ФГБОУ ВПО «БРЯНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ АКАДЕМИКА И.Г. ПЕТРОВСКОГО»
реклама
ФГБОУ ВПО «БРЯНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ АКАДЕМИКА И.Г. ПЕТРОВСКОГО» Инновационный научно-образовательный центр биотехнологии и экологии На правах рукописи СМАЗНОВА ИРИНА АЛЕКСАНДРОВНА ХАРАКТЕРИСТИКА АЛЛЕЛЬНОГО ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНА BoLA-DRB3, ВЛИЯЮЩЕГО НА УСТОЙЧИВОСТЬ К ЛЕЙКОЗУ, И ГЕНОВ МОЛОЧНОЙ ПРОДУКТИВНОСТИ У БЫКОВ-ПРОИЗВОДИТЕЛЕЙ Специальность 03.02.07 – генетика Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук Нам Ирина Ян Гуковна Санкт-Петербург – 2014 2 СОДЕРЖАНИЕ Список сокращений ВВЕДЕНИЕ 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 1.1. Распространенность лейкоза крупного рогатого скота в мире и в России 1.1.1. Распространенность лейкоза крупного рогатого скота в мире 1.1.2. Распространенность лейкоза крупного рогатого скота в России 4 5 13 13 1.1.3. Характеристика распространенности лейкоза КРС в хозяйствах Брянской области 1.2. Экономический и социальный эффект от поражения КРС 16 1.8. 1.8.1. 1.8.2. 1.8.3. 1.8.4. лейкозом Строение вируса лейкоза, молекулярный механизм заражения клетки и размножения ВЛКРС, генетическое разнообразие ВЛКРС Развитие персистентного лимфоцитоза, распространение вируса в популяции BoLA - комплекс генов, определяющий устойчивость крупного рогатого скота к болезням Генетический полиморфизм гена BoLA-DRB3, связанного с устойчивостью к вирусу лейкоза крупного рогатого скота Генетический полиморфизм популяций быков – производителей, используемых для разведения КРС в России Генетические маркеры молочной продуктивности Аллельный полиморфизм гена бета-лактоглобулина Аллельный полиморфизм гена соматотропина Аллельный полиморфизм гена пролактина Аллельный полиморфизм гена каппа-казеина 2. 3. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1.3. 1.4. 1.5. 1.6. 1.7. 13 15 17 20 23 26 31 34 39 40 43 45 46 50 63 3 Генетический полиморфизм крупного рогатого скота по гену BoLA-DRB3 3.1.1. Анализ аллельного полиморфизма гена BoLA-DRB3 методом 3.1. 3.2. 3.2.1. 3.3. 3.3.1. 3.4. 3.4.1. 3.4.2. ПЦР-ПДРФ Аллельный полиморфизм гена BoLA-DRB3 у быковпроизводителей черно-пестрой и голштинской пород из разных регионов Сравнение быков-производителей черно-пестрой и голштинской пород из разных регионов по генотипам гена BoLA-DRB3 Аллельный полиморфизм гена BoLA-DRB3 у быковпроизводителей разных пород Брянской области Анализ генотипов по гену BoLA-DRB3 быков производителей разных пород Брянской области Аллельный полиморфизм быков-производителей разных пород Брянской области по генам молочной продуктивности и качества молока Анализ аллельного полиморфизма гена соматотропина у быков-производителей Брянской области Анализ аллельного полиморфизма гена β-лактоглобулина у быков-производителей Брянской области 3.4.3. Анализ аллельного полиморфизма гена пролактина у быков-производителей Брянской области 3.4.4. Анализ аллельного полиморфизма гена казеина у быков-производителей Брянской области ЗАКЛЮЧЕНИЕ ВЫВОДЫ ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПРОИЗВОДСТВУ СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ ПРИЛОЖЕНИЯ 63 63 67 74 78 83 85 86 92 96 98 101 104 105 106 127 4 ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ СОКРАЩЕНИЯ КРС – крупный рогатый скот ВЛКРС – вирус лейкоза крупного рогатого скота ПЛ – персистентный лимфоцитоз ПЦР – полимеразная цепная реакция ПЦР-ПДРФ – полимеразная цепная реакция с изучением полиморфизма длин рестрикционных фрагментов ГКГ – главный комплекс гистосовместимости BoLA – bovine leucocyte antigen MHC – major histocompatibility complex GH - соматотропин βLG - β – лактоглобулина PRL - пролактин CSN3 - каппа-казеин SNP - единичные однонуклеотидные мутации 5 ВВЕДЕНИЕ Для ускоренного развития животноводческого комплекса России необходимо использование современных подходов и методов для выявления и разведения ценных племенных животных, обладающих комплексом хозяйственно – полезных признаков, таких как устойчивость к распространенным в стране инфекционным заболеваниям, высокий генетический потенциал молочной и мясной продуктивности, качество продукции. Поэтому одним из наиболее актуальных направлений современной биотехнологии и генетики сельскохозяйственных животных является разработка ДНК-маркеров хозяйственно – ценных признаков для генотипирования животных и широкое внедрение ДНК-технологий для оценки племенного стада. Особое значение для разведения крупного рогатого скота имеет генетическая оценка быков-производителей, используемых для производства семени на государственных племенных предприятиях (станциях). Оценка быков проводится по обширному ряду показателей и признаков и включает не только параметры воспроизводительной способности самих быков (темперамент и тип нервной системы, количество и качество спермы, пригодность ее к замораживанию и оплодотворяющая способность), но и многолетнюю оценку их потомства: величину удоя коров-дочерей (максимальная молочная продуктивность выявляется в 3-5 лактацию), содержание жира и белка в молоке, индекс развития и форму вымени, интенсивность молокоотдачи, особенности экстерьера и конституции коровы и др. Стандартная процедура оценки быков-производителей по качеству потомства требует 7-8 лет, по ее итогам определяют, является ли бык - производитель улучшателем, нейтральным или ухудшателем, и по каким показателям. При этом учитывается корреляция между показателями матерей и дочерей, однородность потомства, изменение корреляции между признаками молочной продуктивности у дочерей по сравнению с их матерями, степень наследования этих признаков. Только 6 после такой длительной и трудоемкой оценки быка дают заключение о возможности использования его семени. В течение всего этого периода семя сотен быков- производителей накапливается и сохраняется, при этом сами быки могут быть выбракованы, и на госплемстанциях хранится несколько тысяч доз их семени. В развитых странах Евросоюза, США, Канаде и других странах в последние два десятилетия бурно развивается геномная селекция, и для оценки быков используется метод биочипов, позволяющий единовременно определить 54 тысячи мутации по единичным однонуклеотидным локусам (SNP). Исследователями разных стран проведена огромная работа по составлению каталога ДНК-маркеров сотен показателей, в том числе хозяйственно-ценных признаков устойчивости к инфекционным заболеваниям и стрессорным факторам внешней среды, аллелей генов, связанных с молочной продуктивностью и качеством продукции. В нашей стране пока не созданы возможности для разработки и внедрения метода геномной селекции при разведении крупного рогатого скота. Даже имеющиеся скромные возможности для проведения молекулярно-генетической оценки племенных быков используются незначительно. Исследования большой выборки быков-производителей разных пород из государственных племенных станций были проведены в работах Ковалюк (2008), Сацука (2009), Мачульской (2009): авторы изучали генетическую устойчивость к лейкозу и потенциал молочной продуктивности и качества продукции быковпроизводителей Московской, Ленинградской и Ростовской областей, Краснодарского края, Карелии, Финляндии, Норвегии. По результатам анализа аллельного полиморфизма гена BoLA-DRB3, связанного с генетической устойчивостью животных к вирусу лейкоза крупного рогатого скота (КРС). Результаты выявили существенное преобладание аллелей чувствительности к ВЛКРС (60-70%), незначительное количество генотипов с аллелями У в гетерозиготном состоянии (11-13%), практически полное отсутствие особей, несущих аллели устойчивости в гомозиготном состоянии. Авторы представили 7 данные о прогрессирующем накоплении аллелей восприимчивости к лейкозу при голштинизации черно-пестрой породы. Брянская область по сравнению с другими регионами России относительно благополучна по распространенности лейкоза, однако в 2012 году было выявлено 6,3% голов серопозитивного скота, в том числе гематологически больных животных - 434 гол., вирусоносительство зарегистрировано в 162 хозяйствах области. В некоторых товарных хозяйствах наблюдается высокий уровень поражения КРС вирусом - до 80%. Ранее нами были проведены исследования генетической устойчивости к лейкозу поголовья 2 племенных хозяйств Брянской области: СПК «Агрофирма «Культура» и ООО «Новый путь», в которых более 20 лет не были зарегистрированы заболевшие лейкозом коровы. Ежегодное обследование всего молочного стада выявляло не более 0,5% РИД - положительных животных, при этом вирусоносителей сразу выбраковывали. Результаты аллельного анализа гена BoLA-DRB3 у коров показали, что в этих хозяйствах 38,3% и 34,3% животных несут аллели устойчивости, в том числе 6,4% и 8,3% в гомозиготном состоянии. При этом 57,4% и 51,4%. коров имеют генотип Ч/Н или Ч/Ч, в том числе гомозиготных по чувствительности к вирусу - 31,9% и 24,1%. Таким образом, общее количество генотипов с аллелями чувствительности почти вдвое больше, чем генотипов, несущих аллели устойчивости (Кожевина и др., 2009; Смазнова и др., 2010; Козлов и др., 2011). Однако генетическая устойчивость к вирусу у быков-производителей Брянской области практически не изучалась, хотя эти результаты имеют важнейшее значение для создания поголовья КРС, устойчивого к болезни. Современные технологии позволяют получать 50 – 65 тыс. доз спермы от одного быка-производителя в год, и сперма от одного быка, несущего аллели устойчивости к лейкозу в гомозиготном состоянии, позволит получить за год 10-12 тысяч телят, устойчивых к вирусу. Поэтому изучение аллельного полиморфизма гена BoLA-DRB3 быков - 8 производителей Брянской области для выявления генетически устойчивых к вирусу особей является актуальной задачей для оздоровления КРС от лейкоза. Большой интерес представляет также исследование генетической устойчивости быков из племхозяйств Ленинградской области и Беларуси, в которых хозяйства Брянской области закупают сперму. Актуальность. Для животноводства страны актуальнейшей проблемой является оздоровление крупного рогатого скота от лейкоза. В настоящее время при разведении КРС используются быки-производители западной селекции (или их сперма) с генами восприимчивости к лейкозу, что приводит к накоплению в российских стадах КРС аллелей, подавляющих формирование защитных реакций и определяющих восприимчивость к вирусу лейкоза. При наличии на фермах возбудителя заболевания - ВЛКРС это приводит к постоянному росту вирусоносительства и появлению больных животных. Использование ДНК-маркеров для генотипирования быков-производителей имеет высокую актуальность для оценки генетического потенциала молочной продуктивности и качества молока и для повышения производства молока и рентабельности сыроделия. Тема диссертационной работы имеет высокую актуальность не только для Брянской области, но и для большинства других регионов России, в особенности для тех, где высок уровень поражения КРС вирусом лейкоза. Новизна Впервые был изучен аллельный полиморфизм гена BoLA-DRB3 у быковпроизводителей госплемстанции Брянской области разных пород: черно-пестрой, швицкой, симментальской, красно-пестрой и абердин-ангусской. Аллельный полиморфизм гена BoLA-DRB3 был также изучен у быков-производителей чернопестрой и голштинской пород Ленинградской области (ОАО «Невское») и быковулучшателей из «НПЦ НАН Беларуси по животноводству». 9 Установлено, что у быков черно-пестрой породы преобладают аллели чувствительности и их частота увеличивается с ростом степени голштинизации. С увеличением уровня голштинизации наблюдается сужение аллельного разнообразия гена BoLA-DRB3. У быков производителей других пород выявлено преобладание нейтральных аллелей и снижение доли аллелей чувствительности. Оценен потенциал генетической устойчивости к ВЛКРС быков- производителей из разных племепредприятий. Также впервые был изучен аллельный полиморфизм генов молочной продуктивности соматотропина, пролактина, бета-лактоглобулина и качества молока – каппа-казеина у быков-производителей госплемстанции Брянской области разных пород. Выявлены все парные аллели для каждого изучаемого гена. Цели и задачи исследований. Целью настоящей работы является исследование быков-производителей разных пород Брянской области, быков черно-пестрой породы племенной станции ОАО «Невское» и быков голштинской породы из «ЖодиноАгроПлемЭлита» НПЦ НАН Беларуси по животноводству, по устойчивости к вирусу лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС), а также изучение генетического полиморфизма быковпроизводителей разных пород Брянской области по генам молочной продуктивности. Задачи исследования: 1. Провести анализ генетической устойчивости к ВЛКРС по аллелям гена BoLA-DRB3 быков-производителей разных пород из ОАО «Брянское» - Брянская госплемстанция; 2. Провести генотипирование по гену BoLA-DRB3 быков-производителей черно-пестрой породы из ОАО «Невское» - госплемстанция Ленинградской области; 3. Анализ генетического полиморфизма гена BoLA-DRB3 у быков производителей голштинской породы из «ЖодиноАгроПлемЭлита» НПЦ НАН Беларуси по животноводству; 10 4. Провести генотипирование быков - производителей разных пород Брянской области по генам, связанным с молочной продуктивностью и качеством молока: - ген гормона роста, - ген бета-лактоглобулина, - ген пролактина, - ген каппа-казеина. Практическая значимость Установлены различия в аллельной структуре гена BoLA-DRB3 чернопестрой, швицкой, симментальской, красно-пестрой и абердин-ангусской пород у быков госплемстанции ОАО «Брянское», и черно-пестрой и голштинской пород у быков ОАО «Невское» и «ЖодиноАгроПлемЭлита». Показан невысокий уровень аллельного разнообразия по гену BoLA-DRB3 у быков-производителей чернопестрой породы. Результаты генотипического анализа быков по гену BoLA-DRB3 являются основой для проведения мероприятий по повышению генетической устойчивости стад КРС к вирусу лейкоза, и позволяют планировать племенную работу по обогащению поголовья КРС Брянской области аллелями устойчивости к ВЛКРС. Молекулярно-генетический анализ генов, связанных с молочной продуктивностью, у быков-производителей Брянской области позволяет разработать систему их использования для повышения продуктивности КРС в хозяйствах. Положения, выносимые на защиту: 1. Сравнительная характеристика по аллельному полиморфизму гена BoLADRB3 быков-производителей разных пород из ОАО «Брянское» - государственной племенной станции Брянской области. 2. Сравнительная характеристика генетической структуры быков- производителей разных пород ОАО «Брянское» - государственной племенной станции Брянской области по аллелям генов молочной продуктивности и качества молока. 11 3. Сравнительная характеристика аллельного полиморфизма по гену BoLADRB3 быков-производителей черно-пестрой и голштинской пород из ОАО «Невское» - государственной племенной станции Ленинградской области и «ЖодиноАгроПлемЭлита» Минской области. Апробация работы Материалы исследований доложены и обсуждены: Всероссийская выставка «Золотая осень», 2012 год – бронзовая медаль, 2013 год – серебряная медаль; Международная научно-практическая конференция «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине», Санкт-Петербург, 2010; Научно-практическая конференция «Интеллектуальный потенциал молодежи на службу России», Брянск, 2011; «Международная научно-практическая конференция «Трансфер инновационных биотехнологий в растениеводстве, животноводстве, медицине, экологии», Брянск, 2012; III и IV региональная научно-практическая конференция молодых исследователей и специалистов «Приоритетные направления современной науки: фундаментальные проблемы, инновационные проекты», Брянск, 2012, 2013; Международная конференция ученых «Трансфер инновационных биотехнологий в селекции растений, экологии, растениеводстве, животноводстве». Республика Беларусь, г. Брест, 2012; II Среднерусский экономический форум. Выставкапрезентация инновационных проектов молодых ученых и специалистов Центрального федерального округа и диалога с экспертами «Молодежь в инновационном пространстве. Идеи молодых в оценке компетентных профессионалов» Курск, 2013; VІІI Международная научная конференция "Факторы экспериментальной эволюции организмов", Украина, Алушта, 2013; Международная научно-практическая конференция «Научное обеспечение инновационного развития животноводства», Жодино, Беларусь, 2013; - на конкурсе УМНИК Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере; - на Всероссийской выставке-форуме РосБиоТех-2012 – золотая медаль. 12 Структура и объем работы. Диссертация изложена на 137 страницах, состоит из следующих разделов: введение, литературный обзор, материал и методика проведения исследований, результаты и обсуждение, выводы, список литературы. Работа содержит 10 таблиц, 35 рисунков и 6 приложений. Список цитируемой литературы содержит 196 источников, из них 152 на английском языке. Работа поддержана грантами: 1. Минобрнауки АВЦП 2.1.1./224 (2009-2011) «Развитие фундаментальных исследований по биотехнологии растений, животных, нанобиотехно-логии» 2. ФЦП 1.1. № 02.740.11.0285 (2009 — 2011) «Проведение фундаментальных и прикладных исследований по биотехнологии растений и животных и нанобиотехнологии и развитие малого бизнеса на основе инновационных разработок» 3. Администрация Брянской области. ХД № 125, (2008-2009) «Разработка биотехнологических подходов для повышения рентабельности животноводства в Брянской области (КРС) за счет формирования молочного стада с генетической устойчивостью к лейкозу, высоким потенциалом молочной продуктивности и высоким качеством молока». 13 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 1.1. Распространенность лейкоза крупного рогатого скота в мире и в России 1.1.1. Распространенность лейкоза крупного рогатого скота в мире Эпизоотическое благополучие в стадах крупного рогатого скота – одна из наиболее актуальных проблем современного животноводства. Персистентный лимфоцитоз (лейкоз, лейкемия) является широко распространенным и опасным вирусным заболеванием крупного рогатого скота в разных странах, в том числе и в России (Гулюкин, 2008; Ковалюк и др., 2012; Эрнст, Зиновьева, 2008). Впервые в мире лейкоз крупного рогатого скота был диагностирован О. Зидамгродским в 1878 году при исследовании опухолевых поражений у павших животных черно-пестрой породы остфризского происхождения в Восточной Пруссии (цит. по Гулюкин, 2008). Поскольку для повышения продуктивности аборигенных пород на фермы разных стран Европы завозили высокопродуктивных животных из Пруссии, лейкоз распространялся среди завозимых и местных пород скота вследствие перезаражения последних. В то время не была неизвестна природа заболевания и не были разработаны лабораторные гематологические методы исследования животных, выводы о заболеваемости животных делали только на основании вскрытия павших и вынужденно убитых животных и их количества. В масштабных исследованиях с применением иммунологических методов было показано, что вирус лейкоза КРС распространен в Европе, Азии, Америке, Африке, Австралии. В разных странах Восточной Европы эта болезнь широко распространена Подробная информация об эпидемиологической ситуации в США была собрана NAHMS (National Animal Health Monitoring). Исследования, проведенные в 2007 году, показали, что 83,9% молочного стада США были серопозитивными по ВЛКРС (то есть животные являются вирусоносителями). 14 Последние эпидемиологические данные по нескольким провинциям Канады указывают на высокую распространенность ВЛКСР, которая доходит до 89% в крупных стадах и составляет 20,8% - 37,4% в индивидуальных хозяйствах. В Южной Америке в Колумбии, Венесуэле, Чили и Уругвая было зарегистрировано вирусоносительство на уровне 34 - 50%. В Аргентине на небольших фермах и в крупных стадах уровень распространения вируса составил до 32,8% и 84% соответственно. В Бразилии распространенность вируса значительно варьирует между отдельными регионами и достигает уровня свыше 50% (Rodríguez et al, 2011). Эпидемиологическая ситуация в Азии остается неопределенной. Международная организация по борьбе с эпизоотиями (International Organization of Epizootics (OIE) признает, что ВЛКРС присутствует в Индонезии, Китае и Монголии. Удивительно, что в Камбодже и на Тайване серопозитивными были только около 5% животных. Вирусоносительство в Японии оказалось на уровне 28,6% и 68,1% на мелких стадах и крупных фермах. В Корее уровень поражения животных в мелких хозяйствах превысило 50%, при этом 86,8% крупного молочного стада были инфицировано (Рузина, 2012). В странах Ближнего Востока распространенность ВЛКРС-инфекции несколько ниже, чем в других регионах мира - около 20%. Исключения в этом регионе - Турция и Иран, где распространенность вируса в крупных стадах составляет до 48,3% и 64,7%, соответственно (Rodríguez et al., 2011). В странах Европы с высоким уровнем животноводства, а также в Беларуси лейкоз искоренен, что свидетельствует о возможности борьбы с этой инфекцией. В странах Западной Европы благодаря масштабным и дорогостоящим программам, направленным на искоренение ВЛКРС – инфекции, животноводческие фермы оздоровлены от этого патогена. Недавно страны – члены ЕЭС официально объявили, что большинство ее государств-членов свободны от этого вируса. 15 1.1.2. Распространенность лейкоза крупного рогатого скота в России В России до середины прошлого ХХ века ветеринарные врачи не имели представления о существовании лейкоза КРС как нозологической единицы (Апалькин и др., 2005). После Великой Отечественной войны вследствие массового завоза неблагополучного скота из стран Европы по контрибуции болезнь получила повсеместное стационарное распространение. В 1958 году в стране были созданы научные учреждения по данной проблеме и отделы по диагностике лейкоза КРС при ветеринарных лабораториях. Однако проведение лишь клинико-гематологического анализа не могло позволить установить истинную степень поражения поголовья скота лейкозом. Начиная с 1980 года, поголовье скота в стране стало исследоваться комплексным гематологическим и серологическим методами. В докладе Федеральной службы по ветеринарному надзору России констатируется факт, что лейкоз занимает второе место в десятке заболеваний, составляющих 80% неблагополучия в хозяйствах, где разводится крупный рогатый скот. Количество больных животных в хозяйствах Российской Федерации возросло в период с 2002 года по 2010 год с 695.9 тыс. голов до 936.2 тыс., с 1990 г. по 2008 г. количество животноводческих хозяйств, неблагополучных по лейкозу, возросло с 1476 до 2309, при этом в 2008 г. оздоровлено 292 неблагополучных пунктов, выявлено новых – 190. В 2008 году исследование по РИД 12984 тыс. животных выявило почти 1120 тыс. РИД-положительных животных (8,6%), что отражает высокую степень пораженности скота лейкозом. В 2009 году выявлено 152 первичных пункта, в 2010 г. – 248, в 2011 г. – 117. В ряде субъектов Российской Федерации в ряде товарных хозяйств заболевание лейкозом КРС составляет до 40%, вирусоносительство – до 70%, лейкоз приобрел характер эпизоотии, в отдельных хозяйствах некоторых регионов России уровень поражения КРС лейкозом составляет 90% (Гулюкин и др., 2008; Ковалюк и др., 2011). На 2009 на территории России 8 регионов имело от 101 до 182 16 неблагополучных по лейкозу хозяйств, высокий уровень поражения животных лейкозом наблюдается в Московской, Владимирской, Кировской, Новосибирской областях, Краснодарском и Алтайском краях, Татарстане и других регионах. То есть, даже очень благополучные, экономически регионы могут иметь высокий уровень заражения поголовья скота лейкозом. В 18 областях Центрального Федерального округа в 2008 году было 526 неблагополучных пункта, при этом за год был оздоровлен 81 пункт (частично из-за ликвидации хозяйства), и в то же время был зарегистрирован 21 новый неблагополучный пункт (Гулюкин и др., 2008). 1.1.3. Характеристика распространенности лейкоза КРС в хозяйствах Брянской области Основная разводимая порода в Брянской области – голштинизированная черно-пестрая (Лебедько, 20ХХ), она сильно подвержена инфицированию вирусом лейкоза КРС. Несмотря на это, по уровню распространенности лейкоза Брянская область относится к числу сравнительно благополучных регионов как по России, так и в ЦФО, входя в группу областей, имеющих до 10% неблагополучных хозяйств. В 2012 году в Брянской области было исследовано серологически 206467 гол. КРС, выявлено серопозитивного скота 13083 голов (6,3%). Гематологическим методом исследовано 34735 гол., выявлено гематологически больного скота 434 гол. (1,2%). Большинство племенных хозяйств Брянской области (14 из 17 хозяйств), как и передовые хозяйства в разных районах региона, свободны от лейкоза. В области имеется 130 хозяйств, свободных от вируса лейкоза. Вирусоносительство зарегистрировано в 162 хозяйствах. В неблагополучных пунктах исследовано по РИД всего КРС 7421 гол., выявлено реагирующих 1871 гол. (25%). Коров исследовано 4040 гол., выявлено реагирующих 1335 гол. (33%). Молодняка исследовано 3211 гол., выявлено РИД- 17 положительных 502 гол. (15,6%). Быков-производителей исследовано 113 гол., выявлено 32 гол. (28,3 %). По гематологии исследовано 6241 гол., выявлено больных 63 гол. (1 %). Для диагностики лейкоза КРС и выявления вирусоносителей в хозяйствах Брянской области в Межобластной ветеринарной лаборатории используются не только методы РИД и ИФА, которые позволяют тестировать наличие в крови антител на ВЛКРС, но и метод полимеразно-цепной реакции (ПЦР). ПЦР – очень чувствительный современный метод, он позволяет выявить наличие ВЛКРС на ранних стадиях инфицирования, и своевременно изолировать больное животное, что способствует освобождению стада от больных животных и вирусоносителей и таким образом предотвращает горизонтальную передачу вируса между животными. По данным ветеринарной службы, на начало 2008 г. в области имелось 26 неблагополучных хозяйств, на 01.01.2009 года – 22, на 1.1.2012 г. – 20 хозяйств, на 01.01.2013 года в области зарегистрировано 11 неблагополучных в отношении лейкоза пунктов. То есть прослеживается медленная, но положительная тенденция по оздоровлению КРС области от лейкоза. При этом в отдельных хозяйствах инфицированность КРС достигает 85%, за 6 месяцев 2012 года от лейкоза умерло 1530 голов КРС, из них 97% составляет молодняк. Поэтому генетические исследования устойчивости местной популяции КРС к лейкозу актуальны для успешного развития скотоводства региона. 1.2. Экономический и социальный ущерб от поражения КРС лейкозом Согласно «Обзору эпизоотической ситуации по лейкозу крупного рогатого скота в субъектах Российской федерации в 2008 году», подготовленному группой ученых под руководством акад. М.И. Гулюкина, лейкоз КРС остается заболеванием, которое наносит животноводству большой экономический ущерб, сдерживает развитие вызывает племенного дела, потерю генофонда ценных 18 высокопродуктивных семей, снижает продуктивное долголетие коров, связан с социальной опасностью от больных коров, снижает производство молока и мяса в стране. По экономическому ущербу скотоводству России лейкоз превосходит туберкулез и бруцеллез. Лейкоз наносит главный ущерб селекции и выращиванию ценных чистопородных высокопродуктивных животных. Из-за ограничений по лейкозу племенные хозяйства не могут реализовать ценных в генетическом отношении бычков и телочек, по существу они превращаются в товарных производителей молока. При лейкозе у коров наблюдается снижение молочной продуктивности и качества молока. У животных, больных лейкозом, удои уменьшаются на 5,5-10,2%, а при бессимптомной инфекции - на 2,0-7,0% (Кузин А.И., Закрепина Е.Н., 1997). В молоке и сыворотке крови таких животных снижается содержание общего белка и большинства аминокислот. Молоко лейкозных коров не может использоваться для производства детского питания. При проведении ветеринарно-санитарной экспертизы мяса лейкозных животных было установлено, что биологическая ценность мяса снижается на 3,9% при бессимптомной инфекции, на 7,7 % - при гематологической стадии заболевания, на 13,6% - при опухолевой. По органолептическим свойствам мясо животных, убитых в опухолевой стадии болезни, по признакам относится к мясу сомнительной свежести или несвежего даже при кратковременном хранении (2-3 суток) в холодильнике. Бактериологическими исследованиями установлена контаминация условно-патогенной и патогенной микрофлорой образцов мышечной ткани и внутренних органов лейкозных животных. С помощью ПЦР-метода доказано наличие провируса лейкоза в пробах охлажденного, замороженного мяса, внутренних органов и его длительная сохранность при температуре -20º С (Меньшикова, Рудакова, 2007, Меньшикова и др. 2010). 19 Потенциальную опасность представляет функциональное и структурное сходство ретровируса типа С, вызывающего лейкозы у крупного рогатого скота, с вирусами HTLV-I, HTLV-II, вызывающими Т-клеточную лейкемию у человека(HTLV 1 и 2 типов) и поражающими В-лимфоциты. Структуры геномов провируса Т-клеточного лейкоза человека и ВЛКРС аналогичны, установлена определенная гомологичность генов обоих вирусов, кодирующих внутренний структурный белок (Copeland T. D. et al., 1983; Burny A. et al., 1988; Mirsky et al., 1996; Van Regenmortel et al., 2000) Анализ геномов ВЛКРС и вируса Т- клеточного лейкоза человека, выполненный N.Sagata et al. (1985), дает основание предполагать, что эти вирусы произошли от общего предшественника. В геномах ВЛКРС и HTLV отсутствуют онкогены, не выявлены предпочтительные сайты интеграции провирусов ВЛКРС и HTLV в геном клетки хозяина (Kettmann et al., 1980a, b; Onuma et al., 1982). Исследования, проведенные в Канаде, показали наличие корреляции между распространением лейкоза коров и уровнем заболеваемости лейкемией у человека (Donham K J. et al., 1980). В ряде исследований, проведенных в Европе и Соединенных Штатах, было показано, что в отличие от большинства видов рака, которые имеют более высокие показатели заболеваемости и смертности в городских районах, лейкемия наиболее распространена среди сельского населения (Fasal E. et al., 1968; Milham S., 1971; Dorken H., Singer-Bakker H., 1972; Caldwell G.G. et al., 1973; Linos A. et al., 1978). В СССР было проведено сравнительное изучение географического распределения лейкоза у человека и КРС (Khokhlova MP, Rakhmamin T.P. 1970). В подобной работе, проведенной в республике Калмыкия отмечается сравнительно низкий процент инфицированности лейкозом крупного рогатого скота (всего по республике 1,4%, 2008), но в отдельных районах (Городовиковский, Лаганский, и пригородный Целинный), где регистрируется повышенный процент инфицированности лейкозом крупного рогатого скота, 20 отмечается и повышенная регистрация онкопатологий среди населения (Генджиева, Буваева, 2010). Хотя в настоящее время возможность заражения человека ВЛКРС не доказана, и исследования, проведенные в Краснодарском крае, эту возможность не подтвердили (Сацук, 2011), но возможность заражения человека вирусом лейкоза КРС в настоящее время не исключена. Прослеживается некоторая аналогия с ситуацией, когда мутации вируса птичьего гриппа привели к появлению штаммов, опасных для человека, что вызвало высокую заболеваемость и смертность населения в начале 20-го века (испанка, унесшая миллионы жизней людей). 1.3. Строение вируса лейкоза, молекулярный механизм заражения клетки и размножения ВЛКРС, генетическое разнообразие ВЛКРС ВЛКРС - вирус лейкоза крупного рогатого скота был открыт в 1969 году (Miller J.M. et al., 1969). Вирус относится к роду Deltaretrovirus, семейству Retroviridae, подсемейству Oncornaviridae, которое представляет собой группу РНКсодержащих вирусов (Сюрин В.Н., 1986; Ferrer, J. F. 1980; Coffin et al., 1997). Были выявлены его онкогенные свойства, доказана его инфекционность не только для крупного рогатого скота, но и для ряда других сельскохозяйственных животных (Mammerickx et al., 1980; Burny et al., 1985; Miller, Van der Maaten, 1990). В настоящее время известно, что лейкозом болеют 29 видов животных и 15 видов домашних и диких птиц (Апалькин, 2008). Зрелый вирион ВЛКРС имеет сферическую форму. Вирус состоит из центрально расположенного нуклеоида, с диаметром от 40 до 90 нм, разброс данных связан с методом фиксации и обработки препарата вируса. В центральный комплекс входят протеины и РНК, окруженные двухслойной мембраной с рецепторами на поверхности. Промежуточный слой отделяет центральную часть нуклеоида от внешней вирусной оболочки, которая представлена двухконтурной мембраной, 21 отличающейся лабильностью. На поверхности внешней оболочки выявляют выросты-шипы длиной 8-11 нм (Calafat et al., 1974; Сюрин и др., 1998; Renstrom, 2000; Гулюкин М.И., Замараева Н.В. 2000). Всего вирус состоит из 6 белков: 4 негликозилированных (р10, р12 – нуклеокапсидный, р15–матриксный, р24 – капсидный), представляющих центральный комплекс, и 2 гликозилированных: трансмембранный белок gp30 и поверхностный gp51, ответственный за инфекционность, а также активность гемагглютининов (Portetelle D., 1989; Schwartz I., Lévy D., 1994) Геном ВЛКРС состоит 8714 нуклеотидов (Sagata N.et al., 1985) и имеет структуру, представленную на рис. 1. Рисунок 1. Геном вируса лейкоза крупного рогатого скота и вируса Т-клеточной лейкемии человека 1 типа (по I. Schwartz, D. Levy, 1994) Размножение ВЛКРС происходит только на основе ДНК провируса, встроенной в геном хозяина, в процессе воспроизведения вируса участвуют 4 гена: ген gag обеспечивает синтез группоспецифического белка-предшественника структурных протеинов, ген pol – полимеразы (обратной транскриптазы и интегразы), ген prt – синтез протеазы, ген env отвечает за синтез белков наружной оболочки, участвующих в проникновении вируса внутрь клетки. Вирус имеет также район (Х), который имеет ряд открытых рамок считывания, кодирующих 22 регуляторные белки вирусной экспрессии (Tax, Rex, RIII, GIV). Белки Tax и Rex экспрессируются в инфицированных клетках, но отсутствуют в частицах вируса. Tax является траскрипционным активатором всех вирусных белков. Ген GIV необходим для размножения и проявления патогенности вируса (Kerkhofs P., 1998; Dube S. et al., 2000; Стародуб Н.Ф., Стародуб В.Н., 2003; Alkan F., 2011; Генджиева О.Б., 2012). После взаимодействия со специфическим рецептором на поверхности клеточной мембраны вирус внедряется в клетку. На молекуле РНК с помощью обратной транскриптазы Pol синтезируется провирусная ДНК, которая затем внедряется в геном клетки. Далее вирус экспрессируется в клетке, образуя вирусные РНК и белки, вирионы выходят из клетки, и цикл начинается снова (Новикова Н.А., 2007). В культуре in vitro вирус накапливается в краткосрочных культуpax лимфоцитов и располагается во внеклеточных пространствах в виде скоплений, окруженных клеточным детритом. Внутриклеточный вирус локализован в цитоплазматических вакуолях. Его размножение происходит путем почкования от цитоплазматических мембран через 3-9 часов после начала культивирования лимфоцитов (Апалькин и др., 2005). С первых недель после заражения крупного рогатого скота вирусом лейкоза происходит выработка антител к антигенам вируса р24 и gp51. На этом основана непрямая диагностика вирусоносительства. При изучении генетического разнообразия ВЛКРС у КРС черно-пестрой голштинизированной породы с разной долей голштинизации Новосибирской области и у КРС из 53 хозяйств Японии было выявлено, что встречаются животные, в организме которых циркулирует более чем один генотип вируса лейкоза одновременно (Asfaw Y. et al., 2005, Дробот Е.В., 2007). Asfaw Y. предположил, что у таких животных не могут эффективно индуцироваться иммунные реакции и развивается суперинфекция. 23 Разнообразие географических изолятов оказывает существенное влияние на серологическую диагностику вируса. Для диагностики вируса методом радиальной иммунодиффузии необходимо иметь антитела с достаточно широким диапазоном взаимодействия с антигенами. В настоящее время показано наличие семи кластеров ВЛКРС на основе 74 последовательностей гена env длиной 1329 пн. Гены env были выделены из изолятов ВЛКРС, полученных из разных регионов, эти кластеры были названы генотипами 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 (Рузина, 2012). В другой работе автор выявил 8 генетических вариантов вируса лейкоза КРС по гену env (Rola-Łuszczak M. et al., 2013). При исследовании серонегативных животных было показано, что преобладающим генотипом вируса является 6-й (Дробот, 2007): из 237 РИД – животных провирусная ДНК выявлена в 35 пробах, из них у 94,1% образцов встречается 6-й генотип ВЛКРС и в 5,9% – 1-й генотип. У РИД (–) животных соотношение 1-го и 6-го генотипа составляет 1:13, а у РИД (+) животных 1:3. Увеличение в стадах доли животных с низкой эффективностью реагирования на определенный генотип может быть связано с особенностями кровной и породной принадлежности, наличием в геноме хозяина определенных генотипов по некоторым генам цитокиновой сети или это может быть результатом сочетанной эволюции вируса и хозяина, приведшей к появлению нового генетического варианта вируса, способного более эффективно распространяться благодаря снижению собственных антигенных и иммунологических характеристик и избегать иммунного надзора (Смирнов и др., 2009). 1.4. Развитие персистентного лимфоцитоза, распространение вируса в популяции Ретровирусные инфекции имеют ряд общих существенных признаков: длительность инкубационного периода, хроническое или латентное течение, 24 пожизненная персистенция вируса и строго ограниченный круг восприимчивых животных. При ретровирусной инфекции не происходит гибели клетки, при этом клеточная пролиферация либо увеличивается, либо остается неизменной; ретровирусы имеют фермент — РНК-зависимую-ДНК-полимеразу (обратную транскриптазу или ревертазy), которая синтезирует вирусспецифическую ДНК на матрице геномной РНК ретровируса. Вирусный геном полностью или частично интегрируется в геном хозяйской клетки. В организме вирус лейкоза крупного рогатого скота может находиться в различных формах: экзогенной или инфекционной (РНК вирусов в плазме и сыворотке крови в вирусных частицах) и провирусной (ДНК в геноме лимфоидных клеток) (Апалькин и др., 2005). Репликация генома вируса лейкоза осуществляется через стадию ДНК провируса, связанного с геномом лимфоцитов. РНК вируса лейкоза в организме не продуцируются, но провирусная форма может переходить в экзогенную, т.е. инфекционную форму. Провирус, находясь в генетическом аппарате, распространяется генетическим путем подобно обычным клеточным генам и является важным фактором изменчивости генома клетки хозяина. В клетке транскрипции. подавление Так, у вирусной зараженных экспрессии животных происходит лишь на небольшая уровне часть инфицированных лимфоцитов (от 1 на 5000 до 1 на 50000) экспрессирует большое количество вирусных белков. ВЛКРС и его антигены обнаруживают в лимфоцитах инфицированных животных только после краткосрочного культивирования in vitro. Механизм подавления экспрессии ВЛКРС в организме животного до сих пор остается нерасшифрованным (Merezak C. et al. 2001; Tajima S., 2003). ВЛКРС поражает иммунокомпетентные клетки и органы иммунной системы (селезенку, лимфатические узлы и др.), обуславливая иммунную депрессию и непричастность иммунного ответа к персистенции вируса, что приводит к 25 повышению восприимчивости животных к развитию других инфекционных, инвазионных и незаразных патологий. Развитие персистентного лимфоцитоза в организме зараженного животного может протекать по-разному. ВЛКРС может длительное время находится латентном состоянии. После инкубационного периода, который длится 2-4 месяца, наступает стадия бессимптомного клинических проявлений. вирусоносительства, протекающая без каких-либо У 30% инфицированных животных при поражении вирусом ВЛКРС развивается персистентный лимфоцитоз (ПЛ), который является субклинической стадией заболевания лейкозом и проявляется в увеличении абсолютного числа вирусоносителей B-лимфоцитов вместо в персистентного периферической крови. лимфоцитоза может Иногда у проявляться персистирующая лимфопения, когда животные характеризуются отсутствием сдвигов состояния крови, а также других показателей, характерных для лейкоза, и лишь на финальной стадии лейкозного процесса наступает резкое ухудшение состояния организма (Kabeya et al., 2001; Апалькин и др., 2005). Существует два пути передачи инфекции: вертикальный (пренатально) и горизонтальный (постнатально). Раньше вертикальная передача считалась преимущественной в инфицировании ВЛКРС, на данный момент установлена небольшая вероятность (0-15%) заражения молодняка путем проникновения вируса через плацентарный барьер. При горизонтальной передаче больное животное является источником опасной инфекции, распространителем вируса. Вирус обнаруживается в молоке, мясе, в выделениях больных животных. Доказано, что на ВЛКРС губительно действуют биологические жидкости организма (сперма, экстральный секрет, моча), химические факторы, а также заквашивание молока при кислотности 4,75. Устойчивость ВЛКРС во внешней среде невысокая. Он чувствителен к температурным воздействиям. Разрушается при нагревании до 56°С в течение 30 минут. Вирус не обнаруживают в молоке уже через 24-48 часов при 9-15°С. Полная 26 инактивация вируса в молоке или вируссодержащей жидкости происходит при 60°С за 1 мин., при температуре 70-74°С за 17 секунд. Прямой солнечный свет инактивирует ВЛКРС в течение 4 часов, ультрафиолетовые лучи — за 30 минут. Повторное замораживание и оттаивание разрушает вирус и устраняет инфекционность. В жидком азоте инфекционность вируса сохраняется несколько лет. Вирус полностью теряет активность в растворах натриевого щелока 0,5%, этанола — 2%, формальдегида и фенола - 0,5% и других дезинфицирующих средствах в общепринятых концентрациях. Наиболее простым и экономичным методом инактивации вируса является кипячение, надежно разрушающее ВЛКРС (Baumgartener et al., 1976; Rubino, Donham, 1984, Lucas, 1992; Апалькин и др., 2005). 1.5. BoLA - комплекс генов, определяющий устойчивость крупного рогатого скота к болезням Развитие персистентного лимфоцитоза или лимфопении возможно в определенных условиях. Этими условиями являются с одной стороны недостаточное или неполноценное питание, что ослабляет иммунитет, влияние стрессовых факторов, состояние организма вирусоносителя – истощение организма, связанное с высокой молочной продуктивностью. С другой стороны, размножение вируса и глубина протекания лейкозного процесса находятся под генетическим контролем организма – хозяина. Система защиты животных от болезней представляет собой систему антигенов у лейкоцитов, и была названа главным комплексом гистосовместимости (МНС — Major Histocompatibilty Complex). Главный комплекс гистосовместимости (MHC) играет решающую роль в определении иммунологической реактивности организма (Batra et.al., 1989; Lewin et al., 1989; Pue et al., 1995; Edwardsand, Hedrick, 1998; Ellis, Conder, 2011). МНС имеет две важные функции: ассоциация с иммунореактивностью организма в целом, а также роль антигенов в межклеточных взаимодействиях, то 27 есть гистосовместимости. устойчивостью к Исследования различным показали заболеваниям, связь особенно между после МНС и как в того, экспериментах на мышах была обнаружена ассоциация между антигенами гистосовместимости и восприимчивостью к некоторым онкогенным вирусам. В настоящее время показано существование подобной системы у всех сельскохозяйственных животных и птицы: крупного рогатого скота, лошадей, свиней, овец, коз, кур (Слепченко, 1994), и активно изучается ассоциация МНС-антигенов с восприимчивостью и резистентностью к различным заболеваниям. У человека при изучении HLA-системы (главного комплекса гистосовместимости у человека) была выявлена корреляция антигенов с более чем 30 болезнями у человека. Это послужило толчком к проведению подобных исследований у сельскохозяйственных животных. Система BoLA — это главный комплекс гистосовместимости у крупного рогатого скота. Так же, как и ГКГ у других видов, BoLA подразделяется на гены класса I, класса II и класса III (Удина И.Г., 2004). Многими исследователями изучаются ассоциативные связи между антигенами BoLA-системы и восприимчивостью животных к ВЛКРС, гемобластозам, маститам, туберкулезу, паразитарным болезням, вирусной диарее. Успех в изучении антигенов гистосовместимости крупного рогатого скота предопределен тем, что у этого вида уже открыто значительно большее число полиморфных систем (групповые антигены эритроцитов, белки, ферменты крови и молока), чем у человека и других млекопитающих. Особое значение приобретает поиск внутри МНС-локуса генов, ответственных за восприимчивость к различным болезням, что поможет в дальнейшем использовать BoLA-систему для иммуногенетического мониторинга в селекции на резистентность крупного рогатого скота по данному признаку. Система BoLA закодирована в 23 хромосоме (Петров, 1982; Hediger et al., 1991; Fries et al.,1993; Beever et al., 1996), содержит более 154 генов (Elsik et al., 2009) и разделена на три класса I, II, III (Lewin, 1999; Van Eijk et al.,1995). 28 Рисунок 2. Структура МНС крупного рогатого скота, расположенного в 23 хромосоме (цит. по Amills M.et al., 1998) Геномная организация MHC I класса очень сложна и отличается у разных видов млекопитающих (Zidi et al., 2008). Имеются данные о существовании у крупного рогатого скота по крайней мере 6 классических генов (Ellis, 2004) – в базе данных IPD-MHC утверждены и находятся 62 аллеля этих генов (http://www.ebi.ac.uk/ipd/mhc/bola/index.html); а также 4 неклассических (Davies et al., 2006) генов MHC I класса. Молекулы MHC I класса обладают высокой степенью полиморфизма, высоким уровнем экспрессии в конкретных клетках, а также способностью связывать небольшие молекулы пептида и предоставлять их Т-клеткам (Kaufman et al., 1994). Гены MHC класса II расположены в двух областях IIa и IIb (рис. 2). Эти две области разделены относительно большим расстоянием, охватывающим не менее 15 сМ от DYA региона IIb класса до DRB3 региона класса IIa. Такая организация генов II класса у КРС возникла в результате хромосомной инверсии (Band et al., 1998). 29 Подрегион BoLA класса IIa состоит из двух кластеров генов - DR и DQ. Физическое и генетическое картирование показало, что у КРС гены DR и DQ лежат в непосредственной близости, а также тесно связаны с генами класса III и I (Andersson et al., 1986a; Scott et al., 1987; Gwakisa et al., 1994). В классе IIa идентифицировано 14 генов: 1 DRA, 3 DRB (DRB1, DRB2, DRB3), 5 DQA (DQA1, DQA2, DQA3, DQA4, DQA5) и 5 DQB (DQB1,DQB2, DQB3, DQB, 5 DQB5). У КРС на гаплотип экспрессирует 1 DRA, 1 DRB ген и 1-2 DQ гена. Среди этих генов, BoLA-DRА является мономорфным (Aida et al., 1994), в то время как гены DRB3, DQA и DQB обладают высоким полиморфизмом (Lewin et al., 1999). Молекулы MHC II класса имеют α- и β- цепь, с молекулярной массой 33 кДа и 28 кДа, соответственно. Каждая из цепей содержит два внешних домена: α1 и α2, β1 и β2 домены, соответственно. Дистальные домены α1и β1 образуют антигенсвязывающий сайт (Amills et al., 1998). Ген BoLA-DRB1 является не экспрессирующимся псевдогеном из-за наличия множества стоп-кодонов. Ген BoLA-DRB2 имеет низкий уровень экспрессии (Burke et al. 1991; Russell et al., 1994) и обладает низким полиморфизмом (Muggli-Cockett & Stone, 1991). Из генов DQA высоко полиморфными являются гены BoLA-DQA1 (более 30 аллелей) (Nishino et al, 1995), BoLA-DQA2 (13 аллелей) (Morooka et al., 1995) и BoLA-DQA3 (2 аллеля) (Ballingall et al., 1998). Мономорфными являются гены BoLA-DQA4 и BoLADQA5 (Gelhaus et al., 1999b). Наиболее часто встречается ген BoLA-DQB1, а гены BoLA-DQB2, BoLA-DQB3, BoLA-DQB4 и BoLA-DQB5 могут встречаться только у удвоенных гаплотипов (Takeshima, Aida, 2006). На сегодняшний день в базе данных (IPD)-MHC определены 119 аллелей гена DRB3, 51 аллель гена DQA и 72 аллеля гена DQB (Miyasaka T. et al., 2012). Регион класса IIb включает DMA, DMB, LMP2, LMP7, TAP1 и TAP2 гены (Lewin, 1996; Davies et al., 1997; Russell et al. 1997), которые участвуют в 30 образовании и транспорте антигена, а также DOA, DOB, DYA и DYB гены, функции которых неизвестны (Левин, 1996). DY гены обнаружены только у жвачных животных, они обладают низким уровнем полиморфизма. Анализ DYA и DNB транскриптов у крупного рогатого скота показал, что они имеют открытую рамку считывания и при этом транслируют белки, состоящие из 253 и 259 аминокислот соответственно (Ballingall et al., 2004a). Гены LMP2 и LMP7 кодируют субъединицы протеасомы, которые разрушают антиген до отдельных пептидов, после узнавания его Т-клетками. TAP1 и TAP2 гены кодируют молекулы, участвующие в транспорте антигенных пептидов из цитоплазмы в просвет эндоплазматического ретикулума (Takeshima, Aida, 2006). Молекулы II класса находятся на поверхности антигенпредставляющих клеток (APC), таких как дендритные клетки, макрофаги, Влимфоциты. APC представляют чужеродные пептиды (после внутриклеточного процессинга) на своей мембране в комплексе с молекулами МНС II класса CD4+ Т-клеткам. CD4+ T-клетки могут дифференцироваться в CD4 (Th1)- воспалительные клетки, которые индуцируют воспалительный или клеточноопосредованный ответ, или в CD4(Th2) - T-хелперные клетки, индуцирующие гуморальный иммунный ответ. Дифференцировка CD4 Т-клеток зависит от цитокинов, секреция которых регулируется видом антигена, захваченного антиген-представляющей клеткой (Мешкова, 1998). III класс МНС (рис.2) включает гены С4 и BF – факторы системы комплемента, ген CYP 21 – стероид-21-гидролаза, гены TNFA и TNFB – α и β факторы некроза опухоли, а также ген HSP70 (Amills et al.,1998; Barendse et al., 1994; Schwaiger et al., 1996; Dukkipati et al., 2006). Ген HSP70 кодирует белок теплового шока 70, который представляет внутриклеточное содержимое раковых клеток иммунной системе, и играет важную роль в отторжении опухоли (Srivastava et al., 1998). Ген HPS дублируется, и было показано, что потеря одного 31 из дублированных генов приводит к развитию наследственной миопатии диафрагмальной мышцы у голштинской породы (Sugimoto et al., 2003). Высокий уровень полиморфизма многих генов МНС играет важную роль в развитии устойчивости или чувствительности животных к инфекционным заболеваниям. Корреляция между полиморфизмом генов ГКГ крупного рогатого скота и восприимчивостью и резистентностью животных к болезням изучается более чем в 30 лабораториях мира. 1.6. Генетический полиморфизм гена BoLA-DRB3, связанного с устойчивостью к вирусу лейкоза крупного рогатого скота Определяющую роль в генетической устойчивости коров к лейкозу играет ген BoLA-DRB3, аллели которого отвечают за восприимчивость или устойчивость животного к вирусу лейкоза. Ген BoLA-DRB3 обладает высоким уровнем полиморфизма и экспрессии (Groenen et al., 1990; Klein J., O'hUigin, 1995; Mikko, Andresson, 1995; Russell et al., 2004). Разные аллели данного гена играют неодинаковую роль в развитии лейкоза у КРС (van Eijk et al., 1992; Xu A. et al., 1993; Sulimova et al., 1995; Zanotti et al., 1996; Удина и др., 1998; Aida et al. 2000; Juliarena et al. 2008). Среди пород КРС России ген BoLA-DRB3 представлен 54 аллелями (или более, согласно последним данным), из которых 3 определяют устойчивость к вирусу, а 4 связаны с восприимчивостью. Показано, что животные, несущие аллели *11,*23, *28 - устойчивые (У), они не склонны к переходу лейкоза в стадию персистентного лимфоцитоза. В частности, Сулимовой Г.Е. на большой выборке было показано, что *11,*23, *28 аллели гена BoLA-DRB3.2 являются устойчивыми к лейкемии. Животные, несущие в своем генотипе аллели *22, *24,*16, *8, являются чувствительными и наиболее часто оказываются в выборке 32 гематологических больных. Остальные аллели являются нейтральными (Н) и не связаны ни с устойчивостью, ни с чувствительностью к персистентному лимфоцитозу (Сулимова и др., 1995). Носители аллелей устойчивости гена BoLA DRB3 не заболевают лейкемией, несмотря на возможное вирусоносительство. Исследованиями было доказано, что аллели устойчивости имеют доминирующее положение, и животные, несущие их в гетерозиготном состоянии, не заболевают лейкозом (van Eijk et al., 1992). При анализе нуклеотидной последовательности аллелей гена BoLA-DRB3 Xu (1993) было показано, что у всех устойчивых аллелей в 70-71-м положении находятся аминокислоты Glu-Arg. Эти аминокислоты входят в антиген-узнающий сайт молекул II класса МНС, определяют специфичность взаимодействия с антигеном и развитие полноценного иммунного ответа. У всех аллелей, определяющих чувствительность к лейкозу, в 75-78 положении имеется аминокислотная последовательность Val-Asp-Thr-Tyr(Val), расположенная в месте связывания с рецепторами Т-клеток. Лейкоцитарные антигены крупного рогатого скота имеют молекулярную структуру, показанную на рис. 3 (Kaufman et al., 1994). Они содержат несколько структурных доменов, включающих 2 высоко полиморфных домена α1 и α2, которые образуют антигенсвязывающий сайт, иммуноглобулинподобный домен α3, который соединяется с β-микроглобулином, а также трансмембранные и цитоплазматические домены (Janeway et al., 2004). 33 Рисунок 3. Молекулярная структура лейкоцитарных антигенов крупного рогатого скота I и II класса (цит. по Takeshima, Aida, 2006) Антигены I класса (гликопротеины) располагаются на поверхности всех ядерных соматических клеток, наибольшая их концентрация отмечается на лимфоцитах и макрофагах. Их основная функция заключается в представлении антигенных пептидов CD8+ T-клеткам. Они в свою очередь секретируют цитотоксины, которые убивают опухолевые и инфицированные вирусом клетки, а также клетки чужеродных трансплантантов, но сами при этом выживают (Rammensee et al., 1995; Behl et al. 2012). Meirom R. et al. (1993) установлено, что у больных персистентным лимфоцитозом животных количество лимфоцитов с несвязанными рецепторами намного выше, чем у животных без гематологического проявления заболевания. Результаты генетического анализа стад основных молочных пород свидетельствуют о том, что инфицированность животных ВЛКРС не связана с генетическими факторами (Гаврилов, Шишков, 1983; Эрнст, Шишков, 1984), т.е. практически животные почти всех пород при определенных условиях могут быть заражены вирусом. Установлено также, что инфицированные животные необязательно болеют лейкозом; частота заболевания в значительной степени 34 зависит от генотипа, то есть, клиническому и патоморфологическому проявлению болезни способствует генетическая предрасположенность и иммунологическая недостаточность организма. 1.7. Генетический полиморфизм популяций быков – производителей, используемых для разведения КРС в России При селекционном отборе племенных животных главными параметрами, по которым производится оценка и отбор перспективных особей, особенно быковпроизводителей, являются высокая молочная продуктивность, качество молока (содержание белка и жира) и показатели здоровья, в частности, устойчивость к инфекционным болезням. В развитых европейских странах, откуда в Россию поступает племенной скот (нетели и бычки) и сперма для ведущих племенных хозяйств, отсутствует проблема лейкоза, поэтому в селекционных программах этих стран не учитывается генетическая устойчивость КРС к лейкозу, и поступающие в Россию племенные животные и сперма не могут быть оценены по этому параметру, и могут иметь гены восприимчивости к вирусу лейкоза КРС. Основной вклад в генетический прогресс или регресс популяции вносят быки – производители, поскольку потенциал воспроизводства у быков несравнимо выше, чем у коров, которые приносят в среднем по 1 теленку в год. Современные технологии производства семени позволяют получать от быков по 50-70 тыс. доз спермы в год, и ежегодно можно получать по 15-20 тыс. телят с высокими племенными качествами. Поэтому генетический анализ быков по совокупности хозяйственно-ценных признаков очень важен для их отбора в селекционноплеменной работе, направленной на повышение молочной и мясной продуктивности, качества продукции, устойчивости к инфекционным болезням, а также неблагоприятным факторам внешней среды. 35 Генетические исследования быков-производителей из Московской, Ленинградской и Ростовской областей, Краснодарского края, Карелии, Финляндии, Норвегии по гену BoLA-DRB3 были проведены в работах Ковалюк (2008), Сацук (2009), Мачульской (2009). В этих работах было проведено генотипирование быковпроизводителей голштинской и черно-пестрой пород по гену BoLA-DRB3, изучена частота аллелей чувствительности и устойчивости к ВЛКРС (Ковалюк, 2008; Сацук, 2011; Мачульская, 2012). При генетическом анализе 607 быков – производителей голштинской (n=142) и черно-пестрой (n=107) пород, используемых в системе искусственного осеменения в Краснодарском крае и Ростовской области, было выявлено, что они имеют очень высокий уровень Ч/Ч генотипов – 38% и 41%, соответственно, и Ч/Н (29% и 30%). Самая малочисленная группа имела генотип У/У (по 4%). Быки – производители черно-пестрой породы (n=46) из ОАО «Московское» имели соответственно 55% Ч/Ч, 20% Ч/Н и 2% У/У (Ковалюк, 2008). В работе Сацука (2009) были изучены аллельные профили быков из различных племенных предприятий России: ОАО «Московский», ОАО «ГЦВ», ГУПП РК «Карелиягосплем», ОАО «Краснодарское», ОАО «Невское». Для каждого из этих племпредприятий характерны свои источники поступления быков – производителей. Например, в ОАО «Московское» из 57 быков голштинской породы 35 имеют немецкое происхождение, 13 – американское, 7 – российское и 2 – канадское. Напротив, большинство быков ОАО «ГЦВ» родились в России (54 из 82), 17 поступили из Дании, 9 – из Голландии, 2 – из Канады. В исследовании была прогенотипирована по локусу BoLA-DRB3 сперма 293 быков голштинской породы показано, что у голштинов преобладают генотипы Н/Н, Н/Ч и Ч/Ч (33%, 44% и 34,5%), При этом генотип У/У составляет у голштинов – 2,4%, т.е на группу 293 быка всего 7 быков. Аллельный профиль продемонстрировал абсолютное преобладание у голштинов Ч-аллелей– 59,8%, и в частности *24 – 22,0%, то есть 115 быков из 293 несут эту аллель. У-аллели обнаружены всего у 36 13,65% особей. 10,23% быков гомозиготные, и из этих 30 быков 46,7% имеют генотип 24*24 и 20% - генотип 22*22 (Сацук, 2009). Автором было показано, что длительная селекция голштинского скота на высокую молочную продуктивность привела к увеличению числа быковпроизводителей, несущих Ч-аллели, с 56,25% до 62,72% и снижению в поголовье Уаллелей 18,75% до 14,55%. Полученные результаты позволяют сделать вывод, что, несмотря на различное происхождение быков – производителей голштинской породы, описанные тенденции преобладания Ч-аллелей характерны для всех племпредприятий и количественное преимущество имеют генотипы Ч/Ч (48,31% в ОАО «Московский») или Ч/Н (53,85% в ОАО «Краснодарский). При этом практически отсутствуют носители У/У (от 0 до 4,88%), и имеется немного быков с генотипом У/Н (от 4,88% до 7,87%). В ОАО «Агрообъединение «Кубань» было прогенотипировано по гену BoLADRB3 834 коровы и 50 быков-производителей голштинской породы (ООО НПСХП «Астер»). Определено, что генетическое равновесие смещено в сторону аллелей, имеющих статус чувствительных по отношению к персистентному лимфоцитозу (Ч аллелей - 63,3 %, Н - 22,3 %, У - 14,4 %). Наиболее ценным в хозяйственном отношении генотипом является Ч/У, сочетающий в себе Ч - аллель как маркер повышенной молочной продуктивности и У - аллель - показатель высокого иммунитета (Мачульская, 2009). Айрширский скот, широко распространенный в Скандинавии, характеризуется не только высокими надоями, жирномолочностью и белковомолочностью, но высокими показателями здоровья, в этих странах отсутствует лейкоз как нозологическая единица. В работе Ковалюк было показано, что 6 лучших айрширских финских быков – производителей имеют преимущественно Н-аллели *7 и *1 (Ковалюк, 2008). 37 При анализе по локусу BoLA-DRB3 спермы 113 быков айрширской породы было выявлено, что у айрширского скота преобладает Н-аллель *7 (27,0%): 17 быков из 113 имеют генотип 7*7, 65.5% айрширского скота имеют генотип Н/Н, при этом генотип У/У у быков айрширской породы не обнаружен. У айрширских быков за 20 лет также произошли серьезные изменения в профиле генотипов: количество носителей Н/Н возросло с 52% до 67,57%, Н/Ч уменьшилось с 28% до 16,22%, У/У не было и не появилось, У/Ч не было, а стало 5,4%, Н/У уменьшилось с 16% до 8,11%, Ч/Ч было 4,0, а стало 2,7% (Сацук, 2009). В целом, у айрширов преобладает генотип Н/Н (от 57,14% до 64,29%) при полном отсутствии У/У и невысоком количестве Ч/Ч ( от 2,63% до 7,14%) - 1 бык из 38 2 быка из 28 соответственно. Практически полное отсутствие у айрширских быков генотипов У/У и У-аллелей свидетельствует, что в селекции этой породы ученым удалось избавиться от аллелей *8, *22, *24, наличие которых индуцирует развитие персистентного лимфоцитоза у животных – вирусоносителей. Таким образом, аллельные профили быков по гену BoLA-DRB3 различных племпредприятий различаются, однако общая тенденция на преобладание в голштинов У/У и У/Н генотипов, а у айрширов Н/Н прослеживание во всех популяциях. Для быков-производителей голштинов и айрширов характерна аллельная «узость» - из 54 возможных аллелей (а секвенированием определено около 100 возможных аллелей) у 391 быка обнаружено всего около 30, причем небольшое число аллелей лидирует с большим отрывом от остальных аллелей, что позволяет предполагать, что большая часть последних находится в процессе элиминации. Автор Сацук В.Ф. утверждает, что полученные результаты можно экстраполировать на голштинскую и айрширскую породы в целом. Поскольку от BoLA-DRB3 генотипа зависит наследственная устойчивость к развитию ряда заболеваний, то снижение генетического разнообразия по этому локусу может привести к ограничению пределов компетентности иммунной 38 системы у отдельных животных и далее у популяции в целом, и сделать их уязвимыми при воздействии различных патогенов. Анализ 19 быков – производителей айрширской породы, принадлежащих финской ассоциации по разведению животных (FABA), подтвердил этот вывод: быки имели 89,47% Н-аллелей и по 5,26% У-аллелей и Ч-аллелей. Селекционная работа животноводов FABA значительно снизила аллельное разнообразие коров айрширской породы (на уровне традиционного отбора и скрещивания животных исходя из нескольких основных параметров – молочной продуктивности, здоровья животных, качества молока), и молекулярно-генетический анализ не только подтверждает эту генетическую узость, но и позволяет сделать вывод о снижении общего уровня иммунной резистентности стад крупного рогатого скота (Сацук, 2008). Большинство высокопродуктивных современных быков – производителей голштинской породы произошли от 20 выдающихся быков - производителей, айрширской – от 10 быков. Поэтому интересно сравнение частоты встречаемости разных генотипов 3 линий быков, широко используемых на госплемпредприятиях: Рефлекшен Соверинг 198998 (n=66), Уес Идеал 933122 (n=110), Монтвик Чифтейн 95679 (n=48). Быки этих линий имеют очень близкие значения Ч/Ч и Ч/Н генотипов (в сумме 66,67%, 70,91%, 68,75% соответственно), во всех этих группах преобладает аллель *24 (19,7% - 29,17%), несколько ниже содержание *22 (9,09% - 18,64%). При этом количество быков – носителей генотипа У/У очень незначительно – 1-2 быка на всю популяцию. Генотип Н/Н представлен большим количеством особей - по 6,25% - 9,09% на популяцию. Группы быков одной и той же линии, содержащиеся на разных племпредприятиях, могут существенно различаться по аллельным профилям. При сравнении одинаковых линий разных племпредприятий могут выявляться большие различия, чем межлинейные. 39 Сацук (2009) делает вывод, что с помощью изучения полиморфизма аллелей гена BoLA-DRB3 установлено, что у скота голштинской породы понятие линии, как некой обособленной структуры, обладающей выраженными генетическими особенностями, в данный момент не существует, и различия между быками – производителями в большей степени зависят от того, из какой страны ввезены быки – производители конкретного предприятия. Как указывает Сацук (2009), скандинавская селекционная школа выявила быков, которые, передавая высокий потенциал молочной продуктивности, в то же время ухудшают признаки плодовитости. С помощью генотипирования животных по гену BoLA-DRB3 можно выявлять быков с высокой молочной продуктивностью в сочетании с устойчивостью к заболеваниям. При этом некоторые блоки аллелей наследуются сцепленно и остаются в неизменном виде даже через несколько поколений. Таким образом, в молочных хозяйствах России, в большей степени племенных, происходит накопление аллелей гена BoLA-DRB3, определяющих восприимчивость к лейкозу, что связано с голштинизацией коров черно-пестрой породы, которая является основной молочной породой страны. Низкий уровень животных, несущих аллели устойчивости к вирусу лейкоза КРС и высокий уровень восприимчивости при наличии в окружающей среде источников вирусной инфекции неизбежно должны были привести к массовому поражению животных, что и наблюдается в настоящее время в животноводстве Российской Федерации в целом. 1.8. Генетические маркеры молочной продуктивности крупного рогатого скота Использование метода генетических маркеров при разведении животных имеет ряд преимуществ перед традиционными методами селекции. Маркер направленная селекция делает возможным направленный отбор животных в раннем возрасте, независимо от пола и внешних условий, что в конечном итоге повышает 40 эффективность селекции. Определение генотипа методами молекулярной генетики способствует идентификации и быстрому введению предпочтительных аллелей из ресурсных популяций в популяции реципиентов с целью повышения продуктивности и устойчивости к заболеваниям улучшаемых пород животных. Получение данных о взаимосвязи аллелей анализируемых генов коров с молочной продуктивностью и качеством молока позволяет использовать генетические маркеры для совершенствования пород КРС по этим параметрам. Среди множества генов, контролирующих молочную продуктивность и качества молока, можно выделить группу мажорных генов, вносящих наибольший вклад в формирование и функционирование данного количественного признака. В качестве потенциальных маркеров молочной продуктивности могут рассматриваться разные аллели генов, непосредственно участвующих в регуляции лактации: бета-лактоглобулина (β-LGB), гена гормона роста (GH), гена пролактина (PRL), а также генов казеинов (CSN) - основных белков молока (Сулимова и др., 1991, Сулимова 1998; Дроздов, 2013). 1.8.1. Аллельный полиморфизм гена бета-лактоглобулина Бета-лактоглобулин (β-LGB) является основным сывороточным белком молока жвачных животных, он выявлен в молоке у большинства видов млекопитающих, за исключением человека, грызунов и зайцеобразных и является амфипатическим, кислотоустойчивым белком с оптимумом pH 6,5. β-LGB содержится в молоке в виде димера с молекулярной массой 36кДА, при низких и высоких значениях pH (ниже 3,5 и выше 7,5) распадается на мономеры размером 18 кДА (Kontopidis et al., 2004). Первичная структура белка представлена цепью, состоящей из 162 аминокислот. Вторичная структура образована β-складчатыми слоями (43%), αспиралями (10%) и неорганизованными структурами (47%) (рис. 4). Низкое содержание аминокислоты Pro и наличие Cys, Met и остатков цистина определяют 41 низкую стабильность LG к термической обработке. Тем не менее, глобулярная структура этого белка устойчива к действию протеолитических ферментов и кислоты желудка (Papiz M. et al., 1986). Рисунок 4. Структура субъединицы β-лактоглобулина. Линиями со стрелками обозначены β-структуры, спиралью - α-спираль (Kontopidis et al., 2004) Аминокислотные последовательности лактоглобулина у овец и коз имеют высокую степень гомологии с лактоглобулином крупного рогатого скота, и отличаются от него мутациями в шести позициях (Yahyaoui, 2003). β-LGB относится к семейству липокалиновых белков, которые выполняют ряд функций, главной из которых является связывание лиганда (Flower, 1996). Puyol et al. (1991) предположили, что лактоглобулин участвует в транспортировке ретинола и жирных кислот. β-LGB играет важную роль в метаболизме липидов, активируя липазу путем свободного поглощения жирных кислот(Perez and Calvo, 1995), и участвует в пассивной передаче иммунитета от матери к потомству (Ouwehand et al., 1997). Доказана роль бета-лактоглобулина в проявлении антимикробной активности против бактерий, вызывающих мастит и показано, что аллельный вариант А гена βLGB обладает более высокой ингибиторной активностью в отношении Staphylococcus aureus и Streptococcus uberis, чем В аллель. Варианты А и В имеют высокую частоту встречаемости (Chaneton et al., 2011). 42 Ген β-LGB крупного рогатого скота размером 4,7 тыс. п.о. находится в 11 хромосоме, состоит из 7 экзонов и 6 интронов (Martin et al., 2002). структура гена приведена на рис. 5. Рисунок 5. Структура гена β-LGB крупного рогатого скота. Интроны представлены открытыми полосами. Экзоны, обозначенные серым цветом - 5' и 3' нетранслируемые последовательности; черным цветом – часть экзона, кодирующая сигнальный пептид; сиреневым – части экзонов, кодирующие зрелый пептид. Размер экзонов дается в парах оснований (Martin et al., 2002) Полиморфизм гена LGB был обнаружен в 1957 году (Aschaffenburg and Drewry, 1957), у рода Bos (Bos taurus, Bos javanicus and Bos grunniens) известно 14 генетических вариантов β-LG – А, B, C, D, E, F, G, H, I, J, W и три неунифицированных по номенклатуре варианта X14712, EU883598 и M19088. Возникновение полиморфизма связано с нуклеотидными заменами, которые находятся во II экзоне у вариантов C, D, F, W; в III экзоне – у вариантов A, H, X14712, EU883598 и M19088; в IV экзоне – у вариантов A, G, H, I, X14712, EU883598 и M19088; в V экзоне у F и J; в VI – E, F, G (Caroli et al., 2009). У яка было обнаружено еще 4 генетических варианта β-LG. (рис 6) (Y. Cui et al., 2012). 43 Рисунок 6. Аллельные варианты гена β-LG рода Bos (Cui et al., 2012). Для каждого аллеля верхняя строчка соответствует аминокислоте, нижняя – нуклеотидной последовательности. NA обозначает нуклеотиды, неопределенные по результатам секвенирования 1.8.2. Аллельный полиморфизм гена соматотропина Гормон роста соматотропин (GH) – важнейший эндогенный фактор, обладающий лактогенным, инсулиноподобным, диабетогенным, жиромобилизирующим, и нейротропным действием. Аллельные варианты в структурной и регуляторной частях гена гормона роста интересны с точки зрения их прямого и опосредованного влияния на молочную продуктивность и качество молока. Соматотропный гормон различных видов животных и человека секретируется эозинофильными клетками передней доли гипофиза и обладает высоким консерватизмом. Синтез соматотропина крупного рогатого скота контролируется геном, локализованном в 19 хромосоме, состоящим из пяти экзонов и четырех интронов, имеющим размер порядка 2 тыс. п. о. (Hediger et al., 1990). В гене GH было 44 идентифицировано несколько мутаций. Наиболее изучена взаимосвязь продуктивности с мутацией в пятом экзоне. Данная мутация представляет собой C→G трансверсию в нуклеотидной последовательности, приводящей к замене аминокислоты лейцин на валин в 127 позиции белка (Lucy M.C. et al., 1993). Эта мутация приводит к образованию двух аллелей: L-GH и V-GH, определяемых с помощью эндонуклеазы рестрикции Alu I (Schlee P. et al., 1994). Другая мутация локализована в третьем интроне этого гена и приводит к возникновению дополнительного сайта для рестриктазы MspI (Cowan C.W. et al., 1989; Mitra A. et al., 1995). Данные по влиянию V-аллеля на фенотипическое проявление количественных признаков продуктивности в некоторых случаях противоречивы. Nai S., Fradholm et al., 1993 выявили связь полиморфных вариантов соматотропина с показателями продуктивности содержание жира (жировая масса, молочная продуктивность, в молоке). Хатами С.Р. выявил значимые ассоциации AluI- маркера гена гормона роста с жирностью молока у ярославского и немецкого чернопестрого скота. Он установил, что среди ярославского скота с генотипом LV было больше особей со средней жирностью молока (4,5 – 5%), высокую жирность (5 – 6%) чаще имели коровы с генотипом VV. В выборках с генотипом LL и LV чаще встречались особи с относительно низкими показателями удоя (не выше 5000 кг). Ильясов А.Г., 2008 также отмечает более высокую молочную продуктивность коров бестужевской и чёрно-пёстрой пород с генотипом VV. Калашникова Л.А. отметила, что в группе коров холмогорской породы наивысшие средние значения удоя, молочного жира и молочного белка наблюдались у животных с генотипом LV (8781 кг молока, 322,9 кг жира, 273,1 кг белка), а в группе животных с генотипом LL эти показатели были худшими (8040 кг молока, 302 кг жира, 247,6 кг белка). Наибольший процент жирности молока наблюдался у животных с генотипом LL (3,76%), наименьший - у животных с генотипом LV (3,68%). Наибольший процент содержания белка в молоке выявлен у животных с генотипом VV (3,11%), у коров с 45 генотипом LL (3.08%). Данные Калашниковой Л.А. согласуются с результатами Михайловой М.Е. (2008), полученными на популяции быкопроизводящих коров черно-пестрой породы. Данные по влиянию V-аллеля на фенотипическое проявление количественных признаков продуктивности различны и в некоторых случаях противоречивы (Михайлова М.Е. и др., 2008). В ряде работ была показана ассоциация Msp(-)-аллеля с высоким уровнем жирности молока, а также повышением процента белка в молоке, на выборках животных красной горбатовской породы, монгольского скота и монгольских яков. 1.8.3. Аллельный полиморфизм гена пролактина Пролактин (PRL) – один из гормонов, принимающих участие в инициации и поддержании лактации у млекопитающих, и может рассматриваться как потенциальный генетический маркер молочной продуктивности крупного рогатого скота. Ген пролактина состоит из пяти экзонов и четырех интронов, локализован в 23 хромосоме и имеет размер около 10 тыс. п.о. (Cooke et al., 1981; Camper et al., 1984; Brym et al., 2005). Для аллелей гена пролактина показана связь с различными хозяйственнополезными признаками (Akers et al., 1981), в том числе с молочной продуктивностью, уровнем белка и жира в молоке. На сегодняшний день получены данные по наличию положительной корреляции между уровнем гетерозиготности по данному локусу гена и жирномолочностью у КРС (Удина и др., 2001). Однако эти исследования носят пока поисковой характер и полученные в указанных работах данные не позволяют сделать четкие рекомендации селекционерам. 46 1.8.4. Аллельный полиморфизм гена каппа-казеина Коровье молоко содержит четыре основных казеина αS1, β, αS2, κ в соотношении 4:1:4:1соответственно и составляют 80% от общего белка (Hallen, 2008). Каппа-казеин является единственным гликозилированным казеином, содержащим галактозу, галактозамин и N-ацетилнейраминовую кислоту, которые связаны с остатками треонина С-концевой области. Гликозилирование каппа-казеина происходит в аппарате Гольджи эпителиальных клеток молочной железы в ходе посттрансляционной модификации с помощью О-гликозилтрансферазы (Mepham et al., 1992). У КРС генетические варианты каппа-казеина имеют разную степень гликозилирования. Показано, что высокое содержание углеводов приводит к снижению восприимчивости каппа-казеина к химозину. Модель мицеллы казеина и электронный микроснимок отдельной казеиновой мицеллы представлены на рис. 7 А Б Рисунок 7. А - Модель мицеллы казеина (Walstra, 1999). Б - Электронный микроснимок отдельной казеиновой мицеллы на основе высокого разрешения автоэмиссионной сканирующей микроскопии (Dalgleish et al., 2004) Казеинкиназа отвечает за посттрансляционное фосфорилирование казеинов в аппарате Гольджи (Bingham, 1979). Казеины подвергаются фосфолирированию, в результате которого фосфатные группы этерифицируются с гидроксильными группами серина. Остатки фосфосерина связывают кальций и коллоидный фосфат кальция, что обеспечивает соединение казеинов для формирования мицеллы (Hallen, 2008). 47 Кальций–чувствительные казеины расположены внутри мицеллы, а каппаказеин находится на поверхности. При этом у каппа-казеина в положении 11 и 88 2 цистеина соединяются дисульфидными связями, и происходит образование такой полимерной формы, которая обеспечивает стабилизацию мицеллярной структуры (Horisberger and Vonlanthen, 1980; Rasmussen et al., 1994). N-концом каппа-казеин взаимодействует с кальций-чувствительными казеинами, а отрицательно заряженный за счет кислых аминокислот С-конец является неотъемлемой частью наружного слоя казеиновых мицелл (Walstra, 1990). Каппа-казеин играет важную роль в химозин индуцированной коагуляции молока, происходящей в кишечнике и в процессе производства сыра. Химозин самый активный сычужный фермент, который специфически расщепляет пептидные связи каппа-казеина в положении Phe105-Met106 (Jolles et al., 1968). В результате ферментативного гидролиза образуется гидрофобный N-конец и гидрофильная часть казеиномакропептида (CMP). После выхода СМР на поверхность мицеллы, электростатическая и пространственная стабилизация мицеллы нарушается, что приводит к последующей коагуляции (Swaisgood, 1992). Когда молоко подвергают тепловой обработке, каппа-казеин связывается с казеинами αS1, αS2 и сывороточными белками с помощью дисульфидных связей, что приводит к увеличению поверхности мицеллы и оказывает влияние на технологические свойства молока. (Fox and Brodkorb, 2008). Гены казеинов у крупного рогатого скота локализованы в регионе q31-33 шестой хромосомы. Они образуют кластер из четырех тесносвязанных генов, расположенных в следующей последовательности: αS1, β, αS2 и κ. Длина всего кластера – 250 т. н.п. (Ferretti et al., 1990; Threadgill and Womack, 1990; Rijnkels et al. 1997). На рисунке 8 представлена общая геномная организация казеинов КРС (Martin et al., 2002). 48 Рисунок 8 - Общая геномная организация казеинов КРС (Martin et al., 2002) Три гена, кодирующих кальций чувствительные казеины αS1, β, αS2, возникли из общего гена путем внутри – и межгенной дупликации, перемещения экзонов и разделения общих регуляторных последовательностей в 5` фланкирующей области (Jones et al., 1985; Groenen et al., 1992, 1993). Ген каппа-казеина эволюционно не относится к этим генам и отличается в организации 5` фланкирующей области (Alexander et al., 1988). Наименее полиморфными являются гены αS1- и αS2 – казеинов. У гена αS1казеина выявлено 11 аллельных вариантов (A, B, C, D, E, E*, F, G, H, X, Y) (Formaggioni et al., 1998). Наиболее распространенными являются В и С аллели, из них В аллель имеют высокую частоту встречаемости (Boettcher et al., 2004). Показано, что для животных с генотипом СС характерно повышение молочной продуктивности и содержания белка в молоке, по сравнению с генотипами ВС и ВВ (Eenennaam and Medrano (1991). Ген αS2- казеина имеет четыре аллельных варианта - А B, С, D (Farrell et al., 2004). У β-казеина на уровне белка было выявлено 16 аллельных вариантов гена. Ген CSN3 расположен в районе q31 шестой хромосомы и состоит из 5 экзонов (Martin et al., 2002). Общая длина гена около 13 т.н.п. Большая часть кодирующих последовательностей зрелого белка содержится в четвертом экзоне (Azevedo et al., 2008). Структура гена каппа-казеина КРС представлена на рис. 9. 49 Рисунок 9 - Структура гена каппа-казеина КРС. Интроны представлены открытыми полосами. Экзоны, обозначенные серым цветом - 5' и 3' нетранслируемые последовательности; черным цветом – части экзонов, кодирующие сигнальный пептид; синим – части экзонов, кодирующие зрелый пептид. Размер экзонов дается в парах оснований (Martin et al., 2002) 50 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 2.1. Объекты исследований В работе были исследованы образцы спермы быков ОАО «Брянское» разных пород: черно-пестрой, швицкой, симментальской, красно-пестрой и абердинангусской, быков ОАО «Невское» Ленинградской области черно-пестрой и голштинской пород и быков-производителей голштинской породы дочернего предприятия «ЖодиноАгроПлемЭлита» НПЦ НАН Беларуси по животноводству (г. Жодино Минской области). Характиристика быков-производителей и результаты генотипирования представлены в приложениях 1-6. Исследование выполнялось согласно схеме, приведенной на стр. 52. 2.2. Методы исследований 2.2.1. Выделение ДНК из спермы быков Для выделения ДНК использовали образцы спермы быков-производителей черно-пестрой, симментальской, айширской, красно-пестрой и абердин-ангусской породы. Материал был предоставлен предприятиеми ОАО «Брянское» по племенной работе, ОАО «Невское» в виде замороженных гранул и в пайетах. Семя подвергалось разморозке. После отбора необходимого количества биологического материала для выделения ДНК, пробы хранили при -20ºС. Выделение ДНК из спермы с помощью набора реактивов «Extra Gene™ DNA Prep100» фирмы ИЗОГЕН. Структура хроматина сперматозоидов отличается от структуры хроматина соматических клеток тем, что она дополнительно стабилизирована дисульфидными связями. Использование стандартных методик выделения ДНК является неэффективным, выход ДНК практически нулевой. Возникает необходимость дополнительного применения тиовосстановителей, таких как, 2-меркалтоэтанол или дитиотрейтол, которые разрушают дисульфидные мостики (Перепечина И.О и др., 1996; Иванов П.Л., 1999). 51 Схема проведения исследования Абердин-ангусская ОАО «Брянское» (n=4) Красно-пёстрая ОАО «Брянское» (n=4) Симментальская ОАО «Брянское» (n=9) Швицкая ОАО «Брянское» (n=10) Голштинская «ЖодиноАгроПлемЭлита» (n=12) Чёрно-пёстрая ОАО «Невское») (n=29) Чёрно-пёстрая ОАО «Брянское» (n=29) Отбор образцов крови крупного рогатого скота различных пород, разводимых в Брянской области Выделение ДНК из образцов спермы ПЦР-ПДРФ анализ аллелей гена BoLA-DRB3, определение частот аллелей Определение аллельного разнообразия гена BoLADRB3 у быков разных пород и из разных предприятий Определение генотипов быков разных пород и из разных предприятий по гену BoLA-DRB3 у ПЦР-ПДРФ анализ аллелей генов молочной продуктивности и качества молока, определение частот аллелей Разработка практических рекомендаций по разведению крупного рогатого скота, генетически устойчивого к лейкозу 52 Выделение ДНК из спермы проводили с помощью набора реактивов «Extra Gene™ DNA Prep100» (ООО «Лаборатория Изоген», Москва) с модификацией метода. Приготовление рабочих растворов: 1. Буфер для селективного лизиса (SL buffer, 10x) 10 мл 10х SL буфера довести бидистиллированной водой до 100 мл. Хранить при 4ºС. 2. Раствор ЭнзиМикса В прибирку с ЭнзиМиксом добавить содержимое Растворителя ЭнзиМикса. Перемешать до полного растворения сухого содержимого, энергично встряхивая. Полное растворение может длиться в течение 1 часа. Готовый ЭнзиМикс хранить при – 20 ºС. 3. Рабочий раствор ЭкстраГена ETM В пробирку с 1 мл ЭкстраГена ЕТМ добавить 10 мкл ЭнзиМикса и перемешать. Хранить при 4ºС в течение недели. Этапы выделения ДНК 1. К 1 мл SL буфера добавить 20 мкл спермы и 2 мкл 2-меркалтоэтанола. Перемешать, переворачивая пробирку. 2. Инкубировать при комнатной температуре 5-7 минут. Перемешивать пробирки каждые 1-2 минуты во время инкубации. 3. Центрифугировать пробирки при максимальных оборотах (10000-14000 об/мин) 2 минуты. 4. Осторожно удалить супернатант, не задевая осадок. 5. К осадку добавить 100-200 мкл готового ЭкстраГена ЕТМ (отбирать от общего объема при постоянном перемешивании). 6. Интенсивно перемешать содержимое пробирок на вортексе. 7. Инкубировать пробирки 30-60 минут при 56 ºС, затем 10 минут при 100 ºС. 8. Перемешать содержимое пробирок на вортексе. 53 9. Центрифугировать при максимальных оборотах 2 минуты при комнатной температуре. 10. Выделенная ДНК находится в супернатанте. При необходимости перенести супернатант в чистую пробирку и хранить 1-2 дня при 4ºС или перенести на 20ºС для длительного хранения Выделение ДНК проводили без соблюдения стерильности, но под ламинарным боксом для исключения перекрестного загрязнения образцов ДНК. 2.2.2. Анализ аллельного полиморфизма гена BoLA-DRB3 методом ПЦР-ПДРФ Изучение генетической устойчивости крупного рогатого скота к вирусу лейкоза КРС методом ПЦР-ПДРФ основано на определении генетического полиморфизма гена BoLA-DRB3 и выявлении аллелей, ассоциированных с устойчивостью или чувствительностью к ВЛКРС и ответственных за формирование иммунной реакции к вирусу. Метод ПЦР-ПДРФ для анализа аллельного полиморфизма гена BoLA-DRB3 животных включает несколько этапов работы: 1. Выделение ДНК из крови или спермы животных. 2. Проведение ПЦР с праймерами к гену BoLA-DRB3 для получения фрагмента длиной 284 п.о. 3. Электрофорез продукта амплификации. 4. Рестрикция фрагмента 284 п.о. ферментами RsaI, HaeIII, BstIY. 5. Электрофорез продуктов рестрикции в полиакриламидном геле (ПААГ). На ДНК, полимеразная выделенной цепная из реакция спермы с быков-производителей, использованием праймеров, проводится позволяющих амплифицировать фрагмент гена BoLA-DRB3 размером 284 п.о. Специфичность праймеров, подбор температуры их отжига и глубину протекания реакции ПЦР проверяли с помощью электрофореза 54 амплифицированного фрагмента в агарозном геле. Для определения аллелей гена BoLA-DRB3 на основе данных рестрикционного анализа используют таблицу 1. Таблица 1 Определение аллелей гена BoLA-DRB3 на основе рестрикционного анализа (цит. по Г.Е. Сулимова, В.В. Зинченко, 1999) ПЦР-ПДРФ аллели DRB3.2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 I8 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 RsaI а b b c г d е f f f g h h h I j k l s l l m n n o o o о p q i m n l c l o b t Продукты рестрикции эндонуклеазами BstYI HaeIII a a b a b b a a с с a a с с a a d a b a e a a a b a b b b a b b b b b f b b b b b e b a b a b b a a a b b f b b с с с с b f a a b f a b b B b a b a d a b a 55 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 u a h k k s v w w w x g s y j b b b b b d b a b b b a d b d a a f f i b a a a c a a a a b Частоту встречаемости аллелей определяли по формуле: p = (2N1+N2)/2n, где N1 – число гомозигот по исследуемому аллелю, N2 – число гетерозигот, n – объем выборки. Ожидаемую гетерозиготность рассчитывали по формуле: He = 1-(p2+q2), где He – ожидаемая гетерозиготность, p – частота аллеля А, q – частота аллеля В. Для оценки избытка гетерозигот в изучаемых выборках животных использовали коэффециент Селендера: D = (Ho-He)/He, где Но – наблюдаемая гетерозиготность, He – ожидаемая гетерозиготность. Для оценки достоверности отклонения распределения выявленных частот аллелей от теоретически ожидаемого использовали критерий хи-квадрат. 56 2.2.3. Схема изучения аллельного полиморфизма гена BoLA-DRB3 Выделение ДНК Постановка ПЦР HLO-30: 5' - ATС СTC TCT CTG CAG CAC ATT TCC - 3' HLO-32: 5' - TСG CCG CTG CAC AGT GAA ACT СTC - 3' [Van Eijk et al., 1992] Температурный профиль ПЦР: 1. Первичная денатурация ДНК – 94 0С, 3 мин. 1 цикл 2. Денатурация – 94 0С, 30 сек. 3. Отжиг праймеров – 68 0С, 30сек. 30 циклов 4. Элонгация ДНК – 720С, 30 сек. 5. Заключительная элонгация– 720С – 5 мин 1 цикл Амлифицированный фрагмент ДНК 284 п.о. Рестрикция Rsa I Hae III BstX 2 I 1х буфер SE B 1х буфер SE G 1х буфер SE G 37 ºС 1 час 37 ºС 1 час 60 ºС 1 час Электрофорез продуктов рестрикции в 9% ПААГ Анализ генотипов с использованием физической карты рестрикции по van Eijk et al. 1992; Gelhaus et al. 1995; Maillard et al. 1999 57 2.2.4. Схема изучения аллельного полиморфизма гена соматотропина (GH) по Msp I - маркеру Выделение ДНК Постановка ПЦР GH/MspI: 5'- CCC-ACG-GGC-AAG-AAT-GAG-GC-3' GH/MspI: 5'- TGA-GGA-ACT-GCA-GGG-GCC-CA -3' [Mitra A., 1995] Температурный профиль ПЦР: 1. Первичная денатурация ДНК – 94 0С, 4 мин. 1 цикл 2. Денатурация – 94 0С, 30 сек. 3. Отжиг праймеров – 62 0С, 30сек. 30 циклов 4. Элонгация ДНК – 720С, 40 сек. 5. Заключительная элонгация– 720С – 3 мин 1 цикл Амлифицированный фрагмент ДНК 329 п.о. Рестрикция Msp I 1х буфер SE B 37 ºС 1 час Электрофорез продуктов рестрикции в 9% ПААГ 224 и 105 п.о 329 п.о. 329, 224, 105 п.о. генотип ++ генотип – – генотип + – 58 2.2.5. Схема изучения аллельного полиморфизма гена соматотропина (GH) по Alu I - маркеру Выделение ДНК Постановка ПЦР GH/AluI: 5'- GCT-GCT-CCT-GAG-GGC-CCT-TCG -3' GH/AluI: 5'- GCG-GCG-GCA-CTT-CAT-GAC-CCT -3' [Schlee, 1994] Температурный профиль ПЦР: 1. Первичная денатурация ДНК – 94 0С, 3 мин. 1 цикл 2. Денатурация – 94 0С, 30 сек. 3. Отжиг праймеров – 68 0С, 30сек. 30 циклов 4. Элонгация ДНК – 720С, 30 сек. 5. Заключительная элонгация– 720С – 3 мин 1 цикл Амлифицированный фрагмент ДНК 223 п.о. Рестрикция Alu I 1х буфер SE Y 37 ºС 1 час Электрофорез продуктов рестрикции в 9% ПААГ 171, 52 п.о 223 п.о. 22, 171, 52 п.о. генотип LL генотип VV генотип LV 59 2.2.6. Схема изучения аллельного полиморфизма гена бета-лактоглобулина (βLG) по методике Medrano, et al., 1990 Выделение ДНК Постановка ПЦР β-LG/HaeIII: 5'- TGT-GCT-GGA-CAC-CGA-CTA-CAA-AAA-G-3' β-LG/HaeIII: 5'- GCT-CCC-GGT-ATA-TGA-CCA-CCC-TCT-3' [Medrano J.F. and Aguilar-Cordova E., 1990] Температурный профиль ПЦР: 1. Первичная денатурация ДНК – 94 0С, 4 мин. 1 цикл 2. Денатурация – 94 0С, 30 сек. 3. Отжиг праймеров – 58 0С, 30сек. 30 циклов 4. Элонгация ДНК – 720С, 30 сек. 5. Заключительная элонгация– 720С – 4 мин 1 цикл Амлифицированный фрагмент ДНК 247 п.о. Рестрикция Hae III 1х буфер SE G 37 ºС 1 час Электрофорез продуктов рестрикции в 9% ПААГ 148 и 99 п.о 99, 74, 74 п.о. 148, 99, 74, 74 п.о. генотип АА генотип ВВ генотип АВ 60 2.2.7. Схема изучения аллельного полиморфизма гена бета-лактоглобулина (βLG) по методике Гладырь Е.А., 2001 Выделение ДНК Постановка ПЦР β-LG/PvuII: 5'- CTA-TTG-TCC-TCG-TAG-AGG-AAG-C-3' β-LG/PvuII: 5'- AGA-AAG-CCC-TGG-ATA-AGC-AGC-C -3' [Гладырь Е.А., 2001] Температурный профиль ПЦР: 1. Первичная денатурация ДНК – 94 0С, 3 мин. 1 цикл 2. Денатурация – 94 0С, 30 сек. 3. Отжиг праймеров – 66 0С, 30сек. 30 циклов 4. Элонгация ДНК – 720С, 80 сек. 5. Заключительная элонгация– 720С – 3 мин 1 цикл Амлифицированный фрагмент ДНК 1248 п.о. Рестрикция Pvu II 1х буфер SE G 37 ºС 1 час Электрофорез продуктов рестрикции в 2% агрозном геле 774 и 474 п.о 774, 297, 177 п.о. 774, 474, 297, 177п.о. генотип АА генотип ВВ генотип АВ 61 2.2.8. Схема изучения аллельного полиморфизма гена пролактина (PRL) Выделение ДНК Постановка ПЦР PRL: 5'- CGA-GTC-CTT-ATG-AGC-TTG-ATT-CTT -3' PRL: 5'- GCC-TTC-CAG-AAG-TCG-TTT-GTT-TTC -3' [Mitra A., 1995] Температурный профиль ПЦР: 1. Первичная денатурация ДНК – 94 0С, 4 мин. 1 цикл 2. Денатурация – 94 0С, 60 сек. 3. Отжиг праймеров – 59 0С, 60сек. 35 циклов 4. Элонгация ДНК – 720С, 60 сек. 5. Заключительная элонгация– 720С – 4 мин 1 цикл Амлифицированный фрагмент ДНК 156 п.о. Рестрикция Rsa I 1х буфер SE B 37 ºС 1 час Электрофорез продуктов рестрикции в 9% ПААГ 82, 74 п.о 156 п.о. 156, 82, 74 п.о. генотип АА генотип ВВ генотип АВ 62 2.2.9. Схема изучения аллельного полиморфизма гена каппа-казеина (CSN3) Выделение ДНК Постановка ПЦР SGE: 5'- TAT-CAT-TTA-TGG-CCA-TTG-GAC-CA -3' SGО : 5'- CTT-CTT-TGA-TGT-CTC-CTT-AGA-GTT -3' [Г.Е. Сулимова и др.,1991] Температурный профиль ПЦР: 1. Первичная денатурация ДНК – 94 0С, 4 мин. 1 цикл 2. Денатурация – 94 0С, 30 сек. 3. Отжиг праймеров – 60 0С, 30сек. 35 циклов 4. Элонгация ДНК – 720С, 40 сек. 5. Заключительная элонгация– 720С – 4 мин 1 цикл Амлифицированный фрагмент ДНК 228 п.о. Рестрикция Hinf I 1х буфер SE O 37 ºС 1 час Электрофорез продуктов рестрикции в 9% ПААГ 135, 93 п.о 228 п.о. 228, 135, 93 п.о. генотип АА генотип ВВ генотип АВ 63 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 3.1 Генетический полиморфизм крупного рогатого скота по гену BoLA-DRB3 3.1.1 Анализ аллельного полиморфизма гена BoLA-DRB3 методом ПЦР-ПДРФ Изучение генетической устойчивости крупного рогатого скота к вирусу лейкоза КРС методом ПЦР-ПДРФ основано на определении генетического полиморфизма гена BoLA-DRB3 и выявлении аллелей, ассоциированных с устойчивостью или чувствительностью к ВЛКРС и ответственных за формирование иммунной реакции к вирусу. Метод ПЦР-ПДРФ для анализа аллельного полиморфизма гена BoLA-DRB3 животных включает несколько этапов работы: На этапе выделения ДНК из спермы быков был проведен электрофорез ДНК (рис.10), на рисунке видно, что использованная методика позволяет получать образцы ДНК с выровненной концентрацией ДНК. На этапе проведения ПЦР с праймерами к гену BoLA-DRB3 были получены фрагменты длиной 284 п.о., реакция проходит количественно, электрофорез продукта амплификации позволяет продемонстрировать близкие концентрации получаемого продукта. На рис. 11 видно, что в ПЦР с геномной ДНК из образцов спермы прошла хорошо, в геле видна полоса ДНК с ожидаемым размером 284 п.о., яркость полосы свидетельствует о достаточном количестве в пробе дезоксинуклеозидтрифосфатов, Taq-ДНК-полимеразы, правильном составе буфера для полимеразной реакции. После рестрикции фрагмента 284 п.о. ферментами Rsa I, Hae III, Bst X2I проводится электрофорез продуктов рестрикции в полиакриламидном геле (ПААГ). 64 Рисунок 10. Электрофорез геномной ДНК из образцов спермы в 1% агарозном геле Рисунок 11. Электрофорез в 1% агарозном геле продуктов ПЦР экзона 2 гена BoLA DRB3; pUC19/Msp I– маркер молекулярных масс, К – -отрицательный контроль, 1-9 – исследуемые образцы Фрагмент 284 п.о. далее расщепляли рестрицирующими эндонуклеазами Rsa I, Hae III и/или Bst X2I, с последующим разделением полученной смеси фрагментов ДНК с помощью электрофореза в полиакриламидном геле и определением длин рестрикционных фрагментов (рис. 12, 13, 14). 65 Рисунок 12. Электрофорез в 6% полиакриламидном геле продуктов рестрикции эндонуклеазы Rsa I pUC19/Msp I – маркер молекулярных масс; 1-9 – исследуемые образцы Рисунок 13. Электрофорез в 6% полиакриламидном геле продуктов рестрикции эндонуклеазы Hae III pUC19/Msp I – маркер молекулярных масс; 50-59 – исследуемые образцы 66 Рисунок 14. Электрофорез в 6% полиакриламидном геле продуктов рестрикции эндонуклеазы Bst X2I; pUC19/Msp I – маркер молекулярных масс; 51-61 – исследуемые образцы Различия в нуклеотидной последовательности различных аллелей гена BoLADRB3 (т. е. полиморфизм на уровне ДНК) лежат в основе различного распределения сайтов рестрикции фрагмента 284 п.о., поэтому аллельный полиморфизм ДНК будет проявляться как полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ). Для определения генетической устойчивости КРС к лейкозу необходимо выявить наличие аллелей гена BoLA-DRB3, ответственных за формирование иммунной реакции к вирусу. Аллельные варианты гена определяли по наличию или отсутствию указанных сайтов рестрикции согласно ранее полученным таблицам. Для определения аллелей гена BoLA-DRB3 рестрикционного анализа используют таблицу 1. на основе данных 67 3.2. Аллельный полиморфизм гена BoLA-DRB3 у быков-производителей черно-пестрой и голштинской пород из разных регионов Основная разводимая в Брянской области порода КРС – черно-пестрая голштинизированная, сильно подвержена инфицированию вирусом лейкоза КРС. Изучение аллельного полиморфизма гена BoLA-DRB3 быков-производителей чернопестрой и голштинской пород имеет важнейшее значение для развития молочного животноводства. Нами было проведено генотипирование по гену BoLA-DRB3 быков – производителей черно-пестрой и голштинской пород из ОАО «Брянское» по племенной работе (29 голов), ОАО «Невское» по племенной работе (Ленинградская область) (29 голов), НПЦ НАН Беларуси по животноводству» (г. Жодино Минской области) (12 голов), откуда завозится сперма для племенных и товарных молочных хозяйств Брянской области. Проведен анализ распределения частот аллелей BoLA-DRB3, ассоциированных с устойчивостью и восприимчивостью к лейкозу у изученных пород КРС. Полученные результаты представлены в таблице 2. Таблица 2 Частота встречаемости аллелей BoLA-DBD3 у быков черно-пестрой и голштинской пород № аллеля 8 16 22 24 11 23 Частота аллелей ОАО «Брянское», ОАО «Невское» «ЖодиноАгроПлемЭлита» (n = 29) (n=29) (n = 12) Аллели, определяющие чувствительность к лейкозу 6,9 1,7 12,5 12 25,9 16,7 60,3 67,2 70,86 19 13,7 8,33 22,4 25,9 33,33 Аллели, определяющие устойчивость к лейкозу 8,6 1,7 4,16 19,1 12,1 8,32 8,6 6,9 68 28 3 7 9 10 14 18 20 27 32 37 Все аллели 1,7 3,5 4,16 Аллели, нейтральные по отношению к лейкозу 1,7 12,1 12,5 6,9 0 0 1,7 0 0 1,7 6,9 0 20,6 20,7 0 0 4,16 1,7 0 0 1,7 0 0 0 0 4,16 1,7 0 0 3,5 1,7 0 100 100 20, 82 100 Как следует из данных таблицы 2, быки из 3 разных регионов имеют в совокупности 17 разных аллелей из 54 возможных. При этом наблюдается значительное преобладание в этих популяциях быков-производителей, несущих аллели восприимчивости к вирусу лейкоза. Наибольшее количество животных несет аллели восприимчивости к вирусу лейкоза КРС *22, *24 и в меньшее количество быков - *8. Общее количество аллелей восприимчивости к лейкозу изменяется от 60,3% в Брянском стаде до 67,2% в Ленинградской области и до 70,86% у белорусских быков. Распределение аллелей гена BoLA-DRB3 у быков – производителей показано на рисунках 15, 16, 17. 69 частота встречаемости, % 25 20 15 10 5 0 *8 *16 *22 *24 *11 *23 *28 *3 *7 *9 *10 *18 *20 *32 *37 Спектр аллелей Рисунок 15. Распределение аллелей гена BoLA-DRB3 у быков черно-пестрой породы госплемстанции ОАО «Брянское» На рисунке 15 показано, что аллельный спектр у быков-производителей госплемстанции ОАО «Брянское» достаточно узкий – всего 15 разных аллелей из 54 известных. При этом у быков черно-пестрой породы Брянской области имеются все варианты аллелей чувствительности к вирусу лейкоза КРС, из них преобладают *24 и * 22 аллели с частотой встречаемости 22,4% и 19% соответственно. Из 3 аллелей устойчивости *11 и *23 имеют частоту 8,6% и *28 - 1,7%. Нейтральные аллели представлены только 8 вариантами. 70 Рисунок 16. Распределение аллелей гена BoLA-DRB3 у быков черно-пестрой породы госплемстанции ОАО «Невское» Из рисунка 16 видно, что у быков черно-пестрой породы госплемстанции ОАО «Невское» количество чувствительных аллелей в 2 раза превышает количество устойчивых и нейтральных аллелей, при этом почти по 26% приходится на долю *16 и *24 аллелей. В изученной выборке имеются все три аллеля устойчивости, из них доминирующим является *23 аллель. Из 29 особей только 3 быка имеют нейтральные аллели - *3, *10 и *37. Похожая картина в распределении аллелей наблюдается и у быков голштинофризской породы из Республики Беларусь (рис. 17). На долю аллелей чувствительности приходится 70,86%. Всего 2 быка имеют аллели устойчивости *11 и *28. Нейтральные аллели представлены тремя вариантами - *3, *14 и *27. 71 Рисунок 17. Распределение аллелей гена BoLA-DRB3 у быков черно-пестрой породы «ЖодиноАгроПлемЭлита» Анализ полученных данных приводит к выводу, что у быков-производителей черно-пестрой голштинизированной и голштино-фризской пород, принадлежащих госплемстанциям Брянской и Ленинградской областей и Беларуси, наблюдается резкий сдвиг в сторону аллелей чувствительности: 60,3%, 67,2% и 70,86 соответственно. Поскольку степень голштинизации самая низкая у брянских быков и самая высокая у белорусских быков, то можно сделать вывод о корреляции между уровнем голштинизации стада и количеством аллелей чувствительности. Брянские и ленинградские быки имеют по 3 аллеля устойчивости к ВЛКРС, их количество невелико у брянских быков (19,1%), оно снижается почти в полтора раза у ленинградских животных (12,1%). У быков из Беларуси выявлено 2 аллеля устойчивости к лейкозу, общее их количество составляет 8,32%. Важное значение имеют данные по полиморфизму нейтральных аллелей – генотипирование животных показало, что при повышении степени голштинизации происходит не только уменьшение доли нейтральных и устойчивых аллелей, но и резкое сокращение их разнообразия. Общее количество нейтральных по отношению 72 к вирусу лейкоза аллелей практически одинаково во всех 3 группах (20,6% – 20,8%), но важно отметить резкое уменьшение числа аллелей - так называемое «аллельное сужение»: от 8 в ОАО «Брянское» до 3 в остальных популяциях. Это очень опасная тенденция, поскольку ген BoLA-DRB3 входит в главный комплекс гистосовместимости и определяет формирование гуморального и клеточного иммунитета не только на вирус лейкоза КРС, но и в ответ на другие патогенные микроорганизмы, в том числе вызывающие опасные заболевания – туберкулез, бруцеллез, мастит и др. Сужение аллельного спектра означает снижение защитной реакции организма на проникновение разных инфекционных микроорганизмов, что может привести к массовому распространению заболеваний, вызываемых этими патогенами. Полученные результаты хорошо согласуются с результатами генетических исследований быков – производителей из племенных предприятий Ленинградской, Московской и Ростовской областей, Краснодарского края, Карелии и Финляндии (Ковалюк, 2008; Сацук, 2009; Мачульская, 2009). В работе Сацука В.Ф. (2009) в группе из 293 голштинских быков из госплемстанций Краснодарского края, Ростовской и Ленинградской областей и Карелии было выявлено всего 25 аллелей гена BoLA-DRB3. При этом аллели, определяющие восприимчивость к вирусу лейкоза, имеют высокую частоту встречаемости, что говорит об их селекционной предпочтительности. В то же время значительная часть аллелей, связанных с устойчивостью или нейтральностью к ВЛКРС, находятся в процессе элиминации. По мнению автора, такая аллельная «узость» при высоком потенциале молочной продуктивности может привести к ограничению пределов компетентности иммунной системы у отдельных животных и стад в целом, и как следствие, сделать их уязвимыми перед внешними неблагоприятными воздействиями. Масленников М.Г. (2005) также отмечает, что в изучаемых популяциях животных черно-пестрой породы наблюдается низкий уровень гетерогенности. По 73 его мнению, чем выше степень «голштинизации» скота в хозяйстве, тем меньше вариантов аллелей гена BoLA-DRB3, и больше частота встречаемости аллелей чувствительности к лейкозу. Этот вывод подтверждается полученными нами результатами. Быки-производители, несущие преимущественно аллели восприимчивости к лейкозу, не представляют угрозу для здоровья поголовья КРС в Ленинградской области и в Беларуси в связи с отсутствием возбудителя заболевания – в этих регионах добились полного оздоровления хозяйств от вируса лейкоза. В племенных хозяйствах Брянской области, в которых нет РИД-положительных животных, сперма быков, несущих аллели восприимчивости к вирусу, также не приведет к поражению стада лейкозом. Однако использование спермы изученных быков-производителей в племенных и товарных хозяйствах, где есть вирусоносители и больные животные, будет способствовать дальнейшему распространению болезни. Для Брянской области, как и для подавляющего большинства регионов России, чрезвычайно опасно использование быков-производителей с генами восприимчивости к лейкозу, так как это приводит к накоплению в популяции КРС аллелей, подавляющих формирование защитных реакций и определяющих восприимчивость к вирусу лейкоза. При наличии ВЛКРС на фермах увеличение доли животных с аллелями чувствительности к вирусу приведет к постоянному росту вирусоносительства и появлению больных животных, что и наблюдается на животноводческих фермах в большинстве регионов страны. Поэтому для оздоровления от лейкоза поголовья КРС племенных и товарных хозяйств, разводящих черно-пеструю и голштинскую породу, необходима разработка системы мероприятий, учитывающих передачу от быков-производителей преимущественно аллелей чувствительности к вирусу. потомству 74 3.2.1. Сравнение быков-производителей черно-пестрой и голштинской пород из разных племенных станций по генотипам гена BoLA-DRB3 Анализ генотипической структуры поголовья быков-производителей из всех трех регионов по гена BoLA-DRB3 представлен в таблице 3 и в графическом виде на рисунке 18. В таблице 3 животные распределены по 6 группам: ЧЧ, ЧН, НН, УН, УЧ, УУ. Полученные результаты свидетельствуют, что преобладающее большинство составляют особи, имеющие генотипы ЧЧ, ЧН, ЧУ. При этом среди них большинство составляют особи, несущие аллели восприимчивости к гомозиготном состоянии: 41,35% у брянских, 44,8% у ленинградских и 50,1% у белорусских быков. То есть, с повышением уровня голштинизации и молочной продуктивности и наблюдается явная тенденция к увеличению генотипов, несущих аллели чувствительности к вирусу лейкоза в гомозиготном состоянии. При этом *24 встречается наиболее часто и составляет от 22,4% до 33,33% от общего числа аллелей, он входит в 27,5% всех генотипов в брянском стаде, 31,35% генотипов ОАО «Невское» и 41,67% белорусских быков, гомозиготных по восприимчивости к вирусу лейкоза. В гетерозиготном состоянии аллели чувствительности встречаются совместно с нейтральными аллелями достаточно часто: 20,7% у брянского поголовья, 27,6% в ленинградском стаде и 33,32% у белорусских быков. Генотипы, имеющие сочетание аллелей устойчивости и восприимчивости, наблюдаются у 17,25% брянских и ленинградских и 8,33% белорусских быков. По аллелям устойчивости к лейкозу наблюдается противоположная ситуация: только 1 бык из 29 проанализированных животных Брянской области несет аллели устойчивости к лейкозу в гомозиготном состоянии, в ленинградской и белорусской популяциях такие особи не обнаружены. 75 Таблица 3 Распределение быков – производителей черно-пестрой и голштинской пород по генотипам BoLA-DRB3 Генотип по гену BoLA-DRB3 Отношение Генотип к ВЛКРС Ч/Ч Ч/Н Н/Н У/Н У/Ч У/У Всего: Ho He 8/16 8/24 16/16 16/22 16/24 22/22 22/24 24/24 16/3 22/3 22/10 24/10 16/27 22/14 24/3 9/10 3/3 23/7 23/37 28/3 11/3 11/22 11/24 23/22 23/16 23/24 28/16 28/24 11/23 Частота встречаемости генотипа, % ОАО «Брянское», (n = 29) 3,45 3,45 0 41,35 6,9 6,9 3,45 10,3 6,9 20,7 0 0 20,7 0 0 0 0 3,45 3,45 0 13,8 13,8 0 0 0 3,45 6,9 6,9 17,25 0 0 0 0 3,45 3,45 100 100 0,897 0,872 ОАО «Невское» (n = 29) 0 3,45 6,9 3,45 44,8 17,2 3,45 3,45 6,9 6,9 6,9 6,9 27,6 6,9 0 0 0 0 3,45 3,45 0 6,9 3,45 3,45 0 0 3,45 0 6,9 17,25 3,45 3,45 «ЖодиноАгроПлемЭлита» (n = 12) 8,33 16,68 0 0 16,68 0 0 8,33 0 8,33 0 0 8,33 8,33 8,33 0 0 0 0 0 8,33 50,02 33,32 0 8,33 8,33 8,33 0 100 0 100 0,793 0,821 100 100 0,917 0,816 76 D ч2 0,028 0,00070 -0,034 0,0009 0,123 0,012390 Рисунок 18 наглядно иллюстрирует распределение разных генотипов быковпроизводителей из трех регионов по гену BoLA-DRB3. Рисунок 18. Генотипы по гену BoLA-DRB3 быков черно-пестрой породы разных госплемстанций Наибольшее количество быков, несущих аллели устойчивости в гетерозиготном состоянии, также обнаружено в брянской выборке быков: 31,05% по сравнению с 24,15% в ленинградской и 16,66% в белорусской выборках быков. Таким образом, преобладающее число генотипов быков – производителей содержит аллели восприимчивости к вирусу лейкоза: 79,3% брянской, 87,65% ленинградской и 91,75% белорусской. 77 Устойчивость к лейкозу является доминантным признаком, поэтому генетически устойчивыми к вирусу являются все быки, несущие аллели *11, *23 и *28 даже в гетерозиготе, в сочетании с аллелями чувствительности или нейтральными аллелями. На рисунке 19 представлен рисунок, из которого следует, что устойчивыми к вирусу является 34,5% брянской, 24,15% ленинградской и 16,66% белорусской популяции черно-пестрых быков. Рисунок 19. Распределение быков – производителей черно-пестрой и голштинской пород по устойчивости к лейкозу Как видно на рисунке 19, высокий уровень аллелей чувствительности в популяции даже при рецессивном проявлении признака приводит к высокому уровню поражения поголовья вирусом лейкоза - от 65,5% в брянской популяции до 83,34% у белорусских животных. Таким образом, голштинизация поголовья черно-пестрой породы с использованием спермы быков голштинской породы, в том числе западноевропейской селекции, направленная на повышение молочной продуктивности, наряду с увеличением удоев молока у коров, будет приводить к постоянному росту генетически восприимчивых к вирусу лейкоза животных. На передовых племенных фермах России, а также в Беларуси и ведущих странах Западной Европы, где нет источника инфекции (все животные показывают РИД (-)), этот фактор не играет отрицательной роли в развитии животноводства. Однако в России, где в 63 регионах 78 зарегистрированы РИД-положительные животные и некоторые хозяйства имеют больных лейкозом коров, использование для разведения спермы быков с аллелями чувствительности в гомозиготном состоянии или в гетерозиготном с нейтральными аллелями, будет приводить к повышению числа РИД-положительных коров и дальнейшему распространению лейкоза. Полученные результаты позволяют сделать вывод, что для направленной работы по снижению количества лейкозных животных и повышению генетической устойчивости к вирусу необходимо выявлять быков, имеющих аллели устойчивости в гомозиготном состоянии, и использовать их в качестве производителей на государственных племенных станциях для получения семени, или для покрытия коров в товарных стадах с высоким уровнем распространения ВЛКРС. 3.3. Аллельный полиморфизм гена BoLA-DRB3 у быков-производителей разных пород Брянской области В настоящее время в хозяйствах Брянской области разводят крупный рогатый скот следующих молочных пород: черно-пестрая, голштинская, швицкая, симментальская, красно-пестрая, и в 2010 году в регионе был начат масштабный проект по развитию мясного животноводства на основе скота абердин-ангусской породы. Основное количество животноводческих хозяйств молочного направления разводит коров черно-пестрой породы, животных остальных пород в области немного, поэтому ОАО «Брянское» имеет всего от 4 до 10 быков-производителей этих пород для получения спермы. В таблице 4 представлены характер распределения и частота встречаемости аллелей гена BoLA-DRB3 у быков швицкой, симментальской, красно-пестрой и абердин-ангусской породы. 79 Таблица 4 Частота встречаемости разных аллелей гена BoLA-DBD 3 у быков разных пород Госплемстанции ОАО «Брянское» Отношение № к лейкозу аллеля Чувствительность Устойчивость Нейтральные 8 16 22 24 11 23 28 1 3 6 7 10 12 15 18 20 27 35 37 44 49 Частота встречаемости разных аллелей BoLA-DBD 3 Швицкая СимментальКрасноАбердинская (n=9) пестрая (n=4) ангусская (n=10) (n=4) % Всего, % Всего, % Всего, % Всего, % % % % 5,5 5 33,3 12,5 12,5 16,8 5 5,5 5,5 12,5 12,5 16,8 25 25 22,3 25 0 20 5 5,5 5,5 12,5 12,5 12,5 5,5 25 11,2 12,5 20 70 44,4 62,5 62,5 87,5 12,5 11,2 12,5 5,5 10 5 12,5 5 5,5 5 - Небольшое количество быков – производителей этих пород не позволяет сделать достоверный вывод о характерном для этих пород распределении аллелей гена BoLA-DRB3, на основании проведенных исследований можно говорить только об особенностях производителей. генетической структуры брянского поголовья быков- 80 Сравнение распределения аллелей у быков – производителей представленных пород выявляет их большие отличия от аллельного спектра голштинской и чернопестрой пород. На рисунке 20 показаны аллели, связанные с чувствительностью к лейкозу. У 9 исследованных быков симментальской породы имеются все 4 аллеля: наблюдается частота встречаемости, % равномерное распределение *8, *22, и *24 аллелей и преобладание *16 аллеля. 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 *8 симментальская *16 *22 аллели швицкая красно-пестрая *24 абердин-ангусская Рисунок 20. Распределение аллелей гена BoLA-DRB3, определяющих чувствительность к лейкозу у быков – производителей разных пород госплемстанции ОАО «Брянское» В остальных породах чувствительности представлены одним аллели вариантом. У 10 быков швицкой породы это *22 аллель, 4 быка красно-пестрой и абердин-ангусской породы имеют только аллель *24. Рисунок 21 демонстрирует распределение аллелей устойчивости у быков разных пород: у 4 быков абердин-ангусской породы данных аллелей не выявлено. У быков красно-пестрой породы (исследовано также 4 быка) аллели устойчивости представлены *11 аллелем; у 9 быков симментальской породы имеются аллели *11 81 и *28, при этом наблюдается доминирование *11 аллеля; у 10 быков швицкой породы выявлены аллели *23 и *28. Рисунок 21. Распределение аллелей гена BoLA-DRB3, определяющих устойчивость к лейкозу у быков – производителей разных пород госплемстанции ОАО «Брянское» Анализ показал преобладание группы нейтральных аллелей. Так, у быков швицкой породы нейтральные аллели составляют 70%, симментальской – 44,4%, красно-пестрой 62,5%, абердин-ангусской – 87,5%, в то время как в трех группах быков черно-пестрой породы было 20,6% - 20,82% нейтральных аллелей. Характер распределения нейтральных аллелей показан на рисунке 22. 82 70 частота встречаемости, % 60 50 40 30 20 10 0 *1 *3 *7 *10 *12 *15 *18 *20 *27 *35 *37 *44 *49 *6 аллели симментальская швицкая красно-пестрая абердин-ангусская Рисунок 22. Распределение аллелей гена BoLA-DRB3, нейтральных к лейкозу, у быков – производителей разных пород госплемстанции ОАО «Брянское» Из 47 возможных нейтральных аллелей брянские быки-производители разных пород несут всего по 3-6 аллелей: 9 быков симментальской, как и 10 быков швицкой породы имеют по 6 нейтральных аллелей. 4 быка абердин-ангусской породы имеют всего 3 нейтральных аллеля, 4 быка красно-пестрой породы имеют 5 нейтральных аллелей. Для сравнения: быки черно-пестрой породы имели 8 аллелей – брянская группа, по 3 аллеля – белорусская и ленинградская группы, суммарно по 20,6% 20,82% от общего поголовья быков каждой выборки. 83 3.3.1 Анализ генотипов по гену BoLA-DRB3 быков - производителей разных пород Брянской области Генотипический анализ распределения животных по гену BoLA-DRB3 позволяет увидеть картину реальной устойчивости животных к вирусу лейкоза (таблица 5). Таблица 5 Распределение генотипов по локусу BoLA-DRB3 у быков – производителей разных пород госплемстанции ОАО «Брянское» Генотип по локусу BoLA DRB3 8/16 8/24 16/22 16/24 22/22 22/24 24/24 11/16 11/22 11/24 23/22 28/24 11/23 Всего: Ho He D ч2 Ч/Ч У/Ч У/У Ч/Н Н/Н У/Н чернопестрая (n=29) 3,45 3,45 6,9 41,35 6,9 3,45 10,3 6,9 3,45 17,25 6,9 6,9 3,45 3,45 20,7 3,45 13,8 100 0,897 0,872 0,028 0,00072 Частота встречаемости генотипа, % красно- абердиншвицкая симментальская пестрая ангусская (n=10) (n=9) (n=4) (n=4) 11,1 22,2 11,1 10 44,5 25 25 40 11,1 25 75 50 22,2 50 100 100 100 100 0,9 0,89 1 0,5 0,835 0,894 0,844 0,563 0,078 0,0045 0,185 -0,112 0,0051 0,000078 0,029 0,0071 84 Поскольку аллели устойчивости являются доминантными, то животные, имеющие их в гетерозиготном состоянии совместно с аллелями чувствительности, не проявляют признаков персистентного лимфоцитоза. Полученные выводы наглядно представлены на рисунке 23. Анализ полученных результатов позволяет сделать следующие выводы: - 12 из 29 быков черно-пестрой породы имеют генотип Ч/Ч, для которого характерно подавление формирования защитной реакции на вирус лейкоза КРС, что приводит к развитию лейкоза; - в стаде отсутствуют быки, имеющие аллели устойчивости в гомозиготном состоянии (генотип У/У имел списанный в настоящее время бык Милый чернопестрой породы, сперма которого была проанализирована); Рисунок 23. Распределение быков – производителей разных пород КРС Брянской области по устойчивости к лейкозу - в гетерозиготном состоянии аллели устойчивости имеют всего 9 из 29 быков черно-пестрой породы, 4 из 9 быка симментальской породы, половина быков 85 швицкой и красно-пестрой породы. Среди быков абердин-ангусов генотипов, несущих аллели устойчивости к лейкозу, не имеется. 3.4 Аллельный полиморфизм быков-производителей разных пород Брянской области по генам молочной продуктивности и качества молока Множество фенотипических признаков, к которым относятся количественные признаки сельскохозяйственных животных, является результатом интегрального взаимодействия многих генов и детерминируется сложной сетью взаимоотношений между ними. Поэтому при оценке хозяйственно-полезных признаков наиболее корректным является выявление корреляции изучаемых признаков и аллельного полиморфизма генов, контролирующих их. Селекция, основанная на этом принципе, получила название маркер – направленной селекции. Молочная продуктивность совокупным параметром, определяющим ценность коров. Она подвержена влиянию большого количества абиотических факторов внешней среды, в частности, количеству и соотношению поступающих с кормами сахаров и белков, содержанию в рационе незаменимых аминокислот, минеральных солей, воздействию температуры, влажности, газовому составу воздуха, даже температуры воды для поения. Продуктивность коров как полигенный количественный признак, складывается из интегральной экспрессии сотен генов, большая часть которых не связана с процессом лактации. Среди генов, непосредственно влияющих на молочную продуктивность и качество молока, выявлена группа, которая вносит наибольший вклад в формирование и функционирование данного признака. К ним относятся гены βлактоглобулина (BLG), пролактина (PRL) и соматотропина(GH) по AluI и MspI маркерам. а также ген, связанный с качеством молока – ген каппа-казеина (CSN). Эти гены представлены в популяции несколькими аллелями, была установлена связь 86 между определенными аллелями каждого из них и интенсивностью лактации и качеством молока – белковомолочностью и жирномолочностью. Для генотипирования животных по этим генам были разработаны методы генетического маркирования на основе ДНК-маркеров. Методы ДНК-маркирования хозяйственно-ценных признаков позволяют проводить оценку сельскохозяйственных животных, основанную непосредственно на анализе наследственной информации. Результаты молекулярно-генетического анализа ДНК быков-производителей по генам, определяющим генетический потенциал молочной продуктивности и качества молока, могут быть использованы в племенной работе и разведении животных для ускоренного формирования высокопродуктивного молочного стада. Применение метода ДНК-маркеров хозяйственно-ценных признаков позволяет целенаправленно и ускоренно обогатить популяцию КРС особями, несущими соответствующие аллели генов соматотропина (GH), β-лактоглобулина (BLG), пролактина (PRL) и каппа-казеина (CSN), определяющими высокую молочную продуктивность и качество продукции. 3.4.1 Анализ аллельного полиморфизма гена соматотропина у быков-производителей Брянской области Нами было проведено генотипирование быков госплемстанции ОАО «Брянское» по гену гормона роста (GH) по Msp I – маркеру и анализу Alu I – маркеру. Полученные результаты представлены на рисунках 23, 24 (Msp I – маркер) и 25, 26 (Alu I – маркер). На рисунке 23 приведены пример электрофореграммы результата полимеразной цепной реакции для амплификации фрагмента размером 329 п.о. гена гормона роста с праймерами для маркирования по Msp I. 87 Рисунок 23. Электрофоретический анализ продукта ПЦР гена гормона роста (GH) по Msp I – маркеру М27 – маркер молекулярных масс; 1-12 исследуемые образцы Далее фрагмент 329 п.о. подвергают гидролизу с помощью рестриктазы Msp I. И с помощью электрофореза в 6% полиакриламидном геле выявляют продукты рестрикции эндонуклеазы Msp I гена соматотропина (рисунок 24). Появление фрагментов 224 п.о. и 105 п.о. позволяет говорить о генотипе +/+, генотип -/+ характеризуется появлением фрагментов 329 п.о., 224 п.о. и 105 п.о. При отсутствии рестрикции фрагмент 329 п.о. остается неизменным – это генотип (-/-). 88 Рисунок 24. Анализ аллельного полиморфизма гена гормона роста по Msp I - маркеру pUC19/Msp I – маркер молекулярных масс; 24-32 – исследуемые образцы При исследовании гена GH по Alu I – маркеру на этапе амплификации получают фрагмент размером 223 п.о. (рисунок 25), который подвергали рестрикции Alu I. На рисунке 26 показана электрофореграмма результатов анализа: появление полос 171 п.о. и 52 п.о. свидетельствует о генотипе LL, отсутствие рестрикции говорит о VV - генотипе. Как видно на рисунке, среди проанализированных быков преобладают особи с генотипом LL. 89 Рисунок 25. Электрофоретический анализ продукта ПЦР гена гормона роста (GH) по Alu I – маркеру М27 – маркер молекулярных масс; 20-30 исследуемые образцы Рисунок 26. Анализ аллельного полиморфизма гена гормона роста по Alu I-маркеру pUC19/Msp I – маркер молекулярных масс; 1-9 – исследуемые образцы Обобщенные данные по структуре гена соматотропина у производителей разных пород Брянской области представлены в таблице 6. быков – 90 Таблица 6 Генетическая структура быков разных пород ОАО «Брянское» по гену соматотропина По Msp I – маркеру Породы быков черно-пестрая симментальская швицкая красно-пестрая абердинангусская n Частота встречаемости генотипов +/+ +/29 0,76 0,24 9 0,67 0,33 10 0,8 0,2 4 0,5 0,5 4 1 - -/- Частота встречаемости аллелей + 0,88 0,83 0,9 0,75 1 0,12 0,17 0,1 0,25 - D χ2 Ho He 0,24 0,33 0,2 0,5 0 0,21 0,28 0,18 0,38 0 Ho He 0,28 0,33 0,3 0 0,25 0,24 0,167 0,007 0,40 -0,175 0,012 0,26 0,154 0,006 0 0 0 0,21 0,190 0,008 0,143 0,004 0,179 0,009 0,111 0,002 0,316 0,038 0 0 По AluI – маркеру Породы быков черно-пестрая симментальская швицкая красно-пестрая абердинангусская Таким n Частота встречаемости генотипов LL 29 0,72 9 0,56 10 0,7 4 1 4 0,75 образом, LV VV 0,28 0,33 0,11 0,3 0,25 - была Частота встречаемости аллелей L 0,86 0,72 0,85 1 0,88 исследована V 0,14 0,28 0,15 0,12 генетическая D структура χ2 быков- производителей разных пород по гену соматотропина с учетом аллельного полиморфизма двух областей гена гормона роста КРС - интрона III и экзона V, с использованием рестрицирующих эндонуклеаз MspI и AluI, соответственно. Было выявлено, что по MspI – маркеру группа из 29 быков черно-пестрой породы имеет 88% аллелей + и 76% генотипов +/+, при этом 24% быков имели генотип +/-, и не обнаружено ни одного животного с гомозиготой -/-. 6 быков симментальской породы имеют генотип +/+ и 3 быка +/-, при наличии в стаде 83% аллелей +. 91 Из 10 быков швицкой породы 90% имеют + аллель, и 80% животных имеют генотип +/+, и 20% - +/-. Группа абердин-ангусов очень однородна – все 4 быка имеют только + аллели, и соответственно – генотипы +/+. 4 быка красно-пестрой породы имеют 75% + аллелей, и по 50% генотипов +/+ и +/-. Быки всех проанализированных пород не имеют «-» аллель в гомозиготном состоянии. При исследовании поголовья быков-производителей по Alu I – маркеру гена GH были выявлены L и V- аллели гормона роста, и результаты показывают, что частота (+) аллеля значительно превышает частоту (-) аллеля. Для всех пород показано, что быки с генотипом (+/+) встречаются намного чаще, что приводит к преобладанию (+/+)-генотипа на фоне низкой встречаемости животных (-/-)генотипом. Таким образом, анализ частоты встречаемости разных аллелей гена соматотропина по AluI– и MspI - маркерам показал, что в изученной группе быков преобладает (L)-аллель и гомозиготный генотип LL , а также (+)-аллель и гомозиготный генотип (+/+). Из литературных данных известно, что при сравнительном анализе частот Msp(-)-аллеля в группах коров черно-пестрой породы не отмечается строгой породоспецифичности частоты этого аллеля, например: чёрно-пёстрая – Брянск (0,26) и чёрно-пёстрая – Москва (0,13); немецкая чёрно-пёстрая – Германия, Думмерсторф (0,08) и немецкая чёрно-пёстрая – Германия (0,18). В литературе отмечена крайне низкая частота Msp(-)-аллеля у северо-европейских пород КРС. Частота этого аллеля наиболее высока у зебу (Lagziel et al., 2000). 3.4.2 Анализ аллельного полиморфизма гена β-лактоглобулина у быков-производителей Брянской области 92 При анализе структуры по гену β - лактоглобулина стада быковпроизводителей разных пород использовали методику Medrano и методику Гладырь. Для генотипирования стада по методике Medrano получают продукт ПЦР гена β – лактоглобулина размером 247 п.о. (рисунок 27), который при рестрикции Hae III позволяет выявить 3 генотипа быков: генотип АА имеет фрагменты 148 п.о. и 99 п.о.; генотип АВ имеет фрагменты 148, 99, 74 и 74 п.о.; генотип ВВ – 99, 74, 74 п.о. (рисунок 28). Фрагмент ДНК размером 1248 п.о., полученный при проведении ПЦР по методике Гладырь, показан на рисунке 29. Рестрикция с помощью эндонуклеазы Pvu II выявила наличие A, В аллелей βLG у различных пород КРС (рисунок 30). Рисунок 27. Анализ продуктов ПЦР гена β – лактоглобулина по методике Medrano М27 – маркер молекулярных масс; 28-39 - исследуемые образцы 93 Рисунок 28. Анализ аллельного полиморфизма гена β – лактоглобулина по методике Medrano pUC19/Msp I – маркер молекулярных масс; 28-34, 17,18 – исследуемые образцы Рисунок 29. Анализ продуктов ПЦР гена β – лактоглобулинапо методике Гладырь М27 – маркер молекулярных масс; 28-39 - исследуемые образцы 94 Рисунок 30. Анализ аллельного полиморфизма гена β – лактоглобулина по методике Гладырь. М27– маркер молекулярных масс; 51-61, 5 – исследуемые образцы Обобщенные результаты по аллельному полиморфизму гена β – лактоглобулина, выявленному по методикам Медрано и Гладырь, приведены в таблице 7. Таблица 7 Генетическая структура быков разных пород ОАО «Брянское» по гену β – лактоглобулина Породы быков черно-пестрая симментальская швицкая красно-пестрая абердинангусская По методике Гладырь и др., 2001 Частота Частота встречаемости встречаемос n Ho генотипов ти аллелей АА АВ ВВ А В 29 0,14 0,52 0,34 0,4 0,6 0,52 9 - 0,78 0,22 0,39 0,61 0,78 10 0,3 0,6 0,1 0,6 0,4 0,6 4 0,5 0,5 0,25 0,75 0,5 4 - 0,25 0,75 0,12 0,88 0,25 По методике Medrano et al., 1990 He D χ2 0,48 0,48 0,48 0,38 0,21 0,083 0,625 0,250 0,315 0,190 0,003 0,188 0,03 0,038 0,008 95 черно-пестрая симментальская швицкая красно-пестрая абердинангусская 29 0,1 9 10 0,3 4 4 - 0,55 0,35 0,78 0,22 0,5 0,2 0,75 0,25 1 0,38 0,39 0,55 0,37 - 0,62 0,61 0,45 0,63 1 0,55 0,47 0,78 0,48 0,5 0,5 0,75 0,47 - 0,170 0,625 0 0,596 - 0,014 0,188 0 0,167 - Полученные данные свидетельствуют о том, что оба метода позволяют оценить аллельный полиморфизм гена β – лактоглобулина изученной выборки быков, частота аллелей А и В, полученная по разным методикам, достаточно близка. Аллель В выявлена у всех 5 пород, ее частота превышает 60% у всех пород, кроме швицкой. Генотипы, имеющие В-аллель, составляют большинство у всех пород, причем в гетерозиготном состоянии их более 50% у всех пород, кроме абердин- ангусов. Аллель А отсутствует у быков абердин-ангусов, при использовании методики Медрано. По методике Гладырь был выявлен 1 бык, имеющий гетерозиготу АВ. При анализе коров различных пород исследователи (Дроздов, 2013; Гладырь, 2001) выявили аллели А и В у всех пород, при этом частота их встречаемости у исследуемых животных была близкой, кроме красной горбатовской породы. Частота генотипа АА была наивысшей у якутского скота (18,75%). Частота встречаемости гомозигот ВВ была максимальной в швицкой (31,25%), а минимальной в якутской (15,62%) породах. В группах быков чёрно-пёстрой и голштинской пород не было выявлено значительных различий в частотах гомозиготных генотипов АА и ВВ (Яковлев и др., 2002). При оценке полиморфизма гена бета-лактоглобулина у коров абердин-ангусской и украинской красно-пестрой молочной пород отмечено значительное преобладание частот встречаемости аллеля В по сравнению с аллелем А (Арнаут, 2008). Ранее на красной горбатовской породе была выявлена тенденция к превосходству животных с гомозиготным АА генотипом над особями с генотипами АВ и ВВ как по удою, так и по жиру. Полученные по продуктивности животных 96 молочного типа швицкой породы результаты указывают на возможное преимущество коров с АА генотипом β – лактоглобулина над АВ и ВВ по удою, хотя АС гетерозиготы показывают наивысшую продуктивность по первой лактации. Коровы швицкой породы, молочного типа с генотипом ВВ β – лактоглобулина со средними удоем 5399, имеют наивысшее процентное содержание жира и белка в молоке – 4,06 и 3,39%. 3.4.3 Анализ аллельного полиморфизма гена пролактина у быков-производителей Брянской области При проведении полимеразной цепной реакции получен фрагмент ДНК гена пролактина длиной 156 п.о. (рисунок 31), который был рестрицирован с помощью эндонуклеазы RsaI. Электрофорез в 6% полиакриламидном геле продуктов выявил 2 аллеля - А и В. Генотип АА имеет фрагмент 156 п.о.; генотип АВ составляют фрагменты 156, 82 и 74 п.о. (рисунок 32). Рисунок 31. Электрофорез в 1% агарозном геле продуктов ПЦР гена пролактина. М27 – маркер молекулярных масс; 5-14 - исследуемые образцы 97 Рисунок 32. Анализ аллельного полиморфизма гена пролактина pUC19/Msp I – маркер молекулярных масс; 20-28 – исследуемые образцы Генетическая структура поголовья быков – производителей разных пород ОАО «Брянское» по гену пролактина показана в таблице 8. Как показывают полученные результаты, быки молочных пород в основном имеют генотипы с аллелем А, обнаружено лишь 1 животное с генотипом ВВ. 3 быка абердинангусской мясной породы имеют генотип АВ. Таблица 8 Генетическая структура быков разных пород ОАО «Брянское» по гену пролактина Частота Частота встречаемости встречаемос Породы быков генотипов ти аллелей АА АВ ВВ А В черно-пестрая 29 0,62 0,35 0,03 0,79 0,21 симментальская 9 0,78 0,22 0,89 0,11 швицкая 10 0,6 0,4 0,8 0,2 красно-пестрая 4 0,5 0,5 0,75 0,25 абердин4 0,25 0,75 0,63 0,37 ангусская H H Ho He D χ2 0,35 0,22 0,4 0,5 0,75 0,33 0,2 0,32 0,38 0,47 0,061 0,1 0,25 0,316 0,6 0,0012 0,002 0,02 0,038 0,167 3.4.4 Анализ аллельного полиморфизма гена каппа-казеина 98 у быков-производителей Брянской области Аллельный полиморфизм гена каппа-казеина (CSN3) первоначально изучался на уровне белков. Казеины – белки молока, секретируемые клетками молочной железы. В период лактации на их долю приходится до 80% от всех белков, синтезируемых этими клетками. Возрастающее значение переработки молока и получения кисломолочной продукции диктует необходимость использования генетических методов для повышения экономической эффективности производства, в частности, сыроделия. Экономически важным селекционным критерием для молочных пород крупного рогатого скота является генотип племенных коров и быков по каппа-казеину. Во многих развитых странах селекция на В-аллель CSN3 включена в селекционные программы по разведению КРС. Тестирование A-и В- аллелей представляет интерес с точки зрения практики, так как молоко коров с В-аллелем каппа-казеина имеет по сравнению А-вариантом лучшую температурную устойчивость, более короткое время коагуляции, лучшую свертываемость и содержит мицеллы различной величины, что предпочтительнее для производства сыров. Выход сыра из молока коров с ВВ-генотипом на 10% выше, чем из молока с АА-генотипом. Наличие Валлеля CSN3 не только способствует увеличению выхода и качества сыров, но и коррелирует с другими ценными показателями молочной продуктивности (белковостью, удойностью). Генотипирование быков – производителей разных пород ОАО «Брянское» включает 2 этапа: проведение ПЦР для амплификации фрагмента ДНК длиной 228 п.о. и его рестрикцию с помощью эндонуклеазы Hinf I. Результаты приведены на рисунке 33 и в таблице 9. На рисунке 33 показан результат электрофореза фрагментов ДНК продуктов рестрикции гена каппа-казеина в 6% полиакриламидном геле. Генотип 99 АА составляют фрагменты 135 и 93 п.о.; генотип АВ составляют фрагменты 228, 135 и 93 п.о.; генотип ВВ – 228 п.о. Рисунок 33. Анализ аллельного полиморфизма гена каппа-казеина у быков – производителей разных пород госплемстанции ОАО «Брянское» М27 – маркер молекулярных масс; 30-38 - исследуемые образцы Таблица 9 Генетическая структура быков разных пород ОАО «Брянское» по гену каппа-казеина Частота Частота встречаемости встречаемос Породы быков генотипов ти аллелей АА АВ ВВ А В черно-пестрая 29 0,62 0,24 0,14 0,74 0,26 симментальская 9 0,22 0,45 0,33 0,44 0,56 швицкая 10 0,3 0,5 0,2 0,55 0,45 красно-пестрая 4 1 1 абердин4 1 1 ангусская H H Ho He 0,24 0,45 0,5 0 0 0,38 0,49 0,5 0 0 D χ2 -0,368 0,0516 -0,082 0,0033 0 0 - 100 Полученные результаты показывают наличие аллеля В у 26% быков чернопестрой породы, 56% симменталов и 45% быков швицкой породы. Быки краснопестрой и абердин-ангусской породы не имеют аллеля В, и соответственно все быки имеют генотип АА. У быков черно-пестрой породы 14% выборки имеют генотип ВВ, треть быков симменталов и 20% швицов имеют аллели В в гомозиготном состоянии. Ранее в стадах Брянской области был проведен анализ аллелей каппа-казеина у коров черно-пестрой и айширской пород, а также у частного скота Жирятинского района. При этом не было выявлено полиморфизма гена каппа-казеина. У 267 проанализированных особей был отмечен только генотип АА (Дроздов и др, 2009). В литературных источниках приводятся различные данные встречаемости В-аллеля у коров черно-пестрой породы в хозяйствах ЦФО – от 3% до 15-17%. В других регионах количество коров с В-аллелями может несколько выше. 101 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Полученные исследований по результаты гену согласуются BoLA-DRB3 с результатами быков-производителей генетических из племенных предприятий Ленинградской, Московской и Ростовской областей, Краснодарского края, Карелии и Финляндии (Ковалюк, 2008; Сацук, 2009; Мачульская, 2009). Данные свидетельствуют о резком преобладании аллелей чувствительности по сравнению с аллелями устойчивости у быков производителей, хотя у брянских быков относительная частота аллелей устойчивости (19%) несколько выше, чем в ОАО «Невское» (12%) и у быков из Беларуси (8,3%), при обратной тенденции частот аллелей чувствительности (60, 67 и 71% соответственно). Параллельно наблюдается сильное сужение спектра нейтральных аллелей, что может означать снижение защитной реакции организма на проникновение разных других патогенных микроорганизмов и привести к массовому распространению вызываемых ими заболеваний. Вместе с тем, проведенные нами ранее исследования аллельной структуры гена BoLA-DRB3 в стадах коров черно-пестрой породы в племенных репродукторах СПК «Агрофирма «Культура» и ООО «Новый путь» Брянской области показали, что частоты аллелей устойчивости у животных несколько выше (22,4 и 21,3%), а аллелей чувствительности значительно ниже (54 и 44%) по сравнению с результатами, полученными для быков в данном исследовании, несмотря на длительную голштинизацию стада, проводимую в этих хозяйствах (Кожевина и др., 2009; Смазнова и др., 2010; Козлов и др., 2011). В СПК «Агрофирма «Культура» и ООО «Новый путь» более 20 лет не было зарегистрировано случаев заболевания коров лейкозом. Ежегодное обследование всего молочного стада выявляло не более 0,5% РИД - положительных животных, при этом вирусоносителей сразу выбраковывали. Можно предполагать, что такая селекция обеспечила относительно более высокий уровень генетической устойчивости в этих стадах. Понятно, что дальнейшая 102 голштинизация с использованием спермы быков-улучшателей может привести к снижению генетической устойчивости. Ввиду почти полного отсутствия вируса лейкоза в этих хозяйствах можно ограничиться подбором быков-производителей таким образом, чтобы обеспечить разнообразие нейтральных аллелей и обогатить стада ЧУ генотипами, которые по данным Сацука (2009) могут иметь большую продуктивность. В хозяйствах с высоким уровнем инфицированных животных более предпочтительным может быть другой подход - на время освобождения от вируса лейкоза насытить стадо аллелями устойчивости к этому заболеванию и резко снизить уровень аллелей восприимчивости, что наряду с другими мероприятиями обеспечит условия для ускоренного оздоровления. Реализация этого подхода при использовании искусственного осеменения может быть затруднена сложностью подбора особей с аллелями устойчивости в гомозиготном состоянии из-за редкости таких быков-производителей. Можно отметить, что брянские быки, изученные в данной работе, являются носителями несколько более низкого потенциала молочной продуктивности по сравнению с быками ОАО «Невское» и быками из Беларуси (приложение), обладая при этом более высоким соотношением аллелей устойчивости и чувствительности. Складывается впечатление, что между устойчивостью к лейкозу и молочной продуктивностью имеется обратная связь. Но по данным Сацука (2009) и Мачульской (2009), наибольшей продуктивностью обладают животные с УЧ генотипами, различия между носителями только У или Ч аллелей на фоне нейтральных не достоверна. Поэтому можно предположить, что повышенная частота аллелей чувствительности у быков – улучшателей голштинской породы объясняется изначальной генетической узостью быков этой породы. Изучение продуктивностью аллельного и полиморфизма качеством молока, генов, связанных показало наличие с молочной значительного разнообразия этих генов у быков производителей. В частности, частота В-аллеля 103 каппа-казеина у быков черно-пестрой породы ОАО «Брянское» составляет около 25% при практически полном отсутствии в изученных стадах коров черно-пестрой породы Брянской области (Дроздов, 2013). Это обеспечивает определенные возможности для подбора производителей с учетом улучшения аллельного состава генов, связанных с продуктивностью и качеством молока, особенно в хозяйствах, снабжающих заводы по производству сыров и молочнокислых продуктов. При анализе аллельного полиморфизма генов β-лактоглобулина быковпроизводителей разных пород ОАО «Брянское» были использованы две альтернативные методики, которые позволяют определять одни и те же А и В аллели, но по разным сайтам мутаций, поскольку эти аллели отличаются сразу по двум аминокислотным заменам. Полное совпадение результатов наблюдается только для симментальской породы (n=9), а для всех остальных пород у отдельных особей разные методики дают противоречащие результаты. Эти данные подтверждают полученные ранее на более репрезентативных выборках коров результаты, свидетельствующие о рекомбинационном расщеплении двух данных мутаций и, соответственно, о существовании еще двух аллелей (Дроздов, 2013). В целом можно заключить, что использование молекулярно – генетических подходов, наряду с традиционными требованиями племенного дела, открывает дополнительные возможности для оздоровления животных и повышения их продуктивности. 104 ВЫВОДЫ 1. Проведен молекулярно – генетический анализ ДНК спермы у трех групп быков-производителей черно-пестрой голштинизированной породы из Брянской области, Ленинградской области и Беларуси, а также небольших выборок быков других пород из ОАО «Брянское», исследован аллельный полиморфизм гена BoLADRB3, ответственного за устойчивость к вирусу лейкоза КРС. Все группы быков различались по спектру аллелей гена BoLA-DRB3 и частоте их встречаемости. 2. При аллельном анализе гена BoLA-DRB3 обнаружено в общей сложности 24 аллеля, в том числе 17 из них - у черно-пестрой породы. 3. В аллельных спектрах гена BoLA-DRB3 быков черно-пестрой-голштинской породы преобладают аллели чувствительности к вирусу лейкоза КРС. Их частота увеличивается с ростом степени голштинизации и потенциала продуктивности (60 – 71%), а доля аллелей устойчивости падает (19 – 8,3%). 4. С увеличением уровня голштинизации также связано явление аллельного сужения – аллельное разнообразие гена BoLA-DRB3 уменьшается с 15 (у быков ОАО «Брянское») до 9 аллелей (у быков ЖодиноАгроПлемЭлита»). Аллельное сужение может привести к ослаблению потенциала устойчивости к различным болезням. 5. У быков-производителей других пород наблюдается преобладание нейтральных аллелей гена BoLA-DRB3 (44 – 87%, против 21% у черно-пестрой), при этом частота аллелей устойчивости почти 25% (кроме абердин-ангусской), а минимальная частота генов восприимчивости - 5% у швицкой. У четырех быков абердин-ангусской породы аллелей устойчивости не обнаружено. 6. Аллельный анализ генов, связанных с молочной продуктивностью, позволил выявить у быков-производителей из Брянской области все парные аллели для каждого изучаемого гена при соотношении частот аллелей от 1:9 до 1:1, кроме красно-пестрой и абердин-ангусской пород с очень маленькой выборкой (n=4). 105 7. У быков-производителей из Брянской области частота аллеля В гена каппаказеина, ответственного за качество молока, составляет 26%, что дает возможность проводить направленную селекционную работу в хозяйствах, снабжающих заводы по производству сыров и молочнокислых продуктов. ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПРОИЗВОДСТВУ Молекулярно-генетический анализ быков производителей по маркерам хозяйственно-важных признаков позволяет расширить возможности традиционной селекционно-племенной работы в животноводческих хозяйствах. Результаты, полученные при выполнении данной работы целесообразно использовать при разработке плана мероприятий для оздоровления хозяйств Брянской области от вирусного лейкоза крупного рогатого скота и повышении его продуктивности, в частности, предлагается: 1. В хозяйствах, благополучных в отношении вируса лейкоза, подбирать сперму быков – производителей так, чтобы избегать чрезмерного накопления аллелей чувствительности и поддерживать при этом по возможности больший уровень ЧУ генотипов и разнообразие нейтральных аллелей. 2. В хозяйствах, где требуется оздоровление от вируса лейкоза, проводить на период оздоровления от вируса насыщение поголовья аллелями устойчивости при уменьшении частот аллелей восприимчивости, используя для этого сперму быков с УУ и УН генотипами, для чего необходимо проводить поиск быков с генотипом УУ. 3. В связи с тем, что в некоторых хозяйствах Брянской области, в том числе имеющих цеха по переработке молока, отсутствуют коровы с В-аллелем каппаказеина, планировать племенную работу таким образом, чтобы увеличить их частоту. Это позволит повысить выход творожного сгустка и качество сырной продукции. 106 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Апалькин В.А., Гулюкин М.И., Петров Н.И. Лейкоз крупного рогатого (диагностика и оздоровительные мероприятия). С-Пб.: Петролазер, 2005. 87 с. 2. Арнаут Е.А. Использование метода ПЦР-ПДРФ для выявления наследуемых генотипов в популяциях крупного рогатого скота, разводимых на Украине // материалы 7-й международной научной конференции школы «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохо-хозяйственных животных: роль нанотехнологий в реализации приоритетных задач биотехнологии», БиоТехЖ-2008 (23-24 октября 2008). Дубровицы. 2008. C.110-114. 3. Волохов И.М., Волколупов Г.В., Евдокимова А.С., Пащенко О.В. Молочная продуктивность и технологические свойства молока коров различных генотипов по каппа-казеину [Электронный ресурс]. Режим доступа: www.korovainfo.ru 4. Генджиева О.Б., Буваева К.Б. Сравнительный анализ интенсивности проявления эпизоотического и эпидемического процессов лейкозов // материалы международной научно-практической конференции, посвященной 80-летию образования зооинженерного факультета УО «БГСХА»: актуальные проблемы интенсивного развития животноводства. Горки Белорусская сельскохозяйственная академия. 2010. С. 50-56. 5. Генджиева О.Б. Филогенетическое сравнение вируса лейкоза крупного рогатого скота // Вестник Калмыцкого университета. 2012. №2 (14). С. 10-16. 6. Гладырь Е.А. ДНК-диагностика вариантов генов каппа-казеина и беталактоглобулина у крупного рогатого скота: автореф. дис. канд. биол. наук. Дубровицы, 2001. 20 c. 7. Гулюкин М.И., Замараева Н.В., Кунаков Г.Ю., Орлякин Б.Г. Классификация ретровирусов и характеристика вируса лейкоза крупного рогатого скота // Ветеринария. М.: Колос, 2000. №5. С. 17-19. 8. Гулюкин М.И., Замараева Н.В., Коваленко Я.Р. Медико-биологические 107 аспекты вируса лейкоза крупного рогатого скота // Ветеринарная газета. 2001. №5. С. 3. 9. Гулюкин М.И., Симонян Г.А., Шишкин А.В. и др. О распространении лейкоза крупного рогатого скота // Ветеринарный консультант. 2004. № 18. С.4-5. 10. Дробот Е.В. Результаты изучения генотипического разнообразия вируса лейкоза крупного гематологического рогатого скота проявления и лейкоза: особенности автореф. эпизоотологического дис. канд. биол. и наук. Новосибирск. 2007. С. 20. 11. Дроздов Е.В., Заякин В.В., Нам И.Я. Анализ сочетания мутаций при изменении А и В аллелей гена β-лактоглобулина у КРС // Вестник Брянского государственного университета. 2010. №4. С. 136-140. 12. Дроздов Е.В., Заякин В.В., Нам И.Я.Редкие аллели генов, связанных с молочной продуктивностью, в стадах КРС Брянской области // материалы международной научно-практической конференции молодых ученых (26 апреля-8 мая): Современная биотехнология: фундаментальные пролемы, инновационные проекты и бионанотехнология. Брянск. С. 48-51. 13. Дроздов Е.В., Нам И.Я., Заякин В.В. Анализ полиморфизма генов каппаказеина, β-лактоглобулина, пролактина, рилизинг-фактора и соматотропина у коров разных пород Брянской области // сборник научных трудов по материалам научнопрактической конференции (24-25 октября 2013): Научное обеспечение инновационного развития животноводства. Жодино, РУП «Гаучно-практический центр Национальной академии Беларуси по животноводству», 2013. С. 67-69. 14. Иванов П.Л. Использование индивидуализирующих систем на основе полиморфизма длины амплифицированных фрагментов (ПДАФ) ДНК в судебномедицинской экспертизе идентификации личности и установления родства // Методические указания. Минздрав РФ, 1999. 15. Ильясов А.Г. Полиморфизм гена гормона роста крупного рогатого скота в связи с продуктивностью в Республике Башкортостан // Автореф. дисc. канд. с.-х. 108 наук, Уфа, 2008. 16. Калашникова Л.А., Дунин И.М., Глазко В.И. // ДНК-технологии оценки сельскохозяйственных животных. Московская область, Лесные Поляны: Изд-во ВНИИплем, 1999. 17. Калашникова, Л.А., Хабибрахманова Я.А. // Влияние полиморфизма генов молочных белков и гормонов на молочную продуктивность коров чернопестрой породы // Доклады РАСХН. 2009. №3. С. 49-51. 18. Ковалюк Н. В. Молекулярно-генетические аспекты в селекции и ранней диагностике лейкоза крупного рогатого скота: дис. … докт. биол. наук. Краснодар, 2008. 174 с. 19. Кузин А.И., Закрепина Е.Н. Показатели аминокислотного состава молока и сыворотки крови при лейкозе крупного рогатого скота // Профилактика и ликвидация болезней сельскохозяйственных животных. Материалы конференции. Вологда 1995. С.6-9. 20. Масленников М.Г. Использование генотипирования по локусу BoLa DRB3 в селекции крупного рогатого скота на устойчивость к персистентному лимфоцитозу: дис. … канд. биол. наук. Краснодар, 2005. 91 с. 21. Мачульская Е.В. Уровень молочной продуктивности коров голштинской породы черно-пестрой масти различных генотипов по локусам BoLA DRB3 и каппаказеина: автореф. дис. … канд. биол. наук. Ставрополь, 2009. 23 с. 22. Меньшикова З.Н., Рудакова О.Н. Оценка качества и безопасности продуктов убоя крупного рогатого скота при лейкозе // Ветеринарная медицина. 2007. №2-3. С. 13-15. 23. Меньшикова З.Н., Курмакаева Т.В., Рудакова О.Н., Боровков М.Ф., Бузераиб Абдел Крим. Ветеринарно-санитарная экспертиза продуктов убоя сельскохозяйственных животных при лейкозе // Учебное пособие. Москва. 2010. С. 78. 109 24. Мешкова Р.Я. Руководство по иммунопрофилактике для врачей // Учебное пособие. Смоленск: ГМА, 1998. 133 с. 25. Михайлова М. Е., Белая Е.В., Волчок Н.М.,. Камыш Н.А. Генотипирование полиморфных вариантов генов гомона роста (GH) и рилизинг-фактора (PIT-1) ассоциированных с молочной продуктивностью крупного рогатого скота // материалы 7-й международной научной конференции школы «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохо-хозяйственных животных: роль нанотехнологий в реализации приоритетных задач биотехнологии», БиоТехЖ-2008 (23-24 октября 2008). Дубровицы. 2008. С. 185-189. 26. Новикова Н.А. Хранение и реализация генетической информации вирусов // Учебно-методический материал по программе повышения квалификации «Хранение и обработка информации в биологических системах». Нижний Новгород. 2007. 84 с. 27. Петров Р.В. Иммунология //М.: Медицина, 1982. 368 с. 28. Покусай О.Е. Влияние полиморфизма генов молочных белков на молочную продуктивность коров черно-пестрой породы // Вестник Российского государственного аграрного заочного университета. 2011. №10 (15). 29. Рудик І.А., Копилов К.В., Басовський Д.М, Стародуб Л.Ф., Олешко В.П., Бабенко О.І. Молекулярно-генетичний та цитогенетичний аналіз української чорно-рябої молочної породи. Технологія виробництва популяції і переробки продукції тваринництва // Збірник наукових праць. № 3 (72). С. 108-111. 30. Рузина М.Н. Анализ полиморфизма гена BOLA-DRB3 в связи с генетической устойчивостью крупного рогатого скота к лейкозу и вирусоносительством. Москва, 2012. 142 с. 31. Сацук В.Ф. Использование маркера BoLA-DRB3 в селекционно-племенной работе с крупным рогатым скотом: дис. … канд. биол. наук. Ставрополь, 2009. 118 с. 32. Селионова М.И. Молочная продуктивность и уровень естественной резистентности у коров разных генотипов гена каппа-казеина // Вестник АПК 110 Ставрополья. 2011. №1(1). С. 21-24. 33. Семенюк О.В. Молекулярно-генетические аспекты оценки и прогнозирования молочной продуктивности крупного рогатого скота: автореф. дис. … канд. биол. наук, Краснодар. 2006. 21 с. 34. Смирнов П.Н. Новые аспекты методологии иммунопрофилактики болезней сельскохозяйственных животных // Труды СНИВС Екатеринбург, 1994. С. 24-25. 35. Смирнов П.Н., Белявская В.А., Грачева Н.В., Рябинина В.А. Генотипическое разнообразие вируса лейкоза крупного рогатого скота разной породной принадлежности // Аграрный вестник Урала. 2009. №7 (61) С. 89-91. 36. Смирнов Ю.П. Развитие лейкозного процесса в зависимости от среды обитания крупного рогатого скота // Aгpap.HayKa. 1998. № 1. С.18-19. 37. Стародуб Н.Ф., Стародуб В.Н. Инфекционный лейкоз крупного рогатого скота и его диагностика // Біополімер и і клітина. 2003 . Т.19. № 4. С. 307-316. 38. Сулимова Г.Е., Шайхаев Г.О. Берберов Э.М. и др. Генотипирование локуса каппа-казеина у крупного рогатого скота с помощью полимеразной цепной реакции // Генетика. 1991. Т.27. №12. С. 2053-2062. 39. Сюрин В.Н., Белоусова Р.В., Фомина Н.В. Вирус лейкоза крупного рогатого скота // М.:МВА, 1986. С.76-85. 40. Сюрин В.Н., Самуйленко А.Я., Соловьёв Б.В., Фомина Н.В. Вирусные болезни животных // М.: ВНИТИБП, 1998. С. 383- 406. 41. Танана Л.А., Епишко Т.И., Пешко В.В. Ген каппа-казеина как маркер в селекции крупного рогатого скота красной белорусской породной группы // Збірник наукових праць ВНАУ: сучасні проблеми селекції, розведення та гігієни тварин. 2013. №3(73). С. 129-135. 42. Удина И.Г., Карамышева Е.Е., Сулимова Г.Е., Павленко С.П., Туркова С.О., Орлова А.Р., Эрнст Л.К. Сравнительный анализ айрширской и черно-пестрой пород крупного рогатого скота по маркерам гистосовместимости // Генетика. 1998. Т. 34. № 12. С. 1-7. 111 43. Удина И.Г., Туркова С.О., Костюченко М.В., Лебедева Л.А., Сулимова Г.Е. Полиморфизм гена пролактина (микросателлиты, ПЦР-ПДРФ) у крупного рогатого скота // Генетика. 2001. Т.37. N.4. С.511-516. 44.Хатами С.Р., Лазебный О.Е., Максименко В.Ф., Сулимова Г.Е. ДНКполиморфизм генов гормона роста и пролактина у ярославского и черно-пестрого скота в связи с молочной продуктивностью // Генетика. 2005. Т. 41. С. 244-251. 45. Aida Y., Kohda C., Morooka A., Nakai Y., Ogimoto K., Urao T., Asahina M. Cloning of cDNAs and the molecular evolution of a bovine MHC class II DRA gene // Biochemical and Biophysical Research Communications. 1994. V. 204. P. 195–202. 46. Aida Y, Takeshima S, Nagaoka Y, Ikegami M, Gotoh-Inabe K, Kabeya H, Onuma M, Okada K. 2000. The relationship between polymorphism of the MHC class II DR gene and resistance and susceptibility to bovine leukemia virus-induced lymphoma // In: Proceedings of the International Veterinary Cytokine and Vaccine Conference 16–17 March 2000. Tsukuba, Japan. P. 159–162. 47.Akers RM, Bauman DE, Capuco AV, Goodman GT, Tucker HA. Prolactin regulation of milk secretion and biochemical differentiation of mammary epithelial cells in periparturient cows Endocrinology. 1981 Jul; 109(1):23-30. 48. Alexander, L.J., Stewart, A.F., Mackinlay, A.G., Kapelinskaya, T.V., Tkach, T.M., Gorodetsky, S.I. Isolation and characterization of the bovine kappa-casein gene // Eur. J. Blochem. 1988. V178. P. 395-401. 49. Amills M., Ramiya V., Norimine J., Lewin H. A. The major histocompatibility complex of ruminants // Scientifique et Technique. 1998. V. 17. № 1. P. 108–120. 50. Andersson L, Bohme J, Peterson PA, Rask L. Genomic hybridization of bovine class II major histocompatibility genes: 2. Polymorphism of DR genes and linkage disequi-librium in the DQ-DR region // Animal Genetics. 1986a. V.17. P. 295–304. 51. Andersson L., Lunden A., Sigurdardottir S., Davies C. J., Rask L. Linkage relationships in the bovine MHC region. High recombination frequency between class II subregions // Immunogenetics. 1988. V. 27. P. 273–280. 112 52. Aschaffenburg R., Drewy J. Genetics of the β-lactoglobulins of cow’s milk // Nature. 1957. V. 180. P. 376–378. 53. Asfaw Y., Tsuduku S., Konishi M., Murakami K., Tsuboi T., Wu D., Sentsui H. Distribution and superinfection of bovine leukemia virus genotypes in Japan // Arch. Virol. 2005 V.150. P. 493-505. 54. Azevedo A. L., Nascimento C. S., Steinberg R. S., Carvalho, M. R., Peixoto M. G, Teodoro R. L., Verneque R. S., Geimarães S. E., Machado M. A. 2008. Genetic polymorphism of the kappa – casein gene in Brazilian cattle // Genetics and molecular research. 2008. V. 7. P. 623 – 630. 55. Ballingall KT, Marasa BS, Luyai A, McKeever DJ. Identification of diverse BoLA DQA3 genes consistent with non-allelic sequences // Animal Genetics. 1998. V.29. P. 123–129. 56. Ballingall K.T., Ellis S.A., MacHugh N.D., Archibald S.D., McKeever D.J. The DY genes of the cattle MHC: expression and comparative analysis of an unusual class II MHC gene pair // Immunogenetics. 2004a. V.55. P. 748–755. 57. Band M., Larson J. H., Womack J. E., Lewin H. A. A radiation hybrid map of BTA23: identification of a chromosomal rearrangement leading to separation of the cattle MHC class II subregions // Genomics. 1998.V. 53(3). P. 269–275. 58. Barendse W., Armitage S.M., Kossarek L.M. et al. A genetic linkage map of the bovine genome // Nature Genetics. 1994. V. 6 № 3. P. 227–235. 59. Batra T.R., Lee A.J., Gavora J.S., Stear M.J. Class I alleles of the bovine major histocompatibility system and their association with economic traits // J. Dairy Sci. 1989. V. 72(8) P. 2115-24. 60. Baumgartener L., Olson C., Onuma M.,. Effect of pasteurization and heat treatment on bovine leukemia virus // J. Am. Vet. Med. Assoc. 1976. V. 169. P. 11891191. 61. Beever J.E., Lewin H.A., Barendse W., Andersson L., Armitage S.M., Beattie C.W., Burns B.M., Davis S.K., Kappes S.M., Kirkpatrick B.W., Ma R.Z., Mc Graw R.A., 113 Stone R.T., Taylor J.F. Report of the first workshop on the genetic map of bovine chromosome 23 // Anim Genet. 1996. V.27(2). P. 69-75. 62. Behl J.D., Verma N.K., Tyagi N. , Mishra P., Behl R., Joshi B.K. The Major Histocompatibility Complex in Bovines: A Review // ISRN Veterinary Science. 2012. 12 p. 63. Bingham, E.W. Role of mammary casein kinase in the phosporylation of milk proteins // Journal of Dairy Research. 1979. V. 46. P.181-185. 64. Boettcher P.J., Caroli A., Stella A., Chessa S., Budelli E., Canavesi F., Ghiroldi S., Pagnacco G. Effects of casein haplotypes on milk production traits in Italian Holstein and Brown Swiss cattle // J. Dairy Sci. 2004. V. 87. P. 4311–4317. 65. Brym P., Kaminski S., Wojcik E. Nucleotide sequence polymorphism within exon 4 of the bovine prolactin gene and its associations with milk performance traits // J. Appl. Genet. 2005. V. 46 (2) P.179-185. 66. Burke M.G., Stone R.T., Muggli-Cockett N.E. Nucleotide sequence and northern analysis of a bovine major histocompatibility class II DR beta-like cDNA // Animal Genetics. 1991. V.22. P. 343–352. 67. Burny A, Bruck C., Cleuter Y., Couez D., Deschamps J., Ghysdael J., Gergoire D., Ketmann R., Mammerickx M., Marbaix G., Portetelle D., Willems L. Bovine leukemia virus, a versatile agent with various pathogenic effects in various animal species // Cancer. Res. 1985. V. 45. P. 4578-4582. 68. Burny A., Cleuter Y., Kettmann R, Mammerickx M, Marbaix G, Portetelle D, Van den Broeke A, Willems L, Thomas R. Bovine leukemia: facts and hypotheses derived from the study of an infectious cancer // Advances in Veterinary Science and Comparative Medicine. 1988.V. 32. P. 149-170. 69. Calafat, J., Hageman P.C., Ressang A.A. Structure of C-type virus particles in lymphocyte cultures of bovine origin // J. Natl. Cancer Inst. 1974.V. 52. P. 507-519. 70. Caldwell G.G., Rosenlef R.C., Lemon H.M., et al. // Epidemiology of leukemialymphoma in mid-Nebraska. Nebr. Med. J. 1973. V. 58. P. 233-237. 114 71. Camper S.A., Luck D.N., Yao Y., Woychik R.P., Goodwin R.G., Lyons R.H. Jr, Rottman F.M. Characterization of the bovine prolactin gene // DNA. 1984. V. 3. P. 237-49. 72. Caroli A., Chessa S., Bolla P., Budelli E., Gandini G.C. Genetic structure of milk protein polymorphism and effects on milk production traits in a local dairy cattle // J. Anim. Breed. Genet. 2004. V. 121. P. 119–127. 73. Caroli A.M., Chessa S., Erhardt G. J. Milk protein polymorphisms in cattle: Effect on animal breeding and human nutrition // Journal of Dairy Science. 2009. V. 11. P. 5335-5352. 74. Chaneton L., Pérez Sáez J.M., Bussmann L. E. Antimicrobial activity of bovine β-lactoglobulin against mastitis-causing bacteria // J. Dairy Sci. 2011. V. 94. P. 138–145. 75. Coffin J.M., Hughes S.H., Varmus H.E. Retroviruses // Cold Spring Harbor Press 1997. 843p. 76. Cooke N.E. , Coit D., Shine J., Baxter J.D., Martial J.A. Human prolactin cDNA structural analisis and evolutionary comparisons // J. Biol. Chem. 1981. Vol. 256. P. 40074016. 77. Copeland T. D., Oroszlan S., Kalyanaraman V. S., Sarngadharan M. G., Gallo R. C. Complete amino acid sequence of human T-cell leukemia virus structural protein p15 // FEBS Lett. 1983 V. 162. P. 390-395. 78. Cowan C.W., Dentine M.R., Ax R.L., Schuler L.A. Restriction fragment length polymorphism associated with growth hormone and prolactin genes in Holstein bulls: evidence for a novel growth hormone allele // Animal Genetics 1989. Vol. 20. P. 157165. 79. Cui Y., Cao Y., Ma Y., Qu X., Dong A. Genetic variation in the β-lactoglobulin of Chinese yak (Bos grunniens) // Journal of Genetics V. 91. Online Resources e44–e48. Online only: http://www.ias.ac.in/jgenet/OnlineResources/91/e44.pdf 80. Dalgleilsh, D.G., Spagnuolo, P.A. and Goff, H.D. A possible structure of the casein micelle based on high-resolution field-emission scanning electron microscopy // 115 International Dairy Journal. 2004. V. 14. P. 1025-1031. 81. Davies C.J., Andersson L., Ellis S.A., Hensen E.J., Lewin H.A., Mikko S., Muggli-Cockett N.E., Van der Poel J.J., Russell G.C. Nomenclature for factors of the BoLA system 1996: report of the ISAG BoLA Nomenclature Committee // Animal Genetics 1997. V. 28. P. 159–168. 82. Davies C. J., Eldridge J. A., Fisher P. J., Schlafer D. H. Evidence for expression of both classical and non-classical major histocompatibility complex class I genes in bovine trophoblast cells // Am. J. Reprod. Immunol. 2006. V. 55. P. 188–200. 83. Donham K. J., Berg J. W., Sawin R. S. Epidemiologic relationships of the bovine population and human leukemia in Iowa // American journal of epidemiology. 1980. V.112 №1. P. 80-92. 84. Dorken H., Singer-Bakker H. Hodgkins diseasein childhood—an epidemiological study in Northern Germany // Recent Results Cancer Res1972. V. 39. P.235-240. 85. Dube S., Dolcini G., Abbott L., Mehta S., Dube D., Gutierrez S., Ceriani C., Esteban E., Ferrer J., Poiesz B. The complete genomic sequence of a BLV strain from a Holstein cow from Argentina // Virology. 2000. V. 277. P. 379–386. 86. Dukkipati V.S.R., Blair H.T., Garrick D.J., Murray A. ‘Ovar-Mhc’ - ovine major histocompatibility complex: structure and gene polymorphisms // Genet. Mol. Res. 2006. V.5 (4). P. 581-608. 87. Edwardsand S.V., Hedrick P.W. Evolution and ecology of MHC molecules: from genomics to sexual selection // Trends in Ecology & Evolution. 1998. V. 13. P. 305– 311. 88. Eenennaam A., Medrano J.F. Differences in Allelic Protein Expression in the Milk of Heterozygous κ-Casein Cows // J. Dairy Sci. 1991. V. 74(5). P. 1491-1496. 89. Eenennaam A., Medrano J.F. Milk protein polymorphisms in California dairy cattle // J. Dairy Sci. 1991. V. 74. P. 1730–1742. 90. Eigel W.N., Butler J.E., Ernstrom C.A., Farrell H.M., Harwalkar V.R., Jennes 116 R., Whitney R.McL. Nomenclature of proteins of cow’s milk // J. Dairy Sci. 1984. V. 67. P. 1599–1631. 91. Ellis S. The cattle major histocompatibility complex: Is it unique? // Vet. Immunol. Immunopathol. 2004. V. 102. P.1–8. 92. Ellis S., Codner G. The impact of MHC diversity on cattle T cell responses // Vet. Immunol Immunopathol. 2011. 93. Elsik C. G. The genome sequence of taurine cattle: A window to ruminant biology and evolution // Science. 2009. V. 324. P. 522–528. 94. Erhardt G. Detection of a new kappa-casein variant in milk of Pinzgauer cattle // Anim Genet. 1996. V. 27(2). P. 105-107. 95. Farrel H. M., Jimenez – Flores R., Bleck G. T., Brown E. M., Butler J. E., Creamer L. K., Hicks C. L., Hollar C. M., Kwai – Hang F, Swaisgood H. E. Nomenclature of the Proteins of Cows´ Milk – Sixth Revision // Journal of Dairy Science. 2004. V. 87. P. 1641 – 1674. 96. Fasal E., Jackson E.W., Klauber M. Leukemia and lymphoma mortality and farm residence // Am. J. Epidemiol. 1968. V. 87. P. 267-274. 97. Ferretti L., Leone P., Sagarmella V. Long range restriction analysis of the bovine casein genes // Nucleic Acids Research. 1990. V. 18. P. 6829 – 6833. 98. Alkan F., Oğuzoğlu T. Ç., Timurkan M. O., Karapınar Z. Characterisation of env and gag gene fragments of bovine leukemia viruses (BLVs) from cattle in Turkey // Archives of Virology. 2011. V. 156. №10. P. 1891-1896. 99. Ferrer J. F. Bovine lymphosarcoma // Adv. Vet. Sci. Comp. Med. 1980. V.24. P. 1-68. 100. Flower D.R. The lipocalin protein family: structure and function // Biochemistry Journal. 1996. V.318. P. 1-14. 101. Formaggioni P., Formaggioni P., Summer A., Malacarne M., Mariani P. Milk protein polymorphism: Detection and difusion of the genetic variants in Bos Genus // 117 Istituto di Zootecnica, Alimentazione e Nutrizione, Universita degli Studi, Via del Taglio 1999. P. 8. 102. Fox P.F. The milk protein system // Developments in Dairy Chemistry. 1989. V. 4. P. 1-53. 103. Fox P. F. Advanced Dairy Chemistry Proteins // London: Elsevier Science Publishing, 1992. 104. Fox P.F., Brodkorb A. The casein micelle: Historical aspects, current concepts and significance // International Dairy Journal. 2008. V.18(7). P. 677-684. 105. Fries R., Eggen A., Womack J.E. The bovine genome map // Mammalian Genome. 1993. V. 4. P. 405–428. 106. Gelhaus A., Forster B., Wippern C., Horstmann R.D. Evidence for an additional cattle DQA locus, BoLA-DQA5 // Immunogenetics. 1999b. V.49. P. 321–327. 107. Groenen M.A.M. et al. The nucleotide sequence of bovine MHC class II DQB and DRB genes // Immunogenetics. 1990. №31. P. 37. 108. Groenen, M.A., Dijkhof, R.J., Verstege, A.J., van der Poel, J.J. The complete sequence of the gene encoding bovine alpha s2-casein // Gene. 1993. V.123. P. 187-193. 109. Groenen M.A., Dijkhof R.J.M., Poel J.J., Diggelen R., Verstege E. Multiple octamer binding sites in the promoter region of the bovine αS2-casein gene // Nucleic Acids Research. 1992. V. 20(16). P. 4311-4318. 110. Grosclaude F., Mahé M.F., Mercier J.C., Ribadeau-Dumas B. Localisation dans la partie NH2-terminale de la caséine αs1 bovine, d'une délétion de 13 acides aminés différenciant le variant A des variants B et C / F. Grosclaude // FEBS letters. 1970. №11. P. 109-112. 111. Grosclaude F. Genetic Polymorphism of the Main Bovine Lactoproteins: Relationship with Milk yield, Composition, and Cheese yielding Capacity // INRA Prod. Anim. 1988. V. 1. P. 5 – 17. 112. Gwakisa P., Mikko S., Andersson L. Close genetic linkage between DRBP1 and CYP21 in the MHC of cattle // Mammalian Genome. 1994. V. 5 (11). P. 731–734. 118 113. Hallen E. Coagulation properties of milk: Association with milk protein composition and genetic polymorphism // Doctoral thesis. Swedish University of Agricultural Sciences. Uppsala. 2008. 114. Hediger R., Johnson S.E., Barendse W., Drinkwater R.D., Moore S.S., Hetzel J. Assignment of the growth hormone gene locus to19q26-qter in cattle and to 11q25-qter in sheep by in situhybridization // Genomics. 1990. Vol. 8(1). P. 171-174. 115. Hediger R., Ansari H.A., Stranzinger G.F. Chromosome banding and gene localizations support extensive conservation - of chromosome structure between cattle and sheep // Cytogenet Cell Genet. 1991. V. 57(2-3). P. 127-34. 116. Hernández-Ledesma B., Recio I., Amigo L. β-Lactoglobulin as source of bioactive peptides // Amino Acids. 2008. V. 35. P.257–265. 117. Horisberger, M., Vonlanthen M. Localization of glycosylated kappa casein in bovine casein micelles by lectin-labeled gold granules // Journal of Dairy Research. 1980. V.47. P. 185-191. 118. Jolles, J., Alais, C., Jolles, P. The tryptic peptide with rennin-sensitive linkage of cow’s kappa casein // Biochemica Biophysica Acta. 1968. V. 168. P. 91-593. 119. Jones W.K., Yu-Lee L.Y., Clift S.M., Brown T.L., Rosen, J.M. The rat casein multigene family: Fine structure and evolution of the beta-casein gene // Journal of Biological Chemistry. 1985. V.260. P. 7042-7050. 120. Juliarena M.A., Poli M., Sala L., Ceriani C., Gutierrez S., Dolcini G., Rodríguez E.M., Mariño B., Rodríguez-Dubra C., Esteban E.N. Association of BLV infection profiles with alleles of the BoLA-DRB3.2 gene // Animal Genetics. 2008. V. 39. № 4. P. 432–438. 121. Kabeya H., Ohashi K., Onuma M. Host immune responses in the course of bovine leukemia virus infection // J. Vet. Med. Sci. 2001. V. 63. № 7. P. 703-708. 122. Kaufman J., Salomonsen J., Flajnik M. Evolutionary conservation of MHC class I and class II molecules - different yet the same // Semin. Immunol. 1994. V.6. P. 411-424. 119 123. Kettmann, R., Cleuter Y., Mammerickx M., Meunier-Rotival M., Bernardi G., Burny A., Chantrenne H. Genomic integration of bovine leukemia provirus: Comparision of persistent lymphocytosis with lymph node tumor form of enzootic bovine leukosis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1980a. V. 77. P. 2577-2581. 124. Kettmann R., Marbaix G., Cleuter Y., Portetelle D., Mammerickx M., Burny A. Genomic integration of bovine leukemia provirus and lack of viral RNA expression in the target cells of cattle with different responses to BLV-infection // Leuk. Res. 1980b. V.4. P. 509-519. 125. Khokhlova M.P., Rakhmamin T.P. Comparative study on geographical distribution of human and cattle leukosis // Comparative Leukemia Research. 1970. V.36. P. 654-658. 126. Kerkhofs P., Heremans Н., Burny A., Kettmann R. Willems L. In vitro an d in vivo oncogenic potential of bovine leukemia virus G 4 protein // J. Virol. 1998. V. 72. P. 2554—2559. 127. Klein J., O'huigin C. Class II B MHC motifs in an evolutionary perspective. Origin of major histocompatibility complex diversity // Immunological Review. 1995. V.143. P. 89-112. 128. Kontopidis G., Holt C., Sawyer L.M. Lactoglobulin: Binding Properties, Structure and Function // Journal of Dairy Science. 2004. V.87. P. 785-96. 129. Lewin H. A. Disease resistance and immune response genes in cattle: strategies for their detection and evidence of their existence // J. Dairy Sci. 1989. V.72(5). P. 133448. 130. Lewin H. A. Schook L.B., Lamont S.J. Genetic organization, polymorphism, and function of the bovine major histocompatibility complex.The Major Histocompatibility Complex Region of Domestic Animal Species // CRC Press, Florida. P. 65–98. 1996. 120 131. Lewin H.A., Russel G.C., Glass E.J. Comparative organization and function of the major histicompatibility complex of domesticated cattle // Immunol. Rev. 1999. V. 167. P. 145-158. 132. Lin C.Y., Sabour M.P., Lee A.J. Direct typing of milk proteins as an aid for genetic improvement of dairy bulls and cows: A review // Anim. Breed. Abst. 1992. V. 60. P. 1-10. 133. Linos A., Kyle R.E., Elveback L.R., et al. Leukemia in Olmsted County, Minnesota, 1965-1974 // Mayo Clin. Proc. 1978. V. 53. P. 714-718. 134. Lucas M.H, Andrews A.H., Blowey R.W., Boyd H., Eddy R.G. Viral diseases. Enzootic bovine leukosis // Bovine medicine: diseases and husbandry. Blackwell Publishing, 1st edition. 1992. P. 530-537. 135. Lucy M.C., Hauser S.D.,. Eppard P.J, Krivi G.G., Clark J.H., Bauman D.E., Collier R.J. Variants of somatotropinin cattle: Gene frequencies in major dairy breeds and associated milk production // Domest Anim Endocrinol 1993. Vol. 10. P. 325-333. 136. Mammerickx M., Portetelle D., Burny A., Leunen J. Detection by immunodiffusion- and radioimmunoassay-tests of antibodies to bovine leukemia virus antigens in sera of experimental infected sheep and cattle // Zbl. Vet. Med. 1980. (B). V. 27. P. 291-303. 137. Martin P., Szymanowska M., Zwierzcowski L., Leroux C. The impact of genetic polymorphisms on the protein composition of ruminant milks // Reproduction Nutrition Development. 2002. V. 42. P. 433 – 459. 138. Marziali A.S., Ng-Kwai-Hang K.F. Effects of milk composition and genetic polymorphism on cheese composition // J. Dairy Sci. 1986. V. 69. P. 2533-2542. 139. McLean D. M. Influence of milk proteinvariants on milk composition, yield and cheesemaking properties // Anim. Genet. 1987. Vol. 18. P. 100-102. 140. Medrano J.F., Aguilar-Cordova E. Polimerase chain reaction – amplification of bovine beta-lactoglobulin genomic sequences and identification of genetic variants by RFLP analysis // Animal Biotechnology. 1990. V.1. P. 73. 121 141. Meirom R., Brenner J., Trainin Z. BLV-infected lymphocytes exhibit two patterns of expression as determined by Ig and CD5 markers // Vet. Immunol. Immunopathol. 1993. № 36 (2). P. 179-86. 142. Mepham T.B., Gaye P., Marin P., Mercier J.C. Biosynthesis of milk proteins // Advanced Dairy Chemistry. 1992.V.1. Proteins. P. 491-543. 143. Merezak C., Pierreux C., Adam E., Lemaigre F., Rousseau G. G., Calomme C., Van Lint C., Christophe D., Kerkhofs P., Burny A., Kettmann R., Willems L. Suboptimal enhancer sequences are required for efficient bovine leukemia virus propagation in vivo: implications for viral latency // J. Virol. 2001. V. 75. P. 6977-6988. 144. Mikko S., Andersson L. Extensive MHC class II DRB3 diversity in African and European cattle // Immunogenetics. 1995. V. 42. P. 408-413. 145. Milham S. Leukemia and multiple myeloma in farmers // Am. J. Epidemiol. 1971. V. 94. P. 307-310. 146. Miller J.M., Miller L.D., Olson phytohemagglutinin-stimulated lymphocyte C., Gillete K.G. Virus-like particles in cultures with reference to bovine lymphosarcoma // J. Natl. Cancer Inst. 1969. V. 43. P. 1297-1305. 147. Mirsky M.L., Olimstead C.A., Da Y., Lewin, H.A. The prevalence of proviral bovine leukemia virus in peripheral blood mononuclear cells at two subclinical stages of infection // J. Virol. 1996. V. 70. P. 2178–2183. 148. Mitra A., Schlee P., Balakrishnan C.R., Pirchner F. Polymorphisms at growth hormone and prolactin loci in Indian cattle and buffalo // J. Anim. Breed Genet. 1995. V. 112. P. 71-74. 149. Miyasaka T., Yakeshima S.-N., Sentsui H., Aida Y. Indentification and diversity of bovine major histocompatibility complex class II haplotypes in Japanese Black and Holstein cattle in Japan // J. Dairy Sci. 2012. V. 95. P. 420-431. 150. Morooka A., Asahina M., Kohda C., Tajima S., Niimi M., Nishino Y., Sugiyama M., Aida Y. Nucleotide sequence and the molecular evolution of a new A2 gene 122 in the DQ subregion of the bovine major histocompatibility complex // Biochemical and Biophysical Research Communications. 1995. V.212. P. 110–117. 151. Muggli-Cockett N.E., Stone R.T. Restriction fragment length polymorphisms in bovine major histocompatibility complex class II beta-chain genes using bovine exoncontaining hybridization probes // Animal Genetics. 1991. V. 22. P. 123–136. 152. Nishino Y., Tajima S., Aida Y. Cattle cDNA clone encoding a new allele of the MHC class II DQA1 gene // Immunogenetics. 1995. V.42. P. 306–307. 153. Nassiry M.R., Shahroodi F.E., Mosafer J. Analysis and frequency of bovine lymphocyte antigen (BoLA-DRB3) alleles in Iranian Holstein cattle // Genetika. 2005. №41(6). P. 817-822. 154. Onuma M., N. Sagata, K. Okada, Y. Ogawa, Y. Ikawa, K. Oshima Integration of bovine leukemia virus DNA in the genomes of bovine lymphosarcoma cells // Microbiol. Immunol. 1982. V. 26. P. 813-820. 155. Ouwehand A.C., Salminen S.J., Skurnik M., Conway P.L. Inhibition of pathogen adhesion by –lactoglobulin // International Dairy Journal. 1997. V7. P. 685-692. 156. Papiz M.Z., Sawyer E., Eliopoulos E. E. , North A. C. T., Findlay J. B. C. , Sivaprasadarao R., Jones T. A. , Newcomer M. E., Kraulis P. J. The structure of βlactoglobulin and its similarity to plasma retinol-binding protein // Nature. 1986. V. 324. P. 383 – 385. 157. Perez M.D., Calvo M. Interaction of -lactoglobulin with retinol and fatty acids and its role as a possible biological function for this protein: a review // Journal of Dairy Science. 1995. V.78. P. 978-988. 158. Prinzenberg E.M, Hiendleder S., Ikonen T., Erhardt G. Molecular genetic characterization of new bovine kappa-casein alleles CSN3F and CSN3G and genotyping by PCR-RFLP // Anim Genet. 1996. V. 27(5). P. 347-349. 159. Prizenberg E. M., Krause I., Erhardt G. SSCP Analysis et the Bovine CSN3 Locus Discriminantes Six Alleles Corresponding to Known Protein Variants (A, B, C, E, 123 F, and G) and Three New DNA Polymorphisms (H, I, A (1)) // Animal Biotechnology. V. 10. P. 49 – 62. 160. Puel A., Groot P. C., Lathrop M. G., Demant P., Mouton D. Mapping of genes controlling quantitative antibody production in Biozzi mice // Journal of Immunology. 1995. № 154. P. 5799-5805. 161. Puyol P., Perez M.D., Ena J.M., Calvo M. Interaction of bovine beta lactoglobulin and other bovine and human proteins with retinol and fatty acids // Agricultural Biological Chemistry. 1991. V.10. P. 49-62. 162. Portetelle D., Dandoy C., Burny A., Zavada J., Siakkou H., Gras-Masse H., Drobecq H., Tartar A. Synthetic peptides approach to identification of epitopes on bovine leukemia virus envelope glycoprotein gp51 // Virology. 1989. V.169(1). P. 34-41. 163. Rammensee H.G., Friede T., Stevanoviic S. MHC ligands and peptide motifs: first listing // Immunogenetics. 1995. V. 41. P. 178-228. 164. Rasmussen L.K., Hojrup P., Petersen T.E. Disulphide arrangement in bovine caseins: localization of intrachain disulphide bridges in monomers of k- and αs2-casein in bovine milk // Journal of Dairy Research. 1994. V.61. P. 485-493. 165. Renström L. Enzootic bovine leukosis // OIE Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines. France, Paris. 2000. P. 371-380. 166. Rijnkels M., Kooiman P.M., De Boer H.A., Pieper F.R. Organization of the bovine casein gene locus // Mammalian Genome. 1997. V.8. P. 148-152. 167. Rodríguez S.M., Florins A., Gillet N., Brogniez A., Sánchez-Alcaraz M. T., Boxus M., Boulanger F., Gutiérrez G., Trono K., Alvarez I., Vagnoni L., Willems L. Preventive and Therapeutic Strategies for Bovine Leukemia Virus: Lessons for HTLV // Viruses 2011. V.3. P. 1210-1248. 168. Rola-Łuszczak M., Gerilovych M., Pluta A., Vinogradova A., Olech I., Choudhury M., Donnik B., Kuźmak I., Petropavlovskiy J. The molecular characterization of bovine leukaemia virus isolates from Eastern Europe and Siberia and its impact on phylogeny // PLoS One. 2013. V. 8(3): e58705. DOI: 124 10.1371/journal.pone.0058705. 169. Rubino M.J., Donham K.J., 1984. Inactivation of bovine leukemia virusinfected lymphocytes in milk // Am. J. Vet. Res. V. 45. P. 1553-1556. 170. Russell G.C., Marello K.L, Gallagher A., Mc Keever D.J., Spooner R.L. Amplification and sequencing of expressed DRB second exons from Bos indicus // Immunogenetics. 1994. V. 39. P. 432–436. 171. Russell G.C., Davies C.J., Andersson L., Ellis S.A., Hensen E.J., Lewin H.A., Mikko S., Muggli-Cockett N.E., Van der Poel J.J. BoLA class II nucleotide sequences, 1996: report of ISAG BoLA Nomenclature Committee // Animal Genetics. 1997. V. 28. P. 169–180. 172. Russell G.C., Smith J.A., Oliver R. A. Structure of the BoLA DRB3 gene and promoter // European Journal of Immunogenetics. 2004. № 31. P.145-151. 173. Sagata N., Yasunaga T., Tsuzuku-Kawamura J., Ohishi K., Ogawa Y., Ikawa Y. Complete nucleotide sequence of the genome of bovine leukemia virus: Its evolutionary relationship to other retroviruses // Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 1985. V. 82. P. 677-681. 174. Schlee P., Graml R. Influence of growth hormone genotypes on breeding values of Simmental bulls // J. Anim. Breed. Genet. 1994a. V. 111. P. 253-256. 175. Schwaiger F. W., Maddox J., Ballingal K. et al. The ovine major histocompatibility complex,” in The Major Histocompatibilty Complex Region of Domestic Animal Species, L.B. Schook and S. J. Lamont, Eds. // CRC Series in comparative Immunology. CRC Press, Boca Raton, Fla, USA, 1996. Chapter 6. P. 121– 176. 176. Schwartz I., Lévy D. Pathobiology of bovine leukemia virus // Vet. Res. 1994. V. 25(6). P. 521-36. 177. Scott P.C., Choi C.L., Brandon M.R. Genetic organization of the ovine MHC class II region // Immunogenetics 1987. V.25. P.116–122. 125 178. Srivastava P.K., Menoret A., Basu S., Binder R.J., Kristi L. Heat-shock proteins come of age: primitive functions acquire new roles in an adaptive world // Immunity. 1998. V.8. P. 657-665. 179. Sugimoto M., Furuoka H., Sugimoto Y. Deletion of one of the duplicated Hsp70 genes causes hereditary myopathy of diaphragmatic muscles in Holstein-Friesian cattle // Anim. Genet. 2003. V. 34. P. 191-197. 180. Swaisgood, H.E. Chemistry of the caseins // Advanced Dairy Chemistry. V.1 Proteins. London, Elsivier. Applied sciences, 1992. P. 63-110. 181. Sulimova G.E., Sokolova S.S., Semikozova O.P., Nguet L.M., Berberov E.M. Analysis of DNA polymorphism of cluster genes in cattle: casein genes and major histocompatibility complex (MHC) genes // Genet. 1992. V. 26(5). P. 18-26. 182. Sulimova G.E., Udina I.G., Shaïkhaev G.O., Zakharov I.A. DNA polymorphism of the BoLA-DRB3 gene in cattle in connection with resistance and susceptibility to leukemia // Genetika. 1995. V. 31(9). P. 1294-9. 183. Sulimova G.E., Badagueva I.N., Udina I.G. Polymorphism of the κ-casein gene in subfamilies of the Bovidae // Genetika. 1996. 184. Tajima S., Tsukamoto M., Aida Y. Latency of viral expression in vivo is not related to CpG methylation in the U3 region and part of the R region of the long terminal repeat of bovine leukemia virus // J. Virol. 2003. V. 77. P. 4423–4430. 185. Takeshima S.-N., Aida Y. Structure, function and disease susceptibility of the bovine major histocompatibility complex // Animal Science Journal. 2006. V. 77. P. 138– 150. 186. Threadgill D.W., Womack, J.E. Genomic analysis of the major bovine milk protein genes // Nucleic Acid Research. 1990. V.18. P. 6935-6942. 187. Van der Maaten M.J., Miller J.M. Bovine leukosis virus // Virus Infections of Vertebrates. 1990. V. 3, P. 419-429. 126 188. van Eijk M.J., Stewart-Haynes J.A., Lewin H.A. Extensive polymorphism of the BoLA-DRB3 gene distinguished by PCR-RFLP // Anim Genet. 1992. V. 23(6). P. 48396. 189. van Eijk M.J., Beever J.E., Da Y., Stewart J.A., Nicholaides G.E., Green C.A., Lewin H.A. Genetic mapping of BoLA-A, CYP21, DRB3, DYA, and PRL on BTA23 // Mamm Genome. 1995. V. 6(2). P. 151-2. 190. Van Regenmortel M.H.V., Fauquet C.M., Bishop D.H.L., Carstens E.B., Estes M.K., Lemon S.M., Maniloff J., Mayo M.A., McGeoch D.J., Pringle C.R., Wickne D.J. Family Retroviridae. In: Virus Taxonomy; Classification and Nomenclature of Viruses // Academic Press, San Diego, CA. 2000. P. 369–387. 191. Walstra P. On the stability of casein micelles // Journal of Diary Sciences1990. V. 73. P. 1965-1979. 192. Walstra P. Casein sub-micelles: do they exist? // International Dairy Journal. 1999. V. 9(3-9). P. 189-192. 193. Xu A., van Eijk M.J., Park C., Lewin H.A. Polymorphism in BoLA-DRB3 exon 2 correlates with resistance to persistent lymphocytosis caused by bovine leukemia virus // J. Immunol. 1993. V. 151(12). P. 6977-85. 194. Yahyaoui M.H., Angiolillo A., Pilla F., Sanchez A., Folch J.M. Characterization and Genotyping of the Caprine κ-Casein Variants // J. Dairy Sci. 2003. V. 86. P. 2715–2720. 195. Zanotti M., Poli G., Ponti W., Polli M., Rocchi M., Bolzani E., Longeri M., Russo S., Lewin H.A., van Eijk M.J. Association of BoLA class II haplotypes with subclinical progression of bovine leukaemia virus infection in Holstein-Friesian cattle // Anim. Genet. 1996. V. 27(5). P. 337-41. 196. Zidi A., Sanchez A., Obexer-Ruff G., Amills M. Sequence analysis of goat major histocompatibility complex class I genes // J. Dairy Sci. 2008. V. 91. P. 814–817. 127 Приложение 1 Характеристика быков-производителей госплемстанции ОАО «Брянское» № п/п Кличка Инв. № Порода Линия Продуктивность матери средн. макс. 5314 6342 Место рождения 1 Милый 1015 Черно-пестрая Вис Бэк Айдиал 1013415 ПЗК Новая жизнь Тульская обл. 2 Витязь 5521 Черно-пестрая Вис Бэк Айдиал 1013415 7934 8204 ОПХ Дубровцы Московская обл. 3 Альпинист 5433 Черно-пестрая Вис Бэк Айдиал 1013415 7311 8126 ОПХ Дубровцы Московская обл. 4 Нектар 671 Черно-пестрая Вис Бэк Айдиал 1013415 7057 7456 5 Сапфир 685 Черно-пестрая Вис Бэк Айдиал 1013415 7013 8442 6 Дадон 283 Черно-пестрая Вис Бэк Айдиал 1013415 - 8402 7 Акробат 2793 Черно-пестрая Вис Бэк Айдиал 1013415 6152 7768 8 Гвидон 7951 Черно-пестрая Вис Бэк Айдиал 1013415 7014 8861 9 Лак 7873 Черно-пестрая Вис Бэк Айдиал 1013415 9122 10601 10 Мунк 69 Черно-пестрая Вис Бэк Айдиал 1013415 6003 6386 ЗАО Заря Подмосковья Московская обл. ЗАО Заря Подмосковья Московская обл. ЦЭБ ВНИИ кормов Московская обл. ТнВ Красный Октябрь Брянская обл. ТнВ Красный Октябрь Брянская обл. ТнВ Красный Октябрь Брянская обл. Эстония 11 Ласковый 1790 Черно-пестрая Вис Бэк Айдиал 1013415 - 7661 Эстония 12 Койт 1370 Черно-пестрая Вис Бэк Айдиал 1013415 7311 7941 Эстония 13 Мажор 463 Черно-пестрая Вис Бэк Айдиал 1013415 8983 9538 Эстония 14 Звон 646 Черно-пестрая Вис Бэк Айдиал 1013415 8942 10081 15 Фриланд 89 Черно-пестрая голштинская Вис Бэк Айдиал 1013415 - 11634 ЗАО ПЗ Гражданский Ленингр-я обл. Канада 128 16 Мутант 250 Вис Бэк Айдиал 1013415 - 8589 Канада Вис Бэк Айдиал 1013415 7179 7996 ЗАО Заря Подмосковья Московская обл. Вис Бэк Айдиал 1013415 - 13367 Вис Бэк Айдиал 1013415 - 7708 588 Черно-пестрая голштинская Черно-пестрая голштинская Черно-пестрая голштинская Черно-пестрая голштинская Черно-пестрая 17 Торшер 241 18 Салют 2239 19 Джей 446 20 Атлант Примус 59 9608 10245 21 Риск 8507 Черно-пестрая Рефлекшн Соверинг 198998 6846 7234 22 Кадр 1892 Черно-пестрая Рефлекшн Соверинг 198998 - 7489 23 Луч 9822 Черно-пестрая Рефлекшн Соверинг 198998 9343 10146 24 Алан 562 Черно-пестрая Рефлекшн Соверинг 198998 9031 10399 25 Лужок 426 Рефлекшн Соверинг 198998 6849 7436 26 Реал 1522 Рефлекшн Соверинг 198998 - 7544 27 Гордый 583 Рефлекшн Соверинг 198998 8172 8314 28 Смелый 2766 Монтвик Чифтейн 95679 - 5452 ЗАО Заря Подмосковья Московская обл. ТнВ Красный Октябрь Брянская обл. ЗАО ПЗ Константиново 29 Баян 2048 Черно-пестрая голштинская Черно-пестрая голштинская Черно-пестрая голштинская Черно-пестрая голштинская Красно-пестрая Монтвик Чифтейн 95679 6389 8325 СХА к-з Дружба Воронежская обл. 30 Чай 9686 Красно-пестрая Монтвик Чифтейн 95679 8327 8628 Воронежская ГСМ 31 Букет 9975 Красно-пестрая Вис Бэк Айдиал 1013415 7505 8480 СХА к-з Дружба Воронежская обл. 32 Мануэль 5740 8033 Австралия Ергон Красно-пестрая голштинская Черно-пестрая голштинская Рефлекшн Соверинг 198998 33 71893 9545 52 Рефлекшн Соверинг 198998 9585 11502 Канада к-з Заветы Ленина Тульская область ПЗ к-з Родина Вологодская обл. ТнВ Красный Октябрь Брянская обл. ТнВ Красный Октябрь Брянская обл. ТнВ Красный Октябрь Брянская обл. ЗАО ПЗ Гражданский Ленинградская обл. ПЗ ЗАО Заря Вологодская обл. 129 34 Бокал 5438 Симментальская Фасадник 642 4689 5449 35 Напиток 3003 Симментальская Фасадник 642 - 5335 36 Лорд 7002 Симментальская Рефлекшн Соверинг 198998 - 5653 ФГУП Краснояружский Белгородская обл. ФГУП Краснояружский Белгородская обл. Украина 37 Гамбо 1067 Симментальская Рефлекшн Соверинг 198998 - 8200 Германия 38 Лентяй 153 Симментальская Прочие лииии 6269 8038 ООО Дубрава Белгородская обл. 39 Задорный 152 Симментальская Прочие лииии 7159 9259 40 Завет 6253 Симментальская Радонис 838 6450 6792 ОАО БелгородскоеБелгородская обл. Украина 41 Мудрый 5742 Симментальская Радонис 838 5438 6000 Украина 42 Хорст 3979 Симментальская Монтвик Чифтейн 95679 - 9138 Германия 43 Зодиак 2029 Бурая швицкая Концентрат 106157 6043 6955 ГПЗ Токарево Смоленская обл. 44 Полет 8793 Бурая швицкая Концентрат 106157 7187 7492 45 Уран 8803 Бурая швицкая Концентрат 106157 6245 7088 46 Нил 8799 Бурая швицкая Концентрат 106157 9500 10484 47 Беляк 3345 Бурая швицкая Концентрат 106157 5568 6773 СПК ПЗ Доброволец Смоленская обл. СПК ПЗ Доброволец Смоленская обл. СПК ПЗ Доброволец Смоленская обл. АО Санталово Тульская обл. 48 Герой 8410 Бурая швицкая Меридиан 90827 5402 6325 49 Бочок 690 Бурая швицкая Меридиан 90827 6547 6953 50 Добрый 8791 Бурая швицкая Меридиан 90827 6831 7625 51 Поток 8673 Бурая швицкая Мастер 106902 7094 7302 52 Алмаз 2071 Бурая швицкая Амур 3033 6218 6551 ООО ПЗ Пролетарий Владимирская обл. СПК ПЗ Доброволец Смоленская обл. СПК ПЗ Доброволец Смоленская обл. ГПЗ Токарево Смоленская обл 130 Приложение 2 Характеристика быков-производителей госплемстанции ОАО «Невское» № п/п Кличка Инв. № Порода Линия Продуктивность матери средн. макс. 11454 12248 1 Эмир 446 Черно-пестрая Рефлекшн Соверинг 198998 2 Родион 206 Черно-пестрая Рефлекшн Соверинг 198998 9388 10359 3 Чибис 5805 Черно-пестрая Рефлекшн Соверинг 198998 11840 13917 4 Спартак 1090 Черно-пестрая Рефлекшн Соверинг 198998 11362 12201 5 Папирус 128 Черно-пестрая Рефлекшн Соверинг 198998 11868 13944 6 Памир 26 Черно-пестрая Рефлекшн Соверинг 198998 11628 13832 7 Нефрит 253 Черно-пестрая Рефлекшн Соверинг 198998 11998 12993 8 Миндаль 520 Черно-пестрая Рефлекшн Соверинг 198998 12851 12890 9 Ким 208 Черно-пестрая Рефлекшн Соверинг 198998 11500 12876 10 Зодиак 638 Черно-пестрая Рефлекшн Соверинг 198998 11697 12116 11 Дрейф 300 Черно-пестрая Рефлекшн Соверинг 198998 12084 13623 12 Вафельный 5103 Черно-пестрая Рефлекшн Соверинг 198998 11090 11684 13 Бенефис 349 Черно-пестрая Рефлекшн Соверинг 198998 10402 13370 14 Базальт 78 Черно-пестрая Рефлекшн Соверинг 198998 10521 11279 Место рождения ЗАО ПЗ Гражданский Ленингр-я обл. ЗАО ПЗ Гражданский Ленингр-я обл. ЗАО ПЗ Гражданский Ленингр-я обл. ЗАО ПЗ Гражданский Ленингр-я обл. ЗАО ПЗ Гражданский Ленингр-я обл. ЗАО ПЗ Гражданский Ленингр-я обл. ЗАО ПЗ Гражданский Ленингр-я обл. ЗАО ПЗ Гражданский Ленингр-я обл. ЗАО ПЗ Гражданский Ленингр-я обл. ЗАО ПЗ Гражданский Ленингр-я обл. ЗАО ПЗ Гражданский Ленингр-я обл. ЗАО ПЗ Гражданский Ленингр-я обл. ЗАО ПЗ Гражданский Ленингр-я обл. ЗАО ПЗ Гражданский Ленингр-я обл. 131 15 Бальзамин 79 Черно-пестрая Рефлекшн Соверинг 198998 10521 11279 16 Неман 335 Черно-пестрая Рефлекшн Соверинг 198998 11960 13945 17 Чухрай 1459 Черно-пестрая Вис Бэк Айдиал 1013415 11840 13917 18 Пилот 690 Черно-пестрая Вис Бэк Айдиал 1013415 8942 9735 19 Пейзаж 409 Черно-пестрая Вис Бэк Айдиал 1013415 12481 15145 20 Ниагар 869 Черно-пестрая Вис Бэк Айдиал 1013415 - 7069 21 Нежный 38 Черно-пестрая Вис Бэк Айдиал 1013415 11941 13980 22 Монарх 140 Черно-пестрая Вис Бэк Айдиал 1013415 11747 12493 23 Малевич 239 Черно-пестрая Вис Бэк Айдиал 1013415 12334 12490 24 Жан 835 Черно-пестрая Вис Бэк Айдиал 1013415 12224 17150 25 Алтай 511 Черно-пестрая Вис Бэк Айдиал 1013415 10505 10505 26 Диалог 155 Черно-пестрая Монтвик Чифтейн 95679 11308 11802 27 Даллас 363 Черно-пестрая Монтвик Чифтейн 95679 10166 11494 28 Велюр 63 Черно-пестрая Монтвик Чифтейн 95679 11102 12396 29 Адажио 1976 Черно-пестрая Монтвик Чифтейн 95679 - 8206 ЗАО ПЗ Гражданский Ленингр-я обл. ЗАО ПЗ Гражданский Ленингр-я обл. ЗАО ПЗ Гражданский Ленингр-я обл ЗАО ПЗ Гражданский Ленингр-я обл ЗАО ПЗ Гражданский Ленингр-я обл ЗАО ПЗ Гражданский Ленингр-я обл ЗАО ПЗ Гражданский Ленингр-я обл ЗАО ПЗ Гражданский Ленингр-я обл ЗАО ПЗ Гражданский Ленингр-я обл ЗАО ПЗ Гражданский Ленингр-я обл ЗАО ПЗ Гражданский Ленингр-я обл ЗАО ПЗ Гражданский Ленингр-я обл ЗАО ПЗ Гражданский Ленингр-я обл ЗАО ПЗ Гражданский Ленингр-я обл ЗАО ПЗ Гражданский Ленингр-я обл 132 Приложение 3 Характеристика быков-производителей «ЖодиноАгроПлемЭлита» НПЦ НАН Беларуси по животноводству № п/п Кличка Инв. № Порода Линия Продуктивность матери 1 Аупро 500547 голштинская Вис Айдиал 933122 средн. 10982 макс. 14078 2 Мастери 750280 голштинская Вис Айдиал 933122 14910 16545 3 Гайлурон 750274 голштинская Вис Айдиал 933122 13240 17240 4 Малстром 750225 голштинская Вис Айдиал 933122 10900 13829 5 Бачелор 750339 голштинская Вис Айдиал 933122 12551 12551 6 Релиант 750379 голштинская Вис Айдиал 933122 5637 16398 7 Шотган 750338 голштинская Вис Айдиал 933122 12096 12096 8 Хайят 750094 голштинская Рефлекшн Соверинг 198998 13103 14565 9 Зоро 750123 голштинская Рефлекшн Соверинг 198998 15368 15368 10 Скотт 750356 голштинская Рефлекшн Соверинг 198998 13512 15025 11 Сидней 750284 голштинская Рефлекшн Соверинг 198998 11300 11300 12 Самуэль 5239 голштинская Монтвик Чифтейн 95679 13626 13626 133 Приложение 4 Результаты генотипирования быков-производителей ОАО «Брянское» по гену BoLA-DRB3, а также генам молочной продуктивности и качества молока черно-пестрая порода № п/п Кличка Номер животного Генотип BoLA-DRB3 Характеристика 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 Милый Луч Ласковый Мунк Алан Койт Мажор Дадон Нектар Витязь Риск Гвидон Акробат Лак Кадр Альпинист Атлант Сапфир Звон Фриланд Ергон Торшер Смелый 1015 9822 1790 69 562 1370 463 283 671 5521 8507 7951 2793 7873 1892 5433 588 685 646 89 52 241 2766 11/23 23/7 28/32 9/10 23/22 11/24 11/24 24/3 8/18 8/7 22/24 16/24 22/24 16/22 16/24 8/16 22/24 22/22 24/24 11/37 23/37 11/22 23/22 у/у у/н у/н н/н у/ч у/ч у/ч ч/н ч/н ч/н ч/ч ч/ч ч/ч ч/ч ч/ч ч/ч ч/ч ч/ч ч/ч у/н у/н у/ч у/ч Генотип GH MspI AluI +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ -/+ +/+ +/+ -/+ +/+ +/+ -/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ -/+ +/+ +/+ LL LL LV LL LL LV LV LV LV LL LL LL LV LL LL LV LL LL LL LL LL LL LL Генотип βLG HaeIII PvuII АА АВ АВ АВ ВВ АВ ВВ АВ ВВ АВ ВВ АВ АА АВ ВВ АВ АВ ВВ АВ AB АВ ВВ АВ АА АВ АВ АВ ВВ АВ ВВ АВ ВВ АА ВВ АВ АА АВ ВВ АВ АВ ВВ АВ АВ АВ ВВ АВ Генотип CSN3 Генотип PRL АВ АВ ВВ АА АА АА АА АА АА АА АА АВ ВВ АВ АА АВ АА АА АА АВ АА АА АВ АА АА АВ АА АВ АА АВ АВ АА АА АА АА АА АА АА АА АВ АА АВ АА ВВ АВ АА 134 24 25 26 27 28 29 Лужок Реал Гордый Мутант Джель Салют 426 1522 583 250 446 2239 22/7 16/20 16/7 24/24 8/24 16/22 ч/н ч/н ч/н ч/ч ч/ч ч/ч -/+ +/+ +/+ -/+ -/+ +/+ LL LL LL LL LV LL ВВ ВВ АВ АА АВ ВВ ВВ ВВ ВВ АА АВ АВ АА АА АА АА ВВ ВВ АВ АА АА АА АВ АВ Генотип CSN3 Генотип PRL АВ АВ ВВ ВВ ВВ АА АВ АВ АА АВ АА АА АА АА АА АА АА АВ симментальская порода № п/п 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Кличка Задорный Хорст Мудрый Напиток Завет Галебо Бокал Лорд Лентяй Номер животного 152 3979 5742 3003 6253 1067 5438 7002 153 Генотип BoLA-DRB3 Характеристика 11/44 11/7 15/15 11/16 16/6 8/18 11/7/ 16/1 24/28 у/н у/н н/н у/ч ч/н ч/н ч/н ч/н ч/у Генотип GH MspI AluI +/+ +/+ +/+ -/+ +/+ -/+ +/+ +/+ -/+ LV LV LL LL LV LL LL VV LL Генотип βLG HaeIII PvuII АВ AB АВ AB ВВ АВ АВ АВ ВВ АВ АВ АВ АВ ВВ АВ АВ АВ ВВ 135 красно-пестрая порода № п/п 1 2 3 4 Кличка Мануэль Букет Баян Чай Номер животного Генотип BoLA-DRB3 Характеристика 718939545 9975 2048 9686 11/35 11/3 1/12 7/24 у/н у/н н/н н/ч Генотип GH MspI AluI -/+ +/+ +/+ -/+ LL LL LL LL Генотип βLG HaeIII PvuII АВ АВ АВ ВВ АВ АВ ВВ ВВ Генотип CSN3 Генотип PRL АА АА АА АА АА АВ АВ АА Генотип CSN3 Генотип PRL АА АВ АВ ВВ АВ АА ВВ АВ АА АВ АВ АА АА АВ АА АА АА АВ АВ АА Генотип CSN3 Генотип PRL АА АА АА АА АВ АВ АВ АА швицкая порода № п/п 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Кличка Зодиак Герой Бочок Добрый Уран Алмаз Полет Поток Нил Беляк Номер животного Генотип BoLA-DRB3 Характеристика 2029 8410 690 8791 8803 2071 8793 8673 8799 3345 23/7 28/20 28/10 28/49 28/10 7/27 7/7 10/20 7/10 22/37 у/н у/н у/н у/н у/н н/н н/н н/н н/н ч/н Генотип GH MspI AluI +/+ +/+ -/+ +/+ +/+ -/+ +/+ +/+ +/+ +/+ LV LL LL LV LL LL LL LV LL LL Генотип βLG HaeIII PvuII АВ АВ АА AB BB АВ АА АВ АА ВВ АВ АВ АА АВ АВ АВ АА АВ АА ВВ абердин-ангусскя порода № п/п 1 2 3 4 Кличка Стрегун Маяк Козырь Храбрый Номер животного Генотип BoLA-DRB3 Характеристика 519 595 1455 587 12/12 12/12 1/12 15/24 н/н н/н н/н н/ч Генотип GH MspI AluI +/+ +/+ +/+ +/+ LL LL LV LL Генотип βLG HaeIII PvuII BB BB BB BB АВ ВВ ВВ ВВ 136 Приложение 5 Результаты генотипирования быков-производителей ОАО «Невское» по гену BoLA-DRB3 № п/п Кличка Номер Генотип Устойчивые к лейкозу гетерозиготные животные с генотипом У/Н 1 2 Нежный Папирус 38 128 23/37 3/28 Характеристика у/н н/у Устойчивые к лейкозу гетерозиготные животные с генотипом У/Ч 3 4 5 6 7 Жан Диалог Нефрит Бальзамин Памир 835 155 253 79 26 16/23 11/24 23/24 16/23 16/28 ч/у у/ч у/ч ч/у ч/у Восприимчивые к лейкозу гомозиготные животные с генотипом Ч/Ч 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Бенефис Ниагар Пилот Пейзаж Базальт Велюр Алтай Ким Родион Чибис Адажио Спартак Малевич 349 869 690 409 78 63 511 208 206 5805 1976 1090 239 16/24 16/16 16/24 16/24 16/24 8/24 24/24 24/24 16/22 16/16 22/22 16/24 22/24 ч/ч ч/ч ч/ч ч/ч ч/ч ч/ч ч/ч ч/ч ч/ч ч/ч ч/ч ч/ч ч/ч Восприимчивые к лейкозу гетерозиготные животные с генотипом Ч/Н 21 22 23 24 25 26 27 28 Дрейф Вафельный Чухрай Эмир Миндаль Даллас Неман Монарх 300 5103 1459 446 520 363 335 140 10/22 10/24 3/16 10/24 10/22 3/22 3/22 3/16 н/ч н/ч н/ч н/ч н/ч н/ч н/ч н/ч Нейтральные в отношении устойчивости к лейкозу гомозиготные животные с генотипом Н/Н 29 Зодиак 638 3/3 н/н 137 Приложение 6 Результаты генотипирования быков-производителей «ЖодиноАгроПлемЭлита» НПЦ НАН Беларуси по животноводству по гену BoLA-DRB3 № п/п 1 Данные о животном Генотип Устойчивые к лейкозу гетерозиготные животные с генотипом У/Н CAN028 BEYERCREST AltaRELIANT-ET USA 62959880 09 Jun 11 11HO10148 3/11 Характеристика Н/У Устойчивые к лейкозу гетерозиготные животные с генотипом У/Ч 2 CANM 7885626 MARKWELL DUCKETT-ET CAN039 110125 0200HO00566 24/28 Ч/У Восприимчивые к лейкозу гомозиготные животные с генотипом Ч/Ч 3 4 5 6 7 8 USA M 61690982 REGEL BACHELOR CAN073 101026 0200H005485 CAN028 WINDSOR-MANOR ZORO-ET USA 133237247 12 APR 11 11HO8451 USAM 60700461 HENKESEEN HYATT-ET CAN073 080110 200H05042 CANM 102618636 DESLACS MALSTROM CAN073 091016 200H05348 Самуэль 500186 «Минское ПП» РБ Аупро 500547 «Минское ПП» РБ 24/24 Ч/Ч 16/24 Ч/Ч 8/16 Ч/Ч 8/24 Ч/Ч 8/24 16/24 Ч/Ч Ч/Ч Восприимчивые к лейкозу гетерозиготные животные с генотипом Ч/Н 9 10 11 12 CANM 103356429 FAVREAUT IERE GAILURON CAN073 110705 0200H005513 CANM 101158614 VTEUXSAULE MASTERY CAN073 090415 200H05241 CANM 7677410 MaPel Wood SCOTT CAN071 090522 200H02151 CANM 7611271 MORSAN OMANY CAN039 100223 200HO0422 14/22 Н/Ч 3/22 Н/Ч 3/24 Н/Ч 16/27 Ч/Н
