Разработка метода определения аллелей гена DRB1

НОВОСИБИРСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
ФАКУЛЬТЕТ ЕСТЕСТВЕННЫХ НАУК
КАФЕДРА ЦИТОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ
Разработка метода определения
аллелей гена DRB1 системы HLA
Кечин Андрей
Научный руководитель:
к.б.н. Боярских У. А.
Институт химической
биологии и фундаментальной
медицины
1
Введение: Что такое HLA?
• HLA (MHC) – важнейшая роль в
распознавании «свой-чужой»
• Анализ обязателен перед
трансплантациями и ЭКО
• С некоторыми аллелями генов
HLA ассоциированы c
заболевания
• 2 основных класса: I и II
• MHC II класса: DR
2
Введение: Строение DR
•
•
•
•
•
Аллели DRB1
Из α- и β-цепей
α кодируется геном DRA
β – DRB1, DRB3, DRB4 и DRB5
DRB1 – 1094 аллеля
DRB3, DRB4 и DRB5, а также
псевдогены DRB2, DRB6, DRB7,
DRB8 и DRB9 присутствуют в геноме
только для некоторых гаплотипов *
Дополнительные гены/псевдогены
*01, *10
*08
*15, *16
DRB6, DRB9
DRB9
DRB5, DRB6, DRB9
*03, *11, *12, *13, *14
DRB3, DRB2, DRB9
*04, *07, *09
DRB4, DRB7, DRB8, DRB9
* Gongora, R., Figueroa, F. & Klein, J. The HLA-DRB9 gene and the origin of HLA-DR
haplotypes. Human immunology 51, 23–31 (1996).
3
Введение: Методы типирования DRB1
• 3 основных метода: SSP, rSSO и SBT
• SSP (аллель-специфические праймеры) – дешевый,
трудозатратный и медленный (14 ПЦР: 19 праймеров+28
флуоресцентных зондов*)
• rSSO (аллель-специфические олигонуклеотиды) –
быстрый и дорогой
• SBT (типирование, основанное на секвенировании) –
требует специального оборудования, средний по
стоимости
• Метод SBT: 8 ПЦР -> 1-2 секвенирований
*Method and kit for the genotypification of hla-drb based on real time pcr, EP1743946 A1, 2004
4
Введение: метод SBT
Метод SBT: 8 ПЦР -> 1-2 секвенирований
Название
Последовательность *
DRB1*01
CACGTTTCTTGTGGCAGCTTAAGTTTGAATGTCATTTCTTC
AATGGGACGGAGCGGGTGCGGTTGCTGGAAAGATGCATCT
ATAACCAAGAGGAGTCCGT
CACGTTTCTTGGAGTACTCTACGTCTGAGTGTCATTTCTTC
AATGGGACGGAGCGGGTGCGGTACCTGGACAGATACTTCC
ATAACCAGGAGGAGAACGT
CACGTTTCTTGKRGYASYYTAMGTYTGARTGTCATTTCTTC
AATGGGACGGAGCGGGTGCGGTWSCTGGAMAGATRCWTC
YATAACCARGAGGAGWMCGT
DRB1*03
Гетерозигота
*приведены только первые 100 нуклеотидов второго экзона гена DRB1
5
Введение: метод SBT
Результат Blast IMGT/HLA, если не разбивать на 8 групп:
Но на самом деле генотип DRB1*01/DRB1*03!
6
Цель и задачи работы
Разработать новый метод определения аллелей гена
DRB1
Задачи:
1.Разработка программы для анализа полученных в
результате секвенировании последовательностей,
позволяющей выявлять оптимальное сочетание аллелей.
2.Разработка метода специфичной амплификации второго
экзона гена DRB1.
3.Сравнение результатов типирования DRB1 с
использованием метода, разработанного нами, и
референсного метода SBT.
7
Результаты: Разработана программа
Интерфейс программы
8
Результаты: Разработана программа
Алгоритм программы
Последовательность
Функция
выравнивания
Функция
сравнения
Генотип
Выбор сочетания
аллелей
9
Результаты: Разработана программа
Алгоритм программы
Номера аллелей
в списке
Введенная последовательность
AGSTCCYCGCG
AGCTCCTCGCG – 1й аллель
AGGTCCCCGCG – теоретический
аллель
Число совпавших
нуклеотидов между
вторым аллелем и
введенной
последовательностью
Число совпавших
нуклеотидов между
вторым аллелем и
теоретическим аллелем
10
Результаты: Разработана программа
Преимущества разработанной программы
• Позволяет не разбивать аллели на несколько групп
• Результат программы – не список нескольких
аллелей, а конкретное сочетание 2х аллелей
11
Результаты: Разработан метод
амплификации гена DRB1
Попытка мультиплексной аллель-специфической ПЦР с
восьмью прямыми праймерами и 1 обратным (подход № 1)
1
1/4
Генотип по разрабатываемому
методу
1/DRB6*01, 4/DRB6*01
2
3/14
14/DRB3*02
3
7/10
7/10
4
8/16
16
5
3/9
3/9
6
11/13
11/DRB3*03, 13/DRB3*03
7
4/12
4/12, 13/DRB3*02
8
1/15
15
Образец Генотип по методу SBT
12
Результаты: Разработан метод
амплификации гена DRB1
Подходы
Мультиплексная аллельспецифичная ПЦР
(5 групп-специфичных
реакций)
1 пара общих
праймеров+
ингибирующие пробы
Подход № 2
Подход № 3
В качестве референсного метода использовался SBT
13
Результаты: Разработан метод
амплификации гена DRB1
Конструирование праймеров для подхода № 2
Красный – 1й групп-специфичный праймер
Фиолетовый – 2й групп-специфичный праймер
Черный – 3 праймера для аллелей 4, 9 и 10
14
Результаты: Разработан метод
амплификации гена DRB1
Проблема «неспецифичности» ПЦР
328
242
328
242
Электрофореграмма
амплифицированных ДНК-образцов,
8 %-ный ПААГ
1, 2, 3, 4 – образцы различных генотипов
M – маркер pBlueScript Msp I
Электрофореграмма
амплифицированных ДНКобразцов, 12 %-ный
денатурирующий ПААГ
15
Результаты: Разработан метод
амплификации гена DRB1
Проверка подхода №2
5 групп-специфичных прямых праймеров и 1 обратный
– в одной ПЦР-смеси
1, 7, 15, 16
3, 8, 11-14
4
9
10
Общий
обратный
№
Обр
Генотип по
методу SBT
1
2
3
4
5
6
7
8
9
7/10
4/8
1/15
11/13
4/12
11/15
8/16
3/9
13/15
Генотип по
разрабатываемому
методу
7/10
4/8
1/15
11/13
4/12
11/15
8/16
3/9
13/15
16
Результаты: Разработан метод
амплификации гена DRB1
Конструирование праймеров для подхода № 3
Красный – общий для всех аллелей прямой праймер
Фиолетовый, черный и желтый – ингибирующие пробы для DRB3,
DRB4678 и DRB5, соответственно
17
Результаты: Разработан метод
амплификации гена DRB1
Проверка подхода №3
18
Результаты: Разработан метод
амплификации гена DRB1
Проверка подхода №3
*
**
Генотип образца DRB1*13/DRB1*13
Сверху – без ингибирующей пробы
Снизу – с ингибирующей пробой
* - G – от DRB3*02, A – от DRB1*13;
** - C – от DRB3*02, G – от DRB1*13
*
**
19
Результаты: Разработан метод
амплификации гена DRB1
Типирование образцов референсным методом SBT
•Пациенты – доноры крови Областной клинической
больницы г. Новосибирска
•ДНК была выделена из лейкоцитарной массы 50
образцов стандартным методом и очищена экстракцией
примесей фенол-хлороформом и осаждена этанолом
•Типирование образцов методом SBT: проведение 8ми
аллель-специфичных амплификаций с последующим
секвенированием и анализом полученной
последовательности с помощью Blast
20
Результаты: Сравнение результатов
типирования ДНК-образцов методом,
разработанным нами, и методом SBT
•
•
•
Сравнение подхода №2: при использовании
мультиплексной аллель-специфичной амплификации с
5-ю прямыми праймерами
Получено 100 % совпадение результатов
Коамплификации генов-паралогов или псевдогенов не
наблюдалось
21
Выводы
1. Разработана программа для анализа полученных в
результате секвенирования последовательностей,
позволяющая определять генотип образца по гену DRB1.
2. Наилучшим методом специфичной амплификации второго
экзона гена DRB1 была выявлена мультиплексная аллельспецифичная ПЦР с использованием пяти прямых
праймеров и одного обратного.
3. Результаты типирования DRB1 разработанного нами метода
подтверждались референсным методом SBT, совпадение –
100%.
22
Образец Генотип по методу SBT
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
1/4
13/13
11/11
4/10
10/11
3/14
7/16
3/16
3/4
7/14
1/4
3/7
1/10
11/11
11/11
10/15
3/11
3/15
3/13
3/15
4/7
Генотип по разрабатываемому
методу
1/4
13/13
11/11
4/10
10/11
3/14
7/16
3/16
3/4
7/14
1/4
3/7
1/10
11/11
11/11
10/15
3/11
3/15
3/13
3/15
4/7
23
Образец Генотип по методу SBT
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
7/15
9/11
1/15
1/11
8/14
1/11
7/7
3/12
7/12
15/15
7/8
13/15
1/7
3/7
4/15
14/15
1/7
4/13
4/7
10/16
Генотип по разрабатываемому
методу
7/15
9/11
1/15
1/11
8/14
1/11
7/7
3/12
7/12
15/15
7/8
13/15
1/7
3/7
4/15
14/15
1/7
4/13
4/7
10/16
24
Введение: Какие классы?
MHC
•
•
•
•
MHC I класса
У большинства клеток
Тяжелая цепь + β2m
Узнаются CD8+-T-клетками
HLA-A, HLA-B* и HLA-C
•
•
•
•
MHC II класса
Только у АПК
α+β
Узнаются CD4+-T-клетками
DP, DQ, DR*
* Наиболее полиморфные антигены своего класса
25
Введение: Методы анализа DRB1
DRB1*03:01:01:01
Параметр
Стоимость
(руб., за 25 тестов)
Число операций
для 1 анализа
Время анализа, ч
Количество тестов
за 1 прогон
SSP
rSSO
SBT
6500
50000
7-10
13+13
2
8+8+2
3-4
1,5-2
2-6
1-10
До 96
До 96
26