Молекулярная биология Скоблов Михаил Юрьевич Лекция 7
реклама
Молекулярная биология Лекция 7. Репликация и репарация. Скоблов Михаил Юрьевич Часть 1. Репликация ДНК Эксперимент Мезельсона и Сталя 1958 год ДНК-полимераза • В 1956 г. Корнберг выделил из клеток бактерии Е. coli фермент ДНК-полимеразу (ДНК-полимераза I). • Этот фермент осуществлял синтез ДНК при наличии в реакционной смеси всех четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов: АТФ, ГТФ, ТТФ, ЦТФ и молекулы ДНК • В 1959 г. получил нобелевскую премию «За открытие механизмов биологического синтеза рибонуклеиновой и дезоксирибонуклеиновой кислот». Артур Корнберг Репликация ДНК Репликация ДНК — процесс синтеза дочерней молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты на матрице родительской молекулы ДНК. «Каждая цепь двуцепочечной ДНК служит матрицей при синтезе комплементарной цепи и в результате образуются две пары цепей, в каждой из которых только одна является родительской» – Уотсон и Крик. Основные этапы репликации: 1. Инициация 2. Элонгация 3. Терминация Основные ферменты репликации • ДНК-полимераза - фермент катализирующий полимеризацию дезоксирибонуклеотидов на матрице ДНК по принципу комплементарности • ДНК-лигаза – фермент катализирующий образование фосфодиэфирных связей между 5'-фосфорильной и 3'гидроксильной группами соседних дезоксинуклеотидов в местах разрыва двуцепочечной ДНК • ДНК-хеликаза – фермент разделяющий цепи двухцепочечной ДНК на одинарные. • ДНК-топоизомераза фермент изменяющий степень сверхспиральности ДНК, путем внесения одноцепочечных разрывов в ДНК. • ДНК-праймаза — это фермент РНК-полимераза, синтезирующий короткий фрагмент РНК, называемый праймером, комплементарный одноцепочечной матрице ДНК. Ориентация цепей в ДНК Репликация ДНК у E.coli STEP1: DnaB helicase(blue) separates a dsDNA into two ssDNAs, as cutting the hydrogen bands between base pairs. Topoisomerase(lime green) has a role in rewinding the twist of double helices which was generated by the dsDNA separation. STEP2: The separated ssDNA has a tendency of annealing. For preventing annealing, Single-Stranded DNA Binding Protein: SSB bind to separated ssDNA. STEP3: DnaG primase(purple) is activated by binding to DnaB helicase, and synthesizes a short RNA primer approximately 10 nucleotides long using a ssDNA as a template. STEP4: DNA polymerase III elongates a new ssDNA strand by adding a deoxyribonucleotide at a time in the 5'-3' direction to the RNA primer, using a ssDNA as a template. Репликация ДНК у E.coli • Лидирующая цепь удлиняется ДНКполимеразой в направлении 3’-конца • Отстающая цепь удлиняется по иному механизму: Репликация ДНК у E.coli Репликации у прокариот Инициация репликации • Репликация ДНК начинается в специфических местах называемых точками начала репликации (origin). • Чем больше размер генома организма, тем большее количество точек репликации ему необходимо: у E.coli, бактериофага лямбда, вируса SV40 – один origin, в эукариотических клетках – множественные начала репликации расположеные на расстоянии 20 т.п.н.. Элонгация • Скорость репликации у бактерий порядка 100 000 пар нуклеотидов в минуту, у эукариот - 500—5000. • Репликация E.coli занимает около 40 минут, в то же время клетки делятся примерно каждые 20 минут – репликация ДНК инициируется при не законченной предыдущей. Репликации у прокариот Терминация репликации Топоизомераза II также принимает участие в рахсождении двух дочерних кольцевых ДНК конкатамеров Репликация ДНК по принципу катящегося кольца Одноцепочечная ДНК Двухцепочечная ДНК Репликации у эукариот Ori - AT-богатые, легкоплавкие участки длинной ~200 пн, расположенные, как правило, между генами в промоторных областях. Репликация теломер Теломе́ры (от др.-греч. τέλος — конец и μέρος — часть) — концевые участки хромосом Нобелевская премия по физиологии и медицине 2009 года американских учёных Элизабет Блэкбёрн (Elizabeth H. Blackburn), Кэрол Грейдер (Carol W. Greider) и Джек Шостак (Jack W. Szostak) «за открытие того, как теломеры и фермент теломераза защищают хромосомы» Репликация теломер Теломераза — фермент, добавляющий особые повторяющиеся последовательности ДНК (TTAGGG у позвоночных) к 3'-концу цепи ДНК на участках теломер, которые располагаются на концах хромосом в эукариотических клетках. Клеточный цикл и его регуляция • Период существования клетки от одного деления до другого называется митотическим или клеточным циклом. • У высших организмов он занимает от 10 до 30 часов, у человека 24 часа • У бактерий – менее часа, около 20 минут Разница в репликации у прокариот и эукариот Часть 2. Репарация Источники повреждения ДНК • У бактерии кишечной палочки E.coli известно более 50 генов, контролирующих процессы репарации. • В среднем в процессе репликации генома млекопитающего длинной 3 млрд нуклеотидов возникает не более 3 ошибок • Ежедневно в молекулах ДНК каждой клетки человеческого тела около 100000 звеньев повреждаются за счет разнообразных эндогенных процессов и экзогенных генотоксичных воздействий. • Менее 1 повреждения ДНК из 1000 превращается в мутацию. Репарация ДНК • Репарация генетических повреждений – свойство живых организмов восстанавливать нарушения и повреждения, возникшие в ДНК в результате ошибок репликации, а также при воздействии разнообразных эндогенных и внешних мутагенных факторов. • Повреждение ДНК – это не мутация. • Мутация – это наследственное (фиксированное) изменение в нуклеотидной последовательности генома организма. Основные повреждения ДНК Наследственные заболевания • • • • Частота генетических заболеваний варьируется от 1:10 000 до 1:1 000 000 Бывают и уникальные заболевания, 1 на 6 000 000 000 Общая частота генетических заболеваний в популяции составляет около 3% В арабских странах около 6% (за счет близкородственных браков) Генетический груз популяции каждый человек является носителем в среднем трех аутосомно-рецессивных аллелей Болезни ассоциированые с дефектами системы репарации Репарация ДНК 1. Репарация неспаренных оснований. 2. Восстановление исходной структуры. 3. Эксцизионная репарация • Вырезание оснований • Вырезание нуклеотидов. 4. Пострепликативная репарация • Рекомбинационная репарация • SOS-репарация – мутагенный или «ошибочный» путь репарации. Прямая репарация • В следствии УФ-излучения возникают пиримидиновые димеры (часто тиминовые димеры) или 6-4-фотопродукт • В основном они блокируют транскрипцию, и только небольшая часть приводит к мутациям. Тиминовый димер 6-4-фотопродукт Фотореактивация • В фотореактивации участвует фермент фотолиаза, мономерный флавинзависимый фермент, и кофакторы : FADH- и 5,10-метенилтетрагидрофолат (5,10-MTHF) • Фотолиаза связывается в темноте с димерами ТТ • На свету кофактор абсорбирует фотон • Используя эту энергию фотолиаза расщепляет ТТ димер • Фотолиаза освобождает ДНК Фотолиазы • Принадлежат большому семейству фотолиазкриптохромов. • Представители этого семейства широко распространены во всех царствах • У растений криптохромы регулируют рост, регулируемый синим светом, а у животных – циркадные ритмы. Эксцизионная репарация Mismatch repair Base excision repair (BER) Nucleotide excision repair (NER) Mismatch repair (MMR) Мисматч репарация: выявляет некомплементарн ую пару только на дочерней цепи ДНК и производит замену неправильного основания только на дочерней цепи. Mismatch repair (MMR) Перед репликацией ДНК находится в метилированной форме, вновь синтезированная цепь неметилирована Mismatch repair (MMR) Основные белки метил-направляемой MMR в E. Coli: • Mut S и Mut L узнают ММ • Mut H • Узнает полуметилированный • сайт GATC и делает надрез • MutU (UvrD) –геликаза II раскручивает дуплекс и освобождает надрезанную область Mismatch repair у человека Mismatch repair у человека • Система MMR у эукариот организована сложнее функционирует эффективнее по сравнению с бактериями. • У эукариот MMR исправляет все некомплементарные пары оснований и, кроме того, репарирует делеции или инсерции в рекомбинационных гетеродуплексах размером до 12 н. • У бактерий MMR неспособна исправлять пары С*С и репарирует делеции/инсерции не более 3 н. в рекомбинационных гетеродуплексах. • Ключевые белки MMR – MutL и MutS высококонсервативны, их гомологи обнаружены у всех организмов от E.coli до человека. • Если у E.coli эти белки (и кодирующие их гены) уникальны, то у эукариот имеется по несколько их гомологов (паралогов). Например, у дрожжей Saccharomyces cerevisiae обнаружены 3 гомолога MutL и 6 гомологов MutS, у человека – 11 гомологов MutL и 4 MutS. Эксцизионная репарация Base excision repair - BER • ДНК гликозилазы, распознают аномальные основания ДНК и катализируют гидролитическое расщепление N-glycosyl связи, между основанием и сахаром. • Образуется AP-сайт (apurinic/apyrimidinic) • АП-сайт распознается АП-эндонуклеазой, которая вводит в нить ДНК разрыв. • Фосфодиэстераза отщепляет от ДНК сахарофосфатную группу, к которой не присоединено основание. • Брешь размеров в 1 н. застраивается ДНК-полимеразой I и концы ДНК соединяются ДНК-лигазой. В каждой клетке млекопитающих за одну 20-ти часовую генерацию спонтанно возникает около 10000 апуриновых сайтов и около 500 – апиримидиновых. Эксцизионная репарация Nucleotide excision repair - NER • Узнавание повреждений • Связывание мультисубъединичного комплекса с поврежденным сайтом • Двойное надрезание поврежденной цепи на несколько нуклеотидов от поврежденного сайта в обоих направлениях 5' и 3' • Освобождение олигонуклеотида, содержащего повреждение между двумя надрезами • Заполнение образовавшейся бреши ДНК полимеразой • Лигирование Эксцизионная репарация • У эукариот система эксцизионной репарации нуклеотидов функционирует по той же схеме, что и у бактерий, но организована сложнее и работает эффективнее, по сравнению с бактериями. • Эукариотическая эксцинуклеаза включает, по крайней мере 17 белков, и при эксцизии вырезаются 29 н. Пострепликативная репарация • Этот способ восстановления целостности ДНК заключается в репарации пробелов, образующихся в дочерних цепях напротив не удаленных в ходе репликации димеров. • Основная часть таких пробелов репарируется путем рекомбинационных обменов между двумя сестринскими цепями. В процессе используются ферменты ДНКполимераза I и лигаза, и белок RecA. SOS-репарация • Ключевая роль в SOS-индукции принадлежит белку RecA. Он связывается с белком SSB и с однонитевой ДНК и образует ДНКбелковые филламенты, представляющие собой активную форму белка, обозначаемую как RecA*. • RecA* является сигналом, запускающим индукцию SOS-регулона (около 30 генов), продукты которых необходимы для выживания клетки при массовых повреждениях ДНК. • В SOS-регулон входят гены UmuD, UmuC и DinB, продукты которых необходимы для «обходной» (translesion) репликации. • Обходная репликация является неточной, склонной к ошибкам. В результате повышается частота мутаций.
