ферменты в иммунологических реакциях, новый этап изучения

УДК 577.15: 612.017.1
ФЕРМЕНТЫ В ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЯХ,
НОВЫЙ ЭТАП ИЗУЧЕНИЯ
Н.А. Добротина, Г.А. Кравченко, Ж.А. Казацкая,
Е.С. Васильева, И.Р. Нурова
Нижегородский госуниверситет
Представлены литературные и собственные данные о значении различных механизмов действия ферментных систем в иммунных реакциях:
обработка антигена, регуляция иммунитета, обеспечение системности и
стадийности процесса. Взаимосвязь иммуномодулирующей и ферментативной активности показана авторами на широком спектре энзимов. В
качестве примера представлены механизмы действия следующих препаратов: лизоцим, церулоплазмин и протеолитические ферменты.
Иммунология исключительно быстро развивается, ее данные переосмысливаются; прогнозируется, что в ближайшие десятилетия иммунология сохранит приверженность к использованию принципов и методов молекулярной и клеточной
биологии. Данное направление характеризуется редукционалистским подходом,
т.е. происходит моделирование, сведение к упрощению организации. Актуальным
является накопление сведений: о рецепторных структурах клеток иммунной системы; о биохимических, в том числе и ферментативных, основах иммунных перестроек; о лигандах мембранных рецепторов, цитокинов и других гуморальных
факторов; о межклеточных коммуникациях; об эффекторных и транссигнальных
взаимоотношениях, которые можно определять и с помощью модели розеткообразования (РО). Именно эти аспекты нашли отражение в настоящей работе.
Сложная проблема регуляции, управления иммунитетом автономна, иерархична, системна. Ферменты принимают большое участие на разных уровнях регуляции, оказывают специфичный и параспецифичный эффект. Для иммунореакции
характерны все типы энзиматической регуляции, то есть в открытой системе
клетки проходят многоступенчатые, цепные, волновые процессы, которые обеспечивают системность и стадийность адаптивного иммунного ответа. Однако есть
и принципиальные отличия энзимологии иммунокомпетентных систем: их сложнейший и активно функционирующий рецепторный аппарат, колоссальное биоразнообразие, кооперативные взаимодействия, иммунологическая память; все это
обеспечивается и ферментативными реакциями.
Во внутриклеточном ферментативном механизме регуляции, в передаче сигнала работающей клетке много общего в нервной и иммунной системах. В 2000 г.
Нобелевскими лауреатами в области физиологии и медицины стали Карлесон,
Грингард и Кандель за расшифровку механизмов передачи сигналов от рецепторов внутрь клетки. Для иммунной системы закономерно формирование памяти,
молекулярные механизмы которой требуют специального изучения. Кроме того,
геном иммунокомпетентных клеток подвергается перестройкам, реаранжировке — что лежит в основе исключительного биоразнообразия антител и рецепторов
лимфоцитов, т.е. возникает своеобразное перепрограммирование. Самые различ12
ные сигналы чужеродности, попадающие на рецептор клетки, сходятся в запуске
универсального молекулярного потока, включая программу перестройки генома.
Для каждой иммунокомпетентной клетки характерны общие и специфические
каскады ферментных процессов. Так, моноциты (макрофаги и другие фагоциты)
— идентифицируются по энзимам, а не только по рецепторам. Перечень ферментов очень широк. Неспецифическая эстераза (в цитоплазме диффузно), миелопероксидаза, 5-нуклеотидаза, в -галактозидаза; в зрелых клетках транс-глутаминаза,
в реализации бактерицидной активности — кислородозависимая NАD-зависимая
оксидаза, миелопероксидаза, супероксиддисмутаза, каталаза. Важным этапом обработки антигена является и функционирование кислород-независимых ферментов — лизоцима, катепсина, аргиназы, протеазы, гидролазы, катионных белков и
др.
Обоснована взаимозависимость иммуномодуляторной и ферментативной активностей как проявление и доказательство полифункциональности ряда энзимов.
На кафедре молекулярной биологии, иммунологии ННГУ (под руководством
проф. Н.А. Добротиной) в течение десятилетия проводится скрининг различных
ферментов, БАВ и некоторых иммунотоксикантов на апробированной, верифицированной системе in vitro, которая включает выделенные иммунокомпетентные
клетки крови человека, другие показатели системы крови (фагоцитоз, комплемент, циркулирующие иммунные комплексы) и разноплановый анализ биохемилюминесценции. Обсуждаются новые данные по биохимии иммунитета, его регуляции за счет различных ферментных систем. Представлены доказательства иммуномодулирующей активности ферментов различной специфичности и классовой принадлежности.
Принципиальный научно-практический интерес имеет анализ действия ферментов различного происхождения на иммунологические реакции. Во-первых, у
большинства изученных ферментов (лизоцим, протеолитические ферменты, эндонуклеазы, церулоплазмин и др.) — выявлен дозозависимый эффект. Смысл дозозависимого действия неодинаков у различных ферментов. Чаще всего обнаружено, что в малых и физиологических дозах наблюдалась модуляция в виде стимуляции; в больших — торможение и снижение иммунореактивности клеток. Вовторых, при изучении действия других белковых препаратов, например альбумина, показано, что он в отличие от изученных ферментов, оказывал противоположное, ограничительное действие, снижая иммунореактивность клеток. В-третьих,
все изученные препараты обладали системным, комплексным эффектом действия
на различные иммунотропные системы: респираторный взрыв фагоцитов; кооперативное взаимодействие иммунокомпетентных клеток (реакция розеткообразования); эффект адгезивности; система комплемента и другие. В-четвертых, обсуждая положительное иммуномодулирующее действие различных ферментов в
системах in vitro, следует подчеркнуть двойственный механизм действия. Так,
большинство ферментов, по-видимому, активировали специфические системы —
рецепторы, лиганды, соответствующие сайты или работали за счет продуктов реакции (лизоцим, нейраминидаза, эндонуклеаза). С другой стороны, по-видимому,
названные ферментативные препараты изменяли жидкостно-кристаллическое,
мозаичное состояние мембран клетки, вызывая различную степень их лабилизации; регулировали межклеточные отношения и транспорт веществ.
Ниже, в качестве примеров, представлены основные механизмы действия некоторых ферментов, которые были изучены нами, и доказана их иммуномодуляторная активность.
13
Лизоцимы (ЛЗ) — мураминидазы [КФ 3.2.1.17] — разного происхождения являются выраженными иммуномодуляторами, иммуномодулирующий эффект их
доказан, однако, разнообразная активность не является выясненной. Нами показано, что ЛЗ действуют на разные клеточные и гуморальные системы иммунитета.
Особенностью поведения ЛЗ в растворе является склонность фермента к самоассоциации или иммуномобилизации на системах (по-видимому, на молекулах IgG),
за счет чего, очевидно, не возникает нарастание активности ЛЗ в процессе насыщения среды (крови) субстратом. Действие на ЛЗ физиологических детергентов
(7 М мочевины) повышает его активность.
Новым в работах кафедры и лаборатории ОБИ НИИ химии ННГУ является и
то, что показано иммуностимулирующее действие ЛЗ в условиях целостного организма. Применение препарата в комплексной терапии больных бронхолегочными заболеваниями приводило к нормализации сниженных показателей клеточного
иммунитета и росту активности эндогенного ЛЗ в 4.5 раза, т.е. ЛЗ является триггером процесса. На примере ЛЗ нами установлено, что тестирование препаратов в
системе in vitro, созданной и апробированной нами, соответствует и коррелирует
с реакциями на целостном организме. По нашим данным, ЛЗ действует не только
непосредственно на субстрат-полисахарид гр(+) микроорганизмов, но и опосредованно, за счет образующихся мурамил-пептидов, которые обеспечивают разносторонний, неспецифический иммуномодулирующий эффект.
Особый интерес представляет обнаруженная иммунотропность, как прямое
проявление полифункциональности и полиэффекторности феррооксидоредуктазы
плазмы крови церулоплазмина (Ср) — медьсодержащей оксидазы [КФ 1.16.3.1].
Этот острофазный белок участвует в механизмах деполяризации различных клеток и молекул. По нашим данным обнаружено, что Ср обладает иммуномодулирующим действием. Выраженная иммуностимуляция проявляется уже в малых и
физиологических дозах. Эффект иммуномодуляции осуществляется за счет кооперативного взаимодействия клеток (реакция розеткообразования и адгезии).
Фундаментальные основы выяснения механизмов активности этого гликопротеина — адаптогена (Ср) — позволило обосновать возможности его дальнейшего
применения в медицине, в том числе при воспалительной, экотоксической, судорожной, иммунодефицитной и других видах синдромной патологии человека
(биотехнология получения активного нативного препарата разработана).
Предпринята попытка создания комплексного препарата церулоплазмина и
IgG. Показан более выраженный эффект при кооперативном взаимодействии с
мононуклеарами, по сравнению с действием изолированного Ср.
Не выяснена роль протеолитических ферментов в иммунологических реакциях
с позиций иммуномодуляции. Изучено влияние комплексных протеолитических
ферментных препаратов бактериального происхождения как иммуномодуляторовадаптогенов на реактивность клеток крови. В настоящей работе использованы
проназа Str. griseus, протеаза Str. spheroides. Проназа — комплексный препарат
нейтральных и щелочных протеиназ, смесь экзо- и эндопептидаз, стабильная по
составу. Протеаза — комплекс протеиназ тромболитического действия. С помощью разработанного нами комплекса методов изучено влияние указанных препаратов на различные системы крови практически здоровых людей в условиях in
vitro.
Для выяснения механизма клеточной кооперации исследован эффект адгезии
лимфоцитов. При сравнительном анализе изменения адгезии под действием исследованных протеолитических ферментов выявлен параллелизм между измене14
нием межклеточных взаимоотношений (по данным РО) и адгезивных свойств
лимфоцитов. Результаты работы свидетельствуют о том, что исследованные концентрации протеазы Str. spheroides усиливали эффект кооперации и адгезии иммунокомпетентных клеток. Проназа же стимулировала адгезию и межклеточные
взаимоотношения только при 10 мкг/мл. Концентрации проназы до 5 мкг/мл
включительно не изменяли уровень адгезии и вызывали нейтральный эффект или
даже подавляли межклеточное взаимодействие.
При изучении биофизиологической реактивности некоторых ферментов на
модели выделенных подсистем крови человека выявлена иммунотропность изученных препаратов.
Таким образом, по-прежнему актуален поиск дополнительных активностей энзимов и ферментных препаратов в регуляции иммунологических реакций, что
взаимосвязано с обоснованием полифункционального значения, полиэффекторности, которая обнаружена нами для целого ряда энзимов различных классов.
Полученные данные могут быть основой для биотехнологического обоснования производства и применения изученных препаратов.
15