МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В ДИАГНОСТИКЕ

ÄÈÀÃÍÎÑÒÈÊÀ È ÏÐÎÔÈËÀÊÒÈÊÀ ÒÓÁÅÐÊÓËÅÇÀ ÆÈÂÎÒÍÛÕ
позволяют сделать заключение о валидности (обоснованности) проведенных экспериментов и определить величину относительной активности туберкулина для
птиц — R=1,0±0,2.
3. Полученные данные позволяют сделать вывод о равном содержании туберкулиновых единиц активности во флаконе
туберкулина для птиц серии № 12 и в ампуле образца Международного стандарта.
4. Установлено, что в одном флаконе туберкулина сухого очищенного (ППД) для
птиц серии № 12 содержится 500000 МЕ активности Первого международного стандарта туберкулина (PPD) M. avium.
5. Таким образом, серия № 12 туберкулина сухого очищенного (ППД) для птиц
может использоваться в качестве национального стандарта туберкулина (ППД)
для птиц.
Литература
1. ГОСТ 23881-79 «Туберкулин сухой очищенный
(ППД) для птиц». М.: Издательство стандартов.
1979. 13 с.
2. Комитет экспертов ВОЗ по стандартизации био-
логических препаратов. Женева. 1988. 36 доклад.
С. 29–49.
3. OIE Manual of Standards for Diagnostic Test and
Vaccines. 2000. P. 718–725.
УДК 619:616.579.873.21Т
Т.В. Гребенникова, С.Л. Кальнов, А.Д. Забережный, Т.И. Алипер,
Е.А. Непоклонов
(Институт вирусологии им. Ивановского, НПО Нарвак)
МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В ДИАГНОСТИКЕ ТУБЕРКУЛЕЗА
За последнее десятилетие во всем мире наблюдается резкое повышение уровня заболеваемости туберкулезом. Одной
из важнейших задач, связанных с данным
заболеванием является быстрая и надежная диагностика, в том числе и для контроля над инфекционным процессом. В
последнее время получили широкое распространение молекулярные методы диагностики микобактерий: это полимераз92
ная цепная реакция (ПЦР), методы молекулярной гибридизации и секвенирования
различных участков ДНК. ПЦР является
удобным методом, сочетающим высокую
чувствительность, специфичность и быстроту. В данной работе отражены этапы
развития молекулярной диагностики туберкулеза с использованием подходов и
тест-систем, разработанных в НПО НАРВАК, совместно с Институтом вирусолоВетеринарная патология. № 1–2. 2004
ÄÈÀÃÍÎÑÒÈÊÀ È ÏÐÎÔÈËÀÊÒÈÊÀ ÒÓÁÅÐÊÓËÅÇÀ ÆÈÂÎÒÍÛÕ
гии им. Д.И. Ивановского.
Ранее разработана тест-система на основе «nested» — ПЦР, позволяющая проводить дифференциальную диагностику микобактерий. В тест-системе используются
праймеры к специфическим фрагментам
геномов различных микобактерий позволяющие дифференцировать M. tuberculosis
от M. bovis, М. avium и других атипичнах
штаммов микобактерий [1]. Данные праймеры дают положительный результат при
использовании образцов, содержащих M.
bovis и M. tuberculosis. При этом M. avium,
M. intracellulare и все исследованные атипичные штаммы микобактерий дают отрицательный результат. Тест-система была
проверена более чем на 1500 образцов от
животных и клинических образцов от людей [2, 3] и показала высокую сходимость
результатов диагностики методом ПЦР с
классическими методами детекции микобактерий.
Особенно важна интерпретация результатов ПЦР: положительный результат ПЦР означает наличие ДНК микобактерий в пробе, однако информация об
их жизнеспособности отсутствует. Существует ряд методов, позволяющих определить стадию развития бактерии. Критерием того, что бактерия живет и размножается, является экспрессия генов и синтез важных для жизни бактерии белков.
Экспрессию генов можно определить по
наличию мРНК микобактерий. Поскольку бактериальная мРНК имеет очень короткое время жизни (1–2 мин.), определение мРНК возможно только при постоянной экспрессии генов бактерии. Существует модификация полимеразной цепной реакции (ПЦР), с помощью которой
можно определить наличие бактериальной мРНК. Это метод обратной транскрипции и амплификации (ОТ-ПЦР), который позволяет определять РНК (а не
только ДНК) бактерий. Первая стадия
этой реакции (обратная транскрипция) —
синтез на матрице РНК комплементарной
цепи ДНК (кДНК). Второй стадией является проведение ПЦР. Результаты данной
реакции можно наблюдать после проведения электрофореза. Результаты метода ОТ-ПЦР могут дополнять результаты
ПЦР в тех случаях, когда затруднена интерпретация результатов. Наличие ДНК
и мРНК указывает на то, что микобактерии жизнеспособны, идет постоянная экспрессия генов и синтез белка. Отсутствие
синтеза мРНК говорит о том, что бактерии находятся в дормантом состоянии или
нежизнеспособны.
Метод ОТ-ПЦР был применен для контроля экспрессии генов диагностики микобактерий в культуре макрофагов и образцах от животных и человека [4], а также
для контроля внутрибольничной инфекции [5]. Исследовали 100 проб, полученных
от пациентов Института фтизиопульмонологии. Пробы были исследованы с использованием классических методов диагностики микобактерий (бактериологический
метод и микроскопия) и методов ПЦР и
ОТ-ПЦР. Для проведения ПЦР были использованы специфические праймеры на
ДНК Mycobacterium tuberculosis, позволяющие отличить M. tuberculosis от M.
bovis и от атипичных штаммов микобактерий [3]. Показана более высокая чувствительность метода ОТ-ПЦР по сравнению с
ПЦР и классическими методами исследования.
Последние годы показали, что молекулярные методы исследования, такие как
ПЦР и ОТ-ПЦР, могут с успехом использоваться в диагностике туберкулеза. Однако
использование данных методик необходимо корректировать в зависимости от конкретных задач и ситуаций. Только комплексная постановка диагноза на туберкулез
будет наиболее полно отражать реальную
картину в хозяйстве.
Литература
1. Grebennikova, T.V., Grabovetsky, V.V., Kalnov, S.L.,
Nepoklonov, E.A. // Differental diagnostics of mycobacteria by PCR in blood and tissues from animals.
1997 // First International Veterinary Vaccines and
Diagnostics Conference. Madison. Wisconsin. USA.
27–31 July. P. 72.
2. Grebennikova, T.V., Grabovetsky, V.V., Shumsky, N.I.,
Kalnov, S.L., Nepoklonov E.A. Differential diagnostics of mycobacteria by polymerase chain reaction.
1999. Veterinaria (Rus.). N. 3. P. 17–20.
3. Grebennikova T.V., Nepoklonov E.A. // Detection
and identification of Mycobacteria isolates from human clinical samples // 1999, 9th ECCMID. March
21–24. Berlin. Germany. P. 204.
4. Гребенникова Т.В., Забережный А.Д., Грабо-
Ветеринарная патология. № 1–2. 2004
вецкий В.В., Бикетов С.Ф., Кальнов С.Л., Алипер Т.И., Непоклонов Е.А. // Детекция экспрессии генов микобактерий в культуре макрофагов и образцах от животных и человека
// II Международная научная конференция
«Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии. 2000. 18–19 октября. С.
213
5. Т.В Гребенникова, М.А. Гусева, А.Н. Власова,
И.Р. Дорожкова, С.А. Попов, Т.И. Алипер, Е.А.
Непоклонов // Применение метода ОТ-ПЦР для
контроля внутрибольничной инфекции // Российская научно-практическая конференция «Нозокомиальная туберкулезная инфекция». 2001.
Москва. Россия. 14–16 июня.
93