Генетика микроорганизмов Павел Несмиянов План 1. Организация генетического материала у бактерий 2. Репликация ДНК 3. Механизмы генетического разнообразия: Трансформация Конъюгация Трансдукция Мобильные генетические элементы (плазмиды, транспозоны, IS-элементы) Мутации и репарация мутаций Зачем нужно знать о генетике микроорганизмов? Плазмидная наследственность: Метициллин-резистентный золотистый стафилококк (MRSA), карбапенем-устойчивая Klebsiella pneumoniae, ванкомицин-устойчивый золотистый стафилококк Генетический обмен: приобретение E. Coli O157:H7 генов токсина Shiga от Shigella Происхождение HIV, H1N1? Конструирование бактерий с нужными свойствами Структура и функция генетического материала Поток генетической информации Структура и функция генетического материала: бактериальная ДНК Короткие Тандемные Повторы (STR) Метаболизм аминокислот Репликация и восстановление ДНК Время, за которое гены переносятся между клетками (минуты) Метаболизм липидов Метаболизм углеводов Мембранный синтез Генетическая карта E. Coli Количество оснований: 4,6 миллиона Длина: 1 мм (в 1000 раз больше самой клетки) Набор: гаплоидный Структура и функция генетического материала: бактериальная ДНК Лизированная E. Coli и молекула ДНК, вышедшая из клетки Поток генетической информации в клетке Упаковка ДНК в суперспирали Репликация ДНК Важные ферменты ДНК-гираза «Расслабляет» спираль в репликационной вилке. Хинолоны блокируют её ДНК-лигаза Соединяет нити ДНК ковалентными связями ДНК-полимераза Синтезирует и «ремонтирует» ДНК Эндонуклеазы Вырезают внутренние фрагменты ДНК Экзонуклеазы Отрезают концевые фрагменты ДНК Хеликазы Разделяют двухцепочечную молекулу ДНК Метилазы Метилируют основания ДНК Фотолиазы Используют свет для разделения пиримидиновых димеров (образуются в результате УФ-облучения) Рибозимы Удаляют интроны РНК (сплайсинг) РНК-полимераза «Снимает» РНК-копию с цепи ДНК РНК-праймаза Делает праймеры РНК для работы ДНК-полимеразы snRNP Комплекс, удаляющий интроны в РНК Топоизомераза Расплетает ДНК в процессе репликации Транспозаза Расщепляет ДНК, оставляя «липкие концы» Важные ферменты Репликация ДНК Генетическое разнообразие E. Coli – штамм K-12 E. Coli – штамм O157:H7 Генетическое разнообразие Общий предок E. Coli – штамм K-12 E. Coli – штамм O157:H7 4,6 миллионов пар нуклеотидов 5,5 миллионов пар нуклеотидов 528 «оригинальных» генов (их нет у O157:H7) 1387 «оригинальных» генов (их нет у K-12) Генетическое разнообразие Секвенировано более 30 штаммов E. Coli У штаммов E. Coli ≈18000 генов (ПАНГЕНОМ) Анимация: механизмы генетического разнообразия Трансформация: эксперимент Гриффита (1928) Трансформация Конъюгация F=fertile (фертильность) Трансдукция Трансдукция: общая и специфическая Плазмиды Что кодируют плазмиды? Пили для конъюгации (F-плазмиды, конъюгативные) Устойчивость к антибиотикам (R-плазмиды) Бактериоцины (колицины) (Col-плазмиды) Факторы патогенности (Entплазмиды, Hly-плазмиды) Ферменты метаболизма Ti-плазмиды индуцируют опухоли у растений Несовместимые плазмиды Неинтегративные и интегративные плазмиды Использование плазмид: генетическая модификация растений Анимация: конъюгация и перенос плазмиды Транспозоны и IS-элементы Кодируют белки Содержат только последовательности встраивания Анимация 1: рекомбинация Мутагенез: тест Эймса Мутации изменения в последовательности отдельных нуклеотидов ДНК, которые передаются по наследству Спонтанные – возникают самопроизвольно. Индуцированные – возникают в результате воздействия мутагенов (УФО, гамма-излучение, температура, нитраты, нитриты, азотистая кислота, аналоги пуриновых и пиримидиновых оснований, транспозоны и др.) По протяженности: • точечные – повреждение одной пары нуклеотидов • протяженные (сложные) или аберрации: делеция – выпадение нескольких пар нуклеотидов дупликация – добавление нуклеотидных пар транслокация – перемещение фрагментов хромосомы инверсия – перестановка нуклеотидных пар Мутации Точечные мутации замены оснований классифицируют на транзиции и трансверсии • Транзиция — одно пуриновое основание замещается на другое (аденин на гуанин или наоборот), либо происходит аналогичная перестановка пиримидиновых оснований (тимин с цитозином). • Трансверсия — пуриновое основание замещается на пиримидиновое основание или наоборот. Точечные мутации сдвига рамки чтения классифицируют на делеции и инсерции Дым шел три дня • Делеции — в молекуле ДНК выпадает один или несколько нуклеотидов Дыш елт рид ня • Инсерция — в молекулу ДНК встраивается один или несколько нуклеотидов Дым шее лтр идн я Мутации Точечные мутации по эффекту, который изменённый нуклеотид оказывает на триплет: Дым шел три дня Нонсенс-мутация — мутация, в результате которой кодон теряет способность кодировать какую-либо аминокислоту и становится стопкодоном, что приводит к преждевременной терминации синтеза белка Дым шел (stop) Миссенс-мутация — переключает кодон на кодирование другой аминокислоты. Дым шел три пня Сеймсенс-мутация — кодон продолжает кодировать ту же аминокислоту. Мутации • Прямые мутации – возникают в геноме дикого типа бактерий и приводят к потере функции (мутанты). • Обратные мутации (реверсия) – в результате мутации происходит восстановление исходного дикого генотипа (ревертанты). • Супрессорная мутация – мутация восстанавливает только фенотип. Репарационные системы • Световая – связана с деятельностью фотореактивирующих ферментов, которые расщепляют тиминовый димер. • Темновая – дефектные участки ДНК удаляются и образовавшаяся брешь достраивается при помощи полимеразы и соединяется с цепью лигазой. Мутации: световая репарация Мутации: эксцизионная репарация Анимация: восстановление ДНК Мутации: последствия • • • • изменение морфологии, устойчивость к антибиотикам, снижение вирулентности, S-R- диссоциация колоний на питательной среде, • возникновение потребностей в факторах роста и т.д.