Расширенная аннотация проекта. 1. Полное наименование проекта (в соответствии с госконтрактом или соглашением) Молекулярные механизмы регуляции фосфорного и азотного метаболизма бацилл 2. Наименование программы: Федеральная целевая программа «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 годы». 3. Наименование мероприятия Программы 1.3.1 «Проведение научных исследований молодыми учеными - кандидатами наук» мероприятия 1.3 «Проведение научных исследований молодыми учеными - кандидатами наук и целевыми аспирантами в научнообразовательных центрах» направления 1 «Стимулирование закрепления молодежи в сфере науки, образования и высоких технологий» федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы, 4. Научный руководитель Ульянова Вера Владимировна, к.б.н., н.с. кафедры микробиологии 5. Ответственный исполнитель Каюмов Айрат Рашитович, к.б.н., доцент кафедры генетики 6. Описание ожидаемых (полученных) результатов с указанием конкретных планируемых характеристик и параметров объектов исследования или разработки (1-2 страницы). Проведена систематизация современных знаний о молекулярных механизмах регуляции активности генов в клетках бацилл, проанализированы экспериментальные данные о системе контроля фосфорного и азотного обмена в клетках бацилл по данным открытых источников информации. Показано, что в экспрессии генов у бактерий основную роль играют репрессоры и активаторы транскрипции, компоненты двухкомпонентных систем трансдукции сигнала. Основными белками регуляторами азотного обмена у бацилл являются белки TnrA, GlnK, GlnR и глутаминсинтетаза. Специфическим ответом бацилл на недостаток фосфора в окружающей среде служит экспрессия генов Pho регулона. PHO регулон B.subtilis насчитывает 37 генов и контролируется на уровне транскрипции двухкомпонентной системой PhoP-PhoR. Исследована активности фактора TnrA в мутантах по белкам GlnK и AmtB при различной доступности азота (избыток-недостаток-отсутствие) на основе активности бэтта-галактозидазы, находящейся под контролем TnrA-регулируемого nrg-промотора. Показано что в отстутствие белка AmtB происходит 8-кратное увеличение активности фактора транскрипции, сравнимо с конститутивным уровнем транскрипции. Инактивация белка GlnK не влияет на активность фактора транскрипции. При этом связывание фактора TnrA с частично ингибированной глутаминсинтетазой способно доолнительно подавить ее ферментативную активность. При повышении доступного азота происходит диссоциация белка TnrA из комплекса GlnK-TnrA и связывание с глутаминсинтетазой. В работе показано, что уровень АТФ определяет клеточную локализацию фактора транскрипции TnrA. 2 мМ АТФ приводит к диссоциации белка TnrA из мембраны в цитоплазму, при 8 мМ АТФ локализация становится полностью цитоплазматической. Также, после внесения АТФ до концентраций 4 и 8 мМ и последующей инкубации происходит расщепление фактора транскрипции TnrA в клеточных экстрактах. Это свидетельствует о том, что диссоциация этого белка в цитоплазму приводит к его дальнейшему протеолитическому расщеплению. Получены штаммы B.subtilis GP249 pDG148-glnK и B.subtilis GP249 pDG148-glnK94. С их помощью показано, что белок GlnK в клетках B.subtilis регулирует активность транспорта аммония белком AmtB в ответ на внутриклеточный уровень АТФ. Также в случае белка GlnK94 диссоциации фактора TnrA в цитоплазму при добавлении АТФ не происходило, и локализация оставалась всегда мембранной. Эти данные подтверждают, что концентрация АТФ определяет локализацию белка GlnK и следовательно фактора транскрипции TnrA внутри клетки. В полученных штаммах наблюдается высокая концентрация рекомбинатного белка GlnK, что не позволяет достоверно оценить роль белка GlnK в процессе протеолиза фактора TnrA. Для решения этой проблемы необходимо получить хромосомную точечную мутацию гена glnK. Показано, что регуляторные белки фосфорного обмена гомологичные PhoP, PhoR, SigB B.subtilis закодированы во всех секвенированных в настоящее время геномах бацилл, а их гены расположены в сходных генетических контекстах. Высокая степень сходства первичных структур, дивергентное происхождения генов при видообразовании, подтвержденное в том числе проведенным филогенетическим анализом, в совокупности позволяют сделать вывод о структурной и функциональной гомологии систем фосфорного обмена бацилл. PhoP и PhoR белки были успешно экспрессированы в рекомбинантной системе на основе штамма кишечной палочки и плазмиды, обеспечивающей продукцию белков при добавлении индуктора. Оптимальными условиями биосинтеза PhoP и PhoR белков стали выращивание бактерий при 30°С, индукция синтеза 0,5 мМ ИПТГ в течение 3 часов. Проведенная металл хелатная аффинная хроматография на никель сефарозе с элюцией связавшихся с носителем белков в градиенте 0,5 М имидазола в фосфатном буфере и последующей гель-фильтрацией позволили получить гомогенные препараты PhoP и PhoR белков. Показано, что PhoP белок, фосфорилированный родственной гистидин киназой PhoR в присутствии АТФ, эффективно связывается с промоторами генов стрессового белка ykoL B.subtilis и рибонуклеаз B.pumilus и B.altitudinis. Однако и нефосфорилированная форма белка PhoP образует комплекс с указанными ДНК мишенями. Белок PhoP не обладал способностью специфически взаимодействовать с промотором гена рибонуклеазы B.circulans. 7. Библиографическое описание публикации по проекту и гиперссылки на публикации на персональных страницах. 1. Федорова К.П., Тарасов Н.В., Халитова А.В., Ильинская О.Н., Барабанщиков Б.И., Каюмов А.Р. Влияние белков AmtB, GlnK и глутаминсинтетазы на активность фактора транскрипции TnrA в клетках Bacillus subtilis // Цитология. -2012, Т.54, №12. С.898-901. 2. Дудкина Е.В., Ульянова В.В., Шах Махмуд Р., Гальцова А.К., Вершинина В.И., Ильинская О.Н. Получение новой секретируемой рибонуклеазы Bacillus sp. на основе рекомбинантного штамма Bacillus megaterium // Естественные и технические науки (подана в печать) 3. Акименко А.С., Шах Махмуд Р., Ульянова В.В., Вершинина В.И. Фосфатрегулируемая внеклеточная рибонуклеаза Bacillus coagulans. Сборник тезисов всероссийской молодежной конференции «Актуальные проблемы химии и биологии», Пущино – 2012, С. 95. 4. Шах Махмуд Р., Ульянова В. В. Участие бактериальных нуклеаз в азотном обмене клеток // VII молодежная школа-конференция с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии»: сб. тезисов. – Москва, 2011. – С. 49-52. http://kpfu.ru/main?p_id=21707&p_lang=&p_type=12 http://kpfu.ru/main?p_id=26491&p_lang=&p_type=12