АССОЦИАТИВНЫЕ БАКТЕРИИ AGROBACTERIUM
реклама
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ – МСХА ИМЕНИ К.А. ТИМИРЯЗЕВА На правах рукописи ФУНГ ТХИ МИ АССОЦИАТИВНЫЕ БАКТЕРИИ AGROBACTERIUM TUMEFACIENS РИЗОПЛАНЫ ОВОЩНЫХ КУЛЬТУР ВЬЕТНАМА Специальность 03.02.03 ‒ Микробиологии ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель ‒ доктор биологических наук, профессор Емцев Всеволод Тихонович Москва – 2015 2 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ…………………………………………………………...….. ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ …...……………..…………..…..... 1.1. Взаимодействие ассоциативных бактерий с высшими растениями ………....................................................................................... 1.1.1. Роль высших растений в бактериально-растительном ассоциативном взаимодействии ....…………............................................ 1.1.2. Роль ассоциативных бактерий в бактериально-растительном ассоциативном взаимодействии …………..………..…………..……. 1.1.3. Этапы формирования бактериально-растительного ассоциативного взаимодействия….…..…………..………..……….. 1.2. Ассоциативная азотфиксация в различных биоклиматических зонах………..………..………..………………..………..………..……… 1.3. Морфологические и физиолого – биохимические особенности ассоциативных азотфиксаторов………..………..………………..…… 1.4. Биопрепараты на основе ассоциативных азотфиксирующих бактерий………..………………..……………..………………..………… ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ, ХАРАКТЕРИСТИКА РАСТЕНИЙ И МЕТОДЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В ОПЫТЕ ……………………….… 2.1. Объекты …………………………………...…….…………...……… 2.2. Характеристика растений, используемых в опытах ………….…… 2.3. Методы …………………………………..…………….…………… 2.3.1. Метод отбора проб корней, проведенный во Вьетнаме и получения накопительных культур ………………………………..…..... 2.3.2. Метод выделения чистых культур……………………………… 2.3.3. Метод опредедения нитрогеназной активности накопительных культур и чистых культур…………………………….………………… 2.3.4. Метод определения ростактивирующего эффекта чистых культур.. …………………………….…………………………….…… 2.3.5. Метод определения влияния чистых культур на рост, массу стеблья, нитрогеназную активность растения и нитрогеназную активность на корнях растения в модельном опыте…………………… 5 11 11 12 14 19 22 27 35 40 40 40 41 41 42 42 43 43 3 2.3.6. Метод определения морфологических и физиологобиохимических особенности отобранных культур…………………… 2.3.6.1. Метод диагностики способности образования 3-кетолактозы 2.3.6.2. Метод диагностики способности образования кислоты из глюкозы…………………………………………………………………… 2.3.6.3. Метод определения способности образования оксидазы…… 2.3.6.4. Метод наблюдения способности подкисления среды при использовании этанола…………………………………………………… 2.3.7. Метод определения филогенетического положения выделенных микроорганизмов………………………………………………………… 2.3.8. Определение влияния разных штаммов Agrobacterium tumefaciens на урожай растения в мелкоделяночном опыте в условиях теплицы……................................................................................ 2.3.9. Статическая обработка полученных данных…………………… ГЛАВА 3. ИЗУЧЕНИЕ НИТРОГЕНАЗНОЙ АКТИВНОСТИ НАКОПИТЕЛЬНЫХ КУЛЬТУР И ВЫДЕЛЕННЫХ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР …………………………………………………………….. 3.1. Изучение нитрогеназной активности накопительных культур ..... 3.2. Изучение нитрогеназной активности чистых культур …………… ГЛАВА 4. ИЗУЧЕНИЕ РОСТОВОГО ЭФФЕКТА ЧИСТЫХ АССОЦИАТИВНЫХ АЗОТФИКСАТОРОВ ……………………… ГЛАВА 5. ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ЧИСТЫХ АССОЦИАТИВНЫХ АЗОТФИКСАТОРОВ НА НИТРОГЕНАЗНУЮ СПОСОБНОСТЬ, РОСТ И РАЗВИТИЕ ОГУРЦА И РАЗНОЛИСТНОЙ КАПУСТЫ В МОДЕЛЬНОМ ОПЫТЕ………………….………………….……………. 5.1. Влияние чистых культур на растения огурца в модельных опытах……………....................................................................................... 5.2. Влияние чистых культур на растения разнолистной капусты в модельных опытах…………………………………………………… ГЛАВА 6. МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ, ФИЗИОЛОГОБИОХИМИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ВЫДЕЛЕННЫХ ЧИСТЫХ АССОЦИАТИВНЫХ АЗОТФИКСАТОРОВ…………………………… ГЛАВА 7. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКОГО ПОЛОЖЕНИЯ ВЫДЕЛЕННЫХ ЧИСТЫХ АССОЦИАТИВНЫХ АЗОТФИКСАТОРОВ…………………………………………………… 45 46 47 47 47 47 48 50 51 51 53 58 64 64 66 69 74 4 ГЛАВА 8. ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ РАЗНЫХ ШТАММОВ AGROBACTERIUM TUMEFACIENS НА УРОЖАЙ ОГУРЦА И РАЗНОЛИСТНОЙ КАПУСТЫ В МЕЛКОДЕЛЯНОЧНОМ ОПЫТЕ В УСЛОВИЯХ ТЕПЛИЦЫ……………………………… 77 8.1. Влияние разных штаммов Agrobacterium tumefaciens на урожай огурца в мелкоделяночном опыте…………………………………… 78 8.1.1. Влияние разных штаммов Agrobacterium tumefaciens на рост огурца…….................................................................................................... 78 8.1.2. Влияние разных штаммов Agrobacterium tumefaciens на нитрогеназную активность на корнях огурцы……………………… 80 8.1.3. Влияние разных штаммов Agrobacterium tumefaciens на содержание нитратов в плодах и общего азота в листьях огурца…… 82 8.2. Влияние разных штаммов Agrobacterium tumefaciens на урожай разнолистной капусты в мелкоделяночном опыте…………………… 84 8.2.1. Влияние разных штаммов Agrobacterium tumefaciens на массу стебля и нитрогеназную активность на корнях разнолистной капусты после 2 недель выращивания………........................................................... 84 8.2.2. Влияние разных штаммов Agrobacterium tumefaciens на урожай, содержание общего азота и нитратов в товарной продукции разнолистной капусты………………….................................................... 85 ВЫВОДЫ..………………………………………………..…………… 88 БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ……..………………………………………………..…. 90 ПРИЛОЖЕНИЕ..……………………………………………………… 112 5 ВВЕДЕНИЕ В последние десятилетия число исследований, посвященных ассоциативным азотфиксирующим бактериям, существенно выросло, так как эти бактерии, обитая на корнях растений, улучшают их азотное питание, а также обеспечивают защиту от фитопатогенов, чем способствуют адаптации растений к стрессовым факторам. Во Вьетнаме микробиологические удобрения изучаются с 60-х годов. Однако объѐм производства микробных удобрений во Вьетнаме все еще не достаточен для удовлетворения практических потребностей сельского хозяйства. Поэтому особое внимание уделяется поиску новых культур микроорганизмов, перспективных для создания новых биопрепаратов, полученных на основе ассоциативных бактерий, способных расти на корнях растений и обеспечивать их атмосферным азотом. К ассоциативным бактериям относят представителей таких родов, как Azospirillum, Enterobacter, Erwinia, Serratia, Alcaligenes, Arthobacter, Acinetobacter, Flavobacterium и Agrobacterium и др. С момента открытия известно, что Agrobacterium tumefaciens является возбудителем корневого рака (Smith, Townsend, 1907), и что эти организмы являются патогенными для растений (El-Fiki, Giles, 1981). Их патогенность обусловлена наличием Ti-плазмиды, которая способна встраиваться в ядерную ДНК растительных клеток, вызывая их неупорядоченный рост и неконтролируемый синтез опинов, которые служат источником питания для бактерий. Уникальная способность A. tumefaciens трансформировать геном растений в настоящее время широко используется в генной инженерии (Wood, 2001). Это направление исследований приковало к себе внимание ученых, тогда как работ в области экологии A. tumefaciens на данный момент проведено недостаточно. В 1990 году Л. Канвинде и Г.Р.К. Састри показали, что A. tumefaciens может фиксировать атмосферный азот (Kanvinde, Sastry, 1990), 6 однако систематических исследований по изучению потенциала A. tumefaciens как азотфиксатора с тех пор не проводилось. Следовательно, изучение этого организма, обитающего в ризоплане растений, является в настоящий момент интересным и практически важным. Данная работа была проделана на образцах из Вьетнама, где давно проводятся исследования по выделению бактерий из ризопланы риса, арахиса, кофе, кукурузы и др. Однако изучение азотфиксаторов в ризоплане овощных культур ранее здесь не проводилось, в связи с чем, исследования в данной области представляется нам актуальными. Цель работы состоит в исследовании бактериального населения ризопланы таких овощных культур как водяной шпинат (Ipomoea aquatica) и разнолистная капуста (Brassica integrifolia), выращиваемых в условиях Вьетнама, а также поиск наиболее активных ассоциативных азотфиксаторов, оказывающих наибольшее стимулирующее влияние на развитие культурных растений. Такие микроорганизмы перспективны в плане использования их для создания бактериальных удобрений. Для релизации поставленой цели в ходе исследования решались следующие задачи: 1. Отобрать образцы корней овощных культур Ipomoea aquatica и Brassica integrifolia, выращиваемых на почвах Вьетнама. 2. Получить накопительные культуры азотфиксирующих бактерий из ризопланы овощных культур Ipomoea aquatica и Brassica integrifolia. 3. Определить азотфиксирующую активность полученных накопительных культур. 4. Выделить чистые культуры диазотрофов из накопительных культур, которые показали наиболее высокую азотфиксирующую активность. 5. Провести сравнительную полученных чистых культур. оценку азотфиксирующей активности 7 6. Определить ростактивирующий эффект чистых культур ассоциативных диазотрофов, показавщих наиболее высокую азотфиксирующую активность. 7. Исследовать влияние чистых культур ассоциативных диазотрофов, показавщих наиболее высокий ростактивирующий эффект, на растение (огурец и разнолистная капуста) в условиях модельного опыта. 8. Изучить морфологические и физиолого-биохимические особенности выделенных чистых культур ассоциативных азотфиксаторов, показавщих самое хорошое влияние на растения в модельном опыте. 9. Определить филогенетическое положение выделенных чистых ассоциативных азотфиксаторов. 10. Изучить влияние азотфиксаторов на разных урожай чистых огурца и культур ассоциативных разнолистной капусты в мелкоделяночном опыте в условиях теплицы. Научная новизна исследования Впервые выделены культуры азотфиксирующих бактерий из ризопланы овощных растений северного Вьетнама. Изучение нитрогеназной активности полученных изолятов показало, что 227 выделенные культуры обладают данной способностью, причем многие штаммы этих бактерий характеризуются довольно высоким уровнем связывания азота. Культуры не только проявляли азотфиксирующую активность, но и оказывали положительный ростовой эффект на растения в условиях модельных и вегетационных опытов, причем инокуляция ими не вызывала изменения обыкновенной структуры корней растений. Определение филогенетического положения выделенных штаммов на основании секвенирования гена 16S рРНК показало, что они принадлежат к семейству Rhizobiaceae филогенетической группы Alphaproteobacteria и наиболее близки к типовому штамму рода Agrobacterium – A. tumefaciens. По физиолого-биохимическим признакам эти организмы также отнесены к A. tumefaciens. Выделенные нами 8 штаммы данного вида бактерий, известного как фитопатоген, выступают в качестве ассоциативных азотфиксаторов и, более того, оказывают положительный эффект на рост и развитие сельскохозяйственных культур. Основные положения диссертации, выносимые на защиту 1. Среди ассоциативных азотфиксирующих бактерий в ризоплане тропических овощных культур водяного шпината (Ipomoea aquatica) и разнолистной капусты (Brassica integrifolia) наибольшей активностью обладают представители семейства Rhizobiaceae, отнесенные на основании анализа нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК и физиологобиохимических особенностей к Agrobacterium tumefaciens. 2. Штаммы Agrobacterium tumefaciens, известного как фитопатоген, выделенные из ризопланы разнолистной капусты и водяного шпината, выступают в качестве ассоциативных азотфиксаторов и оказывают положительный эффект на рост и развитие культурных растений. 3. Положительное влияние Agrobacterium tumefaciens на разнолистную капусту и огурцы, установленное в условиях модельных срерильных опытов и опытов в производственных условиях, обусловлено улучшением азотного питания растений и способностью к биосинтезу регуляторов роста. Практическая значимость Полученные результаты исследований показали, что ассоциативные бактерии Agrobacterium tumefaciens являются весьма перспективными для создания новых высокоактивных биопрепаратов, полученных на основе бактерий, способных расти на корнях растений и обеспечивать их атмосферным азотом, а также оказывать положительный ростовой эффект. Это весьма важно для Вьетнама, так как объем производства микробных удобрений во Вьетнаме все еще недостаточен для удовлетворения потребностей сельского хозяйства. 9 Результаты работы могут быть использовать в учебных курсах по микробиологии, биотехнологии и почвоведении в высших учебных заведениях. Личный вклад автора. В диссертации изложены результаты работ, выполненных автором в течение 3 лет. Личный вклад в диссертационную работу заключается в участии в постановке задач исследований, в проведении экспериментов, в обсуждении и обработке результатов, в формулировании основных выводов и подготовке публикаций. Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на следующих конференциях: XXI Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых ―Ломоносов – 2014‖ (7 – 11 апреля 2014). Международная научная конференция молодых учѐных и специалистов, посвящѐнная созданию объединѐнного аграрного вуза в Москве (3 - 4 июня 2014). Основные результаты и положения работы опубликованы 3 печатных работах, в том числе 2 статьях - в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ. Место проведения работы. Работа выполнена на кафедре микробиологии и иммунологии Российского государственного аграрного университета-МСХА имени К.А. Тимирязева. Определение активности фиксации азота и молекулярно-биологическая часть работы выполнялись на кафедре биологии почвы МГУ имени М.В.Ломоносова. Измерение общего содержания азота в листьях и содержание NO3- в урожае вегетационного опыта проводились на кафедре агрономической, биологической химии и радиологии Российского государственного аграрного университета МСХА имени К.А. Тимирязева. Вегетационный опыт проводился на базе ООО ―Селекционная станция имени Н.Н. Тимофеева‖. 10 Структура и объем работы. Диссертация изложена на 115 страницах и состоит из введения, 8 глав, включая обзор литературы; характеристику объектов и методы, используемые в опыте; анализ результатов исследований; выводы; список использованной литературы, приложение. Библиографический список включает 193 наименований, в том числе 125 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 6 таблицами и 40 рисунками. 11 ГЛАВА 1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Взаимодействие ассоциативных бактерий с высшими растениями Изучение взаимодействий растений и микроорганизмов – это одна из тех проблем, которая вызывает особенный интерес у многих исследователей, особенно биологов (Егоров, 2003; Кацы, 2003; Caballero-Mellado et al., 2004; Rosenblueth et al., 2004; Муратова и др., 2005). Можно перечислить различные формы взаимодействия микроорганизмов с высшими растениями, такие как паразитизм, симбиоз, ассоциация (взаимодействие с небобовыми растениями), антагонизм и др. В начале 70-х годов ХХ в. ученные выявили ассоциативную форму существования бактерий (Доберейнер, 1974, 1976). При паразитизме бактерии получают питание от растения, что для последних является отрицательным фактором. Ассоциативные бактерии тоже потребляют эксудаты растении, но в результате формирования ассоциативного взаимодействия, совместного развития и размножения на растениях, эти бактерии могут способствовать стимулированию роста, снабжению растений азотом и даже оказывать фитосанитарный и другие положительные эффекты на растения. Ассоциация и симбиоз – формы взаимоотношений, при которых бактерии могут находиться с растениями в синтрофных связях и, являясь взаимными партнерами, способствуют развитию друг друга. Различие между двумя типами отношений в том, что при симбиозе бактерии колонизируют ткани растений и те образуют специализированные структуры (например клубеньки), без которых бактерии не могут осуществлять метаболическую функцию. В случае ассоциативного симбиоза бактерии не образуют специализированных структур в растениях. В данном случае сами микроорганизмы формируют специфические бактериальные объединения, а в ряде случаев и структуры, с помощью которых они прикрепляются к поверхности листьев или корней, или 12 проникают во внутренние ткани (Каменева, Муромец, 1999). Поэтому, видимо, почти каждый орган растения является эконишей для ассоциативных бактерий (ризосфера, ризоплана, филлосфера и филлоплана). В 1904, Хилтнером было введено понятие «ризосфера». В настоящее время ризосферой считается пространство вокруг корня от 0 до 2-8 мм в диаметре (Нетрусов и др., 2004). Большинство ризосферных бактерий относится к грамотрицательным микроорганизмам (Добровольская, 2002). Под ризопланой обычно подразумевают поверхность корня, к которому непосредственно прикрепляются микроорганизмы. Многие микроорганизмы могут также колонизировать внутренние ткани корней растений, поэтому их называют эндофитными ризобактериями (Добровольская, 2003; Бирюкова, 2001; Колесников, 2012). Надо отмечить, что после проникновения бактерий во внутренние ткани растения, они могут, поданным ряда авторов, мигрировать в другой орган растений, например из корней в стебли и листья (Шелудько, 2010; Колесников, 2012). Филлосфера представляет собой пространство, окружающее надпочвенную часть растения, а поверхность надпочвенной части растения – это филлоплана (Нетрусов и др., 2004). Для понимания понятия ―взаимодействие ассоциативных бактерий с высшим растением‖ необходимо изучить эту проблему, как со стороны роли растений, так и со стороны роли бактерий, в их взаимодействии, что позволит нам рассмотреть более подробно сущность установления этой ассоциации. 1.1.1. Роль высших растений в бактериально-растительном ассоциативном взаимодействии Высшие растения являются эконишей для бактерий. Растения выделяют экссудат, депозит, называемый ещѐ ризодепозитом, который является источником питания и энергии для бактерий. Выделяемые 13 растениями различные вещества (депозиты) создают необходимые условия для бактериально-растительного взаимодействия. Устьица растений являются местами выделения веществ, в том числе летучих органических веществ (ЛОВ) и нелетучих веществ, которые служат питательными субстратами для бактерий. Считают, что ризосфера – это место, где происходит более интенсивное развитие бактерий, так как из корней растений выделяются различные легкодоступные органические вещества, служащие источником питания и энергии для микроорганизмов (Кравченко, 2000). К корневым экссудатам относятся сахара, аминокислоты, витамины, ростовые вещества и другие низкомолекулярные органические вещества. В состав ризодепозитов входят и многие другие соединения, например, высокополимерные слизи, ферменты, отмирающие поверхности клеток и ряд других веществ. Вид, возраст и условия выращивания высших растений определяют количество и качество выделенных веществ из растения, поэтому особенности растения играют главную роль в селективирющем влиянии растения на его бактериальное сообщество (Bais et al., 2006). Например, Burkholderia развивается в анаэробных или аэробных условиях, но очень низкое содержание кислорода является оптимальным условием для данного микроорганизма. Как известно, на заливных полях во Вьетнаме, когда корни риса погружают под воду, окружающая среда содержит мало кислорода, поэтому используют водоросли Burkholderia vietnamiensis и Burkholderia kuruiensis в качестве ассоциативного организма при выращивании риса (Hồ Thị Kim nh v c ng s , 1999). Многочисленные выделения из высщих растений нe только служат источником питания и энергии для ассоциативных бактерий: они еще являются необходимым фактором, влияющим на метаболическую функцию бактерий. King N. D. et al. в 2000 г. выдвинули гипотезу о функции пролина, продуцироваемого растениями при бактериально-растительном взаимодействии. В работе они указали на наличие гена, который 14 обусловливает это взаимодействие. Эту гипотезу подтвердили (Dillewijn Pieter et al., 2004), показав, что, концентрация пролина в ризосфере растений обусловливает степень колонизации ризобактериями Pseudomonas putida (CS-4) корней кукурузы, причѐм бактерии погибали при отсутствии пролина. Ассоциативные бактерии используют вещества, выделенные из корня, в большинстве случаев вблизи от зоны кончика корня, в то время как бактерии выделяют ростактивирующие вещества на боковых корнях. Чем больше развиваются корни, тем больше выделяется веществ, служащих источником питания для бактерий, что обусловливает положительный эффект взаимодействия растений и бактерий. Что касается роли высщих растений в бактериально-растительном ассоциативном взаимодействии, то здесь необходимо отметить роль ауксина – одного из продуцируемых бактериями фитогормонов, который играет важнейшую роль в механизме взаимодействия в растительно-бактериальных ассоциациях. Но синтез этого фитогормона ризосферными бактериями в значительной степени обусловивается составом корневых выделений, в основе которых имеется метаболитический предшественник L-триптофана (Bais et al., 2006; Frankenberger, Arshad, 1995). 1.1.2. Роль ассоциативных бактерий в бактериально-растительном ассоциативном взаимодействии Известно, что ассоциативные бактерии весьма активно проникают в органы высших растений (корни, листья, стебли). Это воздействие приводит к общему результату – ускоренный рост растений, повышение иммунитета, способности и устойчивости к стрессам. Следовательно, ассоциативные бактерии образуют с высшими растениями ассоциацию с положительным взаимодействием партнеров (Bais et al., 2006). В бактериально-растительном ассоциативном взаимодействии участвуют многие представители азотфиксирующих бактерий: Azospirillum, Azotobacter, Bacillus, Klebsiella, Enterobacter, Escherichia, Citrobacter, 15 Pseudomonas, Erwinia и другие (Chelins Marisa et al., 2000; Егоров, 2003; Arkhipova et аl., 2004; Phạm Bích Hiên, Phạm Văn Toản, 2003). Способность бактерий образовывать фитогормоны (в том числе ауксины, гиббереллины, цитокинины), а также витамины и другие биологические активные вещества является одним из важнейших факторов, определяющим функционирование бактериально-растительного ассоциативного комплекса (Мишке, 1988; Каменева и др., 1999; Емцев, 2001; Цавкелова и др., 2005). Среди ауксинов – индолил-3-уксусная кислота (ИУК) является фитогормоном, который синтезирует большинство ризобактерий (Costacurta et al., 1995; Каменева и др., 1999; Кацы, 2003; Yasmin et al., 2004; Leveau et al., 2005; Somers et al., 2005). К представителям ассоциативных бактерий, которые обладают способностью к синтезу ИУК, относятся бактерии родов Agrobacterium, Enterobacter и другие. Acetobacter, Klebsiella, Pseudomonas, Spaepens S. и соавторы (2007), а также и другие исследователи, изучали метаболизм и гены, обусловливающие синтез ИУК. Costacurta А. с соавторами (1995) выявили 5 путей биосинтеза ИУК, 4 из которых являются трептофанзавивимыми. Выявленные четыре пути биосинтеза осуществляются в условии наличия предшественника Lтриптофана, выделяемого из экссудатов растений (Bais et al., 2006; Frankenberger, Arshad, 1995). Только один путь биосинтеза ИУК не связан с метаболизмом триптофана, хотя такие бактерии как азоспириллы могут осуществлять такой путь биосинтеза. Азоспириллы могут использовать одновременно несколько путей образования ИУК. Роль ИУК в бактериальнорастельной ассоциации заключается в стимулировании деления клеток, дифференциации и растяжения клеток и тканей высших растений, однако главное действие – это ускорение ксилемо- и корнеобразования (Дефлинг, 1995; Цавкелова и др., 2005). Установлено, что некоторые бактерии способны разлагать фитогормоны, например, штаммы Рseudomonas putida расщепляют ИУК, что приводит к снятию ингибирующего действия на растения 16 суперпродуцентов ИУК (Leveau, Lindow, 2005). В настоящее время найдены новые биологически активные вещества, которые являются летучими метаболитами, стимулирующими рост Arabidopsis thaliana. К этим соединениям относятся ацетон, 2,3-бутандиол, продуцируемые штаммами Bасillus subtilis и Bаcillus аmyloliquefaciens (Ryu et at., 2003). Подобный эффект летучих метаболитов на Arabidopsis thaliana был выявлен у штаммов Burkholderia cepacia и Staphylococcus epidermidis (Vespermann et al., 2007). Представитель ризобактерий, способный к синтезу цитокининов является Bac. subtilis, который оказывает эффективную стимуляцию на рост салата ( rkhipova et аl., 2004). Следует особо отметить роль лектинов, представляющих собой углеводсодержащие белки, синтезируемые всеми живыми организмами и которые участвуют в межорганизменных взаимодействиях. В бактериальнорастительном ассоциативном взаимодействии бактериальные лектины участвуют в процессе колонизации корней (проникновении бактерий в корни), а также адгезии, стимулировании активности ферментов растений и оказывают ростовой эффект (Карпунина, 2005; Никитина и др., 2005). Например, лектины разных видов Azospirillum участвуют в адгезии бактерий к корням пшеницы и формируют азотфиксирующую ассоциацию. Ассоциативные бактерии могут улучшать питание растений такими элементами, как азот, фосфор, калий. Большинство необходимых растениям соединений фосфора относится к минеральным и органическим нерастворимым солям, которые недоступны для растений (Mantelin, 2004). Как известно, ризосферные бактерии способны к растворению труднодоступных почвенных фосфатов, что положительно сказывается на фосфорном питании растений (Rodriguez, Fraga, 1999; Andres, 2009). Этот процесс осуществляется благодаря жизнедеятельности многих бактерий, которые подкисляют среду, например при утилизации сахаров образуются органические кислоты, в результате чего ризобактерии осуществляют 17 растворение труднодоступных фосфатов. Учѐными были выделены гены, определяющие процесс расщепления органических соединеий фосфора под действием кислой фосфатазы и фитазы ферментов, а также гены, обусловивающие процесс растворения минеральных фосфатов (Rodriguez, Fraga, 1999). Известно, что азот является одним из основных элементов, входящих в состав нуклеиновых кислот, белков, АТФ и других главных полимеров клеток живых организмов. Дефицит доступного азота в почве – один из основных факторов, лимитирующих рост и развитие растений. Биологическая азотфиксация – способность усваивать молекулярный азот атмосфера – уникальная способность прокариотов. Азотфиксация является процессом восстановления атмосферного азота до аммиака (Dixon, Kahn, 2004), которой становится доступным для растений. Нитрогеназа представляет собой ферментную систему, катализирующую реакцию азофиксации (Игнатов,1998). Известен ряд генов, которые обусловивают процессы синтеза и регулирования активности фермента нитрогеназы (Берцова и др., 2005; Задорина, 2008; Слободова, 2006), в том числе ген nifH кодирует один из основных компонентов в структуре нитрогеназного комплекса (Компонент - Fe-белок). Существуют общие принципы генетического контроля процесса азотфиксации для всех азотфиксирующих микроорганизмов (свободноживующие, ассоциативные, симбиотические) (Каменев, Муромец, 1999). В бактериально-растительном ассоциативном взаимодействии ризобактерии играют определѐнную роль в защите растений от негативных факторов и абиотических стрессов, особую роль в этих процессах играет этилен. Этилен в стрессовых реакциях представляет собой сигнальную молекулу и с помощью бактериальных ферментов (1-аминоциклопропан-1карбоксилат (АЦК) деаминаза) в растениях снижается содержание этилена (Белимов, 2008; Czarny et al., 2006). После адгезии и проникновения в растеие 18 ассоциативные бактерии используют АЦК как источник питания, при этом следует снижение содержания АЦК, что приводит к биосинтезу этилена в корнях (Mantelin, Touraine, 2004; Czarny et al., 2006). Следовательно, уменьшается ингибирующий эффект этилена на развитие растения. После Glickа B. R. с соавторами (1994), в 2005 г. Belimov . с соавторами выявили ростовой эффект АЦК деаминазы при переносе гена (определяемым АЦК деаминазой) в штаммы с отсутствием этого фермента. В течение многих лет, ученые изучали способность ассоциативных бактерий к подавлению развития фитопатогенных микроорганизмов (Bais et al., 2006; Cheng et al., 2007; Bloemberg, Lugtenberg, 2001). Эта биоконтрольная функция у бактерий осуществляется за счет способности ассоцитивных бактерий улучшать жизненный статус растений – следовательно, повышается устойчивость растений к заболеванию. Кроме того, ассоциативные бактерии способны напрямую подавлять фитопатогены, так как имеет место конкуренция в эконишах за пищевые субстраты между ассоцитиваными бактериями и фитапатогенами, что приводит к вытеснению фитопатогенов из экониш (растение) (Cheng et al., 2007; Paulitz, Bélanger, 2001). Также ассоциативные бактерии способны к выделению антифунгальных веществ (антибиотики, токсины, антигрибные метаболиты), ингибирующих рост фитопатогенов. Возможно, сигнальные молекулы зашитных реакций, направленные на обеспечивание устойчивости к фитопатогенам, представляют собой сидерофоры, бактериальные липополисахариды, салициловую кислоту и другие соединенич (Neilands, 1995). Показана способность синтеза сидерофор у рода Pseudomonas. Установлено, что с помощью сидерофор бактерии усваивают железо и образуют недоступные для фитопатагенов Fe-сидерофоные комплексы. Считается, что это один из механизмов конкуренции бактерий с фитопатагенами за пищевые субстраты. Кроме того, между ассоциативными бактериями и фитапатогенами наблюдается такое явление, как паразитизм. 19 При этом ассоциативные бактерии способны к продуцированию литических ферментов, которые они используют для лизиса фитапатогенов, служащих им источником питания (Whipps, 2001). S. Dobbelaere с соавторами (2003), изучая роль ассоциативных бактерий в бактериально-растительных ассоциативных взаимодействиях, показали уменьшение потребности растений в минеральных питательных элементах. Это явление осуществляется в результате одного или аккумулирования разных положительных эффектов ассоциативных бактерий на растения. По-видимому, в этом случае увеличивается почвенное пространство для бактериально-растительного ассоциативного взаимодействия, что сказывается на повышении питательного ресурса. В основном нами изложено влияние ассоциативных бактерий на высшие растения в зоне корней этих растений, однако эксперименты, проведѐнные исследователями, показали наличие бактерий в филлосфере и филлоплане (Ruinen, 1961; Moore, 1963; Jensen, 1965; Jone, 1970; Told, Meyer, 1976; Basilier et al., 1978; Giddens, 1982; Capone, Teylor, 1980). Они использовали генетически модифицированные бактерии, обусловливающие синтез зеленого флуоресцирующего белка, и сделали вывод, что бактерии Pantoea agglomerans способны к преимущественной колонизации поверхности эпидермальных клеток, так как эта группа бактерий находится преимущественно вокруг устьиц (Нетрусов и др., 2004). 1.1.3. Этапы формирования бактериально-растительного ассоциативного взаимодействия Процесс формирования бактериально-растительного ассоциативного взаимодействия определяется различными бактериальными и растительными генами. Согласно Кацы Е. И. (2003) этот процесс состоит из разных этапов: хемотаксис бактерий к экссудату растений (Bachan Y, 1986; П. Н. Голышен, 1991), при этом бактерии прикрепляются к растению и образуют вокруг себя массу фибриллярного материала (Bachan et al., 1986), а корневые волоски 20 деформируются и разветвляются (Hanari Et al., 1988). Если ассоциативные бактерии существуют в (на) корнях растений, бактерии осуществляют следующий этап: прокновение внутрь ткани растений, где они обитают и осуществляют метаболические процессы (Vande Broеk et. al., 1993; Бирюкова, 2001; Nielsen et al., 2001). Итак, после колонизации растений, некоторые ассоциативные бактерии способны мигрировать внутрь растений (от корня растения к листям, побегам и наоборот). В своей работе Бирюкова О. В. (2001) изучала отношения между штаммом Klebsiella planticola ТСХА-91 и небобовыми растениями и сделала вывод, что штамм Klebsiella planticola при проникновении в растение мигрирует во внутренние ткани небобовых растений. Для доказательства этой способности в стерильных условиях был проведен опыт инокулирования штаммом Klebsiella planticola ТСХА-91 корней растений, и выявлено, что Klebsiella planticola мигрирует в стебли и листья растений (Бирюкова, 2001; Колесников, 2012). С помощью находящих на сканирующей поверхности микроскопии корней, отмечали вокруг ризобактерий, слизеподобный слой. Возможно, это образование защищает колонии и клетки ассоциативных бактерий от стрессовых факторов (Lugtenberg et al., 2001). Рядом опытов показано, что способность бактерий проникать в корни растений зависит от их возможности утилизировать компоненты корневых выделений, в перую очередь это низкомолекулярные органические кислоты. Как показано, мутант Pseudomonas fluorescens WCS365 не мог утилизировать сахара, не использовал органические кислоты и при этом плохо проникнал в корни (Кравченко и др., 1993). Исследованиями установлено, что чем больше органических кислот выделяется из корней в ризосферу, тем больше численность ассоциативных бактерий (Штарк и др., 2003). 21 В селекции активных колонизирующих бактерий эффективно использовать метод накопительных культур, основанный на инокулировании стерильных корней бактерями, обладающими способностью хемотаксиса к экссудату растений; после этого происходит заселение в эту эконишу стандартных штаммов, которые активно колонируют растение, при этом можно оценить конкурентоспособность испытуемых изолятов бактерий и стандартных штаммов (Кравченко и др., 2002; Bais et al., 2006). Kuiper I. с соавт. (2001) наносили консорциум ризосферных бактерий на стерильные корни, в результате чего выделили штаммы, доминировавшие и быстрее утилизирующие компонентны корневых выделений. В обзоре Каменевой и Муронец (1999) авторы рассмотрели генетический контроль процессов, регулирующых взаимодействие бактерий и растений в ассоциации: участия фибриллярных структур и экзополисахаридов в контакте бактерий на (в) корнях растений; синтез и регуляцию активности нитрогеназы, и следовательно регуляцию процесса азотфиксации; продукцию фитогормонов, в том числе индолил-3-уксусной кислоты (ИУК). Большинство вышеперечислительных исследований процессов у генетического ассоциативных контроля микроорганов проведено на примере азоспирилл. Экстраклеточные полисахариды бактерий играют важную роль на всех стадиях формирования ассоциативного комплекса. Они представляют собой сигнальные молекулы адекватного физиологического ответа растения. На поздних стандиях, с помощью микрофибрилл, бактерии прочно прикрепляются к корням и в экстремальных условиях поддерживают стабильное сохранение ассоциации. О наличии общих этапов в генетическом контроле процесса прикрепления к растению у ассоциативных, свидетельствует симбиотических большое и количество фитопатогенных у них бактерий гомологичных генов, кодирующих различные полисахариды. У разных ассоциативных бактерий обнаружены существенные различия в локализации (хромосомной или 22 плазмидной) и организации (в опероны и кластеры) как структурных и регуляторных генов нитрогеназы, так и генов других регуляторных систем, контролирующих процесс азотфиксации. Наблюдаемое разнообразие генетических систем может быть обусловлено широким горизонтальным переносом структурных и регуляторных генов азотфиксации между разными видами и даже родами бактерий при участии плазмид и различных мигрирующих элементов. Авторы тоже отмечали, что у ассоциативных бактерий выявлено четыре возможных пути биосинтеза ИУК, который играет важную роль в процессах взаимодействия бактерий и растений в ассоциациях. Однако данные о распространенности и биологическом значении этих четырех путей в связи с особенностями формирования и спецификой ассоциативных систем отсутствуют (Каменева, Муронец, 1999). Как видно, в бактериально-растительном ассоциативном взаимодействии основная роль принадлежит растениям. 1.2. Ассоциативная азотфиксация в различных биоклиматических зонах Умаровым М.М. (1986) было установлено, что все типы почв достаточно богаты азофиксаторами. Росвалл и Гранхалл (1980) изучили активность азотфиксации на моховых болотах с голыми, лишенными растительности участками озовых валов. Ими было обнаружено существенное увеличение активности азотфиксации от незеленых к зеленым частям мха, и в зависимости от интенсивности освещения от холодных, облачных до ясных, теплых дней. Таким образом, фотосинтетическая деятельность растения влияет на интенсивность и динамику азотфиксации в фитоплане. Несимбиотическая азотфиксация в различных биоклиматических зонах Азотфиксирующая активность почв различных природных зон раскрывает роль несимбиотических диазотрофов в азотном балансе 23 надземных экосистем. Согласно данным в обзоре М.М. Умарова (1986) активность диазотрофов мало зависит от рН, но наоборот сильно зависит от наличия фосфора: нитрогеназная активность была самой низкой на участках, содержащих наименьшее количество фосфора. В результате изучения эколого-географических особенностей процесса несимбиотической азотфиксации в почвах разных биоклиматических зон, Е.Н. Мишустиным (1987) была открыта важная закономерность – при переходе от северных к южным почвам активность азотфиксации увеличивается (таблица 1). Таблица 1 Активность несимбиотической азотфиксации в почвах основных типов (Мишустин и др., 1987) Почва Азотфиксация, кг/га/год Дерново-подзолистая 10 - 13 Серая лесная 18 - 30 Чернозем 37 - 53 Каштановая 18 - 30 Серозем 18 - 30 В своем обзоре М.М. Умаров уточнил закономерность распространения азотфиксаторов для вертикально-зональных почв. Она заключалась в том, что азотфиксирующая активность увеличивается при усилении почвообразовательных процессов и снижении содержания гумуса в почве (хотя гумус представляет собой один из главных источников азота для почвенных микроорганизмов и питания растений). По данным Т.А. Калининской (1982), изучавшей активность азотфиксации в интразональных почвах с избыточным увлажнением (пойменных, болотных, почвах рисовников) наиболее высока и составляет от 16,5 кг/га/месяц до 67,5 кг/га/месяц. Согласно Е.Н. Мишутину, И.Г. Захарченко, С.М. Гуревичу и др., в основных зональных типах почв СССР 24 несимбиотическая азотфиксация ежегодно составляет от 26 – 48 кг N2/га (Мишустин, Черепков, 1976; Захарченко и др., 1982) до 77 – 86 кг N2/га (Гуревич, 1962). В зоне субтропиков, в красноземах, коричневых, желтоземах и бурых почвах азотфиксирующая активность также высока (в среднем 40 кг/га/200 дней (Мушустин и др., 1978; З.А. Гочелашвили, 1978)). В почвах тропической зоны наиболее интенсивно протекает несимбиотическая азотфиксация, ее средний уровень равен 200 кг/га/год (Dart, Wani, 1982), а в максимуме достигает 600 кг/га/год (Purschase, 1987). Несимбиотическая азотфиксация в ризосфере (ризоплане) растений различных биоклиматических зон Ринодо (Rinaudo,1970) представил одну из первых работ по изучению азотфиксации в ризосфере, в которой приведено сравнение нитрогеназной активности в вегетационных сосудах с растениями и без растений, однако активность азотфиксации проявлялась лишь в сосудах с растениями. В согласии с этим, Т.А. Калининская с соавт.(1977) при изучении азотфиксации в черноземных почвах сделали вывод, что нитрогеназная активность в почве без растений была примерно в 50 раз ниже, чем в прикорневой зоне проростков риса. Азотфиксирующая активность под естественной растительностью на лугово-болотной почве на участках с нормальной плотностью растений составляет в среднем на 30% больше по сравнением с активностью на участках с низкой плотностью (Tjepkema, Evans, 1976). В таблице 2 суммированы некоторые данные по уровню азотфиксирующей активности в ризосфере различных растений, в том числе перечислены диазотрофные бактерии, обитающие в ризосфере различных растений, произрастающих в почвах зоны тропиков и субтропиков (2 вида климата Вьетнама). Общим свойством растений тропической зоны (маиса, сахарного тростника, росички, паспалума) является способность осуществлять путь 25 фиксации CO2 через четырехуглеродные кислоты при фотосинтезе (С4фотосинтез), в результате они поддерживают высокую активность азотфиксации в фитоплане (Tjepkema, Burris, 1976; Jagnow, 1979). По сравнению с растениями, использующими только цикл Кальвина (С3фотосинтез), растения этого типа обладают значительно более высокой максимальной скоростью фотосинтеза, но требуют интенсивного освещения. Таблица 2 Активность азотфиксации в ризосфере различных растений зоны тропиков и субтропиков (Умаров, 1986) Вид растений Тропические пастбищные травы 1 Микроорганизмы, обнаруживаемые в ризосфере 2 Паспалум (Paspalum notatum) 3 Azotobacter paspalii Росичка (Digitaria decumbens Azospirillum brasilense Spirillum lipoferum Змеевка (Diplachne fusca) Azospirillum spp. Azotobacter paspalii Beijerinckia indica Spirillum lipoferum Перистощет Azospirillum spp. инник (Pennisetum purpureum) Просо Ветвянка (Brachiaria mutica) Свинорой Azospirillum brasilense Нитрогеназна я активность Авторы 4 90 кг N2/га/год 1 кг N2/га/сут 57–238 г N2/га/сут 60 – 404 нМ С2Н4/г корней/ч 210 – 323 г N2/га/сут 127 кг N2/га/100 дней 10 кг N2/га/год 431 г N2/га/сут 215 – 954 нМ С2Н4/г корней/ч 1 кг N2/га сут 5 Purschase, 1987; Dobereiner, Day, 1975; Day et al., 1975; Dart, Day, 1975 Dobereiner, Day, 1975; Barber, Day, 1975; 20 – 229 нМ С2Н4/г корней/ч 156 – 730 нМ С2Н4/г корней/ч 17 – 269 нМ С2Н4/г корней/ч Balandreau et al., 1977; Barber et al., 1979; Dobereiner, Doddey, 1982 Dart, Wani, 1982 Balandreauet al., 1977; Dobereiner, 1987; Dobereiner, Day, 1975; Larson, Neal, 1976; Dobereiner, Day, 1975. 26 Продолжение таблицы 2 1 2 3 Зерновые Пшеница Azotobacter Beijerinckia sp.; Spirillum lipoferum. 4 5 spp.; 2198 нМ Dobereiner et al., 1976 С2Н4/растнение/ч 3,1 – 290 нМ С2Н4/г корней/ч 218 г N2/га/сут Около 10 кг N2/га/год 2 кг N2/га/сут 2,8 – 4,3 г N2/га/сут 550 ± 60 нМ С2Н4/растение/ч Azospirillum sp. 1053 нМ С2Н4/г Klebsiella pneumoniae корней/ч Enterobacter cloaceae 2,8–4,3 г N2Erwinia herbicola /га/сут 0,4 – 1,4 г N2/га/сут 24–1100 нМ С2Н4/растение/ч Гетеротрофы, в меньшей 10 – 55 кг N2степени автотрофы. /га/год Rhodopseudomonas 44 – 49 кг N2capsulatus /га/год В симбиотической 1800 – 6100 нМ ассоциации с С2Н4/г корней/ч гетеротрофами 51 – 63 кг N2Цианобактерии, /га/год факультативно 70 кг N2/га/год анаэробные гетеротрофы Около 80 кг N2Spirillum lipoferum, /га/год Enterobacter spp., Pseudomonas sp., 50 г N2/га/сут Arthrobacter sp. Mycobacterium sp. 60 г N2/га/сут Beijerinckia indica, 23 – 67,5 кг N2Azotobacter sp., /га/мес. Clostridium sp., 1,51 – 5,55 нМ Derxia sp., С2Н4/г корней/ч Spirillum sp., Vibrio sp., Caulobacter sp., Klebsiella pneumoniae Enterobacter cloaceae Erwinia herbicola Bacillus sp. Spirillum spp. Spirillum spp. Spirillum lipoferum Маис Сорго Рис Сахарный тростник Pedersen et al., 1978 Larson, Neal, 1976 Balandreau et al., 1977 Von Bulow, Dobereiner, 1975 Tjepkema, van Berkum, 1977 Dobereiner et al., 1976; Day et al., 1975; Tjepkema, van Berkum, 1977; Dobereiner, 1978 Pedersen et al., 1978 Rinaudo, 1970 Balandreau et al., 1976; Yoshida, 1977 Watanabe et al., 1978; Charyulu et al., 1978; Watanabe et al., 1978 Калининская с соавт., 1973 Balandreau, 1975; Dobereiner et al, 1976; Ruschell et al., 1978; Staphorst, Strijdom, 1978 После того как, К.Вѐзе впервые был применен метод сравнительного анализа последовательностей 16S рРНК в качестве подхода для 27 филогенетического изучения микроорганизмов, было выявлено много новых азотфиксирующих бактерий в ризосфере растений. Например, с помощью этого метода, Leonardo M.C. и соавт. (2000) открыли восемь новых азотфиксирующих генотипов бактерий из ризосферы банана и ананаса, в том числе были определены: Нerbaspirillum seropedicae, Нerbaspirillum rubrisubalbicans, Вurkholderia brasilensis и Вurkholderia tropicalis. Было показано большое разнообразие азотфиксирующих бактерий, связанных с этими тропическими культурами. В 2010 были выделены азотфиксирующие штаммы из водного болотного растения Eleocharis dulcis, которое произрастает на очень кислых почвах (рН 2 – 4) во Вьетнаме. Авторы установили, что эти штаммы относятся к новому виду Burkholderia heleia sp. nov. (Tomoko Aizawa, Nguyen Bao Ve et al., 2010). Таким образом, ризосфера растений, произрастающих во Вьетнаме, расположенном в зонах тропического и субтропического климата, является благоприятной средой для обитания разнообразных диазотрофных бактерий. Эта среда представляется перспективной для поиска активных ассоциативных азотфиксирующих штаммов. 1.3. Морфологические и физиолого – биохимические ассоциативных азотфиксаторов К настоящему времени выдедено более 200 видов азотфиксирующих бактерий, большинство их них являются ассоциативными азотфиксирующими бактериями и относятся к родам: Agrobacterium, Bacillus, Azospirillum, Enterobacter, Flavobacterium, Pseudomonas, Klebsiella и др. Azospirillum (семейство Rhodospirillaceae) относится к бактериям, обладающим способностью к азотфиксации и ассоциативному взаимодействию с растениями. Azospirillum распространѐн в почвах довольно широко. Бактерии были найдены в ассоциативных взаимодействиях с однодольными (кукуруза, рис, 28 сахарный тростник, сорго), а также на кормовых травах (Dobereiner et al., 1976; Haahtela et al., 1981; Reinhold et al., 1986; Rennie, 1980; Wong, Stenberg, 1979), и с двудольными растениями (Rao, Vankateswarlu, 1982). Род Azospirillum был определен Tarrand и коллегами в 1978 году и в настоящее время включает в себя пять видов, характеризующихся в основном своими фенотипическими свойствами и особенностями ДНК: А.brasilense, А.lipoferum, А.amazonense (Falk et al., 1984; Magalhaes et al., 1983), А. halopraeferens (Reinhold et al., 1987), А. irakense (Khummas et al. 1989). Эти бактерии являются аэробными неферментирующими хемоорганотрофами. Они относятся к грамотрицательным бактериям. Клетки спиралевидные, Sобразной формы, от 2 до 4 µм в длину, имеют полярные жгутики в жидких средах. На твердых средах А. brasilense, А.lipoferum и А.irakense имеют несколько боковых жгутиков. Они содержат гранулы полибета-оксибутирата. Содержание G+C в ДНК варьирует между 60 и 70%. Оптимальная температура для роста составляет от 33о до 41о С. А.lipoferum и А. halopraeferens требуют биотин; другие виды предcтавляют собой прототрофы. А. amazonense предпочитает низкий рН. Такие виды, как А. halopraeferens, А. brasilense и А. lipoferum являются галотолерантными. Некоторые виды азоспирилл накапливают каротиноиды, которые определяют розовую окраску старых культур (Eskew et al., 1977). Представители рода Azospirillum используют органические кислоты (малат, лактат, пируват, сукцинат) в качестве источника углерода. Азоспириллы могут быть дифференцированы по спектру использования источника углерода (MartinezDrets et al., 1984; Martinez-Drets et al., 1985; Westby et al., 1983). Так, А. brasilense не может использовать глюкозу, хотя некоторые штаммы могут использовать еѐ. А.irakense и А.amazonense могут использовать дисахариды, такие как сахароза, лактоза, мальтоза, и трегалоза. А.irakense использует пектин в качестве единственного источника углерода (Khummas et al., 1989). Автотрофный рост в аэробных условиях, с H2 в качестве источника энергии 29 был продемонстрирован у А.lipoferum, но не у А. brasilense (Dobereiner, Pedrosa, 1987; Malik, Schlege, 1981). Фиксация азота происходит в условиях микроаэробиозиса. Herbaspirillum. (семейство Oxalobacteraceae) Впервые были описаны в качестве новых видов Azospirillum, с которыми они имеют общие черты: спиральвидная форма клетки, содержание Г + Ц от 66 до 67 моль%, преимуществено рост на органических кислотах и образование налета на поверхности полутвердой среды (Dobereiner, Pedrosa, 1987). Тем не менее, РНК / РНК гибридизации показала, что эти бактерии относятся к новому роду. Видовое название нового организма Herbaspirillum seropedicae (Baldani et al., 1986). Klebsiella, Enterobacter, Грамотрицательные Erwinia (Семейство факультативно-анаэробные Enterobacteria) энтеробактерии обычно изолируют из зерновых культур и кормовых трав. Эти бактерии встречаются чаще в ассоциации с пшеницей, в частности, в районах с умеренным климатом (Kleeberger et al., 1983; Pederson et al., 1978; Rennie, 1980). Эти бактерии имеют общие физиологические свойства Enterobacteriaceae и могут фиксировать азот в анаэробных условиях, хотя вполне возможно, что следы кислорода стимулируют фиксацию азота. Обследование кормовых трав в Техасе (Wright, Weaver, 1981) показало, что большинство азотфиксаторов относится к Enterobacter cloacae и Klebsiella pneumoniae. Те же виды были выделены из трав в Финляндии, вместе с Azospirillum и Pseudomonas. Klebsiella и Enterobacter также были изолированы из риса (Haahtela, Helander, 1983; Haahtela et. аl., 1981). Ladha J. K. и соавторы выделили три азотфиксатора рода Klebsiella: К. pneumoniae, К. oxytoca и К. рlanticola (Ladha et al., 1983). Имеются данные, что К. oxytoca и К. planticola относятся к К. pneumoniae. В отличие от К. pneumonia К. oxytoca является индолположительным, а К. planticola может использовать гидроксил пролина (Bagley et al., 1981; Richard, 1982). Известный штамм К. pneumoniae 30 M5al должен быть отнесен к К. oxytoca (Elmerich, 1979). Вероятность того, что К. pneumoniае может быть изолирована из почвы, относятся и к К. planticola и К. oxytoca. Штаммы К. oxytoca были выделены из риса в Японии (Hirota et. al., 1978; Kim et al., 1986), а штаммы К. planticola были выделены из риса на Филиппинах (Ladha et al., 1983). Ассоциативные азотфиксаторы K. planticola и K. oxytoca могут обеспечивать растение азотом из атмосферы (Brill, 1980). Емцев В.Т. (1994) показал, что азотфиксация в ризоплане овощных культур осуществляется факультативно анаэробными бактериями рода Klebsiella, среди которых наиболее активным азотфиксатоом является К. planticola. K. oxytoca обычно колонизирует внутренние ткани пшеницы, риса и табака (Петак и др., 1995; Bacon, Hinton, 2006), а K. terrigena — ткани ячменя, табака и подсолнечника (Петак и др., 1995; 3лотников, Казакова, 2006). Названные бактерии являются и активными почвенными азотфиксаторами, синтезирующими ауксины и подавляющими развитие фитопатогенных грибов (3лотников, Умаров, 1998). Инокуляция семян ячменя штаммом K. terrigena Е6 повышает энергию прорастания и способствует росту растений (3лотников, Казакова, 2006). Изучены метаболические пути выноса фиксируемого азота из клеток Klebsiella terrigena Е6 в небобовые растения. В процессе азотфиксацци образуется аммонийная группа глутамата и эта группа переносится на пируват. Казакова М. Л. и коллеги изучили Klebsiella terrigena Е6 и обнаружили, что в процессе азотфиксации аминокислота аланин клеток бактерий может служить акцептором аммонийной группы глутамата (или переносчиком фиксированного азота) (Казаков, Злотников, 2012). Показано, что виды Enterobacter, например, E.cloacae, а также некоторые штаммы E.agglomerans, тесно связаны с Erwinia herbicola, которая была изолирована как азотфиксатор (Papen, Werner, 1982; Pederson et al., 1978; Rennie et al., 1982; Singh, 1983). 31 В 2009 году Guixiang Peng и коллеги выделили штамм Enterobacter oryzae sp. – азотфиксирующую бактерию, изолированную из диких видов риса широколистного (Oryza latifolia). Этот штамм Enterobacter характеризуется следующими особенностями: это прямые или слегка изогнутые палочки, 0,8-1,1 × 1,4-2,0 мкм, грамотрицательные и подвижные. Бактерии факультативно анаэробные, хемоорганотрофы. На среде образуют круглые колонии, выпуклые и полупрозрачные, диаметром примерно 3 мм. Рост происходит при температуре 10-40°С (оптимальная температура 28-37 ° С) и при рН 3,5-10. NaCl ингибирует рост бактерий в концентрациях, превышающих 5%. У бактерий этого рода наблюдается устойчивость к эритромицину, неомицину и ампициллину (300 мкг мл-1), хлорамфениколу (50 мкг мл-1), стрептомицину, тетрациклину и гентамицину (5 мкг мл-1), однако они не устойчивы к канамицину (5 мкг мл-1). Бактерии указанного рода дают положительную реакцию на лизиндекарбоксилазу и отрицательную на уреазу и на восстановление нитрата до молекулярного азота. Такие вещества как адонит, L-аспарагиновая кислота, дульцит, оксалат натрия, ванилиновая кислота, бензоат натрия, гиппурат натрия, D-фруктоза, малат, маннит, мальтозу и сорбит могут быть использованы бактериями в качестве единственного источника углерода. Содержание G+C геномной ДНК штамма данного типа является 55,0 ± 0,4% мол. Согласно анализу последовательности гена 16S рРНК ближайшими филогенетическими родственниками этой бактерии являются E. radicincitans и Е. cloacae (Guixiang Peng et al., 2009). Agrobacterium (E. F.Smith, C.O.Townsend, 1907) относится к семейству Rhizobiaceae. Классификация видов Agrobacterium проводилась в соответствии с их фитопатогенностью и на основании способности выделения 3-кетолактозы. Непатогенным видом является А. radiobacter, а A. tumefaciens обычно формирует корончатые галлы на растениях (Skerman et al., 1980). А. radiobacter и A. tumefaciens разделены по своей патогенности 32 (Homles, 1988). При сравнении типового штамма А. radiobacter TCC19358 с типовым штаммом A. tumefaciens наблюдается 80-87% гомологии ДНК, поэтому предполагается, что эти 2 штамма относится к одному виду (Спайнк et al., 2002). Согласно Волкогону (2001), из ризосферы ржи выделялись разные представители бактерий с высоким потенциалом азотфиксации: Azospirillum, Enterobacter, Bacillus, Azotobacter, Pseudomonas, Arthrobacter, и в том числе Agrobacterium. На основе ассоциативных азотфиксирующих бактерий А. radiobacter штамм 57/136 создан биопрепарат Агрофор, стимурирующий рост растений на ранних стадиях вегетационного периода. Кроме того, он используется для ускорения детоксикации пестицидов (Тимофеева, 2000). Kanvinde L. и Sastry G. R. K. (1990) показали, что A. tumefaciens может фиксировать атмосферный азот в свободном состоянии (Kanvinde, Sastry, 1990). В 2006 в Бразилии из стебля сахарного тростника RB867515 были выделены Agrobacterium tumefaciens и Agrobacterium diazotrophicus, способные к азотфиксации. Выделенные штаммы были идентифицированы на основе морфологических, физиологических и биохимических характеристик и анализа последовательности гена 16S рРНК (Yong-Xiu Xing et al., 2006). Согласно определителю бактерий Берджи можно дать характеристику бактерий рода Agrobacterium: форма клеток – палочки 0,6 – 1.0 х 1,5 – 3,0 мкм, одиночные или в парах, грамотрицательные, подвижные, аэробные, в присутствии нитрата несколько штаммов осуществляют анаэробное дыхание, когда парциальное давление кислорода понижается. Большинство штаммов могут размножаться в тканях растений. 28о С – оптимальная температура для этих организмов. Хемоорганотрофы, они используют разнообразные органические вещества в качестве источника углерода кроме крахмала, Dгалактозы, целлюлозы и некоторых других углеводов. А. tumefaciens биовар 1 33 и А. radiobacter биовар 1 способны к образованию 3-кетогликозидазы (Хоулт et al., 1997). Другие роды азотфиксирующих бактерий Род (семейство Bacillus Bacillaceae) Факультативно-анаэробные спорообразующие почвенные бактерии (Rennie, 1980). В. polymyxa и B. macerans: эти виды рода Bacillus характеризуются нитрогеназной активностью, однако не растут в атмосфере молекулярного азота (Seldin, Dubnau, 1985). В отличие от этого вид, B. azotofixans, способен использовать молекулярный азот. Он был изолирован из пшеницы и из сахарного тростника на Гавайях (Scldin et al., 1984). Фиксация азота происходит в анаэробных условиях. Аэробные азотфиксаторы Azotobacter и Beijerinckia (семейство Azotobacteriaceae) были обнаружены в ризосфере сахарного тростника, кукурузы, овса, сои. Для этих бактерий не характрена колонизация корневой системы растений (Kole et al., 1988; Rennie et al., 1982). Была выделена только одна специальная ассоциация А. paspali - Paspalum notatum, способная к колонизации корней (Dobereiner et al., 1973; Patriquin et al., 1983). Pseudomonas (семейство Pseudomonadaceae). Несколько штаммов, отнесѐнные к роду Pseudomonas и способные фиксировать азот в микроаэробных условиях, были выделены из риса, сорго и других злаков (Barraquio et al., 1983; Haahtela et al., 1983). Среди них были идентифицированы новые виды; их таксономический статус отображѐн так: до 93% ДНК характерно Pseudomonas stutzeri (Krotzky and Werner, 1987). Несколько изолятов из водно-болотных угодий риса были классифицированы как новый вид, среди которых один отнесѐн к Pseudomonas diazotrophicus (Watanabe, et. al., 1987). Sandhya V. с соавт.(Shahbaz-Mohammadi et at 2011) выделили Pseudomonas entomophila из разных растений, произрастающих на 34 неорошаемых почвах Индии. Этот штамм способен к выделению ростактивирующих веществ и веществ, растворяющих трудндоступные соединения фосфора, а также к выделению биопестицидов. Другие представители микроаэрофильных азотфиксаторов включают в себя виды Acetobacter, А. diazotrophicus, которые были выделены из сахарного тростника в Бразилии (Dobereiner, 1989). Бактерии образуют оранжево-коричневый пигмент и снижают содержагние ацетилена при пониженном давлении кислорода (Gillis, et al., 1989). Был обнаружен азотфиксатор Alcaligenes faecalis в ассоциативном симбиозе с рисом (Китай), а описанный в Канаде штамм Campylobacter был способен к созданию ассоциации с водорослью Spartina alterniflora (McClung, Palriquin, 1980; McClung et al., 1983). Burkholderia (семейство Burkholderiaceae) Бактерии этого рода являются граммотрицательными подвижными палочками. Могут расти в условиях аэробных или анаэробных, но лучше в условиях недостатка кислорода. Большинство колоний штаммов Burkholderia имеют грязно-белый цвет; колонии круглые, выпуклые и гладкие, желтого цвета, диаметр колоний 0,5 – 1,5 мм (Nguyển Thị Minh Thư, 2010). Burkholderia имеет самый большой генотип по сравнению с другими почвенными бактериями. Burkholderia можно использовать в экологии, производстве биопрепаратов и защите окружающей среды (Lâm Văn Bạch. 2011). Burkholderia vietnamiensis был выделен из ассоциации с корней риса, выращиваемого на юге Вьетнама. Проводили инокуляцию риса, и был получен положительный эффект: увеличивается кустистость на 33%, объем корней на 57%, площадь листьев на 30%, урожай риса на 13 - 22 % (La Nguyễn Tường Vi, 2010). Внесение Herpaspirillum seropedicae и Burkholderia spp. под рис показало, что их способность к азотфиксации обеспечивает 19% от потребности в азоте риса (Vera et al., 2000). Ряд штаммов Burkholderia, например Burkholderia kurriens, который был выделен из промышленного растворителя в Японии (Zhang et al, 2000), а также 35 Burkholderia cepacia, обладают способностью к азотфиксации и образованию антибиотиков. 1.4. Биопрепараты на основе ассоциативных азотфиксирующих бактерий Костычевым С. П. (1925) была показана возможность инокулирования азотфиксаторов в прикорневую зону небобовых растерий, что подтвеждалось различными исследованиями с балансовым методом (например, опыт Прянишникова, опыт ―вечная рожь‖ в Германии и др.) (Соловьев и др., 2011). Для производства биопрепаратов отбирают штаммы, дающие стабильный максимальный положительный эффект на растениях. Эти микроорганизмы способны обеспечивать растения азотом, а также растворять труднодоступные вещества, улучшать иммунитет растений и т.д. Азотфиксирующие микроорганизмцы, на основе которых создаются биопрепараты, должны быть эффективными, повышать продуктивность растений и качество их урожая, не разрушать естественного плодородия почв и сохраниять экологическое равновесие в окружающей среде, а также дать возможность регулировать численность и активность полезной микрофлоры в ризосфере возделываемых культур (Сытников, 2012). В настоящей время, в ряде иститутов разработаны новые современные биологические препараты для сельского хозяйства. В них используется коллекции штаммов микроорганизмов, в том числе ассоциативных диазотрофов, из России, Нидерландов, Бельгии, Польши, Египта, Германии, Молдовы, Украины, Белоруси, Швеции, Франции, Италии, Китая и других стран. 36 Таблица 3 Биопрепараты на основе азотфиксирующих микроорганизмов, применяемые в растениеводстве (Емцев , 1994; Сытников, 2012; Соловьев и др., 2011; Лебедев, 2014; Тимофеева, 2000; Тихонович, Круглов, 2005) Название препарата 1 Агрофил На основе штамма 2 Agrobacterium radiobacter 10. Агрофор Agrobacterium radiobacter 57/136. Азоризин (диазобакт ерин) Азотобакте рин Azospirillum brasilense. Консорциум Azotobacter chroococcum Azotobacter vinelandii Биоплант - Klebsiella К planticola ТСХА - 91 Мизорин Arthrobacter mysorens 7. Действие на растение 3 Активизация всхожести семян, повышает их устойчивость к корневым гнилям, ускоряет созревание урожая. Примение при выращивании овощей (закрытый грунт), и ягодные, плодовые культуры. Для ускорения детоксикации пестицидов в тепличных грунтах и в почве. Стимулирует рост растений, особенно на ранних этапах развития, при этом увеличиается площадь поверхности листья, повышется мощность корневой системы, возрастает продуктивность. Возрастает качество и приживаемость рассады овощных культур. Повышается урожай пшеницы, ячменя, сорго, кормовых злаков, риса, и другие культур. Повышается урожай овощных культур: томатов, моркови, картофеля, капусты, сахартной свеклы. и Под овощные кульруры. Стимулирует рост растений, повыщает устойчивость к фитопатогенным грипам: Mucor, Aspergillus, Рenicillum, Alternaria и др. Под пшеницу, ячмень, рис, сорго, кормовые травы и овощные культуры. Повышает всхожесть семян, стимулирует рост, увеличивает устойчивость к грибным болезням и корневым гнилям. Миколин Bacillus. cereus Под капусту и картофель. Стимулирует рост var. mycoides. растений, повышает устойчивость к высоким концентранциям аммиака в почве. Эффективность Миколина повышается при внесении высоких доз азотных удобрений в виде сульфата аммония и мочевины. Ризоагрин Agrobacterium Под пшеницу, ряд кормовых злаков, риса, и другие. radiobacter 204 Повышает урожайность и содержание белка пшеницы. Ризоэнтери Enterobacter Для повышения урожайности риса, ржи, озимой н aerogenes 30. пшеницы и ячменя. Флавобакте Flavobacterium Широкий спектр действия, кроме азотфиксации, рин sp. 130. стимулирует рост растения, продуцирует фитогормоны, улучшает водный обмен и минеральное питание. 37 Продолжение таблицы 3 1 Псевдобакт ерин - 2 Псевдобакт ерин - 3 Экстрасол Агат 25К Бактосан 2 Pseudomonas aureofaciens BS 1393 Pseudomonas putida BS 1398 В состав препарата входят следующие представители: Azospirillum lipoferum 137; Flavobacterium sp.L30; Arthrobacter mysorens 7; Agrobacterium radiobacter 10; Azomonas agilis 12; Bacillus subtilis Ч -13; Pseudomonas fluorescens 2137; Agrobacterium radiobacter 204; Содержит группы инактивированны х бактерий рода Pseudomonas 3 Широкий спектр действия. Бактерии синтезируют некоторые антибиотические вещества и сидерофоры, связывающие железо и переводят его в недоступное состояние, за счет чего бактерии подавляют рост других микроорганизмов, в том числе фитапотагенных. Выявлена эффективность препарата против септориоза, твердой головни, бурой ржавчины и других болезней. Стимулирует рост растения, и растворяет труднодоступный фосфор для поглошения корневой системой. Для изготовления препарата используют несколько видов (ассоциации) или индивидуальные штаммы применительно для данного вида или сорта растений. Существует 3 модификации: Экстрасол – 09 – стимулирующего действия; Экстрасол – 55 – фунгицидностимулирующего действия; Экстрасол- 90 – фунгицидного действия. Спектр действия этой группы препаратов охватывает практически все небобовые культуры. Они стимулируют рост и защищают растения от фитопатогенных микроорганизмов. Кроме бактерий входят в составе препарата иммуногены и биологически активные вещества растительного происхождения; трех макроэлеменов (N, P, K); флавонойдные вещества, сбалансированный набор 13 микроэлементов (В, Cu, Zn, Fe, Mo, Mn, Mg, S, Ci, Ni, Se, Co). Стимулирует рост и повышает устойчивость растений к грибным и бактериальным заболеваниям. Препарат содействует с минеральными удобрениями, гербицидами и фунгицидами, улучшает всхожесть и энергию прорастания семян, обеспечивает азотфиксацию, активизирует процесс фотосинтеза в листьях, повышает усвоение труднодоступных фосфатов из почвы. Рекомендуется под зерновый культуры. Bacillus subtilis Ч Для улучшения питания растения и устойчивости – 13 к болезням. 38 Окончание таблицы 3 1 2 3 Азогрин - Azomonas agilis 12 Стулирует рост и развитие надземной части растения (зеленные и овощные культуры), за счет фиксации азота, образования физиологических активных веществ (ауксины, гибберелины, витамины). Альбит Кроме 2 вида бактерий, в состав Альбита входят еще азотнокислый калий, калий фосфорнокислый двузамещенный, магний сернокислый, карбамид, и отдушки (хвойный экстракт, паста хвойная хлорофилло-каротиновая). Вызывает образование вторичных корней, усиление роста корневой системы, повышение всхожести семян, кустистости и увеличение количества зерен в колосе, активизацию деятельности полезного микробного сообщества ризосферы, увеличивание засухоустойчивости и жаростойскости растений. Преперат обладает фунгицидным действием в отношении широкого спектра возбудителей основных болезней сельскохозяйственных культур (фомоза, фомопсиса, парши, белой и серой гнилей, головневых заболеваний, корневых гнилей, пятнистостей, фузариозов, фитофтороза, бактериозов). Но препарат оказывает фунгицидное действие только при низкой и средней пораженности болезнями, при высокой используют баковые смеси препарата с половиной дозой химических фунгицидов. В его состав входят: гидролизат Bacillus megaterium (содержит действующее вещество – полигидроксимасляную кислоту) и добавки микроэлементы, гидролизат бактерии Pseudomonas aureofaciens) Таким образом, ассоциативные азотфиксирующие бактерии относятся к различным систематическим группам, широко распространѐные в природе, причем место их обитания – корневая система растений. Обитание на корнях (ризосфера, ризоплана) обусловлено сложными взаимодействиями типа ассоциатиного симбиоза. При благоприятных условиях ассоциации, бактерии 39 активно размножаются, фиксируют азот и синтезируют ростактивирующие вещества, что положительно сказывается на растениях. Следовательно, эти микроорганизмы нашли бактериальных удобрений. практическое использование в качестве 40 ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ, ХАРАКТЕРИСТИКА РАСТЕНИЙ И МЕТОДЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В ОПЫТЕ 2.1. Объекты Объектами исследования стали ассоциативные бактерии ризопланы двух видов овощных культур, выращиваемых в условиях Вьетнама: водяной шпинат (Ipomoea aquatica) и разнолистная капуста (Brassica integrifolia), которые ранее не изучались в подобных исследованиях. Водяной шпинат или ипомея водяная – вид цветковых растений семейства вьюнковые (Convolvulaceae). Однолетнее или многолетнее травянистое растение, в пищу употребляются стебли и листья. Капуста разнолистная из семейства капустные (Brassicaceae) – однолетнее растение, высотой 50-100 см. Эти две овощные культуры – одни из важнейших во Вьетнаме. 2.2. Характеристика растений, используемых в опытах Опыты по инокуляции растений выделенными бактериями проводили на партенокарпическом гибриде F1 огурца (Cucumis sativus) F1 Кассандра селекции Российского государственного аграрного университета - МСХА имени К.А.Тимирязева и разнолистной капусте (Brassica integrifolia) сорта «VK 13» агрофирмы «Vinh Nông». Огурец (Cucumis sativus) - однолетнее травянистое растение семейства Тыквенные (Cucurbitaceae), вегетационный период длится 45 – 72 дней, многочисленные боковые корни находятся преимущественно в верхнем слое почвы толщиной 20-25 см, распространяясь широко в стороны до 70 – 100 см. Партенокарпический гибрид F1 огурца F1 Кассандра раннеспелый – первые плоды достигают технической стадии зрелости менее чем через 45 дней после появления всходов. Товарная урожайность 21,3 кг/ м2. В среднем за вегетацию одно растение поглощает в день 0,1 – 0,2 г азота, 0,05 – 0,08 г фосфора, 0,2 – 0,4 г калия при урожайности 10 – 15 кг/м2. В теченеие 2 – 3 41 недель после появления всходов растения не требует усиленного питания: от начала цветения до образования завязей в растение поступает около 20% питательных веществ, а основная часть (70%) потребляется в период плодоношения. В первые 10 – 15 дней огурец больше нуждается в азоте, затем до начала цветения – в фосфоре, а во время плодоношения – в азоте и особенно калии (Портянкин, Шамшина, 2010). Средние показатели выноса (г/кг продукты) азота при возделывании огурца в теплицах составляют 1,4 г/кг (Круг, 2000). Капуста разнолистная из семейства капустные (Brassicaceae) – происходящая из Индии, Китая, и выращивается в Индии, Китае, и Вьетнаме, однолетнее растение, высотой 50-100 см, вегетационный период длится 20 30 дней. Научная информация о разнолистной капусте очень ограничена. 2.3. Методы 2.3.1. Метод отбора проб корней, проведенный во Вьетнаме и получения накопительных культур Для анализа азотфиксирующих микроорганизмов ризопланы были отобраны образцы корней двух видов овощных культур из Вьетнама - Ipomoea aquatica и Brassica integrifolia. Профиль образцы почвы из Вьетнама: пах (0-20 см), черной окраски, комковатый, Bg (20-30 см) сизой окраски с рыжими прожилками, рНсол. – 6,4; рН вод. – 6,9; органическое вещество – 1,3%; подвижный калий – 123 мг/кг; подвижный фосфор – 48 %; аммонийный азот – 217 мг/кг; нитратный азот – 62 мг/кг. Корни растений отмывали в стерильной воде, помещали во флаконы с безазотистой питательной средой Федорова-Калининской (Нетрусов и др., 2005) (г/л дистиллированной воды): К2НРО4 - 1,74; КН2РО4 -0,91; MgSO4·7Н20 – 0,3; NaCl – 0,5; CaCl2·6Н20 – 0,1; FeСl3·6Н20 – 0,01. К ней добавляли (г/л): глюкозу – 10, дрожжевой автолизат – 0,1, и бромтимолблау раствор 0,5% спиртовой – 2 мл, инкубировали при температуре 25-28°С. 42 Затем культуры пересевали в пенициллиновых флакончиках (объем 15мл) с 5 мл полужидкой средой Федорова-Калининской с сахарозой или малатом и смесью витаминов (мкг/л): биотин – 10, рибофлавин – 200, витамин В12 – 2, тиамин, пиридоксин, пантотенат кальция, никотиновую и парааминобензойную кислоту – по 100. Инкубацию культур проводили при 28°С в течение 2 недель. Всего было получено 36 накопительных культур. 2.3.2. Метод выделения чистых культур Из накопительных культур, показавших высокий уровень нитрогеназной активности, выделяли чистые культуры бактерий на средах DAS (Завалин и др., 2001) (следующего состава г/л: KH2PO4 - 0,4; K2HPO4 0,1; MgSO4.7 H2O - 0,2; NaCl - 0,1; CaCl2.2 H2O - 0,02; FeCl3.6 H2O - 0,01; Na2MoO4. 2 H2O - 0,002; малат натрия - 2,5; сахара - 1,0; дрожжевой экстрат 1,0г; агар - 20,0; и 2 мл бротимолблау 0,5% спиртов раствор) и Эшби (Нетрусов и др., 2005) (следующего состава г/л: маннит - 20,0; KH2PO4 - 0,2; MgSO4.7 H2O - 0,2; NaCl - 0,2; K2SO4 - 0,1; CaCO3 - 5,0; агар - 20,0). Затем пересевали чистые культуры в пенициллиновые флакончики (объем 15 мл) с 5 мл полужидкой среды Федорова-Калининской с сахарозой и через неделю использовали для определения нитрогеназной активности. Параленно, для сохранения каждой чистой культуры для дальнейщего анализа, их пересевали в пробирки на скошенную среду DAS. 2.3.3. Метод опредедения нитрогеназной активности накопительных культур и чистых культур Активность фиксации азота определяли ацетиленовым методом (Звягинцев, 1991) с помощью газового хроматографа Chrom-4, на кафедре биологии почв факультета почвоведения МГУ имени М.В. Ломоносова. Диазотрофные культуры выращивались в пенициллиновых флакончиках, закрытых ватными пробками. Перед измерением пробки заменяли на эластичные резиновые, прочно заворачивали в полиэтилен, добавляли во 43 флакон 1 мл ацетилена, а затем инкубировали образцы сутки при 28°C. Азотфиксирующую активность выражали в наномолях образовавшегося этилена за 1 час инкубации. Активность азотфиксации вычисляли по формуле: АФ = (наномоль С2Н4/ ч), где 0,0067 - калибровочная коэффициента на этилен, S - площадь пика этилена (мВ·сек), V - объѐм воздуха в пенициллиновом флакончике, T время инкубации с ацетиленом (час). 2.3.4. Метод определения ростактивирующего эффекта чистых культур Для выяснения ростактивирующего эффекта выделенных культур был проведен опыт с кресс-салатом. Повторность опытов трѐхкратная. Семена замачивали в течение 30 минут в суточной бактериальной культуре разной концентрации: разведение в 10, 100, 1000 раз; контроль – вода. После этого в чашках Петри на фильтровальную бумагу раскладывали по 20 обработанных семян и вносили 2 мл воды. Затем семена проращивали в термостате при 25С. Через 72 ч измеряли длину корешков и стебельков проростков. 2.3.5. Метод определения влияния чистых культур на рост, массу стеблья, нитрогеназную активность растения и нитрогеназную активность на корнях растения в модельном опыте Модельный опыт проводили на партенокарпическом гибриде F1 огурца (Cucumis sativus) F1 Кассандра Российского государственного аграрного университета - МСХА имени К.А.Тимирязева и разнолистной капусте (Brassica integrifolia) сорта «VK 13» агрофирмы «Vinh Nông». Выращивание растений проводилось в условиях климатической камеры в течение 40 дней при следующих параметрах: день 16 ч при +25С, ночь 8 ч при +18С. Семена огурцов замачивали в воде в течение 2-х суток, а семена разнолистной капусты сутки при температуре 25С. Перед посевом 44 проросшие семена двух видов растений выдерживали в суточной бактериальной культуре в течение 2 часов. Титр суточной культуры составлял 7,5·108 – 8,0·108 КОЕ/мл. Обработанные проросшие семена высевали в стеклянные сосуды (объем 150 мл) с вермикулитом и взвесью Прянишникова, сосуды закрывались ватной пробкой. После 20 дней растения поливали в каждом варианте 8 мл раствора бактериальной суточной культуры разведение 1:50 (титр суточной культуры составлял интервал 1,80·108 – 2,0·108 КОЕ/мл). Повторность опытов шестикратная. Для определения нитрогеназной активности культур в ассоциации с растениями на десятый и двадцатый дни наблюдения мы добавляли в сосуды с вермикулитом и растением 10 мл ацетилена, герметично закрывали их эластичной резиновой пробкой, прочно заворачивали в полиэтилен и инкубировали в течение 2-х суток. Для измерения нитрогеназной активности на корнях растений после 40 дней наблюдений мы отбирали образцы корней растения (0,1 г для огурца и 0,01 г для разнолистной капусты), отмывали их в воде, помещали во флаконы (объем 15 мл) с 5 мл безазотной питательной среды Федорова-Калининской и инкубировали в термостате 28°C в течение 1 недели. Затем добавляли 1 мл ацетилена и после этого инкубировали 1 сутки перед измерением. Анализы также включали в себя измерение высоты и массы стебля растений после 40 дней наблюдений. Опыт проводился с изолятами, выделенными из ризопланы двух видов овощных культур, для которых была характерна самая высокая азотфиксирующая способность и cпособность к активизации роста растений. Схема модельного опыта с огурцом и разнолистной капустой: Вариаты: 1. Без инокуляции (контроль) 2. изолят С7 3. изолят С43 45 4. изолят С22 5. изолят F12 6. изолят C19 7. изолят E17 8. изолят J26 В каждом варианте выращивали растения в 5 г вермикулита с 15 мл смеси Прянишникова (Гродзинский, Гродзинский, 1964). Состав смеси Прянишникова: а. Макроэлементы (г/л дистиллированная вода): Реактивы вносят в растворенном виде 1. NH4NO3 – 0,24 2. KCl – 0,16 3. MgSO4 – 0,06 или MgSO4.7H2O – 0,123 4. FeCl3 – 0,025 Реактивы вносят в сухом виде 5. СaHPO4.2H2O – 0,172 6. CaSO4.2H2O – 0,344 б.Микроэлементы, мг/100г субстрат: 1. В (в виде Na2B4O7. 10 H2O) – 0,5 2. Mn (в виде МnSO4.2 H2O) – 0,25 – 0,5 3. Cu (в виде СuSO4.5 H2O) – 0,1 4. Zn (в виде ZnSO4.7H2O) – 0,1 5. Mo (в виде (NH4)2MoO4.4H2O) – 0,2 или ( в виде Na2MoO4. 2 H2O) – 0,5. в. 1 л дистиллированная вода. 2.3.6. Метод определения морфологических и физиолого-биохимических особенностей отобранных культур Морфологические особенности полученных чистых культур, для которых была характерна самая высокая азотфиксирующая активность, 46 исследовали под микроскопом Axioimager. Измерение размеров клетки осуществляли с использованием программы Axiovision Rel.4.7. Физиолого-биохимические особенности отобранных культур изучали классическими методами (Герхардт et al., 1984; Нетрусов и др. 2005) в соответствии с показателями, согласно «Определителью бактерий Берджи» (Хоулт et al., 1997). Мы рассматривали следующие показатели: образование кислоты из глюкозы, образование оксидазы, рост при 35°C, образование 3кетолактозы, подкисление среды при использовании этанола. 2.3.6.1. Метод диагностики способности образования 3-кетолактозы Культуру выращивали на среде D S (содержащей 2% СаС03, 1% дрожжевого экстракта, 2% глюкозы, и 1,5—2,0% агара). Выросшую культуру снимали петлей с косяка и помещали в виде капли диаметром около 5 мм на поверхности лактозного агара в чашке Петри (2% агара, 0,1% дрожжевого экстракта, 1% лактозы). Можно проверить от 4 до 6 различных штаммов на одной чашке. Инкубировали в течение 2 дней, затем заливали тонкий слой реактива Бенедикта на поверхности агара. Положительная реакция: образование желтого кольца оксида меди вокруг зоны роста, достигающего максимальной величины через 2 ч (приблизительно 2—3 см) (Герхардт, 1984). Состав реактива Бенедикта: цитрат натрия 17,3 г; Na2C03 - 10,0 г; CuS04.5H20 - 1,73 г. Первые два компонента растворяли при нагревании в 80 мл воды. Смесь фильтровали, разбавляли до 85 мл. Растворяли CuS04 в 10 мл воды и, помешивая, переливали в карбонатно-цитратный буфер. Общий объем доводили до 100 мл дистиллированной водой (Герхардт, 1984). Согласно данным литературам Герхардта Ф. (1984), положительную реакцию проявляют только Agrobacterium tumefaciens и A. radiobacter; все остальные бактерии, изученные к настоящему времени, дают отрицательную реакцию (Ф. Герхардт, 1984). 47 2.3.6.2. Метод диагностики способности образования кислоты из глюкозы Микроорганизмы выращивались на среде со следующим основным фоном (г/л): пептон – 5,0; K2HPO4 – 1,0; вода дистиллированная, и добавляли 10 г глюкозы. Образование кислот регистрируют по изменению рН среды. Для этого к основному фону добавляли индикатор из расчета 2 мл 1,6% - го спиртового раствора на 1 л среды, в качестве индикатора применяли бромкрезолпурпур, изменяющий цвет от пурпурного к желтому в интервале рН 6,8 – 5,2. ―Основный фон‖ с раствором индикатора разливали в пробирки по 8 – 10 мл и стерилизовали при 1,0 атм. Глюкозу готовили в виде 10% водного раствора и стерилизовали отдельно от основного фона среды с автоклавированием при 0,5 атм. После этого среду засевали суспензией клеток микроорганизмов и выдерживали 7 сут. Изменение цвета индикатора указывает на образование кислых или щелочных продуктов метаболизма. 2.3.6.3. Метод определения способности образования оксидазы Мы использовали стандартный индикартный бумажный OXI – тест. 2.3.6.4. Метод наблюдения способности подкисления среды при использовании этанола Метод аналогичен методу диагностики способности образования кислоты из глюкозы, за исключением замены глюкозы этанолом. 2.3.7. Метод определения филогенетического положения выделенных микроорганизмов Филогенетическое положение выделенных микроорганизмов определяли на основании секвенирования гена 16S рРНК. Выделение ДНК из бактерий осуществляли согласно методу (Манучарова и др., 2008). Концентрация полученных препаратов ДНК составляла 30-50 мкг/мл. Для проведения полимеразной цепной реакции и дальнейшего секвенирования 48 ПЦР-фрагментов гена 16 S рРНК применяли пару «полнометражных» праймеров (Манучарова, 2014). Секвенирование ПЦР-продуктов проводили с использованием набора реактивов SilverSequencing, Promega (США), согласно рекомендациям производителя. Анализ сходства нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК изучаемых штаммов был проведен при использовании генбанка BL ST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). Последовательности были выровнены с соответствующими последовательностями ближайших видов бактерий с помощью программы BioEdit (http://jwbrown.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html). Филогенетические деревья были построены на основании нуклеотидных последовательностей фрагментов гена 16S рРНК c помощью алгоритма «neighbour-joining», реализованного в программе Mega. 2.3.8. Определение влияния разных штаммов Agrobacterium tumefaciens на урожай растения в мелкоделяночном опыте в условиях теплицы При проведении мелкоделяночного опыта семена огурца замачивали в воде при +25° С в течение 2 суток, семена разнолистной капусты замачивали на сутки. Затем проростки каждого из растений замачивали на 3 часа в растворе соответствующей чистой культуры, приготовленного из суточной культуры, после чего их высаживали в горшочки, наполненные специальным торфяным питательным субстратом (ТПС) для выращивания овощных культур в закрытом грунте в качестве рассады (Самохин, 2011). После 2 недель рассаду высаживали в закрытый грунт. Содержание подвижного азота в грунте перед мелкоделяночным опытом было измерено и составляло 60 мг/л. Эта величина находится ниже оптимальных значений для выращивания овощных культур в защищенном грунте (Круг, 2000) (приложение 9), и для огурца требует внесения доз азота 6-11 г/м3, по действующему веществу (Портянкин, Шамшина, 2010) 49 (приложение 6, 8). В связи с этим мы можем ожидать позитивного эффекта от инокуляции ассоциативными азотфиксирующими бактериями, улучшающими условия питания культурных растений. После появления первого настоящего листа растения огурца повторно инокулировали разбавленной суточной культурой бактерий определенных чистых культур согласно схеме опыта (1 часть суточной культуры на 50 частей водопроводной воды). Под каждое растение огурца вносили 50 мл суспензии, разнолистной капусты – 10 мл. Суточную культуру готовили, внося 1 петлю штамма в 100 мл среды D S. Титр суточной культуры составлял порядка 3,0·108 – 5,0·108 КОЕ/мл. Мелкоделяночный опыт проводился в трехкратной повторности, причем каждая повторность была представлена 12 растениями. Контрольный вариант не подвергался инокуляции, остальные инокулировались одним из 7 отобранных ранее наиболее активных штаммов. Проводились измерения нитрогеназной активность на корнях растений (на разных фазах), общего содержания азота в листьях во время плодоношения по Кьельдалю (Кидин и др., 2008), содержание NO3- в урожае нитратомером Ашон 4100 методом прямой потенциометрии с помощью электродной системы. Также измерялась высота растений после 2 и 4 недели наблюдения, изменение роста в течение пятой недели, масса стебля после 2 недель наблюдения. Все измерения проводились на кафедре агрономической, радиологии РГАУ - МСХА им. К.А. Тимирязева. Схема мелкоделяночного опыта с огурцом: Вариаты: 1. Без инокуляции (контроль) 2. изолят С7 3. изолят С43 4. изолят С22 5. изолят F12 биологической химии и 50 6. изолят C19 Схема мелкоделяночного опыта с разнолистной капустой: Вариаты: 1. Без инокуляции (контроль) 2. изолят С22 3. изолят F12 4. изолят C19 5. изолят E17 6. изолят J26 2.3.9. Статическая обработка полученных данных Статистическую обработку полученных данных проводили по критериям Фишера-Стьюдента с использованием программы Statistica 5.5 (дисперсионный анализ со сравнением средних по критерию Дункана с помощью пакета Statistica 5.5). Корреляционный анализ проводился с использованием программы Ecxel. 51 ГЛАВА 3. ИЗУЧЕНИЕ НИТРОГЕНАЗНОЙ АКТИВНОСТИ НАКОПИТЕЛЬНЫХ КУЛЬТУР И ВЫДЕЛЕННЫХ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР Согласно литературным данным (Мишустин и др., 1978; Гочелашвили, 1987; Dart, Wani, 1982; Purschase, 1987), в зоне субтропиков в бурых, желтоземных, красноземных и коричневых почвах и особенно в почвах тропической зоны протекает наиболее интенсивно несимбиотическая азотфиксация (в среднем 200 кг/га/год). Наши накопительные культуры получили из ризопланы растений, выращиваемых на почвах Вьетнама, в условиях субтропической и тропической зоны, поэтому ожидали высокий уровень нитрогеназной активности этих накопительных культур. В 1995 году, многие ученые из разных научных центров Вьетнама, работающих в области биологии, работали над проблемой производства и внедрения микробных удобрений, для чего были выделенны 309 изолятов, показавших высокую нитрогеназную активносить и положительный эффект на развитие риса и других культур в условиях разных провинций Вьетнама (20 штаммов Azospirillum brasilence, 22 штамма Azospirillum lipoferum, 12 штамма Flavobacterium sp., 1 штамм Enterobacter aerogenes, 15 штаммов Agrobacterium radiobacter, 7 штаммов Arthrobacter mysorence, 7 штаммов Arthrobacter globiformis и.т.д в том числе 60 чистых культур из ризопланы риса неопределены.). Ученые из Вьетнама тоже использовали ацетиленовый метод для оценки нитрагеназной активности полученных культур и результат колеблется в широких пределях (например, нитрогеназная активность разных штаммов Azospirillum на корнях риса варьрует в пределах 16,8 – 113,9 наномоль/мл/час) (Nguyễn Kim Vũ, 1995). 3.1. Изучение нитрогеназной активности накопительных культур В результате проведенных нами исследований установлено, что все 36 образцов накопительных культур полученных из ризопланы Ipomoea aquatica 52 и Brassica integrifolia характеризуются азотфиксирующей активностью (табл. 4, 5). Таблица 4 Нитрогеназная активность накопительных культур из ризопланы Ipomoea aquaticа, которые были культивированы на среде Федорова-Калининской с сахарозой или с малатом (наномоль С2Н4/ч) Номер на среде ФедороваНомер на среде Федороваобразца Калининской с сахарозой образца Калининской с малатом 1 1,15 10 0,15 2 0,92 11 0,29 3 0,87 12 0,05 4 13,00 (А) 13 1,24 5 19,21 (В) 14 0,41 6 13,75 (С) 15 0,32 7 12,32 (D) 16 0,91 8 1,06 17 1,04 9 0,92 18 0,87 Примечание: буквы , B, C, D обозначают накопительные культуры, обладающие самой высокой нитрогеназной активностью. Таблица 5 Нитрогеназная активность накопительных культур из ризопланы Brassica integrifolia, на среде Федорова-Калининской с сахарозой или с малатом (наномоль С2Н4/ч) Номер образца на среде ФедороваКалининской с сахарозой Номер образца на среде Федорова-Калининской с малатом 1 2 3 4 5 6 7 8 0,71 0,59 0,69 0,70 0,56 0,50 9,01 (E) 10,29 (F) 10 11 12 13 14 15 16 17 0,82 1,11 0,95 0,92 0,81 1,11 0,96 0,77 9 10,31 (J) 18 0,96 Примечание таблицы 5: буквы E, F, J обозначают накопительные культуры, для которых характерна самая высокая нитрогеназная активность. Самая высокая нитрогеназная активность среди полученных накопительных культур была выявлена на среде Федорова-Калининской с сахарозой. Она достигла 19,21 наномоль С2Н4/ч. На среде ФедороваКалининской с малатом уровень нитрогеназной активности был заметно 53 ниже (самое высокое значение составило только 1,24 наномоль С2Н4/ч). В целом, образцы из ризопланы Ipomoea aquatica характеризуются более высоким уровнем азотфиксирующей активности, чем из ризопланы Brassica integrifolia (Фунг и др., 2014). 3.2. Изучение нитрогеназной активности чистых культур Из накопительных культур, имеющих самую высокую нитрогеназную активность ( -J), было выделено 227 чистых культур на 2 средах DAS и Эшби. Затем из культур, выделенных из каждой накопительной культуры, мы отобрали чистые культуры, которые имеют самую высокую активность азотфиксации по сравнению с другими. В результате проведенных наблюдений накопительной культуры А, полученной из ризопланы Ipomoea aquaticа, было выделело 47 чистых культур, из них наибольшей нитрогеназной активностью обладает изолят А20 (29,37 наномоль С2Н4/ч) (рис.1). нитрогеназная активность (наномоль С2Н4/ч ) 35.00 30.00 25.00 20.00 15.00 10.00 5.00 0.00 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 номер изолятов Рисунок 1. Нитрогеназная активность чистых культур, выделенных из накопительной культуры А, на среде Федорова-Калининской с сахарозой, полученной из ризопланы Ipomoea aquaticа (наномоль С2Н4/ч) В последующих опытах из накопительной культуры В, полученной из ризопланы Ipomoea aquaticа, выделили 32 чистые культуры, большинство из которых обладали очень низкой нитрогеназной активностью, кроме двух изолятов: В30 показал 19,44 наномоль С2Н4/ч и изолят В31 показал 27,81 наномоль С2Н4/ч (рис 2). 54 нитрогеназная активность (наномоль С2Н4/ч ) 30.00 25.00 20.00 15.00 10.00 5.00 0.00 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011121314151617181920212223242526272829303132 номер изолятов Рисунок 2. Нитрогеназная активность чистых культур, выделенных из накопительной культуры B, на среде Федорова-Калининской с сахарозой, полученной из ризопланы Ipomoea aquaticа (наномоль С2Н4/ч) Ряд изолятов, имеющих достаточно высокую нитрогеназную активность, было выделено из накопительной культуры С, полученной из ризопланы Ipomoea aquaticа (рис.3). В результате из накопительной культуры С, выделили 47 чистых культур, среди которых 8 имеют нитрогеназную активность больше, чем 40 наномоль С2Н4/Ч. Азотфиксирующая активность изолята С7 достигла 44,24; С12 - 42,7; C13 - 43,2; C19 - 42,57; C22 - 42,87; C31 - 42,65; C37 - 43,9; C43 - 41,95 наномоль С2Н4/ч. нитрогеназная активность (наномоль С2Н4/ч ) 50.00 40.00 30.00 20.00 10.00 0.00 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 номер изолята Рисунок 3. Нитрогеназная активность чистых культур, выделенных из накопительной культуры C на среде Федорова-Калининской с сахарозой, полученной из ризопланы Ipomoea aquaticа (наномоль С2Н4/ч) 55 Из накопительной культуры D, полученной из ризопланы Ipomoea aquaticа, выделили 21 чистую культуру, из них был отобран один изолят, нитрогеназная активность которого достигла 2,58 наномоль С2Н4/ч (рис 4). 3.00 нитрогеназная активность (наномоль С2Н4/ч ) 2.50 2.00 1.50 1.00 0.50 0.00 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 номер изолята Рисунок 4. Нитрогеназная активность чистых культур, выделенных из накопительной культуры D, на среде Федорова-Калининской с сахарозой, полученной из ризопланы Ipomoea aquaticа (наномоль С2Н4/ч) Изучение нитрогеназной активности чистых культур, выделеных из накопительной культуры E, полученной из ризопланы Brassica integrifolia, проводено получить 31 чистую культуру. Нитрогеназная активность изолята E17 достигла 4,13 наномоль С2Н4/ч и изолят E30 показал уровень 2,96 наномоль С2Н4/ч (рис 5). нитрогеназная активность (наномоль С2Н4/ч ) 5.00 4.00 3.00 2.00 1.00 0.00 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1314 15 16 17 181920 2122 23 24 25 2627 282930 31 номер изолята Рисунок 5. Нитрогеназная активность чистых культур, выделенных из накопительной культуры E, на среде Федорова-Калининской с сахарозой, полученной из ризопланы Brassica integrifolia (наномоль С2Н4/ч) 56 Определение нитрогеназной активности 30 чистых культур, выделенных из накопительной культуры F, полученной из ризопланы Brassica integrifolia, показало что, наиболее активностью обладает изолят F12 (8,99 наномоль С2Н4/ч) (рис 6). нитрогеназная активность (наномоль С2Н4/ч ) 10.00 8.00 6.00 4.00 2.00 0.00 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 номер изолята Рисунок 6. Нитрогеназная активность чистых культур, выделенных из накопительной культуры F на среде Федорова-Калининской с сахарозой, полученной из ризопланы Brassica integrifolia (наномоль С2Н4/ч) Исследование нитрогеназной активности 40 изолятов, выделенных из накопительной культуры J, полученной из ризопланы Brassica integrifolia, показало что нитрогеназная активность изолята J26 достигла 2,41 а изолята J35 была равна 2,27 наномоль С2Н4/ч. Эти 2 изолята имеются самую высокую азотфиксирующую активность (рис 7). 3.00 нитрогеназная активность (наномоль С2Н4/ч ) 2.50 2.00 1.50 1.00 0.50 0.00 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 номер изолята Рисунок 7. Нитрогеназная активность чистых культур, выделенных из накопительной культуры J, на среде Федорова-Калининской с сахарозой, полученной из ризопланы Brassica integrifolia (наномоль С2Н4/ч) 57 Таким образом, для дальнейшей работы были отобраны 17 чистых культур, которые имеют самую высокую активность азотфиксации: 20, B30, B31, C7, C12, C13, C19, C22, C31, C37, C43, D2, E17, E30, F12, J26, J35. Эти изоляты нами в будущем будут использоваться для изучения их способность к активизации роста растений (Фунг и др., 2014). 58 ГЛАВА 4. ИЗУЧЕНИЕ РОСТОВОГО ЭФФЕКТА ЧИСТЫХ АССОЦИАТИВНЫХ АЗОТФИКСАТОРОВ В настоящее время доказано, что положительное влияние азотфиксирующих бактерий на продуктивность растений может быть обусловлено не только улучшением азотного питания, но и синтезом диазотрофами ростактивирующих веществ, а также подавлением роста фитопатогенных микроорганизмов (Емцев, 1994; Фунг, 2014). Растения и ризосферные бактерии ―обмениваются‖ химическими веществами ―сигналами‖, которые позволяют вступать симбиотические им в – взаимоотношения. Среди таких веществ, образуемых ризобактериями, имеются стимуляторы роста растений – гормоны роста растений, в частности ауксин (индолил – 3- уксусная кислота (ИУК)). Активными продуцентами ИУК являются бактерии Aeromonas veronii, Edwardsiella tarda, Listonella anguillarum, Pantoea ananas, Vibria fluvialis, Vibrio furnissii, в том числе типичные почвенные бактерии, представители родов Arthrobacter, Agrobacterium, Pseudomonas и некоторые другие (Тихонович, Проворов, 2009). Как показывают результаты, большинство полученных штаммов способны к активации роста растений. При достаточно высоком разведении (1:100,1:1000) бактериальной культуры наблюдалась существенная стимуляция роста как корней (от 110% до 149%), так и стеблей (от 110 до 139%) (рисунки 10 – 13). При разведении 1:10, все варианты показывают значения, близкие к контролю (рис. 8 – 9). Один из изолятов (D2) ингибировал прорастание семян и развитие проростков кресс-салата в любом из испытанных разведений (рис. 8-14). 59 длины стебльков проростков (мм) 30 25 20 15 10 5 0 D2 J26 C19 B31 B30 F12 C13 E17 C37 C43 C22 C31 A20 E30 Кон С12 J35 С7 Контроль и изоляты Рисунок 8. Длины стебельков проростков кресс-салата, после замачивания семян в разведении 1: 10 суточной культуры разных изолятов в течение 30 минут и инкубации при 25°C через 72 часа длины корешков проростков (мм 60 50 40 30 20 10 0 D2 B31 E30 A20 C19 C37 C31 J26 F12 C31 J35 C7 C12 B30 Кон С43 E17 C22 Контроль и изоляты Рисунок 9. Длины корешков проростков кресс-салата, после замачивании семян в суточных культур разных изолятов в разведении 1: 10 в течение 30 минут и инкубации при 25°с через 72 часа 60 длины стебльков проростков (мм) 25 117 119 122 123 111 114 114 115 115 117 106 109 100.8 99.7 20 93 99 100 15 10 400 5 0 D2 C31 C13 E17 кон A20 B30 C12 C22 C43 F12 c37 B31 E30 J26 J35 C7 C19 Контроль и изоляты Рисунок 10. Длины стебельков проростков кресс-салата, после замачивания семян в разведении 1: 100 суточной культуры разных изолятов в течение 30 минут и инкубации при 25°C через 72 часа. Над столбиками указано процентное отношение величины к контролю длины корешков проростков (мм) 45 127 122 40 108 35 93 30 100 103 109 111 114 119 121 131 133 139 128 149 123 25 20 49 15 10 5 0 D2 C13 кон C43 C31 A20 B31 C12 E30 c37 C7 J35 C22 B30 E17 C19 F12 J26 Контроль и изоляты Рисунок 11. Длины корешков проростков кресс-салата, после замачивании семян в суточных культур разных изолятов в разведении 1: 100 в течение 30 минут и инкубации при 25°с через 72 часа. Над столбиками указано процентное отношение величины к контролю длины стебльков проростков (мм 61 35 139 30 25 109 20 97 100 115 111 115 117 117 119 120 120 128 121 129 129 134 15 47 10 5 0 D2 C13 кон A20 C12 J26 B30 B31 c37 E17 C7 C19 C31 E30 C22 J35 C43 F12 Контроль и изоляты Рисунок 12. Длины стебельков проростков кресс-салата, после замачивании семян в разведении 1: 1000 суточной культуры разных изолятов в течение 30 минут и инкубации при 25ос через 72 часа. Над столбиками указано процентное отношение величины к контролю 50 длины корешков проростков (мм 45 131 40 112 114 100 100.6 149 127 109 35 136 141 115 115 116 117 118 120 96 30 25 20 15 41 10 5 0 D2 C13 кон A20 c37 B31 C12 C31 C7 B30 C19 J35 C43 E30 F12 J26 C22 E17 Контроль и изоляты Рисунок 13. Длины корешков проростков кресс-салата, после замачивании семян в разведении 1: 1000 суточной культуры разных изолятов в течение 30 минут и инкубации при 25ос через 72 часа. Над столбиками указано процентное отношение величины к контролю Для проверки влияния полученных культур бактерий на растения в условиях модельного опыта, мы отобрали изоляты, дававшие максимальный ростовой эффект. Это изоляты: E17, C22 (максимальный ростовой эффект 62 при разведении 1:1000 на корешки, 141% и 149 % от контроля) (рисунок 15), C43, F12 (максимальный эффект в варианте 1:1000 на стебельки, 134% и 139% от контроля), J26 (максимальный эффект при 1:100 на корешки, 149% от контроля), C7, C19 (максимальный эффект при 1:100 на стебельки, 122% и 123% от контроля). Изоляты С7, С19, С22, С43 были выделены из ризопланы Ipomoea aquaticа, а изоляты E17, F12, J26 – из ризопланы Brassica integrifolia. Рисунок 14. Вариант ингибирования изолятом D2 на проростки кресс-салата Рисунок 15. Вариант стимулирующего действия изолята E17 на рост проростки семян кресс-салата 63 Таким образом, определена ростактивирующая способность ряда микробных культур, выделеных из ризопланы Ipomoea aquatica и Brassica integrifolia. Наиболее активно стимулировали рост кресс-салата изоляты С7, С19, С22, С43, выделенные из ризопланы Ipomoea aquaticа и изоляты E17, F12, J26 из ризопланы Brassica integrifolia (приложение 1). Эти наиболее активные изоляты были отобраны для модельных опытов с огурцом и разнолистной капустой. 64 ГЛАВА 5. ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ЧИСТЫХ АССОЦИАТИВНЫХ АЗОТФИКСАТОРОВ НА НИТРОГЕНАЗНУЮ СПОСОБНОСТЬ, РОСТ И РАЗВИТИЕ ОГУРЦА И РАЗНОЛИСТНОЙ КАПУСТЫ В МОДЕЛЬНОМ ОПЫТЕ Поставленный нами модельный опыт с огурцом и разнолистной капустой позволил нам оценить способность разных изолятов к развитию в ризосфере растений и снабжению растений азотом. Извесно, что морфологические показатели развития растения является интегральным показателем, визуально отражающим насколько данные условия благоприятны для растения (Эдельштейн, 1962). На огурцах и разнолистной капусте после 10 дней наблюдения, азотфиксирующая активность почти во всех сосудах с растениями, инокулированными исследуемыми изолятами, была низкая и находилась на уровне предела обнаружения. Нитрогеназная активность могла быть измерена только после 20 дней опыта (рис. 16, 18). После завершения опыта измерялась азотфиксация на отобранных и отмытых корнях растений, помещенных в безазотную питательную среду Федорова-Калининской. Корреляции между активностью азотфиксации чистых культур в ассоциации с растениями огурца и разнолистной капусты после 20 дней выращивания и на корнях растений после 40 дней выращивании не обнаружено. 5.1. Влияние чистых культур на растения огурца в модельных опытах На рисунке 16 показано, что в условиях модельного опыта (стерильный субстрат, поэтому бактерии не конкурируют с бактериями в субстрате, только конкурируют с бактериями на семенах), инокуляция бактериями оказала существенное воздействие на массу стеблей огурца. 250 1 0.9 200 0.8 0.7 150 0.6 0.5 100 0.4 0.3 50 0.2 Масса стебля, г/растеие Активность азотфикции, наномоль C2H4/ч 65 0.1 0 0 F12 C19 C43 C7 E17 C22 J26 кон Контроль и варианты инокуляции Активность азотфиксации на растении огурца после 20 дней выращивания Активность азотфиксации на 1 г корней огурца после 40 дней выращивания Масса стебля огурца после 40 дней выращивания Рисунок 16. Активность азотфиксации растения огурца после 20 дней выращивания, активность азотфиксации на корнях растений и масса стебля огурца после 40 дней выращивании Рисунок 17. Визуальное сравнение влияние изолятов F12 (из ризопланы Brassica integrifolia) и С7 (из ризопланы Ipomoea aquatica) на рост и массу огурца с контролем (вода) 66 Однако, зависимости между активностью азотфиксации бактерий в ассоциации с растениями огурца и увеличением массы стебля растений после 20 дней выращивания выявлено не было. Но через 20 дней (40 дней выращивания) было отмечено возрастание азотфикцирующей способности на корнях огурца, которое тесно коррелировло с увеличением массы стебля (коэффициент корреляции г = 0,9; tr = 9, 67 > t05). В условиях модельного опыта, инокуляция следующими изолятами оказывает хорошее влияние на массу стебля огурца: C43 (150% от контроля), F12 (168% от контроля), С22 (179% от контроля), С7 (180% от контроля), С19 (186% от контроля) (Приложение 2). При инокуляции этих изолятов стимулирующий эффект заметен визуально (рис. 17). Эти изоляты были отобраны для мелкоделяночного опыта с огурцом. 5.2. Влияние чистых культур на растения разнолистной капусты в модельных опытах Между активностью азотфиксации на корнях растений и массой стебля после 40 дней выращивания наблюдается слабая корреляция (r = 0,45; tr = 2,37 > t05) (рис. 18). Наибольшее увеличение массы стебля растений огурца было отмечено в вариантах с инокуляцией чистыми культурами: J26 (113% от контроля), E17 (146% от контроля), С19 (165% от контроля), С22 (167% от контроля) и F12 (177% от контроля). Эти чистые культуры были выбраны для проведения мелкоделяночного опыта с разнолистной капустой. 350 0.2 300 0.15 250 200 0.1 150 100 0.05 50 0 0 F12 C19 C43 J26 E17 C22 C7 Масса стебля, г/растение Активность азотфикции, наномоль C2H4/ч 67 кон Контроль и варианты инокуляции Активность азотфиксации растении разнолистной капусты после 20 дней варыщивания Активность азотфиксации на 1 г корней разнолистной капусты после 40 дней выращивания Масса стебля разнолистной капусты после 40 дней выращивания Рисунок 18. Активность азотфиксации растений разнолистной капусты после 20 дней выращивания, активность азотфиксации на корнях растений и масса стебля разнолистноц капусты после 40 дней выращивания Рисунок 19. Визуальное сравнение влияния изолята F12 (из ризопланы Brassica integrifolia) на рост и массу разнолистной капусты с контролем (вода) через 10 дней наблюдений Таким образом, в условиях модельного опыта на стерильном субстрате, инокуляция растений изучемыми бактериями оказывает положительное влияние на рост и развитие, как огурца, так и разноличтной капусты. Лучшие показатели были отмечены в вариантах с инокуляцией штаммами С19 в 68 опыте с разнолистной капустой (увеличение биомассы надземной части растений на 186% от контроля) и F12 в опыте с огурцом (177% от контроля). Для дальнейших исследований были отобраны следующие изоляты: C43, C7, C22, C19, F12 для мелкоделяночного опыта с огурцом, и J26, E17, C19, C22, F12 для мелкоделяночного опыта с разнолистной капустой (приложение 2). Параллельно с этим, мы изучали морфологические, физиолого- биохимические особенности, и филогенетическое положение отобранных чистых кульур. 69 ГЛАВА 6. МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ, ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ВЫДЕЛЕННЫХ ЧИСТЫХ АССОЦИАТИВНЫХ АЗОТФИКСАТОРОВ Исследование физиолого-биохимических особенностей чистых культур в сочетании с характеристикой морфологии бактерии иногда позволяет установить их принадлежность к тому или иному таксону (классу, порядку, семейству) (Нетрусов и др., 2005). В результате, из 227 чистых культур ассоциативных азотфиксирующих бактерий, выделенных из ризопланы тропических овощных культур Ipomoea aquatica и Brassica integrifolia, нами были отобраны 7 штаммов, которые характеризуются наиболее высокой нитрогеназной активностью как на питательных средах, так и в ассоциации с растениями, а также оказывают стимулирующее влияние на культурные растения в модельных опытах. Было определено таксономическое положение данных организмов по морфологическим и физиолого-биохимическим особенностям (табл. 6, рис. 20-25). Таблица 6 Морфология и физиолого-биохимические особенности чистых культур, выделенных из ризопланы тропических овощных культур Ipomoea aquatica (C7, C19, C22, C43) и Brassica integrifolia (E17, F12, J26) Изучаемые признаки 1 C43 2 C22 3 C7 4 штаммы C19 5 E17 6 F12 7 J26 8 Форма колонии на среде DAS Круглая с валиком по краю, выпуклая и гладкая, непигмен тированн ая Концентри ческая, выпуклая и гладкая, непигмент ированная Круглая с валиком по краю, выпуклая и гладкая, непигмен тированн ая Концентр ическая, выпуклая и гладкая, непигмен тированн ая Концентр ическая, выпуклая и гладкая, непигмен тированн ая Круглая с валиком по краю, выпуклая и гладкая, непигмен тированн ая. Круглая с валиком по краю, выпукл ая и гладкая, непигме нтирова нная. Окраска по Граму - - - - - - - Форма клеток Прямые палочки Прямые палочки Прямые палочки Прямые палочки Прямые палочки Прямые палочки Прямые палочки 70 Продолжение таблицы 6 1 Длина клеток (мкм) Подвижность в жидкой среде 2 3 4 5 6 7 8 0,6 – 1,0 0,6 – 1,0 0,6 – 1,0 0,6 – 1,0 0,6 – 1,0 0,6 – 1,0 0,6 – 1,0 + + + + + + + Образование кислоты из глюкозы + + + + + + + Оксидаза + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - + - - - - - + + + + + + + + + + + + + + - - - - - - - Рост при 35°C Образование 3кетолактозы Подкисление среды при использовани и этанола Ростактивиру ющий эффект Фиксация азота Изменение обыкновенно й структуры корней растения Рисунок 20. Колония штамма С43, выделенного из ризопланы Ipomoea aquatica (среда DAS) 71 Рисунок 21. Колонии штамма F12, выделенного из ризопланы Brassica integrifolia, (среда DAS) Рисунок 22. Форма клеток бактерий штамма F12, выделенных из ризопланы Brassica integrifolia Рисунок 23. Форма клеток бактерий изолята С19, выделенного из ризопланы Ipomoea aquatica 72 Рисунок 24. Положительный результат теста на образование 3-кетолактозы при росте на лактозе у изолята С19 (вылеленого из ризопланы Ipomoea aquatica) Рисунок 25. Положительный результат теста на образование 3-кетолактозы при росте на лактозе у изолята F12 (выделенного из ризопланы Brassica integrifolia) Все исследованные штаммы показали способность к образованию 3кетолактозы при росте на лактозе, что характерно исключительно для A. tumefaciens и A. radiobacter (Герхардт et al., 1984). Отнесение штамма к одному из этих видов осуществляется исключительно по признаку 73 фитопатогенности, в остальном они идентичны (Хоулт et al., 1997; Г. Спайнк et al., 2002). Однако, как уже отмечалось, данный признак связан с наличием или отсутствием Ti-плазмиды и поэтому не может рассматриваться как видоопределяющий. Поскольку ДНК типовых штаммов A. tumefaciens и A. radiobacter проявляют высокую степень гомологии, их можно рассматривать как один вид (Спайнк et al., 2002). 74 ГЛАВА 7. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКОГО ПОЛОЖЕНИЯ ВЫДЕЛЕННЫХ ЧИСТЫХ АССОЦИАТИВНЫХ АЗОТФИКСАТОРОВ Для указанных выше семи штаммов было определено филогенетическое положение на основании секвенирования гена 16S рРНК. Было показано, что все они принадлежат к семейству Rhizobiaceae филогенетической группы Alphaproteobacteria. При этом наиболее близкой (99,8% гомологий) к полученным последовательностям гена 16S рРНК была аналогичная последовательность типового штамма представителя рода Agrobacterium – A. tumefaciens. Для определения точной филогенетической позиции исследуемых штаммов внутри семейства Rhizobiaceae, и его родства с A. tumefaciens были использованы доступные из базы данных GenBank последовательности представителей других родов семейства Rhizobiaceae. Последовательности гена 16S рРНК изучаемых штаммов оказались практически идентичными (99,8% гомологий) с последовательностью типового штамма A. tumefaciens (рис. 26). Масштаб показывает эволюционное расстояние, соответствующее 1 нуклеотидной замене на каждые 10 нуклеотидов. Цифрами показана достоверность ветвления, установленная с помощью ―bootstrap‖ – анализа 1000 альтернативных деревьев. Таким образом, выделенные нами штаммы являются представителями вида Agrobacterium tumefaciens, который хорошо известен как фитопатоген. К настоящему времени известно (Kanvinde L., Sastry G.R.K., 1990), что A. tumefaciens может фиксировать азот в свободном состоянии, расти на безазотистой среде, восстанавливать ацетилен до этилена и включать в состав биомассы 15 N2. Как и для большинства других, хорошо охарактеризованных диазотрофных бактерий, присутствие NH4+ в среде и аэробные условия подавляют фиксацию азота A. tumefaciens. Нитрогеназная система содержит молибден. Некоторые особенности фиксации азота у А. 75 tumefaciens напоминают другие хорошо изученные диазотрофные бактерии, такие как Klebsiella pneumonia (Robert, Brill, 1981). Последовательности ДНК структурных генов, ответственных за нитрогеназу (nifH, nifD, и nifK) высоко консервативны (Ruvkun, Ausubel, 1980). а) Agrobacterium sp. EP R 18 16S ribosom... Agrobacterium tumefaciens gi|57703055... 72 Rhizobium sp. gi|586830625|gb|KF90613... Agrobacterium tumefaciens gi|60878614... Agrobacterium tumefaciens gi|58586563... Agrobacterium tumefaciens gi|57703055(2) 1 Rhizobium sp. gi|586830630|gb|KF90614... 1 Agrobacterium tumefaciens gi|58586563... б) Uncultured Agrobacterium sp. clone Ag... Agrobacterium tumefaciens strain SM14... Agrobacterium tumefaciens strain R9-7... Agrobacterium sp. gi|657710113|gb|KJ6... Agrobacterium tumefaciens strain SWFU(2) Agrobacterium tumefaciens strain D254... Agrobacterium tumefaciens strain SWFU... Agrobacterium sp. gi|570554466|gb|KF7... 6 0.5 Рисунок 26 – Филогенетические дендрограммы, построенные на основе анализа нуклеотидных последовательностей 16S рРНК видов бактерий, способных к процессу фиксации молекулярного азота. а) штамм, выделенный из ризопланы разнолистной капусты (F12); б) штамм выделенный из ризопланы водяного шпината (C43) Таким образом, филогенетические особенности и физиолого- биохимические тесты изученных культур, в частности образование 3кетолактозы, дают нам основание утверждать, что изученные штаммы относятся к Agrobacterium tumefaciens. 76 Надо полагать, что при отсутствии или повреждении Ti-плазмиды A. tumefaciens не может вызывать заражение растений но, как свидетельствуют наши данные, оказывает положительное воздействие на растения в ассоциации с ней. Помимо снабжения растений азотом и синтеза ростактивирующих веществ, можно ожидать, что данные штаммы конкурируют с патогенными за одни и те же сайты связывания, защищая таким образом растение от болезнетворных агентов. 77 ГЛАВА 8. ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ РАЗНЫХ ШТАММОВ AGROBACTERIUM TUMEFACIENS НА УРОЖАЙ ОГУРЦА И РАЗНОЛИСТНОЙ КАПУСТЫ В МЕЛКОДЕЛЯНОЧНОМ ОПЫТЕ В УСЛОВИЯХ ТЕПЛИЦЫ Влияние разных штаммов на урожай растений в мелкоделяночном опыте раскрывает способность этих штаммов к постоянному развитию и размножению в ризоплане овощных культур. Эта способность зависит от степени сохранения их исходных свойств: ростактивирующей способности, азотфиксации, а также зависит от способности к конкуренции с другими почвенными микробами и фитосанитарного эффекта. Внедрение микробного удобрения, созданого азотфиксирующих бактерий, проведенного во Вьетнаме, на основе способствовало увеличению урожая риса на 6 – 12 %; арахиса 15 – 20 %, и уменьшению содержания NO3- в товарной продукции (Nguyễn Kim Vũ, 1995). При инокуляции Azospirillum, общее содержание азота в урожае повышается на 20 – 60 % и более (Avivi, 1982; Kapulnik, 1983; Okon, 1985). К сожалению, увеличение урожайности растений обусловивается способностью сохраниять положительные исходные свойства азотфиксирующих штаммов в ассоциации с растениями, даже в случае удачного сочетания микробный штамм – сорт растения (Dobereiner, 1977; Okon, 1986). Кроме того, влияние ассоциативных диазотрофов на растении зависит от фаз развития растения. Например, биопрепарат Агрофор, на основе Agrobacterium radiobacter 57/136 рекомендуется применять для стимуляции роста растений на ранних этапах развития. 78 8.1. Влияние разных штаммов Agrobacterium tumefaciens на урожай огурца в мелкоделяночном опыте 8.1.1. Влияние разных штаммов Agrobacterium tumefaciens на рост огурца Для мелкоделяночного опыта с огурцом (рис. 35) были отобраны штаммы С7, C19, C22, С43, F12, а для разнолистной капусты (рис. 40) – C19, C22, E17, F12, J26, поскольку данные штаммы показали наибольшую эффективность в модельных опытах на стерильном субстрате. Измерение биометрических показателей через две недели после закладки мелкоделяночного опыта с огурцом (рис. 27, 28) показало, что длина стебля была выше у инокулированных растений только в двух вариантах (F12 и С43). В этих же вариантах (С43 и F12) был отмечен прирост массы побегов растения по сравнению с контролем на 13,4 и 15,0 %. Инокуляция штаммом С22 привела к замедлению роста стебля и снижению биомассы по сравнению с контролем. 33.25 26.83 28.58 25.25 25.67 длина стеблья, см 19.25 K c7 c19 F12 C22 C43 Контроль и варианты инокуляции Рисунок 27. Влияние штаммов Agrobacterium tumefaciens на длину стебля огурца через 2 недели после посадки, см 79 16 Масса стебля, г/растение 14 12 12.21 10.77 12.39 10.26 8.57 10 7.94 8 6 4 2 0 K c7 c19 F12 C22 C43 Контроль и варианты инокуляции Рисунок 28. Влияние штаммов Agrobacterium tumefaciens на массу растения огурца через 2 недели после посадки, г/растение На пятой неделе вегетации, длины стеблей растений у всех вариантов с инокуляцией не отличались от контроля (рис. 31), хотя в варианте с инокуляцией штаммом F12 были, как и в первый срок наблюдений, отмечены самые высокие значения длины и массы стебля (рис. 29, 30). Эти отличия были связаны исключительно с развитием растений в первые недели жизни. 120 100 92.32 93.47 94.83 98.92 94.25 82.5 Длина, см 80 60 40 20 0 K C7 C19 F12 C22 Контроль и варианты инокуляции C43 Рисунок 29. Влияние штаммов Agrobacterium tumefaciens на длину стебля огурца через 4 недели после посадки, см 80 160 139.41 140.58 141.47 144.56 140.83 127.28 140 120 Длина, см 100 80 60 40 20 0 K C7 C19 F12 C22 Контроль и варианты инокуляции C43 Рисунок 30. Влияние штаммов Agrobacterium tumefaciens на длину стебля огурца через 5 недель после посадки, см 60 Прирост, см 50 40 30 20 10 0 K C7 C19 F12 C22 C43 контроль и варианты инокуляции Рисунок 31. Влияние штаммов Agrobacterium tumefaciens на изменение длины стебля огурца в период между 4-ой и 5-ой неделями выращивания, см 8.1.2. Влияние разных штаммов Agrobacterium tumefaciens на нитрогеназную активность на корнях огурца Изучение нитрогеназной активности на корнях огурца после 2 и 5 недель опыта, не наблюдалось корреляции. Более того, также между нитрогеназной активностью на корнях огурца после 2 недель выращивании и 81 массой стебля огурца по результатам того же периода, корреляции не обнаруживается. Мы объясняем это тем что, в отличие от модельного опыта, на нитрогеназную активность на корнях растений, выращиваемах в производственных условиях в защищенном грунте, оказывает влияние микрофлора грунта в теплице (рисунок 32). Растения на разных стадиях развития предъявляют неодинаковые требования к условиям среды. Что касается огурца, то в течение 2-3 недель после появления всходов он не требует усиленного питания: от начала цветения до образования завязей в растение поступает около 20% питательных веществ, а основная часть (70%) потребляется в период Активгость азотфиксации, наномоль С2Н4/ч плодоношения. 350 300 250 200 150 100 50 0 K c7 c19 F12 C22 C43 Контроль и варианты инокуляции Нитрогеназная активность на 1 г корней огурца через 2 недель после посадки растений Нитрогеназная активность на 1 г корней огурца через 5 недель после посадки растений Рисунок 32 – Влияние штаммов Agrobacterium tumefaciens на нитрогеназную активность на корнях огурца через 2 и 5 недель после посадки растений (наномоль C2H4/ч) В первые 10-15 дней огурец больше нуждается в азоте, затем до начала цветения – в фосфоре, а во время плодоношения – в азоте и особенно калии (Портянкин., Шамшина, 2010). 82 8.1.3. Влияние разных штаммов Agrobacterium tumefaciens на содержание нитратов в плодах и общего азота в листьях огурца Определение содержания общего азота в листьях инокулированных и контрольных растений в период плодоношения показало, что все испытанные штаммы в той или иной степени оказывали положительное влияние на азотное питание растений. Штаммы F12 и C7 давали наиболее существенное повышение содержания общего азота в листьях огурца (рис. 33). Например, содержание общего азота в листьях растений, инокулированных этими штаммами, в среднем было на 0,42–0,57% выше, чем в контроле (прирост от 26,6 до 35,9% относительно контроля), что свидетельствует о более благоприятном режиме азотного питания в этом случае. Содержание нитратов в зеленцах оставалось в пределах допустимой Общий азот в листьях, % от массы абсолютно сухого листья нормы (меньше 400 мг/кг) (приложение 3). 2.16 2.5 2.01 1.82 2 1.81 1.65 1.59 1.5 1 0.5 0 K C7 C19 F12 C22 C43 Контроль и варианты инокуляции Рисунок 33 – Содержание общего азота в листьях инокулированных разными штаммами Agrobacterium tumefaciens и контрольных растений огурца в периоде цветения, % от сухой массы Урожай зеленцов огурца, полученный с инокулированных исследуемыми штаммами Agrobacterium tumefaciens растений, сушествено не отличался от контроля (рис. 34). Урожай, г/растение 83 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 K C7 C19 F12 C22 C43 Контроль и варианты инокуляции . Рисунок 34. Влиянием штаммов Agrobacterium tumefaciens на урожай огурца в мелкоделяночных условия (г/растение) (за период с 12 сентября до 28 октября 2014) Рисунок 35 – Мелкоделяночный опыт c огурцом в условиях теплицы 84 8.2. Влияние разных штаммов Agrobacterium tumefaciens на урожай разнолистной капусты в мелкоделяночном опыте 8.2.1. Влияние разных штаммов Agrobacterium tumefaciens на массу стебля и нитрогеназную активность на корнях разнолистной капусты после 2 недель выращивания В мелкоделяночном опыте с разнолистной капустой было выявлено, что масса стебля и нитрогеназная активность на 1 грамм корней после 2 недель опыта хорошо коррелируют (коэффициент корреляции r = 0,65; tr = 5 > t05) (рис.36). Самыми эффективными штаммами, положительно влияющими на массу стебля разнолистной капусты, являются С22 и особенно F12, 0.9 60 0.8 50 0.7 0.6 40 0.5 30 0.4 0.3 20 0.2 10 0.1 0 0 K E17 J26 C19 C22 F12 Контроль и варианта инокуляции Масса стебля разнолистной капусты после 20 дней выращивания Масса стебля разнолистной капусты после 20 дней выращивания, г Активность азотфиксации, наномоль С2H4/ч инокуляция которым дает прирост биомассы в 20% от контроля (рис. 39). Нитрогеназная активность на 1 г корней разнолистной капусты после 20 дней выращивания Рисунок 36 – Влияние штаммов Agrobacterium tumefaciens на массу стебля и нитрогеназную активность (на 1 грамм корней) разнолистной капусты после 2 недель выращивания 85 8.2.2. Влияние разных штаммов Agrobacterium tumefaciens на урожай, содержание общего азота и нитратов в товарной продукции разнолистной капусты После 30 дней выращивания разнолистной капусты, урожай собранных с инокулированных растений, значимо не отличался от контроля, поскольку наблюдался большой разброс значений между повторностями (рис.37). Однако инокулированные растения содержали значительно больше азота (рис.38), чем растения контрольного варианта, в частности, содержание азота в варианте, инокулированном штаммом F12, оказалось на 3,43% больше, чем в контрольном (что соответствует более чем двукратному приросту). Содержание нитратов в товарной продукции находится в пределах допустимой нормы (меньшее 900 мг/кг) (приложение 4). 185 масс, г/ растение 140 163.33 135.67 129 130 K E17 J26 C19 C22 F12 Контроль и вариант инокуляции Рисунок 37 – Влияние штаммов Agrobacterium tumefaciens на урожай разнолистной капусты, (г/растение) Общий азот в листьях, % от массы абсолютно сухого листья 86 8 6.569 7 5.128 4.981 6 5 3.88 4.444 3.14 4 3 2 1 0 K E17 J26 C19 C22 F12 Контроль и варианты инокуляции Рисунок 38 – Содержание общего азота в листьях инокулированных Agrobacterium tumefaciens и контрольных растений разнолистной капусты во время уборки урожая, % от сухой массы F12 Контроль Рисунок 39 – Влияние штамма Agrobacterium tumefaciens F12 на биомассу расзнолистной капусты после 10 дней выращивания. 87 Рисунок 40 – Мелкоделяночный опыт с разнолистной капустной в условиях теплицы Влияние выделенных штаммов A. tumefaciens на урожай огурца и разнолистной капусты показали, что некоторые из них (прежде всего, штамм F12, выделенный из ризопланы B. integrifolia) оказывает положительное влияние на условия азотного питания растений и содержание азота в стеблях (приложение 5). Однако, надо полагать, что образуемая бактериальнорастительная ассоциация неустойчива, поэтому оказывает эффект только на ранних стадиях развития огурца, и может быть перспективна для применения на культурах с коротким вегетационным циклом. Таким образом, взаимоотношения результаты наших опытов показали что непатогенных штаммов Agrobacterium tumefaciens с тропическими овощными культурами строятся на основе ассоциативного симбиоза. Выделенные нами штаммы могут быть использованы для создания бактериальных препаратов, стимулирующих рост овощных культур. 88 ВЫВОДЫ 1. Впервые из ризопланы тропических овощных культур Ipomoea aquatica и Brassica integrifolia получено 227 изолятов ассоциативных азотфиксирующих бактерий. 2. Установлено, что уровень нитрогеназной активности у изучаемых чистых культур колеблется в широких пределях (от 0,02 до 44,24 наномоль С2Н4/ч). Самая высокая азотфиксация выявлена у культур, выделенных из ризопланы Ipomoea aquatica. 3. Определена ростактивирующая способность ряда микробных культур, выделеных из ризопланы Ipomoea aquatica и Brassica integrifolia. Наиболее активно стимулировали рост кресс-салата изоляты С7, С19, С22, С43, выделенные из ризопланы Ipomoea aquaticа и изоляты E17, F12, J26 из ризопланы Brassica integrifolia. Эти наиболее активные изоляты были отобраны для модельных опытов с огурцом и разнолистной капустой. 4. В условиях модельного опыта с огурцом и разнолистной капустой (стерильный субстрат) инокуляция изолятами оказывает положительное влияние на массу стебля растения, наиболее эффективны С19 (186% от контроля на разнолистной капусте) и F12 (177% от контроля на огурце). 5. Исследование филогенетического положения выделенных культур (7 наиболее активных азотфиксаторов), проведенное на основании секвенирования гена 16S рРНК, показало, что они принадлежат к семейству Rhizobiacea филогенетической Последовательности гена 16S рРНК группы изучаемых Alpharoteobacteria. культур оказались практически идентичными (99,8% гомологий) с последовательностью типового штамма Agrobacterium tumefaciens. Филогенетические особенности и физиолого-биохимические тесты изученных культур, в частности образование 3-кетолактозы, дают нам основание утверждать, что изученные штаммы относятся к Agrobacterium tumefaciens. 89 6. Влияние выделенных штаммов A. tumefaciens на урожай огурца и разнолистной капусты показали, что некоторые из них (прежде всего, штамм F12, выделенный из ризопланы B. integrifolia) оказывает положительное влияние на условия азотного питания растений и содержание азота в стеблях. Однако надо полагать, что образуемая бактериально-растительная ассоциация неустойчива, поэтому оказывает эффект только на ранних стадиях развития растений, и может быть перспективна для применения на культурах с коротким вегетационным циклом. 7. Результаты наших опытов показали что взаимоотношения непатогенных штаммов Agrobacterium tumefaciens с тропическими овощными культурами строятся на основе ассоциативного симбиоза. Выделенные нами штаммы могут быть использованы для создания бактериальных препаратов, стимулирующих рост овощных культур. 90 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Алексеева, Л.С. Выделение и идентификация компонентов азотфиксирующего сообщества гранулированного аэробного активного ила, адаптированного к стрессу / Алексеева Л.С., Тюпа Д.В., Калѐнов С.В., Панфилов В.И. // Успехи в химии и химической технологии. – 2014. – Том ХХVIII. – №4. – C. 121 – 124. 2. Белимов, А.А. Взаимодействие ассоциативных бактерий и растений в зависимости от биотических и абиотических факторов: Автореф. докт. дис. / Белимов А.А. – СПб, 2008. – 46 c. 3. Берцова, Ю.В. Демин О.В., Богачев А.В. Дыхательная защита нитрогеназного комплекса у Azotobacter vinelandii / Берцова Ю.В. Демин О.В., Богачев А.В. // Успехи биологической химии. – 2005. – Т. 45. – С. 205-234. 4. Бирюкова, О.В. Эндофитная ризобактерия Klebsiella planticola, взаимодействие с растением и цнозом микромицетов в фитоплане и ризосфере: Дисc. на соискание ученой степени кандидата биологических наук /Бирюкова О.В. – М., 2001. – 169 с. 5. Воробейков, Г.А. Исследование эффективности штаммов ассоциативных ризобактерий в посевах различных видов растений / Воробейков Г.А., и соавт. //Известия Российского государственного педагогического университета им. А.И. Герцена. – 2011. – № 141. – с. 114 – 123. 6. Герхардт, Ф. Методы общей бактериологии. Том 3. / Герхардт Ф. и др. – М.:Мир, 1984. – с 5. с 14. 7. Голышин, П.Н. Экологическая роль растительных экссудатов во взаимодействии растений микроорганизмов: Автореф. дис. канд. биол. наук / Голышин П.Н. – М., 1991. – 24 с. 91 8. Гочелашвили, З.А. Фиксация свободного азота в почве и на корнях цитрусовых деревьев в субтропиках Грузинской ССР / З.А. Гочелашвили // Микробиология, 1978. - т. 48. - вып. 5. - c. 860 – 865. 9. Губайдуллина, Т.С.Влияние бактерий-стимуляторов и бактерий- ингибиторов роста растений на ростовые процессы и фосфорный обмен листьев озимой пшеницы. В сб.: 4 Микроорганизмы и высшие растения / Губайдуллина Т.С., Самосова С.М. – Казань, 1978. – С. 55-65. 10. Гуревич, С.М. Действие минеральных удобрений на мощном черноземе / С.М. Гуревич - М., 1962. - c.127. 11. Добровольская, Т.Г. Структура бактериальных сообществ почв / Добровольская Т.Г. – М.: ИКЦ «Академ-книга», 2002. – С. 282. 12. Егоров, С.Ю. Регуляция жизнедеятельности микроорганизмов- стимуляторов роста растений / Егоров С.Ю. – Казань: Казанск. ун-та, 2003. – С. 100. 13. Емцев В. Т. Отчѐт о научно-исследовательской работе / В. Т. Емцев и др. - М.: ТСХА. - 1995. - 58 с. 14. Емцев В.Т. микробиология: учебник для визов / В.Т. Емцев, Мишустин Е.Н. – М.: дрофа, 2005. – 445 с. 15. Емцев В.Т. Основы экологической биотехнологии : Интерактивная форма / В.Т. Емцев . – М. : УНЦ РАН, 2001 . – 75 с. 16. Емцев, В. Т. Ассоциативный симбиоз почвенных диазотрофных бактерий и овощных культур / Емцев В. Т. // Почвоведение. – 1994. – № 4. – С. 74-78. 17. Завалин, А. А. / Реакция сортов ячменя на инокуляцию диазотрофами в начальный период онтогенеза / А. А. Завалин, Х. А. Хусайлов, М. Шакиров // Докл. РАСХН. М. - 1999. - №5. - С. 14-16. 18. Завалин, А. А. / Эффективность инокуляции зерновых культур Agrobaсterium radiobacter в зависимости от азотного удобрения, почвенных и 92 метеорологических условий / А. А. Завалин, М. Ф. Чистотин, А. П. Кожемяков // Агрохимия. - 2001. - № 2. - С.31-35. 19. Задорина, Е.В. Биоразнообразие диазотрофов почв с различной антропогенной нагрузкой: дис. кан. биол. наук / Задорина Е.В. – М., 2008. – 135 c. 20. Захарченко, И.Г. Количественная оценка прихода азота за счет симбиотической и несимбиотической фиксации в почвах Украины / И.Г. Захарченко, В.М. Крикунец и др. // Cб. экологическе последствия применения агрохимикатов (удобрения). - Пущино, 1982. - с. 22 – 23. 21. Злотников, А.К. Влияние инокуляции ризосферной бактериальной ассоциации Bacillus firmus и Klebsiella terrigena на пораженность ярового ячменя фитопатогенными грибами. Тез. Межд. конф. «Современные проблемы микологии, альгологии и фитопатологии» / 3лотников А.К., Умаров М.М. – М., 1998. – С. 41-42. 22. Злотников, А.К. Новый бактериальный эндофит сельскохозяйственных культур / 3лотников А.К., Казакова М.Л., 3лотников К.М., Казаков А.В. // С.х. биол. – 2006. – № 3. – С. 62-66. 23. Ивановский, К.В. Влияние биопрепаратов в составе биокомпостов и при инокуляции семян на продуктивность растений: дис. кан. биол. наук / Ивановский К.В. – М., 2005. – С 124. 24. Игнатов, В.В. Биологическая фиксация азота / Игнатов В.В. // Соросовский образовательный журнал. – 1998. – № 9. – С. 28-33. 25. Казакова, М.Л. Накопление аланина в клетках эндофита Klebsiella terrigena E6 в условиях азотфиксации / Казакова М.Л., Злотников К.М., Казаков А.В., Злотников А.К. // Сельскохозяйственная биология. – 2012. – № 3. – С 98-102. 26. Калининская Т.А. Азотфиксирующие симбиозы актиномицетов с растениями / Т.А. Калининская, А.Н. Парийская // Изв. АН СССР. Сер. биол. - 1982. - № 2. - с. 255 – 265. 93 27. Калининская Т.А. Изучение азотфиксирующей активности почв разного типа с помощью 15 N2 / Т.А. Калининская, Ю.М. Миллер, И.Т. Култышкина // Cб. Применение стабильного изотопа 15N2 в исследованиях по земледелию.- М., 1973. - С. 55 – 61. 28. Калининская Т.А. Изучение с помощью 15 N активности несимбиотической азотфиксации в почвах рисовых полей Краснодарского края / Т.А. Калининская, Ю.М. Миллер, Ю.М. Белов, В.П. Рао // Сер. биол. наук. Изв. АН СССР. – 1977. – №4. – С. 565 – 570. 29. Калининская, Т.А. Несимбиотическая азотфиксация в почвах рисовых полей Советского Союза / Т.А. Калининская // Cб. Экологические последствия применения агрохимикатов (удобрения). - Пущино, 1982. - С. 23 – 24. 30. Каменев, С.В. Генетический контроль процессов взаимодействия бактерий с растениями в ассоциациях / Каменев С.В., Муромец Е.М. // Генетика. – 1999. – Т. 35. – № 4. – С. 1480 – 1494. 31. Карпунина, Л.В. Роль агглютинирующих белков ризобий и азотфиксирующих бацилл при взаимодействии с растениями / Карпунина Л.В. // Сб.: Молекулярные основы взаимоотношений ассоциативных микроорганизмов с растениями. – М., 2005. – С. 98-117. 32. Кацы, Е.И. Молекулярно-генетические процессы, влияющие на ассоциативное взаимодействие почвенных бактерий с растениями / Кацы Е.И. Под ред. В.В. Игнатова. – Саратов: Сарат. ун-та, 2003. – С. 17. 33. Кидин, В.В. Практикум по агрохимии / Кидин В.В., Дерюгин И.П., Кобзаренко В.И. – М.: КолосС, 2008. – С. 158-159. 34. Колесников, О. В. Влияние ксенобиотиков и тяжелых металлов на систему микроорганизм – растение.: дис. канд. биол. наук / О. В. Колесников. – М., 2012. – 119 С. 35. Кравченко, Л.В. Влияние корневых экзометаболитов пшеницы с различной плоидностью генома на рост Azospirillum brasilense / Кравченко 94 Л.В., Азарова Т.С., Достанко О.Ю. // Микробиология. – 1993. – № 62(5). – С. 863-868. 36. Кравченко, Л.В. Выделение и фенотипическая характеристика ростстимулирующих ризобактерий (PGPR), сочетающих высокую активность колонизации корней и ингибирования фитопатогенных грибов / Кравченко Л.В., Макарова Н.М., Азарова Т.С. и др. // Микробиология – 2002. – № 71(4). – С. 521-525. 37. Кравченко, Л.В. Роль корневых экзометаболитов в интеграции микроорганизмов с растениями. Автореф. докт. дис. / Кравченко Л.В. – М., 2000. – 45 С. 38. Круг, Г. Овощеводство / Круг Г. – М.: Колос, 2000. – С. 178. 39. Лебедев, В.Н. Ассоциативные штаммы бактерий как современный эдемент экологизации выращивания капустных растений / В.Н. Лебедев // Известия Российского государственного педагогического университета им. А.И. Герцена. - 2014. - № 168. - С.49-53. 40. Манучарова, Н.А. Гидролитические прокариотные комплексы наземных экосистем / Манучарова Н.А. – М.: ―Университетская книга‖, 2014. – 272 с. 41. Манучарова, Н.А. Молекулярно-биологические методы в почвоведении и экологии / Манучарова Н.А. – М.: ―Университетская книга‖, 2014. – С. 23. 42. Манучарова, Н.А. Термофильный хитинолитический микробный комплекс бурой пустынно-степной почвы / Манучарова Н.А., Власенко А.Н., Турова Т.П., Пантелеева А.Н., Степанов А.Л., Зенова Г.М. // Микробиология. – 2008. – №5. – С. 683–688. 43. Мишустин Е.Н. Биологический азот в земледелии СССР / Е.Н. Мишустин, Н.И. Черепкова // Изв. АН СССР. Сер. биол. - 1976. - № 3. - с. 325 – 344. 95 44. Мишустин Е.Н. О несимбиотической азотфиксации в пахотных почвах / Е.Н. Мишустин, Н.И. Черепкова, Т.А. Калининская // Cб. Проблемы почвоведения. - М., 1978. - с. 92 – 96. 45. Нетрусов, А.И. Практикум по микробиологии / Нетрусов А.И., Егорова М.А., Захарчук Л.М. и др. – М.: Издательский центр «Академия», 2005. – 575 с. 46. Нетрусов, А.И. Экология микроорганизмов / Нетрусов А.И., Бонч- Осмоловская Е.А., Горленко В.М., Иванов М.В., Каравайко Г.И., Кожевин П.А. и др. Под ред. Нетрусова А.И. – М.: Академия, 2004. – 272 с. 47. Никитина, В.Е. Пектины клеточной поверхности азоспирилл и их роль в ассоциативных взаимоотношениях с растениями / Никитина В.Е., Понома рева Е.Г., Аленькина С.А. // Сб.: Молекулярные основы взаимоотношений ассоциативных микроорганизмов с растениями. – М., 2005. – С. 70-97. 48. Петак, А.М. Взаимоотношения бактерий рода Klebsiella с растением / Петак А.М., Ковтунович Г.Л., Козыровская Н.А., Туряница А.И., Кордюм В.А. // Биополимеры и клетка. – 1995. – № 11(6). – С. 75-80. 49. Портянкин А.Е. Огурец от посева до урожая / А.Е. Портянкин, А.В. Шамшина. 2010. - 386с. 50. Самохин Л.В. Влияние стрессовых факторов на взаимодействие ассоциативных ризобактерий и растений: дис. канд. биологических наук. – М., 2011. – C. 54. 51. Слободова, Н. В. Изучение биоразнообразия азотфиксирующих прокариот кислых торфяных почв на основе анализа последовательностей генов nifH: автореф. дис. канд. биол. наук / Слободова Н. В. . – М., 2006. – 24с. 52. Соколова, А.Я. Изучение протектроного действия бактерий рода Klebsiella на газонные травы в условиях засоления почвы: дис. канд. биол. наук / Соколовой А.Я. – М., 2006. – 143 с. 53. Соловьев, А.В. Агрохимия и биологические удобрения / Соловьев А.В., Надежника Е.В., Лебедева Т.Б. – М., 2011. – С 18-25. 96 54. Старцева, А.А. Значение биопрепаратов Экстрасол и БиослобиФит в технологии возделывания ячмен на серой лесной тяжелосуглинистой почве / Старцева А.А., Фадькин Г.Н., Костин Я.В. // Семинар – круглый стол 5. Современные технологии в земледелии и растениеводстве. – 2014. – С. 222223. 55. Сытников Д. М. Биотехнология микроорганизмов азотфиксаторов и перспективы применения препаратов на их основе / Д. М. Сытников // Биотехнология. – 2012. - Т. 5. - №4. – с. 34 – 45. 56. Терехов, М.Б. Формирование качества зерна ячменя ярового при обработке семян и посевов биопрепаратом Экстрасол 55 / Терехов М.Б., Полуянова О.Б., Постнов И.Е. // Известия Самарской государственной сельскохозяйственной академии. – 2011. – № 4. – С. 89–91. 57. Тимофеева С.В. Исследование роли биотических и абиотических факторов в приживаемости интродуцируемых бактерий на первых этапах онтогенеза растений: дис. канд. биол. наук / С.В. Тимофеева – Санкт-Петербург, 2000. – 134 с. 58. Тихонович И.А. Биопрепараты в сельском хозяйстве (Методология и практика использования микроорганизмов в растениеводстве и кормопроизводстве) / И.А. Тихонович, Круглов Ю.В. - М. 2005. – 154 с. 59. Тихонович, И.А. Симбиозы растений и микроорганизмов: молекулярная генетика агросистем будущего / Тихонович И.А., Проворов Н.А. – СПб.: Изд-во С.-Петерб.ун-та, 2009. – 210 c. 60. Умаров, М.М. Ассоциативная азотфиксация / М.М. Умаров - Издательство московского университета, 1986. - с 32 – 49. 61. Фунг Т.М. Азотфиксирующая активность ассоциативных бактерий, выделенных из ризопланы овощных культур Вьетнама Ipomoea apuatica и Brassica integrifolia / Т.М. Фунг // Сб. XXI международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых ―Ломоносов 2014‖: секция ―почвоведение‖. – М.: M KC Пресс, 2014. - С 33. 97 62. Фунг Т.М. Биологическая активность ассоциативных бактерий, выделенных из ризопланы овощных растений, выделенных из Вьетнама Ipomea aquatica L. и Brassica integrifolia L. / Т.М Фунг, В.Т. Емцев, Л.А. Поздняков,О.В Селицкая // Известия ТСХА. - вып. 5. - 2014. – C. 24 - 35. 63. Хоулт, Дж. Определитель бактерий Берджи / Хоулт Дж., Криг Н., Снит П., Стейли Дж., Уилльямс С. – М.: Мир. 1997. – Т.1. – С. 76. 109. 64. Шелудько, А.В. Генетико-физиологические аспекты социального поведения ассоциативных бактерий zospirillum brasilense.: автореф. дис. док. биол. наук / Шелудько А.В. - Саратов., 2010. – 49 C. 65. Шерстобоева, Е. В. Биопрепараты азотфиксирующих бактерий: проблемы и перспективы применения / Шерстобоева Е. В., Дудинова И. А., Крама-ренко С. Н., Шерстобоев Н. К. // Микробиол. Журн. – 1997. – Т. 59. – № 4. – С. 109-117. 66. Штарк, О.Ю. Продуцирование антифунгальных метаболитов Pseudomonas chlororaphis при росте на различных источниках питания / Штарк О.Ю., Шапошников А.И., Кравченко Л.В. // Микробиология. – 2003. – № 72(5). – 645-650. 67. Эдельштейн В. И. Овощеводство / В. И. Эдельштейн. М.: Сельскохозяйственная литература, журналы и плакаты, 1962. - 439 с. 68. Юргина, В.С. Роль минерального азота и ассоциативных ризобактерий в формировании продуктивности редьки масличной / Юргина В.С. // Агро ХХI. – 2010. – № 4. – С. 20-21. 69. Andres, D. Inoculation of wheat with Azospirillum brasilense and Pseudomonas fluorescens: Impact on the production and culturable rhizosphere microflora / D. Andres, Naiman, lejandra Latro´nico, Ine´s E. Garcı´a de Salamone // European Journal of Soil Biology. – 2009. - Vol 45. – P. 44 – 51. 70. Arkhipova, T.N. Ability of bacterium Bacillus subtilis to proceed cytokinins and to influence the growth and endogenous hormone content of lettuce plants / 98 Arkhipova T.N., Veselov S.U., Melentiev A.I. e.a // Plant and Soil. – 2004. – Vol. 272. – P. 201-209. 71. Avivi, Y. The response of wheat to bacteria of the genus Azospirillum / Y. Avivi, N. Feldman // JSR. J. Bot. – 1982. – Vol. 31. - № 31. P. 1- 4. 72. Bachan Y. Migration of the rhizosphere bacteria Azospirillum brasilense and Pseudomonas fluorescens towards wheat roots in the soil / Y. Bachan // J. Gen Microbiol . – 1986. – Vol. 132. – p. 3407 – 3414. 73. Bacon, C.W. Bacterial endophytes: the endophytic niche, its occupants, utility. In: Plant-associated bacteria. S.S. Gnanamanickam (ed.) / Bacon C.W., Hinton D.M. – Netherlands: Springer, 2006, Part 1. – P.: 155-194. 74. Bagley, S. Т. Klebsiella planticola sp. nov.: a new species of Enterobacteriaceae found primarily in non-clinical environments / S. Т. Bagley, R. J. Seidler, D. J. Brenner // Curr. Microbiol. – 1981. – Vol. 6. – P. 105-109. 75. Bais, H.P. The role of root exudates in rhizosphere interactions with plants and other organisms / H.P. Bais, T.L. Weir, L.G. Perry. – Annu. Rev. Plant Biol. – 2006. – Vol. 57. – P. 233-266. 76. Baldani, J. L. Characterration of Herbaspirillum seropedicae gen. nov., sp. nov., a root associated nitrogen fixing bacterium / Baldani J. L., Baldani V. L. D., Seldin L., Dobereiner J. // Int. J. Syst. Bacteriol. – 1986. – Vol. 36. – P. 86-93. 77. Barraquio, W. L. Isolation and identification of N2-fixing Pseudomonas associated with wetland rice / W. L. Barraquio, J. K. Ladha, I. Watanabe // Can. J. Microbiol. – 1983. – Vol. 29. – P. 867-873. 78. Basilier K. Nitrogen fixation in wet mineratrophic moss communities of a subarctic mire / K. Basilier, U. Granchall, T. Stenstrom // Oikos. – 1987. – vol. - № 2. – p. 236 – 240. 79. Belimov, A.A. Cadmium-tolerant plant growth-promoting bacteria associated with the roots of Indian mustard (Brassica juncea L. Czern.) / Belimov A.A., Hontzeas N., Safronova V.I. et al. // Soil Biol. Biochem. – 2005. – Vol. 37. – P. 241-250. 99 80. Bertrand, H. Stimulation of ionic transport system in Brassica napus by a plant growth-promoting rhizobacterium (Achromobacter sp.) / Bertrand H., Plassard C., Pinochet X. et al. // Can. J. Microbiol. – 2000. – Vol. 46. – P. 229-236. 81. Bloemberg, G.V. Molecular basis of plant growth promotion and biocontrol by rhizobacteria / Bloemberg G.V., Lugtenberg B.J.J. // Curr. Opin. Plant Biol. – 2001. – Vol. 4. – P. 343-350. 82. Brill, W.J. Biochemical genetics of nitrogen fixation / W.J. Brill // Microbiol. Rev. – 1980. – Vol. 44. – P. 449-467. 83. Capone D. N2 – fixation in the rhizosphere of Thalassia testudinum / D. Capone, B. Teylor // Can. J. Microbiol. – 1980. – vol. 26. - № 8. – p. 998 – 1005. 84. Chelins M. K. Immunolocalization of dinitrogenase reductase produce by Klebsiella pneumonia in accociation with Zea mays L. / M. K. Chelins, E.W. Triplett // Appl. And Environ. Microbiol. – 2000. – vol. 66. - № 2. – p. 783 – 787. 85. Cheng, Z. 1-Aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase from Pseudomonas putida UW4 facilitates the growth of canola in the presence of salt / Cheng Z., Park E., Glick B.R. // Can. J. Microbiol. – 2007. – Vol. 53. – P. 912918. 86. Costacurta A. Synthesis of phytohormones by plant-associated bacteria / A. Costacurta, J. Vanderleyden // Crit. Rev. Microbiol. - 1995. - Vol. 21. -№ 1. - P. 1-18. 87. Czarny, J.C. Genetic modulation of ethylene biosynthesis and signaling in plants / Czarny J.C., Grichko V.P., Glick B.R. // Biotech. Adv. – 2006. – Vol. 24. – P. 410-419. 88. Dart, P. Nonsymbiotic nitrogen fixation and soil fertility / P. Dart, S. Wani // Nonsymbiotic nitrogrn fixat. and org. matter. 12 Congr. ISSS, New Delhi. 1982. - vol. 1. - p. 3 – 27. 89. Dillewijn Pieter, van. Plant – dependent active biological containment system for recombinant rhizobacteria / Dillewijn Pieter van, Vilchez Susana, A. 100 Paz Jose, L. Ramos Juan // Environ. Microbiol. – 2004. – Vol. 6.- № 1. – p 88 – 92. 90. Dixon R., Kahn D. Genetic regulation of biological nitrogen fixation // Nat. Rev. Microbiol. – 2004. – V. 2. – P. 621- 631. 91. Dobbelaere, S. Plant growth-promoting effects of diazotrophs in the rhizosphere / Dobbelaere S., Vanderleyden J., Okon Y. // Crit. Rev. Plant Sci. – 2003. – Vol. 22. – P. 107-149. 92. Dobereiner, J. Ecological distribution of Spirillum Upofentm Beijerinck / Dobereiner J., Marriel I. E., Nery M. // Can. J. Microbiol. – 1976. – Vol. 22. – P. 1464-1476. 93. Dobereiner, J. Isolation and identification of root associated diazotrophs. In F. A. Skinner, R. M. Boddey, I. Fendrik (Eds.): Nitrogen fixation with nonlegumes / Dobereiner J. – Dordrecht: Kluwcr Academic Press, 1989. – P. 103-108. 94. Dobereiner, J. Nitrogen fixation in grass – bacteria association in the tropics / J. Dobereiner // Isotop. Biol. Dinitrogen Fixat. Proc. Vienna. - 1978. - p. 51 – 69. 95. Dobereiner, J. Nitrogen-fixing bacteria in non-leguminous crop plants / Dobereiner J., Pedrosa F. O. – Berlin: Springer Verlag, 1987. – 168 p. 96. Dobereiner, J. Plant genotype effects on nitrogen fixation in grasses. Genetic deversity in plants / J. Dobereiner, A. Muhamed, R. Aksel, R. C. Bortel. – von . N.Y.: Plenum, 1977 . – 325 p. 97. Dobereiner, J. Rhizosphere associations between grasses and nitrogen-fixing bacteria: effect of 02 on nitrogenase activity in the rhizosphere of Paspalum notatum / Dobereiner. J., Day, J. M., and Dart, P. J. // Soil Biol. Biochem. – 1973. – Vol. 5. – P. 157-159. 98. El-Fiki, F. Agrobacterium tumefaciens in agriculture and research / El-Fiki F., Giles K. L. // Int. Rev. Cytol. – 1981. – Vol. 13 (Suppl.). – P. 47-58. 99. Elmerich, C. Genetique et regulation de la fixation de l'azote / Elmerich C. // Phys. Veg. – 1979. – Vol. 17. – P. 883-906. 101 100. Eskew, D. L. Nitrogen Fixation, denitrification, and pleomorphic growth in a highly pigmented Spirillum lipoferum / Eskew D. L., Focht D. D., Ting I. P. // Appl. Environ. Microbiol. – 1977. – Vol. 34. – P. 582-585. 101. Falk, E.C. Deoxyribonucleic acid homology of Azospirillum amazonense and emendation of the description of the genus Azospirillum / Falk E.C., Doeberener J., Jonson J.L., Krieg N.R. // Inter. J. Syst. Bacteriol. – 1985. - Vol. 35. - P. 117-118. 102. Frankenberger, W.T. Phytohormones in soils: production and function / Frankenberger W.T., Arshad M. – N.Y., 1995. - p. 35–71. 103. Giddens J. Nitrogen fixation in soil crusts of tall fescue sods / J. Giddens // Soil Sci. – 1982. – vol. 133. - № 5. – p. 295 – 297. 104. Gillis, M. Acetobacter diazotrophicus sp. nov., a nitrogen-fixing acetic acid bacterium associated with sugarcane / Gillis M., Kersters K., Hoste В., Janssens D., Kroppenstedt R. M., Stephan M. P., Teixeira K. R. S., Dobereiner J., de Ley J. // Int. J . Syst. Bacterial. – 1989. – Vol. 39. – P. 361-364. 105. Glick, B.R. 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid deaminase mutants of the plant growth promoting rhizobacterium Pseudomonas putida GR12-2 do not stimulate canola root elongation / Glick B.R., Jacobson C.B., Schwarze M.M.K. e.a. // Can. J. Microbiol. – 1994. – Vol. 40. – P. 911-915. 106. Haahtela, K. Morphological and physiological characteristics and lipopolysaccharide composition of N2-fixing (C2H2-reducing) root-associated Pseudomonas sp. / Haahtela K., Helander I., Nurmiaho-Lassila E.-L., Sundman V. // Can J . Microbiol. – 1983. – Vol. 29. – P. 874— 880. 107. Haahtela, K. Root-associated N2-fixation (acetylene reduction) by Enterobacteriaceae and Azospirillum strains in cold climate spodosols / Haahtela K., Waartiovaara Т., Sundman V., Skujins J. // Appl. Environ. Microbiol. – 1981. – Vol. 4 1 . – P . 203-206. 102 108. Halda-Alija L. Identification of indole-3-acetic acid producing freshwater wetland rhizosphere bacteria associated with Juncus effuse L. / L. Halda-Alija // Can J. Microbiol. – 2003. - Vol. 49 (12). – p. 781 – 787. 109. Harari A. Involvement of IAA in the interaction between Azospirillum brasilense and Panicum miliaceum roots / A. Harari, J. Kigel, Y. Okon // Plant Soil. – 1988. – vol. 110. – p. 463 – 499. 110. Heumann, W. Rhizobium genetics. In Bothe H. and Trebst A. (ed.). Biology of inorganic nitrogen and sulphur / Heumann W. // New York: Springer-Verlag, 1981. – P. 87-102. 111. Hirota, Y. Rhizosphere of rice / Y. Hirota, Т. Fujii, Y. Sano, S. Lyama // Nature. – 1978. – № 276. – P. 416-417. 112. Homles, B. Acta Hort. / Homles B. – 1988. – Vol. 225. – P. 47-52. 113. Jagnow, G. / Nitrogen-fixing bacteria associated with gramineous roots with special reference to Spirillum lipoferum / G. Jagnow // Zbl. Pflanzen. und Bodenk. – 1979. - vol. 142, № 3. - p. 399 – 410. 114. Jensen, H. Nonsymbiotic nitrogen fixation / H. Jensen // Amer. Soc. Agron. Monogr. – 1965. - № 10. – p 5 – 25. 115. Jones, K. Nitrogen fixation in the phyllosphere of the Douglas-fir, Pseudotsuga douglassii / K. Jones // Ann. Botany. – 1970. – vol. 34. - № 134. – p. 239 – 244. 116. Jordan, D.C. Rhizobiaceae. In Krieg N.R., Holt J.G. (ed.). Bergey's manual of systematic bacteriology / Jordan D.C. – Baltimore: The Williams & Wilkins Co., 1984. – Vol. I. – P. 234-256. 117. Kanvinde, L. Agrobacterium tumefaciens Is a Diazotrophic Bacterium // Kanvinde L., Sastry G.R.K. // Applied and Environmental microbiology. – 1990. – Vol. 56. – №7. – P. 2087-2092. 118. Kapulnik, J. Effect of Azospirillum inoculation in yield of fieldgrow wheat / J. Kapulnik, S. Sarig, J. Nur, J, Okon // Can. J. Microbial. – 1983. – vol. 28. - № 8. – p 895 – 899. 103 119. Khummas, К. M. Azospirillum irakcnse sp. nov., a nitrogen-fixing bacterium associated with rice roots and rhizosphere soil /. К. M. Khummas, E. Agcron, P. A. D. Grimont, P. Kaiser // Res. Microbiol. – 1989. – Vol. 140 .– P. 679-693. 120. Kim, Y-M. Nucleotide sequence of the ni/LA operon of Klebsiella oxytoca NG13 and characterization of the gene products / Y-M. Kim, K-J. Ahn, Т. Beppu, Т. Uozumi // Mol. Gen. Genet. – 1986 . – Vol. 205. – P. 253-259. 121. Kleeberger, A. The rhizosphere microflora of wheat and barley with special reference to Gram-negative bacteria / A. Kleeberger, H. Castroph, W Klingmijller // Arch. Microbiol. – 1983. – Vol. 36. – P. 306-311. 122. Kole, M. M. Distribution of Azotobacter in eastern Canadian soils and in association with plant rhizospheres / M. M. Kole, W. J. Page, I. Altosaar // Can. J . Microbiol. – 1988. – Vol. 34. – P. 815-817. 123. Krotzky, A.Nitrogen fixation in Pseudomonas stutzeri / A. Krotzky, D. Werner // Arch. Microbiol. – 1987. – Vol. 147. – P. 48-57. 124. Kuiper, I. Selection of a plant-bacterium pair as a novel tool for rhizostimulation of polycyclic aromatic hydrocarbon-degrading bacteria / Kuiper I., Bloemberg G.V., Lugtenberg J.J. // MPMI. – 2001. – Vol. 14. – P. 1197-1205. 125. Ladha, J. K. Isolation and identification of nitrogen-fixing Enterobacter cloacae and Klebsiella planticola associated with rice plants /, J. K. Ladha, W. L. Barraquio, I. Watanabe // Can. J . Microbiol. – 1983. – Vol. 29. – P. 1301-1308. 126. Leonardo, M. C. 16S Ribosomal DNA Characterization of Nitrogen – Fixing Bacteria Isolated from Banana (Musa spp.) and Pineapple (Ananas comosus (L.) Merril / M. C. Leonardo, M. S. Emanuel , B. W. Olmar et al. // Applied and Environmental. Microbiology. - May 2001. - vol. 67. - № 5. - p. 2375 -2379. 127. Leveau, J.H.J. Utilization of the plant hormone indole-3-acetic acid for growth by Pseudomonas putida strain 1290 / Leveau J.H.J., Lindow S.E. // Appl. Environ. Microbiol. – 2005. – Vol. 71(5). – P.: 2365-2371. 104 128. Lugtenberg, B.J.J. Molecular determinants of the rhizosphere colonization by pseudomonas / Lugtenberg B.J.J., Dekkers L., Bloemberg G.V. // Annu. Rev. Phytopathol. – 2001. – Vol. 39. – P. 461-490. 129. Magalhaes, F. M. A new acid-tolerant Azospirillum species / F. M. Magalhaes, J. I. Baldani, S. M. Souto, J. R. Kuykendall, J. Dobereiner // An. Acad. Bras. Cien. – 1983. – Vol. 55. – P. 417-430. 130. Malik, K. A. Chemolithoautotrophic growth of bacteria able to grow under N,-fixing conditions / K. A. Malik, H. G. Schlegel // FEMS Microbiol. Lett. – 1981. – Vol. 1 1 . – P . 63-67. 131. Mantelin, S. Plant growth-promoting bacteria and nitrate availability: impacts on root development and nitrate uptake / S. Mantelin, B. Touraine // J. Exp. Bot. – 2004. – Vol. 55. – P. 27-34. 132. Martinez-Drets, G. Catabolism of carbohydrates and organic acids and expression of nitrogenase in Azospirillum / G. Martinez-Drets, M. Del Gallo, C. Burpee, R. H. Bums // J . Bacteriol. – 1984. – Vol. 159. – P. 80-85. 133. McClung, C. R. Enumeration and localization of Nrfixing bacteria associated with roots of Spartina alterniflora Loisel / C. R. McClung, P. Van Berkum, R. E. Davis, C. Sloger // Appl. Environ. Microbiol. – 1983. – Vol. 45. – P. 1914-1920. 134. McClung, C. R. Isolation of a nitrogen-fixing Campylobacter species from the roots of Spartina alterniflora Loisel / C. R. McClung, D. G. Palriquin // Can. J . Microbiol. – 1980. – Vol. 26. – P. 881-886. 135. Mehnaz, S. Isolation and 16S Rdna sequence analysis of beneficial bacteria from the rhizosphere of rice / S. Mehnaz, M.S. Mirza, J. Haurat, R. Bally, P. Normand, A. Bano, K.A. Malik // Can. J. Microbiol. – 2001. – vol. 47. – p 110 – 117. 136. Meyer, J.M. Siderophores of Pseudomonas – biological properties. In: Iron transport in microbes, plants and animals / Meyer J.M., Halle F., Hohnadel D. e.a. – Weinheim: VCH Verlagsgesellschaft, 1987. – P. 188-205. 105 137. Moore, A. Nonsymbiotic nitrogen fixation in soil and soil – plant systems / A. Moore // Soil and Fertil., 1966. – vol. 29. - № 2. – p. 113 – 128. 138. Neilands, J.B. Siderophores: structure and function of microbial iron transport compounds / Neilands J.B. // J. Biol. Chem. – 1995. – Vol. 45. – P. 26723-26726. 139. Nielsen, I. Sulphate reduction and nitrogen fixation rates assciated with roots, rhizomes and sediments from Zostera noltii and Spartina maritima meadows / I. Nielsen, K. Finster, D. Welsch, A. Donelly, R. Herbert, R. De Wit, A. Iomstein // Environ. Microbiol. – 2001. – Vol. 3. – P. 63 – 71. 140. Okon, J. Azospirillum as a potential inoculant for Agriculture / J. Okon // Trends Biotechnol . – 1985. – vol. 3. - № 9. – p. 225 – 228. 141. Okon, J. Development and function of Azospirillum inoculated roots / J. Okon, J. Kapulnik // Plant soil. – 1986. – vol. 9. – p. 3. 142. Papen, H. Organic acid utilization, succinate excretion, cncystation and oscillating nitrogenase activity in Azospirillum brasilense under microacrobic conditions / H. Papen, D. Werner // Arch. Microbiol. – 1982. – Vol. 132. – P. 5761. 143. Patriquin, D. G.. Dobereiner. J., and Jain, D. K. Sites and processes of association between diazotropbs and grasses / D. G. Patriquin, J. Dobereiner, D. K. Jain // Can. J . Microbiol. – 1983. – Vol. 29. – P. 900-915. 144. Paulitz, T.C. Biological control in greenhouse systems / Paulitz T.C., Bélanger R.R. // Annu. Rev. Phytopathol. – 2001. – Vol. 39. – P. 103-133. 145. Pederson, W. L. Nitrogen fixation (acetylene reduction) associated with roots of winter wheat and sorghum in Nebraska / W. L. Pederson, K. Chakrabarty, R. V. Klucas, A. K. Vivader // Appl. Environ. Microbiol. – 1978. – Vol. 35. – P. 129-135. 146. Peng, G. Enterobacter oryzae sp. nov., a nitrogen-fixing bacterium isolated from the wild ricw species Oryza latifolia / Peng G., Zhang W., Luo H., Xie H., 106 Lai W., Tan Z. // International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. – 2009. – Vol. 59. – P. 1650-1655. 147. Purschase B. Nitrogen fixation associated with Eichhormia crassipes / B. Purschase // Plant and Soil. – 1978. - vol. 46. - № 1. - p. 283 – 286. 148. Rao, A. V. Associative symbiosis o f Azospirillum lipoferum with dicotyledonous succulent plants of the Indian desert / A. V. Rao, В. Vankateswarlu // Can. J . Microbiol. – 1982. – Vol. 28. – P. 778-782. 149. Reinhold, В. Azospirillum halopraeferens sp. nov., a nitrogen-fixing organism associated with roots of Kallar grass (Leptochloa fusca (L.) Kunth) / В. Reinhold, Т. Hurek, I. Fendrik, В. Pot, M. Gillis, K. Kersters, S. Thielemans, J . De Ley / / Int. J . Syst. Bacteriol. – 1987. – Vol. 37. – P. 43-51. 150. Reinhold, В. Close association o f Azospirillum and diazotrophic rods with different root zone of Kallar grass / В. Reinhold, Т. Hurek, E. G. Nieman, I. Fendrik // Appl. Environ. Microbiol. – 1986. – Vol. 52. – P. 520-526. 151. Rennie, R. J. Dinitrogen-fixing bacteria: computer assisted identification of soil isolates / R. J. Rennie // Can. J . Microbiol. – 1980. – Vol. 26. – P. 1275-1283. 152. Rennie, R. J. Isolation and identification of N2-Fixing bacteria associated with sugar cane (Saccharum sp.) / R. J. Rennie, J. R. De Freitas, A. P. Ruschel, P. В. Vose // Can J . Microbiol. – 1982. – Vol. 28. – P. 462-467. 153. Rhizobiaceae: Молекулярная биология бактерий взаимодействующих с растениями / под ред. Спайнк Г., Кондороши А., Хукас П., русский перевод под редакцией И.А. Тихоновича и Н.А. Проворова. – СПб.: Бионт, 2002. – C 23-25. 154. Richard, C. Bacteriologie et epidemiologic des especes du genre Klebsiella / C. Richard // Bulletin Inst. Past. – 1982. – Vol. 80. – P. 127-145. 155. Rinaudo, G. Fixation biologique de L’azote dans trois types de sol de rizieres / G. Rinaudo // These Doc. – Ing., Montpelier, 1970. - p. 1 – 215. 156. Robert, G.P. Genetics and regulation of nitrogen fixation / Robert G.P., Brill W.J. // Annu. Rev. Microbiol. – 1981. – Vol. 35. – P. 207-235. 107 157. Rodriguez, H. Phosphate solubilizing bacteria and their role in plant growth promotion / Rodriguez H., Fraga R. // Biotech. Adv. – 1999. – Vol. 17. – P. 319339. 158. Roswall, T. Nitrogen cycling in a subarctic ombrotrophic mire / T. Roswall, U. Granchall // Ecol. Bull. - 1980, № 30, p. 209 – 234. 159. Ruinen J. The phyllosphere An ecological neglected milieu / J. Ruinen // Plant and Soil. – 1961. - № 15. – p. 81 – 109. 160. Ruvkun, G.B. Interspecies homology of nitrogenase / Ruvkun G.B., Ausubel F.M. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1980. – Vol. 77. – P. 191-195. 161. Ryu, C.M. Bacterial volatiles promote growth in Arabidopsis / Ryu C.M., Farag M.A., Hu C.H. e.a. // PNAS. – 2003. – Vol. 100. – P. 4927-4932. 162. Scldin, L. Bacillus azotofixans sp, nov. a nitrogen-fixing species from Brazilian soil and grass roots / L. Scldin, J. D. Van Elsas, E. G. C. Penido // Int. J . Syst. Bacteriol. – 1984. – Vol. 54. – P. 451-456. 163. Seldin, L. Deoxyribonucleic acid homology among Bacillus po-lymixa. Bacillus macerans and Bacillus aiotofixans, and other nitrogen-fixing Bacillus strains / L. Seldin, D. Dubnau // Int. J . Syst. Bacteriol. – 1985. – Vol. 35. – P. 151154. 164. Shahbaz-Mohammadi, H. Screening and characterization of proline dehydrogenase flavoenzyme producing Pseudomonas entomophil / Shahbaz-Mohammadi H., Omidinia E. et at // Iranian journal of mricrobiology. – 2011. – Vol 3. – № 4. – P. 201-209. 165. Singh, M. Location of nitrogen fixation (nif) genes on indigenous plasmids of Enterobacter agglomerans / M. Singh, A. Kleeberger, W. Klingmuller // Mol Gen. Genet. – 1983. – Vol. 190. – P. 373-378. 166. Skerman, V.B.D. Approved Lists of Bacterial Names / Skerman V.B.D. et al. // Int. J. Syst Bacteriol. – 1980. – Vol. 30. – P. 225-420. 167. Smith, E. F. A plant tumor of bacterial origin / E. F. Smith, C.O. Townsend // Science. – 1907. – Vol. 25. – P. 671- 673. 108 168. Somers, E. Azospirillum brassilense produces the auxin like phenylacetic acid bu using the key enzyme for indol-3-acetic acid biosynthesis / E. Somers, D. Ptacek, P. Gysegon, M. Srinivasan, Z. Vanderleyden // Appl. and Environ. Microbiol. - 2005. – Vol. 71. - № 4. – p. 1803 – 1830. 169. Spaepe, S. Indole-3-acetic acid in microbial and microorganism-plant signaling / Spaepe S., Vanderleyden J., Remans R. // FEMS Microbiol. Rev. – 2007. – Vol. 31. – P. 425-448. 170. Tarrand, J. J. A taxonomic study of the Spirillum lipoferum group with description of a new genus, Azospirillum gen. nov. and two species, Azospirillum lipoferum (Beijerinck) comb. nov. and Azospirilum brasilense sp. nov / J. J. Tarrand, N. R. Krieg, J. Dobereiner // Can. J. Microbiom. – 1978. – vol. 24. – p 967. 171. Tjepkema, J. Nitrogen fixation associated with Juncus balticus and other plants of Oregon wetland / J. Tjepkema, H. Evans // Soil Biol. Biochem. - 1976. № 8. - p. 505 – 509. 172. Tjepkema, J. Nitrogenase activity associated with some Visconsin prairie grasses / J. Tjepkema, R. Burris // Plant and Soil. - 1976. - vol. 45. № 1. - p. 89 – 94. 173. Told R. Epiphytic nitrogen fixation in a forest ecosystem / R. Told, R. Meyer // Abs. Annu. Meet. Amer. Soc. Microbiol. – 1976. – p. 171 – 178. 174. Tomoko Aizawa. Burkholderia heleia sp. nov., a nitrogen-fixing bacterium isolated from an aquatic plant, Eleocharis dulcis, that grows in highly acidic swamps in actual acid sulfate soil areas of Vietnam / Tomoko Aizawa, Nguyen Bao Ve et al. // International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology . – 2010. - Vol. 60. – p. 1152-1157. 175. Vande Broek, A. Spatial-tempporal colonization patterns of Azospirillum brasilense on the wheat root surface and expression of the bacterial nifH gene during association / A. Vande Broek, et al. // Mol. Plant-Microbe Interact. - 1993. Vol. 6. - № 5. - P. 592-600. 109 176. Vera, L.D.B. Inoculation of rice plants with the endophytic diazotropha . Herpaspirillum seropedicae and Burkholderia spp. / Vera L.D.B. et al. // Biol Fertil Soil. – 2000. – Vol. 30. – P. 485 – 491. 177. Vespermann, A. Rhizobacterial volatiles affect the growth of fungi and Arabidopsis thaliana / Vespermann A., Kai M., Piechulla B. // Appl. Environ. Microbiol. – 2007. – Vol. 73. – P. 5639-5641. 178. Watanabe, I. A new nitrogen-fixing species of pseudomonad: Pseudomonas diazotrophicus sp. nov. isolated from the root of wetland rice / Watanabe I., So R., Ladha J. K., Katayama-Fujimura Y., Kuraishi H. // Can. J . Microbiol. – 1987. – Vol. 3 3 . – P . 670-678. 179. Weber, O.B. Isolation and characterization of diazotrophic bacteria in banana and pineapple plants / Weber, O.B., V.L.D. Baldani, K.R.S.Teixeira, G.Kirchhof, J.I. Baldani and J. Dobereiner // Plant soil. – 1990. – Vol. 210. – P. 103-113. 180. Westby, C. A. Metabolism of various carbon sources by Azospirillum brasilense / Westby C. A., Cutshall D. S., Vigil G. V. // J . Bacteriol. – 1983. – Vol. 156. – P. 1369-1372. 181. Whipps, J.M. Microbial interactions and biocontrol in the rhizosphere / J.M. Whipps // J. Exp. Bot. – 2001. – Vol. 52. – P. 487-511. 182. Wong, P. and Stenberg, N. E., "Characterization of Azospirillum isolated from nitrogen-fixing roots of haversted sorghum plants / Wong, P. and Stenberg, N. E. // Appl. Environ. Microbiol. – 1979. – Vol. 38. – P. 1189-1191. 183. Wood, D.W. The genome of the natural genetic engineer Agrobacterium tumefaciens C58 / Wood D.W., Setubal J.C., Kaul R., Monks D.E., Kitajima J.P., Okura V.K., Zhou Y. et al. // Science. – 2001. – Vol. 294, № 5550. – P. 2317-23. 184. Wright, S. F. Enumeration and identification of nitrogen-fixing bacteria from forage grass / Wright S. F., Weaver R. W. // Appl. Environ. Microbiol. – 1981. – Vol. 42. – P. 97-101. 110 185. Yasmin, S. Isolation, characterization and beneficial effects of rice associated plant growth promoting bacteria from Zanzibar / S. Yasmin, M.A.R. Baker, K.A. Malik, F.Y. Hafeez // soils. J. Basic Microbiol. – vol. 44. - №3. – p. 241-252. 186. Yong-Xiu Xing. Identification of a new nitrogen fixing endo-bacterium strain isolated from sugarcane stalk / Yong-Xiu Xing et al. // Sugar Tech. – 2006. – Vol. 8, Issue 1. – P. 49-53. 187. Zhang, H. Burkholderia kururiesis sp. nov., a trichloroethylene (TCE) – degrading bacterium isolated from an aquifer polluted with TCE / H. Zhang, S. Hanada, T. Shigematsu, K. Shibuya, Y. Kamagata, T. Kanagawa, R. Kurane // Int J Syst Evol Microbiol. – 2000. – vol. 50. – p. 743 – 749. 188. Hồ, Thị Kim Anh. Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn cố định nitơ trong rễ lúa lên sinh trưởng của mầm lúa CR203 / Hồ Thị Kim nh v c ng s . – NXB Khoa học Kỹ thuật, 1999. - 125 tr. 189. La Nguyễn, Tường Vi. Hiệu quả cố định đạm của m t số dòng vi khuẩn Burkholderia vietnamiensis trên lúa cao sản trồng trong chậu: Đề cương luận án thạc sỹ chuyên nghành sinh thái học / La Nguyễn Tường Vi. – Cần Thơ, 2010. – 87 tr. 190. Lâm, Văn Bạch. Hiệu quả của vi khuẩn cố định đạm trên cây lúa cao sản trồng ở Hậu Giang: Luận văn tốt nghiệp đại học. Đại học Cần Thơ / Lâm Văn Bạch. – Cần Thơ, 2011. – 72 tr. 191. Nguyễn, Kim Vũ. Báo cáo tóm tắt kết quả nghiên cứu đề tài cấp nh nước KC – 08 – 01 về công nghệ sản suất và ứng dụng phân vi sinh vật cố định Nito nhằm nâng cao năng suất lúa và cây trồng cạn / Nguyễn Kim Vũ // Chương trình công nghệ sinh học KC – 08. – Hà Nôi,1995. – 20 c. 192. Nguyển, Thị Minh Thư. Phân lập và nhận diện m t số dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm từ đất vùng rễ lúa ở Kiên Giang: luận văn thạc sỹ Sinh Thái Học / Nguyển Thị Minh Thư. – Cần Thơ, 2010. – 134 tr. 111 193. Phạm, Bích Hiên. Nghiên cứu tuyển chọn m t số chủng Azotobacter đa hoạt tính sinh học sử dụng cho sản xuất phân bón vi sinh chức năng / Phạm Bích Hiên, Phạm Văn Toản // Báo cáo h i nghị CNSH toàn quốc. – 2003. – 12 tr. 112 ПРИЛОЖЕНИЕ Приложение 1 Ростовой эффект чистых культур ассоциативных азотфиксаторов (длина корешков и стебельков проростков кресс-салата, после замачивания семян в разведении 1:100, 1:1000 суточной культуры разных изолятов в течение 30 минут и инкубации при 25°C через 72 часа) Варианты инокуляции и контроль Контроль (вода) D2 C13 A20 C12 J26 B30 B31 C37 E17 C7 C19 C31 E30 C22 J35 C43 F12 При разведении 1:100 Длина Длина корешков (мм) стебельков (мм) 27,06 bc 17,67 bc При разведении 1:1000 Длина Длина корешков (мм) стебельков (мм) 26,84 bc 16,28 b 13,18 a 25,20 b 29,62 bcde 30,89 bcde 40,22 f 34,51 cdef 30,03 bcde 32,65 bcdef 35,31 def 33,04 bcdef 35,90 def 29,15 bcd 32,26 bcdef 34,36 cdef 33,16 bcdef 27,99 bcd 37,74 ef 11,09 a 25,66 b 27,01 bc 30,78 bcde 36,37 cde 31,2 bcde 30,08 bcde 29,33 bcd 39,95 e 30,94 bcde 31,5 bcde 30,89 bcde 33,98 bcde 37,97 de 31,59 bcde 32,24 bcde 35,09 bcde 7,12 a 17,47 bc 17,81 bc 19,18 bcd 20,75 cd 18,68 bcd 20,33 cd 20,22 cd 17,61 bc 21,49 d 21,77 d 16,39 b 20,72 cd 19,59 bcd 21,04 cd 20,08 cd 20,11 cd 7,63 a 15,80 b 17,81 bc 18,11 bc 18,72 bc 18,78 bc 18,97 bc 19,13 bc 19,38 bc 19,46 bc 19,55 bc 19,63 bc 20,84 bc 20,94 bc 21, 00 bc 21,80 c 22,65 c Приложение 2 Влияние разных штаммов Agrobacterium tumefaciens на массу стеблья и нитрогеназную активность на корни огурца и разнолистной капусты после 40 дней выращивания в модельном опыте Варианты инокуляции и контроль K J26 C7 C19 C43 Масса стебля огурца (г/растение) Нитрогеназная активность на 1 г корней огурца (наномоль С2Н4/ч) 0.445 a 0,617 ab 0,842 bc 0,870 c 0,668 abc 79,93 a 14,69 a 204,39 c 208,57 c 142,98 b Масса стебля разнолистной капусты (г/растение) 0,084 ab 0,096 abc 0,079 ab 0,139 bc 0,067 a Нитрогеназная активность на 1 г корней разнолистной капусты (наномоль С2Н4/ч) 240,8 b 63,07 a 48,20 a 95,80 a 385,50 c 113 E17 C22 F12 0,610 ab 0,845 bc 0,792 bc 14,23 a 193,28 c 203, 87 c 0,122 abc 0,141 bc 0,148 c 22,87 a 244,01 c 315,80 bc Приложение 3 Влияние разных штаммов Agrobacterium tumafaciens на содержание нитрата товарной продукции огурца в мелкоделяночном опыте в условиях теплицы Показатели контроль Содержание нитрата в товарной продукции (мг/кг товарной 324,3 ± 24 продукции) (среднее значение ± стандартное отклонение) С7 С19 F12 380,9±20 314,4±17 328,3±32 C22 C43 395±43 237,75±55 Приложение 4 Влияние разных штаммов Agrobacterium tumafaciens на содержание нитрата товарной продукции разнолистной капусты в мелкоделяночном опыте в условиях теплицы Показатели контроль E17 Содержани е нитрата в товарной продукции (мг/кг 448,7±45 510,5±66 товарной продукции) (среднее значение ± стандартное отклонение) J26 498±56 C19 C22 470,25±30 461,44±48 F12 846,5±32 114 Приложение 5 Влияние разных штаммов Agrobacterium tumefaciens на рост, массу стебля, урожай, и содержание общего азота в листьях огурца и разнолистной капусты в мелкоделяночном опыте в условиях теплицы Варианты инокуляц ии и контроль K E17 J26 C19 C22 F12 C43 Длина стебля через 2 недели после посадки , см 26,83 b * * 25,67 b 19,25 a 33,25 c 28,58 bc 25,25 b C7 Огурец Масса Урожай, стебля г/растечерез 2 ние недели после посадки, г/растение Общий азот в листьях, % от массы абсолют но сухого в-ва 10,77 b * * 8,57 a 7,94 a 12,39 c 12,21 c 1581,46 * * 1548,55 1544,89 1686,46 1681,30 1,59 a * * 1,82 ab 1,81 ab 2,01 bc 1,65 a 10,26 b 1581,46 2,16 c Fф ‹ F05 Разнолистная капуста Масса Урожай Общий азот стебля г/расте- в листьях, через 20 ние % от массы дней после абсолютно посадки, сухого в-ва г/растение 0,66 bc 0,52 a 0,63 abc 0,573 ab 0,75 cd 0,79 d * 140,00 135,67 129,00 130,00 163,33 185,00 * 3,14 a 5,128 abc 3,880 ab 4,444 ab 4,982 abc 6,569 bc * * * Fф ‹ F05 * Примечание: *) не проведены наблюдения Приложение 6 Уровень обеспеченности грунта азотом по данным анализа образцов объемным методом, мг/л (Портянкин, Шамшина,2010). Уровень обеспеченности грунта азотом Азот, мг/л Низкий 0 – 30 Умеренный 31 - 60 Нормальный 61 - 90 Повышенный 91 - 120 Высокий 120 - 150 115 Приложение 7 Средние показатели выноса азота растениями огурца (по действующему веществу) с урожаем (Портянкин, Шамшина,2010). Урожайность кг/м2 Общая зеленая масса кг/м2 Вынос азота, г/м2 30 32,7 42 25 31 36 20 24,8 30 15 19 23 10 13,2 17 Приложение 8 Средние нормы удобрений азота (по действующему веществу) для основного внесения в почву в зависимости от уровня обеспеченности грунтов, г/ м2. (Портянкин, Шамшина,2010). Азота, г/м2 Уровень обеспеченности грунта азотом Низкий 16 - 11 Умеренный 11 - 6 Нормальный 6-0 Повышенный 0 Высокий 0 Приложение 9 Оптимальное и избыточное количества азота в почве защищенного грунта, мг/л (Гельмут, 2000). Содержание азота, мг/л Оптимальное Избыточное 80 – 150 > 400
