Молочное брожение. Маслянокислое брожение

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РФ
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ
ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ
ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ
«НИЖЕГОРОДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ТЕХНИЧЕСКИЙ
УНИВЕРСИТЕТ имени Р.Е. Алексеева»
Кафедра «Нанотехнологии и биотехнологии»
МОЛОЧНОЕ БРОЖЕНИЕ.
МАСЛЯНОКИСЛОЕ БРОЖЕНИЕ
Методические указания к лабораторным занятиям
по дисциплине «Основы биотехнологии»
для студентов, обучающихся по направлению
«Биотехнология» дневной формы обучения
Нижний Новгород 2014
Составители: О.В. Кузина
УДК 576(076.5)
Молочное брожение. Маслянокислое брожение. Методические указания к
лабораторным занятиям по дисциплине «Основы биотехнологии» для
студентов, обучающихся по направлению «Биотехнология» дневной формы
обучения / НГТУ; Сост.: О.В. Кузина.– Н. Новгород, 2014.– 9 с.
Методические указания предназначены для проведения лабораторного
практикума по дисциплине «Основы биотехнологии».
Представленная теоретическая и прикладная часть к лабораторным
работам по теме «Брожение».
Редактор Э.Б. Абросимова
Подписано в печать
Печать офсетная. Усл. п. л.
. Формат 60801/16. Бумага газетная.
. Уч.-изд. л. . Тираж 80 экз. Заказ
.
Нижегородский государственный технический университет им. Р.Е. Алексеева.
Типография НГТУ. 603950, г. Нижний Новгород, ул. Минина, 24.
Нижегородский государственный технический
университет им. Р.Е. Алексеева, 2014
ЗАНЯТИЕ 8
Молочное брожение и его возбудители.
Теория вопроса
Молочнокислое брожение лежит в основе силосования, квашения
овощей, приготовления молочнокислых продуктов и сыра. Кислый вкус
ржаного хлеба определяется молочной кислотой, образующейся при
брожении.
Молочнокислое брожение вызывается группой молочнокислых
бактерий, которая очень разнообразна и широко распространена в природе.
Они имеют много общих признаков: образуют молочную кислоту,
грамположительные, спор не образуют, неподвижны, по форме кокки или
палочки; требовательны к источникам азота и ростовым веществам, не
образуют фермент каталазу, который расщепляет перекись водорода на воду
и кислород.
Молочнокислые бактерии можно разделить на две группы:
1)
гомоферментативные (типичные), образующие из сахара только
молочную кислоту по уравнению
C6H12O6 → СH3CHOHCOOH + 77,9 кДж
2)
гетероферментативные (нетипичные), которые на ряду с
молочной кислотой образуют значительное количество побочных продуктов:
C6H12O6 → СH3CHOHCOOH + СH3COOH + СH2OHCHOHCH2OH + C2H5OH + CO2
молочная
кислота
уксусная
кислота
глицерин
этиловый
спирт
Кроме этих продуктов, нередко образуются ароматические вещества,
придающие аромат кисломолочным продуктам и сливочному маслу.
В качестве источника углерода все молочнокислые бактерии используют
моно- и дисахариды. Из моносахаридов лучше используют гексозы. Из
дисахаридов – бактерии, развивающиеся на растениях, лучше сбраживают
мальтозу, а в молоке – лактозу.
Молочнокислые бактерии требовательны к источникам азота. Они
усваивают органические формы азота. Большинство их используют белки, но
лучше – пептоны, полипептиды, смесь аминокислот. Минеральные формы
азота эти бактерии не используют.
Молочнокислые бактерии относятся в основном к двум родам:
Streptococcus u Lactobacterium.
К роду Streptococcus относятся микроорганизмы, имеющие в молодых
культурах форму стрептококка. Типичным представителем этого рода
является Streptococcus lactis, накапливающий 0.8-1% молочной кислоты и
вызывающий естественное скисание молока в зоне умеренного климата
(рис.1). Оптимальная температура для него 30-35°C.
а
б
в
г
д
Рис. 1 Форма клеток молочнокислых бактерий молока:
а – стрептококк молочный (Streptococcus lactis), б – стрептококк
сливочный (Streptococcus cremores), в – сырная палочка (Termobacterium
helveticum),
г – болгарская палочка (Lactobacterium bulgaricum), д –
молочная плесень (Oidium lactis)
Род объединяет микроорганизмы, имеющие палочковидную форму. К
нему относится Lactobacterium bulgaricum – болгарская палочка, имеющая
довольно большие размеры. Она накапливает до 3% молочной кислоты.
Оптимальная температура для болгарской палочки 40°C. Близки к ней по
форме Lactobacterium acidophilum (ацидофильная палочка). Ацидофильная
палочка легко приживается в кишечнике человека и животных, имеет
оптимальную температуру 37°C.
При квашении овощей и силосования развиваются мелкие палочки
Lactobacterium plantarum.
На поверхности постаявшего прокислого молока появляется бархатистая
пленка, в которой обнаруживается молочная плесень (Oidium lactis). Клетки
этой плесени имеют четырехугольную или овальную форму и значительно
крупнее бактерий Oidium lactis не образуют молочную кислоту, а окисляет ее
до углекислоты и воды.
Постановка опыта молочнокислого брожения
Свежее молоко разливают по колбочкам приблизительно по 40—50
мл, закрывают ватными пробками и ставят в термостат с температурой
30—35°С. Параллельно закладывают второй вариант опыта: колбы с
молоком, закрытые ватными пробками, кипятят и после кипячения ставят в
термостат.
Через 10—12 ч свежее (некипяченое) молоко окисает. В молоке
образуется ровный плотный сгусток, который получается вследствие того,
что молочная кислота реагирует с казеинатом кальция и казеин выпадает в
осадок.
В кипяченом молоке молочнокислые бактерии погибают, но остаются
споры маслянокислых бактерий.
В термостате они прорастают и
осуществляют маслянокислое брожение. Масляная кислота также
реагирует с казеинатом кальция и казеин выпадает в осадок. В
дальнейшем он подвергается пептгонизации, сгусток превращается в
кремовую жидкость с неприятным прогорклым запахом масляной кислоты.
Качественная реакция на молочную кислоту
(реакция с фенолом)
Отфильтровывают немного молока в пробирку. Полученный фильтрат
прибавляют к реактиву, состоящему из смеси 5%-го раствора карболовой
кислоты и хлорного железа (1:2), разбавленной двойным количеством
воды. При этом аметисто-синий цвет реактива обычно переходит в
соломенно-желтый за счет образования молочнокислого железа.
Приготовление препаратов молочнокислых бактерий.
Микроскопическое исследование молочнокислых продуктов и силоса
Для микроскопических наблюдений над молочнокислыми бактериями
готовят препарат из прокисшего молока. Бактериологическую петлю вводят
в сгусток и, повернув вокруг оси, извлекают, прикасаясь ею и к пленке.
Сгусток размазывают на предметном стекле очень тонким слоем без воды.
Сушат на воздухе. Фиксируют смесью спирта с эфиром (1 : 1), несколько
раз нанося смесь на мазок и сливая ее. При этом бактерии погибают и
прикрепляются к стеклу, а жир из препарата вымывается. Это необходимо,
так как капли жира на препарате мешают окраске и микроскопированию.
После фиксации препарат окрашивают метиленовой синью в течение
5 минут, промывают водой, подсушивают фильтровальной бумагой и
микроскопируют с иммерсией. При этом обычно обнаруживаются цепочки
бактерий Str. lactis и длинные клетки болгарской палочки. Можно также
встретить крупные клетки молочной плесени (Oidium lactis).
Для знакомства с микрофлорой силоса из него готовят препарат
следующим образом. Берут пинцетом силос и плотно прижимают его к
предметному стеклу без добавления воды. На стекле остается отпечаток.
Препарат сушат на воздухе, фиксируют на пламени горелки и
окрашивают метиленовой синью (2—3 мин.). Мазок промывают,
высушивают и микроскопируют с иммерсией. На препарате выявляются
тонкие неспороносные палочки и молочнокислые стрептококки. Обычно
преобладают Lactob. plantarum. Короткие палочки, часто располагающиеся
параллельными рядами. Иногда встречаются клетки почкующихся
дрожжей. В силосе низкого качества обнаруживаются бациллы и
плесневые грибы.
Контpольные вопросы
1. Общая характеристика молочнокислых бактерий. Назвать основных
представителей.
2. Распространение молочнокислых бактерий.
3. Основные группы молочнокислых бактерий.
4. Гомоферментативное и гетероферментативное брожение. Написать
суммарные уравнения.
5. Какие источники углерода
и азота
используют молочнокислые
бактерии?
6. Как поставить опыт по молочнокислому брожению?
7. Как приготовить препарат из кислого молока и силоса?
Материалы и оборудование: свежее молоко, колбы емкостью 100 мл,
пипетки на 5 и 10 мл, микроскопы, метиленовая синь, спирт, эфир, воронки,
раствор фенола с хлорным железом (1:2), силос.
ЗАНЯТИЕ 9
Маслянокислое брожение и его возбудители.
Теория вопроса
Возбудители маслянокислого брожения — строгие анаэробы,
подвижные палочки с клостридиальным или плектридиальным типом
спорообразования, относятся к роду Clostridium.
В зависимости от количества образующихся конечных продуктов
маслянокислое брожение подразделяется на: 1) собственно маслянокислое
брожение (брожение глюкозы, крахмала); 2) ацетонобутиловое брожение;
3) брожение пектиновых веществ.
Маслянокислые бактерии широко распространены в природе (до 90 %
почвенных образцов, как правило, содержат эти бактерии), навозе,
загрязненных водоемах, на разлагающихся растительных остатках, в
молоке, на поверхности растений и т. д.
Собственно маслянокислое брожение осуществляется по уравнению:
С6Н12О6  С Н3СН2 СО ОН + 2СО2 + 2H2 + 86,6 кД ж.
Кроме масляной кислоты, в процессе брожения в заметных количествах
образуется уксусная кислота, а при смещении реакции в кислую сторону
(до рН 5,5) —в больших количествах бутиловый спирт и ацетон.
В качестве источника углерода маслянокислые бактерии могут
использовать моно- и дисахариды, молочную и пировиноградную кислоты,
маннит, глицерин, некоторые полисахариды (декстрин, крахмал) и ряд
других соединений. Источниками азота служат весьма разнообразные
вещества — белки, пептоны, аминокислоты, аммиачные соединения и даже
молекулярный азот.
Типичными представителями маслянокислых бактерий являются:
Clostridium butyricum, Cl. pasteurianum, Cl. felsineum (рис. 2). В молодой
культуре подвижные, крупные палочки, имеют размеры около 10 мкм х
0,5—1 мкм. При старении подвижность теряется и ближе к одному из концов
образуется крупная спора. При сбраживании углеводов образуют большое
количество масляной кислоты.
а
б
в
Рис. 2. Форма клеток маслянокислых и гнилостных бактерий:
а – маслянокислые бактерии рода клостридиум, клетка со жгутиками
(вегетативная), клетки со спорами (клостридии), б – клетки бактериум
флуоресценс (Bacterium fluorescens), в – клетки бациллус путрификум
(Bacillus putrificum).
Cl. pasteurianum. В молодой культуре бактерии имеют вид прямых
палочек с закругленными концами. Размеры палочек — 2,5—2,7 мкм х
0,5—1 мкм. Клетки подвижные, располагаются одиночно или парами. При
старении, от образующейся споры, палочки приобретают форму сигары или
веретена с одним более острым концом.
Cl. felsineum. В молодой культуре палочки имеют размеры 2—5 мкм
х 1 мкм. При спорообразовании бактерии принимают грушевидную форму. В
протоплазме клеток накапливается большое количество гранулезы. Активно
разлагают пектин с образованием масляной кислоты.
В природе маслянокислое брожение имеет большое значение как
звено в цепи превращений соединений углерода. Масляная кислота в
небольших концентрациях является физиологическим стимулятором роста
растений. В то же время маслянокислые бактерии могут наносить
значительный ущерб, вызывая вспучивание сыров, прогоркание молока,
порчу консервов, силоса, овощей, картофеля и др. продуктов.
Постановка опыта маслянокислого брожения
Для изучения маслянокислого брожения ставят опыт на среде с
картофелем. Для этого на дно высокой пробирки вносят немного мела (для
нейтрализации масляной кислоты), а затем мелко изрезанный сырой,
немытый и неочищенный картофель, им заполняют 1/3 пробирки; до 2/3
объема пробирки добавляют водопроводную воду. Пробирку ставят на
водяную баню для пастеризации (80°С— 10 мин), а затем — в термостат с
температурой 30—35 °С.
Через 2—3 дня в пробирках развивается маслянокислое брожение:
картофель всплывает наверх, на поверхности среды появляются пузырьки
газа и образуется пена, в жидкости накапливается большое количество
маслянокислых бактерий.
Качественные реакции на масляную кислоту
Получение масляноэтилового эфира. К 3—5 мл культуральной
жидкости в пробирке прибавляют 0,5 мл 96%-го этилового спирта и
1—2 мл крепкой серной кислоты. При взбалтывании и нагревании
появляется характерный запах эфира (запах ананаса).
Реакция идет по следующему уравнению:
Са(СН3СН2СН2СОО)2 + 2СН3СН2ОН = 2СН3СН2СН2СООСН2СН3 + Са(ОН)2
Получение маслянокислого железа (реакция с FeCl3). Для проведения
этой реакции в пробирку наливают 3—5 мл сброженной жидкости,
добавляют 1—2 мл 5%-то хлорного железа и нагревают на пламени.
Вследствие образования маслянокислого железа жидкость в пробирке
приобретает коричневое окрашивание.
Микроскопическое исследование маслянокислых бактерий
Каплю сброженной жидкости пипеткой наносят на предметное стекло,
добавляют такое же количество раствора Люголя (I KI), покрывают
покровным стеклам, на которое наносят каплю кедрового масла.
Раствор Люголя окрашивает клетки, содержащие гранулезу в синий
цвет. Эта реакция является характерной для маслянокислых бактерий и
позволяет отличать их от других бактерий. При микроскопировании
препаратов обнаруживаются клетки Clostridium pasteurianum и др.
бактерии, имеющие подобную форму (рис. 2).
Контpольные вопросы
1. Назвать бактерии, вызывающие маслянокислое брожение. Их
морфологические и физиологические свойства.
2. Уравнение маслянокислого брожения.
3. Почему маслянокислые бактерии не могут развиваться при доступе
кислорода воздуха?
4. Каким образом можно выявить гранулезу у маслянокислых бактерий?
5. В чем сущность качественной реакции на масляную кислоту?
Материалы и оборудование: картофель, высокие пробирки, мел
(СаСО3), термостат, термометр, водяная баня, микроокопы, предметные и
покровные стекла, раствор Люголя, концентрированная серная кислота,
пипетки, спирт.