Микробиологические методы исследования объектов

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РФ
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ
ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ
ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ
«НИЖЕГОРОДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ТЕХНИЧЕСКИЙ
УНИВЕРСИТЕТ имени Р.Е. Алексеева»
Кафедра «Биотехнология, физическая и аналитическая химия»
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ОБЪЕКТОВ
ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ
Методические указания к лабораторным занятиям
по дисциплине «Общая биология и микробиология»
для студентов, обучающихся по направлению
«Биотехнология» и «Техносферная безопасность»
дневной формы обучения
Нижний Новгород 2013
Составители: О.В. Кузина, О.Н. Смирнова
УДК 576(076.5)
Микробиологические методы исследования объектов окружающей среды. Методические указания к лабораторным занятиям по дисциплине «Общая биология и микробиология» для студентов, обучающихся по направлению «Биотехнология» и «Техносферная безопасность» дневной формы обучения / НГТУ;
Сост.: О.В. Кузина, О.Н. Смирнова.– Н. Новгород, 2013.– 14 с.
В лабораторный практикум включены задания, цель которых освоение методов микробиологического исследования объектов окружающей среды, техногенных потоков и продуктов. Объектами исследования служат широко распространенные в природных средах культуры микроорганизмов, участвующих в
биогеохимических циклах превращения веществ в биосфере.
Редактор Э.Б. Абросимова
Подписано в печать
Печать офсетная. Усл. п. л.
. Формат 60801/16. Бумага газетная.
. Уч.-изд. л. . Тираж 80 экз. Заказ
.
Нижегородский государственный технический университет им. Р.Е. Алексеева.
Типография НГТУ. 603950, г. Нижний Новгород, ул. Минина, 24.
 Нижегородский государственный технический
университет им. Р.Е. Алексеева, 2013
2
ВВЕДЕНИЕ
Микроорганизмы широко распространены в природе и обнаруживаются во
всех природных средах (почве, воде, воздухе), на растениях и в организме животных и человека.
Согласно концепции С.Н. Виноградского микроорганизмы, встречающиеся
в экосистеме, можно подразделить на две группы: автохтонные и аллохтонные
(или зимогенные). Автохтонные микроорганизмы – это типичные обитатели
данной экосистемы и присутствуют там постоянно, что обусловлено наличием
питательных веществ, характерных для данной экосистемы.
Аллохтонные (или зимогенные) микроорганизмы обнаруживаются в данной экосистеме в связи со случайным повышением концентрации питательных
веществ или привнесением каких-то веществ, не свойственных данной экосистеме. Количество и качественное разнообразие микроорганизмов в окружающей среде зависят не только от наличия питательных веществ, но и температурных условий, влажности, аэрации, действия солнечных лучей и других
абиотических и биотических факторов окружающей среды. Качественный состав, количество и соотношение между различными группами микроорганизмов изменяются в зависимости от типа почвы, способов ее обработки, климатических условий и др.
С выделениями больных животных и человека в почву попадают и патогенные микроорганизмы, многие из которых, особенно споровые, могут сохраняться в почве длительное время, иногда десятками лет. Поэтому почву рассматривают как возможный путь передачи возбудителей ряда инфекционных
заболеваний (ботулизма, столбняка, газовой гангрены, сибирской язвы и др.).
При санитарно-микробиологических исследованиях почвы рассматривают возможность ее фекального загрязнения и помимо показателя «микробное число»
(количество микроорганизмов в 1 г почвы) определяют и коли-индекс, т.е. содержание кишечных палочек в 1 г почвы.
Обнаружение и количественный учет микроорганизмов в объектах окружающей среды (природных и техногенных средах) необходимы при санитарногигиенических и экологических исследованиях для моделирования природных
систем и разработке основ управления природными процессами.
3
Лабораторная работа № 1
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ВОЗДУХА
Цель работы: изучение количественного и качественного содержания
микрофлоры воздуха различных помещений методом седиментации.
Воздух не является средой обитания микроорганизмов, а является транзитной средой.
Микрофлору воздуха можно условно разделить на постоянную, часто
встречающуюся, и переменную, представители которой, попадая в воздух из
свойственных им мест обитания, недолго сохраняют жизнеспособность. Постоянно в воздухе обнаруживаются пигментообразующие кокки, палочки, дрожжи,
грибы, актиномицеты, спороносные бациллы, клостридии и др., т.е. микроорганизмы, устойчивые к свету, высыханию.
В воздухе крупных городов количество микроорганизмов больше, чем в
сельской местности. Над лесами, морями воздух содержит мало микробов (в 1
м3 – единицы микробных клеток). Дождь и снег способствует очищению воздуха от микробов. В воздухе закрытых помещений микробов значительно больше,
чем в открытых воздушных бассейнах, особенно зимой при недостаточном
проветривании. В воздухе могут попадаться и патогенные микроорганизмы от
животных, людей (больных и носителей).
Микробное число воздуха характеризует состав микрофлоры и количество
микроорганизмов, обнаруживаемых в 1 м3 воздуха. Оно зависит от санитарногигиенического режима помещения, числа находящегося в нем людей, состояния их здоровья и других условий.
Для микробиологического исследования воздуха пользуются методами, в
основу которых положены оседание (седиментация) и аспирация. При помощи
седиментационных методов можно получить общее представление о встречающихся в воздухе микроорганизмах. Аспирационные методы дают возможность определить не только качественное, но и количественное содержание
бактерий в определенном объеме воздуха.
Метод оседания. Простейший метод бактериологического исследования
воздуха – метод оседания, который основан на оседании бактериальных частиц
и капель под влиянием силы тяжести на поверхности агара открытой чашки
Петри.
Метод оседания не дает точного количественного представления о содержании микрофлоры в воздухе, так как на открытых чашках плохо улавливаются
мелкие фракции бактериальных капель и пылевых частиц, а задерживаются,
главным образом, крупные пылевые частицы, которые оседают или прибиваются токами воздуха к поверхности среды. Поэтому данный метод не пригоден
для атмосферного воздуха, где имеют место большие колебания в скорости его
движения. Тем не менее, метод оседания может быть использован в тех случа4
ях, когда отсутствуют более совершенные приборы и методы или когда нет источника электроэнергии.
Для определения микробного числа воздуха используют метод перерасчета
Омелянского. По методу Омелянского – на поверхности агара равной 100 см2
оседает за 5 минут такое количество бактерий, которое содержится в 10 л воздуха.
Ход выполнения работы
Предварительно подготовленные чашки Петри с тонким слоем питательного агара (10-15 мл) экспонируют в исследуемом помещении 5-10-15 минут в
зависимости от предполагаемого бактериального загрязнения. Засеянные чашки
переворачивают вверх дном и термостатируют при 370С. Сроки культивирования микроорганизмов зависят от состава питательной среды и группы учитываемых микроорганизмов.
На мясо-пептонном агаре (МПА) обычно на 2-3 сутки инкубации учитывают споровые и неспоровые формы бактерий.
На среде Чапека-Докса на 5-7 сутки учитывают колонии актиномицетов.
На сусло-агаре на 5-7 сутки – колонии дрожжей и грибов.
По истечении времени культивирования, подсчитывают все выросшие колонии и производят перерасчет содержания бактерий в 1 м3 воздуха.
Примерный расчет микробного числа воздуха:
Например, в чашке Петри диаметром 10 см выросло 25 колоний.
1) Определяют площадь питательной среды в чашке Петри по формуле: r2
3,14х52 или 3,14х25=78,5 см2;
2) Вычисляют количество колоний на площади 1 дм2 или 100 см2.
25 колоний выросло на площади – 78,5 см2
Х колоний – 100 см2,
Х=(25х100)/78,5=32 колонии.
Т.е. на площади 1 дм2 имеется 32 колонии.
3) Пересчитывают количество бактерий на 1 м3 воздуха или 1000 л.
Содержащиеся 32 колонии бактерий на площади 1 дм2 соответствует объему 10 л воздуха. Чтобы узнать количество в 1 м3 воздуха, составляют
пропорцию:
32 – 10 л
Х – 1000 л
Х=(32х1000)/10=3200.
Следовательно, в 1 м3 воздуха содержится 3200 бактериальных телец.
Далее приступают к качественному анализу микрофлоры воздуха. Для этого производят описание колоний по внешним признакам. Отдельные колонии
микроскопируют.
5
Материалы, оборудование, реактивы
Чашки Петри, МПА, среда Чапека-Докса, предметные стекла, бактериологическая петля, микроскоп, иммерсионное масло, вата, этанол 96%-ный, термостат для культивирования микроорганизмов, спиртовки.
ЗАДАНИЕ К РАБОТЕ
1. Определить микробное число воздуха различных помещений (по заданию преподавателя) методом седиментации.
2. Определить качественный состав микрофлоры воздуха. Приготовить
фиксированные препараты микроорганизмов (бактерий и грибов), и зарисовать их.
6
Лабораторная работа № 2
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ПОЧВЫ
Цель работы: изучение и учет численности почвенных микроорганизмов
методом прямого микроскопирования и методом посева на плотные питательные среды.
Населяющие почву многочисленные популяции и группы популяций разнообразных микроорганизмов, различающиеся по экологическим функциям и
таксономическому положению, объединяются общим понятием «почвенная
биота».
Почва является средой обитания большого числа разнообразных микроорганизмов. В 1 г почвы содержится от 1 до 10 млрд. клеток микроорганизмов.
В почве активно протекают процессы разложения органических природных веществ при участии широкого разнообразия сапрофитных микроорганизмов.
Для выявления, изучения и учета численности почвенных микроорганизмов используют прямые методы микроскопирования и методы посева из разведений почвенной суспензии на плотные и жидкие среды.
Отбор почвенных образцов
Образцы отбирают ножом или лопатой, тщательно очищенными и протертыми спиртом. При исследовании пахотных почв пробы берут обычно с глубины всего пахотного слоя. Вначале удаляют самый верхний, 2-3-сантиметровый
слой, который может быть загрязнен посторонней микрофлорой. Затем с исследуемого участка берут монолиты. Длина монолита соответствует толщине слоя,
из которого хотят взять образец. На опытном участке площадью 100-200 м2 отбирают 7-10 проб, весом около 0,5 кг каждая. Пробы тщательно смешивают в
стерильном мешке, из смешанных проб берут средний образец весом примерно
1 кг и помещают его в стерильный пергаментный пакет, вложенный в мешок из
ткани. Мешок плотно завязывают и помещают в полиэтиленовый пакет. В полиэтиленовый пакет вкладывают этикетку, на которой указан район исследования, отмечены особенности выбранного участка (рельеф, растительность, агротехнический фон) и характеристика почвы. До анализа и между определениями
пробы хранят в холодильнике.
Подготовка образца к микробиологическому анализу
Хорошо перемешанную почву высыпают на сухое стекло, протертое спиртом и обожженное пламенем горелки. Почву тщательно перемешивают шпателем и раскладывают ровным слоем. Пользуясь пинцетом, удаляют корешки и
другие посторонние включения. Непосредственно пред работой шпатель и
пинцет прокаливают в пламени и слегка остужают на воздухе. Из разных мест
распределенной на стекле почвы шпателем отбирают небольшие порции и в
7
стеклянной, предварительно тарированной фарфоровой чашке взвешивают на
технических весах 1 г среднего образца.
Для разрушения почвенных агрегатов и отделения клеток микроорганизмов с почвенных частиц пробу подвергают специальной обработке. Заранее готовят две стерильные колбы емкостью до 250 мл: одну со 100 мл водопроводной воды, другую оставляют пустой. Берут из первой колбы 0,4-0,8 мл воды,
увлажняют ею навеску почвы в фарфоровой чашке до пастообразного состояния, и смесь растирают 5 мин стерильным резиновым пестиком или пальцем в
резиновой перчатке. Стерильной дистиллированной водой из первой колбы переносят растертую почвенную массу в пустую колбу, используя для этого весь
объем воды. Почву растирают и переносят в колбу около пламени горелки.
Колбу с почвенной суспензией встряхивают на качалке в течение 5 мин. После
этого суспензии дают отстояться 30 с, чтобы осели крупные частицы, и тотчас
же используют ее для приготовления препарата или разведений. При этом учитывают, что в полученной исходной суспензии исследуемый материал (почва)
разведен в 100 раз (1:102). При выявлении микроорганизмов, численность которых в исследуемом субстрате невелика, готовят исходную суспензию в 10 мл
воды (1:10).
Подсчет клеток на фиксированных окрашенных мазках
Для прямого микроскопического изучения почвы применяется метод Виноградского в различных модификациях.
Метод сводится к тому, что в определенном объеме исследуемой суспензии непосредственно под микроскопом подсчитывают количество клеток микроорганизмов. Исследование фиксированных мазков дает возможность сохранять препараты длительный срок и проводить подсчет не по ходу опыта, а в
другое, удобное для исследователя время.
Приготовление препарата. Определенный объем исследуемой суспензии
(обычно от 0,02 до 0,05 мл) наносят микропипеткой на хорошо обезжиренное,
сухое предметное стекло. К капле суспензии добавляют каплю стерильного
0,03%-ного водного раствора агар-агара, быстро их перемешивают стерильной
бактериологической петлей и равномерно распределяют на площади 6-4 см2.
Мазок высушивают на воздухе, фиксируют 20-30 мин 96%-ным спиртом. Препарат споласкивают дистиллированной водой и погружают его на 20-30 минут
в раствор карболового эритрозина. После окрашивания препарат промывают
водопроводной водой и высушивают на воздухе.
Подсчет клеток микроорганизмов проводят с иммерсионным объективом.
Метод посева на плотные среды (метод Коха)
Несмотря на то, что прямые микроскопические методы позволяют выявить
и учесть значительно большее количество микроорганизмов (число бактерий,
учитываемых прямыми методами, в 1000 раз превышает то, которое учитывается методом посева), метод посева остается одним из распространенных в практике исследования почвенных микроорганизмов. Сущность метода заключается
в высеве определенного объема исследуемой суспензии на плотную среду в
8
чашки Петри, что позволяет не только учитывать количество, но и групповой (а
часто и видовой) состав микрофлоры, а также позволяет из изолированных колоний, выросших на чашках, выделять микроорганизмы в чистые культуры для
дальнейшего исследования и идентификации.
Приготовление разведений. В ходе одного опыта пользуются постоянным
коэффициентом разведения, так как в этом случае уменьшается вероятность
ошибки. Чаще всего делают десятичные разведения. Для этого стерильную дистиллированную воду разливают стерильной пипеткой по 9 мл в стерильные сухие пробирки. Затем переносят стерильной пипеткой 1 мл исследуемого материала в пробирку с 9 мл стерильной воды. Если исследуемый материал (почва)
уже был разведен в 100 раз (стр. 7-8), получают разведение 1:103. Суспензию
этого разведения тщательно перемешивают с помощью новой стерильной пипетки, вбирая в пипетку и выпуская из нее полученную взвесь. Затем этой же
пипеткой берут 1 мл полученного разведения и переносят его во вторую пробирку – это разведение 1:104. Таким образом готовят и последующие разведения. Для приготовления каждого разведения обязательно используют отдельную пипетку.
Рис. 1. Схема приготовления разведенной суспензии микроорганизмов и посева
Посев на плотные среды производится из разных разведений (1:102, 1:103,
1:104). Разведения для высева подбирают таким образом, чтобы на чашке развивалось 50-200 колоний. Из каждого разведения делают не менее 3-х повторных высевов.
На поверхность застывшей и подсушенной среды наносят 0,1-0,2 мл почвенной суспензии определенного разведения и с помощью стеклянного шпате9
ля распределяют ее по всему агару. Засеянные чашки переворачивают вверх
дном и помещают в термостат. Засеянные водно-почвенной суспензией чашки
Петри периодически просматривают. Сроки учета микроорганизмов зависят от
состава питательной среды и группы учитываемых микроорганизмов. На мясопептонном агаре (МПА) обычно на 2-3 сутки инкубации учитывают споровые и
неспоровые формы бактерий. На среде Чапека-Докса на 5-7 сутки учитывают
колонии актиномицетов, на сусло-агаре на 5-7 сутки – колонии дрожжей и грибов.
Подсчет количества колоний проводят обычно со дна чашки в проходящем свете. На месте подсчитанной колонии чернилами или маркером ставится
точка.
Следует иметь в виду, что точность метода зависит от числа подсчитанных
колоний: лучшим разведением считается то, при высеве из которого на плотной
питательной среде вырастает от 50 до 150 колоний. Если число выросших колоний меньше 10, то эти результаты отбрасывают и для расчета количества
клеток не используют.
Подсчитав количество колоний на всех параллельных чашках, вычисляют
их среднее число на одной чашке и затем делают пересчет для определения содержания микроорганизмов в 1 г (1 мл) почвы по формуле:
N= (Х2x)K /V,
где N – количество клеток в 1 г (1 мл) почвы, К – разведение, из которого сделан посев, Х – среднее количество колоний на чашке Петри при разведении К,
V – объем суспензии, взятый для посева, мл; 2 – критерий при уровне достоверности 95% (Р0,95), x – среднее квадратичное отклонение, x=х/n, n –
число повторностей, х – общее количество подсчитанных колоний при высеве
данного разведения.
Например, если при разведении 1:105 выросло 85 колоний, количество бактерий в 1 мл исследуемого вещества при объеме суспензии, взятой для посева,
равном 0,1 мл, будет равно:
85105 /0,1 = 85106 = 8,5107+2x.
Материалы, оборудование, реактивы
Лопата или большой нож, пергаментный пакет 25х15 см, мешок из ткани
35х20 м, полиэтиленовый пакет, вата, этанол 96%-ный, колбы на 250 мл, стекло
50х50 см, фарфоровая чашка, пипетки на 0,1, 1, 2, 10 мл, пинцет, шпатель металлический, резиновые перчатки или резиновый пестик, весы технические с
разновесом, предметные стекла, бактериологическая петля, спиртовка, микроскоп, иммерсионное масло, пробирки, 0,03%-ный водный раствор агар-агара,
эритрозин карболовый, качалка (150-250 об/мин).
10
ЗАДАНИЕ К РАБОТЕ
1.
2.
3.
11
Подсчитать количество бактерий, количество споровых и неспоровых
форм в почве методом Виноградского. Приготовить фиксированный препарат доминирующей группы бактерий. Микроскопировать с иммерсией.
Зарисовать.
Подсчитать количество микроорганизмов в почве методом поверхностного
посева на МПА. Приготовить фиксированный препарат из доминирующего
типа колоний. Микроскопировать с объективом 100х и зарисовать.
Подсчитать количество дрожжей и грибов в почве методом поверхностного посева на сусло-агар. Приготовить препараты «раздавленная капля» из
доминирующего типа колоний грибов и дрожжей. Микроскопировать с
объективом 40х. Зарисовать.
Лабораторная работа № 3
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ВОДЫ
Цель работы: изучение микрофлоры воды, определение микробного числа водопроводной воды и вод открытых водоемов.
Водные экосистемы являются средой обитания микроорганизмов. Первичными продуцентами служат одноклеточные водоросли. В пищевую цепь входят
бактерии и простейшие. Микрофлора воды чаще всего отражает микробный
пейзаж почвы около водоема, постоянно меняется и обновляется, что связано с
попаданием различных бактерий с ливневыми, сточными, талыми водами, с
пылью, из организма живущих в водоеме рыб, гниющих растений. Микрофлора
в пресных и соленых водоемах различна.
В пресных водоемах (озерах, реках) обнаруживаются кокки (Micrococcus
roseus и др.) и палочковидные бактерии (Pseudomonas fluorescens). Анаэробов в
воде мало; в основном они размножаются в иле на дне водоемов, участвуя в
биохимических процессах очищения. Сапрофитные микроорганизмы выполняют роль мусорщиков, расщепляя органические отходы, делая их пригодными
для метаболических процессов других живых существ.
Микрофлора морей и океанов не так богата и представлена галофильными
(солелюбивыми) микроорганизмами.
Вода артезианских скважин почти не содержит микроорганизмов, что объясняется фильтрующей способностью почвы.
С ливневыми, талыми и сточными водами в реки и озера попадают микроорганизмы – представители нормальной флоры кишечника человека и животных, например, кишечная палочка, энтерококки, различные клостридии. Вместе
с ними могут попасть и патогенные микроорганизмы (брюшнотифозные, дизентерийные бактерии, холерные вибрионы, вирусы полиомиелита, гепатита),
которые сохраняются от нескольких дней до недель. Именно поэтому водный
путь передачи является одним из возможных факторов распространения кишечной инфекции.
Общепринятыми показателями санитарно-микробиологического исследования воды являются: микробное число воды, коли-индекс или коли-титр.
Микробное число воды характеризует содержание микроорганизмов в 1 мл
исследуемой жидкости. Коли-индекс – это количество бактерий группы кишечных палочек содержащихся в 1 л воды, а коли-титр – это наименьшее количество или наибольшее разведение воды, в котором еще обнаруживается кишечная палочка.
Отбор проб воды. В зависимости от задачи исследования определяют место и время отбора пробы.
Для исследования воды открытых водоемов, а также колодцев отбирают
пробы воды на глубине 10-15 см от поверхности в стерильные флаконы.
12
Для отбора проб водопроводной воды используют стерильные склянки
вместимостью 500 мл с ватно-марлевыми пробками. Бактериологическое исследование отобранных проб должно производиться не позднее 2 ч с момента
отбора или не позднее 6 ч при хранении пробы при 1-50С.
Методы определения микробного числа
В 1 мл исследуемой воды определяют содержание мезофильных аэробов и
факультативных анаэробов, способных при 370С в течение суток на мясопептонном (МПА) образовывать колонии, видимые невооруженным глазом или
при увеличении в 2-5 раз. Из каждой пробы делают посев не менее двух различных объемов, выбранных с таким расчетом, чтобы число выросших колоний
на чашке колебалось от 30 до 300.
При исследовании водопроводной воды в каждую из двух чашек вносят по
1-0,1 мл чистых вод и по 0,01 и 0,001 мл более загрязненных. При определении
микробного числа сильно загрязненных вод и сточных жидкостей исследуют по
0,0001 и 0,00001 мл.
Для посева 0,1 мл и меньших объемов исследуемую воду разводят стерильной дистиллированной водой. Готовят последовательно 10-кратные разведения (см. приготовление разведений стр. 9).
По 1 мл каждого разведения вносят в 2 чашки Петри и заливают тонким
слоем предварительно растопленного и остуженного до 450С питательного агара (10-12 мл агара). После интенсивного перемешивания среде дают застыть на
строго горизонтальной поверхности. Посевы выращивают в течение суток при
370С. С лупой при увеличении в 2-5 раз подсчитывают все выросшие колонии.
Учитывают результаты только на тех чашках, где число колоний колеблется в
пределах от 30 до 300, и производят перерасчет содержания бактерий в 1 мл исследуемой воды. Подсчет количества колоний и определение микробного числа
воды производят, как описано в лабораторной работе № 2 (см. стр. 10).
Материалы, оборудование, реактивы
Колбы на 250 мл, пипетки на 0,1, 1, 10 мл, пробирки, предметные стекла,
бактериологическая петля, спиртовка, микроскоп, иммерсионное масло, термостат, МПА, среда Чапека-Докса, чашки Петри.
ЗАДАНИЕ К РАБОТЕ
Определить количество микроорганизмов (микробное число) в водопроводной воде и загрязненных водах.
13
РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА
1. Асонов Н.Р. Микробиология. – М.: Колос, 2001. – 352с.
2. Шлегель Г. Общая микробиология. – М.: Мир, 1987. – 567с.
3. Градова Н.Б., Бабусенко Е.С., Горнова И.Б., Гусарова Н.А. Лабораторный практикум по общей микробиологии. - М.: ДеЛи принт, 2001. – 131с.
4. Сидоров М.А., Нецепляев С.В., Корнелаева Р.П. Лабораторный практикум по микробиологии мяса и мясопродуктов. – М.: Колос, 1997. – 352с.
5. Степаненко П.П. Микробиология мяса и молочных продуктов. – М.: Колос, 1996. – 271с.
6. Практикум по микробиологии. Под ред. Н.С. Егорова. – М.: МГУ, 1976.
– 307 с.
14