МИНЗДРАВСОЦРАЗВИТИЯ РОССИИ Государственное образовательное учреждение Высшего профессионального образования ИРКУТСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ (ГОУ ВПО ИГМУ Минздравсоцразвития России) Медико-профилактический факультет Кафедра микробиологии Методические рекомендации к практическим занятиям для студентов ИГМУ по теме: «ВЛИЯНИЕ ФАКТОРОВ ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ НА МИКРООРГАНИЗМЫ» » для специальности: 060108 «Фармация» Иркутск – 2008г. Методические рекомендации составлены: зав. кафедрой микробиологии ИГМУ, проф. Р. В. Кибортом, проф.. Е.В. Симоновой ст. препод.,к.б.н. Т. А. Платоновой Методические рекомендации составлены в соответствии с типовым учебным планом общеобразовательного стандарта подготовки студентов высших медицинских учебных заведений и медицинских факультетов университетов по курсу «Микробиология с вирусологией и иммунологией» и рабочей программой кафедры микробиологии ИГМУ. Методические рекомендации обсуждены на заседании кафедры микробиологии ИГМУ. Протокол № ______ от _____________ 2008г. Методические рекомендации рассмотрены и рекомендованы к изданию на заседании цикловой методической комиссии кафедр медико-биологического профиля ИГМУ. Протокол № ___ от __________2008г. Председатель ЦМК профессор Р.В. Киборт. ЗАНЯТИЕ № 1 Тема занятия: «Действие физических факторов внешней среды на микроорганизмы». 1. 2. 3. 4. 1. 2. 3. 4. Вопросы для самостоятельной подготовки студентов к занятию: Влияние факторов внешней среды на микроорганизмы. Влияние физических факторов на микроорганизмы. Механизм повреждающего действия. Практическое использование факторов физической природы для уничтожения микроорганизмов. Дезинфекция. Принципы, положенные в основу дезинфекции физическими методами. Студент должен знать: Механизм повреждающего действия факторов внешней среды. Практическое использование физических факторов для микроорганизмов. Принципы и способы дезинфекции. Принципы, положенные в основу стерилизации. уничтожения Студент должен уметь: 1. Использовать физические методы для стерилизации. ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА СТУДЕНТОВ НА ЗАНЯТИИ Задание 1. Используя рис. 1, 2 и 3 разобрать принципы, положенные в основу дезинфекции. Факторы внешней среды, обладающие противомикробным эффектом действия следует разделять по их природе на: а) физические. К ним относятся: - температура - давление - фильтрование - энергия УФ - рентгеновская, -излучение и др. б) химические: К ним относятся неорганические и органические вещества разных классов. в) биологические – микроорганизмы или продукты их метаболизма. ДЕЗИНФЕКЦИЯ – это комплекс мероприятий, направленных уничтожение болезнетворных микроорганизмов во внешней среде. Задание 2. Используя рис. 4,5 разберите принципы и методы стерилизации. на Ведет к прерыванию передачи микроорганизмов от заразного материала к неинфицированному. Приводит К уничтожению микроорганизмов К удалению микроорганизмов Дезинфекция Отсутствует источник инфекции Имеется источник инфекции В эпидемиологическом очаге Профилактическая А) накопление микробов Б) размножение микробов В) распространение микробов Предупреждение процесса Ликвидация процесса Рис.1 МЕТОДЫ ДЕЗИНФЕКЦИИ дезинфекция Механические Вытряхивание Фильтрование Химические Воздействие дезинфектантов методами Погружения, орошения, смачивания, засыпания Комплексная Сочетание нескольких методов Физические Биологические Кипячение, сжигание, сухой или влажный воздух, УФ-облучение и др. Антагонистические взаимоотношения между микроорганизмами Рис. 2 ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА ДЕЗИНФЕКЦИЮ ДЕЗИНФЕКЦИЯ Физико-химические свойства дезинфектантов: Концентрация :: растворимость в воде; рh, температура и др. Биологическая устойчивость микробов дезинфектантам: Факторами резистентности микроорганизмов к Особенности обработки: Качества материала, особенности обрабатываемого объекта Массивность микробного обсеменения: Степень загрязнения объекта Время воздействия: экспозиция Способ дезинфекционной обработки: Крупнокапельное орошение, погружение, протирание и т.д. Рис. 3 МАТЕРИАЛЫ, ПОДВЕРГАЮЩИЕСЯ СТЕРИЛИЗАЦИИ Изделия, соприкасающие ся с раневой поверхностью Контакт с кровью и инъекционными препаратами, питательные среды Рис. 5 Медицинские инструменты, которые в процессе эксплуатации соприкасаются со слизистой оболочкой и могут вызвать ее повреждение ХИМИЧЕСКИЕ ВЕЩЕСТВА, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ДЛЯ УНИЧТОЖЕНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ Поверхностно -активные Нарушают проницаемость Клеточной стенки и цитоплазматической мембраны Формальдегиды Приводят к денатурации белка Окислители Связывают сульфидрильные группы активных белков Красители Задерживают рост бактерий, ингибируют синтез ферментов индуцибельных Рис. 1 Фенолы Повреждают клеточную стенку, денатурируют белки Соли тяжелых металлов Коагулируют белки СТЕРИЛИЗАЦИЯ ПОЛНОЕ УНИЧТОЖЕНИЕ ВЕГЕТАТИВНЫХ ФОРМ МИКРООРГАНИЗМОВ И ИХ СПОР В РАЗЛИЧНЫХ ОБЪЕКТАХ ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ Термический метод Уничтожение путем воздействия: 1. Высоких температур 2. Давления (используются стерилизаторыпаровые, воздушные, глассперленовые) Химические методы Уничтожение воздействием химических веществ, обладающих микробоцидным действием и приводящих к специфическим и неспецифическим повреждениям в микробной клетки. (газовые стерилизаторы, растворы химических средств) Биологические методы Уничтожение путем воздействия продуктов микробного биосинтеза, влияющих на метаболические пути ингибирующих микроорганизмов Рис. 4 Радиационные методы Использование УФ, R-лучей (установки стр.344) ЗАНЯТИЕ № 2 Тема занятия: «Действие факторов внешней среды химической природы на микроорганизмы». 1. 2. 3. Вопросы для самостоятельной подготовки студентов к занятию: Химические факторы внешней среды. Механизм повреждающего действия. Классификация химических веществ, используемых в качестве дезинфектантов. Принципы, положенные в основу дезинфекции химическими методами. Студент должен знать: 1. Механизм повреждающего действия факторов внешней среды химической природы. 2. Химические вещества, используемые в качестве дезинфектантов. Студент должен уметь: 1. Определять эффективность использования дезинфицирующих веществ для обработки рук. 2. Определять эффективность действия химических препаратов в отношении разных видов микроорганизмов. ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА СТУДЕНТОВ НА ЗАНЯТИИ Задание 1. Используя рис. 1 разобрать классификацию химических веществ, используемых для уничтожения микроорганизмов. Задание 2. Оцените эффективность применения дезинфицирующих веществ: туалетное мыло и хлоргексидин в концентрации 0,5% для обработки рук медицинского персонала. При выполнении задания Вам необходимо: 1. Первой группе, участвующих в эксперименте студентов, ватным тампоном, смоченным стерильным физиологическим раствором обработать кисть левой руки и провести посев на МПА (а) рис.7. После помыть руки с туалетным мылом и провести смыв стерильным ватным тампоном, смоченным стерильным физиологическим раствором с кисти правой руки и провести посев на МПА (б) рис.7, просев проводить методом истощающего штриха. А Б МПА Рис. 2 2. Вторая группа, участвующих в эксперименте студентов ватным тампоном, смоченным стерильным физиологическим раствором провести смыв с кисти левой руки и сделать посев на МПА-2 (а). После этого правую руку обработать ватным тампоном, смоченным 0,25% раствором хлоргексидина и сделать смыв через 5 минут стерильным ватным тампоном, смоченным стерильным физиологическим раствором и сделать посев на МПА –2 (б). Рис.8. Посев провести методом истощающего штриха. А Б МПА Рис.3 Задание 3. Оценить эффективность применения хлорамина Б в разных концентрациях для дезинфекции медицинского инвентаря в гнойном отделении ОКБ. При планировании экспериментальных исследований, следует помнить, что циркулирующие на объектах внешней среды микроорганизмы находятся в виде микробных ассоциаций. В связи с этим необходимо исследовать действие дезинфектанта в отношении микроорганизмов различных систематических групп. Вам рекомендованы для этих целей культура стафилококков (грам+), культура кишечной палочки (грам-) и культура грибов рода Кандида. При выполнении необходимо: 1. сформулировать цель исследования 2. определить материал исследования 5. выбрать тест-культуру, на которой проводят экспериментальное исследование 6. провести экспериментальную работу, согласно методической инструкции приведенной ниже. 7. Результат, выполненной работы внести в таблицу 1. Ход выполнения экспериментальной работы: 1. В питательный агар (МПА) внесен хлорамин Б, с учетом его концентрации в среде 0,1%, 1,0%, 10,0%. Каждый вариант разлит в чашки Петри, на которые Вам необходимо провести посев тест-культуры в концентрации КОЕ- 10 кл/мл (Рис.9). Для этого из микробной взвеси отобрать и внести на поверхность питательной среды во все опытные варианты по 0,1 мл микробной суспензии. Микробную взвесь равномерно растирают стерильным бактериальным шпателем (посев «газоном»). 2. Экспериментальные исследования с культурами других видов микроорганизмов проводят по аналогичной схеме. 3. Посевы инкубируют в термостате при температуре 37 с. Таблица 1 ОПРЕДЕЛИТЬ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ДЕЙСТВИЯ ХЛОРАМИНА Б В ОТНОШЕНИИ МИКРООРГАНИЗМОВ Цель Конт Концентрация, % Тестисследования роль культуры 0,1 1,0 10,0 1. 2. 3. Заключение ЗАНЯТИЕ № 3 Тема занятия: «Влияние факторов внешней среды на микроорганизмы. Биологические факторы». 1. 2. 3. 4. Вопросы для самостоятельной подготовки студентов к занятию: Биологические факторы внешней среды. Явление микробного антагонизма и синергизма. Антибиотики. Классификация по происхождению. Получение антибиотиков. Механизм взаимодействия с бактериальной клеткой. Студент должен знать: 1. Биологические факторы, влияющие на жизнедеятельность микроорганизмов. 2. Механизмы повреждающего действия биологических факторов на микроорганизмы. 3. Механизмы действия антибиотиков на микробные клетки. Студент должен уметь: 1. Оценить антагонистическое и синергическое действие микробов в ассоциации. 2. Оценить спектр антимикробного действия антибиотиков. ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА СТУДЕНТОВ НА ЗАНЯТИИ Задание 1. Оценить результаты посева смывов с рук с использованием разных дезинфицирующих веществ. Для выполнения данной работы Вам необходимо качественно оценить результаты предыдущего занятия: 1. полученные результаты внесите в таблицу 1. Результаты оцениваете качественно: - сплошной рост культуры – «++++» - рост отдельных изолированных колоний от 100 до 200 – «+++» - рост колоний от 10 до 100 – «++» - рост колоний от 0 до 10 – «+» Таблица 1 ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ ДЕЗИНФИЦИРУЮЩИХ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ УНИЧТОЖЕНИЯ МИКРОФЛОРЫ НА КОЖЕ РУК. Анализируемые варианты Результаты 1. контроль 2. Туалетное мыло 3. Контроль 4. Хлоргексидин 0.25% Заключение 2. Оцените: А) Эффективно ли мыть руки с мылом перед едой? Б) Эффективно ли использовать хлоргексидин для дезинфекции рук по сравнению с контролем? В) Какой из используемых дезинфицирующих препаратов является наиболее эффективным? Г) На основании полученных результатов сделайте заключение. Задание 2. Экспериментальная задача. Оцените эффективность действия хлорамина Б, в зависимости от концентрации на разные виды микроорганизмов. Для выполнения данной работы необходимо: 1. Подсчитайте на экспериментальных посевах и в контроле, полученные данные внесите в таблицу 1, предыдущего занятия. 2. На основании полученных данных оцените токсический эффект действия, используя формулу: L = (Sк – Sоп) (1), где: Sк и Sоп – выживаемость, соответственно в опыте и контроле, которую расчитывают по формуле 2, принимая выживаемость в контроле за 100%. N оп S = ------------ х 100, (2), где: Nк Nоп – число колоний, выросших в опыте Nк – число колоний, выросших в контроле. 3. Полученные результаты внесите в таблицу 2 и постройте график концентрационной кривой. Таблица 2 ОЦЕНКА ТОКСИЧЕСКОГО ЭФФЕКТА ДЕЙСТВИЯ ХЛОРАМИНА Б В ОТНОШЕНИИ РАЗЛИЧНЫХ ВИДОВ МИКРООРГАНИЗМОВ Анализируемые Контроль Концентрация хлорамина Б,% тест-культуры 0,1 1,0 10,0 Escherichia coli Staphyllococcus aureus Candida albicans ЛЕТАЛЬНЫЙ ЭФФЕКТ ХЛОРАМИНА Б В ЗАВИСИМОСТИ ОТ КОНЦЕНТРАЦИЙ (для разных культур микрооганизмов) Летальный эффект,% 100 80 60 40 20 0,1 1,0 10,0 Концентрация, мг/мл Рис.1 4. Дайте заключение. Задание 3. Используя рис.2, разберите влияние биологический факторов на микроорганизмы. Биологические методы стерилизации В основе лежит ингибирующий процесс метаболизма в микробной клетке за счет: 1. Воздействия бактериоцинов, продуцируемые микробной клеткой. 2. Воздействия специфических фагов на микробную клетку, приводящие к ее лизису. 3. Воздействия фитонцидов на микроорганизмы. 4. Воздействия продуктов секреции животных на микроорганизм: лизоцим, интерферон, иммуноглобулины и другие белковые продукты. Рис. 2 Задание 4. Используя Рис.3 разобрать типы взаимодействия микроорганизмов в микробных ассоциациях. е Антагонизм Микробы продуцируют биологически активные вещества, ингибирующие рост и размножение других микроорганизмов: Синегнойная палочка Холерный вибрион, сальмонеллы, стафилококки, шигеллы. МИКРОБНЫЕ АССОЦИАЦИИ Нейтрализм Микроорганизмы в биотопе не оказывают друг на друга ни стимулирующего, ни подавляющего действия: Кишечная палочка, Бифидобактерии, лактобактерии, бактерии нормальной микрофлоры. Синергизм За счет общих процессов метаболизма усиливают физиологические функции и свойства бактерий при совместном выращивании: Дрожжи и молочнокислые бактерии. Рис. 3 Задание 5. Изучите влияние синегнойной палочки на разные виды микроорганизмов. Для этого необходимо: 1. Изучить демонстрационные посевы культур кишечной палочки, стафилококка, сальмонелл в присутствии синегнойной палочки 2. Определить в отношении каких микроорганизмов проявляет свои антагонистические свойства синегнойная палочка. 3. Определить спектр (в мм) антагонистической активности синегнойной палочки. 4. Результаты записать в таблицу 3. 5. Сделать заключение. Таблица 3 ВЛИЯНИЕ СИНЕГНОЙНОЙ ПАЛОЧКИ НА РОСТ ДРУГИХ МИКРООРГАНИЗМОВ Исследуемые культуры Цель исследования Результаты антагонистического действия синегнойной палочки 1. Кишечная палочка 2. Стафилококк 3. Сальмонеллы Заключение Задание 6. Используя Рис.4 разобрать классификацию антибиотиков по происхождению. ЗАНЯТИЕ № 4 Тема занятия: «Влияние факторов внешней среды на микроорганизмы: Антибиотики». Вопросы для самостоятельной подготовки студентов к занятию: 1. Антибиотикорезистентные штаммы микроорганизмов. Механизм формирования лекарственной устойчивости у микроорганизмов. 2. Принципы рациональной антибиотикотерапии. 3. Побочное действие антибиотиков: - возможные осложнения у человека при нерациональной антибиотикотерапии. - отрицательное воздействие нерациональной антибиотикотерапии на микроорганизмы. 4. Определение чувствительности бактерий к антибиотикам. Практическое применение. Студент должен знать: 1. Принципы рациональной антибиотикотерапии 2. Механизмы действия антибиотиков на микробные клетки. Студент должен уметь: 1. Определить чувствительность бактерий к антибиотикам ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА СТУДЕНТОВ НА ЗАНЯТИИ Задание 1. Используя Рис. 1 разобрать классификацию методов определения чувствительности бактерий к антибиотикам. Задание 2. Изучить спектр действия антибиотиков на разные виды микроорганизмов. Для определения чувствительности бактерий к антибиотикам используют различные методы. Среди них наиболее широко применяемым является метод дисков (Рис.2). Культуру исследуемого микроорганизма засевают «газоном» на МПА и на поверхность раскладывают диски, пропитанные разными антибиотиками в минимальной ингибирующей концентрации. Учет результатов проводится через 24 часа. Оценивают зону задержки роста культуры вокруг диска, измеряя ее диаметр. Степень активности определяется по табл. 1. Выполняя задание Вам необходимо: 1. Изучить демонстрационные посевы культур стафилококка, кишечной палочки и дрожжеподобных грибов рода Кандида. 2. Определить диаметры зоны задержки роста вокруг дисков, пропитанных различными антибиотиками: - Неомицином - Пенициллином - Тетрациклином - еворином 3.Результаты записать в табл.1. 3. Оценить к каким препаратам чувствительные: А) Грам (+) бактерии (стафилококк) Б) Грам (-) бактерии (кишечная палочка) В) Дрожжеподобные грибы рода Кандида 4.Сделать заключение. КЛАССИФИКАЦИЯ АНТИБИОТИКОВ ПО ПРОИСХОЖДЕНИЮ Антибиотики получают: Биологическим синтезом: Бактерии Грамацилин Полимиксин Макролиды Левомицетин Тетрациклины Аминогликозиды Грибы Пенициллины Цефалоспорины Экстракцией Из тканей животных Эритрин Экмолин Лизоцим Иммуноглобули ны Интерферон Из растительного сырья Новоилеанин Сальвин Сангривитин Аллицин Рафанин Фитонциды черемухи Сибирской пихты Рис. 4 Актиномицеты Методом генной инженерии Интерферон Химическим синтезом Полусинтетические Препараты Оксациллин Ампициллин Синтетические препараты Хиноксалины Рифампицин МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К АНТИМИКРОБНЫМ АГЕНТАМ Диффузный метод 1. Исходный метод 2. Метод дисков Микротитрационная модификация метода серийных разведений в жидких средах Метод серийных разведений в жидких средах Определение способности к образованию -лактамаз Метод серийных разведений в плотных средах Табл. 1 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ МИКРОБОВ К АНТИБИОТИКАМ Анализируемые Исследуемые культуры микроорганизмов антибиотики Стафилококк Кишечная палочка Грибы рода Кандида 1. Неомицин 2. Пенициллин 3. Тетерациклин 4. Леворин Заключение Задание 3. Разобрать определения чувствительности бактерий к антибиотикам методом серийных разведений. Данным методом определяют минимальную концентрацию антибиотика, ингибирующую рост исследуемой культуры бактерий. Концентр ация АБ мг/мл Исследуе мая культура 10-10 кл/мл 1 100 2 50 0,1 0,1 Схема постановки опыта 3 4 5 25 12,5 6,25 0,1 0,1 6 3,12 7 1,65 К.К МПБ без АБ 0,1 0,1 0,1 0,1 При определении минимальных ингибирующих концентраций (МИК), вначале готовят основной раствор, содержащий определенную концентрацию исследуемого антибиотика (мгк/мл или ЕД/мл) в специальном растворителе или буферном растворе. Из него готовят все последующие разведения в бульоне (1мл). Затем к каждому разведению добавляют 0,1 мл исследуемой бактериальной суспензии. В контрольную пробирку вносят бульон и 0,1 мл суспензии бактерий (контроль культуры). Оценку результатов проводят по помутнению питательной среды, сравнивая с контролем культуры. Минимальная ингибирующая концентрация (МИК) – последняя концентрация, вызывающая задержку роста культуры (последняя пробирка с прозрачной питательной средой). Оценку результатов проводят по таблице «Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам методами дисков и серийных разведений». Задание: 1. Определить МИК разных антибиотиков. 2. По результатам подобрать антибиотик для лечения. 3. Обосновать решение Задание 4. Заслушать рефераты по темам «Антибиотики и бактериофаги». 1. 2. 3. Темы рефератов Явление микробного антогонизма и синергизма. Микробы – продуценты антибиотиков. Классификация антибиотиков по механизму действия. 4. Антибиотикорезистентные штаммы микроорганизмов. Механизмы формирования лекарственной устойчивости у мироорганизмов. 5. Принципы рациональной антибиотикотерапии. 6. Побочное действие антибиотиков: - Возможные осложнения у человека при нерациональной антибиотикотерапии - Отрицательное воздействие нерациональной антибиотикотерапии на микроорганизмы. 7. Определение чувствительности бактерий к антибиотикам. 8. Бактериофаги. Вирулентные и умеренные. 9. Практическое использование фагов: - Для индикации и идентификации бактерий. - При терапии и профилактики инфекционных заболеваний. - Для оценки санитарного состояния окружающей среды - В биотехнологии. ЗАНЯТИЕ № 5 Тема занятия: «Влияние факторов внешней среды на микроорганизмы. Бактериофагия». Вопросы для самостоятельной подготовки студентов к занятию: 1. Бактериофаги. Структура. Классификация. Вирулентные и умеренные фаги. 2. Механизмы взаимодействия бактериофагов с микробной клеткой. 3. Практическое использование фагов: для индикации и идентификации бактерий; при терапии и профилактики инфекционных заболеваний; для оценки санитарного состояния окружающей среды; в биотехнологии. Студент должен знать: 1. Механизмы взаимодействия бактериофагов с микробной клеткой. Студент должен уметь: 1. Уметь проводить фагодиагностику чистых культур микроорганизмов. ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА СТУДЕНТОВ НА ЗАНЯТИИ Задание 1. Используя Рис. 1 изучить методы определения фаголизабельности выделенных культур. Задание 2. Изучить использование фагов для идентификации выделенных культур микроорганизмов. В основе лежит специфический лизис фагом культуры микроорганизмов. Фагодиффиринцирование бактериальных культур с целью установления их видовой принадлежности проводят методом Отто («стекающей капли») или капельным методом (Рис.2). Для этого исследуемую культуру засевают на плотные питательные среды методом «газоном». Затем наносят специфический фаг капельно, чашку Петри наклоняют так, чтобы капля стекла к противоположному краю чашки. После суточной инкубации в термостате, учитывают стерильные зоны на месте нанесения фага. Задание 3. Определить вид бактериальной культуры, используя метод Отто по демонстрационным посевам, в котором использовался бактериофаг Шигелл Зонне. 1 2 3 Рис.2. Заключение: На чашке с посевом № ……. Стерильная зона. Вывод: культура № ______