физиология и количественный учет микроорганизмов
реклама
Федеральное агентство по образованию ГОУ ВПО «Уральский государственный технический университет − УПИ» Г.С. Сакович, М.А. Безматерных ФИЗИОЛОГИЯ И КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ УЧЕТ МИКРООРГАНИЗМОВ Учебное электронное текстовое издание Подготовлено кафедрой «Технология органического синтеза» Научный редактор: доц., канд. хим. наук И.С. Селезнева Методическая разработка к лабораторным занятиям по курсам "Общая биология и микробиология" и "Основы микробиологии" для студентов дневной формы обучения специальностей 070100 – Биотехнология и 320700 – Охрана окружающей среды и рациональное использование природных ресурсов. Разработка является продолжением пособия «Морфология микроорганизмов». В ней описаны методы и условия культивирования микроорганизмов. Особое внимание уделено принципам подбора питательных сред, их классификации и влияния на физиологию и метаболизм микроорганизмов. Подробно описаны способы учета микроорганизмов и сущность метода счета колоний при оценке микробной обсемененности объекта. © ГОУ ВПО УГТУ−УПИ, 2005 Екатеринбург 2005 Сакович Г.С., Безматерных М.А. Физиология и количественный учет микроорганизмов ВВЕДЕНИЕ Организация любого микробиологического синтеза практически важных веществ начинается с изучения физиологии продуцента. Необходимо изучить характер питания продуцента, а также влияние внешних факторов на состояние клеток и популяций. Вопросы эти выясняются путем оптимизации исследуемого процесса. Основой для этого является культивирование микроорганизмов в контролируемых и управляемых условиях. В конечном итоге устанавливают состав сред и режим культивирования, наиболее приемлемые экономически и, которые в дальнейшем эмпирически возможно совершенствовать при введении процесса в промышленном масштабе. Чем глубже познается физиологическая и биохимическая изменчивость микробной клетки, тем больше возможностей открывается для управления микробным биосинтезом, изменения метаболизма в желаемую сторону. Изменяя условия культивирования, можно изменить состав биомассы и продуктов метаболизма. Лимитирование и ингибирование роста приводят к замедлению одних процессов биосинтеза, но могут вызвать даже ускорение других. На этом основан сверхсинтез тех или иных продуктов. Данная методическая разработка является продолжением лабораторного практикума, изложенного в пособии «Морфология микроорганизмов». Занятие 5 МЕТОДЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ Цель занятия – ознакомление с основными питательными средами, принципами их приготовления, способами стерилизации и методами выращивания микроорганизмов в лабораторных условиях. Вопросы для обсуждения: 1. Определение понятий «культивирование микробов», «культура», «клон», «колония», «штамм». ГОУ ВПО УГТУ-УПИ – 2005 Стр. 2 из 40 Сакович Г.С., Безматерных М.А. Физиология и количественный учет микроорганизмов 2. Условия, необходимые для выращивания микроорганизмов: температура, аэрация, кислотность среды. 3. Общие требования, которым должны удовлетворять питательные среды. 4. Классификация сред по составу компонентов и назначению. 5. Способы уплотнения сред; вещества, применяемые для уплотнения сред, их характеристика и области применения. 6. Общеупотребительные (стандартные) среды для выращивания бактерий, дрожжей, плесеней. 7. Среды, позволяющие получить преимущественный рост одних микробов при одновременном подавлении роста других видов. 8. Среды, служащие для изучения ферментативных свойств микробов. 9. Способы стерилизации питательных сред. 10. Способы стерилизации посуды и инструментов. План занятия: 1. Ознакомиться с условиями выращивания микроорганизмов, свойствами, классификацией питательных сред, способами их приготовления и стерилизации. 2. .Самостоятельная работа. Физиология микроорганизмов Физиология микроорганизмов - это раздел микробиологии, изучающий процессы жизнедеятельности микробов. Особенности жизнедеятельности микроорганизмов, т.е. потребности в питательных веществах (тип питания), способ биологического окисления (тип дыхания), реакция клетки на воздействие различных факторов среды обитания, называются физиологическими свойствами. Знание физиологических свойств микробов необходимо для понимания их расселения и поведения в природе, использования в народном хозяйстве. ГОУ ВПО УГТУ-УПИ – 2005 Стр. 3 из 40 Сакович Г.С., Безматерных М.А. Физиология и количественный учет микроорганизмов В лабораторной практике исследование физиологических свойств микробов проводится наряду с морфологическими для идентификации микроорганизмов, т.е. определения их названия. Для исследования физиологических свойств микроорганизмы выращивают в лабораторных условиях. Выращивание микроорганизмов в лабораторных условиях называется культивированием, а выращенные на питательной среде микробы – культурой. Культуры, состоящие из различных видов микроорганизмов, называют смешанными; культуры, состоящие из одного вида микробов – чистыми. При специальных способах посева, когда в питательную среду вносится одна клетка, в результате ее размножения образуется совокупность особей, которая называется клон. Если клон развивается на поверхности плотной питательной среды, по мере роста числа особей он образует видимое невооруженным глазом скопление микробов, которое называется колонией. Микроорганизмы одного вида, выделенные из определенного источника внешней среды (из почвы, организма человека, животного, пищевого продукта и т. д.), называются штаммом. Например, если стафилококк одного вида выделен из пяти источников (пяти разных порций продукта, от пяти разных человек и т. д.), считают, что получено, пять штаммов данного вида стафилококка. На занятиях по данной теме рассматриваются условия выращивания микроорганизмов и методы количественного учета микроорганизмов. Условия выращивания микроорганизмов Температура. Для оптимального развития микроорганизмов необходима температура, соответствующая видовым потребностям культуры. Большинство видов бактерий активно размножается при температуре 36–37° С, мицелиальные грибы - при 25–З0° С. Это мезофильные микроорганизмы. ГОУ ВПО УГТУ-УПИ – 2005 Стр. 4 из 40 Сакович Г.С., Безматерных М.А. Физиология и количественный учет микроорганизмов Холодолюбивые (психрофильные) микроорганизмы развиваются при температуре в пределах от 0 до 20° С. Для теплолюбивых (термофильных) микроорганизмов оптимальная температура роста 45–65° С. При отклонении температуры от оптимальной развитие микроорганизмов задерживается. Поэтому их выращивают в специальных термостатах - шкафах с термоизоляцией, в которых поддерживается постоянная температура, соответствующая потребностям культур. Свет. Большинство микроорганизмов не нуждается в свете, а прямые солнечные лучи подавляют их развитие. Аэрация. Потребности в свободном кислороде у микроорганизмов неодинаковы. Микроорганизмы аэробы и факультативные анаэробы выращивают при доступе кислорода в обычных условиях воздушной среды. Культивирование анаэробов производится в бескислородных условиях, которые создаются различными приемами. Наиболее простой способ - механическая защита микроорганизмов от воздуха путем выращивания их в высоком слое жидкой среды (в пробирке до 10-15 мл). Для этого поверхность среды заливается тонким слоем стерильного вазелинового масла или парафина. Диффузия кислорода из воздуха в жидкие среды уменьшается при загущении среды агар-агаром (0,2–0,3 %). При использовании плотных сред посев осуществляется в чашках Петри под слоем агара. Строгие анаэробные микроорганизмы выращивают в специальных аппаратах - стеклянных вакуумных эксикаторах или анаэростатах. Сроки культивирования. В соответствии с закономерностью роста большинство культур бактерий выращивают в течение 24–48 ч. Микроскопические грибы культивируют в течение недели. Питательные среды Среды необходимы для накопления, выделения и сохранения микроорганизмов, а также для выращивания культур с целью исследования их обмена ГОУ ВПО УГТУ-УПИ – 2005 Стр. 5 из 40 Сакович Г.С., Безматерных М.А. Физиология и количественный учет микроорганизмов веществ или получения ценных продуктов метаболизма. В лабораторных условиях микроорганизмы выращивают также при качественном анализе микрофлоры различных объектов, при количественном анализе - для подсчета жизнеспособных клеток. Среда должна включать все компоненты, необходимые для конструктивных и энергетических процессов клетки, – источники элементоворганогенов – С, Н, О, N; зольные элементы – Р, S, К, Mg, Fe, Ca; микроэлементы – Ni, Cu, Co, Zn и др.; для некоторых микробов необходимо присутствие в питательной среде витаминов. Питательная среда должна содержать определенное количество воды, так как питательные вещества поступают в клетку только лишь в растворенном виде на основе физических законов осмоса. Синтетические возможности микроорганизмов и способы получения ими энергии разнообразны, следовательно, и очень различны их потребности в источниках питания. Отсюда ясно, что универсальных сред, одинаково пригодных для роста всех без исключения микроорганизмов, не существует. Разнообразие обмена веществ микроорганизмов проявляется прежде всего в их отношении к источникам углерода и азота; вот почему эти элементы представлены в средах различными веществами и именно они определяют специфичность сред. Автотрофные микроорганизмы способны использовать в качестве единственного источника углерода углекислоту воздуха или карбонатов. Для развития гетеротрофных микроорганизмов среда должна содержать более восстановленные соединения углерода, которые в зависимости от физиологобиохимических особенностей организма могут быть представлены различными органическими соединениями, например, спиртами, углеводами, углеводородами. Неодинаковы требования микроорганизмов и к источнику азота. Для культивирования микроорганизмов, фиксирующих молекулярный азот, исГОУ ВПО УГТУ-УПИ – 2005 Стр. 6 из 40 Сакович Г.С., Безматерных М.А. Физиология и количественный учет микроорганизмов пользуют среды, не содержащие соединений азота. В состав всех других сред входят различные азотсодержащие соединения. Это могут быть нитраты или соли аммония, одна или несколько аминокислот. Наконец, известны микроорганизмы, нуждающиеся в полном наборе аминокислот или белках. Потребности разнообразных групп микроорганизмов в зольных элементах и микроэлементах удовлетворяются обычно за счет одних и тех же минеральных солей. Поэтому так называемый «минеральный фон» сред для многих микроорганизмов может быть очень близким по составу. Кроме элементов, необходимых для конструктивных процессов, среда должна содержать и энергетический материал. В средах для культивирования гетеротрофных организмов соединения углерода в большинстве случаев являются и энергетическим материалом. В средах для хемоавтотрофных организмов эту роль выполняют минеральные соли. Из вышесказанного ясно, что при составлении сред следует обязательно учитывать особенности обмена веществ микроорганизмов. Кроме того, среды для одного и того же микроорганизма могут быть разными в зависимости от задач исследования. Например, среда для длительного сохранения микроорганизма в лабораторных условиях заметно отличается от сред, предназначенных для получения тех или иных продуктов обмена веществ. К питательных средам для выращивания микроорганизмов предъявляют определенные требования: они должны содержать необходимые питательные вещества в легкоусвояемой форме (азотистые, углеводные, минеральные вещества, витамины); должны быть изотоничны по отношению к микробной клетке; обладать буферными свойствами; иметь оптимальную вязкость и определенный окислительно-восстановительный потенциал. Обязательное условие - стерильность питательных сред, поскольку посторонние микроорганизмы изменяют свойства среды и затрудняют культивирование и изучение определенных микробов. ГОУ ВПО УГТУ-УПИ – 2005 Стр. 7 из 40 Сакович Г.С., Безматерных М.А. Физиология и количественный учет микроорганизмов Питательные среды различаются по составу, назначению и консистенции. По составу среды для культивирования делят на три группы: естественные, или натуральные, искусственные, или полусинтетические, и синтетические среды. Натуральными называют среды, которые состоят из продуктов животного и растительного происхождения. К таким средам относятся овощные или фруктовые соки, животные ткани, разведенная кровь, молоко, вода морей, озер и минеральных источников, а также отвары или экстракты, полученные из природных субстратов, как, например, мясо, навоз, почва, различные части растений. На натуральных средах хорошо развиваются многие микроорганизмы, так как в таких средах имеются, как правило, все компоненты, необходимые для их роста и развития. Однако эти среды имеют сложный, непостоянный химический состав и мало пригодны для изучения физиологии обмена веществ микроорганизмов, так как не позволяют учесть потребление ряда компонентов среды и образование продуктов обмена по ходу развития. Натуральные среды используются главным образом для подержания культур микроорганизмов, накопления их биомассы и диагностических целей. Примерами натуральных сред неопределенного состава, которые широко применяются в лабораторной практике, служат мясопептонный бульон, неохмеленное пивное сусло, дрожжевая и картофельная среды, почвенная вытяжка. К искусственным, или полусинтетическим, средам относят среды, в состав которых наряду с соединениями известной химической природы входят вещества неопределенного состава - природные продукты. Такие среды находят широкое применение в технической микробиологии для получения аминокислот, витаминов, антибиотиков и других важных продуктов жизнедеятельности микроорганизмов. ГОУ ВПО УГТУ-УПИ – 2005 Стр. 8 из 40 Сакович Г.С., Безматерных М.А. Физиология и количественный учет микроорганизмов К полусинтетическим средам относятся, например, мясопептонный бульон с глюкозой и фосфорнокислым калием, картофельная среда с глюкозой и пептоном. Основой в указанных средах является компонент неопределенного состава. К полусинтетическим средам следует отнести также среды, главными частями которых являются соединения известного состава - углеводы, нитраты или соли аммония, фосфаты и другие, а соединения неопределенного состава - гидролизат казеина, дрожжевой автолизат, кукурузный экстракт - добавляются в качестве факторов роста и витаминов. Синтетические среды - это среды, в состав которых входят только определенные, химически чистые соединения, взятые в точно указанных концентрациях. Синтетические среды наиболее удобны для исследования обмена веществ микроорганизмов. Зная точный состав и количество входящих в среду компонентов, можно изучить их потребление и превращение в соответствующие продукты обмена. Для разработки синтетических сред необходимо знать потребности микроорганизмов в источниках питания и основные особенности их обмена веществ. В зависимости от потребностей микроорганизмов синтетические среды могут иметь относительно большой набор компонентов, как, например, среды для ряда молочнокислых бактерий, но могут быть и довольно простыми по составу, как среды для автотрофных микроорганизмов. В большинстве случаев синтетические среды готовят на водопроводной воде и микроэлементы не добавляют, так как они в небольших количествах всегда содержатся в водопроводной воде и могут поступать в среду из стекла посуды. Как правило, ограничиваются внесением только тех микроэлементов, к которым изучаемый микроорганизм проявляет повышенную требовательность. В специальных целях, например, при изучении потребностей микроорганизмов в отдельных компонентах минеральных солей, для приготовления ГОУ ВПО УГТУ-УПИ – 2005 Стр. 9 из 40 Сакович Г.С., Безматерных М.А. Физиология и количественный учет микроорганизмов синтетических сред используют дистиллированную воду. В этом случае микроэлементы вносят в среду обязательно. По назначению различают общеупотребительные (стандартные), элективные и дифференциально-диагностические (индикаторные) среды. Обычные, или общеупотребительные (стандартные), среды пригодны для выращивания большинства микробов: мясопептонный бульон (МПБ), мясопептонный агар (МПА), мясопептоновый желатин (МПЖ) и др. Элективные среды обеспечивают преимущественное развитие одного вида или группы микроорганизмов и менее пригодны или даже совсем непригодны для развития других. Элективные среды применяют главным образом для выделения микроорганизмов из мест их естественного местообитания или для получения накопительных культур определенного вида из материала, содержащего смешанную культуру (сахарный бульон, желчный бульон, агар с кровью и т. д.). Дифференциально-диагностические среды служат для дифференциации различных видов микроорганизмов на основании различий в обменных процессах. В состав этих сред обычно вводят вещества, позволяющие изучить особенности ферментов исследуемых культур. Дифференциальнодиагностическими средами пользуются в основном для идентификации неизвестных видов микроорганизмов. К ним относятся среды для определения способности микробов к расщеплению белков (мясопептонный желатин), ферментации углеводов (среды Гисса, Эндо и др.), гемолитической способности (кровяной агар), восстановительной способности (среды, содержащие красители, обесцвечивающиеся при восстановлении и др.) и т.д. В настоящее время многие питательные среды для лабораторных исследований изготовляют фабричным способом и выпускают в виде порошка. Для хранения питательных сред и выращивания микроорганизмов обычно используют стеклянную посуду различной вместимости. По консистенции различают жидкие, плотные и сыпучие среды. ГОУ ВПО УГТУ-УПИ – 2005 Стр. 10 из 40 Сакович Г.С., Безматерных М.А. Жидкие среды Физиология и количественный учет микроорганизмов широко применяют для выяснения физиолого- биохимических особенностей микроорганизмов, для накопления биомассы или продуктов обмена, а также поддержания и хранения многих микроорганизмов, плохо развивающихся на плотных средах. В лабораторной практике применяют жидкие среды: МПБ, пептонная вода, сахарный бульон и др. Плотные среды используют для выделения чистых культур (получение изолированных колоний) в диагностических целях (установление морфологии колоний, особенностей роста на скошенном агаре и др.), для хранения культур, количественного учета микроорганизмов, определения их антагонистических свойств и в ряде других случаев. Примером плотных питательных сред являются МПА, МПЖ, свернутый яичный белок, картофель и др. Сыпучие среды применяют в промышленной микробиологии. К ним относятся, например, разваренное пшено, отруби, кварцевый песок, пропитанные питательным раствором. Уплотнение сред Для уплотнения сред применяют агар-агар, желатину и кремнекислый гель. Агар-агар используют особенно часто. Это сложный полисахарид, получаемый из некоторых морских водорослей. Его выпускают в виде пластин, «стебельков» или порошка. Агар-агар удобен тем, что большинство микроорганизмов не используют его в качестве питательного субстрата. В воде агарагар образует гели, плавящиеся при 100°, а затвердевающие при температуре около 40° С. Поэтому на агаризованных средах можно культивировать микроорганизмы практически при любой подходящей для их роста температуре. При остывании агар выделяет «конденсационную» воду. Чем меньше концентрация агара, тем больше выделяется воды. ГОУ ВПО УГТУ-УПИ – 2005 Стр. 11 из 40 Сакович Г.С., Безматерных М.А. Физиология и количественный учет микроорганизмов Чаще всего агар-агар добавляют к средам в количестве 2 %. Если хотят получить более влажную среду, вносят 0,5–1,5 %, а более плотную и сухую – 3 % агар-агара. Следует отметить, что в слабокислых, нейтральных и слабощелочных средах агар-агар сохраняет способность образовывать гель после нескольких, циклов плавления и затвердевания, а также после повторной стерилизации. Однако в кислой среде при рН ниже 5,5 агар-агар при стерилизации частично гидролизуется и поэтому после стерилизации часто не образует гель. В этом случае агар-агар следует стерилизовать отдельно от среды в определенном объеме воды и добавлять в среду после стерилизации. Для этого стерильный водный агар-агар расплавляют на водяной бане и приливают при постоянном перемешивании к стерильной, предварительно подогретой среде. Желатина – это белок, получаемый путем вываривания костей и хрящей животных. Образуемый желатиной гель плавится при температуре 23– 36° С, которая ниже обычной температуры инкубации многих микроорганизмов (30–37° С). Кроме того, желатина разжижается протеолитическими ферментами, выделяющимися некоторыми микроорганизмами в среду. Эти свойства желатины сильно ограничивают ее применение в качестве уплотняющего средства. Желатину используют главным образом для выявления протеолитической активности микроорганизмов, а также получения «гигантских» и глубинных колоний дрожжей с целью их идентификации. В первом случае употребляют мясопептонную, а во втором - сусловую желатину. Желатину добавляют к жидким средам в количестве 10–15 %, оставляют ее набухать 10–15 мин и нагревают на водяной бане до полного растворения. Доводят рН среды до 6,8–7,0. Все среды с желатиной стерилизуют при 0,5 атм в течение 15 мин. Повторная стерилизация желатиновых сред, особенно при рН сред ниже 6,0 или выше 7,3 не рекомендуется, так как желатина при этом теряет способность образовывать гель. ГОУ ВПО УГТУ-УПИ – 2005 Стр. 12 из 40 Сакович Г.С., Безматерных М.А. Физиология и количественный учет микроорганизмов Кремнекислый гель (силикагель) используют как твердую основу для синтетических сред строго определенного состава, поскольку он является веществом неорганической природы. Методы стерилизации Стерилизация в переводе с латинского языка означает обеспложивание. В микробиологической практике стерилизацией называют уничтожение микроорганизмов и их спор или полное удаление микроорганизмов из обработанной среды. Стерилизуют питательные среды, посуду, инструменты и другие предметы для того, чтобы не допустить развития посторонней микрофлоры в исследуемом материале. Существуют различные способы стерилизации: термическая стерилизация - кипячением, прокаливанием в пламени, горячим воздухом, насыщенным паром под давлением (автоклавирование), текучим паром; холодная стерилизация - фильтрованием, воздействием различными физическими факторами (ультрафиолетовыми лучами, ультразвуком) или химическими веществами (антисептиками). Стерилизация лучистой энергией. Действие ультрафиолетовых лучей находит широкое использование для стерилизации воздуха в лабораторных помещениях, в цехах промышленных предприятий. Для обеззараживания воздуха используют бактерицидные лампы. Ввиду возможного неблагоприятного действия ультрафиолетовых лучей на организм человека бактерицидные лампы включают только при отсутствии людей в помещении. Химический метод стерилизации применяется при дезинфекции. Дезинфекция - это способ уничтожения микроорганизмов при помощи сильнодействующих химических веществ или так называемых антисептиков. Гибель микроорганизмов при дезинфекции происходит в основном в результате гидролиза компонентов клетки, коагуляции белков, инактивации клеточных ферментов. ГОУ ВПО УГТУ-УПИ – 2005 Стр. 13 из 40 Сакович Г.С., Безматерных М.А. Физиология и количественный учет микроорганизмов К группе антисептиков относятся неорганические и органические вещества. Из неорганических антисептиков широко используются неорганические кислоты, щелочи и соли (0,1–0,2%-ые растворы сулемы), хлорная известь 10–20%-ый, йод; из органических веществ - этиловый и бутиловый спирты, альдегиды, органические кислоты и растворители (3-5%-ый раствор фенола, 0,2–0,5%-ый раствор хлорамина и 1–4%-ый раствор формалина). В лабораторной практике методы дезинфекции применяют для обеззараживания рабочего стола, рук, камер для посевов. Способ стерилизации выбирают в зависимости от свойств стерилизуемого объекта и цели исследования. Стерилизация питательных сред Стерилизация насыщенным паром под давлением (автоклавирование) является основным методом стерилизации питательных сред. Сущность метода заключается в обработке материала паром под давлением выше атмосферного. Известно, что температура пара возрастает при повышении его давления. Используется дополнительное давление, при котором температура пара возрастает соответственно до 112, 120 и 134° С. Благодаря совместному действию высокой температуры и пара уничтожаются в сравнительно короткие сроки как вегетативные, так и споровые формы микроорганизмов. Стерилизацию в условиях повышенного давления пара проводят в специальных герметически закрывающихся двустенных аппаратах - автоклавах, способных выдерживать высокое давление (рис.1.). Внутренняя часть автоклава - стерилизационная камера, в которую помещают стерилизуемый материал, окружена водопаровой камерой, имеющей ГОУ ВПО УГТУ-УПИ – 2005 Стр. 14 из 40 Сакович Г.С., Безматерных М.А. Физиология и количественный учет микроорганизмов Рис. 1. Схема автоклава: 1 - стерилизационная камера; 2 - кран для выхода воздуха; 3 - манометр; 4 - предохранительный клапан; 5 - водопаровая камера; 6 - воронка для заполнения автоклава водой; 7 - отверстия для поступления в камеру пара; 8 - крышка автоклава; 9 - подставка для стерилизуемых материалов кран для выхода воздуха и пара. При стерилизации в водопаровую камеру наливают воду (лучше дистиллированную) до необходимого уровня. Внутрь стерилизационной камеры на специальную подставку помещают стерилизуемый материал. Предметы следует размещать не слишком плотно, так как пар должен свободно проходить между ними. Крышка автоклава герметически закрывается. Автоклав включается в электрическую сеть. Когда весь воздух будет вытеснен парами воды, пар выпускают еще 15–20 мин. За давлением следят по манометру (табл. 1). ГОУ ВПО УГТУ-УПИ – 2005 Стр. 15 из 40 Сакович Г.С., Безматерных М.А. Физиология и количественный учет микроорганизмов Таблица 1 Температура насыщенного пара при различных давлениях Давление, атм Температура, °С нормальное добавочное 1,0 - 100 1,0 0,5 112 1,0 1,0 121 1,0 1,5 128 1,0 2,0 134 Режим автоклавирования (температура и длительность стерилизации) определяется составом питательной среды. Среды, содержащие сахар, витамины (сусло пивное), некоторые белковые среды (желатиновые, молоко), автоклавируют при t=112° C в течение 20–30 мин, мясопептонные среды - при t=120° C в течение 20–30 мин. Стерилизация текучим паром применяется для питательных сред, свойства которых изменяются при температуре выше 100 °С. Это среды с добавлением белка, углеводов, витаминов. Сущность метода заключается в нагревании среды при нормальном давлении несколько раз с перерывами; в период между прогреванием среду помещают в термостат для проращивания спор. Стерилизуют такие среды чаще всего в парах кипящей воды – текучим паром три раза по 30–40 мин через 24 ч, используя автоклав с не завинченной крышкой или специальный аппарат Коха. Текучим паром проводят также пастеризацию и тиндализацию. Пастеризация - неполная стерилизация производится нагреванием до 50–60° С 15–30 мин с последующим охлаждением до 10–11° С. Применяется для инактивации вегетативных клеток микроорганизмов, бактерий в жидкостях, не выдерживающих высокой температуры (молоко, пиво, соки и т. п.). ГОУ ВПО УГТУ-УПИ – 2005 Стр. 16 из 40 Сакович Г.С., Безматерных М.А. Физиология и количественный учет микроорганизмов Так как при пастеризации споровые формы выживают, то для того, чтобы споры не проросли, пастеризованные продукты хранятся на холоду. Тиндализация - вид дробной стерилизации, который применяют к объектам, содержащим вещества, разлагающиеся и денатурирующиеся при 100° С (витамины, некоторые глазные капли, питательные среды). При этом нагревают стерилизуемый объект на водяных банях или в кипятильниках Коха с терморегулятором при 60–65° С 5 раз или при 70–80° С 3 раза по 60 мин с выдерживанием между стерилизациями при температуре 18–37° С 24 ч. Кипятильник Коха представляет собой металлический цилиндр, покрытый теплоизоляционным материалом (асбестом, эбонитом). Внутри кипятильника имеется сетчатая подставка, на которую ставят объекты для стерилизации. На дно цилиндра наливают воду, так чтобы ее уровень не доходил до подставки. Кипятильник закрывают крышкой, в которой имеется отверстие для выхода пара, и нагревают с помощью электричества или газовой горелки. Стерилизацию фильтрованием применяют в тех случаях, когда жидкие питательные среды не выдерживают нагревания, в частности, растворы белков, сыворотки, некоторые витамины, летучие вещества. Для фильтрации используют специальные фильтры, задерживающие микробные клетки как механически, так и путем адсорбции клеток на фильтрующем материале. Бактериальные фильтры выпускаются из различных материалов - ацетилцеллюлозы, асбеста и т. д. Они представляют собой диски толщиной около 0,1 мм, диаметром 35 мм. В зависимости от размеров они обозначаются № 1–5 (табл. 2). ГОУ ВПО УГТУ-УПИ – 2005 Стр. 17 из 40 Сакович Г.С., Безматерных М.А. Физиология и количественный учет микроорганизмов Таблица 2 Обозначение фильтров № фильтра Средний диаметр пор, мкм 1 0,35 2 0,5 3 0,7 4 0,9 5 1,2 Как правило, бактериальные фильтры пропускают вирусы и бактериофаги. Наиболее широко используют два типа фильтров: мембранные и фильтры Зейтца. Фильтры Зейтца представляют собой плотные диски, изготовленные из смеси асбеста с целлюлозой. Перед употреблением фильтрующее устройство должно быть простерилизовано. Мембранные фильтры стерилизуют, поместив их в дистиллированную воду, автоклавированием или длительным кипячением. Держатель стерилизуют отдельно, автоклавируя. Прибор собирают в асептических условиях непосредственно перед работой. Фильтры Зейтца автоклавируют в собранном виде, предварительно завернув в бумагу. Стерилизация стеклянной посуды и инструментов Стеклянную посуду, вымытую, высушенную и завернутую в бумагу, стерилизуют, в основном, горячим воздухом в сушильных шкафах при температуре 165–170° С в течение 2 ч. Посуду можно стерилизовать и в автоклаве. Посуду развертывают непосредственно перед употреблением. Каждую пипетку заворачивают отдельно в длинные полоски бумаги шириной 4–5 см. В концы пипеток, которые берут в рот, предварительно вставляют ватные тампоны. Обмотку начинают с противоположного конца постепенным движением бумаги по спирали и оканчивают у конца с тампоГОУ ВПО УГТУ-УПИ – 2005 Стр. 18 из 40 Сакович Г.С., Безматерных М.А. Физиология и количественный учет микроорганизмов ном. Бумага должна плотно охватывать пипетку. Завернутые пипетки заворачивают по несколько штук вместе или помещают в специальные металлические или картонные пеналы. Шпатели обертывают по отдельности аналогично пипеткам, используя для обмотки полоски бумаги большей ширины. Чашки Петри завертывают вместе по 2–4 штуки. Колбы, пробирки и др. сосуды со средой закрывают ватными тампонами, а сверху бумажными салфетками. Мелкие металлические лабораторные предметы (пинцеты, бактериологические иглы, петли и др.) во время работы можно стерилизовать прокаливанием в пламени горелки (фламбированием) непосредственно перед использованием. На пламени также кратковременно обжигают горлышки колб, пробирок, бутылок, ватные пробки при пересевах культур и розливе сред. В пламени спиртовки (t=270С) погибают клетки и споры микроорганизмов. Отработанные пипетки с культурой опускают в дезинфицирующие растворы (например, в 5%-ный раствор фенола). Самостоятельная работа 1. Познакомиться с устройствами, используемыми для стерилизации посуды, сред, воздуха и т. д. (автоклав, сушильный шкаф, фильтры, бактерицидные лампы). 2. Подготовить для стерилизации чашки Петри, пипетки, шпатели. 3. Подготовить для стерилизации эрленмейеровские колбочки (емкостью 100 мл) с жидкой питательной средой; закрыть ватной пробкой, бумажной салфеткой и завязать. 4. Подготовить для стерилизации пробирки с водопроводной водой (9 мл). ГОУ ВПО УГТУ-УПИ – 2005 Стр. 19 из 40 Сакович Г.С., Безматерных М.А. Физиология и количественный учет микроорганизмов Занятие 6 СТАНДАРТНЫЕ КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЕСТЕСТВЕННЫХ СУБСТРАТОВ: ПОЧВЫ, ВОДЫ, ВОЗДУХА И ДРУГИХ ОБЪЕКТОВ Цель занятия - освоение количественного метода учета микроорганизмов путем счета колоний. Вопросы для обсуждения: 1. Существующие методы учета микроорганизмов. 2. Понятие «микробного числа». 3. Понятие «санитарно-показательные микроорганизмы». 4. Отбор пробы при исследовании обсемененности микроорганизмами поверхности объекта. 5. Отбор пробы при исследовании обсемененности рук. 6. Определение количества микроорганизмов в воздухе. 7. Сущность метода счета колоний; среды, применяемые в этом методе для выращивания бактерий, дрожжей и плесеней. 8. Достоинства и недостатки метода счета колоний при оценке микробной обсемененности объекта. План занятия: 1. Ознакомиться с методами количественного учета микроорганизмов, способами «взятия средней» пробы. 2. Ознакомиться с методами определения общего количества микроорганизмов (микробного числа) в различных объектах. 3. Самостоятельная работа: постановка задач по количественному учету микроорганизмов в пробах почвы, воздуха, смыва с рук и поверхности рабочих столов. ГОУ ВПО УГТУ-УПИ – 2005 Стр. 20 из 40 Сакович Г.С., Безматерных М.А. Физиология и количественный учет микроорганизмов Характеристики обсеменения окружающей среды микроорганизмами Микроорганизмы распространены в природе повсеместно: в почве, водоемах, на различных поверхностях, в теле человека и животных. Одним из наиболее благоприятных субстратов для развития самых разнообразных микроорганизмов является почва. Из почвы микроорганизмы попадают в воздух. В воздух и воду попадают микроорганизмы из тела человека и животных. Почва, вода, воздух могут служить источником микробного загрязнения пищевых продуктов, лекарственного сырья и препаратов, производственных помещений, а также источником заражения людей патогенными микроорганизмами. Однако определение в объектах окружающей среды патогенных микроорганизмов затруднено, так как они пребывают там временно и содержатся в небольших количествах, а методы их выявления длительны и трудоемки. Поэтому для характеристики обсеменения окружающей среды микроорганизмами определяют микробное число и содержание санитарнопоказательных микроорганизмов. Микробное число – это общее содержание микроорганизмов в единице веса или объема исследуемого объекта (1 г почвы, 1 мл Н2О, 1 м3 воздуха). Санитарно-показательные микроорганизмы - это микроорганизмы, которые постоянно содержатся в выделениях человека и некоторых теплокровных животных; не находятся в других природных резервуарах или не имеют других естественных мест обитания; после выделения в окружающую среду сохраняются жизнеспособными в течение сроков, близких к срокам выживания некоторых патогенных бактерий, выделяющихся из организма теми же путями; не могут интенсивно размножаться в окружающей среде, т. е. их количество остается постоянным определенный период времени после попадания в окружающую среду, легко обнаруживаются современными микробиологическими методами и поддаются количественному определению; являют- ГОУ ВПО УГТУ-УПИ – 2005 Стр. 21 из 40 Сакович Г.С., Безматерных М.А. Физиология и количественный учет микроорганизмов ся достаточно типичными для дифференциации от других видов и достаточно стабильными по своим признакам. Основными санитарно-показательными микроорганизмами для разных объектов окружающей среды являются следующие: E. coli, S.faecalis - для воды, E. сoli, S. faecalis, C. Perfringens - для почвы, S. haemolyticus, S. viridans, S. аureus - для воздуха, E. coli, S. faecalis, S. аureus - для предметов обихода. Для количественной характеристики микробной загрязненности почвы, воды и других объектов наиболее часто употребляют показатели: коли-титр, коли-индекс и перфрингенс-титр. Коли-титр - это наименьшее количество исследуемого материала, в котором обнаруживается жизнеспособная E. coli, коли-титр выражается в миллилитрах для воды и в граммах для твердого материала. Коли-индекс - количество клеток кишечной палочки в 1 л воды или. 1 г почвы. Санитарная оценка показателя: присутствие в объекте повышенного количества бактерий группы кишечной палочки свидетельствует о неудовлетворительном санитарном состоянии объекта. Существует два основных, принципиально различных метода количественного учета микроорганизмов в исследуемом объекте: прямой подсчет клеток под микроскопом (в счетных камерах, на фиксированных окрашенных мазках, на мембранных фильтрах) и путем культивирования на питательных средах. На плотных средах - чашечный метод Коха, на жидких средах - метод предельных разведений или метод титра. Методы прямого счета клеток под микроскопом дают возможность учесть численность, микроорганизмов в субстрате наиболее полно. Однако при этом определяются чаще всего живые и мертвые клетки. Кроме того, одно только наблюдение микроорганизмов под микроскопом не позволяет судить о том, какие процессы проводят они в данном субстрате. ГОУ ВПО УГТУ-УПИ – 2005 Стр. 22 из 40 Сакович Г.С., Безматерных М.А. Физиология и количественный учет микроорганизмов Методами высева на плотные и в жидкие питательные среды учитываются только жизнеспособные клетки микроорганизмов. Если хотят выделить и учесть как можно более широкий круг микроорганизмов, населяющих данный субстрат, используют метод Коха и при этом подбирают такую по составу среду, на которой способны развиваться микроорганизмы с различными свойствами. Но поскольку не существует универсальных питательных сред и условий выращивания, пригодных для всех видов микроорганизмов, метод высева дает возможность определить наличие на субстрате только тех микроорганизмов, которые способны расти на данных средах и в данных условиях. Для выявления санитарно-показательных микроорганизмов используют элективные среды. Количественный учет микроорганизмов путем счета колоний (чашечный метод Коха) Этот метод является наиболее распространенным для определения общей микробной обсемененности различных субстратов. Сущность чашечного метода заключается в том, что производят посев определенного объема исследуемого материала в чашки Петри с плотной питательной средой. При последующем выращивании посева в термостате из каждой клетки в результате размножения образуется колония; количество их подсчитывают. В качестве питательной среды для учета бактерий применяют мясопептонный агар, для подсчета плесневых грибов и дрожжей - сусло-агар. Работа этим методом включает три этапа: приготовление разведений, посев на плотную питательную среду в чашки Петри и подсчет выросших колоний. Приготовление разведений. Количество микроорганизмов в объектах внешней среды, как правило, велико, поэтому для получения отдельных колоний готовят ряд разведений исследуемого вещества. ГОУ ВПО УГТУ-УПИ – 2005 Стр. 23 из 40 Сакович Г.С., Безматерных М.А. Физиология и количественный учет микроорганизмов Разведения готовят в стерильной водопроводной воде или физиологическом растворе (0,5%-ый водный раствор NаСl), обычно пользуют десятикратными последовательными разведениями (1:10, 1:100, 1:1000 т. д.). При исследовании продукта твердой консистенции на технических весах отвесить, с помощью часового стекла и стерильного скальпеля пробу продукта (1-10 г), перенести в стерильную ступку и растереть в однородную массу, добавляя стерильный кварцевый песок. Полученную навеску количественно и асептически перенести в колбу со 100 мл стерильного физиологического раствора - получится 1-е разведение (1:100). Суспензию в колбе тщательно взболтать в течение 3-5 мин, стерильной пипеткой взять 1 мл полученной суспензии и перенести в пробирку с 9 мл стерильного раствора NaCl. Это второе разведение 1:103. Суспензию этого разведения перемешивают с помощью другой стерильной пипетки, вбирая и выпуская из нее полученную взвесь. Эту процедуру повторяют 3-5 раз, что обеспечивает перемешивание суспензий и уменьшает адсорбцию клеток на стенках пипетки. Затем этой же пипеткой берут 1 мл этой взвеси и переносят ее во вторую пробирку - это разведение 1:104. Таким образом, готовят и последующие разведения. Степень разведения исследуемого образца определяется предполагаемым количеством микроорганизмов в образце, и соответственно число разведений тем больше, чем больше микроорганизмов в исходном субстрате (рис. 2). Рис. 2. Схема приготовления разведений суспензии микроорганизмов и посева ГОУ ВПО УГТУ-УПИ – 2005 Стр. 24 из 40 Сакович Г.С., Безматерных М.А. Физиология и количественный учет микроорганизмов Для приготовления каждого разведения обязательно используют отдельную пипетку. Пренебрежение этим правилом может привести к получению ошибочного результата, иногда в 1000 и более раз превышающего истинный. Ошибка связана с адсорбцией микроорганизмов на стенках пипетки, в результате чего не все клетки удаляются из пипетки при приготовлении соответствующего разведения. Часть клеток, оставшаяся на стенках пипетки, может затем попасть в одно из последующих разведений, что и явится причиной получения завышенного результата. Посев на агаризованные среды в чашки Петри для поверхностного роста. В стерильные чашки Петри наливают расплавленную на кипящей водяной бане агаризованную среду, по 20-30 мл в каждую. Чашки оставляет на горизонтальной поверхности, пока не застынет агар. Затем их в большинстве случаев выдерживают 2-3 суток при 30˚ С крышками вниз для подсыхания поверхности среды и проверки ее стерильности. Для посева отбирают чашки, среда в которых осталась стерильной. Когда используют элективные среды или выделяют и учитывают микроорганизмы, требующие повышенной влажности, посев проводят сразу же или вскоре после застывания агара. Посев делают из определенных разведений в зависимости от предполагаемого количества микроорганизмов в исследуемом субстрате. Стерильной пипеткой наносят определенный объем (обычно 0,05, 0,1 или 0,2 мл) соответствующего разведения, предварительно тщательно перемешанного, на поверхность агаровой пластинки в чашке Петри. Этот объем распределяют по поверхности среды стерильным шпателем. Затем этим же шпателем проводят по всей поверхности во второй чашке, куда посевной материал не вносили. При выявлении микроорганизмов, количество которых в субстрате относительно невелико, посевной материал распределяют по поверхности среды только в одной чашке Петри. Из каждого разведения делают, таким образом, 4-6 параллельных высевов. Для параллельных рассевов из одного разведения можно пользоваться ГОУ ВПО УГТУ-УПИ – 2005 Стр. 25 из 40 Сакович Г.С., Безматерных М.А. Физиология и количественный учет микроорганизмов одной стерильной пипеткой и одним шпателем. Для посевов из разных разведений, используют новую стерильную пипетку и новый шпатель. Чашки с засеянными средами помещают в термостат, отрегулированный на определенную температуру, благоприятную для развития выявляемых микроорганизмов, перевернув их вверх дном. Для глубинного посева (в толще среды) используют обычно мерные количества плотной среды, заготовленные в пробирках по 10-15 мл. Культуру вносят в пробирки с расплавленным и охлажденным до 40-45° С агаром, а затем заливают смесь в чашку Петри. Возможен и другой способ глубинного посева: взвесь микроорганизмов вносят непосредственно в стерильную чашку Петри на дно, слегка приоткрыв крышку, а затем заливают ее расплавленным и охлажденным агаром. Среду с культурой тщательно перемешивают круговыми движениями чашки, не поднимая ее с поверхности стола. После этого чашку оставляют на столе до застывания агара. ГОУ ВПО УГТУ-УПИ – 2005 Стр. 26 из 40 Сакович Г.С., Безматерных М.А. Физиология и количественный учет микроорганизмов Самостоятельная работа Работа выполняется на двух занятиях. Задание на первое занятие: 1. Подготовка питательных сред для количественного учета микроорганизмов чашечным методом. 2. Засев питательных сред пробами почвы, воздуха, воды, смывом с рук для определения микробного числа. 3. Оформление протокола исследования. Методические указания Задачи выполняются по выбору группами по 2 человека. ЗАДАЧА 1. Определение микробного числа почвы Стерильную расплавленную среду МПА (для выявления бактерий) и сусло-агар (для выявления дрожжей и плесневых грибов) разливают каждую в 3 стерильные чашки Петри (всего 6 чашек). Навеску почвы, взятую в асептических условиях, суспендируют 2 мин в 100 мл стерильной водопроводной воды. Дают отстояться частичкам почвы в течение 5-10 мин. Из надосадочной жидкости отбирают 1 мл и переносят в другую пробирку, заполненную 9 мл стерильной водопроводной воды (разведение 1:103). Встряхивают суспензию, отбирают 1 мл надосадочной жидкости и переносят в третью пробирку с 9 мл воды (разведение 1:104). Посев производят из второй или третьей пробирки на выбор: 0,05 мл суспензии соответствующего разведения наносят на поверхность питательного агара в чашке Петри и размазывают стерильным шпателем Дригальского по поверхности плотной питательной среды (МПА и СА). Чашки переворачивают вверх дном, и чашки с МПА инкубируют при ГОУ ВПО УГТУ-УПИ – 2005 Стр. 27 из 40 Сакович Г.С., Безматерных М.А. Физиология и количественный учет микроорганизмов 37° С 48 ч, а с СА выдерживают при 24° С 6-7 суток. Подсчет выросших колоний проводится на следующем занятии. ЗАДАЧА 2. Определение микробного числа воздуха Методы микробиологического исследования воздуха подразделяют на седиментационные и аспирационные. Наиболее простым является седиментационный метод Коха: стерильные чашки Петри с плотной питательной средой открывают в местах отбора проб воздуха и выдерживают в течение определенного времени (5-30 мин), после чего закрывают и термостатируют. По количеству выросших колоний подсчитывают микробное число воздуха, пользуясь правилом Омелянского, в соответствии с которым считают, что на поверхность питательной среды площадью 100 см2 в течение 5 мин оседает столько микроорганизмов, сколько их содержится в 10 л воздуха. Каждая микробная клетка дает начало одной колонии. Зная количество выросших колоний и время экспозиции, вычисляют количество микробов, содержащихся в 1 м3 (1000 л) воздуха. Для определения микробной загрязненности воздуха расплавляют на водяной бане стерильные среды МПА и СА и разливают каждую в 3 стерильные чашки Петри (всего 6 чашек). Чашки ставят в месте отбора проб и открывают на 5, 10 и 15 мин. Время выдержки отмечают на крышке чашки. Затем чашки с МПА термостатируют при 37° С 48 ч, а с СА - при 24° С 6-7 суток, перевернув их вверх дном. Подсчет колоний ведут на следующем занятии. ГОУ ВПО УГТУ-УПИ – 2005 Стр. 28 из 40 Сакович Г.С., Безматерных М.А. Физиология и количественный учет микроорганизмов ЗАДАЧА 3. Определение микробного числа воды Микробное число воды - это общее количество микроорганизмов, содержащееся в 1 мл воды. Для санитарно-микробиологического исследования водопроводной воды пробы берут из уличных водоразборов и кранов внутренних водопроводов. Краны обжигают, затем полностью открывают и спускают воду 10 мин., а затем отбирают пробы воды с соблюдением требований асептики, не смачивая пробки, в количестве не менее 0,5 л. Если вода подвергалась хлорированию, то ее собирают в колбы, содержащие 2 мл 1,5%-ого стерильного раствора тиосульфата натрия. При посеве в агаризованную среду 1 мл воды вносят в пустую стерильную чашку Петри, куда затем наливают 10-12 мл расплавленного МПА (45° С) и тщательно перемешивают. После застывания агара посевы инкубируют при 37° С 24 ч. Из одной пробы воды засевают 3 параллельных чашки и не только на МПА, но и на сусло-агар для выявления роста дрожжей и грибов, в этом случае посевы инкубируют 2-З суток при температуре 24° С. ЗАДАЧА 4. Определение микробной загрязненности предметов обихода и рук Для анализа микробной загрязненности столов, оборудования, полотенец, халатов, рук персонала используют тампонный метод. Для этого готовят ватные тампоны, стерилизуют их, погружают в пробирки с 2 мл стерильной воды или изотонического раствора хлорида натрия, при этом тампон не должен касаться поверхности жидкости, смачивают тампон непосредственно перед взятием проб. Для отбора проб с плоских крупных поверхностей (столы) используют трафареты из проволоки или жести, которые предварительно стерилизуют фламбированием; затем накладывают их на поверхность стола, ГОУ ВПО УГТУ-УПИ – 2005 Стр. 29 из 40 Сакович Г.С., Безматерных М.А. Физиология и количественный учет микроорганизмов производят смыв влажным тампоном (салфеткой) с поверхности 100 см2, ограниченной трафаретом; тампон помещают в пробирку, добавляют еще 8 мл жидкости и тщательно прополаскивают тампон (салфетку) с последующим отжимом его. Общую микробную загрязненность определяют, засевая 1 мл смыва, в глубину расплавленного МПА в чашке Петри, как это описано для определения микробного числа воды. Посевы выращивают сутки при 37° С, подсчитывают количество выросших колоний и определяют общую микробную загрязненность данного объекта. Для выявления дрожжей и грибов делают посев на сусло-агар. Смывы с рук получают, тщательно протирая ладони, межпальцевые и подногтевые пространства влажным стерильным тампоном на деревянной пилочке. Тампон погружают в ту же пробирку, в которой он смачивался, добавляют еще 8 мл стерильной воды. Смывы с поверхности предметов содержатся в 10 мл стерильной воды (2 мл для увлажнения салфетки, 8 мл доливают к смывам), поэтому исходный смыв уже разведен 1:10. Для приготовления разведения 1:100 1 мл исходного смыва (1:10) помещают в пробирку и доливают к нему 9 мл стерильной водопроводной воды. Берут две стерильные чашки Петри, нумеруют их со стороны дна (№ 1 и 2). В первую чашку вносят 1 мл исходного разведения смыва (1:10), во вторую - 1 мл разведения 1:100. Заливают в каждую чашку 15-30 мл расплавленного и охлажденного до 35° С МПА. После застывания агара посев термостатируют при 37° С сутки. Параллельно ведут посев на 2 чашки со стерильным СА. Этот посев выдерживают при 24° С 4- 5 суток. В отчете по данной работе указать классификацию и способы стерилизации питательных сред, этапы подготовки микробиологических материалов для количественного учета чашечным методом, схему подготовки разведении и посева, описать конкретную задачу. ГОУ ВПО УГТУ-УПИ – 2005 Стр. 30 из 40 Сакович Г.С., Безматерных М.А. Физиология и количественный учет микроорганизмов Занятие 7 КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ПРИРОДНЫХ ОБЪЕКТОВ: ПОЧВЫ, ВОДЫ, ВОЗДУХА. КАЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ МИКРОФЛОРЫ Цель занятия - определение степени обсемененности бактериями изучаемого объекта; оценка чистоты воды, воздуха, рук, предметов обихода; изучение культуральных и морфологических свойств микробов, выделенных из исследуемых объектов; ознакомление с понятиями «смешанная» и «чистая» культура, задачами и методами выделения чистых культур. Вопросы для обсуждения: 1. Способы подсчета колоний, выросших в чашках Петри. 2. Признаки колоний, учитываемые при изучении культуральных свойств бактерий. 3. Определение понятий «смешанная» и «чистая» культура. 4. Задачи и методы выделения чистых культур микроорганизмов. 5. Принцип выделения чистых культур по методу Коха. 6. Определение чистоты культуры бактерий. План работы: 1. Ознакомиться с понятиями «смешанная» и «чистая» культура и методами выделения чистых культур. 2. Самостоятельная работа. Содержанием этого занятия является продолжение работы по определению микробной обсемененности объектов, а именно, подсчет выросших на твердой питательной среде колоний, изучение культуральных свойств колоний, морфологических свойств бактерий, преобладающих в объекте, и выделение чистой культуры этих бактерий. ГОУ ВПО УГТУ-УПИ – 2005 Стр. 31 из 40 Сакович Г.С., Безматерных М.А. Физиология и количественный учет микроорганизмов Выделение чистой культуры бактерий Для выявления микроорганизмов, находящихся в изучаемом объекте, определения их систематического положения (семейство, род, вид) и изучения их свойств необходимо, прежде всего, изолировать отдельные виды микробов и вырастить их в виде так называемых чистых культур, а затем идентифицировать - установить идентичность найденных видов микроорганизмов видам, описанным ранее в литературе. Чистой культурой микроорганизмов называют культуру одного вида, выращенную как потомство одной клетки. Микроорганизмы чистых культур широко используются в технологии при производстве антибиотических веществ, аминокислот, ферментов, многих пищевых продуктов (хлеб, вино, пиво, сыры и т. п.). Применение культур микробов с известными свойствами дает возможность эффективнее использовать их деятельность - получать высокий выход и надлежащее качество продукции. В естественных условиях различные объекты (почва, вода, пищевые продукты) содержат, как правило, смешанную микрофлору. Потому при изучении состава микрофлоры того или иного объекта бактериологическое исследование начинают с выделения микроорганизмов в виде чистых культур. Существует несколько методов получения чистых культур. Отличаются они между собой приемами выделения из популяции одной-единственной клетки. Чаще других используют метод, предложенный Кохом, это так называемый чашечный метод или метод истощающего посева на плотной питательной среде. Самостоятельная работа 1. Подсчет колоний, выросших на питательной среде в чашках Петри, и определение микробного числа. 2. Изучение культуральных свойств колоний, выросших на МПА и СА. ГОУ ВПО УГТУ-УПИ – 2005 Стр. 32 из 40 Сакович Г.С., Безматерных М.А. Физиология и количественный учет микроорганизмов 3. Изучение морфологических свойств бактерий и грибов, преобладающих в исследуемом объекте, путем микроскопирования фиксированных препаратов. 4. Выделение чистой культуры бактерий, преобладающих в исследуемом объекте. Методические указания 1. Подсчет колоний, выросших на питательной среде в чашках Петри и определение микробного числа Колонии бактерий подсчитывают обычно через 2 суток, колонии грибов и дрожжей - через 5-7 суток. Колонии, как правило, подсчитывают с помощью лупы, не открывая чашек Петри. Для удобства отмечают просчитанную колонию точкой на наружной стороне дна чашки, пользуясь стеклографом или чернилами по стеклу. Колонии подсчитывают следующими способами: если они изолированы друг от друга, крупные и в небольшом количестве, то обычно их считают по всей поверхности чашки; при большом количестве выросших колоний дно чашки Петри делят на секторы (4-6-8 и т. д.). Подсчитывают в 2-3 секторах, находят, среднее арифметическое на один сектор, а затем умножают на количество секторов. Или подсчитывают количество колоний в каждом секторе и результаты суммируют; если колонии очень мелкие и их много, то следует пользоваться счетным аппаратом Вольфхюгеля. Аппарат состоит из черной: доски и стеклянной пластинки, разделенной на квадраты площадью 1 см2. Чашки необходимо поставить на доску вверх дном, покрыть стеклянной пластинкой и подсчитать колонии в квадратах по диагонали (10-12), затем рассчитать среднее арифметическое на один квадрат и пересчитать на площадь всей чашки, используя формулу S = πr2. Очень удобны для подсчета колоний полуавтоматические счетчики. Для подсчета колоний чашку Петри помещают на специальный столик, подсвечиваемый снизу, и подсчитывают колонии пером с пружинным острием. ГОУ ВПО УГТУ-УПИ – 2005 Стр. 33 из 40 Сакович Г.С., Безматерных М.А. Физиология и количественный учет микроорганизмов Острием пера касаются стекла в участке, где расположена колония, и нажимают на перо. В результате на стекле остается метка, а держатель поднимается вверх, замыкая цепь, и показания счетчика увеличиваются на единицу. Лучшее разведение то, при высеве из которого на плотной питательной среде вырастает от 50 до 100 колоний. Чтобы определить степень обсемененности изучаемого объекта (микробное число) необходимо результат подсчета количества колоний в чашках Петри, помножить на знаменатель соответствующего разведения и вычислить среднее арифметическое число из полученных цифр. Среднее арифметическое число высчитывается только из цифр одного порядка. Например, при анализе посева получили следующее количество колоний в чашках Петри: I - 150, II - 95, III - 8. Полученные цифры умножаем на знаменатель соответствующего разведения: I − 150х100 = 15000 II − 95х1000 = 95000 III − 7х10000 = 70000 180000:3= 60000 Следовательно, во взятой навеске исследуемого продукта содержится 60000 бактерий. По полученным результатам рассчитывают количество бактерий в 1 г или 1 см2 исследуемого продукта. Основные этапы исследования оформляются в таблицу. При оценке микробной обсемененности поверхностей рабочих столов санитарное состояние считается отличным, если общее количество микроорганизмов на 1 см2 от 0 до 100, хорошим - от 100 до 1000, удовлетворительным - более 1000, плохим - более 10000. Воздух нестерильных помещений считается чистым при микробном числе до 1500, загрязненным - свыше 2500. ГОУ ВПО УГТУ-УПИ – 2005 Стр. 34 из 40 Сакович Г.С., Безматерных М.А. Физиология и количественный учет микроорганизмов 2. Изучение культуральных свойств колоний микроорганизмов, выросших в чашках Петри на МПА Для изучения качественного состава микрофлоры исследуемых объектов необходимо, прежде всего, изолировать отдельные виды микробов и вырастить их в виде так называемых чистых культур, а затем, изучив их свойства (культуральные, морфологические и биохимические), определить систематическое положение (семейство, род, вид) с помощью специальных определителей микроорганизмов. Чистой культурой называется масса клеток, состоящая из микроорганизмов одного вида, или потомство одной клетки. Каждая изолированная колония, как правило, являясь потомством одной клетки, будет чистой культурой. Большое значение для идентификации бактерий (семейство, род, вид) имеют культуральные признаки - это характер роста бактерий на плотных и жидких средах. Для изучения культуральных свойств бактерий необходимо выбрать на чашках Петри три хорошо обособленные колонии, причем наиболее типичные, то есть преобладающие в посеве. Затем, не открывая чашек, приступить к описанию внешних свойств колоний, обратив внимание на следующие признаки: а) форма (круглая, корневидная, неправильной формы, амебовидная, ризоидная и т. д.); б) окраска (бесцветная, грязно-белые колонии относятся к бесцветным, или пигментированная - белая, желтая, золотистая, красная, черная); в) поверхность колоний (гладкая, шероховатая, бороздчатая, складчатая, морщинистая, концентрически или радиально-исчерченная и т. д.); г) профиль колонии (плоский, выпуклый, кратерообразный, конусовидный и т. д.); ГОУ ВПО УГТУ-УПИ – 2005 Стр. 35 из 40 Сакович Г.С., Безматерных М.А. Физиология и количественный учет микроорганизмов д) блеск и прозрачность (колония блестящая, матовая, тусклая, мучнистая, прозрачная); е) размер колонии (диаметр) измеряют с помощью обычной линейки и указывают ее величину в миллиметрах. Точечными называют колонии менее 1 мм в диаметре; мелкие имеют 1-2 мм, средние - 2-4 мм и крупные - более 4 мм в диаметре; ж) край колонии (ровный, волнистый, зубчатый, бахромчатый и т. д.) определяют при малом увеличении микроскопа или с помощью лупы. Чашку помещают на предметный столик микроскопа; з) структура колонии (однородная, мелкозернистая, крупнозернистая, струйчатая и т. д.) определяется при малом увеличении микроскопа или с помощью лупы; и) консистенцию колонии определяют, прикасаясь к ее поверхности бактериологической петлей. Колония может легко сниматься с агара, быть плотной, мягкой или врастающей в агар; слизистой (прилипает к петле), тягучей, хрупкой (легко ломается при прикосновении петлей). Колонии, отличающиеся хотя бы по одному из указанных признаков, следует рассматривать как разные типы. Каждому виду бактерий свойственен определенный характер колоний, по числу типов колоний в чашках можно иметь представление о разнообразии видового состава бактерий исследуемого объекта. Описанные колонии (2-3) следует зарисовать в тетрадь. ГОУ ВПО УГТУ-УПИ – 2005 Стр. 36 из 40 Сакович Г.С., Безматерных М.А. Физиология и количественный учет микроорганизмов 3. Установление чистоты и морфологических свойств бактерий, преобладающих в исследуемом объекте. Микроскопия бактерий, окрашенных простым способом Морфологическая характеристика бактерий включает форму клеток, их сочетание и размер, подвижность, спорообразование. Изучение морфологических свойств проводят, используя методы микроскопии. Для этого готовят препараты живых и фиксированных окрашенных клеток. Фиксированный окрашенный препарат готовят по способу «простой окраски». На готовый окрашенный препарат наносят каплю иммерсионного масла и микроскопируют объективом с увеличением в 90 раз. В правильно окрашенном и хорошо промытом препарате поле зрения остается совершенно светлым и чистым, а окрашенными оказываются только клетки микроорганизмов. При микроскопировании окрашенных препаратов споры бактерий не прокрашиваются. Бактерии следует зарисовать. Убедиться в чистоте культуры. О чистоте культуры судят по однородности клеток. При микроскопировании различных участков препарата необходимо сравнить клетки бактерий. Сходство формы и размера клеток и спор (при их наличии) служит доказательством чистоты культуры. 4. Выделение чистой культуры бактерий, преобладающих в исследуемом объекте Основным методом выделения чистых культур микроорганизмов является метод, предложенный Кохом. Принцип метода заключаются в получении чистой культуры из отдельной колонии, которую считают результатом развития одной клетки. Чтобы выделить чистую культуру из исследуемого объекта, необходимо из описанных нами колоний выбрать одну, растущую наиболее изолированно и преобладающую в посеве. Затем с помощью стерильной бактериологической петли взять небольшое количество бактериальной массы из выГОУ ВПО УГТУ-УПИ – 2005 Стр. 37 из 40 Сакович Г.С., Безматерных М.А. Физиология и количественный учет микроорганизмов бранной колонии, слегка к ней прикасаясь. Необходимо внимательно следить, чтобы не задеть иглой близлежащие колонии. Петлю с бактериями ввести в пробирку с «косым» мясопептоновым агаром, коснуться поверхности в его нижней части и повести петлю вверх, скользя по поверхности агара (не взрыхляя его) в виде штриха. При отвивке необходимо соблюдать правила асептики. На пробирку наклеить этикетку с указанием фамилии студента и поставить пробирку в термостат. ГОУ ВПО УГТУ-УПИ – 2005 Стр. 38 из 40 Сакович Г.С., Безматерных М.А. Физиология и количественный учет микроорганизмов БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК 1. Гусев М.В. Микробиология : учебник. 4-е изд. / М.В. Гусев, Л.Н. Минеева. М. : Издательский центр «Академия», 2003. 464 с. 2. Шлегель Т. Общая микробиология / Т. Шлегель М. : Мир, 1987. 566 с. 3. Практикум по микробиологии. Учебное пособие / Под. ред. Н.С.Егорова. М. : изд-во Моск. ун-та, 1976. 308 с. 4. Лерина И.В., Педенко А.И. Лабораторные работы по микробиологии / И.В. Лерина, А.И. Педенко. М. : Экономика, 1986. 128 с. 5. Елинов Н.П., Заикина Н.А., Соколова И.П. Руководство к лабораторным занятиям по микробиологии / Н.П. Елинов, Н.А. Заикина, И.П. Соколова. М. : Медицина, 1988. 208 с. 6. Мудрецова-Висс К.А., Колесник С.А., Гринок Т.И. Руководство к лабораторным занятиям по микробиологии / К.А. Мудрецова-Висс, С.А. Колесник, Т.И. Гринок М. : Экономика, 1975. 152 с. 7. Промышленная микробиология / под ред. Н.С. Егорова. М. : Высшая школа, 1989. 688 с. ГОУ ВПО УГТУ-УПИ – 2005 Стр. 39 из 40 Учебное электронное текстовое издание Сакович Галина Степановна Безматерных Максим Алексеевич ФИЗИОЛОГИЯ И КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ УЧЕТ МИКРООРГАНИЗМОВ Редактор Компьютерная верстка Е.А. Ишунина А.А. Шолина Рекомендовано РИС ГОУ ВПО УГТУ-УПИ Разрешен к публикации 10.11.05. Электронный формат – PDF Формат 60х90 1/8 Издательство ГОУ-ВПО УГТУ-УПИ 620002, Екатеринбург, ул. Мира, 19 e-mail: sh@uchdep.ustu.ru Информационный портал ГОУ ВПО УГТУ-УПИ http://www.ustu.ru
