембране, поскольку разрыв связи ПГ-порин происходит в более мягких условиях. 2.5. Конформационные переходы изолированных поринов Понимание основ стабильности структуры белков остается фундаментальной проблемой физико-химической биологии. Более того, эти знания являются важными для многочисленных биомедицинских применений, например, приготовление стабильных терапевтических препаратов с использованием белков и лечение различных патологий, вызываемых мутирующими нестабильными белками [78 - 80]. И, несмотря на значительный интерес и внимание исследователей к проблеме, удовлетворительное понимание того, как белок образует (формирует) соответствующую конформацию, до сих пор далеко не полно. Как правило, вторичная структура водорастворимых белков имеет невысокую стабильность, которая в значительной степени усиливается за счет взаимодействий на уровне третичной и четвертичной структуры белка. В процессе фолдинга белков такого типа наблюдаются экстенсивные взаимодействия внутри белковой молекулы, приводящие к образованию переходного конформационного состояния (интермедиата), структурно очень схожего с нативным белком. В случае белков, обладающих «закрепленной» вторичной структурой (к которым относятся и трансмембранные порины), процесс фолдинга становится более иерархичным. Конформационные интермедиаты таких белков, образующиеся в процессе сборки, обладают прочной сеткоподобной структурой и состоят из доменов с заранее сформированной вторичной структурой [81]. Эти особенности, присущие пориновым белкам, предопределяют высокую стабильность их молекул и механизмы денатурации, значительно отличающиеся от таковых водорастворимых белков. Процесс денатурации мембранных белков в растворах детергентов подобен разворачиванию сложных мультидоменных белков [82]. В отличие от водорастворимых глобулярных белков, при денатурации которых определяют три основные формы белка (исходную нативную, переходную, так называемую «расплавленную глобулу», и полностью денатурированную, представляющую собой статистический клубок), процесс денатурации мембранных белков является многоступенчатым. Особенностью его является появление целого ряда стабильных интермедиатов белка, которое предшествует образованию «расплавленной глобулы». Эти интермедиаты представляют собой частично развернутые полипептидные цепи с промежуточной степенью разрушения третичной структуры белка, иными словами с конформацией, отличающейся и от нативной формы белка, и от состояния «расплавленной глобулы». Примечательным является и тот факт, что конформация конкретного мембранного белка в частично развернутой и/или денатурированной форме в значительной степени зависит от условий денатурации. В литературе известен целый ряд примеров, иллюстрирующих этот экспериментальный факт [83, 84]. Порообразующие белки отличаются высоким содержанием (до 42%) полярных АК остатков. В связи с этим, по образному выражению Розенбуша [85], не только гидрофобные, но и электростатические взаимодействия участвуют в образовании своеобразной «сети», прочно связывающей отдельные участки молекулы белка, что обеспечивает поринам необычную для трансмембранных белков стабильность. Они проявляют высокую термоустойчивость, а также устойчивость к действию органических растворителей, хаотропных агентов и к протеолизу. Основные физико-химические характеристики этих белков, так же, как и конформационные превращения поринов в присутствии стандартных денатурирующих добавок, в настоящее время достаточно изучены. В изолированном состоянии в растворах детергентов порины сохраняют тримерную структуру и высокое содержание β-структуры (до 80 %), присущие им в НМ, даже при повышенной температуре. Однако в литературе встречаются сообщения о том, что диссоциация олигомерной структуры поринов ряда микроорганизмов может наблюдаться уже на стадии солюбилизации НМ бактерий [86]. Термоденатурация изолированных поринов, приводящая к диссоциации олигомеров на мономеры с одновременной их денатурацией и к потере белком функциональной активности, считается необратимой. Для поринов из разных источников она может происходить при различных температурах, от 70 до 95oC [87]. Эта, так называемая критическая температура термоперхода белка существенно зависит от природы детергента, который используется для получения раствора порина. В ряде работ [88 - 90] показано, что в растворах SDS (при концентрации детергента ниже мицеллярной) при комнатной температуре большинство поринов из разных источников сохраняет тримерную структуру. Нагревание в интервале температур ниже температуры необратимого термоперехода порина может вызвать конформационные изменения на уровне третичной структуры белка, вплоть до диссоциации олигомеров на мономеры, но эти изменения, как правило, являются обратимыми. Однако полного разворачивания полипептидной цепи мономеров поринов не наблюдается даже при необратимой денатурации (при нагревании раствора белка выше критической температуры и концентрации SDS выше мицеллярной). С помощью методов оптической спектроскопии у термоденатурированных поринов обнаружено существенное уменьшение степени внутримолекулярных взаимодействий на уровне третичной структуры белка. Содержание элементов регулярной вторичной структуры остаётся высоким, меняется только соотношение ее отдельных элементов в полипептидной цепи порина, например заметно возрастает доля α-спиральных участков [91, 92], а также несколько увеличивается количество неупорядоченной структуры [93]. Присутствие в растворе поринов неионных детергентов существенно увеличивает устойчивость белков к нагреванию. Так, термоустойчивость OmpF порина из E. coli в присутствии ОГ была заметно выше, чем в присутствии SDS, поскольку температура термоперехода в первом случае оказалась на 15-20 oC выше [91]. На примере поринов нессерий Por B белков класса 2 и 3 было проведено сравнение конформационной стабильности тримерной структуры белков в растворах различных детергентов (SDS и Zwittergent 3.14) [94, 95]. Они оказались одинаково устойчивы за исключением того, Por B класса 3а был более чувствителен к действию SDS. Этот детергент вызывал диссоциацию и частичную денатурацию 3а белка, которая проходит в две стадии со средней точкой конформационного перехода при 0,35% SDS. Тример диссоциирует обратимо, образуя частично развернутый мономер с увеличенным количеством неупорядоченной структуры (образующейся из экспонированных на поверхность жестких развернутых петель), но, тем не менее, сохраняющий характеристичное содержание β-структуры. Авторы считают, что полученные результаты проливают свет на пути сборки пориновых белков и факторы, влияющие на общую стабильность их структуры. Изучение конформационных превращений поринов в различных денатурирующих условиях, помимо определения их физико-химических характеристик, важно для установления корреляций между изменениями в структуре и функции этих белков. Например, в ходе таких исследований на примере порина из дикого штамма и мутантных белков из P. denitrificans Sukumaran с соавторами показали [96], что высокая конформационная стабильность является следствием определенной молекулекулярной организации порина (как β-структурированного белка) и не связана с проявлением его функциональной активности, поскольку минимальные изменения в структуре порина приводили к значительным изменениям его порообразующих свойств. Так, порообразующая активность порина из дикого штамма, прогретого при 50 о С, снижалась на 90%, несмотря на то, что ИК-спектры исходного и прогретого поринов практически одинаковы. Авторы предположили, что связанные с потерей активности конформационные изменения на уровне вторичной структуры белка и/или изменения в «геометрии» (пространственном положении) боковых цепей, минимальны, и они не смогли их обнаружить. Тем не менее, эти небольшие изменения в районе петель могли вызвать проблемы с реконструкцией белка в липидный бислой. распределение Необходимо учитывать и другой фактор: (соотношение) мономеров, димеров и тримеров белка при различных температурах постоянно меняется. По мнению авторов наиболее важным экспериментальным результатом является то, что прогревание белка при 50 о С приводит к функционально значимым изменениям в его структуре, что весьма удивительно, поскольку температура необратимого термоперехода порина (диссоциации тримера на мономеры) значительно выше. Предыдущие исследования авторов показали, что изменения в окружении тирозинов в ароматическом «поясе» порина могут наблюдаться даже при небольшом увеличении температуры, и эти изменения необратимы. Таким образом, минимальные нарушения нативной конформации порина могут повлечь за собой изменения в функциональной активности. В работе [97] показано, что для порина из Y. pseudotuberculosis характерно резкое уменьшение активности белка в достаточно узком интервале значений рН (5.8-5.0), которое, как и в случае других функционально активных мультидоменных белков [98], не сопровождается сколько-нибудь значительными перестройками в его молекулярной организации. Таким образом, исследования структурных превращений поринов под действием денатурирующих факторов или агентов выявили ряд особенностей конформационных переходов этих белков. Вторичная структура порообразующих белков чрезвычайно стабильна, однако на уровне третичной структуры белка они отличаются высокой степенью изменчивости (пластичности). Следствием этого является способность поринов образовывать множество конформационных интермедиатов, пространственная структура которых зависит от условий денатурации белка. 2.6. Антигенная структура порообразующих белков наружной мембраны граморицательных бактерий 2. 6. 1. Исследование антигенной структуры поринов иммунохимическими методами Исследование антигенной структуры белков представляет собой трудоемкую и многоплановую задачу. Одним из подходов является постепенное разрушение присущей данному белку нативной структуры (четвертичной, третичной, вторичной) и сравнительный иммунохимический анализ образующихся конформационных интермедиатов белка [99]. Для определения размеров (протяженности) антигенных детерминант необходимо получить из исходного белка набор химически модифицированных производных пептидов и затем определить их иммунологическую активность. Для исследования антигенной структуры широко используются также генно- инженерные методы, включающие в себя создание рекомбинантных мутантных белков с делециями отдельных АК остатков и последующее изучение их иммунохимических свойств. Основная роль в подобных исследованиях принадлежит технологии получения специфических моноклональных антител (МАТ), представляющих из себя продукт одного клона иммунных клеток. Такие МАТ являются специфичными к одной АГ детерминанте и позволяют однозначно выявить ее роль в формировании антигенной структуры исследуемого белка. На сегодняшний день эксперименты многих исследователей подтверждают существование у поринов двух типов антигенных детерминант: линейных, обусловленных первичной АК последовательностью белка, и конформационных, формирующихся на более высоких уровнях структурной организации белковой молекулы. Некоторые авторы считают, что большая часть антигенных детерминант поринов является «прерывистыми» и приходится преимущественно на участки петель с неупорядоченной структурой [100]. Например, поликлональная сыворотка, полученная к OprF порину из Pseudomonas aeruginosa, обнаруживала слабую реактивность при связывании с отдельными участками аминокислотной последовательности этого белка, подтверждая предположение вырабатываются, в основном, на конформационные детерминанты. о том, что антитела МАТ, специфичные к мономерам поринов ОmpC из P. aeruginosa и OmpF из E. coli, не реагируют с тримерами этих белков [101]. Анализ распределения специфических эпитопов у поринов различных грамотрицательных энтеробактерий, выполненный с помощью МАТ, показал, что наибольшей вариабельностью обладают эпитопы, расположенные на поверхности бактериальной клетки. Напротив, эпитопы, расположенные на трансмембранных участках белка, оказались очень консервативными и имели высокую степень родства для всех поринов энтеробактерий [102]. При исследовании OmpC порина из S. typhimurium было установлено, что антитела, реагирующие с «петельными» эпитопами, не реагируют перекрестно с OmpC белком из E. coli. В то же время МАТ к высококонсервативному домену Por 1 белка из E. coli 055 обнаруживали высокий уровень перекрестных реакций как с другими энтеробактериями, так и с патогенными и непатогенными нейссериями [103]. Сравнение аминокислотной последовательности гидрофобных и гидрофильных участков молекул поринов PorA и PorB из Neisseria meningitidis показало, что области наибольших структурных различий между ними находятся в гидрофильных максимумах [104]. Именно эти области ответственны за различие антигенных свойств этих поринов. Оказалось, что два из восьми гидрофильных вариабельных участков, выступающих за пределы НМ и формирующих петли различной длины, являются носителями серологических субтиповых детерминант. Предполагается, что вариабельные участки молекулы поринов непосредственно контактируют с иммунными клетками хозяина и способствуют формированию субтипового специфического иммунного ответа, как после вакцинации, так и после менингококковой инфекции [104]. Весьма эффективными также для определения локализации антигенных детерминант пориновых белков оказались биоинженерные подходы. С помощью гомологичной рекомбинации in vivo ompC и ompF генов, кодирующих соответствующие белки НМ E. coli, была сконструирована серия ompC-ompF химерных генов [105] Химерные OmpF-OmpC белки, экспрессированные этими генами, были с успехом использованы для определения локализации АГ детерминант, распознаваемых МАТ, специфически реагирующих либо с OmpF, либо с OmpC поринами. Взаимодействие антигенов с антителами было проанализировано с помощью ИФА и иммуноблоттинга. В результате были определены АГ детерминанты, специфичные к одному анти–OmpF и трем анти–OmpC МАТ. Полипептиды, соответствующие двум выявленным эпитопам, были синтезированы. Они реагировали с соответствующими антителами после конъюгации с бычьим сывороточным альбумином. Большинство МАТ, использованных в этой работе, были высоко специфичны к денатурированному мономеру, к которому они были получены, но не реагировали с нативной тримерной формой белка. Одним из наиболее продуктивных и часто используемых методов определения антигенной структуры белков является иммунохимичесий анализ пептидов, полученных в результате расщепления полипептидной цепи белка. Так, с помощью анализа взаимодействия пептидов, полученных в результате расщепления порина бромцианом, с МАТ были исследованы антигенные детерминанты OmpC белка из Salmonella typhimurium [106]. Были идентифицированы 6 полипептидов с мол. массами 35.5; 31.0; 25.0; 22.5; 13.8 и 10.0 кДа. Результаты скрининга пептидов, полученных с помощью расщепления бромцианом, с 12-ю МАТ к тримерной и мономерной молекулярным формам порина из S. typhimurium с помощью иммуноблоттинга были скорректированы с данными анализа пространственной «укладки» полипептидной цепи этого порина, аналогично известной трехмерной структуре OmpF порина из E. coli. Обнаружено, что 4 МАТ реагируют с поверхностно экспонированными эпитопами в петлях L2, L8, L4 и L7, 4 МАТ реагируют с сайтом, расположенном в «глазке» в петле L3, и, наконец, 4 МАТ специфичны к погруженным в мембрану участкам β-барреля. МАТ, специфичные к детерминантам, локализованным во внешних петлях, не обнаружили перекрестной реакции с OmpC порином E. coli, АК последовательность которого в значительной степени отличается от первичной структуры поринов S. typhimurium и S. typhi именно в этих участках. Напротив, МАТ, реагирующие с детерминантами в трансмембранных участках β-тяжей, последовательность которых высоко консервативна, обнаруживают перекрестные реакции с OmpC E.coli. В общем плане эти данные подтверждают мнение многих исследователей о том, что эволюционные дивергенции в АК последовательности поринов происходят преимущественно во внешних петлях. В связи с этим, идентификация поверхностных и трансмембранных эпитопов чрезвычайно важна, поскольку синтетические пептиды, в зависимости от того, каким участкам АК последовательности поринов они соответствуют, могут быть использованы для целей диагностики, вакцинопрофилактики или структурно-функциональных исследований. Например, консервативные эпитопы могут быть использованы для защиты от родственных инфекций, в то время как вариабельные эпитопы могут обеспечивать видо- и штаммоспецифичную защиту. 2. 6. 2. Предсказание локализации антигенных детерминант Несмотря на определенные успехи в использовании различных экспериментальных подходов для исследования антигенной структуры белков, в частности поринов, с начала 80-х годов прошлого столетия усилия многих авторов были направлены на разработку предсказательных методов. Имевшиеся в литературе данные достаточно четко свидетельствовали о том, что некоторые структурные особенности, характерные для конкретного белка, такие как доступность тех или иных участков последовательности, гидрофильность и подвижность боковых цепей аминокислот, коррелируют с локализацией эпитопов. Эти данные обусловили возможность выбора участков АК последовательности поринов с наибольшей вероятностью содержащих антигенные детерминанты. Так, Hopp и Woods [107] разработали метод установления локализации антигенных детерминант белка с помощью определения в его АК последовательности участков максимальной локальной гидрофильности. Для этого каждой АК присваивается численное значение, определяющее степень ее гидрофильности, а затем эти величины распределяются вдоль полипептидной цепи. Точки наибольшей гидрофильности, как правило, входят в состав либо находятся в непосредственной близости от антигенной детерминанты. На протяжении 1520 лет именно этот метод считался наиболее успешным для идентификации антигенных детерминант и других сайтов взаимодействия белковых молекул. Основой для этого служила корректная оценка взаимодействия заряженных групп в молекуле белка, в равной степени учитывающая наличие положительно и отрицательно заряженных групп, в отличие от других методов, отдающих предпочтение какому-нибудь одному типу взаимодействий. Благодаря этому антигенные сайты, предсказанные с помощью данного метода, наиболее полно отражают все экспонированные на поверхности молекулы участки АК последовательности. Использование пептидных фрагментов белков в качестве антигенов способных стимулировать образование антител является ключевым моментом в создании пептидных противовирусных и антибактериальных вакцин, при разработке диагностических тест-систем, а также при получении антител к белкам для научных исследований. В последние годы в результате интенсивных научных исследований стала доступной информация о структуре большого числа Т-хелперных эпитопов, а именно участков белков, ответственных за связывание с молекулами главного комплекса гистосовместимости (MHC) II типа и Тклеточными рецепторами. На основании этой информации предложены многочисленные и эффективные программы предсказания Т-хелперных эпитопов, активируемых молекулами MHC человека и мыши. Согласно одному из подобных подходов [108] потенциально активный пептид должен содержать девятичленный участок, в первом положении которого находится гидрофобный аминокислотный остаток, а в девятом – положительно заряженный остаток. Поскольку процесс стимуляции антител пептидами чрезвычайно сложен, не все его этапы хорошо изучены и, очевидно, он не может быть обусловлен только наличием в пептиде характерного девятичленного пептида. Тем не менее, предлагаемый подход, по мнению его авторов, позволяет с высокой эффективностью выбирать в последовательности белков потенциально иммуногенные пептиды. Этот вывод был подтвержден корреляцией между наличием в структуре белка такого девятичленного участка и уровнем проявляемой активности в ряду ранее изученных синтетических пептидов. Разработанный подход был использован также для выбора в последовательности различных белков иммуногенных фрагментов, проявивших впоследствии специфическую активность. 2.7. Регуляция экспрессии OmpF и OmpC поринов грамотрицательных бактерий Бактериальные клетки достаточно устойчивы в окружающей среде и легко приспосабливаются к воздействию внешних неблагоприятных факторов. Одним из наиболее эффективных механизмов их адаптивности является изменение проницаемости НМ, которая, в свою очередь, зависит от модуляции экспрессии порообразующих белков. Это осуществляется за счет регулирования биосинтеза близкородственных белков с различным диаметром пор (OmpF и OmpC поринов). Однако, согласно современным взглядам большинства исследователей, под воздействием внешних факторов может изменяться не только тип экспрессируемых белков, но и их количественное содержание а также число открытых пор [109]. В естественных условиях конформеры порина, соответствующие определенным состояниям пор, могут возникать под влиянием локальных физико-химических условий на внешней стороне НМ, липидного состава мембраны, а также в результате взаимодействия молекулы порина с молекулами - эффекторами, присутствующими в мембране и способными изменять конформацию молекул белка [110]. Как правило, в клетке представлены различные популяции поринов с высокой степенью гомологии на уровне первичной структуры, но с различным диаметром пор, кодируют их различные гены [111]. В условиях низкой осмолярности доминирующим белком в НМ является OmpF порин. Напротив, при увеличении концентрации солей в среде происходит репрессия ompF гена, и OmpC белок становится основным (в количественном отношении) порином НМ бактерий. В E. coli уровни экспрессии двух основных белков НМ, OmpF и OmpC поринов, регулируются в соответствии с различными параметрами окружающей среды. На сегодняшний день известно, что регуляция экспрессии поринов осуществляется с помощью сложного взаимодействия нескольких регуляторных систем: EnvZ-OmpR двухкомпонентной системы [112 - 115], антисмысловых РНК micF и micC [116, 117], сигма факторов - сигма s и сигма e [118, 119], двухкомпонентной регуляторной системы CpxA-CpxR, глобального регулятора Lrp [120], и гистоноподобного протеина IHF (integration host factor) [121, 122]. Наряду с этими системами регуляции известны некоторые факторы, влияние которых на экспрессию поринов выражено незначительно, и/или они действуют опосредованно [123]. Наиболее изученным механизмом регуляции экспрессии поринов E. coli является двухкомпонентная система, состоящая из мембранного сенсорного белка, называемого EnvZ и регулятора ответа OmpR. Компоненты системы участвуют в ответе на изменение внешних условий в качестве модуляторов и эффекторов: OmpR является активатором транскрипции, а EnvZ – сенсором гистидин-киназы. EnvZ контролирует осмолярность внеклеточной среды и способен активировать OmpR путём фосфорилирования и дефосфорилирования [124]. Фосфорилированный OmpR в свою очередь изменяет уровень транскрипции оmpF и ompC генов. В условиях низкой осмолярности фосфорилированный регулятор активирует транскрипцию оmpF гена. При условиях высокой осмолярности OmpR-p подавляет транскрипцию ompF и усиливает транскрипцию ompC гена [125]. Такое различное влияние на гены объясняется различным строением OmpR связывающих сайтов, и, как следствие, их различным сродством к регулятору. При низкой концентрации OmpR-p происходит преимущественно связывание с OmpF регулирующими сайтами, однако при увеличении концентрации OmpR-p происходит активация оmpC регулирующих сайтов, и в дополнение к этому активируется IHF, создающий препятствия для транскрипции оmpF гена. Данный механизм позволяет достаточно эффективно регулировать поступление нутриентов из окружающей среды, и в то же время противодействовать осмотическому шоку, возникающему при экстремальных значениях концентрации электролитов в окружающей среде. Экспрессия генов OmpF, OmpC и LamB белков регулируется также при изменении рН внешней среды [126]. Так, в кислых условиях наблюдается уменьшение экспрессии OmpF и LamB белков и увеличение продукции OmpC. Показано, что регуляция рН-зависимости осуществляется на транскрипционном уровне экспрессии ompF, ompC генов и на посттранскрипционном уровне экспрессии ompF гена. Подобное исследование, проведенное с использованием envZ штаммов, показало, что рН-контролируемый трансдукционный сигнал проводится с помощью EnvZ белка, хотя в процесс включены и другие механизмы рН- зависимости. В то время, как при высокой осмолярности среды регулирование происходит в основном путем ингибирования транскрипции OmpR, при низкой осмолярности OmpF посттранскрипционно регулируется так называемым mic фактором (micF) матричной РНК (мРНК) [127]. Ген, кодирующий micF, расположен прямо перед ompC и транскрибируется в обратном направлении [128]. Продукт транскрипции образует стабильный димер с участком, связывания рибосомы гена OmpF белка, таким образом, мешая его трансляции и дестабилизируя мРНК [129, 130]. Транскрипция micF регулируется с помощью OmpR, с использованием тех же сайтов связывания, что и для регуляции транскрипции ompC [131]. Показано, что транскрипция micF в E. coli уменьшается при низкой осмолярности [132], понижении температуры [133], и снижении кислотности среды [134]. Другими исследователями было доказано, что присутствие салицилата может служить единственной причиной, способной изменить экспрессию OmpF исключительно путем блокирования трансляции с помощью micF мРНК [135]. Другая двухкомпонентная регуляторная система CpxA-CpxR принимает участие в регуляции экспрессии поринов, реагируя на такие условия среды как, защелачивание и избыточная продукция [136 - 138], а также участвует в прикреплении клетки к поверхностям. В ходе исследований этой системы было показано, что дезактивация сpxA гена приводит к увеличению количества активированного регулятора CpxR-p, и в последствии к подавлению транскрипции ompF гена и наоборот активации ompC гена. Связывание CpxR-p с промотором гена ompF предположительно приводит к его дезактивации (невозможности связаться с OmpR либо РНК полимеразой), и дополнительно к формированию петли ДНК препятствующей транскрипции. Также было показано, Обнаружено, что эта система тесно связана с EnvZOmpR, хотя и активируется другим путём. Так, было показано, что CpxR-p не активирует транскрипцию ompC гена в отсутствие достаточного уровня OmpR. Это позволяет сделать вывод о конвергентности влияния этих систем на промоторы ompC и ompF генов. Известны и другие системы регуляции ответа на стресс, изменяющие уровень экспрессии поринов. Так, σE фактор реагирует на повышение температуры окружающей среды и наряду с активацией других генов ответа на температурный шок подавляет экспрессию как OmpС, так и OmpF поринов [118]. Проведённые исследования позволяют предположить, что активация системы CpxACpxR направлена на более эффективную защиту бактерий от вредного влияния некоторых условий окружающей среды (таких как присутствие токсинов), в отличие от σE системы, которая действует не селективно, подавляя экспрессию обоих поринов [139]. Таким образом, бактерии «осуществляют» постоянный мониторинг условий окружающей среды посредством фенотипических модификаций, которые определяют соответствующую адаптивную реакцию Это обусловлено различными факторами, в том числе присутствием огромного числа поринов в НМ, функциональное состояние которых регулируется извне и тем самым предохраняет клетку от неблагоприятных факторов. Несмотря на постоянно проводимые исследования в этой области, детальные механизмы регуляции экспрессии поринов до конца не установлены и представляют интерес для исследователей. Приблизиться к решению этих задач позволяет использование современных генно-инженерных подходов. 2.8. Характеристика и свойства антигенов Yersinia ruckeri Иерсиниоз у рыб, вызываемый грамотрицательной бактерией, Yersinia ruckeri, регистрируется в прибалтийском регионе, в большинстве стран Восточной и Западной Европы, в США. Радужная форель наиболее подвержена заболеванию, тем не менее, все лососевые и около 20-ти видов других пресноводных и морских рыб восприимчивы к данной инфекции. В связи с этим, ежегодно Y. ruckeri является причиной больших экономических потерь в индустрии аквакультур. Инфекция распространяется среди рыб при прямом контакте с заражёнными особями или носителями. Кроме того, некоторое время бактерии могут оставаться жизнеспособными, находясь в водной среде. Из-за воспаления и точечных кровоизлияний внутри и вокруг ротовой полости, а также в нижнем отделе кишечника инфицированных рыб это кишечное заболевание известно как «болезнь красного рта» (ERM, enteric redmoth disease). При остром течении ERM у лососевых развивается сепсис, некроз и воспаление всех тканей. Впервые ERM была обнаружена и описана в 1950-х годах в штате Айдахо (США) у радужной форели (Oncorhynchus mykiss) Rucker [140, 141] обнаружил, что часть особей рыб, находящихся в состояния носительства, выжили через 2 месяца после экспериментального заражения. Позже было доказано, что 25% популяции радужной форели при инфицировании могут переносить Y. ruckeri без заметных проявлений болезни. Передача возбудителя при прямом контакте особенно усиливается в стрессовых для рыб условиях. Так, факторами, способствующими возникновению и распространению заболевания, являются: ручные манипуляции с рыбой, неблагоприятные условия окружающей среды (дефицит кислорода, накопление органических веществ, увеличение количества аммиака), высокие показатели плотности посадки рыб. Hunter также установил [142], что носители передают Y. ruckeri здоровым рыбам при увеличении температуры до 25 градусов, в то время как при нормальных условиях, заражения не происходит. Поскольку бактерии Y. ruckeri обладают способностью выживать в водной среде, периодический сброс их вместе с испражнениями рыб играет важную роль в распространении болезни. Как и многие другие водные бактерии, возбудитель иерсиниоза может прикрепляться к различным поверхностям и донным отложениям. Coquet с соавторами [143] изолировали штамм способный формировать биоплёнки на твёрдых поверхностях, включая материалы, использующиеся для резервуаров на рыбных фермах. Было показано, что в процессе адгезии большую роль играют жгутики, использующиеся в процессе движения, связи бактерий друг с другом, а также формировании и росте колоний. Предполагается, что передача Y. ruckeri может происходить также через морских безпозвоночных и птиц [144] Факторы условий внешней среды могут оказывать прямое влияние на патогенность микроорганизмов. Особенно это касается организмов обитающих в водной среде, поскольку в данном случае и микроорганизм, и организм хозяина сильно зависят от воздействия колебаний условий водного окружения. Altinok и Grizzle [145] доказали, что такие факторы как температура и солёность оказывают влияние на возникновение и степень тяжести инфекции, обусловленной Y. ruckeri. Особенно важным фактором регуляции патогенности этих бактерий является температура, поскольку экспрессия специфических факторов вирулентности резко сокращается при достижении определённой температуры – верхнего уровня патогенности, который находится ниже уровня оптимального роста микроорганизма. Это подтверждается исследованиями температурной зависимости экспрессии таких факторов вирулентности Y. ruckeri, как Yrp1 протеаза и сидерофор рукербактин (ruckerbactin). Их максимальный уровень экспрессии наблюдается при 18 градусах, снижаясь при 28 градусах – оптимальной температуре роста. Исследовалось также влияние солёности на вирулентные свойства Y. ruckeri. Смертность радужной форели несколько уменьшалась при заражении рыб погружением в слегка солёную воду, однако смертность при оральном заражении была гораздо меньше в пресной воде [145]. Полученные данные довольно сложно интерпретировать, поскольку солёность воды оказывает прямое воздействие как на микроорганизм, так и на рыб, возможно являясь для последних стрессовым фактором. Несмотря на значение ERM для рыборазведения, мало известно о механизмах патогенеза, в результате реализации которых Y. ruckeri преодолевает защиту организма хозяина и вызывает заболевание. К настоящему моменту намного больше известно о такого рода взаимодействиях для иерсиний, вызывающих болезни у человека (Y. enterocolitica, Y. pseudotuberculosis, Y. pestis). Многие исследования были направлены на выявление сходных механизмов патогенеза у Y. ruckeri, и, несмотря на различия в клинической картине заболеваний и различных путях передачи инфекции, некоторые общие факторы вирулентности были обнаружены. Помимо устойчивости к защитным механизмам врожденного иммунитета, у Y. ruckeri были выявлены многие потенциальные факторы вирулентности, например, внеклеточные токсины, высоко аффинная система поглощения железа под названием рукербактин [146], секреторные системы III [147] и IV типа, и металлопротеаза [148]. Система поглощения железа необходима микроорганизму для выживания в условиях низкого содержания железа в организме хозяина. Секретируемый гемолизин уничтожает эритроциты, а токсическое действие металлопротеаз направлено на разрушение белков хозяина, что приводит к серьезному повреждению тканей. Известно, что адгезия и инвазия являются начальными стадиями бактериального патогенеза. Способность Y. ruckeri к адгезии и эффективному проникновению в клеточные культуры in vitro была доказана, однако сообщалось, что эти свойства по-разному проявляются по отношению к различным клеточным линиям [149, 150] Y. enterocolitica, Y. pseudotuberculosis продуцируют по крайней мере три белка инвазии: инвазин, Ail закодированные в хромосоме и YadA в 70-kb плазмиде вирулентности. Kawula [150] проверял наличие генов inv и ail в Y. ruckeri используя Саузерн блоттинг, но не обнаружил соответствующих генов, однако следует учесть, что он исследовал лишь один штамм. Известно, что Y. pestis не производит ни инвазин, ни Ail, ни YadA белки, однако обладает способностью к адгезии и инвазии в эпителиальные клетки наравне с другими патогенными иерсиниями. Эта способность осуществляется с помощью протеазы активирующей плазминоген, кодирующейся в 9.6-kb плазмиде pPCP1. Можно предположить наличие подобной протеазы у Y. ruckeri, однако исследований, подтверждающих этот факт не проводилось. Изучение патогенных для человека иерсиний показало, что важным фактором для развития инфекции является способность бактерий выживать и размножаться в макрофагах. Было выяснено, что Y. pseudotuberculosis и Y. pestis содержат пигментационный сегмент, входящий в состав нестабильного pgm-локуса (размером в 102-kb) вместе с так называемым островком патогенности НРI (high-pathogenicity island), который несет ген вирулентности. Этот пигментационный сегмент необходим для репликации бактерий в активированных макрофагах и ингибирует также синтез оксида азота в макрофагах, заражённых этими бактериями. Никаких исследований о взаимодействии Y. ruckeri с макрофагами не проводилось. Одним из немногих исследованных факторов вирулентности Y. ruckeri является система захвата железа рукербактин. Захват железа важен для многих патогенов, так как позволяет успешно конкурировать с организмом хозяина за ионы Fe3+, необходимые для роста и размножения. Он осуществляется с помощью сидерофоров - низкомолекулярных веществ имеющих высокое сродство к ионам Fe3+. Было показано, что гены, ответственные за синтез сидерофора у Y. ruckeri, активируются во время инфекции. Они также регулируются температурой окружающей среды, способствуя максимальной экспрессии рукербактина при 18 о С, температуре инфекции, и замедляя ее при 28 градусах, оптимальной температуре роста. Химическая структура и путь биосинтеза рукербактина не исследован. В результате анализа нуклеотидной последовательности рецептора рукербактина показано Анализ нуклеотидной последовательности рецептора рукербактина показал его большее сходство с рецептором феррихризобактина известного патогена растений Erwinia chrysantemii, чем с соответствующими рецепторами родственных иерсиний. Более того, для протеазы Yrp1, чьё участие в процессе патогенеза Y. ruckeri было доказано, обнаружена высокая степень гомологии с PrtG протеазой E. сhrysantemii, что позволяет сделать вывод о большей близости Y. ruckeri к E. сhrysantemii в плане механизмов патогенеза, чем к другим патогенным иерсиниям [146]. Yrp1 протеаза является 47–kDa металлопротеазой, которая продуцируется в клетках на стадии окончания экспоненциального роста. Исследования показали, что Yrp1 расщепляет различные виды внеклеточной среды и мускульные ткани, что может приводить к изменениям в мембранах и порах капилляров. Предполагается, что это, в свою очередь, вызывает кровотечения и типичные для ERM симптомы [148]. Применение технологии экспрессии в естественных условиях (IVET) к Y. ruckeri позволило идентифицировать два соседних гена, которые представляют бактериальную систему, участвующую в поглощении и деградации L-цистеина. Было показано, что обнаруженный оперон, названый cdsAB, учавствует в патогенезе Y. ruckeri [151]. Участие порообразующих белков НМ в патогенезе иерсиниозной инфекции, вызываемой Y. ruckeri, пока не рассматривалось. Однако данные, основанные на предыдущих исследованиях поринов различных патогенных грамотрицательных бактерий, свидетельствуют о том, что эти белки являются высоко иммуногенными компонентами НМ иерсиний. Показано, что антитела к ним обнаруживаются как после вакцинации, так и при естественном развитии инфекции. Порины представляют собой молекулы-мишени для системы врожденного иммунитета организма-хозяина, а также выступают в качестве эффекторов патогенеза, подавляя отдельные стадии иммунной защиты хозяина и обеспечивая выживание патогена в макрорганизме. Всё это позволяет предполагать значимую роль поринов в процессе развития инфекции и в случае Y. ruckeri. Выяснение роли поринов Y. ruckeri в процессе патогенеза, а также взаимосвязи их структуры и функциональной активности расширит представления о механизмах патогенеза для многих грамотрицательных бактерий. 3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ Бактерии рода Yersinia играют существенную роль в инфекционной патологии человека. Этим объясняется внимание исследователей к изучению антигенов, входящих в состав НМ этих микроорганизмов, в частности порообразующих белков. Сведения о структуре, функциональной активности и иммунобиологических свойствах неспецифических поринов рода Yersinia, представлены в серии работ, выполненных в лаборатории молекулярных основ антибактериального иммунитета ТИБОХ им.Г.Б. Елякова. Так, для некоторых представителей микроорганизмов рода Yersinia (Y. pestis, Y. pseudotuberculosis Y. enterocolitica, Y. intermedia, Y. frederiksenii и Y. kristensenii) определен полипептидный состав НМ бактерий и идентифицированы порообразующие белки [152 - 154]. Существование недавно открытого порина Y. pseudotuberculosis OmpY было предсказано в результате анализа генов этого микроорганизма. Этот новый порин был экспрессирован как рекомбинантный белок в порин-дефицитном штамме E. сoli. Анализ пространственной структуры OmpY, проведённый с помощью методов оптической спектроскопии, показал его значительное сходство с OmpF порином Y. pseudotuberculosis. С помощью техники бислойных липидных мембран (БЛМ) была исследована порообразующая активность OmpY. Показано, что данный белок встраивается в мембрану в виде тримеров. Наиболее вероятный уровень проводимости каналов OmpY равен 180 пСм, что сравнимо с проводимостью OmpC порина Y. pseudotuberculosis [155]. Данные о поринах НМ других представителей рода Yersinia в литературе отсутствуют. Известно, что иерсинии обладают широкими адаптационными возможностями, что позволяет им существовать как в паразитическом, так и в сапрофитическом состояниях [156]. Учитывая это, значительный интерес представляет изучение структурно-функциональных особенностей поринов тех видов иерсиний, которые обитают в условиях отличных от условий обитания патогенных для человека иерсиний, таких, например, как Y. ruckeri, являющейся патогеном для холоднокровных организмов (лососевых пород рыб). Поскольку порины являются высокоиммуногенными компонентами НМ грамотрицательных бактерий, антитела к ним обнаруживаются в сыворотке крови как после вакцинации, так и при естественном развитии инфекции. В связи с этим, выявление структурных особенностей поверхностных участков молекул поринов и установление их роли в формировании антигенных эпитопов, имеет важное значение для конструирования диагностических и вакцинных препаратов. Представляет также интерес способность поринов взаимодействовать с клетками эукариот. Так, известно, что порины проявляют свойства индукторов и ингибиторов апоптоза, способны связываться с Toll-подобными рецепторами, зачастую обладают высокой цитотоксичностью и способностью влиять на клеточный цикл. Однако биологические свойства порообразующих белков НМ иерсиний до сих пор остаются мало изученными. 3.1. Получение неспецифических (OmpF- и OmpC- подобных) поринов наружной мембраны Y. ruckeri Перевод мембранных белков из связанного с НМ состояния в раствор сопряжен с определенными трудностями, обусловленными, прежде всего, подбором подходящего солюбилизирующего агента. Для того, чтобы в дальнейшем контролировать эффективность выбранного метода извлечения поринов из НМ бактерий Y. ruckeri и иметь возможность идентифицировать эти белки на электрофореграммах, мы определили их молекулярную массу (мол. массу), исходя их нуклеотидной последовательности. 3.1.1. Первичная структура OmpC– и OmpF поринов из Y. ruckeri Нуклеотидные последовательности кодируемой части ompF и ompC генов Y. ruckeri (штамм КММ 821) были получены с помощью ПЦР амплификации с использованием генспецифичных праймеров. На основе этих последовательностей были выведены первичные структуры OmpF и OmpC-подобных поринов, которые приведены на рис. 13 (глава 3.3.1). Величины мол. масс мономеров OmpC- и OmpF- поринов Y. ruckeri, рассчитанные из данных аминокислотной (АК) последовательности, составили 39359.35 и 38015.20 Да. 3.1.2. Анализ состава фракций пориновых белков наружной мембраны Y. ruckeri, извлекаемых детергентами различной природы Для солюбилизации мембранных белков, в том числе порообразующих белков НМ бактерий, требуется использование детергентов. Это связано с гидрофобной природой этих белков и, как следствие, их нерастворимостью в воде. В растворе эти белки могут существовать также только в присутствии детергентов, которые, связываясь с белком, экранируют его гидрофобную поверхность от молекул гидрофильного растворителя. Перевод мембранных белков из связанного состояния в солюбилизированное, как правило, сопряжен с изменением пространственной организации молекул белка. В связи с этим, методам экстракции мембранных белков и способам их очистки уделяется особое внимание. Для получения поринов из НМ Y. ruckeri были использованы несколько подходов, в основу которых легли классические методы извлечения поринов НМ грамотрицательных бактерий с помощью ионного детергента SDS [72, 76] и неионного детергента октилполиполиоксиэтилена РОЕ [72]. Для очистки фракции поринов от сопутствующих низкомолекулярных мембранных белков использовали неионный детергент саркозилат натрия [72]. 3.1.2.1 Экстракция поринов неионным детергентом октилполиоксиэтиленом Для получения фракции пориновых белков НМ Y. ruckeri применяли многоступенчатую экстракцию бактериальной массы с помощью POE. Поскольку максимальная активность метаболических процессов у иерсиний отмечена при 26 о С [156], для экспериментов использовали микробные клетки, выращенные при комнатной температуре. 2 2к* 5 5к 6 6к 7 7к 8 8к 9 9к М Рис. 4. Профиль белков НМ Y. ruckeri, выращенной при 26 оС, экстрагируемых РОЕ. Номера фракций указаны на рисунке (приведены профили не всех фракций). *к – образец кипятили в течение 5 минут для получения ТСБ мономеров; М – белки-маркеры, мол. массы указаны в кДа. Для разрушения микробных клеток использовали ультразвуковую дезинтеграцию. Полученную фракцию «сырых» мембран последовательно экстрагировали 5 раз 0.5%-ным POE и 4 раза - 3%-ным POE. Анализ полипептидного состава полученных экстрактов проводили методом SDS, ПААГ-электрофореза. Профиль полученных белков НМ представлен на рис. 4. Как видно из данных рисунка, с помощью растворов с низкой концентрацией детергента не происходит извлечения пориновых белков (рис. 4, линии 2, 2к, и 5, 5к) Максимальная интенсивность полипептидных полос в области олигомеров поринов (мол. масса 105-110 кДа) обнаружена во фракциях 6 и 7. Порины являются термозависимыми белками, т. е. белками, изменяющими свою молекулярную форму (тример или мономер) и, соответственно, электрофоретическую подвижность в зависимости от температуры предварительной обработки образца. Для большинства известных неспецифических порообразующих белков при температуре выше 70оС происходит диссоциация олигомеров белка на мономеры, сопровождаемая необратимым конформационным переходом. Белки после такой обработки являются термостабильными (ТСБ), в отличие от термолабильных (ТЛБ) олигомеров. После кипячения фракций, содержащих олигомеры поринов Y. ruckeri, в области мономеров было обнаружено несколько полипептидов с мол. массами в интервале значений 32 - 40 кДа. Принимая во внимание расчетные значения мол. масс исследуемых белков (глава 3.1) и их электрофоретическую подвижности в условиях SDS, ПААГ – электрофореза (рис. 5), можно предположить, что во фракциях 6к и 7к, помимо доминирующего в количественном отношении OmpC порина (39 кДа) присутствует OmpF порин (38 кДа) и, возможно, OmpA порин с мол. массой 37,75 кДа. Кроме того, данные фракции содержали неидентифицированные белки, не изменяющие свою электрофоретическую подвижность после кипячения, с мол. массами близкими к целевым поринам (рис. 4, линии 6к, 7к, 8к). Рис. 5. Полипептидный состав фракции, извлекаемой 5% РОЕ, в области пориновых белков (фрагмент электрофореграммы, приведенной на рис.1, линия 7к). Таким образом, фракция белков НМ, извлекаемая 5% раствором РОЕ, помимо неспецифических поринов содержала примесные белки с близкими значениями мол. масс, что значительно затруднило бы очистку целевых белков. 3.1.2.2 Экстракция ионным детергентом SDS и очистка фракции пориновых белков В качестве альтернативного метода, использованного в работе для получения неспецифических поринов НМ Y. ruckeri, применяли экстракцию ионным детергентом SDS [72]. Этот детергент, как уже упоминалось выше, был использован в классическом способе получения поринов по методу Rosenbusch. методику. Например, Мы внесли существенные изменения в эту для очистки от цитоплазматичесмких белков вместо тритона Х-100 использовали саркозилат натрия, который оказался более эффективным для получения очищенной фракции порообразующих белков. С его помощью можно удалить не только цитоплазматические белки, но и некоторое количество примесных низкомолекулярных белков, ассоциированных с пептидогликаном (ПГ). Более того, обработка саркозилатом натрия целых микробных клеток Y. ruckeri позволила одновременно разрушить их и перевести в раствор значительную часть сопутствующих белков, которые отделяли центрифугированием. Полученный осадок, состоящий преимущественно из клеточных оболочек, обрабатывали ДНКзой для расщепления и последующего удаления нуклеиновых кислот. Затем с помощью экстракции 2%-ным раствором SDS получали нерастворимый ПГ-белковый комплекс, обогащенный неспецифическими поринами. В отличие от метода Rosenbusch, который предусматривает эту обработку при температуре 50 – 60 оС, получение ПГ-белкового комплекса Y. ruckeri проводили при комнатной температуре, поскольку при повышенной температуре происходила диссоциация комплекса, что приводило к большим потерям порина за счет перехода его в супернатант. Для получения термолабильной олигомерной пориновой фракции диссоциацию ПГ-белкового комплекса проводили по методу Reithmeier [157], с помощью обработки 1%-ным раствором SDS, содержащим 0.5 М NaCl при 37 оС. Полученный после центрифугирования супернатант содержал олигомерную фракцию поринов Y. ruckeri и небольшое количество примесных белков. (рис. 6, линия 2) После кипячения в этой фракции были обнаружены белки, по подвижности соответствующие OmpC и OmpF поринам. (рис. 6, линия 3). Рис. 6. Электрофореграмма клеточного лизата и фракций пориновых белков Y. ruckeri: 1 –лизат бактериальных клеток; 2 – фракция, содержащая ТЛБ олигомеры поринов; 3 – фракция, содержащая ТСБ мономеры поринов; 4 – очищенные с помощью гель-хроматографии на Sephacryl S-300 ТСБ мономеры поринов; 5 – белки-маркёры Вследствие больших различий мол. масс примесных белков и ТЛБ тримеров поринов (105-110 кДа) для последующей очистки целевых белков был использован метод гельхроматографии. В качестве сорбента использовали Sephacryl S-300, элюирующий буфер содержал 0.25%-ный SDS. Электрофоретический профиль очищенной фракция поринов, прогретой при 100 оС, приведён на рис. 6 (линия 4). Таким образом, с помощью экстракции SDS была получена олигомерная фракция поринов Y. ruckeri, в которой после термоденатурации были обнаружены белки с мол. массой, соответствующей мол. массе мономеров OmpF и OmpC поринов. Данная фракция не содержала значительных количеств трудноотделимых примесных белков, (как в случае выделения с помощью экстракции РOE) и легко очищалась методом колоночной хроматографии. К достоинствам описанного метода следует также отнести его относительную простоту по сравнению другими способами получения поринов, основанными на предварительной дезинтеграции бактериальных клеток с помощью различных экструзионных, баллистических, ультразвуковых методов Как видно из полученных данных, культивирование Y. ruckeri при комнатной температуре приводит к одновременной экспрессии двух неспецифических поринов по подвижности соответствующих белкам OmpF и OmpC. В связи с этим следующим этапом исследования стал подбор условий культивирования Y. ruckeri для получения максимального выхода индивидуальных поринов. 3.1.3. Изучение влияния условий культивирования (осмолярности и температуры) на экспрессию OmpF и OmpC-подобных поринов и их идентификация Как известно, иерсинии являются психротолерантными бактериями [158], поэтому они способны выживать и размножаться при пониженных температурах (6-8 оС). Более того, культивирование при низких температурах приводит к повышению патогенного потенциала этих микроорганизмов [159]. Для адаптации к изменению условий окружающей среды иерсинии, подобно различным энтеробактериям, наряду с другими факторами используют переключение биосинтеза неспецифических поринов. С целью изучения влияний условий культивировании Y. ruckeri на экспрессию OmpF и OmpC поринов нами был проведен сравнительный анализ профилей фракций пориновых белков, полученных из НМ бактерий, выращенных в различных условиях (при температурах 8, 26, 37 ˚С и концентрациях NaCl 0, 150, 300 мМ) (рис. 7). 8-0 8-150 8-300 26-0 26-150 26-300 37-0 37-150 37-300 Рис. 7. Электрофоретические профили фракций пориновых белков, полученных из бактерий, выращенных в различных условиях (температура указана в оС, молярность NaCl в мМ). Идентификация поринов, присутствующих в исследуемых фракциях, была проведена с помощью масс-спектрометрического анализа образца 26-300, в котором представлены оба типа поринов. Результаты масс-спектрометрического анализа, представленные на рис. 8 подтверждают наличие во фракции 26-300 двух белков с массами соответствующими расчетным мол. массам OmpC и OmpF поринов (39 359 и 38 015 кДа соответственно). В качестве маркера взят BSA (расчетные массы ионов 33 и 66 кДа). Рис 8. Идентификация исследуемых поринов из НМ Y. ruckeri с помощью MALDI-NOF. Данные, представленные на рис. 7, свидетельствуют о том, что во всех исследуемых образцах присутствуют оба типа поринов (за исключением фракции 8-0). Однако, соотношение OmpF и OmpC белков сильно зависит от условий культивирования бактерий. При пониженной температуре вне зависимости от осмолярности среды, а также при комнатной температуре в бессолевой среде преимущественно экспрессируется OmpF порин (рис. 4, линии 1 - 4). При этом, как видно из рисунка 4, в экстремальных для бактерии условиях (8°С, 0 мМ NaCl) снижается экспрессия обоих типов исследуемых порообразующих белков. Исходя из полученных данных, оптимальными условиями культивирования бактерий с целью получения максимального выхода OmpF белка следует считать 8 оС и 150 мМ NaCl или 8 оС и 300 мМ NaCl. При комнатной температуре введение в среду NaCl (образцы 26-150 и 26-300) приводит к появлению (наряду с OmpF) значительного количества OmpC порина. При повышении температуры до 37°С в присутствии соли (37-150, 37-300) наблюдается изменение соотношения двух типов белков, при этом превалирующим белком становится OmpC порин. Данное обстоятельство, а также уменьшение количества OmpF белка во фракциях 37-150 и 37-300 позволяют считать эти условия оптимальными для получения максимального выхода OmpC порина. С целью выявления корреляции между уровнями экспрессии OmpF и OmpC поринов и транскрипции соответствующих генов о были выполнены эксперименты по изучению уровня транскрипции пориновых генов в интересующих условиях с использованием метода ПЦР в режиме реального времени. Данные исследования были проведены совместно с сотрудниками Лаборатории морской биохимии ТИБОХ ДВО РАН (асп. Быстрицкой Е.П. и с.н.с. Исаевой М.П.). Поскольку по результатам сравнительного анализа профилей фракций пориновых белков Y. ruckeri было установлено, что OmpF преимущественно экспрессируется в холодовых условиях (8°С), а OmpC при 37°С, количественную оценку уровня транскрипции пориновых генов проводили при данных температурах в средах с разной осмолярностью (0, 150, 300 мМ NaCl). Контрольным параметром, относительно которого производили расчеты, был принят уровень транскриптов ompF-, ompC-генов при культивировании бактерий в гипоосмолярной среде (0 мМ NaCl). Полученные результаты в виде графиков представлены на рис. 9. Рис. 9. Относительные уровни транскрипции ompF и ompC генов при различных условиях культивирования Y. ruckeri, контроль – уровень транскрипции при 0 мМ NaCl. Как видно из рисунка наиболее высокий уровень транскрипции ompF гена (в 2.54 раза выше по сравнению с контролем) наблюдается при 8°С в среде с концентрацией NaCl 150 мМ. При этом уровень транскрипции ompC в данных условиях изменяется незначительно, однако при гиперосмолярных условиях (300 mM NaCl) он повышается в 2.5 раза. Таким образом, результаты, полученные методом ПЦР в режиме реального времени, подтверждают данные SDS, ПААГ-электрофореза. Для максимального выхода OmpF порина следует выбрать температуру 8 °С и концентрацию NaCl 150 мМ. Как видно из рис.9, при 37 °С изменение концентрации соли в среде не оказывает какого-либо существенного влияния на уровень транскрипции ompC гена. Однако максимальное снижение транскриптов ompF (в 9.1 раз по сравнению с контролем) наблюдалось при 150 мМ NaCl. Следовательно, именно эти условия можно считать оптимальными для максимальной экспрессии OmpC порина. Таким образом, данные ПЦР в режиме реального времени согласуются с результатами, полученными на основе SDS, ПААГ-электрофореза, и позволяют выбрать наиболее подходящие условия для максимального выхода неспецифических поринов Y. ruckeri. 3.1.4. Выделение индивидуальных OmpF и OmpC поринов Y. ruckeri Для исследования физико-химических свойств неспецифических поринов OmpF и OmpC поринов НМ Y. ruckeri перед нами стояла задача получить индивидуальные белки в нативном состоянии. Исходя из данных по зависимости экспрессии целевых белков от условий среды, для получения OmpF порина была использована микробная масса, выращенная при 8 оС в присутствии 150 мМ NaCl, а для получения OmpC порина - микробная масса, выращенная при 37 оС в присутствии 150 мМ NaCl. Для выделения индивидуальных белков был использован метод экстракции SDS, описанный в гл. 3.1.2. На рис. 10 приведены электрофореграммы очищенных олигомеров и ТСБ мономеров OmpС (линии 3, 4 соответственно) и OmpF поринов (линии 6, 7 соответственно). Для сравнения приведены соответствующие фракции (линии 1, 2), полученные из бактерий, выращенных при комнатной температуре в присутствии 150 мМ NaCl. В этой фракции, как видно на рисунке, присутствуют оба типа поринов. Рис. 10. Электрофореграммы очищенных с помощью гель-хроматографии олигомеров и мономеров поринов Y. ruckeri: 1, 2 – фракция, содержащая смесь OmpF и OmpC белков; 3, 4 – ТЛБ олигомеры и мономерыOmpC; 5, 6 – ТЛБ олигомеры и мономерыOmpF; M – белки - маркеры Степень очистки полученных белков была подтверждена методом твердофазного секвенирования до 8 остатка с N-конца. N-концевой аминокислотой у обоих белков был аланин. 3.1.5. Технологичный способ получения и очистки OmpF порина Y. ruckeri Согласно процедуре выделения поринов НМ грамотрицательных бактерий по методу Rosenbusch [72], перед извлечением комплекса ПГ- белок необходима обработка ДНК-зой для удаления большого количества нуклеиновых кислот, присутствующих в экстрактах после разрушения микробных клеток. Кроме того, как было сказано выше, сырая фракция пориновых белков содержит большое количество примесных низкомолекулярных белков. С целью упрощения процедуры выделения, мы изменили порядок обработки микробных клеток и обрабатывали ДНК-зой фракцию пориновых белков, после диссоциации комплекса ПГ-белок. Для этой цели был использован преперат из гепатопанкреаса крабов, содержащий помимо ДНКазы ряд протеолитических ферментов. Поскольку тримеры поринов устойчивы к действию протеиназ [160], использование данного препарата позволило в одну стадию очистить порин от нуклеиновых кислот и примесных белков. Результат такой очистки представлен на рис. 11. Рис. 11. 1 – неочищенная фракция пориновых белков, полученная методом экстракции SDS,содержащая олигомерыOmpF порина; 2 – фракция 1 после кипячения, 3 – фракция пориновых белков, обработанная ДНК-азой из гепатопанкреаса крабов (очищенные олигомеры OmpF порина; 4 – фракция 3 после кипячения (ТСБ мономеры OmpF порина). Данные электрофореза свидетельствуют о том, что метод обеспечивает хорошую очистку от низкомолекулярных примесей. Высокая степень очистки от нуклеиновых кислот подтверждается также результатами УФ-спектроскопии исходной и очищенной фракции порина (рис. 12) D, ед.о.п. Рис 12. Спектры поглощения сырой 0,8 (1) и очищенной (2) фракции пориновых 0,7 0,6 белков из Y. ruckeri. 2 0,5 1 0,4 0,3 0,2 0,1 240 260 280 300 320 340 360 λ , нм Таким образом, разработан технологичный способ получения очищенной фракции OmpF порина Y. ruckeri, исключающий стадию гель-хроматографии. 3.2. Исследование функциональных свойств OmpF и OmpC поринов. 3.2.1. Характеристика проводимости одиночных каналов OmpF и OmpC поринов из НМ Y. ruckeri С помощью техники БЛМ был проведен сравнительный анализ проводимости одиночных каналов, образованных поринами OmpF (рис.13) и OmpC (рис.14). из НМ Y. ruckeri в искусственном бислое, сформированном из дифитаноилфосфатидилхолина в присутствии 1 М KCl. При добавлении образцов исследуемых белков в водную фазу наблюдались дискретные флуктуации тока через БЛМ с характерным для поринов ступенчатым изменением проводимости модельных мембран. Каналы, образованные этими белками имели проводимости соответственно 3 и 2 нСм. Кроме того, поры, образованные OmpF белком закрывались при мембранном потенциале 175 мВ, а каналы OmpC белка - при 150 мВ.. Рис. 14. Запись флуктуаций тока одиночного канала OmpС порина НМ Y. ruckeri через БЛМ, из дифитаноилфос-фатидилхолина, в 10 мМ трис и 1 М КCl, рН 7.9. Концентрация белка 4 нг/мл. Рис.13. Запись флуктуаций тока одиночного канала OmpF порина НМ Y. ruckeri через БЛМ, из дифитаноилфосфатидилхолина, в 10 мМ трис и 1 М КCl, рН 7.9. Концентрация белка 4 нг/мл. Таким образом, проведенные эксперименты подтвердили сделанный ранее вывод о том, чтопри пониженной температуре в НМ Y. ruckeri экспрессируется OmpF порин а при 37 оС OmpC порин, поскольку известно [161], что поры образованные OmpF больше по размеру. 3.2.2. Порообразующие свойства OmpF порина из НМ Y. ruckeri Для OmpF порина Y. ruckeri с помощью техники БЛМ была исследована зависимость функциональной активности от температуры. Как показал анализ записей тока через БЛМ (рис. 15, б), величина наиболее вероятной проводимости канала исследуемого белка при 20 и 50 мВ составляла 320±60 пСм, что находится в интервале соответствующих уровней проводимости функционально активных тримеров OmpF поринов патогенных и непатогенных видов иерсиний, изученных нами ранее (280-400 пСм) [153]. б а в г Рис. 15. (а) Запись флуктуаций тока через БЛМ из 1-моноолеилглицерина в присутствии в водной фазе OmpF порина из Y. ruckeri. Концентрация белка 100 нг/мл (1) и 50 нг/мл (2). Водная фаза: 100 мM NaCl, 10мM Трис-HCl буфер, pH 7.8. (б) Гистограмма проводимости пор, образованных OmpF порином из Y. ruckeri в БЛМ. По оси ординат: N – число каналов; по оси абсцисс: G – проводимость каналов в пСм. (в) Порообразующая активность порина после инкубации образца при температуре 85°С в течение 30 мин. Запись тока через БЛМ через 5 мин (1) и через 1 ч (2) после включения белка в бислой. (г) Порообразующая активность порина после инкубации образца при температуре 95°С в течение 30 мин. Образец добавляли через 5 мин после прогревания. Обнаружено, что исследуемый белок сохранял функциональную активность после инкубации при 85-95˚ C. Следует отметить, что через 5 мин после включения прогретого белка в липидный бислой наблюдались аномальные флуктуации тока (рис. 15, в, кривая 1), однако уже через 1 ч характер изменения проводимости мембраны мало отличался от такового в присутствии нативного белка (рис. 15, в, кривая 2). После прогревания образца порина при 95 °С (в этих условиях в растворе белка с помощью SDS, ПААГ – электрофореза были обнаружены только ТСБ мономеры белка) наблюдались единичные включения белка (рис. 15, г), которые в большинстве случаев приводили к образованию короткоживущих каналов и/или дестабилизации мембраны. Такое необычное поведение впервые отмечено нами для неспецифических поринов иерсиний. 3.3. Молекулярная структура и пространственная организация OmpF и OmpC поринов Y. ruckeri 3.3.1. Характеристика топологических моделей OmpF и OmpC поринов Y. ruckeri. Анализ их первичной и антигенной структуры При анализе аминокислотных последовательностей OmpF и OmpC поринов Y. ruckeri обнаружено, что эти порины, подобно неспецифическим поринам патогенных и непатогенных для человека иерсиний, имеют те же самые особенности первичной структуры. Подобно поринам НМ других энтеробактерий, исследуемые порины отличаются значительным содержанием кислых аминокислот (аспарагиновой и глутаминовой), низким содержанием лизина (не более 5%) и относительно высоким (по сравнению с водорастворимыми белками) содержанием ароматических аминокислот (до 13%). Содержание АК остатков со схожими свойствами в исследуемых поринах очень близко (табл. 1)., что отражается на общих физикохимических свойствах данных белков. АК остатки Количество 103 OmpF Содержание, % 29.97 Количество 100 Заряженные (RKHYCDE) Кислые (DE) 44 12.8 42 Основные (KR) 30 8.73 26 Полярные 116 33.74 125 (NCQSTY) Гидрофобные 101 29.39 106 (AILFWV) Таблица 1. Характеристика АК состава OmpF и OmpC поринов. OmpC Содержание, % 28.19 11.84 7.33 35.24 29.92 Положение элементов пространственной структуры (β-тяжи, изгибы и петли) в полипептидной цепи OmpF и OmpC белков было определено с помощью выравнивания их АК последовательностей с белком Ompk36 из Klebsiella pneumonia (код PDB 1OSM), для которого доступны данные рентгеноструктурного анализа. Топологические модели OmpF и OmpC поринов приведены на рис. 16. OmpC_YR_mature AEIYNKDGNK LDLYGKIDGL HYFSDNQSVD GDQSYMRFGL KGETQISDQL OmpF_YR_mature AEIYNKDGNK LDLYGKVDAR HQFSDNAGQD GDETYVRFGF KGETQITDQL β16 Т1 β1 L1 β2 Т2 51 100 OmpC_YR_mature VGYGQWEYQA NLNKTESQDN N-NFTRVGFA GLKFADFGSL DYGRNYGVLY OmpF_YR_mature TGYGQWEYNI QANHAESQST EGNKTRLGFA GLKFANYGSF DYGRNYGVIY β3 L2 β4 Т3 β5 101 150 OmpC_YR_mature DVTSWTDVLP EFGGDTYGA- DNFLSQRGNG ILTYRNNNFF GLVDGLNFAM OmpF_YR_mature DVNAWTDMLP VFGGDSLSAS DNFMTGRSTG LATYRNTNFF GMVDGLNFAL L3 β6 Т4 β7 151 200 OmpC_YR_mature QYQGKNGNGT ETNNGRDVAG QNGDGYGMSV SYDIGWGVSA SAAFASSKRT OmpF_YR_mature QYQGKNEEGR DK-----VKD ENGDGFGLSS TYDIGYGVTF GAGYSSSNRT L4 β8 Т5 β9 201 250 OmpC_YR_mature DEQNHDLLPG GQSIYGNGDH AEAYTAGLKY DANNVYMAAN YTQTYNLTRF OmpF_YR_mature VAQKDSTTAD G-------DK AQVWNIGAKY DANNVYLAVM YAEALNTTPY L5 β10 Т6 β11 251 300 OmpC_YR_mature GDFKNANTNA VYGFANKAQN IELVAQYQFD FGLRPSVAYL QSKGKDLG-- OmpF_YR_mature GNKFDD---- --TIANKTQD IEITAQYQFD FGLRPSLGYV QSKGKDLFGA L6 β12 Т7 β13 301 350 OmpC_YR_mature ---NYGDQDL VKYVDVGATY FFNKNMSTYV DYKINLLDEN QFTKNAGINT OmpF_YR_mature TGAPIGDQDL VKYVSVGSYY YFNKNMSTYV DYKINLLDKN DFTRANGINT L7 β14 351 Т8 β15 L8 362 OmpC_YR_mature DDIVAVGMVY QF OmpF_YR_mature DDVVGVGLVY QF β16 Рис. 16. Топологические модели OmpF и OmpC поринов Y. ruckeri. Линиями обозначены участки аминокислотной последовательности, соответствующие β-тяжам, участки наружных петель обозначены L1 – L8, участки периплазматических петель Т1-Т8. Отмечено также расположение остатков триптофана в полипептидной цепи белков. Темным цветом обозначены гомологичные АК остатки, серым –идентичные. Согласно топологической модели, построенной для OmpF E. coli, β-тяжи формируют высоко консервативные трансмембранные участки белка, а последовательности с неупорядоченной или α-структурой приходятся на наружные петли. В случае поринов НМ из Y. ruckeri, как и следовало ожидать, высоко консервативные участки соответствуют β-тяжам, а вариабельные участки – наружным петлям. Как видно из данных рис.16, исследуемые белки, подобно другим неспецифическим поринам грамотрицательных бактерий, состоят из 16 βтяжей, 8 наружных, или внешних (L1 – L8) и 8 периплазматических (Т1 – Т8) петель. Как следует из данных рис. 16, в отличие от неспецифических поринов E. coli порины Y. ruckeri подобно поринам других видов иерсиний, содержат по три остатка триптофана (Trp), два из которых одинаково расположены в полипептидной цепи обоих белков (Тrp56 - в 3-ем βтяже, Тrp105 - в петле L3). Положение третьего остатка Trp существенно различается: в OmpС белке Trp184 входит в состав периплазматической петли Т5, а в OmpF порине Тrp212 находится в 10-ом β-тяже. Наибольшие различия в АК последовательности OmpF и OmpС поринов Y. ruckeri, за исключением петли L3, отмечены в вариабельных участках, соответствующих наружным петлям (рис. 16). Как правило, степень подобия участков АК последовательности, соответствующих петле L3, среди поринов энтеробактерий очень высока и в отдельных случаях приближается к 100%. Исследуемые белки не являются исключением: степень подобия петли L3 OmpF и OmpС поринов Y. ruckeri составляет 79%. Однако, в высоко консервативном для поринов иерсиний пентапептиде PEFGG OmpF порин Y. ruckeri, в отличие от OmpC белка, имеет замену (Glu-111 заменен на Val-111). Потеря одного из отрицательно заряженных АК остатков в зоне констрикции (сужения) поры, несомненно, должна повлиять на свойства каналов исследуемых белков, в частности на ионселективность, поскольку петля L3 участвует в механизме «открытия-закрытия» канала, проникая внутрь поры и взаимодействуя с внутренней стенкой βбарреля. Повышенную вариабельность структуры наружных петель поринов, согласно общепринятому мнению, можно рассматривать как механизм «противостояния» системе иммунитета организма-хозяина, которая наряду с модуляцией экспрессии поринов в ответ на изменение условий окружающей среды является «стратегией выживания» патогенных микроорганизмов, развитой ими в процессе эволюции. Эти участки АК последовательности белков, как правило, служат антигенными детерминантами [163], сайтами связывания бактериофагов, бактериоцинов, и комплемента [164]. Кроме того, петля L2 участвует также в стабилизации тримерной структуры молекулы порина [60]. Известно [161], что степень подобия между поринами одного типа из разных видов бактерий выше, чем между поринами разных типов одного и того же вида микроорганизма. Проведенные нами расчеты для вариабельных участков АК последовательностей исследуемых поринов подтвердили эти наблюдения (табл. 2). Так, средняя степень подобия на одну петлю для OmpF и OmpC Y. ruckeri составляет только 44.7%, в то время как та же величина в случае OmpF белков Y. ruckeri и Y. pseudotuberculosis составляет 61.4%, а OmpC белков этих видов иерсиний – 55% (данные не приведены). Как видно из данных рис. 16 и табл. 2, петли L4, L5 и L6 OmpF и OmpC поринов Y. ruckeri существенно отличаются не только по длине, но и имеют наименьшую степень подобия первичной структуры. Скорее всего, именно эти участки полипептидной цепи поринов определяют основные иммунохимические различия исследуемых белков. В то же время степень подобия петель L1 и L8 исследуемых белков достаточно высока и составляет 63 и 69 % соответственно. Можно предположить, что в области этих петель находятся перекрестно реагирующие антигенные детерминанты неспецифических поринов Y. ruckeri. Таблица 2. Степень подобия (%) участков аминокислотной последовательности, соответствующих наружным петлям в пространственной структуре OmpF и OmpС поринов Y. ruckeri и Y. pseudotuberculosis. Ln Y. OmpF/Y. ruc Y.ruc ruc OmpF/ OmpC Y.psdt OmpF L1 63 75 L2 38 71 L3 79 93 L4 31 54 L5 20 38 L6 20 60 L7 38 31 L8 69 69 средний % 44.7 61.4 на петлю Однако, обнаружено, что между степенью подобия первичной структуры наружных петель и предпочтительной локализацией (количеством) антигенных детерминант на данном участке АК последовательности нет прямой корреляции. Расчеты, выполненные программы AntigenPro, представленной на сервере Scratch Protein помощью Predictor (http://www.ics.uci.edu/~baldig/scratch/) показали, что наибольшая вероятность локализации Вэпитопов приходится на петли L1 и L2 (рис. 17). В связи с этим, окончательный вывод о вкладе того или иного участка АК последовательности исследуемых поринов в антигенную структуру белков может быть сделан только после экспериментального исследования их иммунохимической активности. Рис. 17. Вероятность локализации В-эпитопов OmpF порина Y. ruckeri (в относительных величинах) 3.3.2. Сравнительный анализ пространственной структуры OmpF и OmpC поринов Y. ruckeri Для характеристики пространственной организации исследуемых белков в растворе использовали методы оптической спектроскопии: круговой дихроизм и собственную белковую флуоресценцию. Для солюбилизации образцов поринов использовали 0.25% раствор SDS, в котором, как было показано ранее [165] не происходит денатурации OmpF порина из псевдотуберкулезного микроба. Круговой дихроизм. Спектр КД OmpF порина в ближней УФ-области (240 - 310 нм), области поглощения остатков ароматических хромофоров и дисульфидных связей, имеет достаточно выраженную тонкую структуру, обусловленную остатками фенилаланина в области 260-270 нм, остатками тирозина в области 275-285 нм и триптофана в области 285-305нм (рис. 18, А кривая 1). В спектре КД OmpC порина в этой УФ-области те же характеристичные полосы менее выражены и имеют меньшую эллиптичность (рис. 18, Б кривая 1). Полученные данные указывают на то, что третичная структура OmpF Y. ruckeri более жестко фиксирована в этих условиях, нежели структура OmpC белка. Спектры КД исследуемых поринов в далекой УФ-области (190 - 240 нм), области поглощения пептидных связей, существенно различаются. OmpF белок имеет в этой области отрицательную полосу небольшой эллиптичности с «плечами» при 215 и 202 нм и положительную полосу малой эллиптичности при 195 нм (рис. 18, А кривая 2). Форма спектра КД этого порина указывает на достаточно высокое содержание β-структуры и присутствие небольшого количества α-спиральных участков в полипептидной цепи белка. Спектр КД OmpC порина в этой области имеет отрицательную полосу при 220 нм и положительную полосу большой эллиптичности при 197 нм, что свидетельствует о высоком содержании α-спирали во вторичной структуре белка. (рис. 18, Б кривая 2). 4 8 8 3 6 6 2 4 4 1 2 0 2 2 0 -1 200 220 240 260 280 -2 -2 -4 0 300 λ, нм -2 -4 [θ], 10-3 град см2 моль-1 [θ], 10-3 град см2 моль-1 10 1 10 [θ]M, 10-4 град см2 моль-1 5 16 8 2 16 12 6 1 12 8 4 4 2 0 8 4 [θ]M, 10-4 град см2 моль-1 Б А 0 0 200 220 240 260 280 -4 300 λ, нм -2 -4 Рис. 18. Спектры КД OmpF (А) и OmpC (Б) НМ Y. ruckeri в ближней (250 – 300 нм) УФобласти (кривые 1) и дальней (190 – 240 нм) УФ-области (кривые 2). Выводы, сделанные на основе качественной оценки спектров КД исследуемых поринов, были подтверждены расчётом элементов вторичной структуры (табл. 5), выполненным с помощью пакета программ CD Pro [31]. Как следует из данных табл. 3, содержание α-спирали в OmpC порине в 3 раза больше, нежели в OmpF белке. Поскольку порообразующие белки обоих типов (OmpF и OmpC), выделенные из НМ Y. ruckeri имеют высокое содержание (62.8 и 60.6 %) суммарной β-структуры, их можно отнести к белкам β-класса, что характерно для изолированных поринов грамотрицательных бактерий в растворах детергентов. Таблица 3. Содержание элементов вторичной структуры поринов OmpF и OmpC поринов НМ Y. ruckeri, %. α-cпираль* Образец β-структура* β- белка I II III I II III изгиб Omp F 2.3 3.9 6.2 28.9 12.3 41.2 21.6 Неупорядоченная структура 31.1 OmpC 6.1 8.9 15.0 25.4 12.7 38.1 22.5 24.5 *I, II, III –регулярная, искаженная и общая структуры соответственно. Собственная белковая флуоресценция. Спектры суммарной флуоресценции OmpF и OmpC поринов Y. ruckeri имеют различное положение максимумов. В случае OmpF порина максимум суммарной эмиссии находится при 323±1 нм, а в случае OmpC белка - при 339±1 нм. Максимумы триптофановой флуоресценции обоих поринов находятся, соответственно, при 335±1 и 340±1 нм. Аппроксимация суммарной эмиссии исследуемых белков спектральными формами излучения остатков триптофана и тирозина (рис. 14) показала, что в случае OmpF порина 24% остатков триптофана приходится на долю III формы (максимально доступной растворителю), а в случае OmpC белка это значение достигает 45%. Для анализа полученных данных нужно отметить, что подобно поринам других видов иерсиний OmpF и OmpC порины Y. ruckeri содержат по три остатка Trp, два из которых одинаково расположены в полипептидной цепи (Тrp56 - в 3-ем β-тяже, Тrp105 - в петле L3). Положение третьего остатка Trp существенно различается: в OmpС белке Trp184 входит в состав периплазматической петли Т9, а в OmpF порине Тrp212 находится в 10-ом β-тяже. Моделирование положений различающихся остатков триптофанов в исследуемых белках показало (табл. 4), что Trp184 OmpC порина при температуре 27 оС полностью доступен растворителю, в отличие от Trp212 OmpF порина. Данный факт хорошо обьясняет вышеописанные особенности спектров суммарной и триптофановой флуоресценции исследуемых белков при нормальных условиях. Таблица 4. Влияние температуры на доступность растворителю* остатков Trp184 OmpC Y. ruc и Trp212 OmpF Y. ruc. АК остатки Trp184 OmpC Y. ruc Trp212 OmpF Y. ruc. Температура 27 оС 97 оС 27 оС 97 оС % доступности растворителю 97,336 98,438 56,889 100,625 * - Расчет поверхности доступной растворителю проведен с помощью программы Discovery Studio 3.0 ( Discovery Studio Modeling Environment, Release 3.0, San Diego: Accelrys Software Inc., 2010) с размером грида 240 точек на атом и радиусом пробы 1.0 Å Следует отметить, что для обоих белков характерна невысокая интенсивность флуоресценции остатков триптофана. Это также свидетельствуют о том, что значительная часть остатков этого ароматического флуорофора в составе обоих белков либо подвергается тушению со стороны соседних групп, либо доступна растворителю. I 0,6 0,4 0,2 I фл при λвозб=280 нм I фл при λвозб=280 нм 0,8 S III Y Б 1,0 A 1,0 0,8 0,6 III I 0,4 Y 0,2 S 0,0 0,0 300 320 340 360 380 400 λ, нм 300 320 340 360 380 400 λ, нм Рис. 19. Спектры флуоресценции поринов OmpF (А) и OmpC (Б)НМ Y. ruckeri и их аппроксимация спектральными формами излучения остатков тирозина (Y) и триптофана (формы S, I, III). Возбуждение 280 нм. Температура 20 оС. А – Спектр OmpF порина: вклады остатков тирозина (27.9 %) и спектральных форм триптофана S, I и III (14.0, 47.7 и 24.5 соответственно). Б - Спектр OmpС порина: вклады остатков тирозина (11.4 %) и спектральных форм триптофана S, I и III (10.9, 32.4 и 45.3 % соответственно). Таким образом, изолированные OmpF и OmpC порины НМ Y. ruckeri в растворах детергентов имеют нативоподобную структуру и представляют собой β-структурированные мембранные белки, которые по своей пространственной структуре подобны неспецифическим поринам иерсиний [153] и других энтеробактерий [76]. 3.3.3. 3D структура мономеров и тримеров OmpF и OmpC поринов Y. ruckeri Анализ аминокислотных последовательностей поринов Y. ruckeri OmpF (код Uniprot E2FHC9) и OmpC (идентичная на 100% последовательности с кодом C4UFZ3) проведен с помощью модуля поиска прототипов программы МОЕ 2013.08 [166]. Для поринов Y. ruckeri в качестве прототипа была выбрана кристаллическая структура осмопорина (ompk36) Klebsiella pneumoniae (код PDB 1OSM) [167]. Степень идентичности аминокислотных последовательностей OmpF и OmpC поринов Y. ruckeri и прототипа составляют 63.5% и 75.4%, а степени подобия 72.0% и 83.0% соответственно. Выравнивание аминокислотных последовательностей OmpF и OmpC поринов Y. ruckeri и прототипа, на основе которого построены 3D-модели мономеров поринов показано на рис. 20. Рис. 20. Выравнивание АК последовательностей OmpF и OmpC поринов Y. ruckeri и прототипа осмопорина K. pneumonia (код PDB 1OSM). Внешние петли и элементы вторичной структуры указаны в соответствии с кристаллической структурой прототипа: - спиральные участки отмечены красным, -структура –синим цветом. Рисунок выполнен с помощью программы Maestro 9.3 ( ) На рис. 21 показана суперпозиция пространственной структуры мономеров исследуемых поринов и прототипа. Качество построенных моделей проверено программой МОЕ. Суперпозиция всех Сα-атомов 3D-моделей поринов Y. ruckeri и прототипа показала, что величина среднеквадратичного отклонения для OmpC и OmpF поринов составляет 0,68 Å и 0,77 Å соответственно. Основные отличия в структуре мономеров OmpC и OmpF поринов Yersinia ruckeri от прототипа наблюдаются в области внешних петель (рис. 21). А Б Рис. 21. 3D-суперпозиция моделей мономеров OmpС (А) и OmpF (Б) поринов Y. ruckeri и осмопорина Klebsiella pneumonia (код PDB 1OSM). Структуры белков показаны в виде ленточных диаграмм. OmpС и OmpF порины Y. ruckeri показаны оранжевым цветом и осмопорин Klebsiella pneumonia показан розовым цветом. На рисунке отмечены положения Nи C-концов и внешних петель. Теоретические модели пространственных структур OmpF и OmpC поринов Y. ruckeri построены методом сравнительного моделирования с помощью программы МОЕ 2013.08 (рис. 22). После 3D-протонирования окончательной модели проводилась оптимизация структуры молекул методом минимизации энергии с потенциалом сил Amber12:EHT. Величина потенциальной энергии 3D-моделей OmpF и OmpC поринов Y. ruckeri составляет -17794,8 кДж/моль и -19882,6 кДж/моль соответственно. Структуры мономеров Y. ruckeri по аналогии с прототипом представляют собой βбаррель (бочонок), образованный 18-ю β-тяжами, связанными восемью короткими периплазматическими петлями Т1-Т8 и восемью петлями различной длины L1-L8 (Рис. 22 и 23). Петля L2 участвует в образовании олигомерной структуры поринов. Петля L3 поринов направлена к центру поры, где она образует сужение канала. Петли L1, L4 - L8 направлены во внеклеточное пространство. А Б В Г Рис. 22. Теоретические модели пространственных структур мономерв OmpF (а, в) и OmpС (б, г) поринов Y. ruckeri (а, б - вид сбоку, в, г – вид сверху). Структуры белков показаны в виде ленточной диаграммы (β-структура отмечена желтым цветом, α-спирали красным цветом, изгибы синим цветом и неупорядоченная структура –белым цветом). На рисунке отмечены положения N- и C-концов и внешних петель L1-L8. Рис. 23. 3D-суперпозиция моделей мономеров OmpС и OmpF поринов Y. ruckeri. Структуры белков показаны в виде ленточных диаграмм желтого (OmpС) и розового (OmpF) цвета. Остатки триптофанов показаны в объемном виде. Остаток Trp 212 OmpF порина показан розовым цветом и остаток Trp 184 OmpC порина – желтым цветом. На рисунке отмечены петли L4-L7, для которых наблюдаются наибольшие различия в структуре. Однако, несмотря на сходство основных элементов пространственной структуры, OmpC и OmpF порины Y. ruckeri у этих обнаружены некоторые различия, например, в локализации одного из остатков остатков Trp (рис. 23). Так, Trp212 в 10-м β-тяже в OmpF белка входит в состав так называемого гидрофобного пояса (гирлянды), расположенного на внешней стороне барреля, что предполагает его взаимодействие с другими расположенными вблизи ароматическими остатками. Trp184 находится в цитоплазматической петле Т5, не имеет такого гидрофобного окружения и «выходит» на поверхность молекулы порина. Петли L4, L5 и L6 OmpC порина более длинные, а петля L7 более короткая, чем соответствующие петли OmpF порина. Остальные элементы пространственной структуры проявляют значительное сходство в строении. Анализ контактов в структуре мономеров показал, что структура порина стабилизирована водородными связями, гидрофобными контактами и ионными связями (табл. 5). Таблица 5. Количество контактов, стабилизирующих структуру мономеров OmpC и OmpF поринов Yersinia ruckeri. Вид контактов Количество контактов в Количество контактов в мономере OmpF мономере OmpC Водородные связи 105 105 Гидрофобные контакты 47 50 Ионные связи 22 15 Пространственные структуры неспецифических OmpC и OmpF поринов Y. ruckeri использовали для расчета содержания элементов вторичной структуры с помощью программы VEGA ZZ (гл. 4.8). Сравнение содержания элементов вторичной структуры OmpC и OmpF поринов Y. ruckeri и прототипа показало, что содержание β-структуры консервативно и хорошо согласуется с экспериментальными данными для поринов Y. ruckeri, полученными методами КД спектроскопии (табл. 6) Таблица 6. Содержание элементов вторичной структуры 3D-моделей мономеров OmpC и OmpF поринов Y. ruckeri и прототипа Порин α-спираль, % β-структура, % Неупорядоченная структура, % OmpF Y. ruckeri 5,8% 56,4% 37,8% OmpC Y. ruckeri 5,1% 58,9% 36,0% 1OSM K. Pneumonia 6,4% 56,1% 37,4% Функционально активной формой поринов в мембране является тример. Теоретические модели тримеров OmpC и OmpF поринов Y. ruckeri построены и оптимизированы с помощью программы МОЕ 2013.08 с использованием в качестве прототипа кристаллической структуры тримера осмопорина (Ompk36) K. pneumoniae (рис. 21 ). Анализ контактов, стабилизирующих структуру тримеров, показал, что структура олигомеров стабилизируется водородными межмономерными контактами (табл. 7). и ионными связями и гидрофобными Таблица 7. Межмономерные контакты, стабилизирующие структуру тримеров OmpC и OmpF поринов Yersinia ruckeri. Вид контактов Количество контактов в Количество контактов в тримере OmpF тримере OmpC Водородные связи 24 19 Гидрофобные контакты 38 35 Ионные связи 6 6 Полярные контакты образуются в области внешних петель с участием петли L2 и со стороны периплазмы (рис. 24, А). В стабилизации олигомерной структуры OmpF порина Y. ruckeri участвует большее количество контактов, чем количество контактов, стабилизирующих структуру OmpC тримера Y. ruckeri (табл. 7). Это коррелирует с данными о термостабильности исследуемых белков. А Б В Рис. 24 . Пространственная структура OmpF порина Y. ruckeri. А. Полярные межмономерные контакты, стабилизирующие структуру тримера. Структура мономеров М1 и М2 порина показана в виде ленточной диаграммы зеленого и красного цвета. Аминокислотные остатки, образующие полярные контакты, показаны в объемном виде; Б. Вид сверху; В. Вид сбоку. Таким образом, впервые построены полноатомные модели пространственной структуры мономеров и тримеров OmpC и OmpF поринов Yersinia ruckeri высокой точности. Сравнение пространственных структур OmpC и OmpF поринов Y. ruckeri показало, что основные различия наблюдаются в строении внешних петель. В молекулах OmpC и OmpF поринов присутствуют три остатка триптофана, из которых положение двух остатков триптофана консервативно, а положение третьего остатка различно для OmpC и OmpF поринов. 3.4. Изменения в пространственной структуре OmpF и OmpC поринов Y. ruckeri под действием температуры 3.4.1. Сравнительный анализ изменений в молекулярной структуре и микроокружении ароматических флуорофоров в молекулах OmpF и OmpC OmpF и OmpC поринов в процессе термоденатурации Для того чтобы определить, насколько различия в пространственной структуре исследуемых белков влияют на их термоустойчивость, мы провели сравнительный анализ изменений в их молекулярной структуре под действием температуры с помощью SDS, ПААГэлектрофореза (рис. 25). Полученные данные свидетельствовали о различной стабильности тримерной структуры исследуемых поринов. Заметная полоса в области мономера OmpF белка появлялась при температуре 70-80°С, полное превращение олигомеров в денатурированный мономер наблюдалось только при температуре 90°С. В случае OmpC порина диссоциация тримеров белка начиналась при 65°С и заканчивалась при 75°С. А Рис. 25. Электрофореграммы образцов и OmpC поринов Y. Б ruckeri, прогретых при различных температурах. А - OmpF порин; Б - OmpC порин; образцы белков были инкубированы в течение 10 мин при указанных температурах; М - белки-маркеры (мол. масса указана в кДа). Изучение процесса температурной денатурации исследуемых белков с помощью метода собственной белковой флуоресценции подтвердило результаты, полученные с помощью SDS, ПААГ-электрофореза (рис.23). Обнаружено, что в процессе термоденатурации белков в микроокружении ароматических флуорофоров в составе OmpF и OmpC поринов происходят различные изменения, поскольку характер изменения интенсивности суммарной эмиссии исследуемых поринов под действием температуры и, соответственно, соотношения R (I320/I350) различается. Середины переходов, отражающих зависимость изменения соотношения R от температуры при термоденатурации OmpF и OmpС приходятся на 87 и 70°С соответственно. Таким образом, подобно неспецифическим поринам НМ других грамотрицательных бактерий, OmpF порин Y. ruckeri оказался более устойчив к действию температуры, нежели порин OmpC типа. λmax при λвозб=296 нм 365 1 360 355 350 345 2 340 335 330 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 температура, С Рис. 26. Изменение положения спектра триптофановой флуоресценции поринов Y. ruckeriв процессе термоденатурации. 1– OmpF, 2 – OmpC (λвозб. 280 нм) Существенные различия были обнаружены также в характере изменения положения максимума триптофановой флуоресценции исследуемых белков. Как видно из данных рис. 26, в случае OmpC порина, существенного сдвига λmax в длинноволновую область спектра при нагревании белка не наблюдается. Это свидетельствует о том, что изменение конформации молекулы OmpC порина в процессе термоденатурации, скорее всего, мало связано с изменением доступности остатков Trp растворителю. Напротив для OmpF порина при температуре выше 90 °С характерно резкое изменение микроокружения остатков Trp, связанное с высоко кооперативным переходом этих флуорофоров в состояние, подобное состоянию свободного Trp. Для анализа изменений в конформации (пространственной ориентации) остатков триптофана в OmpC и OmpF поринов из Y. ruckeri, наблюдаемой в результате термоденатурации этих белков, был использован метод молекулярной симуляции 3D-структур мономеров этих белков при температурах 300 и 395 К (27 и 87 ºС). Расчёт изменений в процессе термоденатурации поверхности доступной растворителю различающихся по положению остатков триптофана в исследуемых белках показал следующий эффект. Остаток Trp212 OmpF порина при увеличении температуры от 27 до 97 оС становится в два раза более доступным для растворителя, в то время как Trp184 OmpC порина не меняет своей доступности (табл. 8). Таблица 8. Влияние температуры на доступность растворителю* остатков Trp197 OmpC Y. ruc и Trp212 OmpF Y. ruc. АК остатки Trp184 OmpC Y. ruc Trp212 OmpF Y. ruc. Температура 27 оС 97 оС 27 оС 97 оС % доступности растворителю 97,336 98,438 56,889 100,625 * - Расчет поверхности доступной растворителю проведен с помощью программы Discovery Studio 3.0 (Accelrys Software Inc., Discovery Studio Modeling Environment, Release 3.0, San Diego: Accelrys Software Inc., 2010) с размером грида 240 точек на атом и радиусом пробы 1,0 Å. С помощью моделей пространственной структуры исследуемых белков было наглядно показано, как изменяется положение боковой цепи остатков триптофана относительно барреля поверхности OmpF и OmpC поринов (рис. 27) при термоденатурации. Рис. 27. 3D-суперпозиция структур мономеров OmpF и OmpC поринов Y. ruckeri после молекулярно динамической симуляции в течении 1нс при температуре Т 300 и Т 370 К. Структура белка показана красным (Т 300 К) и синим (Т 370 К) цветом. Аминокислотные остатки Trp212 и Trp 184 показаны в шаростержневой форме красного (Т 300 К) и синего (Т370 К) цвета. Как видно из данных рис. 27, для OmpF порина при термоденатурации характерно значительное изменение положения индольного кольца остатка Trp212. В нативном OmpF белке плоскость этого кольца расположена практически параллельно тяжам барреля, при повышенной температуре она разворачивается (почти на 90 градусов по отношению к исходному положению). В случае OmpC порина изменения, происходящие в процессе термоденатурации, мало связаны с изменением доступности остатков Trp184 растворителю. Таким образом, было показано, что OmpF порин Y. ruckeri, по сравнению с белком OmpC и поринами других энтеробактерий обладает повышенной термоустойчивостью. Температура перехода ТСБ тример – ТЛБ мономер составляет 80-90 о С. Методом молекулярной динамики впервые показано, что определяющим фактором в изменении параметров спектра триптофановой флуоресценции OmpF порина при повышенной температуре (в частности сдвига максимума эмиссии триптофана в длинноволновую область) является изменение конформации (пространственной ориентации) остатка Trp212и, соответственно, изменение во взаимодействии этого флуорофора с окружающими аминокислотными остатками и молекулами растворителя. Конформационный переход молекулы OmpC порина в процессе термоденатурации, напротив, мало связан с изменением доступности остатков Trp растворителю. Ранее нами было показано[153], что различие в расположении 3-его остатка Trp является общим свойством первичной структуры OmpF и OmpC поринов иерсиний. В связи с этим, мы считаем, что исследование характера изменения эмиссии триптофана при термоденатурации этих белков может служить способом определения принадлежности неспецифических поринов иерсиний. Такой метод может представлять практический интерес, учитывая простоту эксперимента и минимальное количество белка (50-100 мкг). 3.4.2. Мониторинг изменений в пространственной структуре OmpF порина под действием температуры Ранее мы показали, что для поринов из ряда патогенных и непатогенных видов иерсиний температурный интервал необратимого конформационного перехода, связанный с диссоциацией олигомеров белка, составляет 50 – 70°С [168, 153]. Однако, в случае порина OmpF Y. ruckeri по данным SDS, ПААГ –электрофореза и собственной белковой флуоресценции (раздел 3.4.1.) температура этого перехода оказалась на 15-20 градусов выше по сравнению с поринами других видов иерсиний. Этот факт представляет особый интерес, поскольку до сих пор в литературе не встречалось сообщений о столь высокой степени термоустойчивости среди поринов НМ бактерий. В связи с этим мы провели более детальное исследование изменений в пространственной организации OmpF порина под действием температуры с помощью оптических методов и микрокалориметрии. Изучение структуры OmpF порина из НМ Y. ruckeri с помощью методов КД и собственной белковой флуоресценции показало, что процесс его температурной денатурации сопровождается конформационными изменениями на различных уровнях пространственной структуры белка. Круговой дихроизм. На рис. 28 представлены спектры OmpF порина в пептидной области до и после прогревания образца белка при 90 оС. Как видно из данных рисунка, исходный порин имеет спектр, подобный спектрам белков, в структуре которых доминирует βструктура. Об этом свидетельствует отрицательный максимум при 215 нм. . Рис. 28. КД спектры OmpF порина из НМ Y. ruckeri: записанные при температуре 25 (1) и 97 оС -(2) в течение 2 мин уравновешивания. КД данные представлены в виде усредненного остатка молярной эллиптичности ([θ] MRW). В спектре термоденатурированного (ТМ) порина появляется отрицательный максимум при 207 нм и плечо при 220 нм. Изменение характера спектра порина после нагревания указывает на присутствие в структуре белка значительной доли α-спиральных участков, что характерно для белков α + β типа. Анализ вышеприведенных спектров КД исследуемого белка с помощью расчетных методов показал [31], что при переходе от тримерной формы порина к мономерной происходит резкое увеличение (в 4.4 раза) доли α-спиральных участков и уменьшение содержания (в 1.5 раза) суммарной β-структуры, в то время как содержание неупорядоченной структуры остается практически неизменным (табл. 9). Таким образом, изменения на уровне вторичной структуры OmpF порина из Y. ruckeri под действием температуры подобны таковым в структуре поринов из других видов иерсиний, в частности ОmpF порина из НМ Y. pseudotuberculosis [168]. Таблица 9. Содержание элементов вторичной структуры в OmpF порина НМ Y. ruckeri, %. α-cпираль* Образец β-структура* Неупоря- β- доченная Белка I II III I II III изгиб Omp F (23о С) 2.3 3.9 6.2 28.9 12.3 41.2 21.6 31.1 Omp F (90о С) 14.0 13.3 27.3 17.0 10.0 27.0 18.9 27.7 Форма *I, II, III –регулярная, искаженная и общая структуры соответственно. Собственная белковая флуоресценция. OmpF порин НМ Y. ruckeri содержит три остатка триптофана и 29 остатков тирозина. Для анализа изменений на уровне третичной структуры (изменений в микроокружения ароматических флуорофоров) исследуемого белка под действием температуры мы использовали его эмиссию при возбуждении 280, 296 и 305 нм. Как показал анализ полученных спектров, третичная структура порина оказалась достаточно чувствительной к действию температуры. Как и в случае поринов из других видов иерсиний [168], для OmpF белка из НМ Y. ruckeri под действием температуры наблюдается постепенное уменьшение интенсивности флуоресценции, так называемое температурное тушение. Кроме того, помимо потери жесткости пространственной организации белковой молекулы в целом для термостабильного мономера (ТМ) порина, проявляющейся в уменьшении амплитуды спектра КД белка в ароматической области, пространственная структура ТМ порина отличалась от структуры тримерной формы белка по взаиморасположению ароматических флуорофоров. Это проявлялось в сдвиге максимума суммарной эмиссии ТМ по сравнению с тримером в коротковолновую область спектра на 20 нм (рис.29) . Как известно, такое явление носит название «голубого сдвига» максимума суммарной флуоресценции белка. λ, нм 360 350 340 330 λex= 280 нм λex= 296 нм 320 λex= 305 нм 310 300 50 60 70 80 90 100 Т, 0С Рис. 29. Изменение максимума спектра триммера OmpF порина НМ Y. ruckeri под действием температуры при разных длинах волн возбуждения. Сдвиг обусловлен увеличением вклада остатков тирозина в суммарное излучение белка за счет уменьшения эффективности передачи энергии возбуждения от тирозина к триптофану вследствие увеличения расстояния между ароматическими флуорофорами и/или тушения флуоресценции триптофана растворителем на поверхности белковой глобулы. Интересно отметить, что взаиморасположение ароматических флуорофоров в молекуле порина до 70 оС практически не меняется. Однако уже при 70 оС наблюдается резкое смещение максимума спектра суммарной флуоресценции OmpF порина, что свидетельствует о высокой степени кооперативности термоперехода в белке и указывает на его денатурацию (рис. 29). Положение максимума триптофановой флуоресценции OmpF порина (при 296 нм) при увеличении температуры смещается в длинноволновую область спектра. До 85 оС, когда по данным SDS, ПААГ-элекрофореза в растворе присутствуют в основном тримеры белка, это изменения незначительно. Затем в интервале 85-90 оС происходит резкое смещение λмакс спектра белка в область свободного Trp, очевидно, связанное с диссоциацией тримера порина на мономеры. Ранее в работе [169] на примере порина из E. coli было показано, что при возбуждении триптофановой флуоресценции при 305 нм излучают только остатки Трп-61, находящиеся в межмономерном пространстве, т. е. 3-ем тяже. В случае OmpF порина Y. ruckeri в подобном положении находится Trp 56. Мы использовали возбуждение эмиссии триптофана при 305 нм для того, чтобы еще более точно определить температуру диссоциации тримеров OmpF порина. В этом случае, как следует из данных рис. 29 при 85 оС максимум эмиссии порина изменяется от 340 до 350 нм (максимума эмиссии свободного Trp). Для того чтобы определить, какие изменения в микроокружение ароматических флуорофоров в молекуле OmpF порина вносит температурная диссоциация, мы провели мониторинг изменений вкладов излучения тирозина и различных спектральных форм триптофана. Результаты представлены на рис. 30. Как следует из данных рис., при увеличении температуры в эмиссии порина происходит существенное перераспределение вкладов I и III форм триптофана: значительно увеличивается количество остатков триптофана, экспонированного в воду за счет соответствующего уменьшения остатков триптофана в гидрофобном окружении. Следует отметить, что небольшое гидрофобное ядро в молекуле порина сохраняется (наблюдается небольшое увеличение остатков триптофана формы S) и практически не изменяется вклад остатков тирозина. F 0,5 I III 0,4 Tyr 0,3 S 0,2 0,1 20 30 40 50 60 70 80 0 90 T, C Рис. 30. Температурная зависимость относительной эмиссии OmpF порина Y. ruckeri и вкладов спектральных форм триптофана. Сравнительный анализ изменений в структуре порина OmpF порина в процессе термодентурации. КД в дальней УФ-спектроскопии является чувствительным методом мониторинга изменений вторичной структуры белка, поэтому для изучения перестроек на этом уровне структуры белка использовали изменения эллиптичности OmpF белка при 210 нм (θ210). На рис. 31 представлены объединенные результаты изменений под действием температуры в пространственной и молекулярной структуре OmpF порина из Y. ruckeri, определяемые методами КД, собственной белковой флуоресценции (R = I350/I320) и SDS, ПААГэлектрофорезом. Как видно из данных рис. 31, эти изменения сопровождаются поэтапной перестройкой структуры белка на различных уровнях его пространственной организации. Характер зависимости изменения эллиптичности OmpF белка при 210 нм от температуры свидетельствует о том, что основные изменения на уровне вторичной структуры порина происходят в интервале 60-85 оС (рис. 31). При более низкой температуре (в интервале 20-60 о С) наблюдается плавное повышение эллиптичности, что, очевидно, можно связать с незначительными перестройками в области петель, участков АК последовательности порина с относительно гибкой структурой. Середина температурного перехода на уровне вторичной структуры ОmpF порина (Tm), приходится на 77.5 оС. При этом на кривой зависимости можно выделить два перехода: первый с серединой перехода 70-72 оС, второй – 80-82 оС. Рис. 31. Относительные изменения под действием температуры в пространственной структуре OmpF порина из Y. ruckeri. Для характеристики изменений методом собственной белковой флуоресценции (чёрная линия) взята величина отношения интенсивностей флоуресценции при длинах волн 350 и 320 нм, для характеристики изменений методом КД (синяя линия) взята величина средней молярной эллиптичности при 210 нм. В интервале 60-75 оС (первый переход) отмечен интенсивный рост эллиптичности, предположительно, мономеров порина, вызванный значительными предшествующими изменениями диссоциации тримера во вторичной OmpF белка. структуре В этом температурном интервале, согласно данным SDS, ПААГ-электрофореза, олигомерная структура порина еще сохраняется. Дальнейшее повышение температуры, в интервале 75-85 оС, (второй переход) приводит к резким изменениям на уровне вторичной структуры белка, которые сопровождаются кооперативным переходом на уровне третичной и четвертичной структуры белка, т.е происходит диссоциация тримеров порина. Важно отметить, что изменения вторичной структуры предшествующие денатурации ТЛБ формы до ТСБ мономеров являются обратимыми. Об этом говорят результаты наших исследований функциональной активности белка, которые показали, что при реконструкции образца OmpF порина, прогретого до 85 оС в липидный бислой, их функциональная активность восстанавливается до нормальной в течение часа (гл 2.2, рис. 10-1, кривая 2). Этот эффект можно объяснить присутствием в этих условиях нестабильных интермедиатов тримеров порина, которые легко восстанавливают функционально активную конформацию в липидном бислое. Как уже отмечалось выше, OmpF Y. ruckeri является необычным по термоустойчивости белком по сравнению с другими известными неспецифическими поринами иерсиний. Как правило, температура необратимого термоперехода диссоциацией на мономеры, не превышает 70 о этих белков, сопровождающаяся С, при этом порины теряют свою функциональную активность. С помощью сканирующей микрокалориметрии была определена точка плавления ТЛБ тримеров OmpF порина Y. ruckeri. Избыточная теплоемкость белка описывается кривой с максимумом при при 82.5 оС и полушириной 2.5 оС (рис. 32 ). Рис. 32. Температурная зависимость избыточной удельной теплоемкости OmpF порина Y. ruckeri. Концентрация порина 0.7 мг/мл. Скорость прогрева образца белка 1 К/мин. Следует отметить, что тепловой переход исследуемого белка необратим, поскольку при повторном прогреве образца порина изменения теплоемкости белка не наблюдалось. Значение температуры тотального плавления OmpF порина хорошо согласуется с данными конформационного перехода на уровне четвертичной структуры белка (диссоциации олигомера порина). 3.5. Иммунологическая и иммунохимическая характеристика OmpF порина Y. ruckeri 3.5.1. Иммуногенные и иммунохимические свойства OmpF порина Y. ruckeri Изолированный тример OmpF порина НМ Y.ruckeri обладал высокой иммуногенностью, поскольку трехкратная иммунизация мышей линии BALB/c позволила получить антисыворотку с титром антител равным 1/25600 (4.4 в -lg) (рис. 33). 2,50 АТ/тример Om pF Y.ruckeri 2,00 ОП 492 нм АТ/норм. 1,50 1,00 0,50 0,00 1/200 -0,50 1/400 1/800 1/1600 1/3200 1/6400 1/12800 1/25600 разведение сыворотки Рис. 33. ИФА взаимодействия тримера OmpF порина НМ Y. ruckeri с гомологичной антисывороткой, полученной при иммунизации мышей линии BALB/c. Обнаружено, что антисыворотка к тримеру OmpF порина Y. ruckeri взаимодействует с тримерами OmpF поринов некоторых видов патогенных и непатогенных иерсиний - Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica, Y. frederiksenii, Y. intermedia. Результаты ИФА (рис. 34) взаимодействия этой антисыворотки с указанными гетерологичными антигенами демонстрируют достаточно высокий (60-88 %) уровень перекрестных реакций между OmpF поринами бактерий рода Yersinia., что свидетельствует о значительной доле у поринов рода Yersinia общих эпитопов (гомологичных участков связывания). Рис. 34. ИФА взаимодействия антисыворотки к OmpF порину НМ Y. ruckeri с OmpF поринами некоторых видов патогенных и непатогенных иерсиний. Обозначения: (посл.) – подобие (%) полной АК последовательности исследуемых поринов, (петли) – подобие (%) участков наружных петель и (ИФА) Мы провели расчеты степени подобия полных АК последовательностей исследуемых белков и вариабельных участков, соответствующих наружным петлям в структуре белков. Полученные расчёты свидетельствуют о высокой степени подобия первичной структуры поринов в целом, степень подобия которых достигает значения 83-87% (рис. 32). Однако степень подобия вариабельных участков структуры исследуемых белков (рис. 32, табл.10) существенно ниже (в среднем около 60%). Это указывает на то, что, с одной стороны, участки петель содержат общие детерминанты поринов иерсиний, а с другой, могут играть значительную роль в антигенной специфичности этих белков. Таблица 10. Расчетные данные степени подобия наружных петель OmpF поринов различных видов иерсиний OmpF порин OmpF_Y OmpF_Y OmpF_Y OmpF_Y OmpF_Y OmpF_Y OmpF_Y OmpF_Y (∑ степень R_matur R_mature R_mature R_mature R_mature R_mature R_mature R_mature подобия e L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7 L8 40.0 93.3 42.8 53.8 44.4 23.0 58.8 60.0 93.3 42.8 53.8 55.5 15.3 64.7 57.1 90.0 46.6 44.4 33.3 23.0 58.8 71.4 90.0 33.0 53.8 44.4 30.7 88.0 петель, %) OmpF YF4849 87.5 (55.5%) OmpF YPS 75.0 31758 (57.5%) OmpF YI 253 62.5 (51.9%) OmpF YE164 100 (66.3%) 3.5.2. Определение элементов антигенной структуры OmpF порина Y. ruckeri Как известно, антитела вырабатываются только на ограниченные участки молекулы белка, представляющие собой линейные и составные (конформационные) эпитопы данного антигена. В связи с этим, сведения о степени подобия полных АК последовательностей и участков внешних петель исследуемых поринов не дают точного представления о гомологии в области их эпитопов. Учитывая высокую степень подобия первичных структур поринов Y. ruckeri и Y. pseudotuberculosis, для определения вклада эпитопов разного типа (линейных и конформационных) в антигенную структуру OmpF порина Y. ruckeri были использованы обе молекулярные формы (ТЛБ тример и ТСБ мономер) сравниваемых OmpF белков, а также синтетические пептиды, соответствующие участкам наружных петель и рекомбинантные мутантные белки порина псевдотуберкулезного микроба с делециями этих петель. 3.5.2.1. Характеристика рекомбинантных мутантных белков OmpF порина из НМ Y. pseudotuberculosis. Как показали наши исследования, для спектров КД мутантных OmpF поринов в ароматической области по сравнению со спектром полноструктурного рекомбинантного тримера (РБ-2) наблюдается более низкая амплитуда (del4 и del8) и меньшая степень разрешенности полос (del1,del6 и del8), что указывает на меньшую жесткость третичной структуры тримеров мутантных белков. Спектры КД образцов мутантных поринов в области поглощения пептидных связей являются характерными для β-структурированных белков α+βтипа. Однако форма спектров поринов с делециями различных петель (интенсивность отрицательных и положительных полос) несколько различаются между собой и по отношению к полноструктурному порину. Эти различия были подтверждены с помощью расчета содержания элементов вторичной структуры исследуемых поринов, выполненного по методу CONTIN/CONTINLL (пакет программ CDPro [31]. Таким образом, отсутствие той или иной наружной петли определенным образом влияет на соотношение элементов регулярной вторичной структуры порина. Спектры суммарной эмиссии мутантных поринов и их аппроксимация спектральными формами излучения остатков триптофана и тирозина указывают на значительные различия в микроокружении ароматических флуорофоров. Отсутствие петли L8 в наименьшей степени приводит к изменениям в третичной структуре рекомбинантного тримера. В то же время в случае мутантных поринов с делециями петель L1 и L6 по сравнению с РБ-2 наблюдается существенное увеличение доли триптофановых остатков спектральной формы I (в 1.8 и 2.2 раза соответственно). Тем не менее, все мутантные белки, подобно РБ-2, имеют длинноволновое положение максимумов как суммарной, так и триптофановой флуоресценции по сравнению с таковым для нативного порина [170]. В случае del1 и del6 это может быть обусловлено увеличением вклада триптофана спектральной формы II и уменьшением вклада триптофана спектральной формы S в эмиссию мутантных белков (табл. 11). Таблица 11. Вклад спектральных форм триптофана в спектрах флуоресценции мутантных и полноструктурного рекомбинантных поринов Образец S* I II III del1 0.000 0.491 0.405 0.104 del4 0.169 0.000 0.000 0.832 del6 0.005 0.616 0.000 0.379 del8 0.102 0.258 0.285 0.355 РБ-2 0.099 0.201 0.269 0.431 Таким образом, пространственная структура мутантных белков по сравнению с таковой для полноструктурного рекомбинантного порина имеет свои особенности на уровне как вторичной, так и третичной структуры белка. Мутантные порины оказались в разной степени иммуногенны для экспериментальных животных (мышей линии BALB/c). В результате трехкратной иммунизации мышей рекомбинантными белками (полноструктурным и мутантными) в количестве 100 мкг/мышь были получены иммунные сыворотки с рабочим разведением 1/6400. Анализ полученных результатов (рис. 35) позволяет предположить, что участок, соответствующий петле L8, не содержит Т-эпитопов, т.к. отсутствие этой петли не сказывается на иммуногенности (эффективность образования антител) белка del8 по сравнению с таковой полноструктурного порина. Напротив, иммуногенность образца del1 оказалась значительно ниже, что может свидетельствовать о наличии Т-хелперных эпитопов в первичной последовательности участка, соответствующего данной петле 3 del1 del4 del6 del8 РБ-2 контроль 2,5 ОП 492 нм 2 1,5 1 0,5 0 1/100 1/200 1/400 1/800 1/1600 1/3200 1/6400 1/12800 1/25600 1/51200 разведение сыворотки Рис. 35. Определение титров сывороток, полученных при иммунизации мышей мутантными и полноструктурным рекомбинантными поринами. . Мутанты del4 и del6 оказались более иммуногенными для мышей даже по сравнению с полноструктурным рекомбинантным белком РБ-2. Такой результат можно объяснить следующим образом. Скорее всего, в случае отсутствия одной из вышеуказанных наружных петель «разрыхление» третичной структуры мутантных поринов делает «внутренние» Тэпитопы белка, соответствующие участкам β-тяжей порина, более доступными для антигенпрезентирующих клеток. 3.5.2.2. Элементы антигенной структуры OmpF порина Y. ruckeri Как следует из данных рис. 36, несмотря на высокую степень подобия полных АК последовательностей OmpF поринов Y. ruckeri и Y. pseudotuberculosis степень подобия линейных детерминант белков невелика. Очевидно, определяющим фактором во взаимодействии OmpF порина Y. ruckeri с гетерологичными антителами является степень подобия конформационных детерминант. Так, в случае рекомбинантных мутантных белков с делециями петель мы наблюдали значительное уменьшение полноты связывания. Очевидно, это связано с утратой одного из элементов структуры порина, что, как было сказано выше, может вызывать изменения в конформации остальных наружных петель. 1,8 1,6 1,4 ОП 492 нм 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 Y. . но рм pF Ат ru ck er i ps dt . O m pF m O ТЛ Б ТС Б O m антитела к антигенам Y. Y. ps dt . pF de l8 de l6 de l4 de l1 0 Рис. 36. А. ИФА взаимодействия тримера OmpF Y. ruckeri с антисыворотками к различным молекулярным формами и мутантным белкам OmpF порина Y. Pseudotuberculosis. Б. ИФА взаимодействия тримера ТСБ мономера OmpF порина Y. pseudotuberculosis с гомологичными антителами. Ингибиторы: ТСБ OmpF поринов Y. pseudotuberculosis (ТСБ Y. psdt.) и Y. ruckeri (ТСБ Y. ruck.). Также уменьшалась в 2 раза эффективность взаимодействия OmpF Y. ruckeri с антителами к ТСБ мономеру порина Y. pseudotuberculosis по сравнению с таковой при взаимодействии с антителами к тримеру порина псевдотуберкулезного микроба (рис.36, А). Кроме того, был выявлен достаточно низкий уровень торможения специфического связывания при ингибировании реакции связывания ТСБ мономера OmpF порина Y. pseudotuberculosis с гомологичными антителами соответствующим мономером OmpF порина Y. ruckeri (рис. 36, Б). Скорее всего, это связано с тем, что в процессе термоденатурации тримеров поринов конформационные детерминанты разрушаются, и в реакции участвует только часть эпитопов, представленных линейными детерминантами и устойчивыми к действию температуры общими эпитопами, сохранившимися на более высоких уровнях организации молекулы белка. Подобные результаты были описаны в литературе. Так, Pages с соавторами [171] обнаружили, что моноклональные антитела, полученные к порину из E. coli В не распознавали денатурированную форму белка из-за утраты конформационных эпитопов и взаимодействовали только с нативным порином из этого штамма. Ранее нами также было показано, что термоденатурированный мономер порина из Y. pseudotuberculosis показал меньшую (на 30%) эффективность по сравнению с тримером белка при ингибировании системы поликлональная антисыворотка к тримеру белка – комплекс ПГ-белок (в составе которого порин находится в нативной тримерной форме) [168]. Одним из методов, применяемых для детального исследования антигенной структуры белков, является использование специфических моноклональных антител. Тем не менее, определенные представления о локализации антигенных детерминант можно получить и при использовании поликлональной сыворотки [172]. Так, например, применяя в качестве ингибиторов синтетические пептиды, структура которых соответствует наружным петлям порина, может быть выявлено участие той или иной петли в формировании антигенных детерминант [172]. Мы использовали этот подход для выяснения роли некоторых наружных петель в формировании антигенной структуры OmpF порина Y. ruckeri (рис. 37). В связи с этим, для исследования были использованы синтетические пептиды, соответствующие наружным петлям L1, L4, L6, L8 OmpF порина Y. pseudotuberculosis (коммерческие пептиды производства Peptide 2.0 Inc., USA). С помощью реакции ингибирования специфической тест-системы (OmpF порин Y. ruckeri - гомологичная антисыворотка) указанными синтетическими пептидами было проведено сравнение антигенной структуры исследуемых поринов в области наружных петель (L1, L4, L6, L8). Рис. 37. Ингибирование реакции взаимодействия (ИФА) OmpF порина Y. ruckeri с гомологичной антисывороткой. Ингибиторы: синтетические пептиды, соответствующие участкам наружных петель L1, L4, L6, L8 OmpF порина Y. pseudotuberculosis. [C] ингибитора 16 мкг. Обнаружено, что только для петли L1 существует определенная корреляция между высокой степенью подобия этих участков АК последовательностей поринов Y. ruckeri и Y. pseudotuberculosis (75%) и наибольшим уровнем ингибирования соответствующим пептидом (22.7%) реакции связывания OmpF порина Y. ruckeri с гомологичной антисывороткой (рис. 37). Для пептида, соответствующего петле L4 со значительно меньшей степенью подобия АК последовательностей поринов (42.5%), тем не менее, наблюдался достаточно высокий уровень ингибирования (17%). В то же время пептиды, соответствующие петлям L6 и L8, практически не ингибировали данную тест-систему. Из полученных результатов можно сделать вывод о том, что петли L1 и L4 участвуют в формировании В-эпитопов OmpF порина Y. ruckeri. и играют значительную роль в образовании перекрестно реагирующих антигенных детерминант белка. Кроме того, построение 3D модели (рис 38) показало, что участки, соответствующие петлям L1 и L4 в нативной структуре исследуемых поринов, более доступны для взаимодействия с клетками иммунной системы, чем, например, петля L6. Таким образом, можно предположить, что участки петель L1 и L4 (или их фрагменты) являются иммунодоминантными эпитопами OmpF порина Y. ruckeri. Отсутствие ингибирования реакции связывания OmpF порина Y. ruckeri с гомологичной антисывороткой пептидами, соответствующими петлям L6 и L8, может быть вызвано малым количеством АГ детерминант, находящихся в данных петлях и/или низкой степенью гомологии этих эпитопов. Возможно также, что АГ детерминанты, входящие в состав петель L6 и L8 являются прерывистыми, а участки нативной структуры поринов Y. ruckeri и Y. pseudotuberculosis в пределах этих петель в значительной степени отличаются по конформации. Построение 3D модели (рис. 38) OmpF порина Y. ruckeri подтверждает различную пространственную ориентацию рассматриваемых петель и, соответственно, их различную доступность. Рис. 38 Пространственная модель (А) тримера и (Б) мономера OmpF порина Y. ruckeri. Изображение дано в виде ленточных диаграмм. С помощью программы, доступной на сервере IEDB Analysis Resource [173], была вычислена вероятность расположения Т-эпитопов молекулы OmpF порина, Y. ruckeri, взаимодействующих с рецепторами MHC-II класса мыши (табл. 12). Данные эпитопы отвечают за общую иммуногенность и способность лимфоцитов вырабатывать антитела к антигену. В табл. 12 приведены участки первичной структуры исследуемого порина, с наибольшей вероятностью связывающиеся с белками MHC II (чем меньше расчетное значение, тем вероятнее локализация эпитопа). Величины, характеризующие вероятность локализации Тэпитопов в остальных участках АК последовательности белка, согласно расчетам, были меньше на порядок. Таблица 12. Относительная вероятность локализации Т-эпитопов молекулы OmpF порина Y. ruckeri Участок последовательности белка Относительная вероятность Локализация расположения Т-эпитопа (β – стрэнд, L – петля) 222-236 2.4 β11 276-290 5.13 L7 183-197 6.8 β9-L5 298-312 8.09 β14- β15 Полученные данные указывают на то, что Т-эпитопы OmpF порина Y. ruckeri расположены преимущественно в β-тяжах, составляющих структуру барреля, однако петля L7 также, вероятно, принимает участие в формировании Т-эпитопов. Таким образом, в результате иммунохимических исследований нам удалось показать экспериментально, что участки, соответствующие наружным петлям L1 и L4 (или их фрагментам) в нативной структуре OmpF порина Y. ruckeri участвуют в формировании иммунодоминантных В-эпитопов порина Y. ruckeri и играют значительную роль в образовании общих (перекрестно реагирующих) антигенных детерминант с OmpF порином Y. pseudotuberculosis и, возможно, поринов других представителей рода иерсиний. Это соответствует современным представлениям, о том, что В-лимфоциты и антитела узнают конформационно-зависимые поверхностные эпитопы, расположенные в местах наибольшей гидрофильности и гибкости полипептидной цепи белка. 3. 6. Взаимодействие OmpF порина Y. ruckeri с клетками эукариот. Известно, что на ранней стадии развития инфекции возбудитель в качестве инструментов воздействия на системы организма-хозяина использует макромолекулы, обладающие способностью обеспечивать адгезию и инвазию микроорганизма в клетки. У большинства видов патогенных бактерий факторы адгезии представлены морфологически выраженными структурами клеточной поверхности, которые носят название фимбрий или пилей. Однако бактериальная клетка может взаимодействовать с поверхностью клеток эукариот и с помощью белков НМ, в том числе поринов. Для изучения процесса взаимодействия OmpF порина Y. ruckeri с клетками макроорганизма были использованы клетки моноцитарного лейкоза человека (THP-1) и нормальные клетки сердца кеты (CHH439). В предварительных опытах была определена цитотоксическая активность порина. Для ее оценки был использован MTS-метод, в качестве положительного контроля в этом эксперименте был использован цисплатин (IC50 = 3.15 мкг/мл). OmpF порин проявил умеренную цитотоксичность по отношению к обоим видам клеток (после 48 часов обработки IC50 составляли 23.5 и 48.6 мкг/мл для CHH439 и THP-1 соответственно). На основании полученных данных был выбран рабочий диапазон концентраций порина: для CHH439 - 5.4 и 11.8 мк/мл, а THP-1 – 12.5 и 24.3 мк/мл. Для оценки влияния белка на распределение клеток эукариот по фазам клеточного цикла был применён метод проточной цитометрии (FACS) с окрашиванием ДНК клеток красителем пропидий йодидом. Как известно, клеточный цикл эукариот состоит из двух периодов: (1) интерфазы, во время которой идет синтез ДНК и белков и (2) митоза, стадии клеточного деления. Интерфаза, в свою очередь, состоит из фазы начального роста (G1), во время которой идет синтез мРНК, белков и других клеточных компонентов, S-фазы (репликации ДНК) и G2 фазы подготовки к митозу. Обнаружено, что в присутствии ТЛБ тримеров OmpF Y. ruckeri в 1.5 раза увеличивалось количество клеток THP-1 в фазе S (рис. 39), а также наблюдалось снижение в 5.6 раза количества клеток в фазе G2, причем эффект был наиболее выражен при низких концентрациях 12.5 мкг/мл. Обработка клеток CHH439 порином в концентрации 11.8 мкг/мл также стимулировала небольшое, однако, статистически достоверное увеличение количества клеток, находящихся в S-фазе, и их незначительное снижение в фазе G2. На стадии G1 количество клеток THP-1 и CHH439-В снижалось в 1.38 и 1.05 раз, по сравнению с контролем, соответственно. Таким образом, можно предположить, что в присутствии OmpF порина НМ Y. ruckeri как в нормальных, так и в опухолевых клетках происходит накопление клеток в S-фазе, так называемый S-арест клеточного цикла, что препятствует синтезу белков, необходимых для клеточного деления. В связи с этим уменьшается количество клеток, находящихся на стадии подготовки к митозу. Интересно отметить, что наблюдаемый эффект был наиболее выражен в отношении опухолевых клеток. Рис. 39. Влияние OmpF порина Y.ruckeri на распределение клеток по фазам клетки клеточного цикла. моноцитарного THP-1 - лейкоза человека, CHH439 - нормальные клетки сердца кеты. Рис. 40. Влияние OmpF порина Y. ruckeri на развитие клеток лейкоза человека ТНР1. Слева контроль; справа клетки обработанные ТЛБ OmpF порином в концентрации IC50 Кроме того, для тримера OmpF порина Y. ruckeri было показано, что белок в концентрации, соответствующей IC 50, стимулирует развитие апоптоза в клетках THP-1. Количество клеток в состоянии апоптоза после 48 часовой инкубации с исследуемым порином составило18.26% (рис.40). Полученный результат согласуется с данными Buommino с соавторами [174], показавшими индукцию апоптоза в клетках эпителия семенников крысы под действием порина из Pseudomonas aeruginosa. 4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 4.1. Материалы В работе были использованы реактивы для электрофореза в ПААГ реактивы для капиллярного ДНК секвенатора; набор стандартов для определения молекулярных масс (Pharmacia, Fine Chemicals AB, США и Serva, ФРГ); трихлоруксусная кислота (Merck, ФРГ); агар (Ferak Berlin, ФРГ); саркозил (ICN Biochemicals, США); дрожжевой экстракт, глюкоза, тригидроксиметиламинометан (Трис), этилендиаминтетрауксусной кислоты динатриевая соль (ЭДТА), β-меркаптоэтанол. 4.2. Приборы и оборудование Детектирование белков осуществляли с помощью проточного спектрофотометра Uvicord 8300 (LKB, Швеция) при длинах волн 280 нм и 214 нм. Для определения молекулярной массы поринов использовали время-пролетные массспектрометры MALDI-TOF BIFLEX III (Bruker, ФРГ). Измерение электрических характеристик БЛМ осуществляли на высокоомном вольтметр-электрометре ВК2-16 в режиме фиксации потенциала на мембране с помощью хлорсеребряных электродов, ток на выходе регистрировали усилителем- потенциометром КПС-4 (Россия). Калориметрические измерения проводили с помощью дифференциального сканирующего микрокалориметра ДАСМ-4 (СССР). Определение N-концевых АК последовательностей проводили на секвенаторе Procise 492c LC (Applied Biosystems, США), оборудованном детектором Series 200 UV/VIS detector (Perkin Elmer, США). УФ-спектры поринов снимали на спектрофотометре CECIL CE 7250 (Англия). Спектры КД поринов регистрировали на спектрополяриметре (Jasco-500А, Япония). Спектры флуоресценции поринов измеряли на спектрофлуориметре (Hitachi 850, Япония). Величину рН растворов измеряли на рН-метре (InoLab, ФРГ). Полимеразную цепную реакцию проводили на амплификаторе (Eppendorf, ФРГ). 4.3. Общие и аналитические методы исследования физико-химических характеристик поринов SDS, ПААГ-электрофорез проводили в вертикальных пластинах (9×12×1 мм) 14%-ого полиакриламидного геля в присутствии 0.1%-ного SDS) или в градиенте плотности ПААГ по методу Лэммли [175]. Белки, разделенные в геле, окрашивали раствором Кумасси яркоголубого G-250 в 3.5% хлорной кислоте [176]. Определение молекулярной массы поринов проводили с помощью масс-спектрометрии на Ultraflex III TOF/TOF (Bruker Daltonics, ФРГ) оборудованном детектором больших масс HMD_1 detector (CovalX AG, Швецария) в режиме детекции положительных ионов. В качестве матрицы использовалась система синапиновая кислота (10мг/мл) в ацетонитриле – 0.1% ТФУ (1:1). Образцы смешивались с матрицей и наносились на мишень методом высушивания капли. Определение N-концевых АК последовательностей проводили по методу Эдмана в АК секвенаторе Procise 492c LC (Applied Biosystems, США), оборудованном детектором Series 200 UV/VIS detector (Perkin Elmer, США) для анализа фенилтиогидантоиновых производных АК, согласно руководству к прибору. Теоретический анализ. Поиск гомологичных последовательностей проводили, используя белковые базы данных, при помощи программы BLASTX [177]. Сравнение аминокислотных последовательностей проводили, используя программу CLASTALW [178]. 4.4. ПЦР амплификация и секвенирование ompC и ompF генов Нуклеотидные последовательности кодируемой части ompF и ompC генов Y. ruckeri штамм КММ 821 были получены путём ПЦР амплификации геномной ДНК с помощью генспецифичных праймеров для ompF (FYR-For, 5’-GTAATCCCAGCATTGTTAGTTGC-3', и FYRRev, 5’-TTAGAACTGATAAACCAAGCCAA-3',) и для ompC (CYR-For, 5’- ATTCCGGCCTTATTGGTAG -3’ и CYR-Rev, 5’- TTAGAACTGATAGACCATACCTACT-3’). Дизайн праймеров был выполнен с использованием программы Vector NTI8 (Invitrogen, США). ПЦР проводили в буфере объёмом 25 мкл, включающего 1.5 мМ MgCl2, 200 мкМ каждого дНТФ, по 0.5 мкмоль прямого и обратного праймеров, 1.25 ед Go-Taq полимеразы и 50 нг ДНКматрицы. Температурный режим ПЦР включал: 1) предварительную денатурацию ДНК при 95°С – 3 мин; 2) 30 циклов: денатурация при 94°С – 20 с, отжиг при 58°С – 30 с; полимеразная реакция при 72°С – 1 мин; 3) достройка ПЦР-фрагментов при 72°С – 7 мин. Результаты реакции анализировали с помощью электрофореза в 1% агарозном геле. ПЦР-фрагменты очищали с помощью коммерческого набора DNA Extraction Kit (Fermentas, Литва) и секвенировали на автоматическом ДНК анализаторе 3130XL (Applied Biosystems, США). 4. 5. Получение изолированных поринов иерсиний Культивирование бактерий. В работе использовался штамм КММ 821 Y. ruckeri. Микроорганизмы культивировали в среде 2хYT при 4, 25 и 37 о С (в условиях, описаных в работе [179] и отбирали на логарифмической фазе роста. Затем культуру клеток центрифугировали при 5 тыс. g и промывали осадок 30 мМ трис-HCl-буфером, pH 7.8 (буфер А). Получение фракции ПГ-ассоциированных белков и выделение поринов 1. Экстракция неионным детергентом POE Для разрушения бактерий Y. ruckeri их обрабатывали с использованием ультразвукового дезинтегратора (УЗДН-2Т, Россия) при 44 мГц на ледяной бане 10 раз по 1 мин с перерывом на охлаждение смеси 1-2 мин. Не разрушенные клетки удаляли центрифугированием в течение 5 мин при 5 тыс g. Супернатант центрифугировали в течение 1 ч при 18 тыс g. Затем полученную фракцию «сырых» мембран последовательно экстрагировали 5 раз 0.5%-ным раствором POE и 4 раза - 3%-ным раствором POE. После каждой экстракции образцы центрифугировали в течение 5 мин при 12 тыс. g и отбирали супернатант. 2. Экстракция ионным детергентом SDS Микробную массу обрабатывали 0.5%-ным раствором саркозилата натрия в течение 12 ч, затем последовательно центрифугировали: не разрушенные клетки удаляли в течение 5 мин при 5 тыс g, для удаления белков цитоплазматической мембраны супернатант центрифугировали ч при 18 тыс g. Осадок обрабатывали ДНКазой в течение ночи и центрифугировали 1 ч при 18 тыс g. Затем осадок суспендировали в буфере А, содержащем 2%ный SDS, перемешивали в течение 30 мин при комнатной температуре, затем центрифугировали 1 ч при 18 тыс g для выделения комплекса пептидогликан (ПГ)-белки НМ. Фракцию, содержащую ПГ-ассоциированные белки экстрагировали в течение 1 ч буфером А, содержащим 1% SDS и 0.5М NаCl, центрифугировали в течение 1 ч при 18 тыс. g и отбирали супернатант. Полипептидный состав фракции контолировали с помощью SDS, ПААГэлектрофореза. Очистка тримеров порина. Очистку поринов проводили с помощью гель- хроматографии на Сефакриле S-300. Для элюирования белков использовали буфер А содержащий 0.25%-ный SDS. Степень очистки полученных образцов порина анализировали с помощью SDS, ПААГ-электрофореза [326] и N-концевым анализом. 4.6. Спектроскопические методы исследования пространственной структуры поринов УФ-спектры регистрировали на спектрофотометре Cecil CE 7200 (Англия) в кварцевых кюветах с толщиной слоя 1 см при ширине щели 1 нм. Поправку на светорассеяние раствора белка проводили, как описано в работе [180]. Удельный коэффициент поглощения А 0,1% /1 см порина принимали равным 1.00. Спектры КД регистрировали на спектрополяриметре Jasco-500А (Япония) в кварцевых кюветах с толщиной слоя 1 мм для пептидной и 1 см для ароматической областей спектра. В пептидной области спектра эллиптичность считали как эллиптичность среднего остатка, принимая среднюю молекулярную массу аминокислотного остатка равной 110 Да, в единицах град·см2/дмоль по формуле: [θ] = θнабл·S·110/10·c·l, где S – чувствительность шкалы прибора, с – концентрация белка, мг/мл, l –длина оптического пути, мм. В ароматической области спектра эллиптичность считали как молярную эллиптичность [θ]М с молекулярной массой мономера порина, равной 40 кДа и тримера порина, равной 110 кДа. Шкалу спектрополяриметра калибровали по 0.06%-ному водному раствору аммониевой соли 10-сульфоната–D-камфорной кислоты. Отношение эллиптичностей полос при 191 и 290 нм составляло 2.05. Спектры флуоресценции поринов измеряли на спектрофлуориметре Hitachi 850 (Япония) в кварцевых кюветах с длиной оптического пути 1 см. Возбуждение флуоресценции проводили светом с длинами волн 280 и 296 и 305 нм. Спектры флуоресценции, корректированные по родамиду B (Wako Pure Chemical Industries, Япония), регистрировали, вычитая рамановскую полосу буферного раствора. Ширина щели на монохроматорах возбуждения и излучения составляла 5 нм. Разложение экспериментальных спектров на компоненты [181] соответствующие излучению спектральных форм остатков триптофана в белке, проводили, используя программу оптимизации, основанную на методе Маркуардта [182]. 4.7. Изучение порообразующей активности белка с помощью техники БЛМ БЛМ получали из 1%-ного раствора 1-моноолеоилглицерина в н-гептане. Способ формирования бислойных липидных мембран (БЛМ), а также описание установки и методика измерения электрических параметров в БЛМ приведены в работе [179]. Образцы порина (в заданных концентрациях) добавляли в водную фазу до формирования БЛМ. Все эксперименты проводили при одинаковых стандартных условиях: 100 мМ NaCl, 10 мM Трис-HCl буфер, pH 7.8 при комнатной температуре (22°С). Для определения термоустойчивости функционально активной конформации исследуемого белка образцы порина инкубировали при температуре 85 и 95°С и использовали для рекострукции в бислой. Через 5 мин и 1 ч после формирования БЛМ регистрировали ток через бислой при мембранном потенциале -20 или -50 мВ. Микрокалориметрические методы исследования. Температурную зависимость избыточного удельного теплопоглощения растворов порина в буфере А, содержащем 0.25 % SDS, регистрировали с помощью дифференциального адиабатного микрокалориметра ДАСМ-4 (ИБП РАН, Пущино, Россия). Для измерения базовой линии обе калориметрические ячейки заполняли растворителем. Для измерения теплоемкости одну из ячеек заполняли раствором исследуемого образца порина. Ошибка измерения составляла не более 5%. Все измерения проводились со скоростью нагревания 1 К/мин. Все измерения проводили при скорости прогрева 1 К/мин. Температуру термоиндуцированных переходов (при данной скорости сканирования) определяли в точке максимума температурной зависимости избыточного теплопоглощения. Точность определения температуры соответствовала 0.1°С. Температура, при которой наблюдалось максимальное теплопоглощение, регистрировалась как температура фазового перехода (Tmax). Экспериментальные термограммы обрабатывали согласно [183]. 4.8. Построение теоретических моделей поринов Анализ аминокислотных последовательностей поринов Y. ruckeri OmpF (код Uniprot E2FHC9) и OmpC (идентичная на 100% последовательности с кодом C4UFZ3) проведен с помощью модуля поиска прототипов программы МОЕ 2013.08 [166]. Для поринов Y. ruckeri в качестве прототипа была выбрана кристаллическая структура осмопорина (ompk36) Klebsiella pneumoniae (код PDB 1OSM) [167]. Теоретические модели пространственных структур OmpF и OmpC поринов Y. ruckeri построены методом сравнительного моделирования ( ) с помощью программы МОЕ 2013.08. После 3D-протонирования окончательной модели проводилась оптимизация структуры молекул методом минимизации энергии с потенциалом сил Amber12:EHT. Пространственные структуры неспецифических OmpC и OmpF поринов Y. ruckeri использовали для расчета содержания элементов вторичной структуры с помощью программы VEGA ZZ. Теоретические модели тримеров OmpC и OmpF поринов Y. ruckeri построены и оптимизированы с помощью программы МОЕ 2013.08 с использованием в качестве прототипа кристаллической структуры тримера осмопорина (Ompk36) K. pneumoniae. 4.9. Иммунохимические методы Получение иммунных сывороток. Все эксперименты с животными были проведены в соответствии с нормативами. Животные, мыши BALB/с, самки в возрасте от 4 до 8 недель массой 20±2 г, содержались в стандартных условиях, получая пищу и воду ad libitum. Антигены (ТЛБ олигомеры OmpF порина Y. ruckeri; ТЛБ олигомеры, ТСБ мономеры, рекомбинантные мутантные порины с делециями наружных петель (del1, del4, del6, del8) OmpF порина Y. pseudotuberculosis) вводили животным 3-хкратно, внутрибрюшинно с интервалом в 7 суток, однократное количество вводимого белка составило 100 мкг на мышь. Для получения контрольной сыворотки были использованы мыши, иммунизированные трехкратно физ.раствором. Забор крови осуществляли через неделю после последней иммунизации. Кровь брали путём тотальной декапитации животных. Антигены для иммунизации использовали в смеси с полным адъювантом Фрейнда (1:1, v/v). Иммуноферментный анализ. Для исследования сывороток крови применяли непрямой вариант ИФА, используя микропланшеты Costar (США). В качестве антивидовых антител использовали коммерческие иммуноферментные конъюгаты (Invitrogen, США). Результаты учитывали на спектрофотометре μQuant (BIO-TEK INSTRUMENTS INC., США) при 492 нм, в качестве хромогена применяли 0.04%-ный раствор ортофенилендиамина. При проведении реакции ингибирования связывания антигена со специфической сывороткой в ИФА планшеты для ИФА сенсибилизировали поринами Y. ruckeri (10 мкг/мл) и Y.pseudotuberculosis (10 мкг/мл). Сенсибилизацию планшетов проводили в 0.05 М карбонатном буфере, рН 9.0, при 37˚С в течение ночи. В качестве ингибиторов использовали: 1) коммерческие синтетические пептиды (PEPTIDE 2.0 INC., США), соответствующие наружным петлям OmpF порина Y.pseudotuberculosis, концентрация ингибитора 16 мкг. 2) порины Y.ruckeri и Y.pseudotuberculosis, концентрация ингибитора 28 мкг. Реакцию ингибирования проводили по схеме непрямого конкурентного ИФА, ингибитор вносили в лунки одновременно с антисывороткой, рабочее разведение антисыворотки определяли в предварительном опыте. 4.10. Исследование взаимодействия поринов с клетками эукариот Клеточные культуры. Для исследования были взяты клетки моноцитарного лейкоза человека (THP-1), а также нормальные клетки сердца кеты (CHH439), любезно предоставленные зам. директора Камчатского интситута рыбного хозяйства и океанографии к.б.н. Рудаковой С.Л. Для культивирования клеток использовали питательную среду 5% FBS/МЕМ, содержащую 5% (v/v) FBS, 2 мМ раствора L-глутамина и 15 мкг/мл гентамицин сульфата. Для определения цитотоксической активности веществ использовали стандартный MTS-метод (усовершенствованная модификация MTT-метода) [184]. Клетки высевали в 96луночный планшет (6 × 103 клеток/лунку) и инкубировали в течение ночи в соответствующей клеточной среде в объёме 100 мкл/лунку. Далее клеточную среду заменяли на свежую (100 мкл), содержащую различные концентрации исследуемых веществ), после чего клетки инкубировали в течение 46 ч. Затем 20 мкл раствора MTS-реагента добавляли в каждую лунку и инкубировали в течение 2 ч. Степень переработки MTS-реагента в формазан измеряли спектрофотометрически при λ = 492 нм и λ = 690 нм (фон) с помощью спектрофотометра μQuant. Все измерения проводили в трипликате, каждый эксперимент повторяли 2 раза. Исследования влияния веществ на клеточный цикл с помощью метода проточной цитометрии. Распределение клеток по фазам клеточного цикла анализировали с помощью окрашивания ДНК пропидиум йодидом. Клетки рассеивали, в 6-луночные планшеты, инкубировали в течение ночи, затем заменяли клеточную среду на среду содержащую 0.1 FBS (вместо стандартных 5%) и инкубировали 24 ч. Далее заменяли клеточную среду на стандартную среду (содержащую 5% FBS) содержащую белок в определённой концентрации и инкубировали в течение 24 ч. Затем клеточную среду отделяли, клетки промывали 0.5 мл PBS и трипсинизировали 0.5 мл раствора трипсин-ЭДТА. Для каждой лунки объединяли клеточную среду, фракцию PBS после промывки и фракцию клеток после трипсинизации и центрифугировали при 220 g [185]. Затем клетки ресуспендировали в EtOH/H2O (7:3 (v/v), 1 мл/образец) и инкубировали в течение ночи при -20°C. Затем перемешивали и центрифугировали 5 мин при 453 g. После удаления супернатанта клетки ресуспендировали в 0.2 мл раствора 0.002% (w/v) пропидиум йодида и 0.02% (w/v) РНКазы А (Roth, Германия) в PBS и инкубировали 30 мин на льду в темноте. Затем добавляли 0.2 мл PBS и анализировали на проточном цитометре. Результат анализировали с помощью программы Cell Quest Pro. Вывод о распределении клеток по фазам клеточного цикла делали на основании различной интенсивности окраски ДНК клеток пропидиум йодидом. Все измерения проводили в трипликате, каждый эксперимент повторяли 2 раза. 4. ВЫВОДЫ 1. Полученные в индивидуальном виде неспецифические OmpF и OmpC порины наружной мембраны Y. ruckeri являются β-структурированными белками, отличаются особенностями строения и физико-химических свойств, способны образовывать разные по проводимости каналы в липидных мембранах. 2. Выявлена зависимость экспрессии исследуемых поринов и транскрипции соответствующих генов от условий культивации бактерий. При пониженной и комнатной температуре в бессолевой среде преимущественно экспрессируется OmpF порин, введение в среду NaCl и повышение температуры приводит к появлению заметного количества OmpC порина. 3. Обнаружена необычайно высокая для поринов термостабильность OmpF белка НМ Y. ruckeri и его способность восстанавливать функционально активное состояние в присутствии липидного бислоя после инкубации при температуре 85оС. 4. Показано, что процесс термоденатурации нативной формы (тримера) OmpF порина проходит в несколько стадий. На начальных этапах этот процесс сопровождается изменениями в структуре относительно «гибких» наружных петель, а в дальнейшем перестройкой на уровне четвертичной и третичной структуры белка, приводящей к диссоциации порина на мономеры. 5. С помощью иммунохимических методов выявлена локализация в наружных петлях L1 и L4 двух иммунодоминантных В-эпитопов перекрёстно реагирующих с АГ детерминантами OmpF порина Y. pseudotuberculosis. 6. Исследовано влияние OmpF порина Y. ruckeri на клеточный цикл злокачественных клеток (лейкоза крови человека) и клеточных культур тканей рыб. Установлено, что порин в низких концентрациях приводят к S-аресту клеточного цикла, а в высоких вызывают апоптоз злокачественных клеток. 7. Разработан упрощенный метод выделения очищенной фракции порина Y. ruckeri, исключающий стадию гель-хроматографии, пригодный для технологического способа получения белка. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АК – аминокислота, аминокислотный, ДНКазы – дезоксирибонуклеазы, дНТФ – дезоксинуклеотидтрифосфат, SDS – додецилсульфат натрия, ИПТГ – изопропил-β-D-тиогалактозид, КД – круговой дихроизм, ЛПС – липополисахарид, мол.масса – молекулярная масса, НМ – наружная мембрана, ПГ –пептидогликан, ПААГ – полиакриламидный гель, п.н. – пары нуклеотидов, ПЦР – полимеразная цепная реакция, ЭДТА – этилендиамин тетрауксусная кислота. СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 1. Lugtenberg B., Van Alphen L. Molecular architecture and functioning of the outer membrane of Escherichia coli and other Gram-negative bacteria // Biochim. Biophys. Acta. 1983. V. 737. N. 1. P. 51-115. 2. Bayer M.E. The fusion sites between outer membrane of bacteria: their role in membrane assembly and virus infection // In: Outer membrane. Biogenesis and function. Inouye M. ed. N.-Y.: Wiley-Interscience. 1979. P. 167-202. 3. Osborn M., Gander J.E., Parisi E., Carson J. Mechanism of assembly of the membrane of Salmonella typhimurium. Isolation and characterization of the cytoplasmic and outer membrane // J. Biol. Chem. 1972. V. 247. N. 12. P. 3962-3972. 4. Schweizer M., Schwarz H., Sonntag I., Henning U. Mutational change of membrane architecture. Mutants of Escherichia coli K-12 missing major proteins of the outer cell envelope membrane // Biochim. Biophys. Acta. 1976. V. 448. N. 3. P. 474-491. 5. De Leij L., Witholt B. Structural heterogeneity of the cytoplasmic and outer membranes of Escherichia coli // Biochim. Biophys. Acta. 1977. V. 471. N. 1. P. 92-104. 6. Smit J., Kamio J., Nikaido H. Outer membrane of Salmonella typhimurium: chemical analysis and freeze-fracture studies with lipopolysaccharide mutants // J. Bacteriol. 1975. V. 124. N. 2. P. 942-958. 7. Van Alphen L., Verkleij A., Leunissen-Bijvelt J., Lugtenberg B. Architecture of the outer membrane of Escherichia coli. III. Protein-lipopolysaccharide complex in intramembraneous particles // J. Bacteriol. 1978. V. 134. N. 3. P. 1089-1098. 8. Nakae T. Outer membrane of Salmonella. Isolation of protein complex that produces transmembrane channels // J. Biol. Chem. 1976. V. 251. N. 7. P. 2176-2178. 9. Schirmer T.General and Specific Porins from Bacterial Outer Membranes // J. Struct. Biol. 1998. V. 121(2), Pages 101–109 10. Nikaido H. Molecular basis of bacterial outer membrane permeability revisited // Microbiol. & Mol. Biol. Rev. 2003. V. 67. P. 593-656. 11. Achouak, W. Multiple facets of bacterial porins / W. Achouak, T. Heulin, J. M. Pagès // FEMS Microbiol. Lett. 2001. Vol. 199. P. 1-7. 12. Delcour, A. H. Solute uptake through general porins // Front. Biosci. 2003. Vol. 8. P. 1055-1071. 13. Müller DJ, Engel A. Voltage and pH-induced channel closure of porin OmpF visualized by atomic force microscopy // J Mol Biol. 1999. V.285(4). P.1347-51. 14. Benz R., Schmid A., Hancock R.E. Ion selectivity of gram-negative bacterial porins // J. Bacteriol. 1985. V. 162. N. 2. P. 722-727. 15. Delcour A.H. Function and modulation of bacterial porins: insight from electrophysiology // FEMS Microbiol. Lett. 1997. V. 151. N. 2. P. 115-125. 16. Schindler H., Rosenbusch J. Matrix protein from Escherichia coli outer membranes forms voltage-controlled channels in lipid bilayers // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1978. V. 75. N. 8. P. 3751-3755. 17. Hamill O.P., Marty A., Neher E., Sakmann B., Sigworth F.J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recordings from cells and cell-free membrane patches // Pflugers Arch. 1981. V. 391. N. 2. P. 85-100. 18. Martinac B., Buechner M., Delcour A.H., Adler J., Kung C. Pressure-sensitive ion channel in Escherichia coli // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. V. 84. N. 8. P. 22972301. 19. Duechner M., Delcour A.H., Martinac B., Adler J., Kung C. Ion channel activity in the Escherichia coli outer membrane // Biochim. Biophys. Acta. 1990. V. 1024. N. 1. P. 111121. 20. Delcour A.H., Martinac B., Kung C., Adler J. A modified reconstitution method used in patch-clamp studies of Escherichia coli ion channels // Biophys. J. 1989. V. 56. N. 3. P. 631-636. 21. Berrier C., Coulombe A., Houssin C., Ghazi A. A patch-clamp study of ion channels of inner and outer membranes and of contact zones of E. coli fused into giant liposomes // FEBS Lett. 1989. V. 259. N. 1. P. 27-32. 22. Кантор Ч., Шиммел П. Биофизическая химия. Том 2: Методы исследования структуры и функции биополимеров. М: Мир, 1984. 23. Adler A.J., Greenfield N.J., Fasman G.D. Circular dichroism and optical rotatory dispersion of proteins and polypeptides // Methods Enzymol. 1973. V. 27. P. 675-735. 24. Kelly S.M., Price N. C. The application of circular dichroism to studies of protein folding and unfolding // Biochim. Biophys. Acta 1997. V. 1338. P.161-185. 25. Correal D. H. A, Ramos C. H. I. The use of circular dichroism spectroscopy to study protein folding, form and function // African J. Biochem. Res. 2009. Vol.3 .P. 164-173. 26. Saxena V.P., Wetlaufer D.B. A new basis for interpreting the circular dichroic spectra of proteins // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1971 V.68. P. 969-972. 27. Сhang C.T., Wu C. -S.C., Yang J.T. Circular dichroic analysis of protein conformation: inclusion of the b-turns // Anal. Biochem. 1978. V. 91. P. 13-31. 28. Verheyden S, Sillen A., Gils A., Declerck P.J., Engelborghs Y.Tryptophan Properties in Fluorescence and Functional Stability of Plasminogen Activator Inhibitor 1 // 2003. V. 85 (1). P. 501–510. 29. Manavalan P., Johnson W.C., Jr. Variable selection method improves the prediction of protein secondary structure from circular dichroism spectra // Anal. Biochem. 1987. V. 167. P. 76-85. 30. Provencher C.W., Glockner J. Estimation of globular protein secondary structure from circular dichroism // Biochemistry. 1981. V. 20. N. 1. P. 34-37. 31. Sreerama N., Woody R.W. Estimation protein secondary structure from circular dichroism spectra: comparison of CONTIN, SELCON and CDSSTR methods with an expanded reference set. // Anal. Biochem. 2000. V. 287. N. 2. P. 252-260. 32. Эфтинк М.Р. Использование флуоресцентных методов для изучения разворачивания белков // Биохимия. 1998. Е. 63, вып. 3 С. 327-337. 33. Пермяков Е.А. Метод собственной люминесценции белка. М.: Наука, 2003, 189 с. 34. Eftink M.R. The use of fluorescence methods to monitor unfolding transitions in proteins // Biophys J. 1994. V. 66(2). P. 482–501. 35. Lakovicz J.R. Principles of fluorescence spectroscopy. 1983. N.-Y.: Plenum Press. 36. Munishkina L. A. Fink A. L. Fluorescence as a method to reveal structures and membrane-interactions of amyloidogenic proteins // Biochim. Biophys. Acta (Biomembranes). 2007. V. 1768 (8). P. 1862–1885. 37. Ababou A., Bombarda E. On the involvement of electron transfer reactions in the fluorescence decay kinetics heterogeneity of proteins // Protein Sci. 2001. V. 10(10). P. 2102–2113. 38. Туроверов К. К., Кузнецова И. М., Зайцев В. Н. Интерпретация УФ-флуоресценции азурина на основе данных рентгеноструктурного анализа // Биоорг. химия 1984. Т.10 (6). С. 792-806. 39. Bajzer Z., Prendegrast F. A model for multiexponential tryptophan fluorescence intensity decay in proteins // Biophys J. 1993 V. 65(6) P. 2313-23. 40. Engelborghs Y. Correlating protein structure and protein fluorescence // J. Fluoresc. 2003. V. 13. P. 1319-1326. 41. Bushueva TL, Busel EP, Burstein EA: Some regularities of dynamic accessibility of buried fluorescent residues to external quenchers in proteins // Arch Biochem Biophys. 1980. V. 204(1). P. 161-166. 42. Reshetnyak Y., Burstein E.A. I. Decomposition of protein tryptophan fluorescence spectra into log-normal components. II. The statistical proof of discreteness of tryptophan classes in proteins // Biophys J. 2001 V. 81(3). P.710–1734. 43. Royer C.A. Approaches to teaching fluorescence spectroscopy // Biophys J. 1995. V. 68(3). P. 1191–1195. 44. Burstein E.A., Vedenkina N. S., Ivkova M. N. Fluorescence and the location of tryptophan residues in protein molecules // Photochem. And Photobiol. 1973. Vol. 18. P. 263-279. 45. Burstein E.A., Permyakov E. A., Yashin VA, Burkhanov SA, Finazzi Agro A. The fine structure of luminescence spectra of azurin // Biochim. Biophys. Acta. 1977. Vol. 491, N 1. P. 155-159. 46. Пермяков Е. А., Ярмоленко В. В., Калиниченко Л. П., Морозова Л.А., Бурштейн Э.А. Связывание ионов Ca2+ c α-лактальбумином коровьего молока // Биофизика. 1982. Т. 27, № 3. С. 380-385. 47. Ramsay G, Ionescu R, Eftink MR. Modified spectrophotometer for multi-dimensional circular dichroism/fluorescence data acquisition in titration experiments: application to the pH and guanidine-HCI induced unfolding of apomyoglobin // Biophys J. 1995. V. 69(2). P.701–707. 48. Garavito R.M., Rosenbusch J.P. Three-dimensional crystals of an integral membrane protein: an initial X-ray analysis // J. Cell Biol. 1980. V. 86. N. 1. P. 327-329. 49. Weiss M.S., Kreusch A., Schiltz E., Nestel U., Welte W., Weckesser J., Schulz G.E. The structure of porin from Rhodobacter capsulatus at 1.8 Ǻ resolution // FEBS Lett. 1991. V. 280. N. 2. P. 379-382. 50. Weiss M.S., Wacker T., Weckesser J., Welte W., Schulz G.E. The three-dimensional structure of porin from Rhodobacter capsulatus at 3 Ǻ resolution // FEBS Lett. 1990. V. 267. N. 2. P. 268-272. 51. Schulz G.E. The structure of bacterial outer membrane proteins // Biochim. Biophys. Acta. 2002. V. 1565. N. 2. P. 308-317. 52. Weiss M.S., Abele U., Weckesser J., Welte W., Schiltz E., Schulz G.E. Molecular architecture and electrostatic properties of a bacterial porin // Science. 1991. V. 254. N. 5038. P. 1627-1630. 53. Koebnick R., Locher K.P., van Gelder P. Structure and function of bacterial outer membrane proteins: barrels in a nutshell // Mol. Microbiol. 2000. V. 37. N. 2. P. 239-253. 54. Schulz G.E. β-Barrel membrane proteins // Curr. Opin. Struct. Biol. 2000. V. 10. N. 4. P. 443-447. 55. Przybylski M., Glocker M.O., Nestel U., Schnaible V., Blüggel M., Diederichs K., Weckesser J., Schad M., Schmid A., Welte W., Benz R. X-ray crystallographic and mass spectrometric structure determination and functional characterization of succinylated porin from Rhodobacter capsulatus: implications for ion selectivity and single-channel conductance // Protein Sci. 1996 V. 5(8). P. 1477-89. 56. Palva E.T., Randall L.L. Arrangement of protein I in Escherichia coli outer membrane: cross-linking study // J. Bacteriol. 1978. V. 133. N. 1. P. 279-286. 57. Palva, E.T. Cross-linking analysis of the two forms of protein I, a major outer membrane protein of Eschericha coli // J.Bacteriol. 1979. V. 138. N1. P.38-42. 58. Steven AC, Heggeler B, Müller R, Kistler J, Rosenbusch JP. Ultrastructure of a periodic protein layer in the outer membrane of Escherichia coli // J.Cell.Biol. 1977. V.72. N2. P. 292-301. 59. Jap B.K. Wallia P.J., Gehring K. Structural architecture of an outer membrane channel as determined by electron crystallography // Nature. 1991. V. 350. N. 6314. P. 167-170. 60. Phale P.S., Philippsen A., Kiefhaber T., Koebnik R., Phale V.P., Schirmer T., Rosenbusch J.P. Stability of trimeric OmpF porin: the contributions of the latching loop L2 // Biochemistry. 1998. V. 37. N. 45. P. 15663-15670. 61. Jeanteur D., Lakey J. H., Pattus F. The bacterial porin superfamily: sequence alignment and structure prediction // Mol. Microbiol. 1991. V. 5. N. 9. P. 2153-2164. 62. Mapingire OS, Wager B, Delcour AH. Electrophysiological characterization of bacterial pore-forming proteins in planar lipid bilayers // Methods Mol Biol. 2013. V. 966. P.381396. 63. Sipos L., von Heijne G. Predicting the topology of eukaryotic membrane proteins // Eur. J. Biochem. 1993. V. 213. N. 3. P.1333-1340. 64. Hancock R.E. Role of porins in outer membrane permeability // J. Bacteriol. 1987. V. 169 (3). P. 929-934. 65. Gnanasekarean T.V., Peri S., Arockiasamy F., Krishnaswamy S. Profiles from structure based sequence alignment of porins can identify β-stranded integral membrane proteins // Bioinformatics. 2000. V. 16. N. 9. P. 839-842. 66. Ferenci T. From sequence alignment to structure prediction: the case of the OmpF porin family // Mol. Microbiol. 1994. V. 14. N. 1. P. 188-189. 67. Berven F.S., Flikka K., Jensen H.B., Eidhammer I. BOMP: a program to predict integral β-barrel outer membrane proteins encoded within genomes of Gram-negative bacteria // Nucleic Acids Res. 2004. V. 32. (Web Server). P. W394-W399. 68. Heringa J. Computational methods for protein secondary structure prediction using multiple sequence alignments // Curr. Protein Pept. Sci. 2000. V. 1. N. 3. P. 273-301. 69. Burke D.F., Deane C.M., Nagarajaram H.A., Campillo M., Martin-Martinez M., Mendes J., Molina F., Perry J., Reddy B.V., Soeres C.M., Steward R.E., Williams M., Carrondo M.A., Blundell T.L., Mizuguchi K. An interactive structure-assisted approach to sequence alignment and comparative modeling // Protein. Struct. Funct. Genet. 1999. V. 37. N. S3. P. 55-60. 70. Jackups R.Jr., Liang J. Interstrand pairing patterns in β-barrel outer membrane proteins: the positive outside rule, aromatic rescue, and strand registration prediction // J. Mol. Biol. 2005. V. 354. N. 4. P. 979-993. 71. Waldispuhl J., Berger B., Clote P., Steyaert J.M. transFold: a web server for predicting the structure and residue contacts of transmembrane β-barrels // Nucleic Acid Res. 2006. V. 34. (Web Server). P. W189-W193. 72. Garavito R.M., Rosenbusch J.P. Isolation and crystallization of bacterial porin // Methods Enzymol. 1986. V. 125. N. 2. P. 309-328. 73. Kleinschmidt J.H. Membrane proteins - Introduction // Cell Mol. Life Sci. 2003. V. 60. N. 8. P. 1527-1528. 74. Eriks L. R. Mayor J.A., Kaplan R.S. A strategy for identification and quantification of detergents frequently used in the purification of membrane proteins // Anal. Biochem. 2003. V. 323. N. 2. P. 234-241. 75. Arachea B.T., Sun Z., Potente N., Malik R., Isailovic D., Viola R.E. Detergent selection for enhanced extraction of membrane proteins // Protein Expres. Purif. 2012. V. 86. P. 12-20. 76. Rosenbusch J.P. Characterization of the major envelope protein from Escherichia coli. Regular arrangement on the peptidoglycan and unusual dodecyl sulfate binding // J. Biol. Chem. 1974. V. 249. N. 24. P. 8019-8029. 77. Nurminen M. Isolation of porin trimers // In: Enterobacterial surface antigen methods for molecular characterization. II In Korhonen T.K., Dawes E.A., Makela P.H. eds. N.-Y.: Elsevier Science Publ. 1985. P. 293-300. 78. Magliery T. J., Regan L. Combinatorial approaches to protein stability and structure // Eur. J. Biochem. 2004. V. 271. P. 1595-1608. 79. Graddis T.G., Remmele R.L. Jr., McGrew J.T. Designing proteins that work using recombinant technologies // Curr. Pharm. Biotechnol. 2002. V. 3. P 285-297. 80. Buxbaum J.N. Diseases of protein conformation: what do in vitro experiments tell us about in vivo diseases // Trends Biochem. 2003. V. 28. P. 585-592. 81. Daggett V., Fersht A.R. Is there a unifying mechanism for protein folding? // Trends Biochem. Sci. 2003. V. 28. N. 1. P. 18-25. 82. Jaenicke R. Protein stability and molecular adaptation to extreme conditions // Eur. J. Biochem. 1991. V. 202. N. 3. P. 715-728. 83. Sivaraman T., Kumar T.K., Jayaraman G., Han C.C., Yu C. Characterization of a partially structured state in an all β-sheet protein // Biochem. J. 1997. V. 321. N. 2. P. 457-464. 84. Pawar S.A., Deshpande V.V. Characterization of acid-induced unfolding intermediates of glucose/xylose isomerase // Eur. J. Biochem. 2000. V. 267. N. 21. P. 6331-6338. 85. Van der Woude AD1, Mahendran KR, Ummels R, Piersma SR, Pham TV, Jiménez CR, de Punder K, van der Wel NN, Winterhalter M, Luirink J, Bitter W, Houben EN. Differential detergent extraction of mycobacterium marinum cell envelope proteins identifies an extensively modified threonine-rich outer membrane protein with channel activity // J. Bacteriol. 2013. V. 195(9). P.2050-2059. 86. Rosenbusch J.P. Structural and functional properties of porin channels in E. coli outer membranes // Experientia. 1990. V. 46. N. 2. P. 167-173. 87. Eisele J.L., Rosenbusch J.P. In vitro folding and oligomerization of a membrane protein. Transition of bacterial porin from random coil to native conformation. // J. Biol. Chem. 1990. V. 265. N. 18. P. 10217-10220 88. Bolla J.-M., Loret E., Zalewsky M., Pages J.-M. Conformational analysis of the Campylobacter jejuni porin // J. Bacteriol. 1995 V. 177. N. 15. P. 4266-4271. 89. Arcidiacono S., Butler M.M., Mello A.M.A Rapid Selective Extraction Procedure for the Outer Membrane Protein (OmpF) from Escherichia coli. Protein Expression and Purification 2002. V. 25. P. 134–137. 90. Hirsch A., Wacker T., Weckesser J.,, Diederichs K., Welte W. Purification, characterization, crystallization, and preliminary X-Ray results from Paracoccus denitrificans porin // Proteins. 1995. V. 23(2). P.282-284. 91. Markovic-Housley Z., Garavito R.M. Effect of temperature and low pH of matrix porin in micellar detergent solutions. // Biochim. Biophys. Acta. 1986. V. 869. N. 2. P. 158-170. 92. Worobec E.A., Martin N.L., Mecubbin W.D., Kay C.M., Brayer G.D., Hancock R.E. Large-scale purification and biochemical characterization of crystallization-grade porin protein P from Pseudomonas aeruginosa // Biochim. Biophys. Acta. 1988. V. 939. N. 2. P. 366-374. 93. Sugawara E., Ekaterina M. Nestorovich E.M., Bezrukov S.M., H. Nikaido Pseudomonas aeruginosa Porin OprF Existsin Two Different Conformations // J.Biol.Chem. 2006. V.281. P.16220-16229. 94. Minetti C.A.S.A., Tai J.Y., Blake M.S., Pullen J.K., Liang S.M., Remeta D.P. Structural and functional characterization of a recombinant PorB class 2 protein from Neisseria meningitidis. Conformational stability and porin activity // J. Biol. Chem. 1997. V. 272. N. 16. P. 10710-10720. 95. Minetti C.A.S.A., Blake M.S., Remeta D.P. Characterization of the structure, function, and conformational stability of PorB class 3 protein from Neisseria meningitidis // J. Biol. Chem. 1998. V. 273. N. 39. P. 25329-25338. 96. Sukumaran S., Hauser K., Maier E., Benz R., Mäntele W. Structure-function correlation of outer membrane protein porin from Paracoccus denitrificans // Biopolymers. 2006. V. 82. N. 4. P. 344-348. 97. Ким Н.Ю. Новикова О.Д., Хоменко В.А., Лихацкая Г.Н., Емельяненко В.И., Кузнецова С.М., Соловьева Т.Ф. Функционально значимые конформационные переходы порина из наружной мембраны Yersinia pseudotuberculosis // Биол. мембраны. 2007. Т. 24. № 2. С. 150-158. 98. Мажуль В.М., Кананович С.Ж. О возможности белка существовать во множестве частично свернутых состояний // Биофизика. 2004. Т. 40. № 3. С. 413-423. 99. Новикова О.Д. Порины рода Yersinia // Успехи в изучении природных соединений. Владивосток: Дальнаука, 1999. С. 178-201. 100. Rawling E.G., Martin N.L., Hancock R.E.W. Epitope mapping of the Pseudomonas aeruginosa major outer membrane porin protein OprF // Infect. Immun. 1995. V. 63. N. 1. P. 38-42. 101. Lupi N., Bourgois A., Bernadac A., Laboucarié S., Pagès J.M. Immunological analysis of porin polymorphism in Escherichia coli B and K-12 // Mol. Immunol. 1989. V. 26. N. 11. P. 1027-1036. 102. Mutharia L. M., Hancock R. E. Surface localization of Pseudomonas aeruginosa outer membrane porin protein F by using monoclonal antibodies // Infect Immun. 1983. V. 42(3). P. 1027–1033. 103. Henriksen A.Z., Maeland J.A. Immunogenicity expressed in patients with bacteraemia of an epitope shared by enterobacterial and neisserial porin proteins // APMIS. 1995. V. 103. N. 5. P. 388-394. 104. Дельвиг А.А., Семенов Б.Ф. Механизмы формирования иммунного ответа к пориновым белкам наружной мембраны менингококков серогруппы В // Журн. микробиол. эпидемиол. иммунобиол. 1997. № 6. С. 92-96. 105. Yamada H, Oshima N, Mizuno T, Matsui H, Kai Y, Noguchi H, Mizushima S.Use of a series of OmpF-OmpC chimeric proteins for locating antigenic determinants recognized by monoclonal antibodies against the OmpC and OmpF proteins of the Escherichia coli outer membrane // J. Biochem. 1987. V. 102. N. 3. P. 455-464. 106. Singh S.P., Singh S.R., Williams Y.U., Jonnes L., Abdullach T. Antigenic determinants of the OmpC porin from Salmonella typhimurium // Infect. Immun. 1995. V. 63. N. 12. P. 4600-4605. 107. Hopp T.P., Woods K.R. A computer program for predicting protein antigenic determinants // Mol. Immunol. 1983. V. 20. N. 4. P. 483-489. 108. Вольпина О.М., Титова М.А., Жмак М.Н., Короев Д.О., Обозная М.Б., Волкова Т.Д., Иванов В.Т. Предсказание структуры пептидов, способных индуцировать образование антител у мышей // Биоорган. химия. 2002. Т. 28. № 5. С. 387-395. 109. Alcaraz A., Nestorovich E. M., Aguilella-Arzo M., Aguilella V. M., Bezrukov S. M. Salting out the ionic selectivity of a wide channel: the asymmetry of OmpF // Biophys. J. 2004. V. 87. N. 2. P. 943-957. 110. XueQiao Liu and Thomas Ferenci*Regulation of Porin-Mediated Outer Membrane Permeability by Nutrient Limitation in Escherichia coli // J. Bacteriol. 2014. V. 196 (10). P. 3917-3922. 111. Tomassen J., van der Ley P., van Zzeiji M., Agterberg M. Localization of functional domains in E. coli outer membrane porins // EMBO J. 1985. V. 4. N. 6. P. 1583-1587. 112. Egger L. A., H. Park, Inouye M. Signal transduction via the histidyl-aspartyl phosphorelay //Genes Cells. 1997. V. 2.P. 167-184. 113. Kenney L. J. Structure/function relationships in OmpR and other winged-helix transcription factors // Curr. Opin. Microbiol. 2002. V.5. P.135-141. 114. Slauch J. M., Silhavy T. J. The porin regulon: a paradigm for the two-component regulatory systems In Regulation of Gene Expression in Escherichia coli ed. Lin E. C. C., Lynch S. A. N.Y.: Chapman & Hall.1996. P. 383-417. 115. Pukklay P., Nakanishi ., Nitta M., Yamamoto K., Ishihama A., Shiratsuchi A. Involvement of EnvZ-OmpR two-component system in virulence control of Escherichia coli in Drosophila melanogaster // BBRC. 2013. V. 438(2). P. 306-311. 116. Chen S., Zhang A., Blyn L. B., Storz G. MicC, a second small-RNA regulator of Omp protein expression in Escherichia coli //.J. Bacteriol. 2004. V.186. P.6689-6697. 117. Delihas N., Forst S. MicF: an antisense RNA gene involved in response of Escherichia coli to global stress factors // J. Mol. Biol. 2001. V. 313. P.1-12. 118. Mecsas J., Rouviere P. E., Erickson J. W., Donohue T. J., Gross C. A. The activity of sigma E, an Escherichia coli heat-inducible sigma factor, is modulated by expression of outer membrane proteins // Genes Dev.1993. V.7. P.2618-2628. 119. Pratt L. A., Silhavy T. J. The response regulator SprE controls the stability of RpoS // Proc. Natl. Acad. Sci. 1996. V. 93. P. 2488-2492. 120. Ferrario M., Ernsting, B. R., Borst D. W., Wiese D. E., Blumenthal R. M., Matthews R. G. The leucine-responsive regulatory protein of Escherichia coli negatively regulates transcription of ompC and micF and positively regulates translation of ompF // J. Bacteriol.1995. V.177. P.103-113. 121. Huang L., Tsui P., Freundlich M. Integration host factor is a negative effector of in vivo and in vitro expression of ompC in Escherichia coli // J. Bacteriol. 1990. V. 172. P.5293-5298. 122. Ramani N., Huang L., Freundlich M. In vitro interactions of integration host factor with the ompF promoter-regulatory region of Escherichia coli // Mol. Gen. Genet. 1992. V.231. P.248-255. 123. Leslie A. Pratt, Weihong Hsing, Katherine E. Gibson, Thomas J. Silhavy From acids to osmZ: multiple factors influence synthesis of the OmpF and OmpC porins in Escherichia coli // Mol. Microbiol. 1996 V. 20(5). P. 911–917. 124. Mizuno T., Mizushima S. Signal transduction and gene regulation through phosphorylation of two regulatory components: the molecular basis of the osmotic regulation of the porin genes // Mol. Microbiol. 1990. V. 4. N. 7. P. 1077-1082. 125. Aiba H., Kato N., Tsuzuki M., Mizuno T. Phosphorylation of a bacterial activator protein, OmpR, by a protein kinase, EnvZ, results in stimulation of its DNA-binding ability // J Biochem. 1989. V.106. P. 5–7. 126. Heyde M., Portaller R. Regulation of major outer membrane porin proteins of Escherichia coli K-12 by pH // Mol.Gen.Genet. 1987. V. 208(3). P. 511-517. 127. Ramani N, Boakye K. Salicylate inhibits the translation and transcription of ompF in Escherichia coli // Can J Microbiol. 2001. V. 47 (11). P.1053-1057. 128. Mizuno T., Chou M.-Y. Inouye, M. A unique mechanism regulating gene expression: translational inhibition by a complementary RNA transcript (micRNA) // Proc Natl Acad Sci U S A. 1984. V.81. P.1966–1970. 129. Schmidt M., Zheung P., Delihas N. // Secondary structures of Escherichia coli antisense micF RNA, the 5′-end of the target ompF mRNA, and the RNA/RNA duplex // Biochemistry. 1995. V.34. P. 3623–3631. 130. Andersen J., Delihas N. micF RNA binds to the 5′-end of ompF mRNA and to a protein from Escherichia coli // Biochemistry. 1990. V. 29. P.9249–9256. 131. Coyer J., Andersen J., Forst S. A., Inouye M.,, Delihas N. micF RNA in ompB mutants of Escherichia coli: different pathways regulate micF RNA levels in response to osmolarity and temperature change // J Bacteriol. 1990. V. 172. P. 4143–4150. 132. Takayanagi K., Maeda S., Mizuno T. Expression of micF involved in porin synthesis in Escherichia coli: two distinct cis-acting elements respectively regulate micF expression positively and negatively // FEMS Microbiol Let. 1991. V. 67. P. 39–44. 133. Delihas N. Regulating the regulator: MicF RNA controls expression of the global regulator Lrp // Mol. Microbiol. 2012. V. 84(3). P.401-404. 134. Pratt L. A., Hsing W., Gibson K. E., Silhavy T. J. From acids to osmZ: multiple influence synthesis of the OmpF and OmpC porins of Escherichia coli // Mol Microbiol. 1996. V. 20. P. 911–917. 135. Rosner J. L., Chai T. J., Foulds J. Regulation of ompF porin expression by salicylate in Escherichia coli // J. Bacteriol. 1991.V. 173(18). P. 5631-5638. 136. Danese P. N., Oliver K G., Barr R., Bowman G. D., Rick P. D., Silhavy T. J.. Accumulation of the enterobacterial common antigen lipid II biosynthetic intermediate stimulates degP transcription in Escherichia coli // J. Bacteriol. 1998. V. 180. P. 58755884. 137. Langen G. R., Harper J. R., Silhavy T. J., Howard S. P. Absence of the outer membrane phospholipase A suppresses the temperature-sensitive phenotype of Escherichia coli degP mutants and induces the Cpx and σE extracytoplasmic stress responses // J. Bacteriol. 2001. V. 183. P.5230-5238. 138. Snyder W. B., Davis L. J., Danese P. N., Cosma C. L., Silhavy T. J. Overproduction of NlpE, a new outer membrane lipoprotein, suppresses the toxicity of periplasmic LacZ by activation of the Cpx signal transduction pathway // J. Bacteriol. 1995. V. 177. P. 4216-4223. 139. Batchelor E., Walthers D., J. Kenney L., Goulian M. The Escherichia coli CpxA- CpxR envelope stress response system regulates expression of the porins OmpF and OmpC // J. Bacteriol. 2005. V. 187(16). P. 5723-5731. 140. Ross A. J., Rucker R. R., Ewing W. H. Description of a bacterium associated with redmouth disease of rainbow trout (Salmo gairdneri) // Can J Microbiol. 1966. V.12(4). P. 763-770. 141. Rucker RR. Redmouth disease of rainbow trout (Salmo gairdneri) // Bull. Off Int. Epizoot. 1966. V. 65(5). P. 825-830. 142. Hunter V. A., Knittel M. D., Fryer J. L. Stress-induced transmission of Yersinia ruckeri infection from carriers to recipient steelhead trout Salmo gairdneri Richardson // J. Fish Dis.. 1980. V. 3. P. 467-472. 143. Coqet L., Cosette P., Junter G. A., Beucher E., Saiter J. M., Jouenne T. Adhesion of Yersinia ruckeri to fish farm materials: influence of cell and material surface properties. Colloids and surfaces B // Biointerfaces 2002. V. 26. P. 373-378. 144. Willumsen B. Birds and wild fish as potential vectors of Yersinia ruckeri // J. Fish Dis. 1989. V. 12. P. 275-277. 145. Altinok I., Grizzle J. M. Effects of salinity on Yersinia ruckeri infection of rainbow throut and broun throut // J. Aquat. Anim. Health 2001. V. 13. P. 334-339. 146. Fernandes L., Marquez I., Guijarro J. A. Identification of specific in vivo-induced genes in Yersinia ruckeri and analysys of ruckerbactin, a catecholate sideropore iron acquisition system // Appl. Environ. Microbiol. 2004 70, 5199-5207. 147. Gunasena D. K., Komrower J. R., Mac Intyre S. The fish pathogen Yersinia ruckeri possesses a TTS system // Adv. Exp. Med. Biol. 2003. V. 529. P. 105-107. 148. Fernandes L., Lopez J. R., Secades P., Mendez A., Marquez I., Guijarro J. A. In vitro and in vivo studies of the Yrp1 protease from Yersinia ruckeri and its role in protective immunity against enteric red mouth disease of salmonids // Appl. Env. Microbiol. 2003. V. 69. P. 7328-7335. 149. Romalde J. L., Toranso A. E. Pathological activities of Yersinia ruckeri, the enteric redmouth bacterium // FEMS Microbiol. Lett. 1993. V. 112. P. 291-300. 150. Kawula T. H., Lelivelt M J, Orndorff P. E. Using a new inbred fish model and cultured fish tissue cells to study Aeromonas hydrophila and Yersinia ruckeri pathogenesis // Microb. Pathogen. 1996. V. 20(2). P.119-25. 151. Méndez J., Reimundo P., Pérez-Pascual D., Navais R., Gómez E., Guijarro, J.A. A novel cdsAB operon is involved in the uptake of l-cysteine and participates in the pathogenesis of Yersinia ruckeri // J. Bacteriol. 2011. V. 193. P. 944–951. 152. Новикова О.Д. Хоменко В.А., Вострикова О.П., Портнягина О.Ю., Сидорова О.В., Чистюлин Д.К., Соловьева Т.Ф. Порообразующие белки наружной мембраны некоторых грамотрицательных бактерий. Структура и свойства // Вестник ДВО РАН. 2014. Т.1(173). С.120-134. 153. Вострикова О.П., Ким Н.Ю., Лихацкая Г.Н., Гузев К.В., Вакорина Т.И., Хоменко В.А., Новикова О.Д., Соловьева Т.Ф. Структура и функция порообразующих белков бактерий рода Yersinia. I. Выделение и сравнительная характеристика физико-химических свойств и функциональной активности поринов иерсиний // Биоорган. химия. 2006. Т. 32. № 4. С. 371-383. 154. Новикова О.Д., Набиуллин А.А., Соловьева Т.Ф., Оводов Ю.С. Выделение и характеристика белков внешней мембраны Yersinia pseudotuberculosis // Химия природн. соедин. 1983. № 3. С. 359-366. 155. Solov`eva T.F., G.N. Likhatskaya, V.A. Khomenko, A.M. Stenkova, N.Y. Kim, O.Y. Portnyagina, O.D. Novikova, E.V. Trifonov, E.A. Nurminski and M.P. Isaeva. A Novel OmpY Porin From Yersinia Pseudotuberculosis: Structure, Channel-Forming Activity and Trimer Thermal Stability // J. Biomolecular Structures and Dynamics. 2011. V. 28. N 4. P. 517-533. 156. Смирнов И.В. Возбудитель иерсиноза и близкие к нему микроорганизмы // Клин. микробиол. антимикроб. xимотер 2004. T 6(1). C. 10–21. 157. Reithmeier R.A.F., Bragg P.D. Purification and characterization of heat- modifiable protein from outer membrane of Escherichia coli // FEBS Lett. 1974. V. 41. N. 2. P. 195-198. 158. Сомов Г. П. , Покровский В. И. , Беседнова Н. Н., Антоненко Ф. Ф. Псевдотуберкулез. М.: Медицина, 2001. 256 с. 159. Ценева Г.Я. Иерсинии и иерсиниозы. СПб.: Медмассмедиа. 2006.168 c. 160. Schirmer T. General and specific porins from bacterial outer membranes // J. Struct. Biol. 1998. V. 121(2). P. 101–109. 161. Новикова О.Д., Хоменко В.А., Емельяненко В.И., Лихацкая Г.Н., Зелепуга Е.А., Ким Н.Ю., Исаева М.П., Портнягина О.Ю., Вострикова О.П., Соловьева Т.Ф. Omp C – подобный порин из Yersinia pseudotuberculosis: молекулярная характеристика, физико-химические и функциональные свойства // Биол. мембраны 2011. Т. 28(1). С. 1-16. 162. Cowan S.W., Schirmer T., Rummel G., Steiert M., Ghosh R., Pauptit R.A., Jansonius J.N., Rosenbusch J.P. Crystal structure explain functional properties of two Escherichia coli porins // Nature. 1992. V. 358. P. 727-733. 163. Arockiasamy A., Murthy G.S., Rukmini M.R., Sundara Baalaji N., Katpally U.C., Krishnaswamy S. Conformational epitope mapping of OmpC, a major cell surface antigen from Salmonella typhi // J. Struct. Biol. 2004. V.148. P. 22-33. 164. Портнягина О.Ю., Новикова О.Д., Соловьева Т.Ф. Иммунологические свойства неспецифических поринов наружной мембраны грамотрицательных бактерий // Биол. мембраны. 2005. T. 22(6). C. 435-443. 165. Новикова О.Д., Федореева Л.И., Хоменко В.А., Портнягина О.Ю., Ермак И.М., Лихацкая Г.Н., Мороз С.В., Соловьева Т.Ф., Оводов Ю.С. Влияние способа экстракции порообразующего белка из Yersinia pseudotuberculosis на его макромолекулярную организацию // Биоорган. химия. 1993. Т. 19(5). C. 536-547. 166. Molecular Operating Environment (MOE), 2013.08; Chemical Computing Group Inc., 1010 Sherbooke St. West, Suite #910, Montreal, QC, Canada, H3A 2R7, 2013; http://www.chemcomp.com 167. Dutzler R., Schirmer T. Crystal structure and functional characterization of OmpK 36, the osmoporin of Klebsiella pneumoniae // J. Structure. 1999. N. 7. P. 425-434. 168. В.П., Новикова О.Д., Фролова, Вакорина Т.И., Г.М., Таранкова З.А., Глазунов Соловьева Т.Ф., Оводов Ю.С. Конформационная стабильность и иммунохимические свойства иерсинина - основного белка внешней мембраны псевдотуберкулезного микроба // Биоорган. химия. 1989. Т. 15(6). C.763-772. 169. Pattnaik B.R., Ghosh S., Rajeswarib M.R Selective excitation of tryptophans in OmpF: A fluorescence emission study. Biochem Mol. Biol. Int. 1997. V. 42 (1). P. 173181. 170. Сидорова О. В., Исаева М. П., Хоменко В. А., Портнягина О. Ю., Лихацкая Г. Н., Ким Н. Ю., Новикова О. Д., Чистюлин Д. К., Соловьева Т. Ф. Мутантные OmpF-порины Yersinia pseudotuberculosis с делециями наружных петель: создание генетических конструкций, экспрессия, выделение, рефолдинг // Биоорган. химия. 2012. Т. 38(2). С. 156–165. 171. Pages J.-M., Bolla J M, Bernadac A, Fourel D Immunological approach of assembly and topology of OmpF an outer membrane protein of Escherichia coli // Biochimie. 1990. V 72(2-3). P.169-176. 172. Laver W.G., Air G.M., Webster R.G., Smith-Gills S. J. Epitopes on protein antigens: Misconceptions and realities // Cell 1990. V.61. P. 553-556. 173. IEDB Analysis Resource http://tools.immuneepitope.org/main/html/tcell_tools.html 174. Buommino E., Morelli F., Metafora S., Rossano F., Perfetto B., Baroni A. Porin from Pseudomonas aeruginosa induces apoptosis in an epithelial cell line derived from rat seminal vesicles // Infect. Immun. 1999. V. 67. Nо. 9. P. 4794-4800. 175. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. V. 227, N. 5259. P. 680–685. 176. Гааль Э., Медьеши Г., Верецкеи Л. Электрофорез биологических макромолекул. М.: Мир. 1982. С. 157. в разделении 177. Altschul S.F., Gish W., Miller W., Myers E.W., Lipman D.J. Basic local alignment search tool // J. Mol. Biol. 1990. V. 215. N. 3. P. 403–410. 178. Thomson J.D., Gibson T.J., Plewniak F., Jeanmougin F., Higgins D.G. The CLUSTALW windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools // Nucl. Acids Res. 1997. V. 25. N. 24. P. 4876-4882. 179. Чистюлин Д. К., Новикова О. Д., Портнягина О. Ю., Хоменко В. А., Вакорина Т. И., Ким Н. Ю., Исаева М. П., Лихацкая Г. Н., Т. Ф. Соловьева Выделение и характеристика OmpF-подобного порина наружной мембраны Yersinia ruckeri // Биол. мембраны 2012. Т. 29(3). С. 1-9. 180. Winder A. F., Gent W. L. G. / Correction of light-scattering errors in spectrosphotometric protein determinations // 1971. Biopolymers. V.10 (7). P. 12431251. 181. Burstein E.A., Vedenkina N.S., Ivkova M.N., 1973 Fluorescence and the location of try ptophan residuesin protein molecules // Photochem. Photobiol. V. 8. P.263-279. 182. Marquardt D.W. 1963. An algorithm for least-squares estimationof nonlinear parameters // J. Soc. Indust. Appl. Math. V. 11. P. 431-441. 183. Privalov P.L., Potekhin SA. Scanning microcalorimetryin studying temperature- induced changes in proteins // Methods Enzymol. 1986. V. 131 P.4-51. 184. Barltrop JA, Owen TC, Cory AH, Cory JG. 5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4,5- dimethylthiazolyl)-3-(4-sulfophenyl)tetrazolium, inner salt (MTS) and related analogs of 3-(4,5-dimethylthiazolyl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) reducing to purple water-soluble formazans as cell-viability indicators // Bioorg Med Chem Lett. 1991. V. 1. P. 611-614. 185. Nicoletti I, Migliorati G, Pagliacci MC, Grignani F, Riccardi C. A rapid and simple method for measuring thymocyte apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry // J Immunol Methods. 1991. V. 139. P.271-279.
