ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ (СИСТЕМА senX3

ÄÈÀÃÍÎÑÒÈÊÀ È ÏÐÎÔÈËÀÊÒÈÊÀ ÒÓÁÅÐÊÓËÅÇÀ ÆÈÂÎÒÍÛÕ
мента, температура отжига и число циклов
амплификации.
В результате сконструирована дифференцирующая ПЦР-система, основанная
на методе стандартного нестеда.
Адаптация системы проходила на сложном биологическом материале медицинского и ветеринарного значения: мокрота, промывные воды бронхов, моча, кровь,
биоптаты лимфатических органов и внутренних органов. Материал медицинского
значения поступал из различных медицинских организаций г. Москвы.
Из легочных проб в 142 пробах выявлено ДНК М. tuberculosis, в 8 пробах выявлено ДНК М. bovis.
Из внелегочных проб 17 проб выявлено
ДНК М. bovis, остальные пробы — ДНК М.
tuberculosis.
Все пробы исследовались дифференцирующей системой SenX3-RegX3, так и альтернативными системами, основанными на
амплификации генетической области gyrB
и дальнейшей рестрикции с получением характерных фрагментов для М. tuberculosis
(360\440), а для М. bovis (360\560). И ампли-
фикации генетической области RD2 с получением специфических ампликонов, для
М. tuberculosis 350 п.о, для М. bovis 370 п.о.
В результате в 99% системы gyrB и RD2
подтверждали правильность выявления
и дифференциации нашей системы, основанной на генетической области SenX3RegX3.
Выводы.
1. Разработана дифференцирующая
ПЦР-система, которая выявляет и идентифицирует ДНК М. tuberculosis и М. bovis.
2. Показано, что праймеры подобраны высокоспецифичные и чувствительные
для дифференциации ДНК М. tuberculosis
и М. bovis.
3. Разработан лабораторный вариант
ПЦР-системы для рутинных исследований
клинических образцов, обеспечивающих
выявление минимальных количеств бактериальной ДНК М. tuberculosis и М. bovis в
сложных биологических субстратах. Система работает на клинических образцах
без предварительного выделения возбудителя и культивирования его на питательных средах.
УДК 619:616.579.873.21Т
А.Х. Найманов, Н.П. Овдиенко, Е.П. Осипова, И.В. Солодова, B.C. Суворов
(ВИЭВ)
ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ
(СИСТЕМА senX3-regX3) ПРИ ДИАГНОСТИКЕ
ТУБЕРКУЛЕЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
Работа проведена в лаборатории микобактериозов Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко,
в лаборатории молекулярной диагностики
Института молекулярной генетики РАН, в
Вышневолоцком отделе ВИЭВ, в благополучных и неблагополучных по туберкулезу хозяйствах Московской, Рязанской, Пензенской и Смоленской областей РФ.
В институте молекулярной генетики
РАН и Всероссийском научно- исследовательском институте экспериментальной
ветеринарии были подобраны праймеры и
отработана новая диагностическая система, основанная на амплификации генетической области senX3-regX3 и позволяющая идентифицировать и дифференцировать ДНК М. bovis от ДНК М. tuberculosis.
Исследования проводились в несколько этапов:
1. Исследования культур микобакте96
рий.
2. Исследования экспериментально зараженных телок.
3. Исследования в благополучных по
туберкулезу хозяйствах, где установлена
сенсибилизация животных атипичными
микобактериями.
4. Исследования в неблагополучных по
туберкулезу хозяйствах.
1. Исследования культур микобактерий
При определении специфичности системы senX3-regX3 в реакциях, в которых в качестве матриц использовали ДНК различных видов микобактерий (М. tuberculosis,
M. bovis, M. avium, M. kansasii, M. terrae, M.
fortuitum, M. gordonae, M. marinum, M. flei,
M. scrofulaceum, M. paratuberculosis) специфические ампликоны были получены
только с ДНК М. tuberculosis и М. bovis,
при этом полученные ампликоны имели
разные размеры М. tuberculosis -360 п.о.,
М. bovis — 440 п.о. При исследовании данВетеринарная патология. № 1–2. 2004
ÄÈÀÃÍÎÑÒÈÊÀ È ÏÐÎÔÈËÀÊÒÈÊÀ ÒÓÁÅÐÊÓËÅÇÀ ÆÈÂÎÒÍÛÕ
ной системой различных видов атипичных
микобактерий, специфические ампликоны получены не были, т.е. ПЦР-метод дал
отрицательный результат. Таким образом,
система senX3-regX3 дифференцировала
М. bovis от М. tuberculosis и от исследованных атипичных микобактерий.
2. Исследования экспериментально зараженных телок
На опытной базе Вышневолоцкого отдела ВИЭВ (о. Лисий) провели эксперимент
на 9 телках: 6 телок заразили культурой М.
bovis, 3 телки — контрольная группа.
Шестимесячных телок заражали культурой М. bovis алиментарно, четырехкратно, каждой телке вводили первоначально
по 20 мг культуры ежедневно 3 дня подряд, затем такую же дозу культуры вводили через 7 дней после последнего заражения. Телкам контрольной группы культуры
М. bovis не вводили.
В начальной стадии эксперимента все
зараженные М. bovis и контрольные животные не реагировали на внутрикожную
туберкулиновую пробу, и только через 3
месяца после заражения две зараженных
М. bovis телки стали слабо реагировать на
внутрикожное введение ППД-туберкулина для млекопитающих с утолщением кожной складки на 3 мм. Через 5 месяцев после заражения все зараженные М. bovis телки реагировали на внутрикожное введение
ППД-туберкулина для млекопитающих.
Три телки контрольной группы не реагировали на внутрикожное введение ППДтуберкулина для млекопитающих в течение всего эксперимента.
Через год после заражения все подопытные телки были убиты.
При патологоанатомическом осмотре
убитых телок характерные для туберкулеза изменения (гранулемы в начальной стадии развития, величиной с просяное зерно) были обнаружены только у двух зараженных животных в бронхиальном и средостенном лимфатических узлах. Гистоло-
гически у этих же телок также был подтвержден туберкулез.
В течение всего эксперимента, при исследовании проб крови от подопытных телок полимеразной цепной реакцией, получены отрицательные результаты во всех
случаях.
При исследовании у зараженных животных проб мочи ПЦР-методом, обнаружена ДНК М. bovis в 5 случаях из 6 (83,3%),
от животных контрольной группы возбудителя туберкулеза не выделили.
При культуральном исследовании патматериала от всех зараженных животных
рост культур М. bovis обнаружен через 4–5
недель после посева патматериала на питательные среды только у 2 зараженных телок (у которых патологоанатомически и
гистологически подтвержден туберкулез).
Из патматериала убитых контрольных
телок рост культур М. bovis не выявили.
При исследовании суспензии обработанного патматериала от всех экспериментальных животных методом ПЦР возбудитель туберкулеза не выявлен ни в одном
случае.
Поэтому, учитывая слабый рост культур микобактерий на питательных средах
и отрицательные результаты по ПЦР при
исследовании патматериала от зараженных туберкулезом животных, мы провели
исследования полимеразной цепной реакций верхнего слоя ранее засеянной питательной среды.
При исследовании верхнего слоя питательной среды методом ПЦР, во всех пробах от 6 (100%) зараженных телок была
обнаружена ДНК М. bovis. В контрольных
пробах возбудитель туберкулеза не найден.
Результаты исследований экспериментально зараженных телок представлены в
таблице 1.
Полученные результаты исследований
показывают, что возбудитель М. bovis может находиться в организме экспериментально зараженных животных, но не выявТаблица 1
Исследования экспериментально зараженных телок
группа, зараженная М.
bovis (6 телок)
гистологический
метод
культуральный
метод
контрольная группа (3 телки)
патологоанатомический метод
Группы животных
туберкулинизация
Методы исследования
кровь
-
-
-
-
-
100% 100%
+6
+2
100% 33,3%
ПЦР-метод (система senX3-regX3)
моча
патматериал
культуры, выросшие
на питательной среде
-
-
-
100%
100%
100%
100%
100%
100%
+2
+2
-
+5
-
+6
33,3%
33,3%
0%
83,3%
0%
100%
Примечание: + — положительный результат; - — отрицательный результат.
Ветеринарная патология. № 1–2. 2004
97
ÄÈÀÃÍÎÑÒÈÊÀ È ÏÐÎÔÈËÀÊÒÈÊÀ ÒÓÁÅÐÊÓËÅÇÀ ÆÈÂÎÒÍÛÕ
Таблица 2
Исследования в неблагополучных по туберкулезу хозяйствах
Количество исследованных
животных
83
убой 5 коров
Методы исследования
туберкулиншация
исследование крови патологоПЦР-методом (сис- анатомичестема senX3-regX3)
кий метод
+ 83
+ 15
100%
18,1%
+5
+5
+2
гистологический
метод
культуральный
метод
биопроба
+2
+2
+5
Примечание: + — положительный результат.
ляться в крови и в то же время выделяться
вместе с мочой зараженных животных.
Возбудитель М. bovis может находиться в патматериале (лимфоузлах) и не расти на питательных средах, в то же время
наличие возбудителя туберкулеза на поверхности, засеянной питательной среды
в 100% случаях обнаруживается методом
ПЦР в системе senX3-regX3.
3. Исследования в благополучных по
туберкулезу хозяйствах, где установлена сенсибилизация животных атипичными микобактериями
В благополучных по туберкулезу хозяйствах, где установлена сенсибилизация
животных атипичными микобактериями,
аллергические исследования на туберкулез
проводили методом симультанной туберкулиновой пробы с использованием ППД-туберкулина для млекопитающих и КAM. Для
диагностического убоя отбирали животных
с более выраженной реакцией на ППД-туберкулин для млекопитающих.
При исследовании ПЦР-методом системой senX3-regX3 43 проб крови от реагировавших на туберкулин коров из благополучных по туберкулезу хозяйств, в 7
(16,27%) случаях получены положительные показания по ПЦР. При диагностическом убое и патологоанатомическом осмотре 5 реагировавших на туберкулин и с положительными результатами по ПЦР коров, характерных для туберкулеза изменений не обнаружили ни в одном случае. Лабораторные исследования патматериала
от убитых животных также дали отрицательные результаты.
При комиссионном диагностическом
убое 21 реагирующей на туберкулин коровы характерные для туберкулеза изменения не были обнаружены ни в одном
случае. При культуральном исследовании
патматериала от 21 убитой коровы в 14
(66,6%) случаях выявили рост атипичных
микобактерий. При исследовании патматериала от этих же животных ПЦР-методом
во всех случаях получены отрицательные
98
результаты.
4. Исследования в неблагополучных по
туберкулезу хозяйствах
В неблагополучных по туберкулезу хозяйствах аллергические исследования на
туберкулез проводили внутрикожной туберкулиновой пробой с использованием
ППД-туберкулина для млекопитающих.
Реагирующими считали животных с увеличением толщины кожной складки на 3
мм и более.
В двух неблагополучных по туберкулезу хозяйствах исследовали полимеразной
цепной реакцией пробы крови от 83 реагирующих на туберкулин коров. При учете реакции положительные результаты по
ПЦР получены в 15 (18,1%) случаях. При
выборочном диагностическом убое 5 реагирующих на туберкулин и с положительными реакциями по ПЦР коров, характерные для туберкулеза изменения обнаружены в 2 случаях, у остальных 3 убитых коров характерные для туберкулеза изменения не найдены. При культуральном исследовании патматериала от этих трех животных рост культур возбудителя туберкулеза
не выявлен. Но при постановке биопробы
на морских свинках, через 1 месяц после
заражения, лабораторные животные пали
с характерными для туберкулеза патологоанатомическими изменениями.
Результаты данных исследований представлены в таблице 2 (опыт 1).
В остальных неблагополучных по туберкулезу хозяйствах был проведен выборочный диагностический убой 22 реагирующих на туберкулин коров, а также патологоанатомические и лабораторные исследования на туберкулез патматериала от
убитых животных.
При патологоанатомическом осмотре
22-х реагирующих на туберкулин животных, характерные для туберкулеза изменения были обнаружены в 22 (100%) случаях
в заглоточных, бронхиальных, средостенных лимфоузлах и легких. Гистологически у этих 22 коров также был подтвержден
Ветеринарная патология. № 1–2. 2004
ÄÈÀÃÍÎÑÒÈÊÀ È ÏÐÎÔÈËÀÊÒÈÊÀ ÒÓÁÅÐÊÓËÅÇÀ ÆÈÂÎÒÍÛÕ
Таблица 3
Исследования в неблагополучных по туберкулезу хозяйствах
патологоанатомический метод
гистологический
метод
культуральный метод
22
туберкулинизация
Методы исследования
Количество исследованных животных
+ 22
+ 22
+ 22
+ 15
+ 10
+ 21
100%
100%
100%
68,2%
45,5%
95,5%
ПЦР-метод (система senX3-regX3)
патматериал
культуры, выросшие
на питательной среде
Примечание: + — положительный результат.
диагноз на туберкулез.
При культуральном исследовании патматериала от 22 голов явно больных туберкулезом животных выявлен рост культур М. bovis в 15 (68,2%) случаях, а в 7 случаях рост культур М. bovis не обнаружен.
При исследовании патматериала от 22
голов явно больного туберкулезом крупного рогатого скота полимеразной цепной реакцией, положительный результат
был получен в 10 (45,5%) случаях, то есть
ПЦР-методом туберкулез подтвержден в
меньшем проценте, чем культуральным
методом. Тем не менее, ПЦР-методом дополнительно подтвержден туберкулез в
трех случаях, когда из патматериала реагирующих на туберкулин коров, с характерными для туберкулеза изменениями,
не была выделена культура М. bovis проведенными бактериологическими исследованиями.
Помимо этого, от этих животных нами проведены исследования выделенных
культур микобактерий. В тех случаях, где
рост колоний не наблюдался, для ПЦРанализа брали верхний слой питательной
среды, ранее засеянной суспензией обработанного патматериала. ДНК М. bovis выявлена в ПЦР-системе senX3-regX3 в 21 из 22
случаев (95,5%).
Результаты исследований представлены в таблице 3 (опыт 2).
Заключение
Диагностика туберкулеза крупного рогатого скота должна быть комплексной, с
применением эпизоотологических, аллергических, патологоанатомических, лабораторных методов исследований.
На данном этапе борьбы с туберкулезом крупного рогатого скота, полимеразную цепную реакцию целесообразно использовать в лабораторной диагностике
туберкулеза крупного рогатого скота как
дополнительный экспресс-метод при исследовании патматериала от убитых с диагностической целью животных и для идентификации культур М. bovis и М. tuberculosis.
УДК 619:616.579.873.21Т
В.А. Душкин, председатель комитета государственного ветеринарного
надзора Нижегородской области, О.Н. Воинова, генеральный директор
ООО Медицинский центр «Наследственность», И.В. Ефимычев, руководитель
ветеринарного отдела ООО Медицинский центр «Наследственность»,
В.М. Кудрячков
ОПЫТ РАБОТЫ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ
МЕТОДА ПЦР В ДИАГНОСТИКЕ ТУБЕРКУЛЕЗА
КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
В НИЖЕГОРОДСКОЙ ОБЛАСТИ.
Введение
Одним из основных звеньев в проведении профилактических и оздоровительных мероприятий при инфекционных болезнях животных является диагностика. В
Ветеринарная патология. № 1–2. 2004
настоящее время в лабораторной практике широко применяются передовые технологии. Первое место в ряду новейших методов занимает полимеразная цепная реакция (ПЦР), позволяющая быстро и объ99