АНАЛИЗ ЧИСЛЕННОСТИ И ОСОБЕННОСТЕЙ БАКТЕРИЙ, ПОСТУПАЮЩИХ С
реклама
АНАЛИЗ ЧИСЛЕННОСТИ И ОСОБЕННОСТЕЙ БАКТЕРИЙ, ПОСТУПАЮЩИХ С СУДОВЫМ БАЛЛАСТОМ В ПРИБРЕЖНЫЕ ВОДЫ Г. ВЛАДИВОСТОКАДаль Мельникова Дарья Игоревна Дальневосточный Федеральный Университет г. Владивосток, Россия ANALYSIS OF THE NUMBER AND FEATURES OF BACTERIA ENTERING FROM SHIPS BALLAST IN COASTAL WATERS OF VLADIVOSTOK CITY Melnikova D I Far Eastern Federal University Vladivostok, Russia МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Федеральное государственное автономное образовательное учреждение Высшего профессионального образования ДАЛЬНЕВОСТОЧНЫЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ШКОЛА ЕСТЕСТВЕННЫХ НАУК Кафедра биохимии, микробиологии и биотехнологии Мельникова Дарья Игоревна АНАЛИЗ ЧИСЛЕННОСТИ И ОСОБЕННОСТЕЙ БАКТЕРИЙ, ПОСТУПАЮЩИХ С СУДОВЫМ БАЛЛАСТОМ В ПРИБРЕЖНЫЕ ВОДЫ Г. ВЛАДИВОСТОКА КУРСОВАЯ РАБОТА Научный руководитель: Л.С. Бузолева г. Владивосток 2 2013 3 ВВЕДЕНИЕ 5 ГЛАВА 1. Литературный обзор ............................................................................. 7 1.1. Микробиологические исследования переноса чужеродных микроорганизмов с судовым балластом ....................................................... 7 1.2. Формы существования микроорганизмов в водных микробных сообществах, методы их анализа и количественного учета .................... 10 1.3. Сохранение и изменение патогенных свойств микроорганизмов в водной среде ...................................................................................................... 16 ГЛАВА 2. Материалы и методы .......................................................................... 22 2.1. Объект исследования ............................................................................... 22 2.2. Учёт численности микроорганизмов .................................................... 24 ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение .................................................................. 30 3.1. Анализ физиолого-биохимических и морфологических свойств штаммов ............................................................................................................. 30 3.2. Результаты бактериологического анализа проб БВ .......................... 32 ВЫВОДЫ ............................................................................................................... 38 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..................................................................................... 40 4 ВВЕДЕНИЕ Одной из серьезных экологических проблем является проблема биологической инвазии. То есть вселение, несвойственных данной акватории, организмов в новые местообитания. Одним из способов попадания микроорганизмов в новые акватории осуществляется путем их сбрасывания с балластными водами. Чужеродные организмы могут перемещаться через океаны в водяном балласте судов, адаптироваться к новым условиям и в результате создавать значительные проблемы для морской среды, государственного имущества и здоровья человека. В забортной воде могут содержаться различные живые существа – от бактерий и мелких водорослей до моллюсков, медуз и даже небольших рыб. Эти живые существа попадают на борт судна в порту выгрузки, путешествуют вместе с судном на многие тысячи морских миль и сбрасываются за борт в порту погрузки. Одним из путей попадания чужеродных морских организмов в акватории портов является транспортировка их с балластными водами. В частности это характерно и для портов города Владивосток. Природные воды могут загрязняться микроорганизмами кишечной группы (холерный вибрион, бациллы брюшного тифа, паратифов, дизентерии), лептоспирами (возбудителями инфекционной желтухи, водяной лихорадки), возбудителями туляремии, бруцеллеза, некоторыми вирусами (Коксаки, ЕСНО, полиомиелита, трахомы и др.). Следует отметить, что вредными могут являться в данных обстоятельствах не только возбудители инфекций, но и вполне мирные в своей нормальной среде обитания существа (Сагайдак, 2003 ). Микроорганизмы обладают уникальной способностью к адаптации. Для них характерна высокая экологическая пластичность и способность сохранять свою жизнеспособность в широком диапазоне различных абиотических факторов — влажность, температура, органический состав, рН и др. (Бухарин, Литвин, 1997). Благодаря чему риск загрязнения акваторий 5 портов возрастает. Микроорганизмы вступают в сложные отношения с другими обитателями экосистем. Отсюда их способность вырабатывать субстанции, которые называются «факторами патогенности». Борьба с переносом водных организмов с водяным балластом является большой и трудной задачей. В настоящее время еще не приняты международные правила по контролю над переносом и внесением вредных водных и патогенных организмов посредством водяного балласта судов. Микроорганизмы, транспортируемые с балластными водами могут находиться в трех формах: в планктонной, в осадках и биопленках. Остается проблемой оценка количества и особенностей этих микроорганизмов. Методы отбора и микробиологического анализа балластных вод до сих пор недостаточно разработаны. Кроме того, в Приморье, где функционируют несколько крупных портов, деятельность которых связана с экспортом грузов, до сих пор не проводилось изучение переноса микроорганизмов с судовым балластом. В связи с этим актуальным является проведение поисковых микробиологических исследований для анализа ситуации с переносом микроорганизмов в балластных танках судов и подбор методик для выполнения последующих масштабных мониторинговых исследований. Поэтому целью курсовой работы было: подобрать методы, провести анализ численности и особенностей микроорганизмов, поступающих с судовым балластом в прибрежные воды г. Владивостока. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: 1) изучить существующие методы оценки численности и состава микробных сообществ в балластных танках судов; 2) выделить коллекцию штаммов и охарактеризовать их физиологобиохимические особенности; 3) провести бактериологический анализ проб балластных вод; 4) выполнить сравнительную характеристику численности и особенностей микроорганизмов БВ за 2007-2009 г. 6 ГЛАВА 1. Литературный обзор 1.1. Микробиологические исследования переноса чужеродных микроорганизмов с судовым балластом Вселение опасных морских видов с балластными водами судов в новую окружающую среду, было идентифицировано как одна из четырех самых больших угроз океанам в мире. Другие три – наземные источники морского загрязнения, чрезмерное использование морских ресурсов и физическое изменение/разрушение морской среды обитания (Сообщение №4 AGPS, 1993). У привнесенных водных видов есть потенциал вызывать крупные экологические и экономические изменения (Carlton et. al., 1990; Mills et. al., 1993) и микробные компоненты могут представлять опасность для здоровья человека (McCarthy, Khambaty, 1994; Hallegraeff, 1998). Главное направление в мировом транспорте чужеродных водных видов – это перенос их с балластными водами, сбрасываемыми с судов (Carlton, 1985; Ruiz et. al., 1997). Например известно, что Соединенные Штаты Америки ежегодно получают более 79 млн. тонн балластных вод из-за границы (Carlton et. al., 1995). Когда суда берут воду в одном порту и сбрасывают в другом, балластные воды могут включать в себя различный состав планктона, нектона и бентоса (Carlton, Geller, 1993; Lavoie et. al., 1999). Исследование балластных вод сосредоточилось в значительной степени на многоклеточных, однако в изобилии среди водных организмов находятся микроорганизмы. Было подсчитано, что бактерии и вирусы естественного происхождения в прибрежных водах имеют высокие концентрации (Ducklow, Shiah, 1993; Wommack, Colwell, 2000). Учитывая такой удельный вес, высокую репродуктивную способность и широкий диапазон устойчивости к физическим факторам – микроорганизмы являются частыми захватчиками прибрежных экосистем (Ruiz et. al., 2000). Исследования микроорганизмов в балластных водах были ограниченны до настоящего времени и сосредоточились главным образом на Vibrio cholerae (McCarthy, Khambaty, 1994), динофлагелятах (Hallegraeff, 1993, 7 1998) и протистах (Galil, Hulsmann, 1997). Примером наиболее вероятного транспорта с балластными водами, среди микроорганизмов, является Vibrio cholerae O1. Этот вид вызывает у человека заболевание холеры. В 1991 Vibrio cholerae был найден в устрицах и кишечнике рыб в заливе Mobile Bay, Алабама (DePaola et. al., 1992). Этот вид Vibrio cholerae не отличался от вида, отвечающего за эпидемию холеры в Латинской Америке, которая была в это же время. Когда же балластные воды судов, покинувших Латинскую Америку и прибывших в Mobile Bay, были проверены на бактерию холеры, то было обнаружено, что они содержали вызывающий эпидемию вид Vibrio cholerae (McCarthy et. al., 1992). Это предполагает, что балластная вода способствовала вселению в прибрежные воды залива Соединенных Штатов вызывающего эпидемию вида. Впоследствии, Береговая охрана Соединенных Штатов организовала Международную Морскую организацию по контролю за Балластными водами. Моряки предпринимают меры по снижению распространения патогенных микроорганизмов в балластных водах (Federal Register 1991). Сейчас единственный широко распространенный метод для управления распространением чужеродных водных микроорганизмов – это обмен балластными водами открытого океана. Эта процедура заключается в том, что судно, которое взяло балластную воду в прибрежном порту, сбрасывает эту воду в открытом океане и заменяет ее океанической водой. В свою очередь эта океаническая вода выпускается в следующем порту захода. Уменьшая плотность прибрежных организмов, и заменяя их океаническими видами, процент успеха вторжения микроорганизмов теоретически ниже. Различия между океанической водой и водой в порту получения, где происходит ее сбрасывание, обеспечивают большую вероятность гибели океанических видов (Smith et. al., 1999). Однако есть несколько проблем с этой обменной процедурой; в первую очередь опасность для судна и команды из-за волнений в море или вследствие выполнения процедуры ненадлежащим образом. Кроме того, 8 много судов предпринимают только частичный обмен (Carlton, 1995); даже когда обмен предпринят, это не всегда полностью эффективно (Zhang, Dickman, 1999), так как осадок в основании резервуаров судов не может быть полностью удален во время обмена (Williams et. al., 1988). Наконец, изменения в солености воды могут немного затронуть микроорганизмы и особенно их покоящиеся стадии, или вообще никак на них не повлиять. Объемы переноса бактерий и степень их выживаемости в новой среде могут быть значительными. Так, например, анализ результатов микробиологических исследований БВ и осадков 69 судов, прибывающих в Чесапикский залив (США), и экстраполяция экспериментальных данных показали, что в заливе ежегодно выживает до 1018–1019 клеток бактерий, перенесенных с балластом (Drake et. al., 2007). Неоднократно также сообщалось о выявлении и высокой выживаемости патогенных и условно-патогенных бактерий в пробах из балластных танков судов, в частности, энтерококков, Listeria monocytogenes, Aeromonas spp., Providencia rettgeri, Salmonella spp., Escherichia coli и других представителей сем. Enterobacteriaceae, Mycobacterium spp., Clostridium perfingens, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putrefaciens, Vibrio algynolyticus, Vibrio cholerae, Vibrio spp. (Burholder et. al., 2007; Dobbs et. al. 2003; Drake et. al., 2003; Ivanov, 2006; Knight et. al., 1999; Whitby et. al., 1998). Томсон с соавторами показали высокий уровень антибиотикорезистентности среди патогенных бактерий, обнаруженных в БВ и опасность этих особенностей превносимых бактерий для сообществ Чесапикского залива (США) (Thomson et. al., 2003). В настоящее время сведений о микроорганизмах балластных вод не так уж и много, универсальных методов анализа и количественного учета не разработано. Известно, что микроорганизмы могут сохраняться в балластных танках в воде, в осадках и в виде биопленок. Каждое из этих типов сообществ – специфично, для каждого существуют свои методы и особенности исследования. 9 1.2. Формы существования микроорганизмов в водных микробных сообществах, методы их анализа и количественного учета Микробные сообщества в воде могут находиться в различных видах. Они могут быть в планктонной форме, в виде биопленок или в осадках. Биопленки. Микроорганизмы предпочитают жить, будучи прикрепленными к твердой поверхности, нежели свободно плавающими - как в водной среде, так и в воздухе. Они организованы в так называемые биопленки (Biofilm), сбалансированные по видовому составу и функциональному распределению членов сообщества. Микроорганизмы в биопленке существуют и ведут себя не так, как свободно плавающие бактерии. Это взаимодействующая общность разных типов микроорганизмов, которые сгруппированы в микроколонии, окруженные защитным матриксом. Матрикс пронизан каналами, по которым циркулируют питательные вещества, продукты жизнедеятельности, ферменты, метаболиты и кислород. Все микроколонии имеют свои микросреды, отличающиеся уровнями рН, усваиванием питательных веществ, концентрациями кислорода. Бактерии в биопленке общаются между собой посредством химических раздражений (сигналов). Микроорганизмы в биопленке более устойчивы к антибиотикам, антимикробным средствам и другим активным агентам. В биопленке по-иному, в сравнении с чистыми культурами бактерий, происходят их многочисленные физиологические процессы, в том числе продукция метаболитов и биологически активных веществ. Сообщество организует единую генетическую систему в виде плазмид - кольцевых ДНК, несущих поведенческий код для членов биопленки, определяющих их пищевые (трофические), энергетические и другие связи между собой и внешним миром. Реакция микроорганизмов на изменение условий окружающей среды в биопленке существенно отличается от реакции каждого отдельного вида в монокультуре. Такая организация обеспечивает ее 10 физиологическую и функциональную стабильность и, следовательно, является залогом конкурентного выживания в экологической нише. Микроорганизмы в донных осадках. Важнейшая из экологических зон – это водное пространство или пленка на поверхности донных осадков, где происходит массовое развитие фототрофных сообществ и осуществляется первичная продукция органического вещества. Продукция органического вещества в результате фотосинтеза является необходимым условием обеспечения жизни в водоеме. Конечные продукты фотосинтеза обычно имеют большую молекулярную массу. К этой группе веществ относят углеводы, пептиды, целлюлоза, растворимые и летучие вещества – прямые субстраты для роста микроорганизмов, а также ряд веществ ингибиторов или стимуляторов роста. Осадки характеризуются присутствием форм, способных к скользящим движениям, либо прикрепленным к субстрату. К их числу относят многие цианобактерии, диатомеи, зеленые фототрофные нитчатые бактерии, флексибактерии, нитчатые серные бактерии (Нетрусов А.И., Бонч-Осмоловская Е.А. и др., 2004). В балластных водах микроорганизмы могут содержаться в донных осадках. Микроорганизмы в планктонной пленке. Поверхностная пленка воды характеризуется обилием питательных веществ, преимущественно липидов, которые вследствие высокого поверхностного натяжения накапливаются здесь из водной массы и из воздуха. Поверхностная пленка представляет собой аналог твердого субстрата, к которому прикрепляются в массовом количестве микроорганизмы. В создании первичной продукции Мирового океана значительную роль играет фотосинтез пикопланктона. Для него характерны некоторые виды цианобактерий, фотосинтезирующие зеленые серобактерии. Методы количественного учета микроорганизмов. О росте микроорганизмов в естественных субстратах или в питательных средах судят по изменению количества их клеток или биомассы в единице объема. Методы определения этих показателей могут быть 11 прямыми (подсчет клеток под микроскопом, взвешивание) или косвенными. Косвенные методы основаны на измерении параметров, величина которых зависит от количества или биомассы микроорганизмов (число колоний, выросших после посева суспензии клеток на питательную среду, рассеяние или поглощение суспензией света, содержание в ней белка и т.д.). Выбор метода зависит от целей исследования, свойств питательной среды или субстрата, а также особенностей роста и морфологии микроорганизмов. Большинство микроорганизмов, растущих в природных образцах, еще ждут своей очереди быть выделенными в чистые культуры. По некоторым оценкам, можно культивировать меньше 0,1% всего микробного разнообразия. Десятки тысяч видов микроорганизмов нуждаются в выделении и идентификации. Хотя многие из таких микроорганизмов относятся к так называемым «некультивируемым» и, таким образом остающимся недоступным классическим микробиологическим методам идентификации, существует несколько способов, позволяющих оценить их разнообразие и распространение. Культивируемые микроорганизмы обладают способностью к росту на плотных и жидких питательных средах (Нетрусов А.И., Егорова М.А. и др., 2005); а некультивируемые - организмы, которые не прорастают на обычно пригодных для них средах. Эта категория относится к физиологическому состоянию известных организмов, а не организмам, для которых не подобраны методы культивирования (Заварзин Г.А., Колотилова Н.Н., 2001). Поэтому выделяют следующие методы количественного учета для некультивируемых форм: Определение количества клеток микроорганизмов под микроскопом. Метод позволяет определить общее количество клеток в единице объема (как 12 живых, так и мертвых). Основное ограничение метода — необходимость довольно высоких концентраций клеток в единице исследуемого субстрата. 1. Подсчет клеток в счетных камерах. Это метод рекомендуется использовать для подсчета некоторых относительно крупных бактерий. 2. Капиллярный метод прямого счета микроорганизмов. Позволяет подсчитывать мелкие микроорганизмы. Применяется для подсчета микробных клеток и контроля роста бактерий. 3. Подсчет клеток на фиксированных окрашенных мазках (метод Виноградского—Брида). модификациях разнообразных для Этот метод определения естественных применяется численности субстратах. в различных микроорганизмов Преимущество в метода заключается также в том, что фиксированные окрашенные препараты могут долго храниться. 4. Подсчет клеток на мембранных фильтрах. Данный рекомендуется использовать для определения метод численности микроорганизмов в субстратах с низкой плотностью клеток. При выявлении и количественном учете микроорганизмов широко применяют люминесцентную микроскопию. Люминесцентная микроскопия дает также возможность выявить и оценить в исследуемой пробе численность отдельных групп микроорганизмов (Нетрусов А.И., Егорова М.А. и др., 2005). Методы количественного учета для культивируемых форм: Определение числа клеток микроорганизмов высевом на питательные среды. В отличие от подсчета микроорганизмов под микроскопом этот метод дает возможность определить только число жизнеспособных клеток в популяции. Поскольку сред, пригодных для роста всех микроорганизмов, не существует, метод высева дает возможность определить лишь число микроорганизмов, способных расти на среде данного состава, причем не позволяет учесть те микроорганизмы, которые не растут (например, так называемые жизнеспособные, но не культивируемые формы) или растут очень медленно. 13 1. Определение количества клеток высевом на плотные питательные среды (метод Коха). Метод широко применяют для определения численности жизнеспособных клеток в различных естественных субстратах и в лабораторных культурах. В его основе лежит принцип Коха, согласно которому каждая колония является потомством одной клетки. 2. Определение количества клеток высевом в жидкие среды (метод предельных разведений). Метод используют для подсчета микроорганизмов, которые плохо или совсем не растут на плотных питательных средах. Определение биомассы взвешиванием. Этот метод широко применяют для оценки роста микроорганизмов в жидких питательных средах. Можно использовать его и для определения массы клеток, выращенных на плотной питательной среде. Определение количества клеток и биомассы нефелометрическим методом. Позволяет быстро и довольно точно определить концентрацию клеток в суспензии или культуральной жидкости. Нефелометрический метод пригоден лишь для тех микроорганизмов, рост которых вызывает равномерное помутнение среды и не сопровождается заметным изменением формы и размеров клеток, образованием мицелия, пленок или других скоплений (Нетрусов А.И., Егорова М.А. и др., 2005 ). Кроме количественного учета микроорганизмов, чрезвычайно важно анализировать качественный состав микробного сообщества, который может указать на роль и потенциал микробоценоза в экосистемах. Существует несколько различных методов анализа структуры микробного сообщества: 1. Структура сообществ на основе липидного анализа. Информация, полученная с помощью липидного анализа, позволяет частично проникнуть внутрь микробного сообщества. ЖК образцы из природных микробных сообществ представляют в основном широкий спектр сложных молекул в которых эти образцы ЖК обеспечивают количественный анализ, но интерпретация отдельных специфических компонентов сообщества может быть трудной. Количественные сравнения суммарных образцов ЖК могут 14 дать информацию о структуре сообщества в целом, но не могут обеспечить более детальный анализ на уровне (внутри) отдельных специфических микробных групп. Анализ содержания специфических липидных биомаркеров не может определить каждый вид микроорганизмов в природных образцах, т.к. много видов имеют сходный ЖК состав. Некоторые специфические группы микроорганизмов, однако, имеют характерный специфический ЖК профиль. Липидный анализ может быть чрезвычайно полезен, когда основные физические параметры или экология системы известны. В особенности, ЖК анализ обеспечивает оценку гетерогенности образцов или гетерогенность внутри образца и оценку структуры сообществ. Липидный анализ дает такую информацию о сообществах, которую невозможно получить другими методами. 2. Структура сообществ на основе анализа нуклеиновых кислот. Анализ ДНК в образцах был использован успешно для усиления ЖК анализа. Такой подход позволяет определить физиологический потенциал микробного сообщества. По сравнению с ЖК анализом это более детальный подход для изучения структуры микробных сообществ, он представляет собой комбинацию следующих методов: амплификацию с помощью ПЦР, следующие затем денатурирующий градиентный гель электрофорез (DGGE) или температурный градиентный гель электрофорез (TGGE) – анализ генов рРНК. Сочетание ЖК анализа и анализа НК может быть очень полезным для характеристики биомассы и структуры микробного сообщества. Липидный анализ является показателем фенотипических свойствам сообщества, которые показывают существующую в настоящий момент микробиологическую активность, скорость роста, действие токсикантов, несбалансированный рост, дефицит некоторых питательных веществ, метаболический баланс между аэробами и анаэробами, в то время как анализ 15 НК позволяет более детально оценить структуру и физиологический потенциал микробного сообщества. 3. BIOLOG. Автоматизированная система идентификации микроорганизмов, основанная на аэробной метаболической активности, используется для определения сравнительной структуры микробных сообществ. Система основана на оценке дифференциальной бактериальной метаболической активности в отношении 92 углеродсодержащих субстратов и может показать различия в метаболизме микробных сообществ. Структура сообществ на основе анализа изолированных штаммов. Для идентификации культивируемых микроорганизмов в настоящее время широко используется анализ содержания distinctive ester-linked FA (преимущественно для фосфолипидов и липополисахаридов клинических изолятов). Образцы уникальных (выдающихся ЖК из микроорганизмов, выращенных на стандартной среде используются для дифференцировки более чем 2000 организмов с использованием стандартной системы MIDI идентификации (MIDI, Newark, Del.). Использование этой системы требует предварительной изоляции и культивирования штаммов. Как результат этого, некультивируемые организмы, составляющие значительную часть микробного сообщества не могут быть идентифицированы (Hurst, 2002). Многие сохраняясь в патогенные балластной и воде условно-патогенные как в микроорганизмы, культивируемом, так и в некультивируемом состоянии, могут представлять угрозу для водных сообществ акваторий, куда идет сброс балласта. 1.3. Сохранение и изменение патогенных свойств микроорганизмов в водной среде Приведем некоторые факты переноса с балластными водами условнопатогенных и патогенных микроорганизмов. Было изучено бактериологическое качество балластных вод судов приходящих из иностранных портов в порты Сингапура. В результате, из-за безудержной разгрузки балластных вод и осадка от судов, была объявлена 16 угроза вселения опасных патогенных микроорганизмов. Образцы балластных вод с судов Сингапурской гавани были сравнены по концентрации таких бактерий, как enterobacteria, Vibrio spp. и Escherichia coli. Концентрация факультативно-анаэробных бактерий, которые часто являются агентами болезней, в балластной воде судов, была выше, чем в морской воде. Образцы проб балластных вод дали следующие результаты: 0,7 – 39,5% eubacteria; 0 – 2,5% enterobacteria; 0,2 – 35,8% Vibrio spp.; 0 – 2,5% E. coli. Существенный процент Vibrio spp. в некоторых образцах балластных вод увеличивает риск вторжения патогенных микроорганизмов в прибрежные области. Так же было показано фекальное загрязнение воды. Из-за содержания в балластных водах патогенных микроорганизмов, за ними был введен регулярный контроль. Так же известны случаи сброса балластных вод содержащих патогенные микроорганизмы, в гавани Мумбай (Индия). По микробиологическому анализу проб, содержание таких патогенных бактерий, как Escherichia coli Shigella-Alkaligens группы Dispar были в изобилии по сравнению с другими частями гавани Мумбай, где не происходило сброса вод. Даже Vibrio cholerae, V. parahaemolyticus, Salmonella spp., campylobacters и aeromonads присутствовали в больших количествах. Есть и еще ряд случаев переноса с балластными водами патогенных микроорганизмов. Которые способны не только выживать в новых условиях, но и передавать свои гены другим микроорганизмам. Появление антибиотико-устойчивых микроорганизмов — эволюционный урок. Селекция антибиотико-резистентных бактерий и лекарственно-устойчивых паразитов часто не соответствует используемым препаратам. Патогены могут «приобретать» новые гены резистентности и для того, чтобы сохраниться в природе среди непатогенных видов. Здесь они селекционируются, а возможно даже и создаются давлением антибиотиков соперничающих видов (Morse S., 1995). 17 Многие вирусы обладают способностью мутировать и благодаря этому постоянно образуют новые эпидемические и эпизоотические варианты. Вирусы, бактерии обладают способностью переносить участки генов от одного организма к другому. Это явление получило название горизонтального переноса генов. У бактерий перенос генов плазмидами, переходящими от одной бактериальной клетки к другой, служит механизмом рекомбинации. Благодаря этому механизму полезные для бактериальной популяции свойства, например устойчивость к антибиотикам, очень быстро становятся всеобщим достоянием. Горизонтальный (латеральным) перенос генов может быть между организмами, как близкородственными, так и филогенетически отдаленными, принадлежащими даже к разным царствам. Горизонтальный перенос генов является главным источником инноваций, инструментом быстрого приобретения и возникновения новых генов, способных радикально изменить свойства клеток, расширить их адаптационный потенциал. Изменчивость организмов в результате горизонтальной передачи генов реализуется через различные каналы генетической коммуникации процессы коньюгации, трансдукции, трансформации, процессы переноса генов в составе векторов - плазмид, вирусов, мобильных элементов. Активный перенос генов может происходить в симбиотических, паразитарных или ассоциативных системах, где осуществляется физический контакт клеток. Возможно три варианта переносов: 1) Приобретение нового гена, для которого нет гомолога в собственном геноме и в геномах филогенетически родственных организмов. В этом случае возникает принципиально новое качество; 2) Приобретение паралогичного (структурно похожего) гена с генетически увеличивается отдаленным родством. функциональное В результате разнообразие белков такого в переноса клетке; 3) Приобретение нового гена ксенолога, функционально замещающего свой собственный ген, который при этом, как правило, элиминируется. Новый и 18 старый гены структурно различаются между собой, но обеспечивают аналогичные физиологические функции. В результате горизонтального переноса организм может получить следующие преимущества: 1) Новый путь биосинтеза или катаболизма, обеспечивающий организму преимущества в изменившихся условиях; например, появление способности утилизировать новый субстрат. 2) Повышение устойчивости к антибиотикам, токсинам, патогенам, подавляющим рост клеток данного вида; через горизонтальный перенос могут быть получены и гены, ответственные за средства "нападения", характерные, например, для патогенных микроорганизмов. 3) Замещение предсуществующих генов такими генами, продукты которых увеличивают эффективность функционирования клеточных систем: например, повышение термоустойчивости, резистентности к ингибиторам, оптимизация кинетических характеристик белка, интеграция в сложные комплексы и т.п. 4) Приобретенные гены могут оказаться и функционально нейтральными, дублирующими уже имеющиеся гены; такие дополнительные гены являются страховкой для организма в тех случаях, когда свой собственный ген будет поврежден мутацией или "замолчит" из-за нарушения в системах регуляции. Приобретение "чужих" генов может изменить направление эволюции вида, существенно повлиять на фенотип организма, на его способность к адаптации в экологическом сообществе. Новый ген может дать начало новой субпопуляции, которая способна вытеснить предсуществующий вид. Горизонтальный перенос генов способствует ускорению эволюционного процесса, по сравнению с градуальным накоплением мутаций или внутригеномными перестройками. Конечно, при этом не отрицается селективное значение мутационных утрат какой-то функции и важная эволюционная роль мутаций в генах, контролирующих стабильность генома 19 (системы репликации, репарации, модификации ДНК и т.д.) и механизмы регуляции и координации генного действия. Поскольку гены являются сложными структурами и содержат различные домены, ответственные за разные функции в белковом продукте, то, очевидно, что через горизонтальный перенос могут передаваться не только целые гены или блоки генов, но и фрагменты генов, содержащие отдельные домены. Микроорганизмы привнесенные в прибрежные акватории вступают в сложные отношения с другими обитателями экосистем, вмещающих их резервуары (конкуренция, симбиоз, отношение «хищник — жертва»). Отсюда их способность вырабатывать «факторы патогенности». Каждый из них ответственен за проявление конкретных свойств микроорганизма в инфекционном процессе. К ним относят: факторы адгезии и колонизации — с их помощью бактерии распознают рецепторы на мембранах клеток, прикрепляются к ним и колонизируют клетки (различные поверхностные структуры клеточной стенки); факторы инвазии — благодаря им бактерия проникает в клетку (белки наружной мембраны); факторы, препятствующие фагоцитозу — либо маскируют бактерию от фагоцитоза (капсула), либо подавляют фагоцитоз (различные белки — белок А у стафилококков, белок М у стрептококков); факторы, подавляющие фагоцитоз — вещества, подавляющие окислительный взрыв фагоцитов (например, V-W-антигены Y. pestis); ферменты «защиты и агрессии» бактерий — способствуют распространению бактерий по тканям хозяина (гиалуронидаза, лецитиназа, протеазы и др.); эндотоксины — представлены только у грамотрицательных микроорганизмов (липосахариды и связанные с ними белки клеточной стенки). Высвобождаются в среду организма после гибели клетки и обладают многообразным воспалительным и пирогенным действием неспецифического характера; экзотоксины — токсические молекулы, активно секретируемые в окружающую среду с помощью специальных секретируемых систем (Коротяев А.И., Бабичев С.А., 1998). 20 Таким образом, микроорганизмы способны приобретать новые гены, переходить от условно-патогенных к патогенным, быть устойчивыми к антибиотикам, и тем самым представлять угрозу как для водных сообществ, так и для человека. 21 ГЛАВА 2. Материалы и методы 2.1. Объект исследования Производился микробиологический анализ проб балластных вод, отобранных в танках танкера «Минотавр», работающего на китайскороссийской линии. Забор вод проводили в портах Лункоу и Лайжоу, залив Лайжоувань; в порту Нантон на реке Янцзы. Порт Лункоу Порт Лайжоу (http://www.worldportsource.com/ports/maps/C (http://www.worldportsource.com/ports/maps/ HN_Port_of_Longkou_2463.php) CHN_Port_of_Laizhou_2459.php) Порт Нантон на р. Янцзы (http://www.worldportsource.com/ports/maps/CHN_Port_of_Nantong_406.php) Также анализировались воды, забор которых проходил в портах Японии: Кавасаки, Мидзушима и Ивакуни. 22 Порт Мидзушима (http://www.worldportsource.com/ports/maps/JP N_Port_of_Mizushima_3335.php) Порт Кавасаки (http://www.worldportsource.com/ports/ma ps/JPN_Port_of_Kawasaki_1381.php) Порт Ивакуни (http://www.worldportsource.com/ports/maps/JPN_Port_of_Iwakuni_3246.php) Микробиологический анализ проб воды проводится с использованием чашечного метода Коха. Определяли наличие микроорганизмов, обладающих способностью синтезировать ферменты, осуществлять внеклеточный гидролиз биополимеров: белков, жиров, углеводов. Определяли присутствие санитарно-показательных микроорганизмов. Которые являются индикаторами санитарного состояния вод. Ставили тесты на чувствительность микроорганизмов к антибиотикам. А также проверяли устойчивость бактерий к действию металлов. Как коллекционные штаммы способны использовать металлы в качестве источника питания. 23 2.2. Учёт численности микроорганизмов Среды, необходимые для учета численности микроорганизмов: А) Гетеротрофные микроорганизмы: Cреда для культивирования морских микроорганизмов – СММ (Youchimizu, Kimura, 1976): MgSO4 – 1 г, пептон – 5 г, дрожжевой экстракт – 5 г, глюкоза – 1 г, CaCO3 – 1 г, K2HPO4 – 0,2 г, морская вода – 500 мл, дистиллированная вода – 500 мл, агар-агар – 15 г, pH = 7,8 (рис. 1 а, б). а б Рис. 1 Пример роста гетеротрофных микроорганизмов: а, б Б) Бактерии группы кишечной палочки и E. сoli: дифференциальнодиагностическая среда Эндо (Общая и санитарная…, 2004) (рис. 2 а, б, в). а б 24 в Рис. 2 Пример роста колоний на среде ЭНДО: а, б, в В) Липолитики (с лецитиназной активностью): В качестве основы использовали среду СММ, в которую после охлаждения до 50ºС добавляли асептически 1 яичный желток (на 800 мл) (Методы общей бактериологии, 1983). Активность ферментов определяли по наличию зоны действия вокруг колонии гидролитического фермента, выделяемого в среду, чем она больше, тем больше фермента синтезируется, или он более активен. Эту же среду использовали для оценки ферментативной активности (рис. 3 а, б). а б Рис. 3 Пример роста штаммов на среде с добавлением желтка: а, б 25 Г) Протеолитики (с казеиназной активностью): В качестве основы использовали среду СММ, в которую добавляли 30 г/л агара. Непосредственно в чашках смешивали 5 мл стерильного обезжиренного молока и 5 мл среды (Методы общей бактериологии, 1983). Активность ферментов определяли по наличию зоны действия вокруг колонии гидролитического фермента, выделяемого в среду (рис. 4). Рис. 4 Пример роста штаммов на среде с добавлением молока Д) Амилолитики (с амилолитической активностью): В качестве основы использовали среду СММ без глюкозы, куда в качестве источника углерода добавляли 0,2 % растворимого крахмала. Режим стерилизации: 0,5 атм, 15 мин. активность фермента оценивалась после окрашивания среды раствором Люголя) (Методы общей бактериологии, 1983). Активность фермента оценивалась после окрашивания среды раствором Люголя. Определяли по наличию зоны действия вокруг колонии гидролитического фермента, выделяемого в среду (рис. 5 а, б). 26 а б Рис. 5 Пример роста штаммов на среде с добавлением крахмала: а, б Е) Enterococcus faecalis: использовали энтерококкагар, содержащий азид натрия и относящийся также к дифференциально-диагностической среде (Общая и санитарная…, 2004). Enterococcus faecalis на энтерококкараре развивается с формированием колонии с гладкими краями, выпуклые, тёмно - малиновые, розовые, светло – розовые, равномерно окрашенные или с тёмно - красным, нечётко оформленным центром, а так же очень мелкие, плоские разных оттенков, с чётко выраженным центром и бесцветным ободком колонии (Пяткин, 1980) Ж) Среда для оценки металлоустойчивости: В качестве основы использовали среду YK, куда добавляли соли металлов, в следующих концентрациях: CdCI2: 80; 90; 100; 110 мг/л; CuCl2: 300; 400; 500; 600 мг/л; CoCl2: 200; 300; 400; 500 мг/л; ZnCl2: 300; 400; 500; 600 мг/л; NiCl2: 800; 1000; 1200; 1400 мг/л (рис. 13 а, б, в, г, д). Использовали метод отпечатков. Использовали метод отпечатков. Этот метод очень удобен, поскольку можно проверить устойчивость к поллютантам до ста штаммов. Прожаренный в шкафу аппликатор помещается около спиртовки и в каждую лунку аппликатора вносится 11 мкл физ. раствора. Используя простериллизованные зубочистки, набирают немного биомассы, зубочистку помещают в лунку и так оставляют на несколько минут. Крышку 27 аппликатора вносят в лунки и отпечатывают на поверхности агара (Лабинская, 1978). З) Тесты на антибиотикочувствительность микроорганизмов. Метод основан на определении зоны задержки роста культур при воздействии противомикробного препарата соответствующего наименования. Определение проводят после высева испытуемых штаммов на плотную питательную среду, на поверхность которой наносят различные диски для оценки антибиотикочувствительности. Диаметр зоны учитывают по полному подавлению роста микроорганизмов, определяемому визуально. Диаметры зон измеряют с точностью до 1 мм при помощи штангенциркуля или линейки (http://www.dntpasteur.ru/7-091201.html). Оценку чувствительности микроорганизмов к противомикробному препарату проводят, сопоставляя полученные результаты с пограничными значениями зон задержки роста (http://www.diakon-diagnostics.ru/). Определение морфологических и физиолого-биохимических свойств. Определение типа клеточной стенки. Использовалась 3% щелочь. На предметное стекло наносили каплю щелочи и затем микробиологической петлей вносили в нее микробную массу и тщательно перемешивали. Если через несколько секунд жидкость в капле приобретает слизистую консистенцию и при отрыве петли от стекла за ней тянутся нити длиной в несколько сантиметров, то это грамотрицательные бактерии. Если микроорганизмы грамположительные, то нитей не образуется, вместо этого микробная масса образует хлопья (Методы общей бактериологии, 1984). Способность синтезировать каталазу и оксидазу. При определении каталазы выросшую культуру снимали с поверхности агара микробиологической петлёй и суспендировали в капле 3% перекиси водорода на предметном стекле. При положительной реакции наблюдаем появление пузырьков газа (Методы общей бактериологии, 1984). При определении оксидазы использовался водный 1% раствор тетраметил-n28 фенил-диамина, который наносился на колонию микроорганизма. Если колония окрашивается в течение 10 – 30 секунд в фиолетово – синий цвет, то реакция положительная (Методы общей бактериологии, 1984). 29 ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 3.1. Анализ физиолого-биохимических и морфологических свойств штаммов Был проведен анализ численности, особенностей бактерий, поступающих с судовым балластом в прибрежные воды г. Владивостика. Составлена коллекция штаммов. Изучены свойства способности штаммов расти на различных концентрациях металлов, синтезировать ферменты, осуществляющие внеклеточный гидролиз белков, жиров и углеводов. Также были поставлены тесты на антибиотикочувствительность, грампринадлежность, католазу и оксидазу. 1) Способностью синтезиравать оксидазу обладают все коллекционные штаммы. И 60% микроорганизмов синтезируют католазу (см. приложение 1). 2) По типу клеточной стенки 23 штамма из 43 – грамположительные, остальные 20 – грамотрицательной грамотрицательные микрофлоры (см. большую приложение часть обычно 1). Среди составляют энтеробактерии, а среди грамположительной – псевдомонады. 3) Микроорганизмы способны использовать в качестве питательных субстратов – белки, жиры и углеводы. Коллекция штаммов обладает слабой гидролитической активностью: 28% составляют бактерии амилолитики – они синтезируют и выделяют в среду амилазу, фермент, который гидролизует крахмал; 26% составляют липолитики, они способны синтезировать и выделять в среду фермент лецитиназу; 14% протеолитики – синтезируют казеиназу (см. приложение 1). 4) Анализ металлоустойчивости бактерий балластных вод показал, что наиболее устойчивыми практически ко всему списку металлов оказалось девять штаммов (М 2-2; М 2-11; 578.1; 579.1; 579.7; 579.8; 512/1; 513/1; 513/2). Данные штаммы коллекции могут использовать эти металлы, как источник питания. Наиболее устойчивы микроорганизмы были по отношению к Pb. Практически при всех его концентраций, наблюдался рост микроорганизмов, за исключением трех штаммов (М 2-10; 579.5; 668.1), которые либо совсем не росли, либо был рост при самых низких значениях 30 концентрации данного металла. Штамм М 2-10 оказался чувствителен к каждому из металлов (см. приложение 1). 5) Проведенные тесты на антибиотикочувствительность показали, что наиболее сильными антибиотиками по отношению к коллекционным штаммам являются: 1) гентамицин. Устойчивым к нему оказался только один штамм (579.3), все остальные – чувствительны. 2) тетрациклин. Число чувствительных – 27, а вот устойчивых к этому антибиотику всего 2 (579.3 и 578.1) штамма. 3) офлоксацин . Среди всех штаммов 26 – чувствительных к данному антибиотику, и 3(579.3, 579.13 и 578.1) – устойчивых. Далее, по силе воздействия на рост микроорганизмов идут такие антибиотики, как рифампицин, ампициллин, налидиксовая кислота и левомицетин. Здесь, большая часть всех штаммов микроорганизмов чувствительна к их действию. И лишь незначительное их количество – устойчивы ( по 5 – 6 штаммов на каждый антибиотик). Олеандомицин, полимиксин - антибиотики, на которые приходится практически равное количество как чувствительных, так и устойчивых штаммов микроорганизмов. Самым слабым, из приведенного списка антибиотиков, является цефтазидим. чувствительны Устойчив и к один, нему 21 относится штамм к микроорганизмов, разряду 6 – промежуточной антибиотикочувствительности (см. приложение 2). Самым устойчивым к действию антибиотиков, является штамм номер 578.1. Единственный антибиотик, к которому он чувствителен это – гентамицин. При рассмотрении антибиотикочувствительности всех штаммов, видно, что большая из них часть чувствительна практически ко всем антибиотикам, за исключением некоторой сложившейся группы. В эту группу антибиотиков входят – ампициллин, цефтазидим, олеандомицин, полимиксин. К ним 31 основная масса штаммов устойчива. Например, штаммы 579.1, 579.5 – чувствительны ко всем антибиотикам, кроме цефтазидима и полимиксина; М 2-1, М 2-2, М 2-16 – устойчивы к цефтазидиму; TS 1-9 и М 2-15 – устойчивы к цефтазидиму, олеандомицину; TS 1-6 и TS 1-35 – устойчивы к олеандомицину; 579.12 – устойчив к полимиксину; М 2-17 – устойчив к ампициллину, цефтазидиму и олеандомицину; TS 1-1 – устойчив к ампициллину и цефтазидиму; TS 1-29 – устойчив к цефтазидиму, олеандомицину и полимиксину; Все эти, выше упомянутые антибиотики можно отнести к числу средне или слабо действующие. Штамм 578.3 чувствителен к действию всех антибиотиков и признаков устойчивости не проявляет. Штаммы 579.6 и 579.9 чувствительны лишь к половине действующих на них антибиотиков, к другой половине они устойчивы (см. приложение 2). 3.2. Результаты бактериологического анализа проб БВ Результаты бактериологического анализа проб балластных вод, отобранных в танках танкера «Минотавр», 2008 г. (см. приложение 3) Отмечена достаточно стабильная общая численность гетеротрофных бактерий в балластных водах, забор которых проводили в портах Лункоу и Лайджоу залив Лайжоувань (Китай), Жёлтое море, в пределах 103 - 104 кл/ мл, что соответствует умеренному уровню загрязнения. Однократное увеличение численности гетеротрофных КОЕ на порядок, что указывает на загрязненное качество воды, было обнаружено в балластных водах из пробы, отобранной в июле, однако, это может быть объяснено и сезонным всплеском численности гетеротрофных бактерий. В пробах балластной воды, отобранной в портах, расположенных на р. Янцзы, с последующей заменой этого балласта в открытом море, в июлеавгусте 2008 г. выявлялась более высокая численность КОЕ гетеротрофных бактерий, которая изменялась в диапазоне105 – 106 кл/ мл. Можно 32 предположить, что замены балласта не производилось, либо была произведена не полностью. Кроме того, обнаружена значительная численность бактерий группы кишечной палочки, на уровне 102 – 103 кл/ мл (проба от 04.07.2008), что не соответствует санитарным требованиям. Бактерии этой группы являются индикаторами санитарного состояния вод и могут указывать на загрязнение коммунально-бытовыми стоками. Единичные бактерии этой группы выявлялись в последующих пробах, что может указывать либо на выживаемость и сохранение штаммов в балластном танке, т.к. полной смены балласта и очистки танков от бактерий достичь невозможно, либо на поступление этих бактерий при заборе балласта в портах следующих заходов танкера. Более вероятным может представляться первый вариант. В пробе, отобранной в сентябре, количество колиформных бактерий было также стабильно высоким на уровне 102 – 103 кл/ мл, при общем снижении численности КОЕ гетеротрофных бактерий до уровня, соответствующего умеренному загрязнению вод. Энтерококки, как индикаторы свежего фекального загрязнения в проанализированных пробах не разу не выявлены. Результаты бактериологического анализа проб балластных вод, отобранных в танках танкера «Sunrise Wisteria», 2008 г. (см. приложение 4) В пробах балластных вод, забор которых производился в портах Японии, численность КОЕ гетеротрофных бактерий была на 1-2 порядка ниже, чем в аналогичных пробах танкера «Минотавр», работающего на китайско-российской линии, изменялась в диапазоне 102 – 103 кл/ мл, бактерии группы кишечной палочки и фекальные стрептококки не обнаружены ни в одной пробе. Если сравнивать пробы балластных вод танков танкера «Minotaur», работающего на китайско-российской линии, отобранные в портах, расположенных на р. Янцзы, с последующей заменой этого балласта в открытом море, то видно, что численность КОЕ гетеротрофных организмов 33 различна в зависимости от месяца отбора проб. Например, численность в июле 104 - 105 кл/мл, а в августе численность превысила июньские результаты на один порядок и составила - (4,2 ± 0,3)×106 кл/мл (поверхностный слой), (4,5 ± 0,5)×105 кл/мл ( у дна танка). Далее, в сентябре численность КОЕ гетеротрофных микроорганизмов в пробах балластных вод поверхностного слоя упала на три порядка и стала равной (3,7 ± 0,5)×103 кл/мл, и у дна – на два порядка (5,2 ± 0,4)×103 кл/мл. При сравнении общей численности гетеротрофных бактерий в балластных водах, забор которых проводили в порту Longkou, залив Лайжоувань (Китай), Жёлтое море, отмечено, что она достаточно стабильна, и составляет 103 - 104 кл/мл, приходящиеся на май и июнь. Однако было обнаружено однократное увеличение численности гетеротрофных КОЕ в балластных водах из пробы, отобранной в июле, численность которой составила - (3,8 ± 0,4)×105 кл/мл (поверхностный слой), (4,5 ± 0,5)×105 кл/мл (у дна танка). И затем с последующим падением численности на один порядок, в августе. Однако, все это может быть объяснено и сезонным всплеском численности гетеротрофных бактерий. В пробах балластной воды, отобранной в портах, расположенных на р. Янцзы (Китай), обнаружена значительная численность бактерий группы кишечной палочки, на уровне 102 – 103 кл/ мл, приходящиеся на июль – сентябрь. Также единичные бактерии этой группы были выявлены в других пробах балластных вод, отобранных в портах Longkou ((3,2 ± 0,1)×10 кл/мл; (5,1 ± 0,1)×10 кл/мл – июль, (1,2 ± 0,1)×10 кл/мл; (0,9 ± 0,1)×10 кл/мл – август) и Лайджоу ((5,0 ± 0,1)×10 кл/мл; (7,1 ± 0,2)×10 кл/мл – июль) залив Лайжоувань (Китай), Жёлтое море. Что не соответствует санитарным требованиям. Бактерии этой группы являются индикаторами санитарного состояния вод и могут указывать на загрязнение коммунально-бытовыми стоками. Пробы балластных вод, которые содержали такие санитарно- показательные микроорганизмы, как Escherichia coli, были отобраны в 34 портах, расположенных на р. Янцзы и в порту Лайджоу. Численность Escherichia coli составила 20кл/мл (р.Янцзы), и 5 кл/мл (Лайджоу). Энтерококки, как индикаторы свежего фекального загрязнения в проанализированных пробах ни разу не выявлены. Численность КОЕ гетеротрофных микроорганизмов в пробах воды из балластных танков танкера “Sunrise Wisteria”, забор которых был произведен в порту Kawasaki (Япония), достаточно устойчивая, в пределах 102 кл/мл, в период с августа по ноябрь. Численность КОЕ в пробах, других портов Японии отличается, на один порядок выше – п. Mizushima: (2,9 ± 0,4)×103 кл/мл (поверхностный слой), (4,8 ± 0,3)×102 кл/мл (у дна танка); п. Iwakuni: (1,8 ±0,1)×103 кл/мл (поверхностный слой), (7,4 ± 0,2)×102 кл/мл (у дна танка). Бактерии группы кишечной палочки и фекальные стрептококки не обнаружены ни в одной пробе балластных вод, забор которых производился в портах Японии. При сравнении балластных вод, забранных в портах Китая и Японии, численность КОЕ гетеротрофных бактерий портов Японии была на 1-2 порядка ниже, чем в аналогичных пробах танкера «Минотавр», работающего на китайско-российской линии, а также бактерии группы кишечной палочки и фекальные стрептококки обнаружены не были. Сравнительная характеристика численности микроорганизмов балластных вод за 2007-2008 гг. При рассмотрении результатов бактериологического анализа балластных вод, забранных в порту Лайджоу (Китай) за 2007 и 2008 год можно увидеть, что численность КОЕ гетеротрофных микроорганизмов достаточно стабильна, и колеблется в пределах 103-104 кл/мл. Отличием является то, что в пробах за 19.12.07 количество КОЕ микроорганизмов в 1 см3 осадков, было на 2 порядка выше обычного - (1,3 ± 0,2)×106. Однако в 2007 году бактерий группы кишечной палочки обнаружено не было, чего нельзя сказать о 2008 г. 35 То же самое можно сказать и о пробах балластных вод, забор которых был произведен в портах Японии. Численность КОЕ гетеротрофных микроорганизмов за 2007 г. и 2008 г. была в пределах 102 -103 кл/мл и не превышала 103 кл/мл. Как в 2007 г., так и в 2008 в пробах балластных вод, из портов Японии, не было выявлено санитарно-показательных микроорганизмов. Результаты бактериологического анализа проб балластных вод, отобранных в танках танкера «Минотавр», 2009 г. (см. приложение 5) Анализ балластных вод, забор которых проводили в порту Лункоу (Китай), в январе и феврале 2009 г. показал, что численность КОЕ гетеротрофных бактерий равна нулю. То же самое можно сказать и о численности санитарно-показательных микроорганизмов (БГКП, E. coli, Enterococcus faecalis). По мере потепления, в апреле месяце численность микроорганизмов начинает расти и держится на уровне 102 кл/мл, так же наблюдается рост единичных бактерий группы кишечной палочки. В пробах балластной воды, отобранной в портах, расположенных на р. Янцзы, с последующей заменой этого балласта в открытом море, в апреле 2009 г. выявлялась более высокая численность КОЕ гетеротрофных бактерий, которая изменялась в районе 103 кл/ мл. Кроме того в этом же диапазоне численности (( 1,04 ± 0,12)×103 –поверхностный слой; (1,47 ± 0,32)×103 – у дна танка)) обнаружены бактерий группы кишечной палочки, что не соответствует санитарным требованиям. Следовательно можно предположить, что замены балласта не производилось, либо была произведена не полностью. При анализе проб балластной воды из порта Лайжоу, было отмечено, что численность КОЕ гетеротрофных бактерий в мае месяце увеличилась на один – два порядка по сравнению с мартом 2009г. Сравнительная характеристика численности микроорганизмов балластных вод за 2008-2009 гг. 36 В сравнении с предыдущим годом, в 2009г., в пробах балластных вод, отобранных в портах, расположенных на р. Янцзы, численность бактерий группы кишечной палочки не изменилась. Все так же сохраняет уровень 102 103 кл/мл. Касаясь же балластных вод, отобранных в портах Лункоу и Лайжоу, то численность БГКП по сравнению с 2008 г. упала и составляет единичные колонии. Так же в пробах БВ, забор которых был произведен в 2008г., в портах, расположенных на р. Янцзы и в порту Лайжоу, были обнаружены единичные штаммы, таких санитарно-показательных микроорганизмов, как E. Coli. Что же касается проб за 2009г., то таковых обнаружено не было. В отличие от 2008г., в 2009 в пробах БВ были обнаружены энтерококки, как индикаторы свежего фекального загрязнения. Проанализированы они были в пробах БВ, отобранных в порту Лайжоу (06.05.2009). При анализе проб (2009г.) забортной воды р-на Первая речка (нефтебаза), были обнаружены санитарно-показательные микроорганизмы БГКП, E. coli, Enterococcus faecalis. Бактерии группы кишечной палочки являются индикаторами санитарного состояния вод и могут указывать на загрязнение коммунально-бытовыми стоками. А энтерококки, выступают как индикаторы свежего фекального загрязнения (см. приложение 6). 37 1. ВЫВОДЫ Существуют различные методы оценки численности и состава микробных сообществ. Одним из основных методов остается чашечный метод Коха. Прямой подсчет микроорганизмов проводится с использованием эпифлуоресцентного окрашивания. 2. В коллекцию было выделено 43 штамма микроорганизмов. Из которых все штаммы обладали способностью синтезировать оксидазу. Большая часть коллекции представлена псевдомонадами. Коллекционные микроорганизмы обладают слабой гидролитической активностью. Практически все штаммы способны использовать в качестве источника питания – Pb. Большая часть коллекционных штаммов чувствительна практически ко всем антибиотикам. 3. Бактериологический анализ балластных вод танкера «Минотавр» показал, что в пробах присутствуют БГКП, а также единичные колонии Escherichia coli. В пробах балластных вод, забор которых производился в портах Японии, численность КОЕ гетеротрофных бактерий была на 1-2 порядка ниже, чем в аналогичных пробах танкера «Минотавр», работающего на китайско-российской линии, изменялась в диапазоне 102 – 103 кл/ мл, бактерии группы кишечной палочки и фекальные стрептококки не обнаружены ни в одной пробе. Забортная вода р – на Первая речка (нефтебаза), содержит санитарнопоказательные микроорганизмы – БГКП, E. coli, Enterococcus faecalis. 4. За период 2007 – 2008 гг. численность КОЕ гетеротрофных бактерий в пробах БВ, забор которых был произведен в портах Китая и Японии, достаточно стабильна. В 2008 г. были обнаружены санитарнопоказательные микроорганизмы. В 2009 г. численность БГКП по сравнению с 2008 г. упала и составляет единичные колонии. Так же в пробах БВ, забор которых был произведен в 2008г., были обнаружены единичные штаммы, таких санитарно38 показательных микроорганизмов, как E. Coli. Что же касается проб за 2009г., то таковых обнаружено не было. В отличие от 2008г., в 2009 в пробах БВ были обнаружены энтерококки, как индикаторы свежего фекального загрязнения. 39 1. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ Гидрохимические показатели состояния окружающей среды / Под ред. Т. В. Гусевой. – М.: Форум: ИНФРА-М. 2007. – 192 с. 2. Заварзин Г. А., Колотилова Н. Н. Введение в природоведческую микробиологию: Учебное пособие. – М.: Книжный дом «Университет», 2001. – С. 71 – 73. 3. Калитина Е. Г., Безвербная И. П., Бузолева Л. С. Динамика численности гидролитически-активной микрофлоры в условиях комплексного загрязнения бухты Золотой Рог // Электронный журнал «Исследовано в России». 2006. № 6. C. 56-66. 4. Лабинская А.С. Микробиология с техникой микробиологических исследований. Изд. 4-е, перераб. и доп. М., «Медицина», 1978. – 394 с. 5. Международная Конвенция о контроле судовых балластных вод и осадков и управлении ими 2004 года. Правило D-2. 6. Методы общей бактериологии. Т.1 / Под ред. Ф. Герхардта и др. – М.: Мир, 1983. – 536 с. 7. Методы общей бактериологии. Т. 3. Пер. с англ. / Под ред. Ф. Гехардта и др. – М.: Мир, 1984. – 264 с. 8. Нетрусов А. Н. Практикум по микробиологии: Учебное пособие для студ. высш. учеб. заведений / А. Н. Нетрусов, М. А. Егорова, Л. М. Захарчук и др.; Под редакцией А. Н. Нетрусова. – М.: Издательский центр «Академия», 2005. – С. 101 – 155. 9. Нетрусов А. Н. Экология микроорганизмов: Учеб. для студ. вузов / А. Н. Нетрусов, Е. А. Бонч – Осмоловская, В. М. Горленко и др.; Под ред. А. И. Нетрусова. – М.: Издательский центр «Академия», 2004. – С. 65 – 71. 10. Общая и санитарная микробиология с техникой микробиологических исследований / Под ред. Лабинской А. С. – Татарстан.: Медицина. 2004. – 575 с. 11. Пяткин К.Д., Кривошеин Ю.С. Микробиология. М.: Медицина, 1980. – 512 с. 40 12. Burkholder, J.M., Hallegraeff, G.M., Melia, G., Cohen, A. et. al. Phytoplankton and bacterial assemblages in ballast water of U.S. military ships as a function of port of origin, voyage time, and ocean exchange practices // 2007. Harmful Algae. Vol. 6. Is. 4. P. 486-518 13. Dobbs F.C., Diallo A.A., Doblin M.A., Drake L.A. et. al. Pathogens in Ships’ Ballast Water and Sediment Residuals // Proceedings of the Third International Conference on Marine Bioinvasions. La Jolla. California. March 1619. 2003. P. 29. 14. Drake L.A., Baier R.E., Dobbs F.C., Doblin M.A. et al. Potential Invasion of Microorganisms and Pathogens Via ‘Interior Hull Fouling’: Biofilms Inside Ballast-Water Tanks // Proceedings of the Third International Conference on Marine Bioinvasions. La Jolla. California. March 16-19. 2003. P. 35. 15. Drake, L.A., Doblin, M.A., Dobbs, F.C. Potential microbial bioinvasions via ships' ballast water, sediment, and biofilm // Marine Pollution Bulletin. Vol. 55. Is. 7-9. 2007. P. 333-341. 16. Hess-Nilsen O.K., Jelmert A., Enger I. Effects on the Microbial Community from Ballast Water Discharge at the Norwegian West Coast, Austevoll Aquaculture Research Station // Proceedings of the Second International Conference on Marine Bioinvasions. New Orleans. La. April 9-11. 2001. P. 69-70. 17. Ivanov, V. Bacteriological monitoring of ships' ballast water in Singapore and its potential importance for the management of coastal ecosystems / /WIT Transactions on Biomedicine and Health. 2006. Vol. 10. P. 59-63 18. Knight I. T., Wells C. S., Wiggins B., Russell H. et al. Detection and enumeration of fecal indicators and pathogens in the ballast water of transoceanic cargo vessels entering the Great Lakes // Proceedings of the General Meeting of the ASM. Chicago. IL. 1999. P. 546. 19. Manual of environmental microbiology / ed. Christon J. Hurst. Washington: ASM Press, 2002. P. 35-167. 41 20. McCarthy, S.A., Khambaty, F.M. International dissemination of epidemic Vibrio cholerae by cargo ship ballast and other nonpotable waters // Applied and Environmental Microbiology. Vol. 60, Is. 7, 1994. P. 2597-2601. 21. Thomson, F.K., Heinemann S.A., Dobbs F.C. Patterns of Antibiotic Resistance in Cholera Bacteria Isolated From Ships’ Ballast Water // Proceedings of the Third International Conference on Marine Bioinvasions. La Jolla. California. March 16-19. 2003. P. 118. 22. Whitby G., Elliot I., Lewis P., Shafer M., Christopher J. A Microbiological chemical and physical survey of ballast water on ships on the Great Lakes 1998 // Abstracts from the 8-th International Zebra Mussel and Other Nuisance Species Conference. Sacramento. California. March 16-19. 1998. P. 14. 23. Youchimizu M., Kimura T. Study of intestinal microflora of Salmonids // Fish. Pathol. 1976. V. 10. № 2. P. 243. 24. http://www.dntpasteur.ru/7-091201.html 25. http://www.diakon-diagnostics.ru/ 26. http://www.worldportsource.com/ports/maps/JPN_Port_of_Iwakuni_3 246.php 27. http://www.worldportsource.com/ports/maps/JPN_Port_of_Kawasaki _1381.php 28. http://www.worldportsource.com/ports/maps/JPN_Port_of_Mizushim a_3335.php 29. http://www.worldportsource.com/ports/maps/CHN_Port_of_Longkou _2463.php 30. http://www.worldportsource.com/ports/maps/CHN_Port_of_Laizhou_ 2459.php 31. http://www.worldportsource.com/ports/maps/CHN_Port_of_Nantong_ 406.php 32. http://www.google.ru/ 42
