009008 - 1 - Настоящее изобретение относится к способу

009008
Настоящее изобретение относится к способу культивирования первичных клеток. Первичные клетки культивируют в бессывороточной среде, содержащей фактор, выбранный из группы, состоящей из
факторов роста и факторов прикрепления. Способ культивирования первичных клеток может быть одной
из стадий в способе амплификации вирусов, таких как вирусы оспы. По данному последнему способу
первичные клетки культивируют в бессывороточной среде, содержащей фактор, выбранный из группы,
состоящей из факторов роста и факторов прикрепления. Затем клетки инфицируют вирусом, и инфицированные клетки культивируют в бессывороточной среде до продукции потомства вируса.
Уровень техники изобретения
Большинство вирусных вакцин, таких как аттенуированные или рекомбинантные вирусы, промышленно получают в системах клеточных культур. Использованные для продукции вируса/вакцины клетки
могут быть клеточными линиями, т.е. клетками, которые непрерывно растут in vitro либо как суспензионная культура единичных клеток в биореакторах, либо как монослой на поддерживающей клетки поверхности колб для культуры клеток тканей или вращающихся колбах. Некоторыми примерами клеточных линий, используемых для получения вирусов, являются эмбриональная клеточная линия легкого
человека MRC-5, используемая для производства вирусов полиомиелита, и эмбриональная клеточная
линия легких человека WI-38, используемая для производства вируса кори, вируса свинки и вируса краснухи (MMR II), Merk Sharp & Dohme.
Для промышленного производства вакцин используются не только клеточные линии, но также и
первичные клетки животных. Примером первичных клеток, которые используются для получения вируса, являются эмбриональные фибробласты цыпленка (клетки CEF). Данные клетки используются для
продуцирования вируса кори и японского энцефалита (Pasteur Merieux), вируса свинки (производимого
Provaccine), вируса бешенства (производимого Chiron Berhing GmbH & Co.), вируса желтой лихорадки
(производимого Aprilvax), вируса гриппа (производимого Wyeth Labs и SmithKline & Beecham) и модифицированного вируса вакцины Анкара (MVA).
Клетки CEF используются часто, так как большинство вирусных вакцин получают аттенуированием вирулентности, вызывающей заболевание вируса последовательными пассажами в клетках CEF. Аттенуированный вирус более не вызывает заболевание, но он все еще способен стимулировать эффективный защитный иммунитет против вирулентной формы вируса. Примером данного типа вируса является
MVA. Репликация данного вируса сильно ограничена у людей и большинства животных. MVA разрабатывают в качестве вакцины-вектора, поскольку его можно использовать для экспрессии антигенов, полученных из множества агентов, вызывающих заболевания у людей. Аттенуированные вирусы, такие как
MVA, предпочтительно не размножают в клетках человека, так как существует опасение, что вирусы
могли бы стать снова способными к репликации в клетках человеческого происхождения. Впрочем, вирусы, которые восстановили способность реплицироваться в клетках человека, могли бы быть опасными
для здоровья, если их вводить людям, в особенности, если люди имеют предварительно активированный
иммунитет. По этой причине некоторые аттенуированные вирусы, такие как MVA, если они предназначены для использования у людей, производятся строго в клетках CEF.
Кроме того, клетки CEF используются для тех вирусов, которые растут только в указанных клетках.
Примерами таких вирусов, в частности, являются вирусы птиц, такие как вирусы оспы птиц, в особенности вирус оспы канареек, ALVAC, вирус оспы домашней птицы и NYVAC.
Клеточные линии и первичные клетки, растущие в условиях культивирования in vitro, нуждаются в
специальной ростовой и поддерживающей среде, которая может обеспечить (I) размножение клетки в
логарифмической фазе и (II) жизнедеятельность клетки, когда клетки больше не делятся, т.е. когда клетки находятся в стационарной фазе. Обычно используемая для клеточной культуры среда содержит обогащенный солевой раствор, включающий витамины, аминокислоты, необходимые микроэлементы и сахара. Гормоны роста, ферменты и биологически активные белки, необходимые для поддержания роста и
жизнедеятельности клетки, обычно добавляют к среде в качестве добавки в виде полученного из крови
животных продукта сыворотки. Примерами полученных из крови животных продуктов сыворотки являются эмбриональная телячья сыворотка, сыворотка курицы, сыворотка лошади и сыворотка свиньи. Указанные сыворотки получают из фракционированной крови, из которой удалены красные кровяные и белые кровяные клетки. Первичные клетки, такие как клетки CEF, даже более зависимы от источников
происхождения сыворотки животных, чем клеточные линии. Так, первичные клетки обычно культивируют в среде для культуры клеток, содержащей от 5 до 10% сыворотки, в большинстве случаев эмбриональной телячьей сыворотки (FCS).
Сыворотки животных содержат не только факторы, необходимые для роста клеток, но также и факторы, которые необходимы для клеток, которые растут в природе как адгезивные клетки, для прикрепления к поддерживающей клетки поверхности сосуда для культивирования. Таким образом, для адгезивных клеток критично, чтобы к среде добавлялось достаточное количество сыворотки, чтобы дать клеткам
возможность вырасти и образовать монослой.
К сожалению, бычья/эмбриональная телячья сыворотка, а также сыворотки других животных могут
содержать случайные патогенные агенты, такие как вирусы. Существует потенциальная опасность, что
данные патогенные агенты передадутся животному/человеку, которого будут лечить или вакцинировать
-1-
009008
вакциной или любым другим фармацевтическим продуктом, продуцированным в клеточной культуре.
Это имеет особую значимость, если продукты клеточной культуры вводят людям с предварительно активированным иммунитетом. Одной из множества потенциальных основных проблем, связанных с широко
используемой добавкой бычьей сыворотки, является возможность передачи агента, вызывающего бычью
губчатую энцефалопатию (BSE), животным/людям, которые контактируют с продуктами, продуцированными в клеточной культуре.
Ввиду возможной опасности, связанной с использованием сывороток животных в клеточной культуре, становится ясно, что производственные процессы, свободные от использования продуктов животных, весьма желательны.
С этой целью для непрерывно растущих клеточных линий и для получения вирусов в непрерывно
растущих клеточных линиях, соответственно, разработаны специальные среды, к которым не нужно добавлять сыворотки животных. Примером такой бессывороточной среды, которую можно использовать
для культивирования клеточных линий, является VP-SFM, производимая Gibco BRL/Life Technologies.
VP-SFM, согласно информации производителей, специально создана для роста VERO, COS-7, MDBK,
Нер2, BHK-21 и других важных клеточных линий (Price, P. and Evege, E. Focus, 1997, 19:67-69) и для получения вирусов в указанных клеточных линиях. Не имеется никакой информации относительно культивирования первичных клеток в указанной среде.
В US 5503582 описано культивирование клеток CEF в среде, содержащей 4% сыворотку теленка,
которое сопровождается инфицированием клеток вирусом оспы домашней птицы в бессывороточной
среде. Spataro, А.С. et al., J. Cell. Sci. 1976, 21, 407-413 обнаружил, что можно поддерживать жизнедеятельность клеток CEF в бессывороточной среде в течение 24 ч до образования монослоя. Таким образом,
согласно двум публикациям среды, которые используются для культивирования клеток после посева,
содержат сыворотку. Бессывороточная среда использовалась только для поддержания жизнедеятельности клеток, которые уже прикреплены к поверхности и которые достигли стационарной фазы. Если посев
выполнен на обычную среду, такую как среда 199 или RPMI-1640, не содержащую сыворотку, монослой
не образуется, и клетки формируют в средах нежизнеспособные агрегаты.
WO 98/15614 относится к конкретной бессывороточной среде для культивирования клеток животных in vitro. Клетки, которые можно культивировать в среде, как описано в WO 98/15614, представляют
собой клетки животного происхождения, включая клетки, полученные от млекопитающих, птиц, насекомых или рыб. Клетки млекопитающих могут быть первичными клетками человеческого происхождения.
Не сделано никаких ссылок на первичные клетки от птиц.
В US 5405772 приведено описание бессывороточной среды для пролиферации и развития клеток.
Клетки предпочтительно представляют собой гематопоэтические и стромальные клетки костного мозга.
Первичные клетки птиц не упоминаются.
В WO 98/04680 приведено описание бессывороточной среды для роста зависимых от фиксации клеток млекопитающих, таких как клеточные линии BHK, Vero или MRC-5. WO 98/04680 не относится ни к
первичным клеткам, ни к клеткам птиц.
Цель изобретения
Цель настоящего изобретения относится к способу, позволяющему культивировать первичные
клетки, в особенности первичные клетки птиц в бессывороточной среде, где способ обеспечивает (I) выращивание клеток во время логарифмической фазы и (II) поддержание жизнедеятельности клеток в стационарной фазе. Кроме того, если клетки являются адгезивными клетками, среда предпочтительно может обеспечить (III) прикрепление адгезивных клеток к поверхности сосуда для культивирования клеток.
Дальнейшая цель настоящего изобретения относится к способу получения вируса с использованием первичных клеток в бессывороточных условиях.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к способу культивирования первичных клеток, отличающемуся
тем, что клетки культивируются в бессывороточной среде, содержащей фактор, выбранный из группы,
состоящей из факторов роста и факторов прикрепления.
По настоящему изобретению первичные клетки, которые растут в природе как адгезивные, прикрепляются к поверхности сосуда для культивирования клеток после посева и растут в логарифмической
фазе до образования монослоя. Согласно настоящему изобретению оставшиеся клетки можно содержать
в среде, использованной во время прикрепления и логарифмического роста клеток.
Способ настоящего изобретения не ограничен для клеток, которые образуют монослои. По альтернативному осуществлению способ по настоящему изобретению можно использовать для всех других
типов первичных клеток, таких как клетки, растущие в природе в суспензионной культуре (например,
лимфоциты или другие типы клеток крови), или клетки, которые в природе росли бы как адгезивные
клетки, но которые были адаптированы к росту в суспензионной культуре.
Как показано ниже, клетки можно также использовать для бессывороточной амплификации вирусов, которые могли бы быть применимы в качестве вакцин.
-2-
009008
Было неожиданно, что первичные клетки, растущие в природе в качестве адгезивных клеток, (I) могут эффективно прикрепляться к поверхности сосудов для культивирования клеток без образования неприемлемого количества агрегатов и (II) могут расти в логарифмической фазе в отсутствие сыворотки,
поскольку обычно полагали, что первичные клетки зависят от множества содержащихся в сыворотке
различных факторов и компонентов. Кроме того, полагали, что адгезивные клетки образуют нежизнеспособные агрегаты, которые не прикрепляются к поверхности сосудов для культивирования клеток при
культивировании в бессывороточной среде. Таким образом, оказалось неожиданным, что достаточно
добавить к бессывороточной среде фактор, выбранный из группы, состоящей из факторов роста и факторов прикрепления, для того, чтобы достичь прикрепления и роста адгезивных первичных клеток. Кроме
того, оказалось неожиданным, что первичные клетки, культивированные в суспензионной культуре, могут расти в среде, использованной в способе по настоящему изобретению. К тому же было удивительно,
что такие первичные клетки птиц, как эмбриональные фибробласты цыпленка (CEF), можно культивировать до прикрепления к поверхности сосуда для культивирования клеток без образования неприемлемого
количества агрегатов в бессывороточной среде, содержащей фактор, выбранный из группы, состоящей из
факторов роста и факторов прикрепления, так как было известно, что клетки растут крайне плохо в бессывороточной среде, не содержащей факторов роста или факторов прикрепления, т.е. было неожиданным, что слабые ростовые свойства первичных клеток птиц можно было значительно улучшить, добавляя к бессывороточной среде фактор, выбранный из факторов роста и факторов прикрепления.
Используемый в настоящем описании термин «первичные клетки» хорошо известен специалистам в
данной области. Не ограничивая следующее определение, термин «первичные клетки» означает клетки,
которые были только что выделены из ткани животного или человека, органа или организма, причем
клетки не способны к непрерывной и неограниченной репликации и делению. Обычно первичные клетки
делятся в клеточной культуре менее чем 100 раз, часто менее чем 50 раз, часто менее чем 25 раз. Таким
образом, первичные клетки не подвержены явлению иммортализации. Примерами первичных клеток
служат лимфоциты пуповинной крови и фибробласты человека или животных. Предпочтительными
примерами фибробластов животных являются фибробласты птиц, наиболее предпочтительны фибробласты эмбриона цыпленка (клетки CEF). Предпочтительным примером для первичных фибробластов человека являются фибробласты крайней плоти человека.
Способы выделения первичных клеток хорошо известны специалистам в данной области. В основном первичные клетки получают непосредственно из тканей, органов или эмбрионов. Для получения
единичных клеток ткани, органы или эмбрионы подвергаются действию протеазы. Затем клетки культивируют по способу настоящего изобретения в условиях культивирования in vitro.
Более определенно, клетки CEF получают из расщепленных протеазой эмбрионов цыплят. По настоящему изобретению клетки CEF хорошо растут как адгезивные клетки, прикрепленные к твердой
поддерживающей клетки поверхности. Клетки начинают размножаться и образуют монослой. Если клетки CEF (после расщепления эмбриона) культивировать in vitro в стандартной культуральной среде без
сыворотки животного, они случайным образом прикрепятся к твердой поддерживающей клетки поверхности, а не реплицируются до образования монослоя клеток и со временем медленно отсоединятся от
твердой поддерживающей клетки поверхности. Напротив, если клетки CEF культивируют по способу
настоящего изобретения, клетки, прикрепленные к твердой поверхности, растут в логарифмической фазе, пока не образуется монослой, и можно поддерживать их жизнедеятельность в стационарной фазе в
течение нескольких дней.
Термин «культивирование клеток» в бессывороточной среде в контексте адгезивных первичных
клеток означает посев клеток в сосуд для культивирования с бессывороточной средой для роста клеток в
бессывороточной среде в логарифмической фазе до тех пор, пока не образуется монослой, и/или для
поддержания жизнедеятельности клеток в бессывороточной среде, как только образуется монослой.
Наиболее предпочтительно термин «культивирование клеток» в бессывороточной среде означает способ,
в котором все вышеуказанные стадии выполняют в бессывороточной среде, так что никаких продуктов
сыворотки животных не присутствует во время всего процесса культивирования клеток. Таким образом,
в большинстве общепринятых значений термин «культивирование клеток в бессывороточной среде» означает тот факт, что все среды, приводящие к образованию монослоя, представляют собой бессывороточные среды. Используемые на всех вышеуказанных стадиях среды могут содержать фактор, выбранный из факторов роста и факторов прикрепления. Однако может быть значительным добавление такого
фактора только к среде, используемой для прикрепления клеток и/или роста клеток в логарифмических
условиях.
Термин «культивирование клеток» в бессывороточной среде в контексте роста клеток в суспензионной культуре означает посев клеток в сосуд для культивирования с бессывороточной средой, рост клеток в бессывороточной среде в логарифмической фазе и/или поддержание жизнедеятельности клеток в
бессывороточной среде, как только получат плотность насыщения, при которой не происходит дальнейшее размножение. Более предпочтительно термин «культивирование клеток» в бессывороточной среде
означает способ, в котором все вышеуказанные стадии выполняют в бессывороточной среде, так что никаких продуктов сыворотки животных не присутствует во время всего культивирования клеток. Исполь-3-
009008
зуемые на всех вышеуказанных стадиях среды могут предпочтительно содержать фактор, выбранный из
группы факторов роста. Однако может быть значительным добавление такого фактора только к среде,
используемой для посева клеток и/или роста клеток в логарифмических условиях. Как более подробно
объяснено ниже, возможно также культивирование клеток, которые росли бы нормально в качестве прикрепленных клеток, также как в качестве суспензионной клеточной культуры, если выбраны подходящие
условия инкубации (например, используя «волновую» инкубацию). Способ по настоящему изобретению
также используют для данного типа инкубации.
Термин «бессывороточная» среда означает любую среду для клеточной культуры, которая не содержит сывороток животного или человеческого происхождения. Подходящие среды для клеточных
культур хорошо известны специалистам в данной области. Данные среды содержат соли, витамины, буферы, источники энергии, аминокислоты и другие вещества. Примером среды, подходящей для бессывороточного культивирования клеток CEF, является среда 199 (Morgan, Morton and Parker; Proc. Soc. Exp.
Biol. Med. 1950, 73, 1; доступная в числе других от Life Technologies).
Используемые по способу настоящего изобретения среды, в особенности среды, используемые для
адгезивных клеток, таких как клетки CEF, содержат фактор, выбранный из группы, состоящей из факторов роста и факторов прикрепления. Примером фактора прикрепления является фибронектин.
Для клеток, которые росли бы в природе как адгезивные клетки, которые, однако, культивируют
тем не менее в суспензионной культуре (которая предназначена, например, для клеток CEF), особенно
предпочтительно использовать фактор, выбранный из группы факторов роста. Примерами факторов роста, применимых для данного типа культивирования, являются рекомбинантный эпидермальный фактор
роста (EGF) быка, мыши, курицы или человека. Наиболее предпочтительным является рекомбинантный
EGF человека (rh-EGF) (Chemicon Int., номер по каталогу GF001).
Для клеток, растущих в природе в суспензионной культуре, среда может предпочтительно включать
фактор, выбранный из группы факторов роста, включая EGF. Наиболее предпочтительно факторы роста
для данного типа клеток представляют собой факторы, специфичные для неадгезивных клеток. Примерами таких факторов роста являются интерлейкины, GM-CSF, G-CSF и др. Специалисты в данной области могут легко определить обычным экспериментированием, какой тип фактора подходит для какого
типа клеток.
Если добавляемым к бессывороточной среде фактором является EGF, в особенности rh-EGF,
его предпочтительно добавляют к среде в концентрации от 1 до 50 нг/мл, более предпочтительно
от 5 до 20 нг/мл. Однако специалисты в данной области осознают тот факт, что для оптимального результата различные типы клеток могут нуждаться в слегка различной концентрации EGF.
Если добавляемым к бессывороточной среде фактором прикрепления является фибронектин (например, Chemicon Int.; фибронектин плазмы человека; номер по каталогу FC010), его предпочтительно
добавляют к среде в концентрации от 1 до 50, более предпочтительно от 1 до 10 мкг/см2 поверхности
сосуда для культивирования клеток. Однако специалисты в данной области осознают тот факт, что для
оптимального результата различные типы клеток могут нуждаться в слегка различной концентрации
фибронектина.
По настоящему изобретению достаточно добавлять к среде только один фактор, выбранный из факторов роста и факторов прикрепления, в особенности, если клетки являются адгезивными. Однако возможно добавление к среде двух и более факторов, выбранных из факторов роста и факторов прикрепления. Среда может предпочтительно содержать EGF и фибронектин, предпочтительно в диапазонах определенных выше концентраций, в особенности, если первичными клетками являются такие адгезивные
клетки, как клетки CEF.
Среда может дополнительно содержать одну или несколько добавок, выбранных из микробных
экстрактов, растительных экстрактов и экстрактов из животных, не являющихся млекопитающими.
Микробный экстракт предпочтительно представляет собой дрожжевой экстракт или ультрафильтрат
Yeastolate. Растительный экстракт предпочтительно представляет собой рисовый или соевый экстракт.
Экстракт из животных, не являющихся млекопитающими, предпочтительно представляет собой рыбный
экстракт.
По предпочтительному осуществлению настоящего изобретения можно добавлять аспарагин к
коммерчески доступной бессывороточной среде, к которой был добавлен фактор, выбранный из факторов роста и факторов прикрепления. Более предпочтительно аспарагин добавляют к среде, которую используют во время инфицирования вирусом (см. ниже). Коммерческая бессывороточная среда обычно
содержит аспарагин в диапазоне концентраций от 0,3 до 1,0 мМ. Предпочтительные количества аспарагина для добавления к среде находятся в диапазоне от 0,5 до 1,5 мМ. Наиболее предпочтительным является добавление аспарагина в концентрации 1 мМ. Общая концентрация аспарагина в среде предпочтительно составляет менее чем 2 мМ и более предпочтительно находится в диапазоне от 0,8 до 1,8 мМ.
Наиболее предпочтительной концентрацией аспарагина в среде является 1,3 мМ.
Более того, к среде предпочтительно можно добавлять глутамин. Более предпочтительно глутамин
добавляют к среде, которую использовали во время инфицирования вирусом (см. ниже). Предпочтительные количества глутамина, добавляемые к среде, находятся в диапазоне от 1 до 5 мМ, более предпочти-4-
009008
тельно - в диапазоне от 2 до 4 мМ. Указанные диапазоны также соответствуют предпочтительным общим
концентрациям в среде, поскольку большинство коммерчески доступных сред не содержит глутамин.
По дальнейшему осуществлению изобретение относится к способу амплификации вируса, включающему в себя следующие стадии:
на первой стадии первичные клетки культивируют по способу, описанному выше, т.е. первичные
клетки культивируют в бессывороточной среде, содержащей фактор, выбранный из группы, состоящей
из факторов роста и факторов прикрепления, в зависимости от типа клеток. Все условия, определения,
предпочтительные осуществления и также порядок предпочтительных и наиболее предпочтительных
осуществлений, приведенные выше для описания способа культивирования первичных клеток, также
применяют для определения первой стадии способа амплификации вируса по данному осуществлению
настоящего изобретения;
на второй стадии первичные клетки инфицируют вирусом;
на третьей стадии инфицированные клетки инкубируют в бессывороточной среде до продукции потомственного вируса.
Термин «амплификация вируса» используется для объяснения того, что способ по настоящему изобретению предпочтительно используют для увеличения количества вируса благодаря продуктивной вирусной репликации вируса в инфицированных клетках. Другими словами, соотношение полученного
вируса и вводимого вируса должно предпочтительно превышать 1. Таким образом, по настоящему изобретению для определенного вируса выбираются те первичные клетки, в которых вирус способен продуктивно реплицироваться.
Термин «репродуктивная репликация» означает тот факт, что определенный вирус реплицируется в
определенной первичной клетке до такой степени, что продуцируется инфекционный вирус потомства,
где соотношение полученного и вводимого вируса превышает 1.
Специалисты в данной области знают, какие вирусы могут продуктивно реплицироваться в каком
типе первичных клеток. Если вирусом, который будут амплифицировать, является цитомегаловирус человека, то в качестве примера первичных клеток могут служить фибробласты крайней плоти человека;
если вирусом, который будут амплифицировать, является вирус кори, вирус свинки, вирус бешенства,
вирус японского энцефалита, вирус желтой лихорадки, вирус гриппа или вирус оспы, такой как вирус
коровьей оспы, в особенности модифицированный вирус коровьей оспы Анкара (MVA), то первичными
клетками могут быть клетки CEF.
Специалистам в данной области известны способы инфицирования первичных клеток по второй
стадии настоящего осуществления. В качестве примера вирус можно просто добавить к среде. Альтернативно среду можно удалить, и вирус можно добавить к свежей среде, которую в свою очередь добавляют
к клеткам. Для того чтобы получить эффективное инфицирование, количество суспензии вирус/среда
должно быть настолько низким, насколько возможно для получения высокой концентрации вируса. После интеграции вируса можно добавить дополнительную среду.
На третьей стадии клетки инокулируют в бессывороточной среде до продукции потомственного вируса.
Бессывороточная среда, которую используют на второй и третьей стадии способа амплификации
вируса, может быть той же самой средой, которую уже использовали ранее, т.е. бессывороточной средой,
содержащей фактор, выбранный из факторов роста и факторов прикрепления в зависимости от типа клеток. Тем не менее, для экономии расходов также возможно использование на одной или как на второй,
так и на третьей стадиях бессывороточной среды, которая не содержит фактор, выбранный из фактора
роста и факторов прикрепления.
Во время всех стадий можно дополнить среду аспарагином и/или глутамином, как описано выше,
где общая концентрация аспарагина в среде является предпочтительно такой, как описано выше.
Вирус потомства можно концентрировать и очищать способами, известными специалистам в данной области.
По предпочтительному осуществлению способ амплификации вирусов применяют для вирусов оспы (поксвирусов). Таким образом, по данному предпочтительному осуществлению изобретение относится к способу амплификации вируса оспы, включающему в себя следующие стадии:
(I) культивирование первичных клеток по способу, как описано выше, т.е. способом, в котором первичные клетки культивируют в бессывороточной среде, содержащей фактор, выбранный из группы, состоящей из факторов роста и факторов прикрепления, в зависимости от типа клеток;
(II) инфицирование первичных клеток вирусом оспы;
(III) культивирование инфицированных клеток в бессывороточной среде до продукции потомственного вируса.
Было неожиданно найдено, что вирус оспы можно амплифицировать в клетках, культивируемых в
бессывороточных условиях, поскольку клетки очень плохо растут в известной бессывороточной среде.
Таким образом, ожидали, что дополнительный стресс, связанный с инфицированием вирусом оспы убьет
уже стрессированные клетки до того, как произойдет значительная амплификация вируса оспы.
Вирус оспы (поксвирус) предпочтительно является ортопоксвирусом. Примерами ортопоксвирусов
служат вирусы птичьей оспы и вирусы коровьей оспы.
-5-
009008
Термин «вирус оспы птиц» означает любой вирус оспы птиц, такой как вирус оспы домашней птицы, вирус оспы канарейки, аномальный вирус оспы, вирус оспы майны, вирус оспы голубя, вирус оспы
попугая, вирус оспы перепелки, вирус оспы павлина, вирус оспы пингвина, вирус оспы воробья, вирус
оспы скворца и вирус оспы индюка. Предпочтительными вирусами оспы птиц являются вирус оспы канарейки и вирус оспы домашней птицы.
Примером вируса вирус оспы канарейки является штамм Rentschler. Очищенный методом бляшек
штамм вируса оспы канарейки, названный ALVAC (US 5766598) поместили согласно условиям Будапештского договора в Американскую коллекцию типовых культур (АТСС), номер доступа VR-2547.
Другими штаммом вируса оспы канарейки является коммерческий штамм вакцины вируса оспы канарейки, обозначенный LF2 СЕР 524241075, доступный в Institute Merieux, Inc.
Примерами вируса оспы домашней птицы являются штаммы FP-1, FP-5 и TROVAC (US 5766598).
FP-1 представляет собой штамм Duvette, модифицированный для использования в качестве вакцины для
однодневных цыплят. Данный штамм является коммерческим штаммом вакцины вируса оспы домашней
птицы, обозначенным как О DCEP 25/CEP67/2309 October 1980, и является доступным в Institute Merieux,
Inc. FP-5 является коммерческим штаммом вакцины вируса оспы домашней птицы, полученным из эмбриона цыпленка, доступным в American Scientific Laboratories (Division of Schering Corp.) Мэдисон,
Висконсин, Ветеринарная лицензия Соединенных Штатов № 165, порядковый № 30321.
Примерами штаммов вируса коровьей оспы являются штаммы Temple of Heaven, Copenhagen, Paris,
Budapest, Dairen, Gam, MRIVP, Per, Tashkent, TBK, Tom, Bern, Patwadangar, BIEM, B-15, Lister, EM-63,
New York City Board of Health, Elstree, Ikeda и WR. Изобретение предпочтительно выполняется с модифицированным вирусом коровьей оспы Анкара (MVA) (Sutter, G. et al. 1994, Vaccine 12:1032-40). Типичным штаммом MVA является MVA 575, который поместили в Европейскую коллекцию культур клеток
животных под номером хранения ЕСАСС V00120707. Наиболее предпочтительным является MVA-BN
или его производное, которое было описано в заявке РСТ/ЕР01/13628, поданной в Европейское патентное ведомство 22 ноября 2001 г., названной «Вариант модифицированного вируса коровьей оспы Анкара». MVA-BN был помещен в Европейскую коллекцию клеточных культур животных под номером хранения ЕСАСС V00083008. Характеристика MVA-BN, описание биологических исследований, позволяющих установить, является ли MVA MVA-BN или его производным, и способов, позволяющих получить MVA-BN или его производные, описаны в упомянутой выше заявке РСТ, которая включена сюда в
качестве ссылки.
Вирус, который необходимо амплифицировать по способу настоящего изобретения, может быть
вирусом дикого типа, аттенуированным вирусом или рекомбинантным вирусом.
Термин «рекомбинантный вирус» означает любой вирус, несущий введенный в вирусный геном гетерологичный ген, который не является природной частью вирусного генома. Гетерологичный ген может
быть терапевтическим геном, геном, кодирующим пептид, содержащий по крайней мере один эпитоп для
индукции иммунного ответа, кассетой, экспрессирующей антисмысловую последовательность, или геном рибозима. Специалистам в данной области известны способы конструирования рекомбинантных
вирусов. Наиболее предпочтительным вектором на основе вируса оспы является MVA, в особенности
MVA 575 и MVA-BN (см. выше).
«Аттенуированный вирус» представляет собой вирус, происходящий от патогенного вируса, но который при инфицировании организма хозяина приводит к низкой смертности и/или заболеваемости по
сравнению с неослабленным исходным вирусом. Примеры аттенуированных вирусов оспы известны
специалистам в данной области. Примером для аттенуированного вируса коровьей оспы является штамм
MVA, в особенности штамм, который был помещен в ЕСАСС под номером хранения V00083008 (см.
выше).
Как указано выше, для вирусов оспы первичными клетками предпочтительно могут быть первичные клетки птицы, такие как клетки CEF или первичные фибробласты эмбриона утенка. Также специалисты в данной области представляют, какие первичные клетки подходят для амплификации какого вируса оспы. Клетки CEF особенно предпочтительны для амплификации MVA. Для амплификации MVA в
клетках CEF предпочтительное осуществление состоит в выборе одного или двух факторов, выбранных
из EGF и фибронектина.
Если способ по настоящему изобретению используется для амплификации MVA в клетках CEF, то
предпочтительно, чтобы начальное значение рН среды находилось в диапазоне приблизительно от 7,0 до
приблизительно 8,5. Особенно предпочтительным является начальное значение рН 7,0.
Далее изобретение относится к вирусам, в особенности к вирусам оспы, полученным описанным
выше способом. По предпочтительному осуществлению вирусом оспы является вирус коровьей оспы,
наиболее предпочтительно штамм MVA, такой как MVA-BN.
Далее изобретение относится к композиции, содержащей вирус, в особенности вирус оспы, полученный способом по настоящему изобретению. Как отмечалось выше, вирус оспы предпочтительно
представляет собой вирус коровьей оспы, наиболее предпочтительно штамм MVA, такой как MVA-BN.
Благодаря способу амплификации вируса, в композиции отсутствуют какие-либо продукты и/или инфекционные агенты, содержащиеся в сыворотках животных. Напротив, композиции, содержащие вирусы,
-6-
009008
полученные по общепринятым способам, содержат остаточные соединения, происходящие из сыворотки
животных. Особенно это касается композиций, содержащих вирусы оспы, такие как штаммы вируса коровьей оспы.
Далее изобретение относится к вирусу, в особенности к вирусам, как определено выше, в качестве
лекарственного средства или вакцины. Если вирус является вирусом дикого типа или аттенуированным
вирусом, то его можно использовать для вакцинации против вируса как такового. Для этой цели особенно предпочтительны аттенуированные вирусы. Если вирус является рекомбинантным, экспрессирующим
белки, экспрессируемые из генов, гетерологичных для вирусного генома, то возможна вакцинация против вируса как такового и/или против экспрессируемого гетерологичного белка. Если рекомбинантный
вирус экспрессирует терапевтический ген, такой как антисмысловая РНК или рибозим, то вирус можно
использовать в качестве лекарственного средства.
Далее изобретение относится
к применению вируса, как описано выше, или композиции, как описано выше, для изготовления
вакцин;
к способу лечения или вакцинации животных, включая человека, нуждающихся в этом, включающему в себя введение вируса, как описано выше, или композиции, как описано выше, в тело животного
или человека.
Примеры
Если в следующих примерах не указано иного, бессывороточной средой является среда 199 (Life
Technologies). Добавляемым EGF обычно является рекомбинантный EGF человека, полученный от
Chemicon. Фибронектин (FN) получен от Chemicon.
Пример 1. Получение клеток эмбриональных фибробластов цыпленка (CEF).
Оплодотворенные яйца, лишенные специфических патогенов (SPF), хранили не более 12 дней при
4°С. Яйца помещали в инкубатор и инкубировали в течение 10-12 дней при 37,8±8°С. Одну чашку Петри
на максимум 11 яиц готовили с использованием 10-20 мл PBS. Яйца помещали в специализированную
картонную коробку для яиц и обрабатывали большим количеством Bacillol, чтобы стерилизовать наружную сторону оболочки яиц. После высушивания в яйцах сделали дырочки и осторожно удалили оболочку. Хориоаллантоисную мембрану отодвинули в сторону. Эмбрионы поднимали за ноги, и затем отрезали им головы. Затем эмбрионы переносили на подготовленные чашки Петри. После удаления ног туловища снова промывали PBS. Максимум 11 туловищ помещали в пластмассовый шприц объемом 20 мл и
выдавливали в колбу Эрленмейера. Добавляли 5 мл предварительно нагретого (37°С) раствора трипсина
с ЭДТА на туловище, и раствор перемешивали в течение 15 мин в бессывороточной среде при комнатной
температуре, используя магнитную мешалку.
Трипсинизированные клетки наливали через слой сита в химический стакан. Все клетки переносили
в одну пробирку для центрифугирования объемом 225 мл и центрифугировали при 20°С, 470×g в течение
7 мин в настольной центрифуге. Осадок после удаления супернатанта тщательно ресуспендировали пипетированием в 1 мл свежей предварительно согретой (37°С) бессывороточной ростовой среды, содержащей 10 нг/мл EGF на туловище. Добавляли до общего объема 150 мл свежую предварительно нагретую (37°С) бессывороточную ростовую среду, содержащую 10 нг/мл EGF. Повторяли стадию центрифугирования. Удаляли супернатант и осадок ресуспендировали, как описано выше. Добавляли до общего
объема 100 мл свежую, предварительно нагретую (37°С) бессывороточную ростовую среду, содержащую
10 нг/мл EGF. Клетки подсчитывали, как описано в следующем разделе. Необходимое количество клеток
высеивали во вращающуюся колбу с бессывороточной ростовой средой, содержащей 10 нг/мл EGF, и
инкубировали при 37°С. На четвертый день после посева клетки были готовы к инфицированию вирусом.
Пример 2. Подсчет плотности клеток.
Образец клеточной суспензии (см. раздел получения CEF) брали и смешивали с одним объемом
трипанового синего, приводящим в итоге к количеству клеток от 20 до 100 клеток на 16 маленьких квадратах гемоцитометра, поставляемого Fuchs-Rosenthal под названием Hemocytometer Fast Read 102 (разведение 1:2-1:10). Для того чтобы предотвратить реагрегацию/седиментацию клеток, образец брали непосредственно после ресуспендирования клеток. После нескольких минут инкубационного времени с трипановым синим для того, чтобы краситель должным образом вошел в мертвые клетки, 10 мкл суспензии
клеток добавляли в гемоцитометр. Только белые живые клетки подсчитывали под световым микроскопом, используя объектив 10×. В общем, было подсчитано 3 репрезентативных больших квадрата, содержащих 3×16 маленьких. Из каждого большого квадрата только две границы в форме буквы L включали в
расчет. Брали среднее количество подсчитанных клеток и окончательную концентрацию клеток вычисляли, используя следующую формулу:
Среднее количество клеток × разведение × 104 = клеток/мл.
Суспензию клеток окончательно разбавляли до желаемой рабочей концентрации.
-7-
009008
Пример 3. Влияние добавления фактора, выбранного из факторов роста, и фибронектина к бессывороточной культуральной среде на образование монослоя CEF.
В предварительных экспериментах авторы изобретения показали, что клетки CEF не прикрепляются к поверхности сосуда для культивирования клеток, если используют среду 199, которая не содержит
FCS. Более того, монослои не образуются. Нормальное образование монослоя наблюдают, если используют среду 199, содержащую 7% FCS. Было проанализировано, можно ли достичь прикрепления и роста
клеток CEF в бессывороточной среде 199, если среду дополнить добавками.
Исследуемые добавки включали в себя рекомбинантный эпидермальный фактор роста (r-hEGF) и
фибронектин (FN).
Для экспериментов клетки CEF выращивали в среде 199 с различными добавками по отдельности
или в комбинации. Клетки, растущие в среде 199 без каких-либо добавок, служили в качестве отрицательного контроля. Клетки, культивируемые в среде 199, содержащей 7% FCS, служили в качестве положительного контроля. Все эксперименты выполняли в 6-луночных планшетах для культивирования
клеток с 3 мл среды. Добавки, до их использования в клеточных культурах, обрабатывали по таблицам
данных поставщиков. Перед использованием проводили адсорбцию фибронектина на поверхность планшетов для культивирования клеток в течение 25 мин. Фибронектин использовали в концентрации
3 мкг/см2 и EGF - в концентрации 10 нг/мл. Перед добавлением любых клеток осуществляли контакт
планшетов для культивирования клеток с содержащей фибронектин средой в течение 25 мин.
Каждую культуральную среду с добавками, которые необходимо было тестировать, культивировали в двух повторах, 6-луночные планшеты для культивирования клеток инкубировали в течение 4 дней
при температуре 37°С. С 1- по 4-й день, используя микроскоп, оценивали прикрепление и рост клеток.
Для положительного контроля наблюдали нормальное прикрепление и рост клеток CEF. Для среды
199 без добавок почти не смогли обнаружить прикрепления клеток CEF.
Значительное улучшение в образовании монослоя обнаружили при использовании добавленного к
среде 199 EGF, по сравнению со средой 199 без добавок. Было обнаружено, что клетки прикрепились и
образовали типичную для фибробластов морфологию. Более того, непрерывный рост можно было наблюдать весь период из 4 дней.
Улучшения прикрепления клеток также достигали, добавляя фибронектин к культуральной среде.
Добавление и EGF, и фибронектина приводило к слабому улучшению по сравнению с добавлением только EGF и только фибронектина.
В итоге сделали вывод, что образованию монослоя клеток CEF в бессывороточной среде 199 можно
способствовать, используя добавки EGF и фибронектина.
Кроме того, в параллельных рядах экспериментов 1×107 клеток CEF высевали в среду, содержащую
10% FCS, среду, не содержащую FCS, и среду, не содержащую FCS, но содержащую EGF. Количество
клеток подсчитывали через 2 дня после посева. Количество клеток составляло 42, 6 и 44% соответственно от количества клеток, использованных для посева. Таким образом, результаты для клеток, высеянных
в бессывороточную среду, содержащую EGS, были также хороши, как и результаты, полученные со средой, включающей FCS, и значительно лучше, чем со средой, не содержащей ни сыворотки, ни EGF.
Дополнительно среду, содержащую EGF, сравнивали с различными стандартными бессывороточными средами, такими как DMEM, Opti-Mem или 293-SFM. С этой целью 1×107 клеток CEF высевали в
различные бессывороточные среды и культивировали в течение 4 дней. Количество клеток, культивируемых в среде, содержащей EGF, было в 24, 5 и 12 раз выше, чем количество клеток, культивированных
в бессывороточной среде DMEM, Opti-Mem и 293-SFM соответственно.
Пример 4. Инфицирование клеток CEF MVA.
Клетки инфицировали через 4 дня после посева во вращающиеся колбы. В этот момент времени
клетки выросли до соответствующего монослоя. Клетки инфицировали MVA при MOI 1,0 или 0,1. Для
инфицирования ростовую среду удаляли из колб. Требуемое количество вируса на вращающуюся колбу
разводили в 20 мл подходящей для инфицирования бессывороточной среде. На данной стадии бессывороточная среда может содержать или может не содержать фактор, выбранный из факторов роста, и фибронектин. Клетки инкубировали с вирусом в течение 1 ч при 37°С при 0,3-0,5 об/мин. в инкубаторе для
вращающихся колб. Через 1 ч вращающиеся колбы наполняли подходящей бессывороточной ростовой
средой до общего объема 200 мл на вращающуюся колбу. На данной стадии бессывороточная среда может содержать или может не содержать фактор, выбранный из факторов роста, и фибронектин. Репликацию вируса останавливали через 48 или 72 ч, замораживая вращающуюся колбу до -20°С.
Пример 5. Получение вирусных экстрактов из инфицированных клеток CEF и титрование MVA.
Замороженные вращающиеся колбы оттаивают при комнатной температуре. Во время процесса оттаивания клетки отделяются от поверхности вращающихся колб, и их можно механически удалить,
встряхивая колбы. Суспензию вирус/клетка собирали и готовили аликвоты для меньших объемов. Для
высвобождения вируса из инфицированных клеток суспензии вирус/клетка 3 раза замораживали/оттаивали. Замороженные/оттаявшие образцы вируса использовали для титрования.
-8-
009008
Титрование выполняли на клетках CEF первого пассажа в 96-луночных планшетах, используя 10кратное разведение вирусной суспензии и 8 репликаций на разведение. После инфицирования инфицированные клетки визуализировали при помощи антител против вируса коровьей оспы и подходящего
окрашивающего раствора.
Подробнее, в 0-й день исследования первичные клетки CEF (см. раздел «Получение клеток эмбриональных фибробластов цыпленка (CEF)») трипсинизировали и подсчитывали, как описано в разделе
«Подсчет плотности клеток». Клетки разводили до концентрации 1×105 клеток/мл в среде RPMI с 7%
FCS. После такого разведения 100 мкл высевали в каждую лунку 96-луночных планшетов, используя
многоканальную пипетку. Клетки инкубировали в течение всей ночи при температуре 37°С и 5% СO2.
Образцы вируса подвергали титрованию (см. раздел «Получение вирусного экстракта из инфицированных клеток CEF»), последовательно разводя с 10-кратным шагом от 10-1 до 10-12, используя бессывороточную RPMI. Такое последовательное разведение выполняют, добавляя 900 мкл RPMI ко всем лункам
96-луночного планшета с глубокими лунками. 100 мкл образца вируса добавляли ко всем лункам первого
ряда и перемешивали. После этого 100 мкл каждого образца переносили в следующий ряд лунок, используя многоканальную пипетку. При проведении разведений 96-луночные планшеты с глубокими лунками держали на льду. Планшеты инкубировали в течение 5 дней при 37°С и 5% СO2 для осуществления
инфицирования. Через 5 дней клетки иммуногистохимически окрашивали антителом, специфичным для
вируса коровьей оспы. Для окрашивания культуральную среду удаляли, поворачивая 96-луночный
планшет вверх дном над резервуаром. Клетки фиксировали смесью метанол/ацетон (1:1) в концентрации
100 мкл/лунку в течение 10 мин при комнатной температуре. Фиксирующий раствор удаляли и планшеты высушивали на воздухе. После высушивания клетки отмывали один раз PBS и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре с антителом против вируса коровьей оспы (антитело против вируса
коровьей оспы, кроличье поликлональное, фракция IgG (Quartett, Берлин, Германия #9503-2057), разведенным до 1:1000 в PBS с 3% FCS. После удаления антитела клетки дважды отмывали PBS и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре с конъюгированным с HRP (конъюгированный с пероксидазой хрена) антикроличьим антителом (козье поликлональное антитело против IgG кролика, конъюгированное с HRP (Promega, Маннхейм, Германия # W4011), разведенным до 1:1000 в PBS с 3% FCS. Клетки снова отмывали PBS и окрашивали либо о-дианизидином, либо ТМВ. Для использования способа
окрашивания о-дианизидином клетки инкубировали с окрашивающим раствором в количестве
100 мкл/лунку, состоящим из 5 мг о-дианизидина и 180 мкл 30% Н2О2 на 60 мл фосфатно-цитратного
буфера в концентрации 50 мМ. Клетки инкубировали при комнатной температуре, пока они не окрашивались в коричневый цвет. Инфицированные клетки были хорошо видны через 1-3 ч. Используя способ
окрашивания ТМВ, клетки инкубировали с ТМВ в количестве 30 мкл/лунку в концентрации 1,2 мМ
(Seramun Diagnostica GmbH). После 15 мин инкубации раствор ТМВ удаляли и клетки один раз отмывали
PBS. Инфицированные клетки выглядели темно-синими. На планшетах подсчитывали инфицированные
клетки. Вирусный титр вычисляли с использованием формулы Спирмена и Кербера. Для вычисления
TCID50 каждая лунка, имеющая коричневые или синие клетки, маркировалась как положительная. Поскольку параметры анализа содержат константу, использовали следующую упрощенную формулу:
где а представляет собой фактор разведения последней колонки, в которой все восемь лунок являются
положительными;
хa представляет собой количество положительных лунок в колонке а+1;
хb представляет собой количество положительных лунок в колонке а+2;
хc представляет собой количество положительных лунок в колонке а+3.
Пример 6. Оптимальная плотность посева клеток CEF в бессывороточную среду и оптимальное количество MVA для инфицирования клеток CEF.
Для бессывороточного роста клеток CEF определили оптимальную клеточную плотность посева
равную 7,5×107 клеток/850 см2 (поверхность одной вращающейся колбы). Клетки были способны образовать хороший монослой без образования больших скоплений на 4-й день после посева, и в данные момент времени их можно было инфицировать.
Для того чтобы определить наилучший уровень вирусной инокуляции и продолжительность
инфицирования для максимальной продукции MVA из клеток CEF, культивируемых бессывороточным
способом, проводили эксперименты. Клетки CEF высевали при плотности 7,5×107 клеток/850 см2 в
среду по настоящему изобретению. На 4-й день после посева клетки инфицировали различными количествами MVA в диапазоне от 0,05 до 1,0 TCID50/клетку MVA. Наилучшие результаты получали при
0,1 TCID50/клетку MVA.
Пример 7. Оптимальное значение рН бессывороточной среды для культивирования и инфицирования MVA.
Инфицирования MVA и другими вирусами оспы чувствительны к значениям рН ниже 7,0. Вирусы
оспы нестабильны при кислом значении рН, и очищенные вирусы оспы рекомендуют хранить в буферном растворе при рН выше 7,0, чтобы гарантировать стабильность и вирусную целостность при хранении
-9-
009008
в качестве жидкого вирусного препарата. Для того чтобы определить влияние проведения инфицирования при различном начальном значении рН на выход вируса, проводили эксперименты. Вращающиеся
колбы засевали клетками CEF обычным способом в бессывороточную среду, содержащую 10 нг/мл EGF
с добавлением 4 мМ L-глутамина, и культивировали в течение 4 дней. Клетки инфицировали MVA в количестве 0,1 TCID50/клетку в бессывороточной среде, содержащей 10 нг/мл EGF с добавлением
L-глутамина и 1 мМ аспарагина, при различных значениях рН, находящихся в диапазоне от 6,5 до 9,0.
Через 72 ч после инфицирования измеряли рН среды и определяли выход вирусов обычным способом
при помощи титрования клеточных экстрактов. Результаты представлены в следующей таблице, в которой показано влияние начального рН среды в начале инициирования на выход вируса.
Для инфицирования, проведенного в бессывороточной среде, содержащей 10 нг/мл EGF, дополненной L-глутамином и аспарагином, вирусная продукция была относительно постоянна при начальном
значении рН от 7,0 до 8,5, но при начальном рН 6,5 и 9,0 вирусная продукция была ниже. Наилучший
выход получили при начальном значении рН 7,0. Коммерчески доступные стандартные бессывороточные среды обычно имеют значение рН 7,4. Следовательно, доведение рН бессывороточной среды до 7,0
может помочь улучшить выход вируса.
Пример 8. Влияние добавления аспарагина к бессывороточной среде.
В предварительных экспериментах выявили, что количество аспарагина может быть ограничивающим во время культивирования клеток CEF и инфицирования клеток CEF MVA. Для того чтобы преодолеть уменьшение количества аспарагина в бессывороточной среде во время процесса культивирования и
инфицирования, дополнительное количество аспарагина добавляли к среде в качестве добавки перед инфицированием клеток CEF. Для того чтобы определить оптимальное количество аспарагина для добавления к среде, вращающиеся колбы засевали клетками CEF (7,5×107 клеток/850 см2) в бессывороточной
среде, содержащей 10 нг/мл EGF с добавлением 4 мМ L-глутамина. Через 4 дня после посева клетки инфицировали MVA в количестве 0,1 ТСID50/клетку в бессывороточной среде, содержащей 10 нг/мл EGF с
добавлением 4 мМ L-глутамина, дополненной аспарагином в различных концентрациях (0,5, 1,0 и
1,5 мМ). Вирусную репликацию останавливали через 72 ч после инфицирования и определяли вирусные
титры. Результаты представлены в следующей таблице, в которой показана продукция MVA клетками
CEF, дополненными различными уровнями аспарагина на стадии инфицирования. Титры представляют
собой средние значения для 3 вращающихся колб для каждого дополнения аспарагином.
Данные результаты демонстрируют, что дополнение аспарагином бессывороточной среды, содержащей 10 нг/мл EGF, может улучшить вирусную продукцию, и для процесса инфицирования дополнение
до 1 мМ оптимально.
- 10 -
009008
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ амплификации вируса оспы, включающий в себя следующие стадии:
культивирование первичных клеток птицы в бессывороточной среде, содержащей по крайней мере
один фактор, выбранный из группы, состоящей из факторов роста и факторов прикрепления;
инфицирование первичных клеток птицы вирусом оспы;
культивирование инфицированных клеток в бессывороточной среде для получения потомства указанного вируса оспы, причем первичными клетками птицы являются клетки, позволяющие осуществить
продуктивную репликацию вируса оспы.
2. Способ по п.1, в котором первичными клетками птицы являются эмбриональные фибробласты
цыпленка (CEF).
3. Способ по любому из пп.1, 2, в котором фактором роста является эпидермальный фактор (EGF), в
частности рекомбинантный EGF человека.
4. Способ по п.3, в котором концентрация EGF составляет от 5 до 20 нг/мл среды.
5. Способ по любому из пп.1-4, в котором фактором прикрепления является фибронектин.
6. Способ по п.3, в котором концентрация фибронектина составляет от 1 до 10 мкг/см2 поверхности
сосуда для культивирования клеток.
7. Способ по любому из пп.1, 2, в котором среда содержит два и более факторов, выбранных из факторов роста и факторов прикрепления.
8. Способ по п.7, в котором среда содержит EGF и фибронектин в диапазонах концентраций, как
определено в пп.4 и 6.
9. Способ по любому из пп.1-8, в котором среда дополнительно содержит один или более компонентов, выбранных из экстракта эукариотических клеток, растительного и животного экстрактов, где
животное не является млекопитающим.
10. Способ по п.9, в котором экстрактом эукариотических клеток является дрожжевой экстракт или
ультрафильтрат Yeastolate.
11. Способ по п.9, в котором растительным экстрактом является рисовый или соевый экстракт.
12. Способ по п.9, в котором животным экстрактом является рыбный экстракт.
13. Способ по любому из пп.1-12, в котором вирусом оспы является ортопоксвирус.
14. Способ по п.13, в котором ортопоксвирусом является вирус коровьей оспы.
15. Способ по п.14, в котором вирусом коровьей оспы является модифицированный вирус коровьей
оспы Анкара.
16. Способ по любому из пп.13-15, в котором вирус оспы является аттенуированным или рекомбинантным вирусом.
17. Способ по любому из пп.1-16, в котором в бессывороточной среде на одной или обеих стадиях
инфицирования первичных клеток птицы вирусом оспы и культивирования инфицированных клеток в
бессывороточной среде для получения потомства вируса оспы отсутствуют факторы, выбранные из факторов роста и факторов прикрепления.
18. Способ по любому из пп.1-17, в котором после стадии культивирования инфицированных клеток в бессывороточной среде необязательно проводят одну или более стадий очистки потомства вируса
оспы.
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2/6
- 11 -