Милушева Р.Ю., Воропаева Н.Л., Рубан И.Н., Рашидова С.Ш

ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОЦЕССА ИЗВЛЕЧЕНИЯ ХИТИНА
ИЗ ГРИБОВ PLEUROTUS OSTREATUS
Р.Ю. Милушева, Н.Л. Воропаева, И.Н. Рубан, С.Ш. Рашидова
Институт физики и химии полимеров Академии наук
Республики Узбекистан, ул. Абдулла Кодирий, 7б, Ташкент
(Республика Узбекистан) e-mail: polymer@online.ru
Использование
хитина
и
хитозана
для
создания
биодеградабельных полимеров, способных легко разрушаться и
усваиваться
микроорганизмами,
представляет,
несомненно,
технологический интерес, вызванный переходом от нефтехимического
к биохимическим производствам. С этой точки зрения использование
хитина в полимерных композициях, в которых он может выступать как
многофункциональный компонент, оправдано и перспективно.
Увеличивающиеся с каждым годом объемы мирового
производства хитина и хитозана обусловливают необходимость
решения вопроса о расширении сырьевых источников получения этих
биополимеров.
Одним из источников получения хитина – природного
аминополисахарида, помимо переработки отходов продуктов моря,
является получение его из клеточных стенок грибов. Содержание
хитина в некоторых видах грибов (например, Streptomyces sp., Agaricus
bisporus и др.) достигает 40%.
Объектами исследования для выделения хитина являются
совершенные грибы Pleurotus ostreatus. Из всех групп организмов,
продуцирующих хитин, грибы обладают самой высокой скоростью
роста. По потенциальной биологической продуктивности грибы
превосходят ракообразных в тысячи раз.
Возросший в последние годы интерес к хитину можно объяснить
следующими причинами. Оказалось, что хитин придает клеточной
стенке грибов особые и очень важные свойства, а синтез этого
полимера является одним из контрольных механизмов, определяющих
направление морфогенеза у грибов. Поэтому очень важны
исследования, посвященные разработке способов получения хитина из
грибов, так как в настоящее время панцири крабов стали дефицитным
сырьем.
91
В последние годы для получения хитина и его производных
предложено использовать отходы ряда микробиологических
производств, например мицелий А. niger, оставшийся после выделения
из культуральной жидкости лимонной кислоты. Установлено, что
получение производных хитина с использованием этого сырья является
экономически выгодным процессом.
Хитин из грибов выделяют методами, сходными с теми, которые
используют для получения хитина из панцирей членистоногих.
Основой этих методов является обработка: 1) 2 н кислотой при
комнатной температуре от 5 до 24 ч; 2) щелочными растворами при
кипячении; 3) перманганатом с последующей щелочной обработкой;
4) перекисью водорода или NaHSO4; 5) растворителями (этанолом,
серным эфиром, хлороформом); 6) 2-хлорэтанолом в комбинации с
растворами некоторых кислот. Обычно используют различные
комбинации указанных выше процедур.
Клеточная стенка грибов отличается по составу от наружного
покрова (панциря) членистоногих. Эти отличия касаются прежде всего
количественного содержания кальция, которого значительно меньше в
клеточной стенке грибов. Кроме хитина, эта структура содержит также
и другие полисахариды, которых нет в панцире крабов, например
гетерополисахарид мукоран. Различия в составе клеточной стенки
грибов и членистоногих привели поэтому к некоторой модификации
методов выделения хитина у микроорганизмов.
С этой целью используют более слабые растворы кислот, но
обработку этими реагентами ведут при температуре около 100°.
Широко распространены также методы, которые включают
обработку клеточных стенок 2 н щелочью в течение 12–24 ч при
комнатной температуре с последующей обработкой при нагревании 1 н
H2SO4. В дальнейшем фрагменты клеточных стенок обрабатывают еще
раз 2 н щелочью для выделения хитина. Согласно другим методам
после обработки кислотами и щелочами клеточные стенки
выдерживают в среде растворителей (ацетоне, хлороформе, спирте).
Нами для выделения хитина использовались совершенные грибы
Pleurotus ostreatus. Для получения грибного мицелия и плодового тела
гриба Pleurotus ostreatus – продуцента хитина – проводилась очистка
гриба от старых спор путем естественного отбора и высева в
агаризованную среду в чашки Петри. Были отобраны активные
92
колонии и перенесены в среду Чапека. В качестве питательной среды
использовали жом хлопчатника и древесные опилки.
Выделение хитина
Ход анализа. Фиксация исследуемого материала: навеска
биомассы гриба отделяется от питательной среды (жом хлопчатника),
промывается водой, спиртом и высушивается. Далее навеска биомассы
растирается в присутствии небольшого количества ацетона, смывается
ацетоном и оставляется на 2 суток в холодильнике, ацетон за это время
дважды декантируется, затем отфильтровывается. Биомасса сушится в
вакуумном эксикаторе над СаСl2 и растирается в порошок. При
наличии в биомассе больших количеств жира производится экстракция
его эфиром. До постоянного веса исследуемый материал доводится в
сушильном шкафу.
Депротеинизация экстрагированного материала проводится в 5%
растворе NаОН в течение 5–8 ч для разрушения белка. Навеска
биомассы тщательно отмывается от щелочи водой до нейтральной
реакции. Затем проводится кислотный гидролиз 0,1 н HCI в течение 5–
6 ч (декальцинирование). Навеска промывается водой, и образец
очищается от пигментов (каратиноидов) 0,2% раствором KMnO4 и
Н2О2.
Процесс выделения хитина из грибов Pleurotus ostreatus не
требует сложного аппаратурного оформления, не связан с применением
концентрированных реагентов (как это происходит при выделении
хитина из панцирей ракообразных), нет большого количества отходных
растворов (маточные кислотные и щелочные растворы, содержащие
хлористый кальций и белок; концентрированные растворы щелочи и
промывные воды).
Изучена кинетика формирования хитина, выделяемого из
совершенных грибов Pleurotus ostreatus, выращенных на различных
питательных средах. Установлено, что выход хитина находится в
зависимости от сроков вегетации гриба. На основании данных
структурных исследований показано, что устойчивое формирование
хитина в матриксе начинается через 50 дней с начала вегетации гриба.
Установлено, что хитины, выделяемые из грибов Pleurotus ostreatus,
обладают биологической активностью и стимулируют рост и развитие
хлопчатника. Это проявляется в увеличении энергии прорастания,
лабораторной и полевой всхожести, темпов появления всходов по
сравнению с контролем.
93