1.43 Mb PDF - Институт экологии и генетики микроорганизмов
реклама
На правах рукописи МАКСИМОВА Юлия Геннадьевна БИОТРАНСФОРМАЦИЯ АКРИЛОНИТРИЛА ИММОБИЛИЗОВАННЫМИ КЛЕТКАМИ АКТИНОБАКТЕРИЙ РОДА RHODOCOCCUS 03.00.07 Микробиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Пермь – 2006 2 Работа выполнена в лаборатории химического мутагенеза Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Демаков Виталий Алексеевич Официальные оппоненты: доктор биологических наук Октябрьский Олег Николаевич доктор биологических наук Карпунина Тамара Исаковна Ведущая организация: Институт биологии Уфимского научного центра РАН, Уфа Защита состоится «___» _______________ 2006 г. в _____ часов на заседании Диссертационного совета Д 004.019.01 в Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН по адресу: г. Пермь, ул. Голева, 13. Факс: (342)244 67 11. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН. Автореферат разослан «___» _____________ 2006 г. Ученый секретарь диссертационного совета, член-корреспондент РАН Ившина Ирина Борисовна 3 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. В естественной среде, особенно в почве, илах и на поверхности растений, микроорганизмы существуют в основном в иммобилизованном состоянии. Способность прикрепляться к поверхности твердых веществ является естественным свойством бактериальных клеток, которое может быть использовано в технологиях, реализующих их биосинтетические и биокаталитические возможности. Известно, что адсорбция микроорганизмов на поверхности носителя ведет к изменениям некоторых физиологических процессов, протекающих в клетках, в частности, ферментативных реакций. Однако это влияние в настоящее время недостаточно исследовано. Использование ферментов и клеток, обладающих определенной ферментативной активностью, в качестве биокатализаторов в органическом синтезе является быстро развивающимся направлением биотехнологии. Применение ферментов в промышленном биокатализе ограничено вследствие их низкой стабильности и высокой стоимости чистых препаратов. Иммобилизация клеток микроорганизмов дает ряд преимуществ, как перед свободными клетками, так и перед иммобилизованными ферментами. Живая клетка представляет собой готовый биохимический реактор, в котором реализуются не только процессы, приводящие к образованию конечного продукта, но и ряд других, способствующих поддержанию каталитической активности системы на высоком уровне (Тривен, 1983). Успешным опытом применения биокатализа в области крупнотоннажного химического синтеза является производство амидов, в частности, акриламида с применением биомассы нитрилгидролизующих микроорганизмов (Астаурова, 1991; Безбородов, 1991; Kobayashi et al., 1991; Pogorelova et al., 1996; Bunch, 1998; Hughes et al., 1998; Banerjee et al., 2002; Mylerova, Martinkova, 2003). Для улучшения характеристик биокатализатора, наряду с подбором высокоактивных штаммов, необходим поиск подходящего носителя для иммобилизации бактерий, используемых в промышленном производстве. Для иммобилизации, главным образом, используется метод включения в массу носителя: геля альгината кальция либо бария (Hann, 1999; Dias et al., 2001; Graham, 2000), агара и агарозы (Colby et al., 2000) κ-каррагинана (Dias et al., 2001), поливинилового спирта (Mylerova, Martinkova, 2003) и полиакриламида (Watanabe, 1987; Kobayashi et al., 1992; Hughes et al., 1998). В то же время недостаточно внимания уделяется адсорбционной иммобилизации, в частности, на активированных углеродных носителях, отличающихся инертностью, невысокой стоимостью, химической и биологической стойкостью. Несмотря на то, что первые работы, посвященные адсорбции клеток на углях были выполнены в 1898 году, длительное время эти носители не использовались для иммобилизации (Давиденко, 1995). 4 Цель настоящего исследования – изучение влияния иммобилизации клеток и свойств носителей на ферментативную активность и физиологические характеристики актинобактерий рода Rhodococcus, обладающих нитрилгидратазной активностью. Основные задачи исследования: 1. Изучить воздействие различных способов иммобилизации на нитрилгидратазную активность штаммов R. ruber gt1 и R. erythropolis 84. 2. Определить сорбционную емкость исследуемых носителей по отношению к микроорганизмам, субстрату и продукту ферментативной реакции. 3. Оценить возможность многократного использования иммобилизованных клеток в биокаталитическом процессе. 4. Сравнить возможность роста клеток штамма R. ruber gt1 на активных углях различных видов и новых углеродсодержащих носителях. Научная новизна. На основе сравнительного анализа выявлены преимущества адсорбционного метода иммобилизации клеток промышленно значимых штаммов, обладающих высокой нитрилгидратазной активностью, перед методами включения в гель и ковалентного присоединения. Установлено, что адсорбционная иммобилизация не приводит к потере нитрилгидратазной активности, в отличие от других изученных методов. Обнаружено, что адсорбция на активных углях стабилизирует нитрилгидратазную активность клеток при воздействии повышенной температуры и высоких концентраций токсичного субстрата, а также обеспечивает возможность многократного использования биокатализатора. Впервые показано влияние пористой структуры, дисперсионного состояния ряда углеродсодержащих адсорбентов, свойств поверхности композиционных материалов на адсорбцию клеток, субстрата и продукта маркерной ферментативной реакции. Теоретическое и практическое значение работы. Выполненные исследования расширяют представления о воздействии различных способов иммобилизации на ферментативную активность микробных клеток. Выявлен наиболее эффективный метод иммобилизации промышленно значимых нитрилгидролизующих бактерий. Полученные результаты могут быть использованы при разработке технологического процесса синтеза акриламида иммобилизованным биокатализатором в непрерывных условиях, а также при разработке технологии очистки стоков от акрилонитрила и оптимизации технологических режимов очистки растворов акриламида. Основные положения, выносимые на защиту. 1. Наиболее перспективными носителями для адсорбционной иммобилизации клеток родококков являются адсорбенты, обладающие следующими характеристиками: (1) развитая система макропор, (2) мелкодисперсность, (3) шероховатый поверхностный слой. 5 2. Адсорбционная иммобилизация стабилизирует нитрилгидратазную активность в условиях повышенной температуры и воздействия высоких концентраций токсичного субстрата, обеспечивая многократное использование биокатализатора. 3. Включение клеток в ионотропные, термотропные и ковалентносвязанные гели приводит к значительному снижению скорости нитрилгидратазной реакции. 4. Ковалентное связывание в ряде случаев обеспечивает более высокую клеточную нагрузку носителя, чем адсорбция, но приводит к снижению нитрилгидратазной активности. Апробация работы и публикации. Основные положения диссертационной работы доложены на 7-й и 8-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века», Пущино, 2003, 2004; Всероссийском симпозиуме с международным участием «Биотехнология микробов», Москва, 2004; Третьем Московском Международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, 2005; 2-й Международной конференции «Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биотехнологический потенциал», Пермь-Казань-Пермь, 2005; Международной научной конференции «Микробные биотехнологии», Одесса, 2006. По теме диссертации опубликовано 30 научных работ. Объем и структура диссертации. Работа изложена на 128 страницах машинописного текста, содержит 34 рисунка и 12 таблиц; состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, трех глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы. Список литературы включает 159 наименований работ отечественных (33) и зарубежных (126) авторов. Связь работы с научными программами. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН и является частью исследований, проводимых по теме «Биохимические и генетические системы трансформации органических соединений у бактерий, перспективных для биотехнологий» (номер государственной регистрации 0120.0 406511). Исследования выполнены при поддержке гранта РФФИ № 04-04-97514, 2005-2006 гг, программы интеграционных исследований Уральского и Сибирского отделений РАН, 2004-2006 гг., молодежного гранта УрО РАН №35, 2004 г. Список принятых сокращений: ГХ – газовая хроматография, ОП – оптическая плотность, НАК – нитрил акриловой кислоты, АА – акриламид, LB – среда ЛуриаБертани, КВУ – каталитический волокнистый углерод, ПААГ – полиакриламидный гель, ПВС – поливиниловый спирт, МИК – минимальная ингибирующая концентрация. Благодарности. Автор выражает благодарность проф., д.т.н. В.Ф. Олонцеву за предоставленные образцы активных углей; к.х.н., с.н.с. Института катализа им. Г.К. Борескова СО РАН Г.А. Коваленко за предоставленные образцы 6 углеродсодержащих носителей и помощь в проведении сканирующей электронной микроскопии образцов. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Бактериальные штаммы. Объектом исследования являются штаммы R. ruber gt1 и R. erythropolis 84, обладающие высокой нитрилгидратазной активностью, полученные в результате селекции в лаборатории химического мутагенеза ИЭГМ УрО РАН. Среды и условия культивирования. Для выращивания нитрилгидролизующих бактерий использовалась синтетическая среда N (солевая основа) следующего состава (г/л): KH2PO4 – 1,0; K2HPO4×3H2O – 1,6; NaCl – 0,5; MgSO4×7H2O – 0,5; CaCl2 – 0,005; CoCl2×6H2O – 0,01; FeSO4×7H2O – 0,005; pH 7,2 ± 0,2. В качестве источника углерода использовали глюкозу в концентрации 0,1%, азота – NH4Cl в концентрации 10 мМ. Клетки бактерий выращивали в 100 мл среды N в конических колбах объемом 250 мл при температуре 28°С и постоянном перемешивании со скоростью вращения 120 об./мин. Бактериальный рост оценивали по оптической плотности клеточной суспензии при λ=540 нм с учетом разведения. Одна единица ОП540 соответствует 0,436 мг сухих клеток. Носители для адсорбционной иммобилизации. В качестве носителей использовались углеродные сорбенты: уголь активный березовый дробленый БАУ, уголь активный гранулированный ФТД, активная углеродная ткань «Урал», активный нетканый материал «Войлок», углеродный активный материал ФАС на основе фуриловой смолы (пр-во Россия), уголь активный дробленый NORIT PK 1-3 (пр-во Голландия), уголь-сырец, измельченный до порошкообразного состояния с размером частиц 50-300 мкм. Ряд носителей был представлен композиционными материалами на основе керамзита с синтезированными на поверхности слоями каталитического волокнистого углерода (КВУ) и графитоподобного углерода. В качестве адсорбентов также использовались углеродные носители марок Сибунит, приготовленный путем карбонизации графитизированной сажи, и Сапропель, приготовленный путем карбонизации илистых отложений озер, а также массивный КВУ. Определение нитрилгидратазной активности иммобилизованных клеток и клеток в суспензии. Нитрилгидратазную активность иммобилизованных клеток и бактерий в суспензии измеряли по изменению концентрации амида в реакционной среде за 10 минут трансформации. Удельную активность фермента определяли как количество амида в мкмоль, образуемое за 1 минуту биомассой бактерий, соответствующей 1 мг сухого веса. Единица нитрилгидратазной активности (1 ЕД) соответствует 1 мкмоль амида/мг сухих клеток/мин. 7 Определение сорбционной емкости носителей по отношению к клеткам, субстрату и продукту нитрилгидратазной реакции. Количество адсорбированных клеток определяли по разности оптической плотности (ОП540) культуральной среды до и после сорбции. Сорбционную емкость по отношению к клеткам выражали в мг сухих клеток на г носителя. Количество адсорбированного акриламида определяли по разности оптической плотности (ОП260) раствора акриламида до и после сорбции. Концентрацию акрилонитрила в надосадочной жидкости после сорбции определяли на газовом хроматографе Chrom 5d (“LP”, Чехославакия). Определение операционной стабильности иммобилизованных клеток и клеток в суспензии. Операционную стабильность иммобилизованных и свободных клеток оценивали по сохранению каталитической активности при последовательном проведении циклов нитрилгидратазной реакции. Цикл реакции представлял собой 20минутную полную трансформацию акрилонитрила, вносимого до концентрации 10% (объем/объем) в 10 мл 0,1 М фосфатного буфера, с последующей отмывкой клеточного центрифугата, либо носителя с иммобилизованными клетками 0,1 М фосфатным буфером pH 7,2±0,05. Реакция катализировалась иммобилизованными или свободными клетками активностью 200 мкмоль/мг/мин, взятыми в количестве 2,5 мг, в пересчете на сухой вес. Отбор проб на определение нитрилгидратазной активности проводили через 10 минут после внесения субстрата. Статистическая обработка. Все опыты повторяли не менее трех раз. При статистической обработке определяли среднее арифметическое, стандартное отклонение, доверительные интервалы. Достоверность различий оценивали с использованием критерия Стьюдента. Анализ результатов проводили с помощью стандартных пакетов программ MS Excel 2003 и Statistica. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Морфология клеток актинобактерий рода Rhodococcus, выращенных на минимальной и богатой средах. Изучение морфологии с помощью фазово-контрастной микроскопии показало, что на стадии наибольшей каталитической активности палочковидные клетки R. ruber gt1 достигают в длину 1-7 мкм, а R. erythropolis 84 – 3 мкм (рис.1, 2). Клетки, выращенные на жидкой синтетической среде N, до фазы роста, соответствующей максимальной активности, были взяты для иммобилизации. 8 4 мкм 4 мкм Рис.1. Клетки R. ruber gt1 в стационарной Рис.2. Клетки R. erythropolis 84 в первой фазе роста на жидкой минимальной среде. трети экспоненциальной фазы роста на жидкой минимальной среде. Сорбционная емкость активных углей по отношению к клеткам родококков, субстрату и продукту нитрилгидратазной реакции. Определена способность клеток родококков адсорбироваться на углеродных носителях, отличающихся по структуре и пористости. Процесс адсорбции зависит от площади доступной поверхности и адгезии клеток к поверхности носителя. Очевидно, что площадь поверхности пористых носителей, доступная для адсорбции клеток, слагается в основном из макропор, превышающих по размерам микробную клетку. Установлено, что наибольшее количество клеток адсорбирует БАУ – 14,6 мг сухих кл. на 1 г носителя (табл. 1). БАУ обладает развитой системой макропор (1,35-1,45 см3/г), что составляет 80-82% от общего объема пор. Показано, что дисперсионное состояние углеродных сорбентов также имеет значение для процесса адсорбции клеток. Так, мелкодисперсность ФТД и угля-сырца обеспечивает адсорбцию родококков, сравнимую с БАУ. Среди изученных сорбентов, активный нетканый материал «Войлок» имеет наименьший суммарный объем пор – 0,60-0,68 см3/г, в то время как у ФАС суммарный объем микро- и мезопор на порядок превышает объем макропор, что отражается на процессе адсорбции клеток. На процесс адсорбции влияют поверхностные свойства как носителя, так и микробной клетки, а основной вклад в адсорбционные взаимодействия вносят гидрофобные связи. Известно, что родококки обладают гидрофобной поверхностью, а активные угли являются гидрофобными сорбентами (Давиденко, 1995), что обеспечивает эффективную адсорбцию клеток на этих носителях. 9 Таблица 1. Сорбционная емкость углеродных сорбентов по отношению к клеткам родококков, субстрату и продукту нитрилгидратазной реакции Сорбционная емкость к акриламиду, мг/г Носители к клеткам, мг сухих кл./г к НАК, мг/г Носители, свободные от клеток Носители, нагруженные клетками БАУ 14,6±1,0 350,0±6,5 22,0±2,5 6,6±2,9 NORIT PK 1-3 13,2±1,1 278,3±1,0 16,7±1,7 7,5±0,6 ФТД 12,0±2,3 217,4±1,1 19,4±1,0 9,5±0,9 уголь-сырец 12,4±1,0 187,3±17,3 2,9±0,5 0,1±0,1 «Урал» 9,5±1,0 287,4±2,1 27,2±1,8 16,8±0,6 «Войлок» 7,4±1,7 366,0±51,0 10,6±0,5 4,6±1,6 ФАС 8,1±1,1 359,0±49,3 16,5±0,7 11,2±3,2 Для адекватной оценки нитрилгидратазной активности иммобилизованных клеток бактерий необходимо определить количество адсорбированных на носителях субстрата и продукта ферментативной реакции. Определена сорбционная емкость углеродных носителей по отношению к акрилонитрилу – субстрату ферментативной реакции, катализируемой нитрилгидратазой. Показано, что высокой сорбционной емкостью (до 350-400 мг/г) обладали БАУ, «Войлок» и ФАС (табл. 1). Минимальная адсорбция наблюдалась на угле сырце. Следуя полученным данным, на БАУ, «Войлоке» и ФАС сорбируется около 15% субстрата, внесенного в концентрации 1 М и 50% - 0,3 М. При использовании иммобилизованных клеток в производственных процессах важно, чтобы продукт ферментативной реакции минимально адсорбировался на носителе. С целью оценки сорбционной емкости углеродных сорбентов по отношению к продукту реакции проводили адсорбцию акриламида из 10 мМ раствора. Установлено, что носители с иммобилизованными на них клетками адсорбируют значительно меньше акриламида, чем свободные от клеток (табл. 1). 10 А Б 20 µm 1 µm В Г 1 µm Д Е 2 µm Рис. 3. Клетки R. ruber gt1, адсорбированные на активных углях. А, Б – БАУ, В – ФТД, Г – NORIT PK 1-3, Д – ткань «Урал», Е – «Войлок». С помощью сканирующего электронного микроскопа были получены микрофотографии клеток родококков, адсорбированных на углеродных носителях (рис. 3). Обнаружено, что поверхность макропор БАУ и NORIT PK 1-3 эффективно 11 заполняется клетками, которые густо покрывают ее подобно сетке или плотной пленке. Диаметр макропор БАУ, NORIT PK 1-3 и ФТД находится в диапазоне 5-40 мкм, 2-30 мкм и 7-15 мкм соответственно, что обеспечивает эффективную адсорбцию клеток, достигающих в фазе наибольшей каталитической активности от 1 до 7 мкм в длину. Напротив, у ФАС пористая структура создается в основном микропорами, недоступными для клеток, адсорбция которых наблюдается лишь на небольшой площади поверхности гранул. Таким образом, клетки более полно покрывают поверхность макропор дробленого активного угля БАУ, NORIT PK 1-3 и угля-сырца, в отличие от волокон «Войлока» и доступной поверхности ФАС. Меньшая сорбционная емкость «Войлока» и ФАС по сравнению с другими активными углями подтверждается электронно-микроскопическим методом. Как показано далее, данные микроскопии согласуются с результатами экспериментов по выращиванию клеток в присутствии сорбентов: на ФАС образуется значительно меньше биомассы, чем на других активных углях. Исходя из полученных данных, можно заключить, что для иммобилизации каталитически активных клеток наиболее предпочтительными среди изученных носителей являются дробленые активные угли, т.к. они сочетают наибольшую способность к адсорбции клеток с наименьшей адсорбцией продукта нитрилгидратазной реакции. Значения адсорбционной емкости гранулированного активного угля ФТД и мелкодисперсного угля-сырца по отношению к клеткам и акриламиду приближаются к таковым дробленых активных углей, но эти носители в большей степени подвержены абразивному истиранию, что затрудняет их использование в технологических процессах. Сорбционная емкость новых углеродсодержащих носителей по отношению к клеткам родококков и акриламиду. Проведена иммобилизация клеток R. ruber gt1 и R. erythropolis 84 на новых углеродсодержащих адсорбентах. В качестве носителей были выбраны композиционные материалы на основе керамзита с синтезированными на поверхности слоями каталитического волокнистого углерода (КВУ) и графитоподобного углерода, а также массивный КВУ и углеродные носители, приготовленные путем карбонизации графитизированной сажи (Сибунит) и илистых отложений озер (Сапропель). Установлено, что независимо от морфологии углеродного слоя, адсорбционная емкость композиционных материалов на основе керамзита, как и массивного КВУ, по отношению к родококкам составляла 4 мг сухих клеток на 1 г носителя (табл. 2). Сорбционная емкость Сапропеля по отношению к клеткам составила 2,5 мг сухих клеток на 1 г носителя. Показано, что внутренняя поверхность широкопористого Сапропеля доступна для адсорбции клеток микроорганизмов размером 1 мкм и более. Величина адсорбции родококков на мезопористом Сибуните сравнима с адсорбцией клеток на 12 Сапропеле и достигает 2 мг/г носителя, что может быть связано с эффективной адсорбцией клеток на более шероховатой поверхности Сибунита. В отличие от композиционных материалов на основе керамзита и массивного КВУ, Сибунит и Сапропель адсорбировали акриламид. Таблица 2. Сорбционная емкость углеродсодержащих носителей по отношению к клеткам родококков и акриламиду Сорбционная емкость по отношению к клеткам, мг сухого веса/г носителя Сорбционная емкость по отношению к акриламиду, мг/г Массивный КВУ 4,35±0,14 0 Керамзит/ графитоподобный слой 4,13±0,38 0 Керамзит/КВУ-слой (6,47 вес%) 4,09±0,03 0 Керамзит/КВУ-слой (2,84 - 3,63 вес%) 4,17±0,05 0 Сибунит 2,01±0,17 5,31±0,60 Сапропель 2,55±0,25 3,92±0,53 Углеродсодержащие носители Рост штамма R. ruber gt1 на углеродных сорбентах и образование акриламида иммобилизованными клетками. Показано, что процесс адсорбции на углеродных материалах не оказывает отрицательного воздействия на жизнеспособность клеток. При культивировании родококков в присутствии углеродных сорбентов рост клеток происходил в основном на носителях (табл. 3). При этом количество выросшей на них (за исключением «Войлока» и ФАС) биомассы, превышало таковую без сорбента, что подтверждено гравиметрически и по возрастанию общей активности (рис. 4). Определено количество акриламида, образующегося в результате трансформации НАК биомассой R. ruber gt1, выросшей на сорбентах в течение 7-и суток культивирования (рис. 4). Установлено, что биомасса на активных дробленых и гранулированных углях, угле – сырце и ткани «Урал» образует в результате 10-минутной конверсии 1,3 М раствора НАК больше акриламида, чем 7-и суточная суспензия клеток. Таким образом, очевидно, что при адсорбции на широкопористых носителях создаются благоприятные условия для роста бактерий. 13 Таблица 3. Рост штамма R. ruber gt1 в жидкой фазе в присутствии углеродных сорбентов Время роста, ч 4 Носитель 24 48 72 96 ОП540 ЕД ОП540 ЕД ОП540 ЕД ОП540 ЕД ОП540 ЕД Суспензия клеток 0,022 165 0,094 162 0,616 123 0,760 126 0,784 163 БАУ 0,006 23 0,018 14 0,04 37 0,044 75 0,058 92 NORIT PK 1-3 0,004 9 0,067 9 0,102 9 0,124 28 0,072 35 ФТД 0,007 0 0,041 0 0,217 34 0,260 83 0,260 64 угольсырец 0,002 0 0,005 0 0,166 5 0,272 36 0,112 14 «Урал» 0,002 0 0 0 0 0 0 0 0 0 «Войлок» 0,001 0 0 0 0 0 0 0 0 0 ФАС 0,023 46 0,054 106 0,228 219 0,196 209 0,036 279 ЕД – нитрилгидратазная активность среды культивирования, мкмоль амида/мг сухих клеток/мин. % 160 120 80 40 0 1 2 3 4 5 6 7 Рис. 4. Общая активность биомассы R. ruber gt1, полученной на углеродных носителях в течение 7-и суток роста. 1 – БАУ, 2 – NORIT PK 1-3, 3 – ФТД, 4 – уголь-сырец, 5 – «Урал», 6 – «Войлок», 7 – ФАС. 100% - нитрилгидратазная активность 7-и суточной суспензии клеток. 14 Нитрилгидратазная активность и операционная стабильность биокатализатора, иммобилизованного на углеродных сорбентах. Определена нитрилгидратазная активность клеток родококков, иммобилизованных на углеродных носителях. Установлено, что скорость нитрилгидратазной реакции, равная максимальной для интактных клеток, у иммобилизованных на углеродных сорбентах родококков достигается при возрастании концентрации субстрата до 0,8–1,3 М. При высоких концентрациях субстрата нитрилгидратазная активность клеток, адсорбционно иммобилизованных на активных углях и новых углеродсодержащих носителях, превышает на 20-40% ее максимальное значение у интактных клеток. С целью оценки операционной стабильности клеток R. ruber gt1 и R. erythropolis 84 проведены повторные циклы полной трансформации 13 ммоль акрилонитрила (концентрация раствора - 10 %). Оказалось, что нитрилгидратазная активность суспензии клеток R. ruber gt1 уже во втором цикле реакций снижается в два раза, а к 6-му циклу остается менее 10 % первоначальной активности (рис. 5А). % % 100 100 80 80 60 60 40 40 20 20 0 0 1 2 3 4 5 6 7 Количество циклов 1 2 3 4 5 6 Количество циклов А Б Рис. 5. Полная конверсия 10%-ного (объем/объем) НАК суспензией клеток А - R. ruber gt1, Б - R. erythropolis 84. 100% - исходная нитрилгидратазная активность клеточной суспензии. В то же время, нитрилгидратазная активность суспензии клеток R. erythropolis 84 уже ко 2-му циклу составила лишь 10% от первоначальной активности (рис. 5Б). Более низкая операционная стабильность нитрилгидратазы клеток R. erythropolis 84, повидимому, связана с ее меньшей термостабильностью у этого штамма (Кузнецова, 2004) и быстрой инактивацией при экзотермической реакции гидролиза нитрила. 15 Определено влияние адсорбционной иммобилизации клеток на операционную стабильность внутриклеточной нитрилгидратазы при повторных циклах полной конверсии 10 %-ного (об./об.) раствора НАК (рис. 6). % 100 % 100 80 80 60 60 40 40 20 0 1 2 3 4 5 1 20 2 3 0 6 7 8 9 10 Количество циклов 6 5 4 7 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Количество циклов Рис. 6. Операционная стабильность биокатализатора, иммобилизованного на углеродных сорбентах. 1 – уголь-сырец, 2 – БАУ, 3 – «Войлок», 4 - NORIT PK 1-3, 5 – ФТД, 6 – «Урал», 7 – ФАС. 100% - исходная нитрилгидратазная активность адсорбированных клеток. Показано, что клетки R. ruber gt1, адсорбированные на волокнистых углеродных материалах, начинают терять свою активность после прохождения пяти циклов реакции. Биокатализатор, иммобилизованный на БАУ, ФТД и ФАС сохраняет первоначальную активность на протяжении 6 циклов, а на угле-сырце и NORIT PK 1-3 – на протяжении 7 циклов реакций. При конверсии акрилонитрила адсорбционно иммобилизованными клетками R. erythropolis 84 подобного сохранения нитрилгидратазной активности не наблюдалось. Однако нитрилгидратазная активность адсорбированных клеток в биокаталитическом процессе была несколько более стабильной, чем у клеток в суспензии: ко второму циклу регистрировали 30% остаточной активности, тогда как в суспензии – лишь 10%. Сохранение активности в повторных циклах трансформации НАК при более высоких его концентрациях, по сравнению с технологическими, может объясняться защитным действием активных углей. Вероятно, оно проявляется не столько в адсорбции части токсичного субстрата, сколько в отведении (вследствие разности теплопроводности носителя и водной фазы) от клеток избыточного тепла, выделяющегося в результате экзотермической реакции трансформации нитрила, тепловой выход которой составляет 18-19 ккал/моль (Аликин, 1999). 16 Скорость нитрилгидратазной реакции, катализируемой клетками родококков, включенными в гели альгината бария, κ-каррагинана и агара. Показано, что каталитическая активность клеток родококков при иммобилизации включением в гранулы гелей альгината бария, κ-каррагинана и агара, резко падает. % 12 10 8 6 4 2 0 0 Рис. 7. 0.25 Скорость 0.5 0.75 1 1.25 1.5 Концентрация НАК, М нитрилгидратазной реакции, катализируемой клетками R. ruber gt1, иммобилизованными включением в гель альгината бария. 100% - нитрилгидратазная активность клеток в суспензии. Так, при возрастании концентрации НАК до 0,3 М скорость нитрилгидратазной реакции, катализируемой клетками R. ruber gt1, иммобилизованными в геле альгината бария, увеличивалась, а при дальнейшем повышении концентрации оставалась на уровне, не превышающем 11% максимальной активности клеток в суспензии (рис. 7). Очевидно, что снижение скорости нитрилгидратазной реакции при включении клеток в гели связано с затруднением массообмена в порах геля. Иммобилизация клеток актинобактерий рода Rhodococcus ковалентным и металлохелатным способами. Определено количество клеток, иммобилизованных методами связывания с силикагелем, активированным хлоридом хрома (III); с полиамидом, активированным глутаральдегидом и с гидрооксидом титана (IV), в грамме носителя. Установлено, что наибольшей сорбционной емкостью по отношению к клеткам обладает гидрооксид титана (IV), который может связать до 200 мг бактерий (по сухому весу), а наименьшей – активированный хлоридом хрома силикагель (табл. 4). В то же время, клетки, ковалентно связанные с активированным силикагелем, сохраняют до 75% исходной нитрилгидратазной активности, тогда как хелатированные гидрооксидом титана – не более 62%, а связанные с активированным полиамидом – не более 40%. 17 Таблица 4. Сорбционная емкость активированных носителей по отношению к клеткам и нитрилгидратазная активность родококков при ковалентном связывании Сохранение активности, % Носитель Силикагель, активированный хлоридом хрома (III) 40/100 мкм* 65,0±9,2 0,26±0,02 100/250 мкм* 60,8±5,6 0,23±0,01 52,2±10,3 200 1,5%** 29,0 ± 0,8 9,9±0,5 2,5%** 26,5 ± 1,0 29,0±3,5 5%** 35,0 ± 3,9 29,0±3,5 12,5%** 32,6 ± 5,9 29,0±3,5 Гидрооксид титана (IV) Полиамид, активированный глутаральдегидом Сорбционная емкость, мг/г * - размер гранул силикагеля ** - концентрация раствора глутаральдегида (вес/объем) Определена операционная стабильность клеток, иммобилизованных ковалентным и металлохелатным способами. Клетки, иммобилизованные методом ковалентного связывания на активированном силикагеле, не теряли нитрилгидратазную активность в течение 5 циклов последовательных ферментативных реакций (рис.8). Затем активность резко снижалась и к 8-му циклу составляла 6-9% от исходной. Однако, при иммобилизации бактерий на гидрооксиде титана (IV) не было обнаружено существенной стабилизации нитрилгидратазной активности клеток (рис.9): уже во 2-м цикле она составляла лишь 50% от первоначальной, а в 4-м цикле – около 20%. Изучена операционная стабильность клеток, иммобилизованных на полиамиде, активированном 12,5% глутаральдегидом, с дофиксацией 0,1% глутаральдегидом и без дофиксации (рис. 10). Показано, что иммобилизованные клетки, дофиксированные 0,1% раствором глутаральдегида, в течение 5 циклов полной конверсии 10% раствора акрилонитрила сохраняют активность на более высоком уровне, чем не подвергнутые дофиксации. Так, во втором цикле у дофиксированных клеток сохранялось 83% нитрилгидратазной активности, а у иммобилизованных без дофиксации – 37%, к третьему циклу оставалось 33% и 8%, а к шестому – 7% и 1%, соответственно. 18 % 100 % 100 80 80 60 60 40 40 20 20 1 2 0 1 2 3 4 5 6 7 0 1 8 2 3 4 Количество циклов Количество циклов Рис. 8. Операционная стабильность клеток R. ruber gt1, иммобилизованных на активированном силикагеле. 1 – силикагель с зернистостью 40/100 мкм, 2 – силикагель с зернистостью 100/250 мкм Рис. 9. Операционная стабильность клеток R. ruber gt1, хелатированных гидрооксидом титана (IV). 100 % - исходная нитрилгидратазная активность иммобилизованных клеток. % 100 80 60 40 20 1 2 0 1 2 3 4 5 6 Количество циклов Рис. 10. Операционная стабильность клеток R. ruber gt1, иммобилизованных на активированном 12,5% глутаральдегидом полиамиде. 1 – иммобилизованные клетки дофиксированы 0,1% глутаральдегидом, 2 – иммобилизованные клетки без дофиксации. 100% - исходная нитрилгидратазная активность иммобилизованных клеток. 19 В результате проведенных исследований установлено, что клетки R. ruber и R. erythropolis, обладающие нитрилгидратазной активностью, эффективно адсорбируются и прочно удерживаются на углеродных носителях. Адсорбция на пористых и волокнистых углях и углеродсодержащих материалах не снижает, а стабилизирует нитрилгидратазную активность клеток при воздействии повышенной температуры и высоких концентраций токсичного субстрата, а также обеспечивает возможность многократного использования биокатализатора. Таким образом, адсорбция на углеродных носителях представляется наиболее перспективным способом иммобилизации клеток Rhodococcus для использования в микробиологических и биохимических исследованиях, а также в промышленной микробиологии. При сравнении иммобилизованных клеток R. ruber gt1 и R. erythropolis 84 установлено, что преимущества адсорбционной иммобилизации более выражены для штамма R. ruber gt1, нитрилгидратаза которого обладает большей термостабильностью и удельной активностью, чем нитрилгидратаза R. erythropolis 84. Таким образом, адсорбционно иммобилизованные клетки штамма R. ruber gt1 представляют собой высокоактивный и стабильный биокатализатор и могут быть рекомендованы к использованию при разработке процесса биотехнологического синтеза акриламида. 20 ВЫВОДЫ 1. Показано, что адсорбционное взаимодействие обеспечивает эффективное связывание клеток с пористыми и волокнистыми углеродными носителями (от 6 до 15 мг клеток родококков на 1 г носителя в пересчете на сухой вес), при этом адсорбция клеток возрастает с увеличением доли макропор в структуре носителя, дисперсности и шероховатости его поверхности. 2. Установлено, что нитрилгидратазная активность адсорбционно иммобилизованных клеток R. ruber gt1 и R. erythropolis 84 сохраняется на уровне активности клеток в суспензии, а при повышении концентрации субстрата до 1,3 М превышает ее в 1,2-2,8 раза. 3. Обнаружено, что включение клеток родококков в ионотропные и термотропные гели ведет к значительному снижению скорости нитрилгидратазной реакции (от 3 до 11% от исходной), а включение в ковалентносвязанные полиакриламидные гели вызывает ее подавление (остаточная активность иммобилизованных клеток - 0,2%). 4. Определено, что металлохелатная иммобилизация на гидрооксиде титана обеспечивает связывание большого количества биомассы - до 200 мг сухих клеток на 1 г носителя, при сохранении нитрилгидратазной активности до 62% от исходной. При ковалентном присоединении клеток нитрилгидратазная активность также снижается и не превышает 70% активности клеток в суспензии. 5. Установлено, что операционная стабильность нитрилгидратазы иммобилизованных клеток, определяемая возможностью многократной полной трансформации 13 ммоль НАК, выше у клеток родококков, адсорбированных на активных углях, чем у иммобилизованных методами включения в гель, а также хелатирования ионами металлов и ковалентного присоединения. 6. Выявлено, что операционная стабильность нитрилгидратазы адсорбционно иммобилизованных клеток штамма R. ruber gt1 выше, чем R. erythropolis 84. 21 Список основных работ, опубликованных по теме диссертации 1. Максимов А.Ю., Кузнецова М.В., Овечкина Г.В., Козлов С.В., Максимова Ю.Г., Демаков В.А.. Влияние нитрилов и амидов на рост и нитрилгидратазную активность штамма Rhodococcus sp. gt1//Прикладная биохимия и микробиология. - 2003. - Т. 39, N. 1. - С. 63-68. 2. Демаков В.А., Максимов А.Ю., Кузнецова М.В., Овечкина Г.В., Козлов С.В., Ремезовская Н.Б., Максимова Ю.Г. Штамм бактерий Rhodococcus erythropolis – продуцент нитрилгидратазы". Патент на изобретение РФ № 2196822. Приоритет от 25.07.2001. Зарегистрир. в Госреестре изобр. 20.01.03. 3. Максимова Ю.Г., Кузнецова М.В., Овечкина Г.В., Ремезовская Н.Б., Максимов А.Ю. Влияние иммобилизации клеток штамма Rhodococcus sp.gt1 на активность нитрилгидратазы//Биология наука XXI века: Матер. 7-й Пущинской конф. молодых ученых. - Пущино, 2003. - С. 115. 4. Максимова Ю.Г., Ремезовская Н.Б., Максимов А.Ю. Иммобилизация клеток бактерий рода Rhodococcus, обладающих нитрилгидратазной активностью//В кн.: Экология: проблемы и пути решения. - Пермь: ПГУ, 2003. - С. 124-127. 5. Демаков В.А., Максимов А.Ю., Кузнецова М.В., Козлов С.В., Овечкина Г.В., Максимова Ю.Г., Ремезовская Н.Б., Гусев В.А. Биоконверсия нитрилов штаммамипродуцентами нитрилгидролизующих ферментов//Биотехнология: состояние и перспективы развития: Матер. II Московского междунар. конгресса. - М., 2003. - С. 279. 6. Максимова Ю.Г., Кузнецова М.В., Козлов С.В., Максимов А.Ю. Влияние различных способов иммобилизации на нитрилгидратазную активность штамма Rhodococcus sp. gt1//В кн.: Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии. - Пермь, 2004. - С. 93-101. 7. Максимова Ю.Г., Кузнецова М.В., Козлов С.В., Максимов А.Ю, Олонцев В.Ф., Демаков В.А. Углеродные сорбенты как носители для иммобилизации бактерий – продуцентов нитрилгидратаз//Сорбенты как фактор качества жизни и здоровья: Матер. Всеросс. научной конф. с международным участием. - Белгород, 2004. - С. 93-96. 8. Максимова Ю.Г., Кузнецова М.В., Максимов А.Ю., Демаков В.А. Операционная стабильность биокатализатора на основе R. ruber gt1, иммобилизованного включением в гель//Биотехнология микробов: Всеросс. симпозиум с международным участием. - М., 2004. - С. 61. 9. Максимова Ю.Г., Кузнецова М.В., Козлов С.В., Максимов А.Ю., Овечкина Г.В., Демаков В.А. Биокатализатор на основе нитрилгидратазного штамма Rhodococcus sp.gt1, иммобилизованного на различных носителях.//Биология - наука XXI века: Матер. 8-й Пущинской конф. молодых ученых. - Пущино, 2004. - С. 269. 10. Кузнецова М.В., Максимов А.Ю., Максимова Ю.Г., Козлов С.В., 22 Овечкина Г.В., Демаков В.А. Конверсия нитрилов карбоновых кислот штаммами R. erythropolis 84 и R. ruber gt1 – продуцентами нитрилгидратаз//Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии: Матер. Междунар. конф. Минск, 2004. - С. 302-303. 11. Demakov V.A., Maksimov A.Yu., Kuznetsova M.V., Kozlov S.V., Maksimova Yu.G., Ovechkina G.V., Remezovskaya N.B., Gusev V.A. Nitrile bioconversion by strains producing nitrile hydrolyzing enzymes//Biotechnology and Industry. - 2004. - P. 1-7. 12. Максимова Ю.Г. Сравнительный анализ и оценка различных способов иммобилизации штамма Rhodococcus ruber gt1 – продуцента нитрилгидратазы// Биотехнология: состояние и перспективы развития: Матер. III Московского междунар. конгресса. - М., 2005. - С. 199-200. 13. Максимова Ю.Г., Коваленко Г.А., Максимов А.Ю., Овечкина Г.В., Демаков В.А. Иммобилизация клеток Rhodococcus ruber gt1, обладающих нитрилгидратазной активностью, на углеродсодержащих носителях//Там же. - С. 13. 14. Максимова Ю.Г., Максимов А.Ю., Демаков В.А. Сравнение различных способов иммобилизации штамма Rhodococcus ruber gt1 – продуцента нитрилгидратазы//Биология - наука XXI века: Матер. 9-й Пущинской конф. молодых ученых. - Пущино, 2005. - С. 355. 15. Максимова Ю.Г., Максимов А.Ю., Демаков В.А. Влияние различных способов иммобилизации на нитрилгидратазную активность штамма Rhodococcus ruber gt1//Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биотехнологический потенциал: Матер. II Междунар. конф. - Пермь, 2005. - С. 61-62. 16. Максимова Ю.Г., Максимов А.Ю., Демаков В.А. Влияние повышенной температуры на иммобилизованные клетки штамма Rhodococcus ruber gt1, обладающего нитрилгидратазой//Биология - наука XXI века: Матер. 10-й Пущинской конф. молодых ученых. - Пущино, 2006. - C. 383. 17. Максимов А.Ю., Кузнецова М.В., Максимова Ю.Г., Ремезовская Н.Б., Демаков В.А. Биотрансформация нитрилов и эфиров карбоновых кислот//Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии: Матер. Междунар. науч. конф. - Минск, 2006. - С. 362-365. 18. Максимова Ю.Г., Максимов А.Ю., Демаков В.А. Иммобилизация бактерий, гидратирующих нитрилы//Микробные биотехнологии: Матер. Междунар. научн. конф. Одесса, 2006. - С. 194.
