Метод видоспецифичной диагностики ортопоксвирусов, патогенных для человека, на основе использования мультиплексной ПЦР в реальном времени Щербаков Дмитрий Николаевич Научный руководитель: д.б.н., профессор Щелкунов С.Н. Патогенные для человека ортопоксвирусы 1.Вирус натуральной оспы 2.Вирус оспы обезьян 3.Вирус оспы коров 4.Вирус осповакцины Рост заболеваемости, обусловленный ортопоксвирусными инфекциями 1. Оспа буйволов в Индии и Пакестане. 2. Вакциноподобный вирус (VACV-like) в Бразилии. 3. Оспа коров в Европе. 4. Оспа обезьян. Оспа коров 1. Наблюдается значительный рост числа заболевших. Только в Германии в течение трех вспышек 2006/07, 2008, 2009 гг. зафиксировано свыше 40 случаев. 2. Увеличивается патогенность вируса. Все чаще наблюдаются серьезные осложнения. Осложнения, обусловленные CPXV, вспышка 2006/07 гг. Вирус оспы обезьян 1. Значительный подъем заболеваемости в последние годы. Подъем заболеваемости MPXV в ДРК, за последние годы 1200 Количество зарегистрированных случаев 1000 2 800 600 Ликвидация натуральной оспы 400 200 1 0 годы 1. Нет данных. 2. Данные полученные для 2 из 9 административных районов ДРК. Вирус оспы обезьян 1. Значительный подъем заболеваемости в последние годы. 2. Регистрация случаев в США, Судане, Республике Конго, Гане. Расширение географии MPXV Судан Гана Республика Конго Демократическая республика Конго Вирус оспы обезьян 1. Значительный подъем заболеваемости в последние годы. 2. Регистрация случаев в США, Судане, Республике Конго, Гане. 3. Происходит изменение вируса. Повышается контагиозность. 4. Наблюдается до 9 генераций передачи вируса. Вирус оспы обезьян изменяется! Indice 1970 - 1995 1996 - 2008 % infections > 15 years Rare 85% Animal contact index case 72% 23% Secondary attack rate 3% 46% Transmission chains (generations) 3 generations from 8% of index cases 9 generations from 16% of index cases Case fatality rate 10% 10% David Heymann, Epidemiology in action: past, present and future, march 2010. Актуальность работы 1. Прекращение вакцинации привело к появлению и росту прослойки невакцинированных людей. 2. Повышается опасность, обусловленная MPXV, CPXV, VACV. Единственный коммерчески доступный набор для выявления OPV с дифференциацией VARV Цель работы Разработка одностадийного метода детекции и видовой дифференциации патогенных для человека ортопоксвирусов на основе мультиплексной ПЦР в реальном времени. Спектры флуоресценции использованных красителей Конструирование положительного контроля Олигонуклеотидные праймеры и зонды, использованные для мультиплексной ПЦР в реальном времени Список штаммов вирусов, ДНК которых использовалась в работе Аналитическая специфичность метода Определение аналитической чувствительности, для праймеров и зонда, специфичных VARV. 2 105 копий 2 103 копий 2 102 копий 2 10 копий 2 копии Результаты определения аналитической чувствительности Диагностическая чувствительность 1. VARV. Препараты ДНК штаммов Aslam, India 387, Brazil 128, Nepal-89, India 164, Khateen. 2. MPXV. Препараты ДНК, выделенные из крови, селезенки, легких, печени и пустулы сурков, зараженных MPXV штамм CDC#v79-I-005. 3. CPXV. Образцы ДНК, выделенные из крови, селезенки, легких и печени мышей, зараженных CPXV штамм GRI-90. 4. VACV. Препараты ДНК, выделенные из корочек кожного поражения после вакцинации VACV штамм ЛИВП. Диагностическая специфичность Образцы ДНК, выделенные из 20 препаратов цельной крови здоровых людей. Выводы Впервые разработан метод видоспецифичной идентификации вируса оспы коров на основе ПЦР в реальном времени. Спасибо за внимание Олигонуклеотиды для обнаружения вируса оспы обезьян (Li et al., 2003)