Толстых Наталья Станиславовна. ЗАО «ЭКОлаб» лабораторная диагностика сифилиса 1 Серологические исследования являются в настоящее время основным элементом клинической лабораторной диагностики сифилиса. Они решают три задачи: n n n скрининг на сифилис; диагностика сифилиса при наличии подозрений на него; контроль эффективности лечения диагностированного сифилиса 2 Динамика антителообразования при сифилисе IgG Рецидив или реинфекция Эффективное лечение IgM Реагины Недели после инфицирования 3 Нетрепонемные тесты n n Сифилис-АгКЛ-РСК реакция связывания комплемента с кардиолипиновым антигеном Сифилис-АгКЛ-РМП реакция микропреципитации и её модификация n Сифилис RPR-тест q Сифилис VDRL -тест 4 Трепонемные тесты n n n n Сифилис-РПГА –тест реакция пассивной гемагглютинации ИФТС ИФА-Антипаллидум-скрин ИФА-Антипаллидум-одностадийный ИФА-Антипаллидум-IgM ИФА-Антипаллидум-IgG иммуноферментный анализ Лайн-блот-сифилис иммунный блоттинг Сифилис-IgG-РИФ и Сифилис-IgM-РИФ реакция иммунофлюоресценции 5 Продукция ЗАО «ЭКОлаб» для серологической диагностики сифилиса Отдельные реагенты: n n n n n Комплемент сухой Сыворотка диагностическая гемолитическая для РСК Кровь баранья дефибринированная для РСК Сыворотки контрольные для диагностики сифилиса (из крови человека или кролика) Рекомбинантные антигены Treponema pallidum (TpN15, TpN17, TpN47, TmpA) 6 Сифилис -РПГА -тест Набор реагентов для определения антител к Treponema pallidum в реакции пассивной гемагглютинации. РУ № ФС 012а2006/5026012а2006/5026-06 от 29.12.06 г. Единственный отечественный набор с использованием лизатных антигенов T.pallidum (штамм Nichols), что обеспечивает его эффективность, не уступающую лучшим мировым образцам (фирмы Spinreact, Испания; Newmarket Laboratories Ltd, Великобритания; BioKit, Испания; Human, Германия.), также использующих лизатные антигены T.pallidum 7 7 Формулировка результатов РПГА В случае положительного результата в бланке направления на РПГА используется формулировка (пример): Обнаружены АТ к Т.pallidum в титре 1:2560 (положительный, 4+). q При отрицательном результате выдается следующее заключение : АТ к Т.pallidum не обнаружены (отрицательный). q Сифилис--РПГА Сифилис РПГА--тест основные характеристики Аналитическая чувствительность метода – 0,05 МЕ/мл Набор выпускается в двух вариантах комплектации: комплект № 1 – только для качественного исследования комплект № 2 – для качественного и полуколичественного исследования Наименование реагента Комплект № 1 Комплект № 2 Тест--эритроциты (ТЭ) Тест 1 фл. (8,5 мл) 2 фл. ( по 8,5 мл) Контрольные эритроциты (КЭ) 1 фл. (8,5 мл) 1 фл. (8,5 мл) Буферный раствор (БР) 1 фл. (20 (20 мл) 1 фл. (25 (25 мл) Контрольный положительный образец (К+) 1 фл. (0,5 (0,5 мл) 1 фл. (0,5 (0,5 мл) Контрольный отрицательный образец (К(К-) 1 фл. (0 (0,5 мл) 1 фл. (0 (0,5 мл) Планшет для микротитрования 2 шт. 2 шт. Объемы реагентов достаточны для исследования 100 образцов, включая контрольные К+ стандартизован по содержанию антител с использованием международного стандарта ВОЗ (NIBSC, London, UK); титр 1:2560. Исследуемые образцы – сыворотка (плазма) крови, ликвор. Время экспозиции до учета результатов – 45 мин. Экспозиция при комнатной температуре. 9 Срок годности набора – 1,5 года Схема постановки РПГА при качественном определении Внесение образцов (предварительно разведены 1:20 в БР) 1 2 3 4 6 5 К- К+ Внесение тест- эритроцитов 1 2 3 4 5 6 Иссл. образец 2 3 4 5 6 Перемешива ние соде рж имого лунок осторожным покачиванием 2 Иссл. образец 3 qВ одну из двух лунок с каждым разведенным образцом внести по 75 мкл ТЭ 4 К+ q Во вторую лунку с каждым разведенным образцом внести по 75 мкл КЭ К- К+ 1 по 25 мкл каждого образца, предварительно разведенного 1:20, в две смежные лунки. К- К+ Вне сение к онтрольных эритроцитов 1 q Внести 5 6 К- q Планшет осторожно покачать, чтобы перемешать содержимое лунок, и выдержать не менее 45 мин при комнатной температуре, после чего учесть результаты реакции. 10 Схема постановки РПГА при определении титра антител в пробах, давших положительную реакцию при качественном определении Приготовле ние серийных 2-кра тных разведений исс ледуемых и контрольных образцов 1 2 3 4 5 6 7 8 Буфер ный ра с тво р обр азец с ыво ротки, разве денный 1:20 Внесе ние контрольных и те ст- эритроцитов 1 2 3 4 6 7 8 5 Те ст-э ритр оциты q Для титрования использовать по 8 лунок в каждом ряду планшета (один ряд для каждого исследуемого образца, включая К+). В первые лунки всех рядов внести по 25 мкл соответствующих образцов, разведенных 1:20, во все остальные - по 25 мкл БР. Приготовить серийные двукратные разведения каждого образца, (от 1:40 в лунке 2 до 1:2560 в лунке 8), из лунки 8 удалить удалить 25 мкл полученного раствора. q В первую лунку каждого ряда внести по 75 мкл КЭ, во все остальные лунки по 75 мкл ТЭ Контр о льные э ритр оциты Перемешивание с одерж имого лунок осторожным пока чиванием 1 2 3 4 5 6 7 8 qПланшет осторожно покачать, чтобы перемешать содержимое лунок, и выдержать не менее 45 мин при комнатной температуре, после чего учесть результаты реакции. 11 Учет результатов РПГА 4+ 3+ 2+ 1+ или + -- Резко положительная реакция - ровный слой ("зонтик") агглютинированных эритроцитов, распределенных по дну лунки (4+) Положительная реакция – эритроциты располагаются на большей части дна лунки, при этом по периферии осадка формируется заметное кольцо (3+). Слабоположительная реакция - эритроциты располагаются на небольшой части дна лунки, формируя плотное кольцо из осадка эритроцитов с заметным просветлением в центре (2+). Неопределенная реакция – наличие небольшого рыхлого осадка эритроцитов в центральной части лунки с нечеткими краями с незначительным просветом в центре (1+ или +) Отрицательная реакция – компактный осадок ("пуговка") в центральной части дна лунки на чистом окружающем фоне (–) 12 Ложнотрицательные результаты РПГА Могут быть вызваны: n Конкуренцией между IgG и IgM за места связывания на антигене. n Феноменом «прозоны», который возникает из-за гиперпродукции А/Т. Положительная реакция наступает при большем разведении сыворотки. Для автоматизации постановки РПГА и учета ее результатов могут быть использованы отечественные аппаратноаппаратно-программные комплексы "Критерий "Критерий--2", "Эксперт"Эксперт-Лаб", импортные ридеры типа Anthos LP LP400, 400, MRX, MRX, MR7000, MR 7000, Dynateh MRXII и автоматические анализаторы типа Olimpus РК 3000. Комплекс «Эксперт-Лаб» 14 15 В серодиагностике сифилиса РПГА может использоваться для: q скрининга образцов - (простота, скорость, хорошая воспроизводимость, возможность автоматизации ) q подтверждающих исследований - (высокая чувствительность и специфичность реакции ). 16 Источники ошибок Небиологические: Небиологические: n загрязнённые плашки n неправильное пипетирование n наличие вибрации в лаборатории n температура воздуха в лаборатории выходит за рамки 1818-25 градусов. Биологические:: Биологические n Зарегистрированы ложные позитивы у больных с инфекционным мононуклеозом, боррелиозом, СКВ, у наркоманов, у больных с коллагенозами, лепрой. n Из двух стандартных трепонемных тестов (флюоресценция и гемагглютинация), РПГА даёт меньшее количество ложноположительных результатов. n В основном , встречаемость ложноположительных результатов в РПГА исследованиях очень редка у «здоровых» людей (меньше 1%). 17 Основные конкурентные преимущества набора «Сифилис--РПГА «Сифилис РПГА--тест» 1. В отличие от других аналогичных наборов отечественного производства, в которых используются рекомбинантные антигены Treponema pallidum pallidum,, в нашем наборе, как и в лучших импортных аналогах, используются нативные антигены возбудителя.. возбудителя 2. Использование для одного анализа по 75 мкл ТЭ и КЭ, хотя и повышает стоимость исследования сравнительно с другими наборами, в которых расходуется по 25 мкл этих реагентов, но зато обеспечивает существенно большую надежность (чувствительность и специфичность) исследования исследования.. 3. Стандартизация К+ (калибровка образца по международному стандарту) обеспечивает высокую воспроизводимость исследования исследования.. 4. Тест применим для исследования не только сыворотки (плазмы) крови человека, но и СМЖ СМЖ.. 5. Только в нашем наборе предусмотрен комплект № 2, позволяющий проводить как скрининговые исследования, так и определение титра антител антител.. 6. По отзывам многих специалистов набор "Сифилис "Сифилис--РПГА РПГА--тест" по своим аналитическим и потребительским характеристикам занимает первое место среди отечественных аналогов аналогов.. 18 Сифилис-АгКЛ- РМП Набор применяется при диагностике сифилиса для исследования плазмы или инактивированной сыворотки в реакции микропреципитации (РМП). СОСТАВ НАБОРА: Антиген кардиолипиновый (АгКЛ) - раствор в спирте этиловом абсолютированном трех высокоочищенных липидов: кардиолипина - 0,03 %; лецитина - 0,27 % и холестерина - 0,9 %; 10 ампул (по 2,0 мл). Раствор холин-хлорида в 0,9 % растворе натрия хлористого; 2 флакона (по 5,0 мл) или 1 флакон (10 мл). Набор рассчитан на проведение 1000 определений Срок годности – 1 год. Сифилис-АгКЛ- РСК Для проведения нетрепонемного теста при серологической диагностике сифилиса по реакции связывания комплемента (РСК). СОСТАВ НАБОРА Антиген кардиолипиновый (АгКЛ) - раствор в спирте этиловом абсолютированном трех высокоочищенных липидов: кардиолипина - 0,0175 %; лецитина - 0,0875 % и холестерина - 0,3 %; 10 ампул (по 2,0 мл). Ампульный нож. Антиген рассчитан на проведение 1000 определений. 19 Срок годности – 1 год. Сифилис-RPR-ТЕСТ Для серодиагностики сифилиса и контроля результатов его лечения. СОСТАВ НАБОРА RPR-антиген – водная 0,02 % суспензия угольных частиц сенсибилизированных смесью холестерина, кардиолипина, лецитина; содержит консервант – азид натрия в конечной концентрации 0,095 %. Положительная контрольная сыворотка (К+) Отрицательная контрольная сыворотка (К-) В комплект поставки входят также карточки для реакции, флакондиспенсер, игла дозирующая. Набор выпускается в двух вариантах комплектации: комплект № 1 (на 100 определений); комплект № 2 (на 500 определений). Быстрый скрининговый метод. Время постановки 8 Срок годности – 2 года. минут Незаменим при мониторинге эффективности лечения К (+) сдантартизован по стандарту ВОЗ (NIBSC, London, UK) Аналитическая чувствительность набора составляет1,5 МЕ/мл 20 Иммуноферментные тест-системы ИФА-Антипаллидум-скрин (антитела классов M, G, A) ИФА-Антипаллидум-одностадийный (антитела M, G, A) ИФА-Антипаллидум-IgM ИФА-Антипаллидум-IgG Исследуемые образцы – сыворотка (плазма) крови, ликвор Комплектация наборов позволяет использовать их как для ручной постановки, так и с ИФА ИФА--анализаторами. Возможно определение титра антител, в том числе по коэффициенту позитивности (КП), т.е. без использования дополнительных стрипов Аналитическая чувствительность метода – 0,02 МЕ/мл Цветная индикация растворов Срок годности = 12 месяцев. 21 Лайн--Блот Сифилис Лайн Тест-система для выявления антител к отдельным антигенам Тествозбудителя сифилиса методом иммунного блоттинга с использованием рекомбинантных антигенов. 22 Состав набора Лайн-Блот-Сифилис Маркировка Зона TpN15 Зона TmpA Контроль интенсивности реакции Стандартная схема нанесения антигенов Treponema pallidum и контролей на стрип Иммуносорбент – тест-полоски (стрипы) из нитроцеллюлозной мембраны, на каждую из которых в виде поперечных полос нанесены рекомбинантные аналоги антигенов Treponema pallidum (TpN15, TpN17, TmpA, TpN47), а также четыре контрольные полосы: контроль специфичности реакции (КАГ), контроли интенсивности окрашивания: • полоса с максимальной интенсивностью окрашивания ("3+"); • полоса со средней интенсивностью окрашивания ("1+") – служит одновременно контролем внесения образца. • полоса с минимальной интенсивностью окрашивания ("0,5+") Контрольный положительный образец (К+) Контрольный отрицательный образец (К–) Конъюгат (концентрат) – антитела козьи к IgG человека, конъюгированные со щелочной фосфатазой в стабилизирующем растворе; прозрачная фиолетового цвета жидкость. Раствор для разведения коньюгата (РРК) Раствор для разведения образцов (РРО) Субстратный раствор (СР) 10-кратный концентрат промывочного раствора (ПРх10) Образец для анализа:сыворотка (плазма) крови , ликвор Количество определений :24 включая контроли Срок годности 1 год Чувствительность и спцефичность : 100% 23 Сыворотки контрольные для диагностики сифилиса Жидкие высокоположительные, слабоположительные и отрицательные сывороткм крови человека или кролика Предназначены для контроля качества лабораторных исследований на сифилис в q q q q RPR ,РПМ, РСК ИФА, РПГА, Иммуноблотинге. Предусмотрено 4 варианта комплектации – отдельные комплекты каждого типа сывороток и полный их набор. Срок годности = 2,0 года 24 q Производство диагностических систем. q 142530, Московская обл., г. Электрогорск, ул. Буденного, д. 1 http://www.ekolab.ru q Отдел маркетинга: тел./факс: +7 (496) 433-35-29 E-mаil: market@ekolab.ru; ekolab_market@mail.ru n n q n n Представительство в г. Москве: тел./факс: +7(495) 938-8165, 938-8174 E-mаil: mosekolab@yandex.ru 25 24 Спасибо за внимание !