Аналитический обзор по разработке и характеристике методов
реклама
Аналитический обзор по разработке и характеристике методов ин витро тестирования для оценки безопасности техногенных наночастиц и содержащей их нанотехнологической продукции. 1.1.1 Введение В последние десятилетия нанотехнологии получили широкое развитие. Сегодня неорганические наночастицы (НЧ) применяются в различных технологических процессах и непосредственно в товарах народного потребления. Например, НЧ оксида цинка (ZnO) используются в солнцезащитных кремах и зубных пастах, а НЧ серебра (Ag) можно найти в пищевых упаковках, дезодорантах и в качестве консерванта в косметической продукции [1-3]. Уникальные особенности и свойства НЧ приводят к широкому их использованию в биомедицинских отраслях. Таким образом, вполне закономерной является растущая озабоченность населения, связанная с потенциальными неблагоприятными последствиями использования НЧ для здоровья человека, что вызывает необходимость оценки безопасности технологических процессов и продуктов, в состав которых входят НЧ [4-7]. Тем не менее, в настоящее время существует лишь очень ограниченное количество нормативных актов и критериев для оценки безопасности использования наноматериалов в промышленности или товарах народного потребления. Основным препятствием на пути к созданию соответствующего законодательства является высокий темп развития нанотехнологий, при котором постоянно расширяется спектр предлагаемых наноматериалов, обладающих индивидуальными физико-химическими свойствами [7] Это законодательство должно охватывать все аспекты нанотехнологий и все существующие НЧ, что чрезвычайно трудно с практической точки зрения. По определению, которое было дано Европейской комиссией, наноматериалы – это природные или изготовленные материалы, содержащие частицы, в свободном состоянии или в виде агломератов, где более 50% частиц имеют внешние размеры в интервале 1-100 нм [8]. Таким образом, нанотехнологии – это совокупность методов и приемов с применением наночастиц или систем, у которых, по крайней мере, один размер ниже 100 nm [9]. Нанотехнологии нашли применение во многих областях науки и производственных процессах. Например, в медицине нанотехнологии используются при разработке систем диагностики, визуализации, лечения и профилактики заболеваний [10]. С одной стороны, благодаря своим размерам НЧ обладают многими уникальными свойствами, с другой стороны, эти размеры часто являются причиной неблагоприятных последствий для здоровья человека [11, 12]. В 2004 году Дональдсон с соавторами отметил важность создания нанотоксикологии - как подкатегории токсикологии - для обеспечения контроля безопасности нанотехнологий [13]. Нанотоксикологией называют исследования взаимодействия между НЧ и биологическими системами с установлением связей, если таковые имеются, между физико-химическими свойствами наночастиц и токсикологическим ответом [14]. Стандартных анализов токсичности, первоначально разработанных для оценки химических веществ, часто недостаточно для определения нанотоксичности, что может быть связано с разными механизмами возникновения токсического эффекта, особенностями поведения НЧ в культуральной среде [15-17]. 1.1.2 Нанотоксикология Общие механизмы нанотоксичности. В то время как большинство химических веществ вызывает повреждение клеток через взаимодействия с конкретными биомолекулами, один тип НЧ может быть токсичным в результате комбинации различных механизмов. НЧ могут индуцировать образование активных форм кислорода, быть генотоксичными, приводить к морфологическим и иммунологическим изменениям в живом организме [14, 18-20]. Высокие уровни токсичности, которые наблюдаются для НЧ, являются следствием таких факторов, как небольшой размер НЧ, позволяющий проникать через внешние и внутренние барьеры организма, большая удельная поверхность (высокое отношение площади поверхности НЧ к объему), высокая реакционная способность поверхности НЧ [11, 21]. Кроме того, большинство НЧ нестабильны в дисперсии, склонны к агрегации и седиментации, что существенно влияет на процесс поглощения НЧ и их токсичность [18,. 22]. Nel с соавторами назвали индукцию активных форм кислорода, как один из основных механизмов возникновения токсичности, вызываемой неорганическими НЧ, причем этот эффект наблюдался как в естественных условиях, так и в опытах in vitro [2325]. Напротив, наночастицы оксида церия (CeO 2 ) не вызывали индукцию активных форм кислорода и даже показали защитный эффект против таких повреждений в естественных условиях, а также in vitro [26, 27]. Продолжительная индукция активных форм кислорода, приводящая к развитию окислительного стресса, может приводить к серьезным последствиям и вызывать денатурацию белка, модуляцию конкретных путей передачи сигнала, воспаление, повреждение митохондриальных мембран и ДНК [11, 28]. НЧ могут быть подвержены деградации в результате окислительного стресса, что приводит к их разрушению, растворению и увеличению реактивности поверхностных групп [18]. Известно, что НЧ могут связывать сывороточные белки на своей поверхности, образуя белковую корону [29-31]. Это, в свою очередь, может инициировать иммунный ответ и приводить к развитию специфической токсичности. Таким образом, при оценке нанотоксичности нужно рассматривать весь комплекс возможных потенциальных эффектов, проводя одновременную оценку целого ряда параметров. Методы тестирования нанотоксичности. Для того, чтобы получить полный токсикологический профиль, токсичность НЧ следует оценивать in vitro и in vivo [32, 33]. Важно отметить, что до начала проведения испытаний на токсичность, НЧ должны быть тщательно охарактеризованы по чистоте (химической и биологической) и физикохимическим свойствам [34]. Для описания этих свойств используются различные подходы. Например, размеры и форму НЧ можно оценивать с помощью просвечивающей электронной микроскопии, атомно-силовой микроскопии и/или динамического светорассеяния. В настоящее время при оценке токсичности широко используются методы, альтернативные классическим тестам на экспериментальных животных – это модели с использованием культур клеток. После публикации книги Russell и Burch широкое распространение получила концепция «3Rs» или концепция усовершенствования, уменьшения и замены (Refinement, Reduction, and Replacement), согласно которой правильная организация эксперимента должна основываться на методах, снижающих стрессовые воздействия и уменьшающих число животных, необходимых для проведения теста, или заменяющих животных моделями, например, клеточными культурами in vitro [35]. Использование клеточных культур позволяет не только решить этические проблемы, связанные с использованием и гибелью лабораторных животных в ходе экспериментов, но и значительно снижает стоимость предварительных исследований токсичности новых материалов. Кроме этого, сокращаются сроки полного цикла токсикологических исследований. Общую схему, которая используется при оценке токсичности во всем мире можно представить в виде следующих этапов. На первом этапе происходит теоретическая оценка активности тестируемого вещества (НЧ) на основании анализа его структуры (QSAR). Такая характеристика может дать информацию о химических и физических свойствах тестируемого вещества, путях его возможного метаболизма и воздействия на клеточном уровне. На следующем этапе токсичность оценивается на in vitro моделях. С помощью клеточных культур определяют цитотоксичность, биосовместимость, генотоксческую активность, видовую специфичность и орган-специфичность тестируемого вещества. Изучение метаболизма и фармакокинетики проводят при ограниченном тестировании на животных. Опыты in vivo позволяют рассматривать эффекты долгосрочного воздействия токсиканта и влияния биологической интеграции на уровне живого организма. In vitro методы. Обычно токсикологические исследования проводятся на классических 2D монокультурах раковых клеток или долгоживущих клеточных линиях, хотя также используют стволовые и первичные клетки. Выбор соответствующего типа клеток, как правило, зависит от изучаемого в естественных условиях органа-мишени. Например, при оценке токсического воздействия на кожу используют такие клеточные линии, как HEK, HDF, HaCaT, MSTO-211H, HSF42; при изучении легких – макрофаги, A549, H1299, NR8383, IMR-90, H596; печени – HepG2, BRL-3A; почек – HEK293, COS-7, COS-1. Кроме этого, для оценки токсического действия используются клеточные линии Hela, K562, RAW264.7, Vero cells, KB cells, фибробласты человека и другие клетки. Возможность работы непосредственно на культурах клеток человека, делает полученные данные более адекватными при оценке воздействия НЧ на организм человека [36]. В большинстве исследований клетки подвергаются инкубации с НЧ от 3 до 48 часов [37, 38]. Индуцированную токсичность оценивают в основном с использованием биохимических аналитических систем (ИФА с различными типами детекции), которые позволяю проводить анализ быстро и в большом количестве проб. Кроме того, возможность автоматизации и быстрая обработка данных делает возможным высокопроизводительный скрининг [39, 40]. Для оценки цитотоксичности существует группа методов, принцип которых заключается в окраске клетки или специфических клеточных компонентов клеточным красителем, антителами с флуоресцентной меткой или введением молекулярных зондов, которые взаимодействуют с конкретным биомолекулами [18, 41]. Одним из таких тестов является тест МТТ. МТТ дифенилтетразолиумбромид), – это который краситель меняет (3(4,5-диметилтиазол-2-yl)-2,5 окраску в результате действия митохондриальных ферментов. Таким образом, интенсивность окраски зависит от степени повреждения митохондрий и служит индикатором цитотоксического действия НЧ. Еще одним тестом на токсичность является измерение активности фермента лактатдегидрогеназы в среде клеточной культуры. Этот фермент локализован в цитоплазме живой клетки и выделяется в инкубационную среду в результате нарушения или разрушения мембран клеток. Общую оценку токсичности дают на основании определения количества выделенного в среду фермента. Данный тест может проводиться в реальном времени и позволяет установить зависимость величины токсического воздействия НЧ от времени экспозиции. Цитотоксичность можно оценивать по образованию отдельной клеткой колоний. Методика заключается в том, что в питательную среду вносят клетки в низкой концентрации, в результате чего отдельные клетки образуют отдельные колонии. Обработку НЧ проводят либо перед внесением клеток в инкубационную среду, либо после образования колоний. Колонии окрашивают красителем и характеризуют количественно и по размеру [42]. Существует группа методов для оценки пролиферативной активности клеток. Они включают в себя гистохимические, иммуногистохимические методы и проточную цитометрию. Гистохимические методы включают в себя прямое наблюдение митоза путем окрашивания ДНК, включение меченного тритием тимидина ([3H] тимидина) и поглощение ДНК аналога бромдезоксиуридина. В более сложных методах оценки токсичности НЧ используются, как уже отмечалось выше, флуоресцентные зонды. Использование таких меток делает тесты очень чувствительными и позволяет оценивать изменения межклеточных параметров, потенциал мембраны, изменения рН. Методы основанные на окраске клеток или введении специальных зондов, позволяют обнаружить эффект с помощью комплексного анализа с использованием разного рода ридеров, проточной цитометрии, микроскопии. Микроскопия является важным инструментом для оценки морфологических особенностей, изменений, возникающих в результате воздействия НЧ. Таким образом, использование культур клеток позволяет установить характер биологической активности изучаемых НЧ непосредственно на клеточном уровне и учесть сложные процессы, происходящие в клетке. Оценку токсичности in vitro проводят не только на культурах клеток, но и на срезах культур высокой точности, которые получают из однородных тканей в стерильных условиях. Такие системы имеют ряд преимуществ по сравнению с культурами однородных клеток. В срезах культур присутствуют все виды клеток исследуемого органа, кроме этого сохраняется система межклеточной коммуникации, которая позволяет дать оценку степени воздействия НЧ на конкретные клетки. Существенным недостатком срезов культур высокой точности является их быстрая дегенерация. Срок жизни таких систем составляет не более 24 часов. In vivo методы. При тестировании острой, субхронической и хронической нанотоксичности in vivo, должна проводиться оценка по следующим параметрам: раздражение кожных покровов и глаз, сенсибилизация, генотоксичность, репродуктивная токсичность, канцерогенность [43]. Способы введения НЧ при тестировании определяются путями попадания НЧ в организм человека и животных в естественных условиях: ингаляционный путь, пероральный путь и контакт с кожей. В ходе всего исследования проводится анализ образцов крови, мочи, фиксируется динамика изменения веса животного, изменения в его поведении, потреблении воды и пищи. Данные должны собираться и в конечных точках (например, при оценки канцерогенности конечная точка – формирование опухоли). Наиболее часто используемый метод при тестировании наночастиц in vivo – это гистопатологическое исследование отдельных органов и тканей, включающее в себя оценку морфологии и окраски анализируемых образцов [43-45]. Проблемы, возникающие в процессе in vitro и in vivo тестирования. Анализ литературных источников показывает наличие противоречий при описании физикохимических свойств НЧ и вызываемых ими токсических эффектов [12, 46-48]. Это может быть связано, прежде всего, с неполной характеристикой НЧ, используемых в in vitro и in vivo тестировании. Практически невозможно получить достоверные выводы о влиянии конкретного физико-химического параметра, поскольку размер, заряд, форма НЧ часто отличаются между исследованиями [49]. Кроме этого не все основные данные о физико-химических характеристиках НЧ бывают предоставлены. Поэтому необходима строгая стандартизация представляемых параметров НЧ (например, состав НЧ, чистота, размер, заряд, площадь поверхности) и методов их характеристики. Второй проблемой при оценке токсического эффекта НЧ, является разный подход к оценке концентрации НЧ. Показано, что при равных концентрациях, выраженных как масса в единице объема, мелкие НЧ могут вызывать более сильные токсические реакции по сравнению с более крупными НЧ той же природы [49]. Известно, что токсикологические реакции зависят от поверхностных свойств НЧ и что площадь поверхности экспоненциально возрастает с уменьшением размера НЧ. Поэтому целый ряд исследователей предлагает выражать концентрацию НЧ, как площадь поверхности НЧ на единицу объема [50]. Таким образом, способ выражения концентрации НЧ также требует стандартизации. Противоречия, возникающие при оценке токсичности НЧ, могут быть следствием использования различных методик для оценки токсичности. Это может касаться времени и условий инкубации образцов с НЧ, используемого диапазона доз. Выбор дозы, которая имитирует воздействие на человека тестируемой НЧ, является непростой задачей, поскольку общая экспозиция включает в себя различные способы воздействия на организм через дыхательную систему, желудочно-кишечный тракт, кожу [33, 51]. Таким образом, необходимо рассматривать каждый случай воздействия индивидуально, что также препятствует адекватному сравнению результатов, полученных в разных лабораториях. Еще одним важным фактором возникновения различий в оценке нанотоксичности является использование различных сред, в которых диспергируются НЧ. Среда может вызвать агрегацию НЧ, что в свою очередь, определяет поведение НЧ в дисперсии, а также в процессах поглощения НЧ и развития токсичности [52, 53]. Подготовка образцов для исследований in vivo также подлежит стандартизации. Здесь может возникать множество специальных вопросов, например, нужно ли повторно диспергировать агломераты НЧ перед введением в среду [54]. Нужно отметить, что использование классических 2D монокультур также имеет ряд недостатков. Монокультуры - статические модели, в которых отсутствует межклеточная коммуникация, в отличие от органов, состоящих из нескольких дифференцированных типов клеток [55]. Этот факт, вероятно, является основной причиной вызывающей расхождения между результатами, полученными при in vitro и in vivo тестировании. Таким образом, вся система оценки токсичности НЧ in vitro и in vivo должна быть оптимизирована и стандартизирована для устранения противоречий при описании физико-химических свойств НЧ и вызываемых ими токсических эффектов. Такая стандартизация должна коснуться методов характеристики НЧ, методов подготовки образцов НЧ и методов проведения самого тестирования. Новые методы тестирования токсичности. Для преодоления перечисленных выше сложностей в оценке токсичности постоянно предпринимаются попытки создания новых методов тестирования. Поскольку НЧ могут вызывать различные эффекты через различные механизмы, был предложен метод многопараметрической оценки токсичности [20, 39]. Этот метод включает оценку целого ряда параметров различными способами и с использованием нескольких типов клеток из разных организмов, что существенно увеличивает эффективность и достоверность оценки токсического эффекта НЧ [56]. В качестве параметров, которые должны быть оценены были выбраны: острая токсичность, индукция активных форм кислорода, морфологические изменения, генотоксичность, деградация НЧ [19, 56]. Метод оценки токсичности in vivo на эмбрионах Данио рерио (Zebrafish) был предложен Hill с соавторами первоначально для определения токсичности химических соединений [57]. В настоящий момент показана возможность использования этой модели для оценки токсичности НЧ золота, серебра и квантовых точек [58-60]. Основные преимущества этой системы заключаются в ее низкой стоимости и удобстве использования. Новые методы исследования генерируют огромное количество данных с высокой скоростью, в результате чего их обработка может стать лимитирующим фактором тестирования. В этой связи интенсивное развитие получают области биоинформатики, которые позволяют автоматизировать анализ данных с высокой скоростью. 1.1.3 Влияние типа клеток на определение токсичности. Исследования in vitro в основном проводятся на клеточных линиях рака или на долгоживущих клеточных линиях, так как они легко доступны, относительно недороги и обладают высокой пролиферативной активностью. Известно, что раковые клетки обладают рядом метаболических особенностей, которые поддерживают их высокую пролиферативную активность [61]. Долгоживущие клеточные линии демонстрируют нестабильный фенотип, изменения в котором могут быть индуцированы в процессе длительного культивирования спонтанно или целенаправленно в процессе иммортализации [62, 63]. Эффект спонтанной иммортализации был показан на эмбриональных фибробластах мышей, когда в уже неделящейся культуре возникала спонтанная точка роста, то есть клетка, дающая начало новому клону. Процесс индуцированной иммортализации клеток осуществляется путем введения в клетки онкогенных ДНК. Трансформация клеток происходит в несколько стадий с низкой частотой, но получаемые таким образом клоны становятся иммортализованными, то есть могут удваиваться неограниченное число раз. Появление методики получения иммортализованных клеток дало развитие созданию клеточных линий различных органов, таких как печень, почки. Исследования нанотоксичности проводят и на первичных клетках, которые изолируют из органа, исследуемого на предмет токсичности. Такие культуры весьма полезны при изучении механизмов воздействия НЧ на клетки конкретных органовмишеней. В таких культурах есть возможность совместного выращивания нескольких видов клеток одного органа, что позволяет оценивать межклеточные взаимодействия, возникающие в результате воздействия НЧ. Потенциальный срок жизни таких культур может колебаться в интервале от нескольких суток до нескольких недель. Влияние типа клеток на потребление и переработку наночастиц. НЧ могут поступать в клетку в результате эндоцитоза, фагоцитоза или пассивной диффузии [64, 65]. Механизм поглощения является очень важным, так как определяет внутриклеточную локализацию НЧ. При поступлении в клетку путем пассивной диффузии НЧ будут находиться непосредственно в цитозоле, в то время как НЧ, поступившие в клетку в результате эндо- или фагоцитоза сохраняются в везикулах, которые могут быть свободно распространены в цитоплазме или локализованы в специфических отделах клетки [65, 66]. Таким образом, механизм поглощения НЧ и их внутриклеточная локализация, определяемые типом используемых клеток, являются важными факторами, от которых зависит окончательный токсический ответ. Авторами работы [67] было показано, что поглощение НЧ золота диаметром 1,9 нм выше в линиях раковых клеток простаты и молочной железы (DU154 и MDA-MB231), чем в долгоживущих клеточных линиях эпителия легких (L132). Diaz с соавторами представили данные по сравнению поглощения пяти различных НЧ в культурах нормальных человеческих моноцитов, лимфоцитов и эритроцитов, мышиных макрофагов и четырех линиях раковых клеток человека: миелоидной клеточной линии моноцитов (U937), T-клеточной линии (Jurkat), B-клеточной линии (HMY) и раковых клеток предстательной железы (PC3) [68]. Моноциты человека демонстрировали высокую скорость фагоцитоза тестируемых частиц, однако макрофаги мыши показали еще более высокий уровень поглощения, сравнимый с поведением раковых клеток линии PC3 [6769]. Barua и Rege наблюдали значительные изменения внутриклеточной локализации квантовых точек в трех фенотипически тесно связанных линиях раковых клеток человека [70]. Таким образом, тип клеток, используемых в опытах in vitro, оказывает существенное влияние на процесс поглощения клеткой НЧ и их внутриклеточное распределение, что определяет, в конечном итоге, уровень нанотоксичности. Влияние типа клеток на токсичность НЧ. Тип используемых клеток оказывает существенное влияние на уровень токсичности. Показано, что первичные клетки и стволовые клетки менее чувствительны к действию НЧ, чем долгоживущие клеточные линии [70]. Hanley c соавторами показали, что две линии Т-клеток лимфомы человека (Jurkat и Хат-78), были соответственно в 28 и 35 раз более чувствительны к воздействию НЧ ZnO, чем первичные Т-клетки человека [71]. Некоторые исследования показывают, что наблюдается повышенная чувствительность к воздействию НЧ у дифференцированных клеток. Это можно объяснить тем, что недифференцированные клетки лучше адаптируются к новым условиям, чем дифференцированные [72, 73]. Реакция различных типов клеток на введение НЧ зависит от физиологических функций клеток. Например, макрофаги и моноциты могут поглощать НЧ в больших количествах путем фагоцитоза, что объясняет более высокие уровни восприимчивости к нанотоксичности [74]. Кроме этого, разные клетки обладают разной пролиферацией и, следовательно, в быстро растущей культуре токсическое действие снижается из-за быстрого увеличения количества клеток и уменьшения концентрации НЧ [75]. Наблюдаемые различия в чувствительности в значительной степени могут быть следствием существующих в конкретной клеточной линии механизмов поглощения НЧ, метаболической клеточной активности и пролиферативной способности клеточной линии. 1.1.4 Влияние агломерации и осаждения НЧ на токсичность. Как уже упоминалось ранее, при оценке токсического действия химических веществ, растворимых в клеточной среде, можно точно указать концентрацию вещества в растворе. С НЧ такая оценка невозможна, поскольку НЧ в дисперсии подвержены не только диффузии, но и процессам седиментации, агломерации и агрегации [52]. Нужно отметить разницу между понятиями агломерации и агрегации: агрегаты формируются посредством ковалентных связей между НЧ и поэтому являются более прочными, чем агломераты, которые образуются за счет сил Ван-дер-Ваальса, гидрофобных взаимодействий или водородных связей [76]. Очевидно, что оценка дозы при определении токсического эффекта НЧ требует моделирования поведения НЧ в дисперсии, с учетом факторов седиментации, агломерации и агрегации [52, 54]. К первой группе параметров, требующих оценки относятся поверхностный заряд, размер и форма НЧ. Было показано, что наностержни и волокна легче образуют агломераты, чем сферы. Мелкие НЧ, как правило, более склонны к агрегации, чем НЧ той же природы, но более крупного размера [77]. К другой группе факторов, влияющих на процессы седиментации, агломерации и агрегации относятся такие параметры, как рН, солевой состав, ионная сила среды [10, 78, 79]. Кроме того, важным фактором является наличие в среде белков, особенно белков сыворотки [78]. Влияние агломерации и осаждения НЧ на поглощение. Образование агломератов НЧ может как увеличивать проникновение НЧ в клетку, так и снижать его [77, 80]. Увеличение поглощения НЧ клеткой при образовании агрегатов можно объяснить тем фактом, что агрегаты быстрее достигают поверхности клетки путем осаждения, чем отдельные НЧ [77]. Степень агломерации и размеры агломератов не только определяют скорость седиментации, но и скорость транспорта НЧ в клетки, а также способ, которым клетки будут обрабатывать полученные НЧ. При этом, увеличение размеров агломератов может препятствовать их поглощению клетками [80]. Таким образом, необходимо оценивать степень агломерации и агрегации в дисперсии НЧ, размеры агломератов, а также механизм клеточного поглощения в тесткультуре. Влияние агломерации и осаждения НЧ на токсичность. Поскольку поглощение НЧ зависит от агломерации и седиментации, то и цитотоксичность НЧ должна зависеть от этих параметров. В ряде работ при тестировании квантовых точек и углеродных нанотрубок показана корреляция между процессами агрегации/осаждения НЧ и увеличением степени повреждения клеток [81]. В других работах представлены данные об уменьшение цитотоксичности агломерированных НЧ, вследствие того, что отдельные НЧ легче проникают в клетку и попадают во внутриклеточные структуры, такие как ядро или митохондрии, являющиеся менее доступными для более крупных частиц [82, 83]. Противоречивость полученных результатов подчеркивает серьезное влияние, которое оказывают процессы седиментации НЧ на оценку токсичности. Поэтому кроме стандартизации методов оценки токсичности и всестороннего анализа компонентов системы, в настоящий момент существует острая необходимость в создании новых модельных систем, в которых можно будет исключить влияние процессов агломерации и седиментации. Новые модельные системы для минимизации эффекта седиментации НЧ. Одной из моделей, в которой минимизирован эффект седиментации является разработка Cho с соавторами, которые предложили «перевернутую клеточную модель» для оценки влияния процесса седиментации на проникновение НЧ золота в клетки. Модель представляет собой ячейку, в которой клетки культивировали в верхней части конструкции на специальной вставке, лицевой стороной вниз. Авторы наблюдали более интенсивное поглощение НЧ клетками при стандартном их расположении, по сравнению с перевернутой конфигурацией. При этом токсичность в этих моделях была на одном уровне [18]. Уменьшить влияние процессов седиментации позволяют микрофлюидные системы. В ряде работ представлены данные об увеличении поглощения НЧ, за счет процессов седиментации, при статическом культивировании по сравнению с экспериментами в динамическом режиме микрофлюидных систем [84, 85]. В работе [86] представлены данные о более высоком уровне токсичности квантовых точек при тестировании в стандартной статической культуре фибробластов по сравнению с динамическим режимом. Нужно отметить, что появление новых модельных систем не только решает уже поставленные ранее методические вопросы, но и ставит перед исследователями новые. Например, использование проточных систем вводит целый ряд дополнительных параметров, по сравнению со стандартными 2D монокультурами, которые нужно учитывать при оценке токсичности НЧ. 1.1.5 Влияние взаимодействия между клетками на токсичность. Одним из недостатков модели монокультуры, который уже упоминался выше, является отсутствие межклеточных взаимодействий между различными типами клеток, которые происходят в органах живого организма в обычных условиях, а также в условиях токсического воздействия [87, 88]. Для того, чтобы максимально приблизить условия проведения опытов in vitro к естественным условиям были предложены модельные системы, в которых проводилось совместное культивирование нескольких типов клеток [89, 90]. Влияние коммуникации между клетками на процесс поглощения НЧ. Известно, что большинство НЧ быстро поглощаются ретикулоэндотелиальной системой после внутривенного введения, поэтому был проведен ряд исследований по оценке механизма поглощения НЧ при совместном культивировании эпителиальных клеток и фагоцитов. Было показано, что самое высокое поглощение НЧ наблюдается у макрофагов, самое низкое – у эпителиальных клеток [91]. Rothen-Rutishauser с соавторами оценивали поглощение НЧ при совместном культивировании клеток А549, макрофагов человека и дендритных клеток человека. Макрофаги человека обладали максимальной поглощающей способностью, что объясняется их высокой фагоцитарной активностью [92]. Наряду с эффектом клеточного фагоцитоза, также был обнаружено, что совместное культивирование клеток может привести к образованию дифференцированных и поляризованных клеток, что препятствует процессу поглощения НЧ [89]. Влияние коммуникации между клетками на токсичность. Неравномерное распределение наночастиц в различных типах клеток при совместном культивировании означает, что доза НЧ не будет одинаковой для компонентов системы. Например, она будет выше в макрофагах и ниже для других типов клеток, по сравнению с тестированием такой же дозы в монокультуре. Одной из популярных моделей для оценки токсичности НЧ является система совместного культивирования клеток альвеолярного эпителия и микрососудистых эндотелиальных клеток. Специальные вставки разделяли эти два типа клеток и только эпителиальные клетки подвергались воздействию НЧ. Эта модель позволяет оценить способность НЧ активировать эндотелиальные клетки через межклеточной коммуникации. С использованием этой модели, было показано, что совместные культуры являются более устойчивыми в опытах по острой токсичности, но при этом в них увеличивается воспалительный ответ на токсическое воздействие [89, 90]. Кроме того, было показано, что состояние, в котором находится клетка, оказывает влияние на нанотоксичность, например, не активированные макрофаги действуют в качестве резервуара для НЧ, таким образом, выполняя защитную функцию, а активированные макрофаги могут стать причиной вторичной токсичности для сопровождающих их в культуре клеток [93, 94]. По данным van Berlo с соавторами сочетание типов клеток, используемых в совместном культивировании может усиливать или ослаблять токсический эффект НЧ. Так, например, макрофаги могут защитить эпителиальные клетки от окислительного повреждения ДНК, тогда как нейтрофилы обостряют этот эффект [95]. Таким образом, клетки по-разному реагируют на воздействие НЧ в монокультуре или при совместном культивировании с другими клетками. Установлено, что при совместном культивировании клетки более устойчивы в опытах по острой токсичности, но показывают значительное увеличение уровня цитокинов, что свидетельствует о воспалительном или иммунном ответе. Наблюдаемые эффекты зависят от комбинации клеточных типов, которые культивировали совместно, и могут быть изменены при внесении в систему дополнительного типа клеток. Кроме того, эпителиальные клетки способны активировать эндотелиальные клетки через межклеточную коммуникацию после воздействия НЧ, а активированные макрофаги могут стать причиной вторичной токсичности. Очевидно, что использование совместного культивирования разных типов клеток может быть очень полезным при экстраполяции полученных in vitro данных на живой организм. 1.1.6 Влияние пространственной организации культуры на токсичность. При проведении опытов на клеточных культурах неизбежно происходит потеря пространственной архитектуры, которая присуща клеткам в структуре органов и тканей. Для максимального приближения опытов in vitro к тестированию токсичности на живых организмах были предложены модельные системы, обладающие пространственной организацией или 3D-культуры. В таких системах клетки плотно упакованы в 3Dструктуру, что оказывает существенное влияние на клеточный фенотип и функции, следовательно, и на токсический эффект НЧ [96]. Еще одним достоинством таких систем является более продолжительное, по сравнению с монокультурами, время жизни, что позволяет оценивать токсический эффект воздействия НЧ в течении долгого времени культивирования [97]. Разработаны 3D-культуры, в которых многоклеточные модели имеют сферическую форму и имитируют опухоли. Другие модели строятся на основе каркасов, в качестве которых используют природные или синтетические гидрогели [98]. Однако, такие модели имеют свои недостатки: каркасы могут препятствовать проникновению НЧ в клетки и искажают результаты токсикологических исследований. Влияние 3D-среды на поглощение НЧ. По сравнению с классическими монокультурами, где НЧ равномерно распределены, 3D-культуры показывают неравномерное распределение НЧ [99]. Это выражается в том, что НЧ распределяются в периферических слоях сферических 3D-систем, и поглощение НЧ такими культурами в целом ниже, чем у обычных монокультур. Huang с соавторами сравнивали поглощение НЧ золота разного диаметра (2, 6 и 15 нм) монокультурой, 3D-культурой и опухолью in vivo. Было показано, что в 3D-культуре и опухоли in vivo НЧ диаметром 2 и 6 нм проникают в более глубокие области клеточной массы, а НЧ диаметром 15 нм были обнаружены только в периферических областях. В культуре, которая представляла собой монослой, НЧ всех размеров были распределены равномерно [100]. Влияние 3D-среды на токсичность НЧ. При сравнении действия НЧ на 2D и 3D культурах было показано, что токсический эффект значительно ниже (от 5 до 20 раз) в моделях сфероида, чем в классической монокультуре [96, 99]. Lee с соавторами показали, что токсическое воздействие НЧ золота и квантовых точек (CdTe) на 2D-культуру сильнее, чем на 3D. Количество мертвых клеток в 3D-культуре было значительно меньше и расположены они были в периферических зонах сферы [101]. Таким образом, культивирование в условиях 3D-культуры оказывает существенное влияние на фенотип и функции клеток. В результате чего клетки реагируют на токсическое воздействие НЧ по-разному, токсический эффект для таких культур в основном ниже и ограничивается наружными слоями 3D-культуры. Несмотря на свою сложность и большое число факторов, оказывающих влияние на оценку токсичности, такие модели обладают большим предсказательным потенциалом, по сравнению с обычными монокультурами. Предпринимаемые в последние десятилетия усилия по оптимизации методов in vitro направлены на создание новых систем, позволяющих максимально приблизить процессы, происходящие в пробирке к естественным условиям живого организма. Необходимость постоянного совершенствования методов in vitro тестирования НЧ определяется высокой скоростью развития современных нанотехнологий, которые постоянно представляют все новые объекты для оценки токсичности. Рассмотренные в обзоре модели обладают разной степенью приближенности к условиям живого организма. При переходе от простых монокультур к проточным системам, системам со-культивирования и 3D-культурам, одновременно с увеличением достоверности прогнозирования по отношению к живому организму, происходит увеличение сложности системы. Появляется целый ряд новых факторов, требующих учета при оценке токсичности испытуемых НЧ. Тем не менее, использование таких моделей позволяет получать более достоверные прогнозы токсичности использования НЧ в условиях живого организма. Список литературы к Главе 1.1: 1. R. A. McIntyre, Sci. Prog., 2012, 95, 1–22. 2. H. Bouwmeester, S. Dekkers, M. Y. Noordam, W. I. Hagens, A. S. Bulder, C. de Heer, S. E. C. G. ten Voorde, S. W. P. Wijnhoven, H. J. P. Marvin and A. J. A. M. Sips, Regul. Toxicol. Pharmacol., 2009, 53, 52–62. 3. T. Thomas, K. Thomas, N. Sadrieh, N. Savage, P. Adair and R. Bronaugh, Toxicol. Sci., 2006, 91, 14–19. 4. A. M. Schrand, L. Dai, J. J. Schlager and S. M. Hussain, Adv. Exp. Med. Biol., 2012, 745, 58–75. 5. A. D. Maynard, Ann. Occup. Hyg., 2007, 51, 1–12. 6. A. D. Maynard, D. B. Warheit and M. A. Philbert, Toxicol. Sci., 2011, 120(suppl 1), S109–S129. 7. C. Som, B. Nowack, H. F. Krug and P. Wick, Acc. Chem. Res., 2013, 46, 863–872. 8. EU, ed. European Commission, Official Journal of the European Union, Brussels, 2011, vol. 2011/696/EU. 9. E. M. Vincent. M. Hoyt, J. Chem. Health Saf., 2008, 15, 10–15. 10. F. Joris, B.B. Manshian, K. Peynshaer, S.C. De Smedt, K. Braeckmans, S.J. Soenen, Chem. Soc. Rev., 2013, 42, 8339-8359. 11. A. Nel, T. Xia, L. Madler and N. Li, Science, 2006, 311, 622–627. 12. S. M. Hussain, L. K. Braydich-Stolle, A. M. Schrand, R. C. Murdock, K. O. Yu, D. M. Mattie, J. J. Schlager and M. Terrones, Adv. Mater., 2009, 21, 1549–1559. 13. K. Donaldson, V. Stone, C. L. Tran, W. Kreyling and P. J. A. Borm, Occup. Environ. Med., 2004, 61, 727–728. 14. H. C. Fischer and W. C. W. Chan, Curr. Opin. Biotechnol., 2007, 18, 565–571. 15. A. Kroll, M. H. Pillukat, D. Hahn and J. Schnekenburger, Arch. Toxicol., 2012, 86, 1123–1136. 16. N. A. Monteiro-Riviere, A. O. Inman and L. W. Zhang, Toxicol. Appl. Pharmacol., 2009, 234, 222–235. 17. Z. Magdolenova, Y. Lorenzo, A. Collins and M. Dusinska, J. Toxicol. Environ. Health, Part A, 2012, 75, 800–806. 18. E. C. Cho, Q. Zhang and Y. Xia, Nat. Nanotechnol., 2011, 6, 385–391. 19. S. J. Soenen, P. Rivera-Gil, J. M. Montenegro, W. J. Parak, S. C. De Smedt and K. Braeckmans, Nano Today, 2011, 6, 446–465. 20. S. George, S. Pokhrel, T. Xia, B. Gilbert, Z. Ji, M. Schowalter, A. Rosenauer, R. Damoiseaux, K. A. Bradley, L. Madler and A. E. Nel, ACS Nano, 2010, 4, 15–29. 21. R. Duffin, L. Tran, D. Brown, V. Stone, K. Donaldson, Inhalation Toxicol., 2007, 19, 849–856. 22. Z. E. Allouni, M. R. Cimpan, P. J. Hol, T. Skodvin and N. R. Gjerdet, Colloids Surf., B, 2009, 68, 83–87. 23. A. Nel, T. Xia, L. Madler and N. Li, Science, 2006, 311, 622–627. 24. G. Oberdorster, E. Oberdorster, J. Oberdorster, Environ. Health Perspect., 2005, 113, 823–839. 25. S. J. Soenen, M. De Cuyper, S. C. De Smedt and K. Braeckmans, Methods Enzymol., 2012, 509, 195–224. 26. J. Niu, A. Azfer, L. M. Rogers, X.Wang and P. E. Kolattukudy, Cardiovasc. Res., 2007, 73, 549–559. 27. F. Pagliari, C. Mandoli, G. Forte, E. Magnani, S. Pagliari, G. Nardone, S. Licoccia, M. Minieri, P. Di Nardo and E. Traversa, ACS Nano, 2012, 6, 3767–3775. 28. F.Marano, S. Hussain, F. Rodrigues-Lima, A. Baeza-Squiban and S. Boland, Arch. Toxicol., 2011, 85, 733–741. 29. I. Lynch, A. Salvati and K. A. Dawson, Nat. Nanotechnol., 2009, 4, 546–547. 30. M. Mahmoudi, S. Laurent, M.A. Shokrgozar, M. Hosseinkhani, ACS Nano, 2011, 5, 7263–7276. 31. S. Laurent, C. Burtea, C. Thirifays, U. O. Hafeli and M. Mahmoudi, PLoS One, 2012, 7, e29997. 32. K. Donaldson, P. J. Borm, V. Castranova and M. Gulumian, Part. Fibre Toxicol., 2009, 6, 13. 33. G. Oberdorster, A. Maynard, K. Donaldson, V. Castranova, J. Fitzpatrick, K. Ausman, J. Carter, B. Karn, W. Kreyling, D. Lai, S. Olin, N. Monteiro-Riviere, D. Warheit and H. Yang, Part. Fibre Toxicol., 2005, 2, 8. 34. C. M. Sayes and D. B. Warheit, Wiley Interdiscip. Rev.: Nanomed. Nanobiotechnol., 2009, 1, 660–670. 35. W.M.S Russell, R.L. Burch. London, UK: Methuen & Co. Ltd., 1959. 36. C. F. Jones and D. W. Grainger, Adv. Drug Delivery Rev., 2009, 61, 438–456. 37. S. J. Kang, B. M. Kim, Y. J. Lee and H. W. Chung, Environ. Mol. Mutagen., 2008, 49, 399–405. 38. W. Lin, Y. W. Huang, X. D. Zhou and Y. Ma, Toxicol. Appl. Pharmacol., 2006, 217, 252–259. 39. A. Nel, T. Xia, H. Meng, X.Wang, S. Lin, Z. Ji, H. Zhang, Acc. Chem. Res., 2013, 46, 607–621. 40. D. Y. Lai, Wiley Interdiscip. Rev.: Nanomed. Nanobiotechnol., 2012, 4, 1–15. 41. P. Carol, S. Sreejith and A. Ajayaghosh, Chem.–Asian J., 2007, 2, 338–348. 42. J.M. Hillegass, A. Shukla, S.A. Lathrop, M.B. Macpherson, N.K. Fukagawa, B.T. Mossman, Wiley Interdiscip. Rev. Nanomed Nanobiotechnol., 2010, 2, 219-231. 43. OECD, Preliminary Review of OECD Test Guidelines for their Applicability to Manufactured Nanomaterials, Organisation for Economic Co-operation and Development, 2009. 44. OECD, In Vitro Skin Irritation: Reconstructed Human Epidermis Test Method, OECD TG 439, 2010. 45. OECD, Acute Eye Irritation/Corrosion, OECD TG 405, 2002. 46. N. Lewinski, V. Colvin and R. Drezek, Small, 2008, 4, 26–49. 47. V. Kumar, A. Kumari, P. Guleria and S. K. Yadav, Rev. Environ. Contam. Toxicol., 2012, 215, 39–121. 48. M. J. Clift and V. Stone, Theranostics, 2012, 2, 668–680. 49. P. Rivera-Gil, D. Jimenez De Aberasturi, V. Wulf, B. Pelaz, P. Del Pino, Y. Zhao, J.M. De La Fuente, I. Ruiz De Larramendi, T. Rojo, X. J. Liang and W. J. Parak, Acc. Chem. Res., 2013, 46, 743–749. 50. E. K. Rushton, J. Jiang, S. S. Leonard, S. Eberly, V. Castranova, P. Biswas, A. Elder, X. Han, R. Gelein, J. Finkelstein and G. Oberdorster, J. Toxicol. Environ. Health, Part A, 2010, 73, 445–461. 51. H. F. Krug and P. Wick, Angew. Chem., Int. Ed., 2011, 50, 1260–1278. 52. J. G. Teeguarden, P. M. Hinderliter, G. Orr, B. D. Thrall and J. G. Pounds, Toxicol. Sci., 2007, 95, 300–312. 53. M. Horie, K. Nishio, K. Fujita, H. Kato, S. Endoh, M. Suzuki, A. Nakamura, A. Miyauchi, S. Kinugasa, K. Yamamoto, H. Iwahashi, H. Murayama, E. Niki and Y. Yoshida, Toxicol. In Vitro, 2010, 24, 1629–1638. 54. P. M. Hinderliter, K. R. Minard, G. Orr, W. B. Chrisler, B. D. Thrall, J. G. Pounds and J. G. Teeguarden, Part. Fibre Toxicol., 2010, 7, 36. 55. R. E. Unger, S. Halstenberg, A. Sartoris and C. J. Kirkpatrick, Methods Mol. Biol., 2011, 695, 229–241. 56. A. Astashkina, B. Mann and D. W. Grainger, Pharmacol. Ther., 2012, 134, 82–106. 57. A. J. Hill, H. Teraoka, W. Heideman and R. E. Peterson, Toxicol. Sci., 2005, 86, 6– 19. 58. C. Y. Usenko, S. L. Harper and R. L. Tanguay, Carbon, 2007, 45, 1891–1898. 59. O. Bar-Ilan, R. M. Albrecht, V. E. Fako and D. Y. Furgeson, Small, 2009, 5, 1897– 1910. 60. T. C. King-Heiden, P. N. Wiecinski, A. N. Mangham, K. M. Metz, D. Nesbit, J. A. Pedersen, R. J. Hamers, W. Heideman and R. E. Peterson, Environ. Sci. Technol., 2009, 43, 1605–1611. 61. J. Wang, X. Fang and W. Liang, ACS Nano, 2012, 6, 5018–5030. 62. C. Albrecht, A. M. Scherbart, D. van Berlo, C.M. Braunbarth, R. P. Schins and J. Scheel, Toxicol. In Vitro, 2009, 23, 520–530. 63. L. Bregoli, F. Chiarini, A. Gambarelli, G. Sighinolfi, A. M. Gatti, P. Santi, A. M. Martelli and L. Cocco, Toxicology, 2009, 262, 121–129. 64. F. Zhao, Y. Zhao, Y. Liu, X. L. Chang, C. Y. Chen and Y. L. Zhao, Small, 2011, 7, 1322–1337. 65. T. T. Wang, J. Bai, X. Jiang and G. U. Nienhaus, ACS Nano, 2012, 6, 1251–1259. 66. C. Schweiger,R.Hartmann, F. Zhang,W. J. Parak, T. H. Kissel and P. Rivera Gil, J. Nanobiotechnol., 2012, 10, 28. 67. J. A. Coulter, S. Jain, K. T. Butterworth, L. E. Taggart, G. R. Dickson, S. J. McMahon, W. B. Hyland, M. F. Muir, C. Trainor, A. R. Hounsell, J. M. O’Sullivan, G. Schettino, F. J. Currell, D. G. Hirst and K. M. Prise, Int. J. Nanomed., 2012, 7, 2673–2685. 68. B. Diaz, C. Sanchez-Espinel, M. Arruebo, J. Faro, E. deMiguel, S. Magadan, C. Yague, R. Fernandez-Pacheco, M.R. Ibarra, J. Santamaria, A.Gonzalez-Fernandez, Small, 2008, 4, 2025–2034. 69. I. Sur, D. Cam, M. Kahraman, A. Baysal and M. Culha, Nanotechnology, 2010, 21, 175104. 70. S. Barua and K. Rege, Small, 2009, 5, 370–376. 71. C. Hanley, J. Layne, A. Punnoose, K. M. Reddy, I. Coombs, A. Coombs, K. Feris and D. Wingett, Nanotechnology, 2008, 19, 295103. 72. H. Zhang, T. Xia, H. Meng, M. Xue, S. George, Z. Ji, X. Wang, R. Liu, M. Wang, B. France, R. Rallo, R. Damoiseaux, Y. Cohen, K. A. Bradley, J. I. Zink and A. E. Nel, ACS Nano, 2011, 5, 2756–2769. 73. E. Jan, S. J. Byrne, M. Cuddihy, A. M. Davies, Y. Volkov, Y. K. Gun’ko and N. A. Kotov, ACS Nano, 2008, 2, 928–938. 74. S. K. Sohaebuddin, P. T. Thevenot, D. Baker, J. W. Eaton and L. P. Tang, Part. Fibre Toxicol., 2010, 7, 22. 75. J. S. Chang, K. L. Chang, D. F. Hwang and Z. L. Kong, Environ. Sci. Technol., 2007, 41, 2064–2068. 76. I. Gosens, J. A. Post, L. J. J. de la Fonteyne, E. H. J. M. Jansen, J. W. Geus, F. R. Cassee and W. H. de Jong, Part. Fibre Toxicol., 2010, 7, 37. 77. L. K. Limbach, Y. C. Li, R. N. Grass, T. J. Brunner, M. A. Hintermann, M. Muller, D. Gunther and W. J. Stark, Environ. Sci. Technol., 2005, 39, 9370–9376. 78. A. Albanese and W. C. W. Chan, ACS Nano, 2011, 5, 5478–5489. 79. L. V. Stebounova, E. Guio and V. H. Grassian, J. Nanopart. Res., 2011, 13, 233–244. 80. D. Drescher, G. Orts-Gil, G. Laube, K. Natte, R. W. Veh, W. Osterle and J. Kneipp, Anal. Bioanal. Chem., 2011, 400, 1367–1373. 81. P. Wick, P.Manser, L. K. Limbach, U. Dettlaff-Weglikowska, F. Krumeich, S. Roth, W. J. Stark and A. Bruinink, Toxicol. Lett., 2007, 168, 121–131. 82. J. M. Zook, R. I. MacCuspie, L. E. Locascio, M. D. Halter and J. T. Elliott, Nanotoxicology, 2011, 5, 517–530. 83. E. Bae, H. J. Park, J. Lee, Y. Kim, J. Yoon, K. Park, K. Choi and J. Yi, Environ. Toxicol. Chem., 2010, 29, 2154–2160. 84. T. Bhowmick, E. Berk, X. Cui, V. R. Muzykantov and S. Muro, J. Controlled Release, 2012, 157, 485–492. 85. A. Lin, A. Sabnis, S. Kona, S. Nattama, H. Patel, J. F. Dong and K. T. Nguyen, J. Biomed. Mater. Res., Part A, 2010, 93A, 833–842. 86. S. K. Mahto, T. H. Yoon and S. W. Rhee, Biomicrofluidics, 2010, 4, 034111. 87. K. Savolainen, H. Alenius, H. Norppa, L. Pylkkanen, T. Tuomi and G. Kasper, Toxicology, 2010, 269, 92–104. 88. C. M. Sayes, K. L. Reed, S. Subramoney, L. Abrams and D. B. Warheit, J. Nanopart. Res., 2009, 11, 421–431. 89. J. Kasper, M. I. Hermanns, C. Bantz, S. Utech, O. Koshkina, M. Maskos, C. Brochhausen, C. Pohl, S. Fuchs, R. E. Unger, C. James Kirkpatrick, Eur. J. Pharm. Biopharm., 2013, 84, 275–287. 90. J. Kasper, M. I. Hermanns, C. Bantz, M. Maskos, R. Stauber, C. Pohl, R. E. Unger and J. C. Kirkpatrick, Part. Fibre Toxicol., 2011, 8, 6. 91. J. Pinkernelle, P. Calatayud, G. F. Goya, H. Fansa, G. Keilhoff, BMC Neurosci., 2012, 13, 32. 92. B. Rothen-Rutishauser, C. Muhlfeld, F. Blank, C. Muss, P.Gehr, Part. Fibre Toxicol., 2007, 4, 9. 93. C. E. Soma, C. Dubernet, G. Barratt, S. Benita and P. Couvreur, J. Controlled Release, 2000, 68, 283–289. 94. K. M. Al-Hallak, S. Azarmi, A. Anwar-Mohamed, W. H. Roa and R. Lobenberg, Eur. J. Pharm. Biopharm., 2010, 76, 112–119. 95. D. van Berlo, A. Wessels, A. W. Boots, V. Wilhelmi, A. M. Scherbart, K. Gerloff, F. J. van Schooten, C. Albrecht and R. P. Schins, Free Radicals Biol. Med., 2010, 49, 1685–1693. 96. C. Godugu, A. R. Patel, U. Desai, T. Andey, A. Sams and M. Singh, PLoS One, 2013, 8, 53708. 97. S. Hackenberg, F. Z. Zimmermann, A. Scherzed, G. Friehs, K. Froelich, C. Ginzkey, C. Koehler, M. Burghartz, R. Hagen and N. Kleinsasser, Environ. Mol. Mutagen., 2011, 52, 582–589. 98. A. Nyga, U. Cheema and M. Loizidou, Cell Commun. Signaling, 2011, 5, 239–248. 99. M. Mitra, C. Mohanty, A. Harilal, U. K. Maheswari, S. K. Sahoo and S. Krishnakumar, Mol. Vision, 2012, 18, 1361–1378. 100. K. Huang, H. Ma, J. Liu, S. Huo, A. Kumar, T. Wei, X. Zhang, S. Jin, Y. Gan, P. C. Wang, S. He, X. Zhang and X. J. Liang, ACS Nano, 2012, 6, 4483–4493. 101. J. Lee, G. D. Lilly, R. C. Doty, P. Podsiadlo and N. A. Kotov, Small, 2009, 5, 1213– 1221.
