Биологически активные вещества, продуцируемые бактериями

Биологически активные вещества, продуцируемые бактериями рода Bacillus
Грязнева Т.Н.
ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина»
Антимикробные вещества, продуцируемые бациллами. Перспективным направлением в конструировании и совершенствовании пробиотиков является применение бактерий рода
Bacillus. Эти микроорганизмы широко распространены в природе, являются устойчивыми к литическим и пищеварительным ферментам, длительно сохраняют жизнеспособность в желудочно-кишечном тракте животных.
Среди различных представителей экзогенной микрофлоры, бациллы характеризуются
рядом преимуществ, которые позволяют считать их наиболее эффективными в качестве основы новых пробиотиков. Эти бактерии (кроме B.anthracis и B.cereus), как правило, являются
безвредными для организма животных даже в высоких концентрациях; обладают антагонистической активностью к широкому спектру патогенных и условно патогенных микроорганизмов;
характеризуются высокой ферментативной активностью, что может обусловить существенное
регулирование и стимулирование пищеварения; способны оказывать противоаллергенное и
антитоксическое действие; технологичны в производстве и стабильны при хранении.
Важная особенность бацилл состоит в том, что хорошо изучена их генетика и поэтому они
являются перспективной системой для клонирования чужеродных генов.
В настоящее время методами генетической инженерии на основе аэробных спорообразующих бактерий получены суперпродуценты различных биологически активных веществ
(колицин Е2 и др). Это открывает перспективу конструирования на основе бацилл штаммов с
заданными свойствами и использования их новых свойств.
В 90-х годах прошлого века в медицинской практике проводились широкие испытания
препарата «Биоспорин», созданного сотрудниками института микробиологии и вирусологии им.
Д.К. Заболотного НАН Украины, на основе штаммов B.subtilis ВКПМ № 2335 и B.licheniformis
ВКПМ № 2336.
Было установлено, что «Биоспорин» более эффективен по сравнению не только с пробиотиками из представителей нормального микробиоценоза желудочно-кишечного тракта (типа бифидумбактерина, лактобактерина или колибактерина), но и в сравнении с препаратами
на основе монопрописей спорообразующих бактерий (бактисубтил, споробактерин).
Таблица 1. Антибиотики, продуцируемые B.subtilis
Год открытия
1911
1944
1945
1946
1947
1948
1949
1950
1951
1952
1955
1956
1958
1964
1965
1969
1975
1978
1979
Антибиотик
Трипанотоксин
Субтилин
Субтилизин
Эндосубтилизин, Бациллин
Бацилломицин
Субтенолин
Ризос тонна-фактор, Микосубтилин, Аспергиллюс-фактор, Бацилизин, Бацилипин
Итурин
Обутин, Ксантелин, Бацилломиксин
Флювомииин, Ризобацидин, Фунгоцин, Токсимицин, Глобицин
Датемицин
Антибиотик В-456
Микобациллин, Петрин
Антибиотик 49-4
Полихлорсубтилин
Субспорин
Антибиотик 61-26, Антибиотик TL-119
Антибиотик 26а
Антибиотик 3, Полимиксин, Колистин, Бацитрацин, Тироцидин, Грамицидин С, Эдеин,
Бутирозин
2
Количество известных антибиотиков, продуцируемых спорообразующими аэробными
бактериями, в настоящее время приближается к 200. По количеству продуцируемых антибиотических веществ микроорганизмы рода Bacillus уступают лишь актиномицетам.
В доступной литературе описано более 70 различных антибиотиков, продуцируемых бактериями рода Bacillus. Некоторые из них уже широко применяются в медицине, ветеринарии,
сельском хозяйстве, пищевой промышленности и др. Это полимиксины, колистин, бацитрацин,
тиротрициновый комплекс (линейный грамицидин + тироцидин), грамицидин С, субтилин, эдеин, бутирозин.
Большинство идентифицированных антибиотиков, продуцируемых бактериями рода Bacillus – пептиды, вместе с тем, в последние годы все больше сообщений свидетельствуют о том,
что представители данной группы микроорганизмов продуцируют антибиотические вещества,
относящиеся и к другим классам соединений.
Образование антибиотиков происходит обычно в логарифмической фазе роста для многих продуцентов, однако для спорообразующих бактерий свойственны и другие сроки их продукции.
Образование пептидных антибиотиков у бацилл контролируется азотной и углеродной
репрессией; влияние репрессии на эти процессы может изменять взаимосвязь между характером роста культур и количеством образуемых антибиотиков.
Снижение синтеза антибиотика бациллами обусловлено не катаболитной репрессией углеродом, а изменением рН среды, вызванным микробным метаболизмом. Этот вывод базировался на обратном эффекте, наблюдаемом при добавлении в питательную среду CaCO3. В
дальнейшем установлено, что подавление синтеза антибиотика определяется не изменением
pH среды, а образованием из глюкозы органических кислот (уксусной и пировоградной). Их
нейтрализация снимает ингибирование синтеза антибиотиков.
Таким образом, пептидные антибиотики синтезируются бациллами-продуцентами в стадии активного роста. Расшифровка механизмов продукции антибиотиков способствует прогрессу исследований, связанных с внеклеточным синтезом пептидных антибиотиков. Внеклеточный синтез грамицидина, тироцидина, грамицидина линейного, эдеина, бацитрацина, колистина и микобациллина детально освещен в работах ученых в 70-х годах 20 века.
Биосинтетические системы бацилл, в которых происходит образование названных выше
полипептидных антибиотиков, отличаются от систем, в которых синтезируется белок. Необходимые условия для синтеза антибиотика включают, как правило, следующие компоненты:
аминокислоты, аденозин-5-трифосфат, ионы магния, редуцирующий агент и свободную от клеток надосадочную жидкость - центрифугат культуральной жидкости.
Синтезируемые бактериями рода Bacillus антибиотики подразделяются на следующие
классы:
- основные пептиды (например, эдеин), подавляющие образование 30 S-рибосомальных
комплексов и ингибирующие синтез ДНК;
- циклические олигопептиды (например, бацитрацин), подавляющие синтез клеточных
стенок;
- линейные или циклические олигопептиды, нарушающие функции мембран - грамицидин,
тироцидин В или ингибирующие синтез РНК - например, тиротрицин;
- аминогликозидные антибиотики - бутирозин.
В последние годы было достоверно установлено, что B.subtilis продуцирует такие антибиотики, как атерримин, aspergillus-фактор, бацилипин, бацилизин, бацилломиксин, бациллин,
бульбифор-мин, глобицин, датемицин, дебариоцидин, истеидин, итурин, ксантелин, микосубтилин, микобаииллин, неоцидин, обутин, петрин, полихлоросубтилин, ризобацидин, ризостониа-фактор, субтилин, субтенолин, субтенолизин, субтилизин, субспорин, токсимицин, трипанотоксин, фунгистатин, фунгоцин, флювомицин, эндосубтилизин, эумицин, антибиотики 49-4,
6633, 26а, В-456, 3, бацилломицин.
Атерримин образуется темнопигментным штаммом В.subtilis v.aterrimus. В 1957 г. из культуры выделены два антибиотических вещества, близкие по природе — атерримины А и В, которые представляют собой лактоны. Атерримины А и В характеризуются выраженным антибиотическим действием на грамположительные бактерии.
Aspergillus-фактор - антибиотическое вещество, которое получил в 1949 г. Michener М. из
культуры В.subtilis 6633. Природа антибиотика не изучена. В небольших концентрациях оказывает выраженное действие на различные виды грибов и дрожжей.
3
Субтилин был выделен из культурального фильтрата штамма В.subtilis 6633. Этот антибиотик подавляет рост ряда микроорганизмов: R.nigricans - в дозе 8,1 мкг/мл; R.solani - 0,4;
S.bataticola - 3,5; S.fructicola - 5,9; P.digitatum - 6,2; A.niger - 9,9; B.cinerea - 4,8 мкг/мг.
Бацилипины А и В описаны в 1949 г. Эти антибиотики получены из культуры В.subtilis. Бацилипины А и В оказывают выраженное бактериостатическое действие на M.phlei, S.aureus,
C.diphteriae, В.anthracis, S.enteritidis, S.typhi, E.coli.
Бацилизин - антибиотик, который так же, как и бацилипины А и В, получен в 1949 г. из
культуры В.subtilis. Антибиотик представляет собой пептид, содержащий аминокислоты: аланин, тирозин, лейцин, фенилаланин, серусодержащую аминокислоту. Оказывает бактерицидное действие на M.phlei, S.aureus, C.xerose, E.coli.
Бацилломиксин - антибиотический комплекс, описанный в 1951 г., представляет собой полипептид, в составе которого имеются глютаминовая и аспарагиновая аминокислоты, тирозин,
серии и треонин.
Бацилломицин - антибиотик, полученный в 1947 г., характеризуется высокой избирательной активностью против патогенных грибов и дрожжей. В дозах 0,025 мкг/мл подавляет рост
М.andonini, M.gypseum, T.rubrum, T.schonleini, E.floccosum, B.brasiliens, C.immitis, H.capsulatum,
M.apiospormum.
Бациллин - антибиотик, полученный из культуры В.subtilis в 1946 г. Подавляет рост грамположительных микроорганизмов (S.aureus, S.albus, S.pyogenes, S.lanceolatus) и грамотрицательных (Е.coli, S.parathyphi, Pasterella sp.). Введение бациллина мышам внутрибрюшинно в
дозе до 1000 мг/кг не вызывает патологических изменений.
Бульбиформин выделен в 1952 г. в виде концентрата. Подавляет рост грибов, не активен
в отношении бактерий. Природа этого антибиотика не изучена.
Глобицин получен из культуры В.subtilis в 1952 г. В дозе 10 мкг/мл подавляет рост
S.aureus, В.cereus, M.phlei, M.avium.
Датемицин - антибиотик, полученный в 1955 г., оказывает угнетающее действие на рост
различных грибов в дозах 50-100 мкг/мл.
Дебариоцидин выделен в 1958 г. Задерживает рост некоторых видов дрожжеподобных
грибов.
Истеидин - антибиотик, выделенный в 1959 г. Подавляет рост грибов и дрожжей.
Итурин синтезируется культурой В.subtilis v.ituriensis. Выделен в 1950 г. Антибиотик подавляет рост Е.coli, S.marcescens, S.aureus, Corynebacterium. Более выраженное действие
итурин оказывает на грибы, в том числе, на патогенные для человека и животных.
Ксантелин получен в 1951 г. Подавляет рост грамположительных, грамотрицательных,
кислотоустойчивых бактерий. Оказывает угнетающее действие на возбудителей бруцеллеза.
Микосубтилин — антибиотик, синтезируемый культурами В.subtilis, которые продуцируют
также субтилин. Микосубтилин высокоактивен в отношении ряда грибов и дрожжей. В дозе 1,5
мкг/мл подавляет рост Trichophyton sp. и U.zeae, в дозе 2,5 мкг/мл - S.fructicola, в дозе 3,75
мкг/мл оказывает угнетающее действие на T.delbruckii, Hansenulaanomala, в дозе 5,0 мкг/мл нa T.cremoris, S.rosens, C.neoformans, M.audouini, R.rubra, A.schonleini.
Микобациллин выделен и описан в 1958. В дозах 0,02 мкг/мл подавляет рост A.niger,
C.albicans. Успешно применяется при лечении грибковых поражений кожи. Подавляет также
рост грибов - возбудителей некоторых болезней растений.
Неоцидин — антибиотический концентрат, выделенный из культуры В.subtilis в 1951 г. Характеризуется бактериологическим действием на грамположительные бактерии М.tuberculosis
avium.
Обутин получен в 1951 г. И проявляет антибактериальную активность я в отношении
S.aureus, В.anthracis. По антибиотическим свойствам сходен с неоцидином.
Петрин — антибиотик, полученный в 1958 г. В дозах 6,7-40 мкг/мл подавляет рост
N.meningitis, H.pertussis, H.parapertussis, H.ihfluenzae, N.gonorrhoeae, C.diphteriae.
Полихлорсубтилин описан в 1965 г. Действует преимущественно на грамотрицательные
микроорганизмы.
Ризобацидин выделен в 1952 г. в кристаллическом виде. Представляет собой пептид,
оказывающий антибиотическое действие на возбудителей заболеваний растений.
Ризостониа-фактор получен из культуры В.subtilis 6633. Описан в 1949 г. Характеризуется
избирательной активностью в отношении ряда микроскопических грибов и дрожжей. Получен
из водного раствора культуры, которая используется для производства субтилина. Ризостониа-фактор обладает антифунгальными свойствами. Угнетает рост Rothium sp. в дозе 270
4
мкг/мл, R.nigricans - 160, R.solani - 45, S.bataticola - 64, S.fructicola - 14, P.digitatum - 68,
B.cinerea - 6,4 мкг/мл.
Субтилин продуцируется культурой В.subtilis NRRL-B 545. Характеризуется выраженным
бактерицидным действием на многие, в том числе патогенные, микроорганизмы. Высокоактивен, в частности, против T.pallidum, S.aureus, В.anthracis, В.cereus, Neisseria, M.tuberculosis.
Успешно применяется в пищевой промышленности как консервант, особенно в производстве
консервов из скоропортящихся продуктов. Прибавление небольших доз этого антибиотика
позволяет значительно уменьшить время стерилизации, что обеспечивает сохранение естественного цвета консервируемых продуктов, особенно фруктов.
Субтенолин выделен в 1948 г. Подавляет рост некоторых грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов: в дозе 16,5-22,5 мкг/мл - Pasteureulla sp.; в дозе 140-200 мкг/мл
- S.aureus; 165 мкг/мл - S.typhi.
Субтилизин описан в 1945. Обладает ферментными свойствами: лизирует Е. coli,
C.septicum, C.oedematiens, S.enteritidis, Pasteurella sp. в дозах 20 - 50 мкг/мл. Полученный из
этой же культуры препарат анализин по своим свойствам аналогичен субтилизину.
Субспорин — комплекс антибиотических веществ, образуемых штаммом В.subtilis PCI219. Известны субспорины А, В и С. Активность субспорина А не снижается после воздействия
хемо-трипсина, пепсина или карбоксипептидазы. Проявляет высокую антибиотическую активность по отношению к некоторым видам грибов и дрожжей.
Токсимицин получен в 1952 г. в виде концентрата. Проявляет антибиотические свойства в
отношении фитопатогенных грибов и В.cereus. Обладает также антивирусными свойствами.
Трипанотоксин, выделенный в 1911 г., подавляет рост Spirillum и Leishmania.
Фунгистатин (синоним - антибиотик XG) описан в 1946 г. Характеризуется выраженным
антибиотическим действием в отношении некоторых грибов, патогенных для человека, животных и растений. В дозах 4-10 мкг/мл подавляет рост T.gypseum, E.floccosum, Rhodotorula,
M.alpicans.
Фунгоцин описан в 1952 г. По антибиотическим свойствам сходен с фунгистатином и бацилломицином. Обладает противогрибной активностью. Антибиотик не диализируется, адсорбируется на активированном угле. Не инактивируется пепсином или трипсином. Не растворяется в воде, эфире, хлороформе. Молекулярная масса 1100Д.
Флювомицин (синонимы: Efsiomycin, Vivicil, Riomycin) — антибиотик, образуемый культурой В.subtilis FC-5036. Выделен в 1952 г. Наиболее выраженное действие оказывает на
S.aureus, P.vulgaris, E.coli и C.albicans.
Эндосубтилизин — антибиотик, описанный в 1946 г. В дозах 1 мкг/мл подавляет рост
S.aureus, в больших дозах - S.haemolyticus и M.tuberculosis.
Эумицин открыт в 1946 г. Оказывает наиболее выраженное антибиотическое действие в
дозе 5 мкг/мл на C.diphteria.
Среди бактерий вида В.subtilis описаны продуценты нескольких антибиотиков, которым
еще не присвоены названия. Это такие, как антибиотик 26а, антибиотик TL-119, антибиотик В456, антибиотик 49-4, антибиотик 61-26 и антибиотик, продуцируемый штаммом В.subtilis 3.
В 1978 г. Jarosz J. опубликовал данные о полипептидном антибиотике, полученном из
культуры В.subtilis 26a. Продуцент антибиотика - В.subtilis 26a – был изолирован из кишечника
личинки большой восковой моли. Указанный штамм продуцирует несколько биологически активных веществ, находящихся в смеси: это полипептидный антибиотик типа бацитрацина, бактериальный фермент, характеризующийся эндо-β-N-ацетилмура-мидгликаногидролазной активностью и неидентифицированное активное вещество. Антибиотик образуется преимущественно в стационарной фазе развития культуры — в то время, когда происходит споруляция.
В составе препарата обнаружено 12 остатков аминокислот, в их числе глютаминовая, изолейцин, лейцин, фенилаланин, лизин, гистидин, орнитин и цистин.
Антибиотик 26а не инактивируется сывороткой крови; не снижает активности под влиянием пепсина, трипсина, липазы. Максимальную антибиотическую активность проявляет в отношении микрококков и бацилл в дозах 0,078—0,3 мкг/мл. По спектру антимикробного действия
антибиотик близок к пенициллину, бацитрацину и лизоциму.
В 1975 г. был выделен антибиотик TL-119, синтезируемый культурой В.subtilis TL-119,
изолированной из почвы Таиланда. Молекулярная масса антибиотика TL-119 - 800Д; он отнесен к полипептидам. В составе антибиотика определены следующие аминокислоты: фенилаланин, треонин, аланин, валин и лейцин.
5
Об антибиотике В-456, образуемом В.subtilis, сообщил в 1956 г. Tanaka. Этот антибиотик
представляет собой препарат полипептидной природы и содержит d-тирозин. Обладает противогрибным действием.
Антибиотик 49-4 продуцируется культурой В.subtilis DINR-49-4. Описан в 1964 г. Получены
три полипептидные фракции. Аминокислотный состав всех трех фракций оказался сходным:
аспарагиновая и глютаминовая кислоты, пролин, серии, тирозин. Биологическая активность
фракций различалась. Первая наиболее активна в отношении Neurospora crassa; вторая Penicillium chrysogenum, третья - Trichophyton tonsurans. Все три выделенные антибиотические
вещества - полипептиды и отнесены к группе бацилломицина. Различаются по содержанию в
них пролина.
Антибиотик 61-26 образуется культурой В. subtilis 61-26, изолированной из почв Новой
Гвинеи. Описан в 1975 г. Анализ ИК-спектров показал, что антибиотик 61-26 является пептидом, содержащим лактон или эфирную связь (предположительные данные). Молекулярная
масса около 1200Д. Содержит следующие аминокислоты: аспарагиновую, серии, валин и изолейцин. Препарат 61-26 оказывает антибиотическое действие на грамполо-жительные бактерии, некоторые грибы и дрожжи, в том числе патогенные для человека и животных.
В 1979 г. Харченко С.Н. и соавт. описали способ борьбы с плесневением кормов при использовании штамма В.subtilis 3. Этот штамм продуцирует антибиотик, подавляющий рост некоторых грибов (Stachybotris alternans Bonord и Dendrodochium toxicum), а также патогенных и
условно патогенных бактерий: Е.coli, P.vulgaris, Ps. aeruginosa, В.anthracis, C. albicans. Согласно предварительным данным о химической природе антибиотика, это - низкомолекулярный
полипептид, в составе которого обнаружены фенилаланин, гистидин, аспарагиновая кислота.
Антибиотик растворим в воде, его водные растворы стойкие.
Штамм В.subtilis 3 используется в сельском хозяйстве для борьбы с плесневением кормов, вызываемым такими грибами, как Stachybotris alternans и Dendrodochium toxicum. Обработка кормов (солома, сено) осуществляется аэрозольным способом с использованием суспензии культуры в разведении 500 млрд. клеток на 10 л воды.
Микологическими исследованиями установлено, что при обработке культурой, например,
соломы, пораженной Stachybotris alternans, количество высеваемых из обработанного субстрата колоний гриба снижается в зависимости от продолжительности и контакта микромицета с
антагонистом: через две недели - в 6 раз, через месяц - в 23-25 раз. Кроме того, у животных
отмечается снижение заболеваемости желудочно-кишечными болезнями.
Таким образом, можно констатировать, что бациллы, и в первую очередь, B.subtilis, характеризуются широким спектром продуцируемых ими антибиотических веществ, обуславливающих их высокую антагонистическую активность в отношении различных микроорганизмов.
Поэтому, создание препаратов на основе бацилл или их метаболитов, является принципиально новым подходом к лечению бактериальных, вирусных, грибных и смешанных инфекций.
Биосинтез бактериями рода Bacillus ферментов, аминокислот и других биологически активных веществ. По данным отечественных и зарубежных ученых бактерии рода Bacillus характеризуются полиферментативными свойствами. Клетки бацилл включают набор ферментов различных классов, что обеспечивает им возможность существовать в разнообразных
субстратах.
У бацилл особенно хорошо развита система гидролаз - ферментов, катализирующих реакции гидролитического расщепления молекул. Среди гидролаз практический интерес представляют протеолитические ферменты, составляющие особый подкласс пептид-гидролаз.
Основной функцией протеолитических ферментов является расщепление белков, содержащихся в окружающей среде, и превращение их в форму, способную легко проникать внутрь
клетки. В связи с этим большинство известных протеаз функционируют как экстрацеллюлярные ферменты. Большинство пептидаз являются внутриклеточными ферментами.
Внеклеточные протеазы, кроме основных функций - катализа гидролиза экзогенных белковых субстратов, принимают участие в разложении вегетативного клеточного материала для
последующего использования в анаболических и катаболических реакциях. Протеазы В.subtilis
играют большую роль в разрушении белковых оболочек спор во время их прорастания.
Инициация споруляции обусловлена расщеплением внеклеточной сериновой протеазой
β-субъединицы РНК-полимеразы, что приводит к изменению ее матричной специфичности и
превращению в РНК-полимеразу спорулирующих клеток.
Имеются данные о том, что протеазы снимают действие белковых ингибиторов споруляции. Анализ аспорогенных мутантов у представителей рода Bacillus показал, что многие из них
6
не образуют внеклеточной протеазы и что реверсия к спорообразованию сопровождается
способностью продуцировать протеазу. Высказывается предположение об участии внеклеточных протеаз в синтезе полипептидных антибиотиков.
Наиболее активными продуцентами внеклеточных протеаз являются
В.subtilis и
В.mesentericus.
Таблица 2. Ферменты, обнаруженные у представителей рода Bacillus
Класс
Оксидоредуктазы
Трансферазы
Гидролазы
Гидролазы
Лиазы
Тривиальное название
l–Лактатдегидрогеназа
Нитратредуктаза
Пируваткиназа
Левансахараза
Рибонуклеаза
Аминопептидаза
Субтилопептидаза
Плазмин
Ксиланаза
Фосфодиэстераза
а-Амилаза
а-Амилаза К (а-1,4-глюкан-4-глюкано-гидролаза)
Дезоксирибонуклеаза
Аргиназа
β-Ацетилглюкозаминидаза
Фосфотаза фосфорилазы
Мальтаза (α-глюкозидаза)
Эстераза, сходная с карбоксилэстеразой
Ламинариназа
Треониндегидратаза
Пектатлиаза
Аконитатгидратаза (аконитаза)
Кетозо-1-фосфатальдолаза (альдолаза)
Среди 990 штаммов рода Bacillus, исследованных Maceda-Coronels и соавт. (1974), 860
расщепляли казеин на казеиновом агаре. У бацилл широко распространено свойство синтезировать фибринолитические ферменты.
У В.subtilis и В.mesentericus обнаружена способность растворять экспериментально вызванные у лабораторных животных тромбы кровеносных сосудов, а также гидролизовать фибриллярный белок эластин. Протеазы этих бактерий превращают фибрин в растворимую форму путем расщепления аргинил-глициновых связей фибрина.
Из клеток бацилл выделены и изучены внутриклеточные протеазы. Они появляются на
ранних этапах споруляции, раньше, чем протеазы в культуральной жидкости. Установлена
тесная взаимосвязь между внутриклеточными и внеклеточными протеазами спорулирующих
бактерий. Внутриклеточные протеазы способны инициировать оборот белка и принимать участие в споруляционно-специфической посттрансляционной модификации белков.
С помощью афинной хроматографии выделены в гомогенном виде внутриклеточные протеазы из В.subtilis и В.licheniformis, установлена их гомологичность, что подтверждает родство
этих двух видов.
Известны протеазы бацилл преимущественно двух типов — сериновые и металлопротеазы. Так, из В.subtilis выделены две гомогенные сериновые протеазы, отличающиеся молекулярной массой: I – 23000-24000 Д, II - 29000 Д; и смесь протеаз с молекулярной массой 26000
Д. В.subtilis может синтезировать одновременно металлопротеазы и сериновые протеазы.
Протеазы бактерий рода Bacillus делятся на щелочные и нейтральные по рН-оптимуму их
действия. Значительно реже у них обнаруживаются кислые протеазы. Наиболее известны и
хорошо изучены щелочные протеазы — субтилизин А (субтилопептидаза А), субтилизин В
(Novo), субтилизин BPN, выделенные из различных штаммов В. subtilis.
7
Из В.subtilis получена щелочная протеиназа с оптимумом действия при рН 10,5-11,0 и
температуре 55°С, устойчивая к ПАВ.
В.subtilis продуцирует и нейтральные протеазы. Оптимум их действия проявляется в диапазоне рН около 7,0. Общим признаком этих ферментов является наличие ионов металлов в
активном центре и действие ингибиторов типа ЭДТА.
Бациллы образуют обычно комплекс ферментов с близкими физико-химическими и каталитическими свойствами. Препараты щелочных протеаз из В.subtilis и В.licheniformis гетерогенны и состоят из нескольких компонентов. По скорости движения на электрофореграммах
протеолитические компоненты препаратов разделены на шесть типов, три из которых отнесены к субтилизинам.
Протеолитические ферменты привлекают большое внимание не только ввиду их распространенности и большого значения для жизни клетки, но и в связи с перспективами их применения в народном хозяйстве, медицине и ветеринарии.
Протеолитические ферменты используют в парфюмерии и косметике; в микробиологической промышленности для приготовления питательных сред; в биохимии для теоретических
исследований и др.
Протеазы внедряются в ветеринарную практику и медицину для лечения воспалительных
процессов, для очистки гнойных и некротических ран, ожогов, обмораживаний, для растворения тромбов и лечения некоторых опухолей. Разработаны промышленные способы получения
субтилизинов, протосубтилизинов, мезентеринов, амилосубтилина.
Среди других ферментов бацилл большой интерес представляют внутриклеточные литические ферменты.
В.subtilis – это первый микроорганизм, у которого была обнаружена способность лизировать не только собственные клетки, но и клетки других бактерий и грибов.
Литические ферменты бацилл представляют собой сложный комплекс, состоящий из
ферментов с различной субстратной специфичностью. Они делятся на две группы: ферменты,
участвующие в лизисе клеточных стенок бактерий, и ферменты, лизирующие клеточные стенки дрожжей и микроскопических грибов.
Бактериолитические ферменты некоторых аэробных спорообразующих бактерий проявляют высокую активность в отношении клеточных стенок M.lysodeikticus, В.megaterium,
S.aureus, P.aeruginosa, E.coli, S.typhimurium.
Литические ферменты бацилл применяются в микробиологической промышленности для
производства амилосубтилина, в животноводстве - для улучшения качества кормового белка,
в медицине - в качестве антимикробных агентов, а также - в теоретических исследованиях для
расшифровки структуры клеточных стенок микроорганизмов.
Бактерии рода Bacillus вырабатывают α- и β-амилазы, глюкозидазы, глюкозоизомеразы,
которые можно использовать для получения глюкозы, мальтозы, глюкозо-фруктозных паток.
Из этих ферментов широкое промышленное применение нашла амилаза, которая используется в пищевой промышленности.
Фермент α-амилаза гидролизует α-1,4-глюконовые связи в полисахаридах и обладает активной разжижающей способностью. Этот фермент образуется культурами В.subtilis и
В.amyloliqulfaciens.
Фермент β-амилаза является осахаривающим ферментом, гидролизующим крахмал с образованием мальтозы.
Практическое применение находят пектиназа - для мочки лубоволокнистых растений; пенициллиназа (β-лактамаза) - в медицине и фармацевтической промышленности.
Иммобилизация некоторых ферментов бацилл позволила во много раз увеличить срок
хранения ферментов и перейти к непрерывным технологическим процессам. Например, в производстве пива используют иммобилизованную протеазу В.subtilis в качестве стабилизатора
против белкового помутнения.
Оказалось возможным иммобилизовать не только ферменты, но и живые клетки, которые
в этом состоянии способны осуществлять ферментативные реакции в течение длительного
времени. Так, разработан способ включения клеток В.subtilis в 5%-ный акриламидный гель с
сохранением иммобилизованными клетками активности α-амилазы.
Благодаря высокой биохимической активности, многообразию метаболических путей
аэробные спорообразующие бактерии участвуют в биологическом разрушении чужеродных
токсических соединений и могут быть использованы для борьбы с загрязнением окружающей
среды.
8
Аэробные спорообразующие бактерии обладают способностью к повышенной экскреции
свободных аминокислот в культуральную среду и могут служить источником их получения в
крупномасштабном производстве.
Среди выделяемых бацилл большинство штаммов (до 43%) образуют лизин, 21,5%
штаммов — фенилаланин, 7% штаммов образуют цистин, метионин, гистидин; 3,5% штаммов
— триптофан.
По данным Romero и соавт. (1978), из 38 исследованных штаммов рода Bacillus, 31 образовывал аргинин, 30 - лизин, 26 - лейцин, 26 - аспарагин.
Валин в наибольших количествах накапливается в культурах В.subtilis. Концентрация валина в культуральной жидкости при выращивании В.subtilis на глюкозно-солевой среде достигает 4,8 г/л.
Аминокислоты, продуцируемые бациллами, обладают золоторастворяющими свойствами,
что имеет большое практическое значение для получения этого ценного металла в трудных
для гидрометаллургии условиях.
Аэробные спорообразующие бактерии изучаются как возможные продуценты белка. Установлено, что белковая масса бацилл содержит все незаменимые аминокислоты, за исключением серосодержащих. Выход биомассы при выращивании в ферментере с добавками мелассы составляет 15-20 г сухого вещества на 1 л питательной среды. Биомасса при этом содержит 8-9% азота, 40% белка, до 30% поли-β-оксимасляной кислоты и 10-14% РНК.
У бацилл обнаружена способность образовывать внеклеточный белок.
Бактерии рода Bacillus с 1959-60 гг. известны как продуценты пуриновых нуклеотидов,
широко используемых в пищевой промышленности в качестве приправ, а также в медицине
для лечения некоторых вирусных инфекций, тромбозов и др.
Селекционированы штаммы В.subtilis, продуцирующие в глюкозной среде при 30-32°С в
течение 60-72 ч инозита - до 11,65 г/л, гипоксантина - до 2,05 г/л, гуанозина - до 15-16 г/л. Эти
штаммы используются для получения нуклеотидов путем управляемой ферментации, в том
числе многоступенчатой, а также посредством разрушения выделяемых нуклеиновых кислот.
Бациллы могут быть источником получения ингибиторов некоторых ферментов и антагонистов витаминов. Из культуральной жидкости В.amyloliquifaciens, В.polymyxa, В.subtilis,
В.subtilis v.niger выделены ингибиторы глюкозидаз. Активными антагонистами витамина В12 у
бацилл, в частности у В. cereus, являются пептиды.
Бациллы синтезируют витамины и выделяют их в среду. Многие штаммы, изолированные
из ризосферы, продуцируют витамин В12 - до 50-60 мкг/мл. Этот витамин получают в ряде
стран промышленным путем из отселекционированных штаммов бацилл.
Ростостимулирующая активность некоторых штаммов бацилл объясняется продуцированием комплекса витаминов - тиамина, пиридоксина, пантотеновой кислоты, инозита, никотиновой кислоты.
Получены мутанты В.subtilis, синтезирующие витамин В6 (2-5 мг/л), рибофлавин и др.
Приведенные данные свидетельствуют о высокой биологической активности В.subtilis,
широком спектре синтезируемых веществ, имеющих огромное значение для современной биотехнологии и ветеринарии.